DE69435013T2

DE69435013T2 - Biologische verfahren zur schnellen bestimmung der sterilität

Info

Publication number: DE69435013T2
Application number: DE69435013T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey C. Naples BURNHAM; George J. Maumee HAGEAGE; Douglas Maumee JAMBARD-SWEET; Judy Findlay HENDRICKS
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 1994-09-26
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2014-09-27
Also published as: ATE370244T1; WO1995008639A1; AU7878794A; CA2169546C; EP0720657A1; EP0720657A4; ES2288299T3; DE69435013D1; EP0720657B1; JPH09503128A; CA2169546A1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Fachgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren für die schnelle Bestimmung der Wirksamkeit von Sterilisationsverfahren, wobei Indikatoren verwendet werden, die biologisch relevante Materialien enthalten, die funktionsmäßig vergleichbar mit, aber tatsächlich keine lebenden Mikroorganismen sind. Die Verfahren und Geräte der Erfindung sind in Einrichtungen des Gesundheitswesens wie z.B. in Krankenhäusern, Laboratorien und Forschungseinrichtungen, in der Nahrungs- und Umwelttechnologie und in allen Technologien, die eine Sterilisation bei der Herstellung, Produktion und der Abfallentsorgung verwenden, nützlich.
2. Beschreibung des Hintergrunds
Hauptsächlich in Einrichtungen des Gesundheitswesens, aber auch in vielen anderen industriellen Anwendungen ist es fast immer notwendig, die Wirksamkeit der Prozesse, die zur Sterilisation der Ausrüstung wie z.B. von medizinischen Apparaten, Instrumenten und von anderen wiederzuverwendenden Gegenständen verwendet werden, zu überprüfen. Mit diesem Hintergrund wird die Sterilisation im Allgemeinen als der Prozess der vollständigen Zerstörung aller lebenden Mikroorganismen einschließlich solcher Strukturen wie z.B. Viren und Sporen definiert. Es ist ein Standardverfahren in diesen Krankenhäusern, einen Sterilitätsindikator in die Charge von Artikeln, die sterilisiert werden sollen, einzuschließen. Die Verwendung von Sterilitätsindikatoren ermöglicht einen direkten und sensitiven Ansatz, um die Letalität des Sterilisationsverfahrens zu untersuchen.
Ein standardmäßiger Typ eines biologischen Sterilitätsindikators schließt eine bekannte Menge mikrobieller Testsporen ein. Der Indikator wird in die Sterilisationskammer platziert und zusammen mit den zu sterilisierenden Gegenständen dem Sterilisationsverfahren ausgesetzt. Die Testmikroorganismen, zum Beispiel Sporen von Bacillus stearothermophilus oder B. subtilis, werden anschließend für einen bestimmten Zeitraum unter Bedingungen inkubiert, welche die Vermehrung fördern, und ein mögliches Wachstum wird untersucht, wie durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten metabolischen Produkten von überlebenden Mikroorganismen bestimmt wird. Ein positives Wachstum deutet darauf hin, dass das Sterilisationsverfahren nicht ausreichend war, um alle Mikroorganismen zu zerstören. Während der Apparat für das Aufbewahren der Sporen stetig variiert wurde, wurde das allgemeine Verfahren zum Nachweisen der Sterilität nicht verändert. Variationen dieses Themas werden in den US-Patenten mit den Nummern 3,239,429 ; 3,440,144 ; 4,596,773 ; 4,717,661 , 4,732,850 und 5,167,923 offenbart.
Die biologischen Indikatoren, die in jedem dieser Patente offenbart werden, enthalten ein Präparat von lebensfähigen Sporen, die von einer Kultur hergestellt wurden, die von einem spezifischen Bakterienstamm abgeleitet wurde und die für die vorhersagbare Resistenz gegenüber einer Sterilisation charakterisiert wurde. Sporen sind in herkömmlichen biologischen Indikatoren häufig die Testorganismen, weil sie viel resistenter gegenüber dem Sterilisationsverfahren als die meisten anderen Organismen sind. Die Indikatoren sind in sich abgeschlossen, das heißt, dass sie die Sporen und das Inkubationsmedium in einem einzelnen Behälter enthalten. Es sind keine Zusätze notwendig, um den Test durchzuführen. Nach der Sterilisation wird die Ampulle, die das Inkubationsmedium enthält, zerdrückt, um die Sporen mit dem Wachstumsmedium in Kontakt zu bringen. Der ganze Behälter wird anschließend für einen bestimmten Zeitraum inkubiert und die Ergebnisse werden bestimmt und aufgezeichnet.
Obwohl die meisten Indikatoren nach 1975 und der gesetzlichen Verfügung des "Medical Devices Act" entwickelt wurden, gibt es auch biologische Indikatoren, die heute auf dem Markt sind, die vor 1976 entwickelt wurden und daher nicht durch die Anordnungen des Gesetzes reguliert werden. Diese biologischen Indikatoren umfassen Sporen auf einem Träger in einem Behälter. Nachdem sie dem Sterilisationsverfahren ausgesetzt waren, wird der Träger mit den Sporen aus dem Behälter in ein steriles Medium transferiert und inkubiert.
Ein großer Nachteil von jedem dieser Sterilitätsindikatoren ist die Zeitverzögerung bis zum Erhalt der Ergebnisse des Sterilisationstests. Diese Sterilitätsindikatoren erfordern im Allgemeinen, dass die Mikroorganismen für mindestens zwei und häufig für bis zu sieben Tage kultiviert werden, um einen adäquaten Nachweis von überlebenden Mikroorganismen sicherzustellen. Während dieser Zeit sollten die Gegenstände, die durch das Sterilisationsverfahren gegangen sind, nicht verwendet werden, bis die Ergebnisse des Tests der Sporenlebensfähigkeit bestimmt wurden. Ein Ergebnis von überlebenden Sporen zeigt, dass keine geeigneten Sterilisationsbedingungen vorgelegen haben.
Viele Einrichtungen der Gesundheitsfürsorge besitzen begrenzte Ressourcen und müssen ihre "sterilisierten" Instrumente innerhalb von 24–48 Stunden und häufig sofort wieder verwenden. Unter solchen Bedingungen ist die Aufbewahrungsdauer von sieben Tagen für die Bestätigung der Sterilität unpraktisch und ineffizient. Das FDA Center for Devices and Radiological Health (CDRH) erlaubt Inkubationen von weniger als sieben Tagen für neue medizinische Geräte, die von den Einrichtungen der Gesundheitsfürsorge verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass der Hersteller die Parameter für die kürzeren Inkubationszeiten validiert. Für die Validierung des CDRH für die Inkubationszeit wird ein Teilzyklus benötigt, der zwischen 30 und 80% Positive (überlebender Mikroorganismen) ergibt. Ein Teilzyklus oder ein unvollständiger Zyklus der Sterilisation ist ein Kontakt zu einem sterilisierenden Mittel, der unangemessen oder erfolglos bei der Zerstörung der Mikroorganismen ist. Die Zeitspanne, wenn 97% dieser Positiven ein Wachstum zeigen, ist die akzeptierbare Inkubationszeit. Unter Verwendung dieser Richtlinien war es für die Hersteller zuvor nicht möglich, eine Verminderung der Aufbewahrungsdauer auf weniger als 2 Tage zu erreichen.
Es sind sogar weitere Zeitverzögerungen bei diesen traditionellen, im Handel erhältlichen biologischen Indikatoren notwendig, weil Techniker ausgebildet und Einrichtungen für einen Sterilraum zur Verfügung gestellt werden müssen. In einigen Fällen ist es für den ausgebildeten Labortechniker notwendig, die Testmikroorganismen von dem Behälter des Sterilitätsindikators in das Inkubationsmedium zu transferieren und anschließend mit geübtem Auge zu das Inkubationsmedium auf ein mögliches Wachstum der Mikroorganismen zu überprüfen. Trotz des Einsatzes von ausgebildeten Technikern und anderer solcher Vorsichtsmaßnahmen zeigen die Tests gelegentlich aufgrund menschlicher Fehler oder kontaminierter Einrichtungen eines Sterilraums falsch-positive Ergebnisse. Als eine Konsequenz müssen die Gegenstände erneut sterilisiert werden, was zu weiteren Verzögerungen führt und die Kosten erhöht.
Bestimmte Industriestandards sollten befolgt werden, um die Wirksamkeit des Sterilitätsindikators sicherzustellen. Diese Standards betreffen die Sensitivität und die Form der verwendeten Mikroorganismen wie z.B. eine Spore für das spezifische Sterilisationsverfahren. Die Produktkonstanz ist sehr wichtig, um ein gleichbleibendes Ergebnis von einer Charge zu der nächsten sicherzustellen. Ein anderer wichtiger Faktor ist die natürliche Gesamtkeimzahl, die Anzahl der Mikroorganismen auf oder in dem Produkt, das sterilisiert werden soll. Das Problem für das Sterilisationsverfahren ist größer als das Problem der natürlichen Gesamtkeimzahl, wenn der biologische Indikator innerhalb seiner Leistungseigenschaften verwendet wird. Um diese industriellen Standards zu erfüllen, benötigen einige der zur Zeit erhältlichen Sterilitätsindikatoren zusätzlich zu übermäßig langen Inkubationszeiträumen auch komplizierte Bearbeitungstechniken.
Die Verwendung eines Enzyms und seiner nachfolgenden Aktivität als ein Indikator in einem Versuch, die Zeitverzögerung beim Nachweisen der Sterilität zu überwinden, wurde vor kurzem im US-Patent Nummer 5,073,488 beschrieben.
Die Technik beinhaltet, dass ein Enzym für einen Sterilisationszyklus verwendet wird. Nach der Beendigung des Sterilisationszyklus wird das Enzym mit einem Substrat inkubiert, auf welches das Enzym wirkt und das in ein nachweisbares Produkt umgewandelt wird. Der Nachweis des enzymmodifizierten Produkts wird entweder kolorimetrisch oder fluorometrisch durchgeführt. Die Nachteile, die mit diesem Verfahren verbunden sind, sind die, dass nur ein Enzym in der Sterilitätsuntersuchung verwendet wird. Obwohl 5,073,488 darlegt, dass die Verwendung von mehreren Enzymen in Erwägung gezogen wird, würde jedes Enzym isoliert gemessen werden und sie sind nicht notwendigerweise interaktiv oder sogar funktionell verwandt. Es gab keine Veranlassung für die Verwendung einer komplexen biologischen Interaktion, um das Verhalten von lebensfähigen Sporen nachzuahmen, oder dass die Enzymreaktion amplifiziert werden könnte, um eine positive Reaktion sehr viel schneller zu zeigen, als sie durch die herkömmliche Enzymologie angezeigt würde. Eine spezielle Ausrüstung war ebenfalls häufig notwendig, um das Produkt nachzuweisen, das durch das einzelne Enzym hergestellt wurde.
Zusammenfassung der Erfindung.
Die Erfindung stellt Verfahren und Apparate bereit zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationszyklus auf der Basis der Aktivität von mehreren interaktiven, von Mikroorganismen abgeleiteten Enzymen. Unter Verwendung dieser Verfahren wird die Verifizierung der Sterilität sehr schnell erreicht. Die Erfindung kombiniert die Zuverlässigkeit von herkömmlichen biologischen Indikatoren mit der Schnelligkeit von Techniken, die ähnlicher zu solchen sind, die von anderen enzymatischen und chemischen Indikatoren verwendet werden, und ermöglicht die Verwendung von Personal mit einer minimalen Ausbildung, wobei trotzdem konsistente und verlässliche Ergebnisse erzielt werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf ein biologisches Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens gerichtet, das frei von Mikroorganismen ist. Dieses Verfahren umfasst:

a) Platzieren eines Testindikators, der einen oder mehrere Bestandteile einer Vielzahl interaktiver Enzymsysteme enthält, in eine Sterilisationskammer;
b) Durchführen des Sterilisationsverfahrens innerhalb der Kammer;
c) Hinzufügen der restlichen Bestandteile der Vielzahl der interaktiven Enzymsysteme zu den ein oder mehreren Komponenten in dem Testindikator, um eine Mischung zu bilden; und
d) Inkubieren der Mischung für eine erste Zeitspanne, die ausreicht, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Produktes nachzuweisen, um eine Bestimmung der Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens durchzuführen.

