DE69414405T2

DE69414405T2 - Verfahren zur messung metaplastischer veränderungen von schleimabsondernden epithelzellen

Info

Publication number: DE69414405T2
Application number: DE69414405T
Authority: DE
Inventors: Louise Laval Quebec H7X 2P9 Boulet; Rejean Montreal North Quebec H1G 3W8 Fortin; Douglas J. Lachine Quebec H8S 2M9 Pon; Carlo J. Apartment 3 Pierrefonds Quebec H9H 4X9 Van Staden
Original assignee: Merck Frosst Canada and Co
Current assignee: Merck Frosst Canada and Co
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-08-30
Publication date: 1999-06-10
Anticipated expiration: 2014-08-31
Also published as: US5932481A; EP0719412B1; JP3436311B2; WO1995008114A1; JPH09502524A; EP0719412A1; ES2123818T3; CA2171477A1; DK0719412T3; DE69414405D1; CA2171477C; ATE173087T1

Description

"Sepharose", "Sephacryl", "Immobilon" und "Sorval" sind, wie sie in der Beschreibung gebraucht werden, Marken.

Hintergrund der Erfindung

Mucusglykoproteine sind die Hauptbestandteile der Schleimhautschicht, die in den oberen und unteren Luftwegen von Säugetierlungen gefunden werden [Rose, M.C. (1992), Am. J. Physiol. 263:L413-L429]. Der Mucus überträgt die viscoelastischen Eigenschaften auf die Atemwegssekretionen und sorgt somit für die schmierenden und schützenden Qualitäten, die notwendig sind für eine optimale mucoziliare Entfernung von Fremdmaterial aus den Lungen [Lamblin, G., et al. (1992) Eur. Resp. J. 5:247-256]. In bestimmten Krankheitszuständen, wie z.B. zystische Fibrose [Rose, M.C. (1988) Horm. metabol. Res. 20:601-608], akute und chronische Bronchitis (Reid, L. (1960) Thorax 15:132-141] und Asthma [Aikawa, T., S. Shimura, (1992) Chest 101:916-921], liegt eine Situation vor, in der eine Hypersekretion von Mucusglykoproteinen durch die Atemwegssekretionszellen betroffener Patienten herrscht. Hypersekretion von Mucusglykoprotein in den luminalen Atem- bzw. Luftwegraum kann zur Obstruktion der bronchiolären Gänge führen und ein Milieu für bakteriellen Befall erzeugen [Rose, M.C. (1992) Am. J. Physiol. 263:L413-L429]. Somit kann die Anwesenheit von überschüssigem Mucus zu beeinträchtigter mucoziliarer Reinigung und fortschreitender respiratorischer Insuffizienz führen und schließlich zu der Morbidität und Mortalität, die mit den oben genannten Krankheiten verbunden sind, beitragen.
Die zugrundeliegenden neuralen und zellulären Mechanismen, die zu den metaplastischen Veränderungen der Atemwegsepithelzellen beitragen, die zur Mucushypersekretion führen, sind nicht gut verstanden. Um diese Mechanismen zu studieren, haben Forscher kleine Tiere Reizstoffen, wie z.B. Endotoxin [Stolk, J., A. (1992) J. Pathol. 167:349-356; Harkema, J.R. und J.A. Hotchkiss. (1992) Am. J. Pathol. 141:307-317], SO&sub2; [Lamb, D. und L. Reid (1968) J. Path. Bact. 96:97-111; Jany, B., (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 181:1-8], Ozon [Pino, M.V., et al. (1992) Am. Rev. Respir. Dis. 145:882-889] und Zigarettenrauch [Farley, J.M. (1992) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:67-88], ausgesetzt. Histologische Untersuchungen offenbaren, daß Endotoxin- oder SO&sub2;-Exposition einen starken Anstieg in der Zahl von mucusenthaltenden Zellen bewirkt, die sowohl die oberen als auch die unteren Atem- bzw. Luftwege der Lunge säumen [Stolk, J., et al. (1992) J. Pathol. 167:349-356; Harkema, J.R. und J.A. Hotchkiss (1992) Am. J. Pathol. 141:307-317; Lamb, D. und L. Reid (1968) J. Path. Bact. 96:97- 111]. Der Anstieg an Atem- bzw. Luftwegmucus wird demonstriert durch einen Anstieg der Zahl von Alcianblau-/Periodsäure-Schiffs-(PAS)-Anfärbungen von Atemwegsepithelzellen und durch eine Erhöhung der 35504 Aufnahme in Atemwegs-Gewebekulturen.
Luftröhrenspülungsproben von mit Endotoxin behandelten Ratten zeigen ebenfalls eine erhöhte Anwesenheit von Muzinmaterial, wie es aus der Immunoreaktivität mit spezifischen monoklonalen Antikörpern folgt [Steiger, D.J., et al. (1993) Am. Rev. Resp. Dis. 147:A437 (Abstr.)]. Neben der Untersuchung von Anstiegen in der Menge an Mucusglykoprotein unter Anwendung von histologischen und immunologischen Verfahren haben Basbaum und Mitarbeiter [(1991), Biochem. Biophys. Res. Comm. 181:1-8] auch gezeigt, daß ein wesentliches Ansteigen der mRNA, die für Muzin kodiert, mit Mucuszellmetaplasie verbunden ist. Ihre Daten deuten darauf hin, daß das Aussetzen von Ratten gegenüber Endotoxin [Steiger, D.J., et al., (1993) Am. Rev. Resp. Dis. 147:A437 (Abstr.)] oder SO&sub2; [Jany, B., (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 181:1-8] Muzingentranskription auslöst, was zu der de-novo-Synthese von Mucusglykoprotein durch die Atemwegsepithelzelle führt.