Gemäß diesem Verfahren wird die biologische Interaktion nur stattfinden, wenn die Komponenten, die für das Sterilisationsverfahren verwendet werden, nicht zerstört oder auf irgendeine Weise inaktiviert wurden. Die Komponenten schließen die Enzyme selber, die Substrate für die Enzyme und alle notwendigen Coenzyme, Katalysatoren, Cofaktoren oder andere Reagenzien des Enzymsystems ein. Das Verhältnis zwischen den Komponenten des Enzymsystems ist für die Bestimmung der Sterilität sehr wichtig, weil es nicht einfach eine chemische Reaktion oder eine Enzymreaktion sondern eine Enzyminteraktion ist, die den physiologischen Zustand der Mikroorganismen innerhalb der Kammer widerspiegelt. Der Grad der Übereinstimmung ist sehr hoch und von einer grundlegend anderen Natur als die, die mit der derzeitigen Methodik zur Verfügung gestellt wird.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf ein biologisches Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens gerichtet, wie es vorstehend beschrieben wird, in dem die Vielzahl von interaktiven Enzymsystemen einen Enzymzyklus umfasst, der aus der Gruppe bestehend aus einem nutzlosen Zyklus, einem Substratzyklus, einem Galactosidasezyklus, einem Citronensäurezyklus, oder dem Tricarbonsäurezyklus, einem Malat/Isocitratzyklus, einem gekoppelten Oxidations-Reduktionszyklus wie z.B. die Umwadlung von alpha-Ketoglutarat zu Glutamat und Phosphogluconat, einer zyklischen Phosphorylierung, Glykolyse, einschließlich der Kinase-Phosphatase-Zyklen oder einer Kombination daraus ausgewählt ist. Gemäß diesem Verfahren werden ein oder mehrere Bestandteile des biologischen Zyklus für das Sterilisationsverfahren verwendet, worauf die übrigen Bestandteile des Zyklus zugegeben werden, um den Zyklus zu starten. Die Inaktivierung eines einzelnen Bestandteils hemmt die Vervollständigung des Zyklus und die Erzeugung einer deutlichen Menge des Produkts, wodurch angezeigt wird, dass das Sterilisationsverfahren erfolgreich durchgeführt wurde.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf ein biologisches Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens gerichtet, wie es vorstehend beschrieben wird, in dem das interaktive System ein enzymatisches Amplifikationssystem wie z.B. eine Fibrin/Gerinnungskaskade, eine Komplementkaskade, eine Trypsin/Trypsinogenkaskade oder eine Kombination davon umfasst. Die Enzyme selber werden nach der Inkubation mit dem Substrat linear oder logarithmisch amplifiziert, wodurch ein schneller Aufbau des enzymmodifizierten Substrats oder des Produkts erfolgt, das leicht nachweisbar ist.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf ein zweistufiges Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens gerichtet. Das Verfahren umfasst:

a) Platzieren eines Testindikators, der einen oder mehrere Bestandteile einer Vielzahl interaktiver Enzymsysteme und eine Probe von Mikroorganismen enthält, in eine Sterilisationskammer;
b) Durchführen des Sterilisationsverfahrens innerhalb der Kammer;
c) Entfernen des Testindikators aus der Kammer;
d) Hinzufügen der restlichen Bestandteile der Vielzahl der interaktiven Enzymsysteme zu den ein oder mehreren Komponenten in dem Testindikator, um eine Mischung zu bilden; und Hinzufügen eines flüssigen Mediums zu der Probe der Mikroorganismen, um eine Kultur zu bilden;
e) Inkubieren der Mischung für eine erste Zeitspanne, die ausreicht, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Produktes nachzuweisen, um in einem ersten Schritt eine Bestimmung der Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens durchzuführen; und
f) Inkubieren der Kultur für eine zweite Zeitspanne, die ausreicht, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines metabolischen Produkts der Probe von Mikroorganismen nachzuweisen, um in einem zweiten Schritt ein Bestimmung der Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens durchzuführen.

In diesem zweistufigen Verfahren kann eine sehr schnelle anfängliche Bestimmung der Sterilität durchgeführt werden, gefolgt von einer Überprüfung in einem zweiten Schritt, die das tatsächliche Züchten der durch die Sterilisation behandelten, biologisch relevanten Mikroorganismen umfasst.
Es wird ebenfalls zur Verfügung gestellt:
Ein Mikroorganismus-freies Verfahren zum Bestimmen einer Überlebensfähigkeit eines Mikroorganismus in einer sterilisierenden Umgebung umfassend die aufeinanderfolgenden Schritte:

a) Inkontaktbringen eines oder mehrere Bestandteile einer Vielzahl interaktiver Enzymsysteme mit einer sterilisierenden Umgebung;
b) Hinzufügen der restlichen Bestandteile der Vielzahl der interaktiven Enzymsysteme zu dem einen oder mehreren Bestandteilen, die der sterilisierenden Umgebung unterworfen wurden; und
c) Nachweisen der Aktivität der Vielzahl der interaktiven Enzymsysteme zum Bestimmen der Überlebensfähigkeit des Mikroorganismus in der sterilisierenden Umgebung.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf einen Testindikator zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens gerichtet, der ein äußeres Gehäuse umfasst mit Wänden, die impermeabel für Flüssigkeiten sind und kein Gas absorbieren, mindestens eine Öffnung in den Wänden des äußeren Gehäuses, die mit einer gasleitenden Bespannung bedeckt sind, wobei die mindestens eine Öffnung in eine Kammer führt, die eine Vielzahl interaktiver Enzymsysteme enthält, die frei von Mikroorganismen sind, wobei eine gasleitende Barriere zwischen den Enzymsystemen und der mindestens einen Öffnung besteht. Diese Komponenten können auf einem festen Träger befestigt sein, der in einer nichtwässrigen oder teilweise wässrigen Lösung frei schwebt. Die Testindikatoren können vollständig abgeschlossen sein, wobei der Benutzer nach der Sterilisation einfach dafür sorgt, dass die zwei Glasfläschchen innerhalb des Indikators ihre Inhalte mischen, wobei das eine einige Komponenten und das andere die übrigen Komponenten des Enzymsystems enthält. Falls eine Enzymaktivität vorhanden ist, werden die Enzyme plus jedes der notwendigen Coenzyme, Cofaktoren und Katalysatoren mit dem Substrat interagieren, wobei ein nachweisbares Produkt erzeugt wird, das untersucht werden kann, um die Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens zu bestimmen.
Andere Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung werden teilweise in der nachfolgenden Beschreibung dargestellt und teilweise werden sie von dieser Beschreibung offensichtlich sein oder sie werden durch die Anwendung der Erfindung in Erfahrung gebracht werden.
Beschreibung der Zeichnungen
1. Allgemeine schematische Darstellung der Enzyminteraktion und der Farbentwicklung auf einer Cellulosescheibe.
2. Spezifische schematische Darstellung einer Zwei-Enzym-Interaktion der Alkoholdehydrogenase/Diaphorase und des enzymmodifizierten Produkts, einer Verbindung, die als ein Ergebnis einer enzymkatalysierten Reaktion erzeugt wird, einer Farbentwicklung auf einer Cellulosescheibe.
3. Spezifische schematische Darstellung einer Drei-Enzym-Interaktion der alkalischen Phosphatase/Alkoholdehydrogenase/Diaphorase und einer Farbentwicklung auf einer Cellulosescheibe
4. Spezifische schematische Darstellung eines einzelnen Enzyms (alkalische Phosphatase) auf einem Scheibenmodell mit einer zusätzlichen Enzyminteraktion (Alkoholdehydrogenase) nach der Sterilisation zur Amplifikation und einer Farbentwicklung auf einer Cellulosescheibe.
5. Vergleich der Hitzestabilität und des Ausmaßes der Reaktion einer einzelnen Komponente (Enzym), die immobilisiert ist, gegenüber einer Vielzahl von Komponenten (Enzymen), die auf Scheiben immobilisiert sind.
6. Diagramm der Gehäusekonstruktion.
7. Diagramm der bevorzugten Bedienung eines Gehäuses mit einer Vielzahl von Komponenten.
8. Photographie von Probenscheiben mit errechneten Farbintensitäten.
9. Beziehung des vielfachen Enzymsystems zu der Inaktivierung von lebensfähigen Sporen von Bacillus stearothermophilus.
10. Diagramm eines geschichteten festen Trägers.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung überwindet die Probleme und Nachteile, die mit den derzeitigen Strategien und Entwicklungen verbunden sind, und stellt neue Verfahren und Apparate für die Bestimmung der mikrobiellen Sterilität zur Verfügung. Lebende Organismen wie z.B. bakterielle Sporen wurden im Allgemeinen als Indikatoren verwendet, um die Sterilisationsverfahren zu testen, um zu zeigen, dass die Bedingungen ausreichend sind, um wirksam alles mögliche Leben innerhalb eines definierten Bereichs zu zerstören. Mit traditionellen Sterilitätsindikatoren, die lebende Sporen enthalten, kann die Lebensfähigkeit der Sporen nicht in einem signifikantem Maß der Präzision bestimmt werden. Die Bedingungen variieren während der Herstellung, des Transports, der Lagerung und der Verwendung stark. Die Lebensfähigkeit der Sporen unter diesen inkonstanten Bedingungen ist nicht genau berechenbar. Es existieren einfach zu viele Variable, die berücksichtigt werden müssen, und die Anforderungen für die Schwankungen, zumindest für die wenigen, die klar definierbar sind, sind so unterschiedlich wie die genetischen Zusammensetzungen der Sporen selber.
Wenn die bakteriellen Sporen als Netzwerke von interagierenden Enzymsystemen, die von einer Zellwand umgeben sind, betrachtet werden können, dann sollten bestimmte Enzymsysteme innerhalb der Spore ebenfalls inaktiviert sein, wenn die bakteriellen Sporen die Lebensfähigkeit aufgrund der Sterilisation verlieren. Dementsprechend kann es möglich sein, interaktive Enzymsysteme anstelle von Sporen zu verwenden, um zu bestimmen, ob die Sterilisationsbedingungen getroffen wurden. Solche Verfahren sollten den FDA-Standards für biologischen Sterilitätsindikatoren entsprechen, würden hocheffizient sein, leicht zu standardisieren und einfach zu verwenden, wobei es Personen mit nur einer minimalen Ausbildung ermöglicht wird, verlässliche Ergebnisse ohne die Hilfe von spezialisierten Anleitungen, Ausgaben und Ausstattung zu erzielen. Es würde ebenfalls kein Risiko einer mikrobiellen Kontaminierung bestehen, die mit den Testindikatoren selber assoziiert sind, weil keine Sporen oder andere Mikroorganismen in die Kammer eingeführt würden, trotz der Tatsache, dass die Indikatoren die biologisch relevanteste Analyse, die erhältlich ist, zur Verfügung stellen.
Die Erfindung stellt Verfahren und Apparate zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationszyklus auf der Basis der Gewinnung der Aktivität von mehreren interaktiven mikrobiologisch abgeleiteten Enzymsystemen zur Verfügung. Unter Verwendung der Verfahren der Erfindung wird die Bestätigung der Sterilität durch die Vervollständigung der Testergebnisse bestimmt, die überraschenderweise sehr schnell erzielt werden können, weil die Verlässlichkeit der herkömmlichen biologischen Indikatoren mit der Geschwindigkeit von Techniken kombiniert wird, die ähnlicher zu denen sind, die für enzymatische und chemische Indikatoren verwendet werden. Des weiteren wird die Lebensfähigkeit im Gegensatz zu Sporen, Enzymsystemen, die Enzyme, Coenzyme, Katalysatoren, Substrate oder andere Reagenzien eines interaktiven Systems enthalten, als Stabilität bestimmt und die Stabilität kann individuell sowie in mehreren Enzymsystemen sehr genau quantifiziert werden. Unter Verwendung von interaktiven Enzymsystemen wird daher nicht nur die Geschwindigkeit erhöht, sondern es kann auch ein Maß der Standardisierung erreicht werden, das dem deutlich überlegen ist, der mit herkömmlichen biologischen oder anderen enzymatischen Techniken erhalten wird.
Die Erfindung stellt eine Bestätigung des Sterilisationsverfahrens in weniger als 60 Minuten zur Verfügung, vorzugsweise in weniger als in etwa 5–15 Minuten und am stärksten bevorzugt in weniger als etwa 1 Minute. Dieses erhöht deutlich die allgemeine Wirksamkeit und Sicherheit des Betriebs von Einrichtungen der Gesundheitsfürsorge durch die Bestätigung der Sterilität vor der Verwendung der behandelten Gegenstände. Die Erfindung beinhaltet den schnellen Nachweis von jeder überlebenden interaktiven enzymatischen Aktivität, die direkt die statistische Wahrscheinlichkeit von überlebenden biologischen Sporen oder anderen Mikroorganismen in einer Testprobe betrifft. Interaktive Enzymsysteme umfassen Gruppen oder Sammlungen von Enzymen einschließlich Coenzymen, Cofaktoren, Katalysatoren, Substraten und jedem anderen notwendigen Reagenz. Die Interaktivität der Gruppe ist grundlegend unterschiedlich von jeder einzelnen Aktivität oder von jeder Kombination der einzelnen Aktivitäten, weil es überraschenderweise eine viel genauere Spiegelung des biologischen Verfahrens ohne eine Notwendigkeit für lebende Mikroorganismen zur Verfügung stellt. Des weiteren ermöglicht es eine erhöhte Flexibilität in Bezug auf verschiedene Sterilisierungstechniken, stellt eine Sterilitätssicherung zur Verfügung, die mit herkömmlichen Techniken nicht erreichbar ist, und stellt einen größeren Bereich der Sterilitätssicherung für unterschiedliche Mikroorganismen zur Verfügung. Bestimmte hitzestabile organische Moleküle, die in einer lockeren Assoziation mit einem Enzym gefunden werden, werden zum Beispiel häufig für eine Enzymreaktion benötigt, damit diese fortschreitet, und sie werden für die Funktionsfähigkeit von anderen Enzymen in der Gruppe benötigt. Die Inaktivierung dieser Moleküle, die nicht notwendigerweise der Inaktivität eines isolierten Enzyms entspricht, korreliert dagegen mit der Sterilität.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren die Durchführung eines Sterilisationsverfahrens mit mindestens einem und vorzugsweise mehreren Komponenten eines Enzymsystems. Das Enzymsystem umfasst ein bekanntes Gemisch von Enzymen, Coenzymen, Katalysatoren, Cofaktoren, Substraten, anderen Reaktionsreagenzien oder Kombinationen davon, das in einem Testindikator untergebracht ist, vorzugsweise in einem nichtwässrigen oder nur teilweise wässrigen Medium. Die Komponenten besitzen eine voneinander abhängige Aktivität, die der Lebensfähigkeit der Mikroorganismen entspricht, die in hochmodernen biologischen Indikatoren verwendet werden. Nach der Beendigung des Sterilisationsverfahrens wird der Testindikator, falls notwendig, aus der Sterilisationskammer entfernt und man lässt ihn mit einem spezifischen Gemisch von Indikatorreagenzien, den verbleibenden Komponenten des Systems, reagieren. Ein positives Ergebnis wird nur beobachtet, wenn jede in Kontakt gebrachte Komponente eine Denaturierung überlebt und in der Lage ist, interaktiv zu wirken, um ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt herzustellen. Das enzymmodifizierte Produkt ist als ein Indikator einer Restaktivität innerhalb von 1 bis 60 Minuten visuell nachweisbar. Jede nachweisbare Veränderung, die vorzugsweise eine Farbveränderung ist, ist für einen Beobachter ein Anzeichen, dass der Sterilisationszyklus bestimmte Komponenten nicht inaktiviert hat und daher nicht ausreichend war, um eine Sterilisation der anderen Gegenstände während des Sterilisationsverfahrens sicherzustellen. Umgekehrt weist die Abwesenheit einer Farbveränderung darauf hin, dass das Sterilisationsverfahren mindestens eine der Komponenten inaktiviert hat, wodurch verhindert wurde, dass die interaktive Reaktion stattfand, und ist ein Äquivalent eines schnellen und direkten Nachweises der Überlebensfähigkeit von bakteriellen Sporen in einem ähnlichen herkömmlichen Test. Mit anderen Worten, die Abwesenheit eines nachweisbaren enzymmodifizierten Produkts innerhalb der etablierten Zeitspanne weist auf einen Sterilisationszyklus hin, der für die Funktion des interaktiven Enzymsystems sowie für eine lebensfähige Population von 10⁶ Sporen von Bacillus stearothermophilus letal war. Im Allgemeinen werden diese Werte als D-Werte ausgedrückt, welche die Zeitspannen sind, die für eine bestimmte Temperatur genommen werden, um die lebensfähige Population der Testmikroorganismen auf zehn Prozent des ursprünglichen Wertes zu vermindern.
Das Sterilisationsverfahren, das bei der Anwendung der Erfindung nützlich ist, kann zum Beispiel ein Dampfdruckverfahren oder Autoklavieren, ein chemisches Verfahren unter Verwendung von Ethylenoxid oder einer anderen geeigneten letalen Chemikalie, ein Trockenhitzeverfahren mit Temperaturen zwischen etwa 50°C und etwa 200°C und ein Bestrahlungsverfahren, einschließlich Gamma-, Beta- und anderer Art von Strahlung sein. Diese Verfahren werden in Gesundheitsfürsorgeeinrichtungen durchgeführt, aber auch in Industrien, die mit Umwelttechnologie, Herstellung von Nahrungsmittel, Abfallentsorgung und mit solchen Technologien zu tun haben, bei denen eine absolute oder eine fast absolute Sterilität benötigt wird.
Der Testindikator, der mindestens eine und vorzugsweise eine Sammlung von Komponenten eines definierten Enzymsystems auf einem festen Träger oder in Lösung enthält, wird in eine Sterilisationskammer platziert. Das Sterilisationsverfahren wird innerhalb der Kammer durchgeführt und, falls notwendig, wird der Indikator aus der Kammer entfernt und die verbleibenden Komponenten des Systems werden zu dem Indikator zugegeben, um ein Gemisch zu erzeugen. Das Gemisch wird anschließend für eine Zeitspanne inkubiert, die ausreichend ist, um eine Erzeugung des Produkts durch die Interaktion der Enzyme mit dem Substrat zu ermöglichen. Unter Verwendung von durch Radioaktivität, enzymatischer, elektrischer oder fluorometrischer Aktivität oder durch eine andere Art nachweisbar markierten Substraten wird das Produkt nachgewiesen, wobei herkömmliche Techniken verwendet werden, um die Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens zu bestimmen. Gemäß diesem Verfahren wird die biologische Interaktion nur stattfinden, wenn die Komponente(n), die dem Sterilisationsverfahren unterworfen wird/werden, nicht zerstört oder auf irgendeine Weise inaktiviert wird/werden. Die Beziehung zwischen den Komponenten ist für die Bestimmung der Sterilität sehr wichtig, weil es sich nicht einfach um eine chemische oder enzymatische Reaktion handelt, sondern um eine Enzyminteraktion, die das mutmaßliche physiologische Stadium der Mikroorganismen innerhalb der Kammer widerspiegelt.
Die Fähigkeit der Verfahren der Erfindung, schnell die Wirksamkeit eines Sterilisationszyklus zu bestimmen, basiert auf der Entdeckung, dass das Überleben der funktionellen Fähigkeit eines Enzymsystems für die Herstellung eines enzymmodifiziertem Produkts notwendig ist. Die Schnelligkeit der Erzeugung des enzymmodifizierten Produkts durch die interagierenden Enzyme ist zumindest teilweise durch die Coimmobilisierung begründet, bei der die große Nähe von zwei oder von mehreren Komponenten des Enzymsystems auf einem gemeinsamen festen Träger bedingt, dass der durch Diffusion kontrollierte Austausch mit der Hauptmenge der Lösung begrenzt ist. Dieses Verfahren wird des weiteren durch das Einschleusen der Komponenten oder das Zusammenbringen von zwei oder mehreren Komponenten von aufeinanderfolgenden Reaktionen an einer Oberfläche oder in einer Mikroumgebung unterstützt, um weiter den durch Diffusion kontrollierten Austausch mit der Hauptmenge der Lösung zu begrenzen. Das Einschleusen von Komponenten mit Bezug auf die Enzyme wird in I. Gibbons et al. (Meth Enzymol 136:93–103, 1987) beschrieben.
Die Fähigkeit der Komponenten eines Enzymsystems, Bedingungen zu überleben, die nur teilweise Testmikroorganismen töten, ist von der Verwendung einer semipermeablen, hydrophoben Barriere zwischen dem sterilisierenden Mittel und den Enzymen abhängig und davon, dass das interaktive Enzymsystem nach dem Sterilisierungszyklus, der unzureichend ist, um die Testmikroorganismen zu töten, aktiv bleiben wird. Dies stellt eine direkte Korrelation der Lebensfähigkeit der Sporen und der interaktiven Aktivität der Enzyme des Systems bereit, das nach einem unzureichenden Sterilisationszyklus ausreichend ist, um ein Substratsystem für diese Enzyme in eine visuell nachweisbare Konzentration eines Produkts innerhalb einer relativ kurzen Zeitspanne, vorzugsweise 1 bis 60 Minuten, umzuwandeln. Die Grundlage für diese Korrelation zwischen der Aktivität der Enzyme und anderen Komponenten und der Keimung und dem Wachstum der Mikroorganismen ist von der Gemeinsamkeit von beiden in ihrer Verlässlichkeit auf die Funktion von Systemen von biologisch abgeleiteten, interagierenden Enzymen und Coenzymen abhängig. Typischerweise ist das Überleben der Enzyme vor der Sterilisation in einem nichtwässrigen Medium optimal. Das nichtwässrige Medium verstärkt die Stabilität und erzeugt ebenfalls eine halbdurchlässige, zeitabhängige Barriere zu dem sterilisierenden Mittel.
Der Sterilitätsindikator zeigt, dass es eine direkte Korrelation zwischen den Bedingungen, einen Mikroorganismus zu töten, und den Bedingungen, eine Komponente eines Netzwerks von interagierenden Enzymen zu inaktivieren, gibt. In dem Fall eines Systems der Amplifikation von interaktiven Enzymen wird keine Farbveränderung stattfinden, wenn eine Indikatorlösung zugegeben wird, wenn eines der Schlüsselenzyme, Coenzyme, Cofaktoren, Substrate, Katalysatoren oder anderen Bestandteilen der Reaktion des Systems vollständig inaktiviert wird.
Die Enzyme, die in der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind Enzyme, die extrazelluläre und intrazelluläre mikrobiologische Enzyme einschließen, deren voneinander abhängigen Aktivitäten mit der Keimung und dem Wachstum von Mikroorganismen korrelieren, die typischerweise in derzeitigen hochmodernen biologischen Sterilitätsindikatoren, künftig als Testmikroorganismen bezeichnet, verwendet werden. Mit dem Ausdruck "korrelieren" ist gemeint, dass die enzymatische Interaktion verwendet werden kann, um ein zukünftiges Wachstum von den restlichen lebensfähigen Mikroorganismen nach einer unvollständigen, unzureichenden oder erfolglosen Sterilisation vorherzusagen. Die Bestandteile sind solche, die nach einem unzureichenden Sterilisationszyklus, der subletal für die Testmikroorganismen ist, ausreichend aktiv bleiben, um mit den verbleibenden Bestandteilen eines Enzymsystems zu reagieren, um ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt innerhalb von 1 bis 60 Minuten herzustellen, die aber nach dem Kontakt mit einem sterilisierenden Mittel, das letal für die Mikroorganismen sein würde, inaktiviert sind. Vorzugsweise würde dieses Produkt visuell nachweisbar sein. Beispiele von interaktiven Enzymen schließen nahezu jede Kombination von im Allgemeinen einer Synthase und Catabolase wie z.B. Transferasen und Epimerasen; Phosphatasen und Kinasen oder Phosphorylasen; Dehydrogenasen und Hydrogenasen oder Diaphorasen; Oxidasen und Desoxidasen; Esterasen oder Diesterasen und Polymerasen; Phosphatasen, Dehydrogenasen und Diaphorasen; Dehydrogenasen und Reduktasen und Dehydrogenase und Oxidoreduktasen ein. Diese Enzyme katalysieren die gegenseitige Umwandlung von einem oder von mehreren Substraten und liegen im Allgemeinen assoziiert mit einem Coenzym oder einem Cofaktor vor.