Tiermodelle für die Mucushypersekretion:

Von der Hypersekretion von Mucusglykoproteinen durch sekretorische Atemwegsepithelzellen von Patienten, die an zystischer Fibrose [Rose, M.C. (1988) Horm. metabol. Res. 20:601-608], Asthma [Aikawa, T., (1992) Chest 101:916-921] und chronischer Bronchitis [Reid, L. (1960) Thorax 15:132- 141] erkrankt sind, wird angenommen, daß sie zu der Morbidität und Mortalität, die mit solchen Krankheitszuständen verbunden sind, beitragen [Rose, M.C. (1992) Am. J. Physiol. 263:L413-L429]. Histologische Schnitte, die von Atemwegsgewebe hergestellt wurden, welches Personen entnommen wurde, die zum Zeitpunkt der Autopsie an Luftwegserkrankungen litten, zeigten Mucusverstopfung der distalen Atemwege, erhöhte Zahlen an mucusenthaltenden Becherzellen [Aikawa, T., et al., (1992) Chest 101:916-921] und eine Vergrößerung der submucösen Drüsen [Douglas, A.N. (1980) Thorax 35:198-201].
Die Grundlage für die Luftwegobstruktion mit Mucus ist unklar, aber die Konzepte der Hypersekretion und der verminderten mucoziliaren Reinigung sind zwei brauchbare Erklärungen. Ein Anstieg der Zahl an Zellen, die in der Lage sind, Mucusglykoproteine zu synthetisieren und abzusondern, kann sicherlich zu der beobachteten Mucusverstopfung der Atem- bzw. Luftwegskanäle beitragen. Biochemische Studien an Mucusglykoprotein von Individuen mit Atem- bzw. Luftwegserkrankung haben Veränderungen der Sialylierung und der Sulfatierung der Oligosaccharidketten, die mit dem Muzinproteinkern verknüpft sind, gezeigt [Cheng. P., et al. (1989)]. Clin. Invest. 84:68-72; Frates, R.C., et al. (1983) Pediatr. Res. 17:30- 34; Mawhinney, T.P., et al. (1992), Carb. Res. 235:179-197]. Veränderungen in der physikochemischen Natur des Mucus im Krankheitszustand könnten seine Entfernung aus den Atemwegen mittels Mechanismen der mucoziliaren Reinigung behindern und dadurch ein Ansammeln von Material in den Atemwegen und schließlich Verstopfen erlauben.
Zahlreiche Laboratorien sind den Mechanismen, die den metaplastischen Veränderungen, die in den sekretorischen Atemwegzellen zu sehen sind, und den Veränderungen des physikochemischen Aufbaus des ausgeschiedenen Muzins zugrunde liegen, intensiv nachgegangen. Kleine Tiere sind umweltrelevanten Reizstoffen, von denen angenommen wird, daß sie kausale Komponenten in der Entwicklung einer Atemwegserkrankung beim Menschen sind, ausgesetzt worden. Modelle, die gebraucht wurden und weiterhin noch gebraucht werden für das Studium der chronisch-obstruktiven Atemwegserkrankung, sind das Aussetzen von Tieren gegenüber SO&sub2; [Lamb, D. und L. Reid (1968), J. Path. Bact. 96:97-111; Jany, B., et al. (1991), Biochem. Biophys. Res. Comm. 181:1-8], Ozon [Pino, M. V., et al., (1992), Am. Rev. Respir. Dis. 145:882-889], Zigarettenrauch [Farley, J.M. (1992), Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:67-88] und Endotoxin [Stolk, J., (1992), J. Pathol. 167:349-356; Harkema, J.R. und J.A. Hotchkiss. (1992), Am. J. Pathol. 141:307-317]. Histologische Studien, die an diesen Modellen durchgeführt wurden, haben alle hypertrophische und hyperplastische Veränderungen in den mucusausscheidenden Zellen, die die Atemwege säumen, und in den submucösen Schichten der oberen Atemwege gezeigt. Solche Veränderungen sind vergleichbar mit jenen, die bei den oben erwähnten Atemwegserkrankungen zu beobachten sind. Die für die Hypersekretion verantwortlichen neurogenen und humoralen Vermittler sind bis heute nicht identifiziert worden.