Beispiele von Coenzymen und Cofaktoren, die für die Erfindung nützlich sind, schließen Nicotinamidadenindinucleotid (NAD), NADH, NADP, NADPH, Acetyl, Biotin, Coenzym-A (CoA), Komponenten des Komplementsystems, Thiaminpyrophosphat (TPP), Pyridoxalphosphat, Cobamid, Tetrahydrofolat, Flavin und Häm ein. Diese Coenzyme katalysieren den Transfer von Acylgruppen (CoA), den Transfer von Gruppen, die von einem Keton (TPP) abgeleitet sind, den Transfer von CO₂ (Biotin), die Transaminierung, die Decarboxylierung und Racemisierung von Aminosäuren (Pyridoxylphosphat), die Transfers einer Kohlenstoffgruppe und die Reduktionen (Tetrahydrofolat) und die Transfers einer Methylgruppe (Cobamid) ein. Redoxreaktionen spielen ebenfalls eine wichtige Rolle in dem biologischem Metabolismus und ihre assoziierten Cofaktoren schließen in der Ordnung ihres abnehmenden Potenzials Ferredoxin, Liponsäure, NAD und NADP, Flavine und Häme ein. Flavine in Flavoproteinen und Häme in Cytochromen sind fest an Proteine gebunden und funktionieren eher als prosthetische Gruppen als als streng definierte Cofaktoren. Zusätzliche Katalysatoren können ebenfalls notwendige Bestandteile eines Enzymsystems sein. Beispiele von typischen Katalysatoren schließen Metallanionen oder -kationen, andere einzelne Elemente oder bestimmte Komplexsubstanzen wie z.B. ein Polysaccharidpolymer, ein Lipid oder eine Fettsäure, eine Membran oder eine inerte Substanz ein. Bestandteile, die Substrate sind, schließen zum Beispiel Saccharide oder Polysaccharide, Nucleinsäuren oder Nucleotide, Chemikalien oder chemische Verbindungen, Fettsäuren, Aminosäuren oder Peptide oder andere stärker spezialisierte Substrate wie z.B. Diphenyltetrazoliumbromid, Phenyltetrazolium-Violett und Ditetrazoliumchlorid, die visuell nachweisbar sind, ein. Die Bestandteile können unter der Verwendung von markierten Substraten nachgewiesen werden, die in identifizierbare Produkte umgewandelt werden, wobei Markierungen wie z.B. eine chromogene Substanz, eine fluoreszierende Substanz, ein lumineszierende Substanz, eine räumliche Chemikalie, eine metallische Substanz, ein stabiles Isotop oder ein radioaktives Isotop verwendet werden. Jedes dieser Bestandteile, unabhängig davon, ob es sich um Enzyme, Coenzyme, Katalysatoren oder Substrate eines Enzymsystems handelt, kann einem Sterilisationsverfahren unterworfen werden, wie hierin beschrieben wird, um eine Sterilität in einem stärker biologisch relevanten Verfahren zu bestätigen, als es zur Zeit erhältlich ist.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf ein biologisches Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens gerichtet, wie vorstehend beschrieben wurde, wobei die Bestandteile eines interaktiven Enzymsystems einen interaktiven Zyklus wie z.B. einen Fructosezyklus (in dem Fructose-6-phosphat in Fructose-1,6-diphosphat durch die Wirkung von Kinasen und Phosphatasen als Zwischenprodukt umgewandet wird), die Glykolyse einschließlich der Kinase/Phosphatasezyklen, den Galactosidasezyklus (in dem Galactose-1-phosphat in Glucose-1-phosphat durch die Wirkung von Uridyltransferasen und Epimerasen als Zwischenprodukt umgewandelt wird), einen Substratzyklus oder einen nutzlosen Zyklus (ein enzymatische Zyklus, der so gut wie nichts außer der Spaltung eines Nucleotidtriphosphat (NTP) in ein Nucleotiddiphosphat (NDP) wie z.B. ATP in ADP oder GTP in GDP durch die Wirkung von Kinasen und Phosphatasen erreicht), den Citronensäurezyklus oder den Tricarboxylsäurezyklus (in dem ein Pyruvat in Oxalessigsäure in einem vielstufigen Verfahren, das Phosphatasen, Kinasen, Epimerasen, Phosphorylasen und Transferasen beinhaltet, als Zwischenprodukt umgewandelt wird), eine zyklische Phosphorylierung, einen Malat/Isocitratzyklus, einen gekoppelten Oxidations-Reduktionszyklus (in dem Oxidasen und Reduktasen bestimmte Elektronen einer Verbindung zufügen oder von ihr entfernen) wie z.B. die Umwandlung von Alpha-Ketoglutarat zu Glutamat und 6-Phosphogluconat oder Kombinationen davon umfassen. Diese und andere Zyklen werden in den meisten biochemischen Lehrbüchern wie z.B. Biochemistry, 3. Ausg. (L Stryer, Hrsg., WH Freeman und Co., NY, 1988) und Biochemistry (DE Metzler, Hrsg., Academic Press, NY, 1977) beschrieben.
Gemäß diesem Verfahren wird/werden die Komponente(n) eines enzymatischen biologischen Zyklus dem Sterilisationsverfahren unterworfen. Die Inaktivierung der Komponente(n) hemmt die Vollendung des Zyklus und die Erzeugung einer signifikanten Menge des Produkts, wodurch angezeigt wird, dass das Sterilisationsverfahren erfolgreich abgeschlossen wurde. Die Schnelligkeit und die Sensitivität des Nachweises der enzymatischen Aktivität beruht auf der Erzeugung des enzymmodifizierten Produkts von einem Netzwerk von interagierenden Bestandteilen des Enzymsystems wie z.B. durch einen Enzymzyklus. Der Enzymzyklus ist die gegenseitige Abhängigkeit von mehreren Enzymen von der gegenseitigen Umwandlung von Coenzymen zwischen den Enzymen, so dass die zwei Enzyme einen Umwandlungszyklus einer Zwischenstufe, mit zwei Formen erzeugen. Dieses Netzwerk kann die kontinuierliche gegenseitige Umwandlung von Coenzymen zwischen den interaktiven Enzymen wie zum Beispiel die gegenseitige Umwandlung des reduzierten Acetyl-Coenzym A (Ac-CoA) zu dem oxidierten Ac- CoA, von NAD oder NADP zu NADH bzw. NADPH oder NTP zu NDP umfassen. Der Zyklus kann das Substrat, ein assoziiertes Coenzym oder die Enzyme selber einschließen und er kann direkt zu der Schnelligkeit, mit der die Ergebnisse erhalten werden, beitragen.
In 2 werden zum Beispiel die alkalische Dehydrogenase und Diaphorase auf einer Cellulosescheibe immobilisiert. Die zwei Enzyme erzeugen einen Umwandlungszyklus eines Zwischenprodukts, das zwei Formen besitzt – NAD ⇔ NADH. Die Alkoholdehydrogenase katalysiert die Umwandlung von Ethanol in Acetaldehyd mit der Hilfe eines Coenzyms, Nicotinamidadenindinucleotid (NAD), das ebenfalls in NADH umgewandelt wird. Die Diaphorase wandelt Iodonitrotetrazolium (INT) in Formazan um, während sie ebenfalls NADH wieder in NAD umwandelt. Diese zwei Enzyme werden auf einem festen Träger coimmobilisiert, der einem Sterilisationszyklus unterworfen wird, wonach NAD, Ethanol und INT zugegeben werden, um ein vollständiges Enzymsystem zu erzeugen. Das Überleben und die erfolgreiche Interaktion von allen interaktiven Enzymen des Testindikators ist für die Herstellung eines visuell nachweisbaren enzymmodifizierten Produkts notwendig. In diesem Fall werden Acetaldehyd und Formazan, eine reduzierte Form eines Tetrazolium-Farbstoffs, der im sichtbaren Bereich stark absorbiert, erzeugt und leicht nachgewiesen.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf ein Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens gerichtet, das die Schritte umfasst, wie vorstehend beschrieben wurde, in dem das Enzymsystem ein System zur Amplifikation umfasst. Systeme zur Amplifikation erhöhen die Menge des Produkts, das in der Art einer Kaskade erzeugt wird. Die Enzyme eines Systems zur Amplifikation werden ebenfalls in den meisten biochemischen Lehrbüchern wie z.B. Enzymes, 3. Ausg. (M Dixon und EC Webb, Hrsg., Academic Press, NY, 1979) beschrieben. Die Enzyme können ebenfalls so sein, dass der visuelle Nachweis des enzymmodifizierten Produkts von dem Überleben aller unterschiedlichen Enzyme abhängig ist. Einige natürliche Verfahren werden durch enzymatische Systeme der Amplifikation kontrolliert (DL Bates, Annales De Biologie Clinique 47:527–32, 1989). Die Fibrin/Gerinnungskaskade, die Trypsin/Trypsinogenkaskade, die Komplementkaskade und die Kinase/Phosphatasezyklen der Glykolyse sind Beispiele einer enzymatischen Amplifikation.
In einem enzymatischen Zyklus der Amplifikation wird das Produkt des einen Schritts anschließend als ein Katalysator des nächsten Schritts verwendet. Ein Zwei Enzyme-Scheibensystem umfassend Trypsin und Chymotrypsin wäre ein typisches Beispiel. Chymotrypsin wird auf einem festen Träger zugegeben und einem Sterilisationszyklus unterworfen. Trypsin plus Substrat würden zu dem Chymotrypsin nach der Beendigung des Zyklus zugegeben, welches die Umwandlung des Substrats in das Produkt und ebenfalls die Umwandlung von Chymotrypsin in Trypsin katalysiert. Unter der Annahme, dass das Chymotrypsin nicht inaktiviert wurde, kann dementsprechend von einer sehr geringen Menge an Trypsin in einer sehr kurzen Zeitspanne eine große Menge des durch Trypsin umgeformten Produkts erzeugt werden. Umgekehrt können Trypsin, Substrat oder Coenzym dem Sterilisationszyklus unterworfen werden und Chymotrypsin wird anschließend zugegeben, um ein anderes Verfahren des Nachweises durch die enzymatische Amplifikation zur Verfügung zu stellen.
Im Allgemeinen ist es in einem interaktiven Enzymsystem üblicherweise nicht notwendig, mehr als eine der anwesenden Komponenten zu inaktivieren, um zu verhindern, dass das Reaktionsprodukt erzeugt wird. Enzyme, von denen gezeigt wurde, dass sie die vorstehend beschriebenen Anforderungen erfüllen, sind solche, die von der Oxidation oder Reduktion der Coenzyme NAD, NADH, NADP und NADPH abhängig sind. Die zwingend erforderliche Natur der gegenseitigen Abhängigkeit durch die Umwandlung zwischen den reduzierten und oxidierten Formen dieser Coenzyme schreibt vor, dass die Enzyme in Paaren auftreten, bei denen das erste Enzym die Oxidation der reduzierten Form des Coenzyms benötigt und das zweite Enzym die Reduktion der oxidierten Form des Coenzyms benötigt. Solche Systeme der Enzyme schließen die Alkoholdehydrogenase und die Cytochromreduktase (EC 1.6.99.3), die Glutamatdehydrogenase und die NAD(P)-Oxidoreduktase (EC 1.4.1.3) und die Glucose-6-Phosphatdehydrogenase und die NADP-1-Oxidoreduktase (EC 1.1.1.49) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein Enzymsystem kann entweder die oxidierte oder die reduzierte Form von einem der vorstehend erwähnten Coenzymen, ein chromogenes Substrat (ein Enzymsubstrat, das als ein Ergebnis einer enzymatischen Reaktion in ein visuell nachweisbares, farbiges, enzymmodifiziertes Produkt umgeformt wird), das, wenn eines der Enzyme darauf wirkt, in ein visuell nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt umgewandelt wird, jedes andere Enzymsubstrat, das für die Aufrechterhaltung dieses enzymatisch gekoppelten Oxidations-Reduktionszyklus notwendig ist, und ein gepuffertes Lösungsmittel enthalten.
Wenn zum Beispiel die Bestandteile des Substratsystems insgesamt oder teilweise in die Indikatorvorrichtung eingeschlossen werden müssen, werden die eingeschlossenen Bestandteile während der Sterilisation nicht spontan abgebaut oder in ein nachweisbares Produkt umgeformt. Die visuelle Darstellung von NAD(P)-abhängigen Reaktionen kann erreicht werden, indem ein Substrat-Wasserstoff-Empfänger in dem Substratsystem zur Verfügung gestellt wird, der, während man die erneute Oxidation von NAD(P)H ermöglicht, in eine reduzierte Form umgeformt wird, die dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Verschiebung der wahrnehmbaren Farbe erfolgt. Die bevorzugten chromogenen Substrate sind Tetrazoliumsalze, die farblos oder nur schwach gefärbt sind und die durch eine enzymatische Reduktion in intensiv gefärbte Formazane umgeformt werden. Einige Beispiele dieser chromogenen Substrate schließen 3-(4',5'-Dimethylthiazol-2-yl)-2,4-diphenyltetrazoliumbromid; 2-(p-Iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium-Violett; 2,2',5,5'-Tetra-(p-nitrophenyl)-3,3,(3-dimethoxy-4-diphenylen)-ditetrazoliumchlorid und 2,2'-Di-(p-nitrophenyl)-5,5'-diphenyl-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-diphenylen)-ditetrazoliumchlorid ein.
Die Verlässlichkeit auf den Zyklus der Coenzyme, wie z.B. der Zyklus eines NAD-abhängigen Enzyms, ist ein Merkmal von einer Ausführungsform der Erfindung. Das Verbinden des Enzymnachweises mit den sich wiederholenden Redoxzyklen ermöglicht eine Steigerung bei der Sensitivität des überlebenden Enzyms um mehrere Größenordnungen (C Self, J Immunol Methods 76:389–93, 1985). In der vorliegenden Erfindung ist der Enzymzyklus eine bestimmte Form der Signalverstärkung, was die Zeitspanne um mehrere Größenordnungen verringert, die für eine visuelle Farbentwicklung benötigt wird. Das Einschließen eines NAD-abhängigen, interaktiven Systems mit mehreren Enzymen umfasst eine neue Verwendung für die Bestimmung der Sterilität, welches die Nützlichkeit und die Schnelligkeit der derzeitigen hochmodernen Verfahren deutlich verbessert.
Die Konzentration der Enzyme und der Enzymsubstrate sind von der Identität des bestimmten Substrats, des Enzymsystems, der Menge des enzymmodifiziertem Produkts, das hergestellt wird, um visuell nachweisbar zu sein, und dem Zeitraum abhängig, den man gewillt ist zu warten, um zu bestimmen, ob aktive Enzyme in dem Reaktionsgemisch vorhanden sind. Der Zeitraum, der benötigt wird, um eine visuell nachweisbare Farbe zu erzeugen, ist ebenfalls eine Funktion der räumlichen Nähe der interagierenden Enzyme zueinander. Die Anordnung der Enzyme, die aufeinanderfolgende, zyklische Reaktionen katalysieren, auf einer Oberfläche oder in einer Mikroumgebung, bei welcher der durch Diffusion kontrollierte Austausch mit der Hauptmenge der Lösung begrenzt ist, wie z.B. bei der Einschleusung von Enzymen, verbessert die Schnelligkeit der Reaktionen und vermindert die Zeitspanne, die für die Erzeugung einer visuell nachweisbaren Farbe notwendig ist.
Dieses Konzept wird für einen allgemeinen Fall in 1 für den Fall von zwei interagierenden Enzymen, Scheibenenzym 1 und Scheibenenzym 2, dargestellt. Die zwei Enzyme werden in diesem Beispiel zusammen auf Cellulosefasern in enger Nachbarschaft immobilisiert, wodurch sie das Einschleusen der Enzyme der aufeinanderfolgenden Reaktionen zeigen, welche das Produkt 1C und das Produkt 2C herstellen. Weil Produkt 2C für die Wiederherstellung des Produkts 1C durch das Scheibenenzym 1 benötigt wird, ist dieses Beispiel ebenfalls eine Darstellung eines Enzymzyklus. Es sollte beachtet werden, dass das Scheibenenzym 1 ebenfalls das Substrat 1A in das Produkt 1B umwandelt. In dem Fall, dass das Scheibenenzym 1 das Produkt 2C benötigt, um die enzymatische Umwandlung von Substrat 1A in Produkt 1B durchzuführen, kann das Produkt 2C als ein Coenzym betrachtet werden. In dem Fall, in dem das Scheibenenzym 2 das Produkt 1C benötigt, um die Umwandlung des Substrats 2A in das Produkt 2B durchzuführen, kann das Produkt 1C gleichermaßen als ein Coenzym für das Scheibenenzym 2 betrachtet werden. Dieses Beispiel stellt ebenfalls die Verwendung eines chromogenen Substrats, Substrat 2A, dar, welches das Scheibenenzym 2 in ein visuell nachweisbares farbiges Produkt 2B umwandelt.
In 2 werden die Alkoholdehydrogenase und die Diaphorase auf einer weißen Cellulosescheibe coimmobilisiert, während sie mit dem sterilisierenden Mittel in Kontakt gebracht werden. In dem nachfolgenden Verfahren nach dem Sterilisieren werden die Enzymsubstrate Ethanol und INT (p-Iodonitrotetrazolium-Violett; 2-[4-4-Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazoliumchlorid) und das Coenzym NAD zu der Hauptmenge der Indikatorlösung zugegeben. DAS NAD ist ein Coenzym für die Umwandlung von Ethanol in Acetaldehyd durch die Alkoholdehydrogenase. In dem Verfahren der durch die Alkoholdehydrogenase katalysierten Reaktion wird NAD in NADH umgewandelt, welches zur rechten Zeit ein Coenzym für die enzymatische Umwandlung von INT in das visuell nachweisbare farbige Produkt, Formazan, durch die Diaphorase wird. Ein zweites Beispiel (3) stellt drei Enzyme dar, die alkalische Phosphatase, die Alkoholdehydrogenase und die Diaphorase, die zusammen auf einer weißen Cellulosescheibe immobilisiert werden, während sie mit dem sterilisierenden Mittel in Kontakt gebracht werden. In dem nachfolgenden Verfahren nach dem Sterilisieren werden die Enzymsubstrate NADP, Ethanol und INT zu der Hauptmenge der Indikatorlösung zugegeben. Jede überlebende alkalische Phosphatase wird das Substrat NADP in das Produkt NAD umwandeln, welches anschließend als ein Coenzym für die vorstehend beschriebenen Reaktionen des Enzymzyklus dient, welches den weißen Träger rot färbt.
Die vielen interagierenden Enzyme oder die anderen Bestandteile können physikalisch getrennt vorliegen, wie in 4 dargestellt wird. In dieser Abbildung wird nur die alkalische Phosphatase auf einer weißen Cellulosescheibe während des Kontakts mit dem sterilisierenden Mittel immobilisiert. In dem nachfolgendem Verfahren nach dem Sterilisieren werden mehrere interagierende Enzyme in der Form von Diaphorase und Alkoholdehydrogenase zusammen mit den benötigten Coenzymen und Enzymsubstraten in die Hauptmenge der Indikatorlösung gegeben. Die enzymatischen Umwandlungen in dieser Ausführungsform sind die gleichen wie solche, bei denen alle drei Enzyme coimmobilisiert werden mit der Ausnahme, dass nur das Überleben von einem Enzym, der alkalischen Phosphatase, dem Überlebensstress in der Form des Kontakts mit einem sterilisierenden Mittel unterworfen wird. In jedem der vorstehenden Beispiele wird das Überleben der Aktivität von allen Enzymen benötigt, um das visuell gefärbte, enzymmodifizierte Produkt, Formazan, zu erzeugen. Wie in 3 gezeigt wird, hat die Coimmobilisierung der drei Enzyme, eine dramatische Steigerung der Schnelligkeit der Erzeugung des Formazans zur Folge, wenn es mit der Immobilisierung des einzelnen Enzyms verglichen wird (4). Dieses Ergebnis wird in 5 graphisch dargestellt, wobei die Hitzestabilität der alkalischen Phosphatase gegenüber der Hitzestabilität der drei Enzyme, die auf einer Scheibe coimmobilisiert sind, verglichen wird. Wie gezeigt wird, wird die vermutete Aktivität des Systems der drei Enzyme, die durch Absorption gemessen wird, schnell und dramatisch vermindert. Das einzelne Enzym beginnt mit einer geringen Aktivität, die langsam abnimmt.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf ein Verfahren gerichtet, das vorstehend beschrieben wird, bei dem ein Inhibitor eines Enzymsystems einer Inaktivierung in einem Sterilisationsverfahren unterworfen wird, und die Bestandteile des Enzymsystems werden anschließend zugegeben, um den Zustand des Inhibitors zu analysieren. Wenn der Inhibitor überlebt hat oder nicht auf eine andere Weise durch das Sterilisationsverfahren zerstört wurde, wird das Enzymsystem nicht funktionieren. Beispiele von solchen Inhibitoren schließen α-Aminooxyessigsäure, die ein allgemeiner Inhibitor von Pyridoxalphosphat-abhängigen Enzymen (Aminosäuretransaminasen und -decarboxylasen) ist, Antabuse, welche die Oxidation von Acetaldehyd durch die Hemmung der Alkoholdehydrogenase hemmt, Flaviansäure, welche die Glutaminase hemmt, Natriumiodessigsäure und Pyrazol, die bestimmte Dehydrogenasen einschließlich der Alkoholdehydrogenasen hemmen, Isopropylhydrazin, welche die Diaminoxidasen hemmt, Parapyruvat, das viele verschiedene Oxidierungsreaktionen hemmt, Oxaminsäure, welche die Milchsäuredehydrogenase hemmt, Phenylmethansulfonylfluorid und Chymostatin, die spezifische. Inhibitoren von Trypsin und Chymotrypsin sind, Weinsäure, die Phosphatasen hemmt, und andere Inhibitoren wie z.B. Tosyllysinchlormethylketon (TICK) und Tosylphenylalaninchlormethylketon (TPCK) ein.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf einen Testindikator zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens gerichtet. In seiner einfachsten Form schließt ein Sterilitätsindikator, der für die Ausübung des Verfahrens der Erfindung nützlich ist, eine Quelle von mehreren interaktiven Enzymen in einem Gehäuse ein, das eine Wand, die impermeabel für eine Flüssigkeit ist und im Wesentlichen kein Gas absorbiert, und mindestens eine Öffnung besitzt, die mit einer gasleitenden Bespannung bedeckt ist, wobei die Öffnung in eine Kammer führt, die ein oder mehrere Bestandteile des interaktiven Enzymsystems mit einer Barriere, die impermeabel für Flüssigkeiten ist, zwischen den Bestandteilen und der Öffnung enthält. Die interagierenden Bestandteile sind in einer großen räumlichen Nähe zu einander lokalisiert, wie z.B. innerhalb der Matrix einer Cellulosefilterscheibe und/oder innerhalb eines definierten Mediums, und sind daher coimmobilisiert. Ein oder mehrere Enzyme, Substrate, Coenzyme oder Katalysatoren können auf der festen Matrix eingeschlossen werden. Innerhalb des Gehäuses ist eine wirksame Menge eines Materials, um die Barriere zu erzeugen, die semipermeabel ist, nicht aber frei oder vollständig permeabel für die Weiterleitung von Flüssigkeiten und Gasen, und die ein wirksames Mittel zur Erhaltung einer begrenzten Entfernung zwischen der semipermeablen Öffnung und den Enzymen ist. Die Barriere kann permeabel oder impermeabel für Flüssigkeiten sein und sie kann ein Stempel oder ein Stopfen sein, aber vorzugsweise ist sie ein Schwamm, der die Wahrscheinlichkeit des Schlupfs vermindert, das manchmal mit Stempeln und Stopfen auftritt. Es wird ebenfalls eine Barriere bevorzugt, die eine Membran ist, die aus einem Polymer wie z.B. einem synthetischen, einem Kunststoff, einem Gummi, Gortex (ein gasdurchlässiges und flüssigkeitsundurchlässiges Polymer) oder einer Kombination davon aufgebaut ist. Eine Gortex-Membran würde impermeabel für Flüssigkeiten sein, wohingegen eine Schwammbarriere semipermeabel für Flüssigkeiten sein würde.
Das definierte Medium kann hydrophil sein, aber es ist vorzugsweise hydrophob, z.B. nichtwässrig, es kann jedoch semipermeabel oder durchlässig für Gase einschließlich eines durch Dampf sterilisierenden Mittels sein. Das Medium kann nichtwässrig sein, wie auch die unmittelbare Umgebung, welche die Bestandteile während der Lagerung vor dem Kontakt zu den sterilisierenden Bedingungen umgibt. Die funktionsfähige Stabilität eines Bestandteils ist im Allgemeinen abhängig von der Erhaltung einer nichtwässrigen Umgebung des Mediums für das Enzym. Die theoretische Grundlage für diese Notwendigkeit ist gut entwickelt (A Zaks et al., J Biol Chem 263:3194–3201, 1987). Das Ausmaß, für das der Bestandteil anfällig für eine Schädigung durch das Sterilisationsverfahren ist, korreliert direkt mit dem Ausmaß, in dem es der Feuchtigkeit in der Form von Dampf ermöglicht wird, mit der Enzymquelle während des Verlaufs des Dampfverfahrens zu interagieren (AM Klibanov, Advances in Applied Microbiology 29:1–28, 1983). Die Komponenten können auf einem festen Träger, wie z.B. einem Träger, der Cellulose, Kunststoffe, Glas, Keramiken, Membrane, Polymere oder Kombinationen davon umfasst, immobilisiert werden. Vorzugsweise ist der feste Träger eine hochkompartimentierte Cellulosescheibe, die in einem wasserfreien Medium suspendiert ist.