Verfahren zu Untersuchung der Atemwegsmucuszellenmetaplasie

Forscher haben stark auf histologische Verfahren zur Untersuchung von Veränderungen in Luftwegsgewebe infolge einer Reizstoffexposition vertraut [Harkema, J.R. und J.A Hotchkiss. (1992), Am. J. Pathol. 141:307-317]. Ihre Untersuchungen haben detaillierte Berichte über Veränderungen im alveolären Atem- bzw. Luftraum, des Atemwegslumendurchmessers, der Basalmembrandicke, der zellulären Infiltration, der epithelialen Schorfbildung und der Größe und Zahl der mucusenthaltenden Zellen ergeben. Die Verwendung von PAS- und Alcianblau-Anfärbung hat quantitative Untersuchungen der Hochregulierung saurer und neutraler Mucusglykoproteine in verschiedenen Graden im Atemweg erlaubt [Lamb, D. und L. Reid, (1968), J. Path. Bact. 96:97-111].
Obwohl sie hervorragende Details der Veränderungen, die in den Luftwegen auftreten, liefern, sind histologische Verfahren extrem langwierig, zeitraubend und erfordern einen hohen Grad an Sachverstand, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse dokumentieren zu können.
In Verbindung mit histologischen Verfahren haben Forscher radioaktives Sulfat in Tiere injiziert, um Sulfomuzin-Level in den Atemwegszellen infolge SO&sub2; Exposition zu untersuchen [Lamb, D. und L. Reid (1968), J. Path. Bact 96:97-111]. Kürzlich haben Basbaum und Mitarbeiter monoklonale Antikörper benutzt, die spezifisch Sekretionsprodukte von Ratten- Becher- und Submukosa-Zellen erkennen [Finkbeiner, W.E. und C.B. Basbaum, (1988), Am. J. Path. 131:290-297].
Luftröhrenspülungsproben von Ratten, die intratracheale Eintröpfelungen von Endotoxin bekamen, zeigten eine erhöhte Freisetzung von Makromolekülen in den Atem- bzw. Luftwegsraum im Vergleich zum Kontrollexperiment. Solche Studien sind ausgedehnt worden auf transkriptionale Aspekte der Muzingenexpression durch die Verwendung spezifischer cDNA-Sonden, die für Mucusglykoprotein kodierende mRNA erkennen. Erhöhungen an Muzin-mRNA wurden in Luftröhren von Tieren beobachtet, die mit Endotoxin behandelt worden waren [Steiger, D.J., (1993) Am. Rev. Resp. Dis. 147:A437 (Abstr.)], und bei mit Sendei-Virus infizierten Ratten, die SO&sub2; ausgesetzt worden waren [Jany, B., (1991), Biochem. Biophys. Res. Comm. 181:1-8].
Die Verwendung von spezifischen Antikörpern und cDNA-Sonden ist insbesondere nützlich für die Untersuchung der hochregulierten Expression und Hypersekretion spezifischer Formen von Mucusglykoprotein. Allerdings sind potentielle Nachteile für die Verwendung spezifischer Antikörper und cDNA- Sonden beim Erforschen verschiedener Modelle der Hypersekretion, daß die verfügbaren Sonden spezies- und/oder modellspezifisch sein können. Zusätzlich kann die Verfügbarkeit solcher Sonden begrenzt sein, insbesondere für Forscher, die nicht ihre eigenen Antikörper oder eigene cDNA entwickeln können. Solche Beschränkungen können schließlich den Fortschritt des Wissens bezüglich der Mechanismen, die zu Atemwegshypersekretion führen, behindern.
Daher haben Forscher zur Untersuchung von metaplastischen Veränderungen in Atemwegsmucussekretionszellen stark auf histologische Methoden vertraut, die langwierig und im besten Falle halbquantitativ sind. Wie oben erwähnt, wurden immunologische und molekularbiologische Verfahren von einigen Laboratorien angewendet, um Mucusgenexpression und Hypersekretion zu studieren. Diese Verfahren basieren auf der Verfügbarkeit spezifischer Antikörper oder cDNA-Sonden, die den/die Typ(en) von Muzin erkennen, der/die hochreguliert ist/sind für die bestimmte Tierspezies, den Stamm und das Reizstoff-Modell. Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur raschen Bestimmung von hyperplastischen und hypertrophen Veränderungen in Tieratemwegen durch direktes Messen von Muzinen unabhängig vom Modell, Stamm oder der Spezies im Gegensatz zur indirekten Messung von mRNA.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Verfahren für die rasche Bestimmung von hyperplastischen und hypertrophen Veränderungen in Tierluft bzw. -atemwegen ist ein Test, der spezifisch saure und neutrale Mucoproteine in einer linearen Weise von 0,5 ug bis mindestens 10 ug mißt. Der Test umfaßt Aussetzen eines Versuchstiers gegenüber einem mutmaßlichen metaplastischen Auslöser, Entfernen der Lungen, Homogenisieren in einer geeignet gepufferten Lösung, die Reduktionsmittel und Proteaseinhibitoren enthält, Entfernen von Feststoffteilchen, Behandeln mit SDS und Größenfraktionierung des löslichen Extrakts. Das Hochmolekulargewichts-Material wird immobilisiert und entweder auf saure oder auf neutrale Mucosubstanzen angefärbt, und die spezifische Anfärbung wird quantifiziert. Die beobachteten Veränderungen stimmen mit jenen überein, die in histologischen Schnitten der exponierten Gewebe zu sehen sind. Der Test ist nützlich bei der Bestätigung des metaplastischen Potentials von verdächtigten Verbindungen, bei der Bestimmung, welche(r) neurohumorale(n) Mediator(en) in der Mucuszellenmetaplasie in Tiermodellen für chronisch-obstruktive Atemwegserkrankung beteiligt ist (sind), beim Identifizieren von Verbindungen, die diese Wirkungen verbessern können, und bei der Entwicklung therapeutischer Agenzien, die die Mucushypersekretion bei Personen lindern würden, die an chronisch-obstruktiver Atemwegserkrankung leiden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1. Alcianblau- und PAS-Quantifizierung der Muzinstandards. Die angegebenen Mengen an Schweinemagenmuzin (1% Sialsäuregehalt) (Kreise) und submaxilläres Rindermuzin (5% Sialsäuregehalt) (Quadrate) wurden dotgeblotted auf eine Immobilon-P-Membran. Die Membranen wurden entweder mit PAS (Tafel a) oder mit Alcianblau (Tafel b) angefärbt. Die angefärbten Membranen wurden durchsichtig gemacht durch Anfeuchten mit 1-Heptanol, und Extinktionen wurden gemessen unter Verwendung eines 96-Mulden-Bio-Rad- Plattenlesers. Jeder Punkt stellt den Mittelwert dreifacher Bestimmungen dar.
Fig. 2. Sepharose CL-6B-Chromatographie von Ratten-Gesamtlungen- Extrakten. Ein Extrakt wurde hergestellt durch Polytronieren einer Ratten- Gesamtlunge in einer Lösung (5 ml/g Gewebe), die enthielt, in mM, NaH&sub2;PO&sub4;, 20; EDTA, 2; und DTT, 10; und 0,05% Natriumazid und 1 mg/ml Leupeptin; pH 7,4. Ein Aliquot des Extrakts (1 ml) wurde von der Säule (1,0 · 20 cm) mit einer phosphatgepufferten Salzlösung, die 10 mM DTT, 0,05% Natriumazid und 2 mM EDTA, pH 7,4, enthielt, eluiert. Fraktionen (1 ml) wurden bei einem Durchsatz von 0,5 ml/Minute gesammelt. Säulenfraktionen (100 ul) wurden dotgeblotted auf Immobilon-P-Membranen und entweder mit PAS (ausgefüllte Quadrate) oder Alcianblau (leere Quadrate) angefärbt. Die Extinktionen wurden gemessen. Das Ausschließungsvolumen der Säule wurde bestimmt unter Verwendung von Dextran-Blau 2000. Die Säulenkalibrierung wurde durchgeführt unter Verwendung von Proteinen mit bekannter molekularer Größe (Einsatz).