Die vorliegende Erfindung ist einzigartig aufgrund der Geschwindigkeit, mit der ein Ergebnis erhalten werden kann, und ebenfalls aufgrund bevorzugter Ausführungsformen, die auf der Grundlage nichtwässriger Systeme beruhen. Der Testindikator verwendet vorzugsweise Mineralöl als das nichtwässrige Medium, das viele Funktionen innerhalb des Systems besitzt. Mineralöl umfasst ein Gemisch von flüssigen Kohlenwasserstoffen, das von Petroleum erhalten wurde, das eine spezifische Schwerkraft von 0,818 und 0,880, eine kinematische Viskosität von nicht mehr als 33,5 Centistokes bei 40°C besitzt und das die Anforderungen für Neutralität, für Substanzen, die leicht zu carbonisieren sind, für eine Grenze für polynukleäre Verbindungen und für ein festes Paraffin, das durch USP XXII festgelegt ist, erfüllt. Das Öl wird verwendet, um die feste Trägerscheibe zu bedecken, auf der die zahlreichen interaktiven Enzyme coimmobilisiert sind, wobei eine nichtwässrige Umgebung zur Verfügung gestellt wird, um die Enzyme zu stabilisieren. Das Öl erzeugt eine Barriere für Wasser und Luft, die schädliche Wirkungen auf die Enzyme während der Lagerung haben könnten. Das Öl wirkt ebenfalls als eine semipermeable Barriere für Dampf, wenn der schnelle enzymatische Indikator mit einem Dampf-Sterilisationszyklus in Kontakt gebracht wird. Durch die Veränderung der Menge des Öls oder der wasserfreien Natur der unmittelbaren Umgebung kann die Menge des Dampfs, welche die Scheibe mit den Enzymen erreicht, präzise kontrolliert werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist auf einen zweistufigen biologischen Indikator zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens gerichtet, der einen Testindikator umfasst, der zwei Fläschchen enthält. In dem ersten ist ein Netzwerk von interaktiven Bestandteilen eines Enzymsystems, wie vorstehend beschrieben wurde. In dem zweiten Fläschchen ist eine Kultur von Mikroorganismen. Ein zweistufiger Testindikator der Erfindung stellt einen doppelten Anhaltspunkt für die Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens zur Verfügung. Im Wesentlichen wird ein Substrat zu den Enzymen zugegeben und sofort durch das Verfahren, das hierin beschrieben wird, analysiert, um einen ersten Anhaltspunkt zu erhalten. Die verbliebenen Sporen des zweiten Fläschchens werden unter Kulturbedingungen für eine längere Zeitspanne inkubiert, um einen zweiten Anhaltspunkt für die Sterilität zu erhalten. Nützliche Mikroorganismen des zweistufigen Indikators schließen Populationen von Sporen der Gattung Bacillus, Neurospora, Candida und Clostridium ein. Die erste Inkubationsperiode ist sehr schnell, wie vorstehend beschrieben wird, und kann weniger als 60 Minuten betragen, vorzugsweise weniger als 15 Minuten und am stärksten bevorzugt weniger als eine Minute. Die zweite Inkubationsperiode kann zwischen etwa 24–48 Stunden liegen, vorzugsweise etwa 1 bis 24 Stunden, stärker bevorzugt weniger als etwa 6 Stunden und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 1 Stunde.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein in sich abgeschlossener Testindikator zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens, der ein äußeres Gehäuse umfasst, das äußere Wände besitzt, die impermeabel für Flüssigkeiten sind und im Wesentlichen kein Gas absorbieren, und mindestens eine Öffnung, die mit einer gasleitenden Bespannung bedeckt ist, wobei die Öffnung in eine Kammer führt, die ein erstes und zweites Fläschchen enthält, wobei das erste Fläschchen mindestens ein Öffnung besitzt, die mit einer gasleitenden Bespannung bedeckt ist und welche die interaktiven Bestandteile eines Enzymsystems enthält, und das zweite Fläschchen die restlichen Bestandteile enthält, die, wenn sie mit den Bestandteilen des ersten Fläschchen gemischt werden, ein nachweisbares Produkt herstellen, wobei die Fläschchen aus einem Material konstruiert sind, das geöffnet werden kann, und deren Bestandteile gemischt werden können, ohne dass sie aus dem Testindikator entfernt werden. Ein Beispiel von einer solchen Konstruktion ist eine Ampulle, die hitzestabile Wände mit inneren Kammern besitzt. Die Kammern schließen ein Paar von Kammern ein, die durch eine zusammenfallende oder auf eine andere Weise zerbrechbare Trennwand getrennt sind, die zusammen jedes der Bestandteile eines interaktiven Enzymsystems enthalten, wie hierin beschrieben wird. Die Ampulle enthält ebenfalls ein anderes Paar von Kammern, die durch eine zusammenfallende oder zerbrechbare Trennwand getrennt sind, wobei eine davon eine Sporenprobe enthält und die andere eine Probe des Mediums für die Inkubation der Sporen.
Die Menge der Bestandteile ist so, dass jede verbleibende Enzymaktivität nach einem unzureichenden Sterilisationszyklus nachweisbar ist. Die Bestandteile, die Enzyme, Coenzyme, Cofaktoren, Katalysatoren, Substraten und jedes andere notwendige Reagenz einschließen, werden inkubiert und bestimmt, nachdem sie dem Sterilisationszyklus unterworfen wurden. Die Inkubation wird für eine Zeitperiode und unter Bedingungen fortgeführt, die ausreichend sind, um eine nachweisbare Menge eines enzymmodifizierten Produkts freizusetzen, unter der Annahme, dass eines der Enzyme aktiv blieb. Im Allgemeinen liegt die benötigte Inkubationszeit zwischen 1 Minute und 60 Minuten und die Inkubationstemperatur liegt zwischen etwa 20°C und etwa 70°C.
Im Allgemeinen verwenden im Handel erhältliche Verfahren zum Nachweisen eines enzymmodifizierten Produkts eine hochentwickelte Messtechnik wie z.B. Fluorimeter und Spektrophotometer. Für den Zweck der Erfindung wird ein visuelles Nachweisverfahren für die Messung des enzymmodifizierten Produkts aufgrund der Einfachheit und der Schnelligkeit des Verfahrens bevorzugt. Das spezifische Enzymsubstrat kann zum Beispiel ein Tetrazoliumsalz umfassen, das nach der Interaktion mit einem NADH-abhängigen Oxidoreduktaseenzym zu einem gefärbten Formazan führt, das visuell nachweisbar ist. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht eine sehr schnelle Bestimmung der Enzymaktivität, die verwendet werden kann, um Bedingungen vorherzusagen, die ein Überleben von Mikroorganismen erlauben, und damit die Wirksamkeit der Sterilisation. Der verwendete enzymatische Bestimmungstest verwendet nur eine kurze Inkubationsperiode, im Allgemeinen von etwa 1 bis 60 Minuten, um ausreichend enzymmodifiziertes Produkt für einen visuellen Nachweis zur Verfügung zu stellen.
Ein schneller Sterilitätsindikator der Erfindung mit mehreren Enzymen wird in 6 dargestellt. Das Gehäuse ist ein zylindrisches Rohr 4, das Wände, die impermeabel für Flüssigkeiten sind, mit einer Öffnung 7 an einem Ende besitzt. Das Rohr 4 enthält eine feste Trägerscheibe 6, auf der mehrere interaktive Enzyme coimmobilisiert sind. Das Rohr 4 enthält ebenfalls ein nichtwässriges Medium 5, das die feste Trägerscheibe 6 bedeckt. Die Öffnung 7 ist mit einem Deckel 1 bedeckt, der Löcher 2 besitzt, die einen ungehinderten Zugang des sterilisierenden Mittels durch die Öffnung 7 ermöglicht. Der Apparat in 6 wird durch das Platzieren der festen Trägerscheibe 6, auf der mehrere interaktive Enzyme coimmobilisiert sind, auf den Boden des Rohrs 4 zusammengebaut. Das nichtwässrige Medium 5 wird zugegeben, um die feste Trägerscheibe 6 zu bedecken. Ein Zylinder aus hitzeresistentem Schaumstoffmaterial 3 wird in das Rohr 4 gedrückt, um ein strukturelles Gerüst für die Eingrenzung des nichtwässrigen Mediums 5 zur Verfügung zu stellen. Das Schaumstoffmaterial dient ebenfalls dazu, einen festgelegten Abstand zwischen den zahlreichen interaktiven Enzymen, die auf der festen Trägerscheibe 6 coimmobilisiert sind, und der Öffnung 7 zu erhalten. Der Deckel 1 wird auf die Oberseite des Rohrs 4 platziert, wobei die Öffnung 7 bedeckt wird.
Der Spender der Indikatorlösung wird in 7 gezeigt. Die Flasche 8 enthält die Indikatorlösung 9, die eine visuelle Farbänderung erzeugt, wenn sie mit den aktiven zahlreichen interaktiven Enzymen, die auf der festen Trägerscheibe 16 coimmobilisiert sind, in Kontakt gebracht wird. Die Flasche 8 enthält einen Augentropfer 11, mit einer vorgemessenen Volumenlinie 10. Das Füllen des Augentropfers 11 bis zu der vorgemessenen Volumenlinie 10 mit der Indikatorlösung 9 stellt sicher, dass das korrekte Volumen der Indikatorlösung 9 in das Rohr 4 abgegeben wird.
Ein Verfahren für das Ausführen des Sterilitätstests wird in 7 dargestellt. Der Sterilitätsindikator wird zusammen mit anderem Material, das sterilisiert werden soll, in den Sterilisator platziert. Der Sterilitätsindikator wird mit dem sterilisierenden Mittel während des Verlaufs eines Sterilisationszyklus in Kontakt gebracht. Nach der Vervollständigung des Sterilisationszyklus wird der Sterilitätsindikator aus dem Sterilisator entfernt und es wird ermöglicht, dass er auf Raumtemperatur abkühlt. Der Deckel 12 und das Schaumstoffmaterial 13 werden entfernt. Die Indikatorlösung 9 wird in den Augentropfer 11 aufgezogen, wobei die vorgemessene Volumenlinie 10 verwendet wird, um sicherzustellen, dass das korrekte Volumen der Indikatorlösung 9 verwendet wird. Die Indikatorlösung 9 wird in das Rohr 14 abgegeben. Die Inkubatorlösung wird bei Raumtemperatur mit den Enzymen, die auf dem festen Träger coimmobilisiert sind, für 1 bis 60 Minuten, vorzugsweise für weniger als 10 Minuten inkubiert. Die feste Trägerscheibe wird am Ende der Inkubationsperiode visuell untersucht. Das Fehlen einer Rotfärbung auf der festen Trägerscheibe weist auf ein negatives Ergebnis 18 hin und kennzeichnet einen erfolgreichen Sterilisationszyklus. Das Vorhandensein einer Rotfärbung auf der festen Trägerscheibe weist auf ein positives Ergebnis 17 hin und kennzeichnet einen erfolglosen Sterilisationszyklus.
Die nachfolgenden Beispiele stellen Ausführungsformen der Erfindung dar, sie sollten aber nicht als eine Einschränkung des Schutzbereichs der Erfindung betrachtet werden.
Beispiele
Beispiel 1
Das Zwei-Enzymsystem besteht aus der Alkoholdehydrogenase (445 E/mg P, Worthington Biochemicals) und der Diaphorase (30,8 E/mg DW, Worthington Biochemicals). Die Alkoholdehydrogenase wurde mit einer bevorzugten Konzentration von 5,0 mg/ml und innerhalb eines Bereichs von 0,5 mg/ml bis 250 mg/ml verwendet. Die Diaphorase wurde mit einer bevorzugten Konzentration von 25 mg/ml und innerhalb eines Bereichs von etwa 2,5 mg/ml bis 1,25 g/ml verwendet. Die Enzyme wurden in einem wässrigen Puffer wie z.B. Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder 0,05 M Tris-Puffer, pH 8,5 gelöst und dialysiert. Für die Dialyse von allen Enzymen wurden molekularporöse Spectrapor-Dialyseschläuche mit einer Molekulargewichtsobergrenze von 3500 Daltons verwendet. Die Schläuche wurden in 2% Natriumbicarbonat, 1 mM EDTA für 10 Minuten gekocht, unter fließendem Leitungswasser für 1 Stunde gewaschen und anschließend zehnmal in destilliertem Wasser gewaschen und in destilliertem Wasser bei 2–8°C gelagert. Die Schläuche wurden auf die benötigte Größe zugeschnitten, an einem Ende zugeknotet, mit der Enzymlösung gefüllt und am anderen Ende zugeknotet. Die Dialyse wurde in dem 100fachen Volumen der Enzymlösung durchgeführt, wobei 0,05 M Tris-Puffer, pH 8,5 verwendet wurde und es wurde zweimal für 4 Stunden und ein weiteres Mal für 14–18 Stunden bei 2–8°C unter leichtem Rühren dialysiert. Die 20 μl der Enzymlösung wurden auf weiße cellulosehaltige feste Trägerscheiben durch das Verteilen der 20 μl auf jede Scheibe transferiert. Die Scheiben, die in einer Mikrotiterplatte mit vielen Vertiefungen untergebracht wurden, wurden sofort auf –71 °C gefroren. Die Scheiben wurden anschließend durch das Platzieren der gefrorenen Scheiben in der Mikrotiterplatte in einer Gefriertrocknungsflasche und das Anlegen eines Vakuums von mehr als 200 Mikrometer Quecksilber für ein Minimum von drei Stunden gefriergetrocknet. Die Scheiben, welche die coimmobilisierten Enzyme enthielten, wurden in einer nichtwässrigen Umgebung innerhalb durchsichtiger Fläschchen, bedeckt durch Mineralöl gelagert, bevor sie als ein Sterilitätsindikator verwendet wurden. Das wasserfreie Medium oder das Mineralöl wurde innerhalb der durchsichtigen Fläschchen durch ein Material, das zu dem Fläschchen gegeben wurde, welches das wasserfreie Medium physikalisch von dem luftgefüllten Raum des Flaschengehäuses trennt, an der richtigen Stelle gehalten. Der Trennstoff war ein hitzeresistentes Schwammmaterial, das in der Form eines Zylinders zugeschnitten war und das physikalisch in das Fläschchen platziert wurde, bis seine Unterseite in einem direkten Kontakt mit dem wasserfreien Medium, welches in diesem Fall Öl war, kam.
Die Indikatorlösung ist eine klare, farblose Flüssigkeit, aber wenn sie zu mehreren interagierenden Enzymen gegeben wird, reagieren die Enzyme mit der Indikatorlösung, so dass ein enzymmodifiziertes farbiges Reaktionsprodukt entsteht. Die Indikatorlösung enthält p-Iodonitrotetrazolium-Violett (2-[4-Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazoliumchlorid) in einem Bereich von 3,2 × 10^-5 M bis 0,16 × 10^-1 M; vorzugsweise 3,2 × 10^-3 M, NAD (B-Nicotinamidadenindinucleotid) in einem Bereich von 1,1 × 10^-6 M bis 5,5 × 10^-3 M, vorzugsweise von 1,1 × 10^-4 M; Ethanol in einem Bereich von 1% bis 100% (Volumen), vorzugsweise 5,5%. Der bevorzugte Puffer war 0,5 M Tris, pH 8,5.
Beispiel 2
Dieses Beispiel stellt die Schnelligkeit und die Einfachheit der Verwendung der vorliegenden Erfindung dar. In diesem Beispiel werden die Alkoholdehydrogenase und die Diaphorase auf weiße Cellulosescheiben coimmobilisiert, wie vorstehend beschrieben wurde und in 2 dargestellt wird. Die Scheiben werden in die Testfläschchen platziert, wie vorstehend beschrieben wurde und in 6 dargestellt wird. Die Testfläschchen wurden in 4 Replikaten für die Zeitspannen von 5 und 15 Minuten autoklaviert. Die Fläschchen wurden aus dem Autoklaven entfernt und man ließ sie abkühlen. Der Sterilitätsindikatortest wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde und in 7 dargestellt wird, wobei eine Indikatorlösung verwendet wurde, die aus Tris-Puffer, Ethanol, NAD und INT zusammengesetzt war. Nach einer Inkubationszeit von zehn Minuten bei Raumtemperatur, wurde eine visuelle Aufzeichnung der Fläschchen durchgeführt, welche die Indikatorlösung und die Cellulosescheibe, auf denen die zwei interaktiven Enzyme coimmobilisiert waren, enthielten, indem die Fläschchen auf eine Glasplattform gestellt wurden und die Scheiben von unten betrachtet oder auf Video aufgenommen wurden. Die so erhaltenen Videobilder wurden digital gespeichert, wobei die Adobe Photoshop-Software verwendet wurde und die relative Farbintensität auf den Scheiben wurde quantifiziert, wobei die Histogrammfunktion der Software verwendet wurde. Die Fläschchen wurden ebenfalls visuell qualitativ als entweder positiv, rot gefärbt, oder negativ, ohne ein sichtbares Zeichen einer roten Farbe, eingestuft.
Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in 8 dargestellt. Nach 5 Minuten des Autoklavierens zeigten alle Replikate des schnellen Enzymindikators eine starke positive Farberzeugung nach einer kurzen, zehnminütigen Inkubation. Die schnellen enzymatischen Sterilitätsindikatoren, die für 15 Minuten autoklaviert wurden, zeigten keine Farbe, weder quantitativ noch qualitativ, bei einer visuellen Untersuchung. 9 zeigt eine graphische Darstellung der quantitativen Bestimmung der Farbintensität des schnellen enzymatischen Sterilitätsindikators der vorliegenden Erfindung gegenüber der Zeit eines Kontakts mit einem sterilisierenden Mittel – wobei in diesem Beispiel eine Dampf-Autoklavierung bei 121°C verwendet wurde. Die Aktivität des Enzymsystems in verschiedenen Konfigurationen von Öl kann verglichen werden, welches dazu dient, den Einfluss einer hydrophoben Umgebung darzustellen. Auf der gleichen graphischen Darstellung werden Daten überlagert, die den Logarithmus der Anzahl der überlebenden Mikroorganismen von Bacillus stearothermophilus zeigen, die aus biologischen Sportrol-Indikatoren isoliert wurden, gegen die Zeit der Dampf-Autoklavierung. Sportrol ist ein biologischer Indikator, der nicht in sich abgeschlossen ist. Die enge Übereinstimmung der graphischen Darstellungen unterstützt den Anspruch der vorliegenden Erfindung, dass die Enzyme, die bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, extrazelluläre und intrazelluläre mikrobiologische Enzyme sind, deren von einander abhängige Aktivität mit der Keimung und dem Wachstum von Mikroorganismen, die typischerweise in hochmodernen biologischen Sterilitätsindikatoren verwendet werden, korreliert.
Beispiel 3
Dieses Beispiel stellt die Korrelation zwischen einem konventionellen biologischen Sterilitätsindikator, der Sporen enthält, und einen schnellen enzymatischen Indikator dar. Der konventionelle biologische Sterilitätsindikator, der für den Vergleich verwendet wurde, war der im Handel erhältliche Sportrol Spore Strip von North American Science Associates, Incorporated in Northwood, Ohio. Er wurde mit dem schnellen enzymatischen Indikator (ein Zwei-Enzymsystem) bei 121°C in einem BIER-Gefäß (biologischer Indikator-Evaluator-Resistometer-Gefäß, das verwendet wird, um präzise kontrollierte Sterilisationsbedingungen zu liefern) verglichen. Beide Sterilitätsindikatoren wurden nach 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 und 15 Minuten der Kontaktzeit in dem BIER-Gefäß getestet.
Der Sportrol Spore Strip wurde in ein Nährstoffmedium platziert und inkubiert, nachdem es mit dem BIER-Gefäß für den vorgesehenen Zeitraum in Kontakt gebracht wurde. Nach einem Tag wurden die Röhrchen kontrolliert und die Anzahl der Röhrchen mit lebensfähigen Sporen (Wachstum) wurde als Positive aufgezeichnet. Die Röhrchen wurden bis zu 7 Tage inkubiert und jedes beobachtete Wachstum in den Röhrchen wurde als ein positives Ergebnis aufgezeichnet.
Der schnelle enzymatische Indikator besitzt eine Indikatorlösung, die INT, Ethanol und NAD in Puffer enthält, die in das Fläschchen zugegeben wurde, nachdem es mit dem BIER-Gefäß für den vorgesehenen Zeitraum in Kontakt gebracht wurde. Der schnelle enzymatische Indikator enthält zwei Enzyme, die Diaphorase und die Alkoholdehydrogenase, die normalerweise in den Indikator-Mikroorganismen gefunden werden, die auf einer weißen Cellulosescheibe coimmobilisiert sind. Nach der Zugabe der farblosen Indikatorlösung auf die Scheibe wurden die Fläschchen bei Raumtemperatur zwischen etwa 2 und etwa 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurde die Scheibe visuell auf ein Anzeichen von Farbe untersucht. Wenn eine rote Farbe auf der Scheibe gesehen wurde, wurde das Ergebnis als positiv aufgezeichnet. Ein positives Ergebnis deutet darauf hin, dass keine geeigneten Sterilisationsbedingungen getroffen wurden. Die Farbentwicklung auf der Scheibe erfolgt, weil die Enzyme nicht vollständig inaktiviert wurden. Wenn die Scheibe vollständig weiß blieb, wurde das Ergebnis als negativ aufgezeichnet. Ein negatives Ergebnis zeigt, dass die richtigen Sterilisationsbedingungen getroffen wurden und dass das Enzym/die Enzyme inaktiviert wurden.
Die Anzahl der positiven Ergebnisse für den biologischen Sportrol-Indikator wurden nach einer Inkubationsperiode von 7 Tagen bestimmt. Die Anzahl der positiven Ergebnisse für den schnellen enzymatischen Indikator wurden 30 Minuten, nachdem die Indikatorlösung zugegeben wurde, bestimmt. Die Anzahl der positiven Ergebnisse für jeden Zeitpunkt war ähnlich für die zwei unterschiedlichen Arten von Indikatoren.
Der Auswuchs und die Lebensfähigkeit der Sporen in dem Sportrol-Indikator war ähnlich zu der enzymatischen Aktivität des schnellen enzymatischen Indikators. Daher kann der enzymatische Indikator ein ähnliches Ergebnis wie der biologische Sportrol-Indikator erzeugen. Durch die Korrelation der Lebensfähigkeit der Sporen nach der Sterilisation mit der enzymatischen Aktivität der Enzyme, die von Mikroorganismen abgeleitet wurden, wird ein schnelles Verfahren erzeugt, um die Wirksamkeit von Sterilisatoren zu überprüfen. Weil das Verfahren zum Sicherstellen von geeigneten Sterilisationsbedingungen nicht auf das Wachstum von Mikroorganismen angewiesen ist, waren die Ergebnisse des Indikatortests nach Minuten anstelle von Stunden oder Tagen erhältlich.
Beispiel 4
Beispiel 4 stellt die Anwendbarkeit des schnellen enzymatischen Sterilitätsindikators der vorliegenden Erfindung für die Verwendung bei der Flash-Sterilisation dar. Die Flash-Sterilisation stellt einen schnelleren Sterilisationszyklus bei einer Temperatur von 132°C durch das Erhöhen des Kammerdrucks her. Diese Erhöhung vermindert die Zeitspanne, die notwendig ist, um lebensfähige Testmikroorganismen zu zerstören, von 15 Minuten bei der Dampfsterilisation bei 121°C auf 2 Minuten bei der Flash-Sterilisation bei 132°C. In diesem Beispiel wurden die Cellulosescheiben, welche die coimmobilisierte Diaphorase und Alkoholdehydrogenase enthielten, wie in 2 dargestellt wird, in das Indikatorfläschchen platziert, wie vorstehend beschrieben wurde und in 6 dargestellt wird. Die Fläschchen wurden bei 132°C für zwei Minuten autoklaviert und anschließend aus dem Autoklaven entfernt und man ließ sie abkühlen. Der Sterilitätsindikatortest wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde und in 7 dargestellt wird, wobei eine Indikatorlösung verwendet wurde, die aus Tris-Puffer, Ethanol, NAD und INT zusammengesetzt war. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten bei Raumtemperatur zeigten die Ergebnisse, dass die Fläschchen qualitativ als negativ bewertet wurden, wobei sie kein visuelles Zeichen einer roten Farbe hatten.
Beispiel 5
Beispiel 5 zeigt eine andere Ausführungsform der Erfindung, die in einer vollständig nichtwässrigen Umgebung funktioniert. Das Durchführen der enzymatischen Reaktionen in einem nichtwässrigen Medium kann die Kinetiken der enzymatischen Reaktion und die Gewinnung der enzymatischen Aktivität verstärken (A Zaks et al., J. Biol. Chem. 263:3194–3201, 1988). In diesem Beispiel wurden die Alkoholdehydrogenase und die Diaphorase mit dem Coenzym NAD auf weiße Cellulosescheiben coimmobilisiert. Die Scheiben wurden in das Indikatorfläschchen platziert, wie vorstehend beschrieben wurde und in 6 dargestellt wird. Die Fläschchen wurden 15 Minuten autoklaviert, aus dem Autoklaven entfernt und man ließ sie abkühlen. Der Sterilitätsindikatortest wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde und in 7 dargestellt wird, wobei eine Indikatorlösung verwendet wurde, die aus INT zusammengesetzt war, das in 100% Ethanol gelöst wurde. Nach einer Inkubation von einer bis zu zwanzig Minuten bei Raumtemperatur wurde eine visuelle Bestimmung der Farberzeugung innerhalb des Fläschchens durchgeführt, das die Indikatorlösung und die Cellulosescheibe, auf der die zwei interaktiven Enzyme coimmobilisiert waren, enthielt, um zu bestimmen, ob die Sterilisation vollständig war.
Beispiel 6
In diesem Beispiel wurde ein geschichtetes Konstrukt eines festen Trägers verwendet. Das Konstrukt beginnt mit dem festen Träger 22, anschließend wurde die Alkoholdehydrogenase 19 auf der Scheibe immobilisiert und das Enzym und die Scheibe wurden eingefroren. Nach dem Einfrieren wurde die Alkoholdehydrogenase mit einer Schicht einer Gelatinelösung 21 bedeckt, die eine Matrix erzeugte, wobei amphoterisch geladene organische Moleküle über der Alkoholdehydrogenase verwendet wurden. Wenn die Gelatine ausgehärtet war, wurde die Diaphorase auf die Oberfläche der Gelatine zugegeben. Das Konstrukt wurde anschließend gefriergetrocknet und die Scheiben wurden in die Indikatorfläschchen platziert, wie vorstehend in 6 beschrieben wurde. Die Fläschchen wurden für 15 Minuten autoklaviert, aus dem Autoklaven entfernt und man ließ sie abkühlen. Der Sterilitätsindikatortest wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde und in 7 dargestellt wird. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur wurde eine visuelle Bestimmung der Farberzeugung auf den Scheiben durchgeführt. Dieses geschichtete Konstrukt erhöhte deutlich die Stabilität der Alkoholdehydrogenase unter der Gelatineschicht, während immer noch eine optimale Diffusion der chromogenen Substrate aus der Hauptmenge der Lösung zu der Schicht der Diaphorase außerhalb der Gelatine ermöglicht wird.
Beispiel 7
In diesem Beispiel werden zwei Enzyme auf einen festen Träger durch Seite-an-Seite gerichtete Enzymkomplexe coimmobilisiert (N Siegbahn et al., Methods Enzymol 136:103–113, 1987). In dieser Konfiguration erfolgt die gegenseitige Umwandlung der Coenzyme zwischen den zwei Enzymen mit einer deutlich erhöhten Geschwindigkeit. Diese Verstärkung ergibt einen schnellen enzymatischen Sterilitätsindikator, der eine größere Sensitivität und Geschwindigkeit der visuellen Farbentwicklung besitzt. Unter Verwendung dieser Scheibenstruktur wurde der schnelle enzymatische Sterilitätsindikator aufgebaut, wie in 6 dargestellt wird. Nach dem Autoklavieren für eine bestimmte Zeitspanne wurde der schnelle enzymatische Sterilitätsindikator verwendet, wie vorstehend beschrieben wurde und in 7 dargestellt wird. Die Fläschchen wurden nach einer Inkubationszeit von einer bis zu zwanzig Minuten visuell untersucht. Die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Farbentwicklung weist auf einen teilweisen oder einen vollständigen Status des Sterilisationszyklus.

Claims

Biologisches Verfahren zum Bestimmen einer Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens umfassend die aufeinanderfolgenden Schritte: a) Platzieren eines Testindikators, der einen oder mehrere Bestandteile einer Vielzahl interaktiver Enzymsysteme enthält, in eine Sterilisationskammer; b) Durchführen des Sterilisationsverfahrens innerhalb der Kammer; c) Hinzufügen der restlichen Bestandteile der Vielzahl der interaktiven Enzymsysteme zu den ein oder mehreren Komponenten in dem Testindikator, um eine Mischung zu bilden; und d) Inkubieren der Mischung für eine erste Zeitspanne, die ausreicht, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Produktes nachzuweisen, um eine Bestimmung der Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens durchzuführen.
Biologisches Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Bestimmen einer Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens umfassend die Schritte: a) Platzieren eines Testindikators, der einen oder mehrere Bestandteile einer Vielzahl interaktiver Enzymsysteme und eine Probe von Mikroorganismen enthält, in eine Sterilisationskammer; b) Durchführen des Sterilisationsverfahrens innerhalb der Kammer; c) Entfernen des Testindikators aus der Kammer; d) Hinzufügen der restlichen Bestandteile der Vielzahl der interaktiven Enzymsysteme zu den ein oder mehreren Komponenten in dem Testindikator, um eine Mischung zu bilden, und Hinzufügen eines flüssigen Mediums zu der Probe von Mikroorganismen, um eine Kultur zu bilden; e) Inkubieren der Mischung für eine erste Zeitspanne, die ausreicht, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Produkts nachzuweisen, um in einem ersten Schritt eine Bestimmung der Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens durchzuführen; und f) Inkubieren der Kultur für eine zweite Zeitspanne, die ausreicht, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines metabolischen Produkts der Probe von Mikroorganismen nachzuweisen, um in einem zweiten Schritt eine Bestimmung der Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens durchzuführen.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Probe von Mikroorganismen eine Population von Sporen der Gattung Bacillus, Neurospora, Candida oder Clostridium umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei die erste Inkubationsperiode weniger als eine Minute und die zweite Inkubationsperiode weniger als eine Stunde beträgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Sterilisationsverfahren ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dampfdruckverfahren, chemische Verfahren, Trockenhitzeverfahrenen, Strahlungsverfahren und Kombinationen daraus.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Vielzahl von interaktiven Enzymsystemen Bestandteile umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Enzymen, Coenzymen, Cofaktoren, prosthetischen Gruppen, Katalysatoren und Substraten.
Verfahren gemäß Anspruch 6, das weiterhin eines oder mehrere der folgende Merkmale umfasst: i) die Enzyme sind ausgewählt aus den Gruppen bestehend aus Alkoholdehydrogenasen und Diaphorasen; alkalischen Phosphatasen, Alkoholdehydrogenasen und Diaphorasen; Alkoholdehydrogenasen und Cytochromreduktasen; Glutamatdehydrogenasen und Oxidoreduktasen; und Glucose-6-Phosphatdehydrogenasen und Nicotinamidadenindinucleotid- oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat-Oxidoreduktasen; ii) das Coenzym, der Cofaktor oder die prosthetische Gruppe ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nicotinamidadenindinucleotid, reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid, Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, reduziertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, Acetyl-Coenzym A, Thiaminpyrophosphat, Komponenten des Komplementsystems, Pyridoxalphosphat, Biotin, Tetrahydrofolat, Cobamid, Flavin und Häm; iii) das Substrat ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus chromogenen Substanzen, fluoreszierenden Substanzen, lumineszierenden Substanzen, räumlichen Chemikalien, metallischen Substanzen, stabilen Isotopen und radioaktiven Isotopen.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die chromogene Substanz ein Tetrazoliumsalz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diphenyltetrazoliumbromid, Phenyltetrazoliumviolett und Ditetrazoliumchlorid ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die interaktiven Enzymsysteme umfassen: i) einen Enzymzyklus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem nutzlosen Zyklus, Glycolysezyklus, Galaktosidasezyklus, Phosphorylierungszyklus, Malat/Isocitratzyklus, Citronensäurezyklus, gekoppeltem Oxidations-Reduktionszyklus und einer Kombination daraus; oder ii) ein Enzymamplifikationssystem ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Fibrin/Koagulationskaskade, Trypsin/Trypsinogenkaskade, Komplementkaskade und einer Kombination daraus.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der eine Bestandteil oder die mehreren Bestandteile, die dem Sterilisierungsverfahren unterworfen werden, auf einem festen Träger coimmobilisiert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Inkubationsperiode: i) weniger als 1 Stunde; ii) weniger als 15 Minuten; oder iii) weniger als 1 Minute ist.
Mikroorganismus-freies Verfahren zum Bestimmen der Überlebensfähigkeit eines Mikroorganismus in einer sterilisierenden Umgebung umfassend die aufeinanderfolgenden Schritte: a) Inkontaktbringen eines oder mehrerer Bestandteile einer Vielzahl interaktiver Enzymsysteme mit einer sterilisierenden Umgebung; b) Hinzufügen der restlichen Bestandteile der Vielzahl der interaktiven Enzymsysteme zu dem einen oder mehreren Bestandteilen, die der sterilisierenden Umgebung unterworfen wurden; und c) Nachweisen der Aktivität der Vielzahl der interaktiven Enzymsysteme zum Bestimmen der Überlebensfähigkeit des Mikroorganismus in der sterilisierenden Umgebung.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei eine oder mehrere Komponenten, die der sterilisierenden Umgebung unterworfen wurden: i) in einem wasserfreien Träger enthalten sind; ii) an einem festen Träger befestigt sind, der eine Cellulosescheibe mit multiplen Schichten amphoretisch geladener organischer Moleküle ist, wobei jede Schicht mindestens eine Komponente enthält; oder iii) mindestens zwei Enzyme umfassen, wobei die Enzyme auf einer festen Trägerscheibe enthalten sind, wobei jedes Enzym physikalisch derartig positioniert ist, dass ein aktives Zentrum eines Enzyms direkt gegenüber einem aktiven Zentrum eines anderen Enzyms ist.
Mikroorganismus-freies Verfahren zum Bestimmen der Überlebensfähigkeit eines Mikroorganismus in einer sterilisierenden Umgebung gemäß Anspruch 12, umfassend zuerst das Inkontaktbringen eines Inhibitors einer Vielzahl interaktiver Enzymsysteme mit der sterilisierenden Umgebung, wobei der Inhibitor α-Aminooxyessigsäure, Antabuse, Flaviansäure, Natriumiodessigsäure und Pyrazol, Isopropylhydrazin, Parapyruvat, Oxamsäure, Phenylmethansulfonylfluorid und Chymostatin, Weinsäure, Tosyllysinchlormethylketon (TICK) oder Tosylphenylalaninchlormethylketon (TPCK) ist.
Testindikator zum Bestimmen einer Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahren umfassend: a) ein äußeres Gehäuse mit Wänden, die impermeabel für Flüssigkeiten sind und kein Gas absorbieren; und b) mindestens eine Öffnung in den Wänden des äußeren Gehäuses, die mit einer gasleitenden Bespannung bedeckt sind, wobei die mindestens eine Öffnung in eine Kammer führt, die eine Vielzahl interaktiver Enzymsysteme enthält, die frei von Mikroorganismen sind, wobei eine gasleitende Barriere zwischen den Enzymsystemen und der mindestens einen Öffnung existiert, wobei der Testindikator gegebenenfalls an ein Sterilisationsverfahren gemäß Anspruch 5 angepasst ist.
Testindikator gemäß Anspruch 15, wobei multiple Komponenten des Enzymsystems auf einem festen Träger coimmobilisiert sind.
Testindikator gemäß Anspruch 16, wobei der feste Träger: i) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cellulosen, Kunststoffen, Gläsern, Keramiken, Membranen, Polymeren und Kombinationen daraus; oder ii) eine hochkompartimentierte Cellulosescheibe ist, die in einem wasserfreien Medium suspendiert ist.
Testindikator gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei die Barriere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gasleitenden und flüssigkeitsimpermeablen Polymermembranen, Polymermembranen, Schwämmen, Stoppern und kompartimentierten Scheiben.
In sich abgeschlossener Testindikator gemäß Anspruch 15, wobei die Kammer ein erstes und zweites Fläschchen enthält, wobei das erste Fläschchen mindestens eine Öffnung aufweist, die mit einer gasleitenden Bespannung bedeckt ist, die mindestens einen Bestandteil eines Enzymsystems enthält, und wobei das zweite Fläschchen die restlichen Bestandteile des Enzymsystems beinhaltet, das ein nachweisbares Produkt herstellt, wenn es mit dem mindestens einen Bestandteil des Enzymsystems aus dem ersten Fläschchen gemischt wird, wobei die Fläschchen aus einem Material konstruiert sind, das geöffnet werden kann und wobei ihr Inhalt gemischt werden kann, ohne dass eine Entfernung vom Testindikator erforderlich ist.
Testindikator gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, der Bestandteile enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Enzymen, Coenzymen, Cofaktoren, prosthetischen Gruppen, Katalysatoren und Substraten.
Testindikator gemäß Anspruch 20, der weiterhin eines oder mehrere der folgenden Merkmale umfasst: i) die Enzyme sind ausgewählt aus den Gruppen bestehend aus Alkoholdehydrogenasen und Diaphorasen; alkalischen Phosphatasen, Alkoholdehydrogenasen und Diaphorasen; Alkoholdehydrogenasen und Cytochromreduktasen; Glutamatdehydrogenasen und Oxidoreduktasen; und Glucose-6-Phosphatdehydrogenasen und Nicotinamidadenindinucleotid oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat-Oxidoreduktasen; ii) das Coenzym, der Cofaktor oder die prosthetische Gruppe ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nicotinamidadenindinucleotid, reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid, Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, reduziertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, Acetyl-Coenzym A, Thiaminpyrophosphat, Komponenten des Komplementsystems, Pyridoxalphosphat, Biotin, Tetrahydrofolat, Cobamid, Flavin und Häm; iii) das Substrat ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus chromogenen Substanzen, fluoreszierenden Substanzen, lumineszierenden Substanzen, räumlichen Chemikalien, metallischen Substanzen, stabilen Isotopen und radioaktiven Isotopen.
Testindikator gemäß Anspruch 21, wobei die chromogene Substanz ein Tetrazoliumsalz ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diphenyltetrazolbromid, Phenyltetrazolviolett und Ditetrazolchlorid.
Testindikator gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei das interaktive Enzymsystem umfasst: i) einen Enzymzyklus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem nutzlosen Zyklus, Glykolysezyklus, Galaktosidasezyklus, Phosphorylierungszyklus, Malat/Isocitratzyklus, Citronensäurezyklus, gekoppeltem Oxidations-Reduktionszyklus und einer Kombination daraus; oder ii) ein Enzymamplifizierungssystem ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Fibrin/Gerinnungskaskade, Trypsin/Trypsinogenkaskade, Komplementkaskade und einer Kombination daraus.
Testindikator gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei der eine Bestandteil oder die mehreren Bestandteile, die der Sterilisierungsverfahren unterworfen wurden, auf einem festen Träger coimmobilisiert sind.