Fig. 3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese des Luftwegsextraktmaterials, das im Säulenausschlußvolumen eluiert wurde. Proben, die aus dem Ausschlußvolumen der an Sepharose CL-6B chromatographierten Luftwegsextrakte erhalten wurden, wurden in einem Puffer, der 2% SDS mit 10 mM Mercaptoethanol enthielt, bei 100ºC für 4 Minuten inkubiert. Proben wurden auf 4-20%-ige Tris-Glycin-Acrylamid-Gele aufgetragen und bei 200 V für 2h der Elektrophorese unterworfen. Die Gele wurden 3 · 15 Minuten gewaschen und mit einer Lösung, die 40% Methanol (Vol./Vol.) und 10% Essigsäure (Vol./Vol.) enthielt, fixiert. Die Gele wurden entweder mit Coomassieblau (Tafel a) oder Alcianblau (Tafel b) angefärbt. Spur 1) Proteinstandards; Spuren 2 bis 5) Kontrollratten; Spuren 7-9) metabisulfitexponierte Ratten.
Fig. 4. Auswirkung der Probendesaminierung auf das Alcianblau-Anfärben. Das Ausschlußvolumenmaterial, das von einem Rattengesamtlungenextrakt erhalten wurde, wurde mit Säulenpuffer auf die angezeigten Fraktionen verdünnt. Die verdünnten Proben (100 ul) wurden dotgeblotted auf Immobilon- P-Membranen. Die Membranen wurden über Nacht in einer Lösung, die 2 M NaNO&sub2; und 12,5% Eisessig enthielt, inkubiert. Die Membranen wurden 2 · 15 min in mit Milli-Q behandeltem Wasser gewaschen und mit Alcianblau angefärbt, und die Extinktionen wurden gemessen. Die Werte sind Mittelwerte von 3 getrennten Experimenten, die doppelt ausgeführt wurden, ± SEM. Leere Symbole repräsentieren unbehandelte Membranen; gefüllte Symbole repräsentieren Membranen, die einer Desaminierung unterzögen wurden.
Fig. 5. Enzymatische Verdauung des Ausschlußvolumenmaterials. Extrakte von Rattengesamtlungen (Kontrolle und natriumbisulfitexponierte) wurden hergestellt und an einer Sepharose CL-6B-Säule, wie in Fig. 2 beschrieben, chromotographiert. Die Proben (1 ml) wurden entweder mit Hyaluronidase oder Chondroitinase AC inkubiert. Die Enzymverdauungsmaterialien wurden erneut chromatographiert und die Mengen an verbleibendem Alcianblau-positiv-Material (Tafel a) und PAS-positiv-Material (Tafel b) im Ausschlußvolumen bestimmt. Die Werte sind Mittelwerte von 3 getrennten Experimenten, die dreifach durchgeführt wurden, ± SEM. MBS = Natriummetabisulfit.
Fig. 6. Wirkung der Metabisulfitexposition auf Rattenluftwegsmuzingehalt. Die Lungen wurden entfernt aus Ratten, die für 3 Wochen exponiert worden waren entweder gegenüber H&sub2;O oder 10%igem Metabisulfitnebel. Der Luftwegsmuzingehalt wurde gemessen durch Sepharose CL-6B-Chromatographie der Extrakte, Desaminierung der dotgeblotteten Membranen und Anfärben der HMW-Mucusglykoproteine entweder mit PAS oder Alcianblau, wie vorangehend beschrieben. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Total-Gesamtlungen-Muzine (Tafel a) oder Muzine pro Gramm Lungengewebe (Tafel b). Kontrollwerte sind Mittelwerte ± SEM von 4 Tieren; Metabisulfit-Werte sind Mittelwerte ± SEM von 3 Tieren. Metabisulfit gegen Kontrolle P< 0,01.
Fig. 7. Agarose-Gelelektrophorese des Ausschlußvolumenmaterials aus dem Kontrollexperiment und von metabisulfitexponierten Ratten. Proben, die erhalten wurden aus dem Ausschlußvolumen der an Sepharose CL-6B chromatographierten Luftwegsextrakte, wurden in einem Puffer, der 2% SDS mit 10 mM Mercaptoethanol enthielt, bei 100ºC für 4 Minuten inkubiert. Die Proben wurden auf 2%-Agarose-Tris-Glycin-Gele geladen und einer Elektrophorese bei 200 V für 2h unterzogen. Die Proteine wurden überführt auf Immobilon- P-Membranen unter Verwendung eines Bio-Rad-Transblotapparats in einem Towbin-Puffer. Die Membranen wurden auf HMW-Mucusglykoproteine mit PAS (Tafel a) oder Alcianblau (Tafel b) angefärbt. Spur 1): Proteinstandards; Spuren 2 bis 5): Kontrollratten; Spuren 6-8): metabisulfitexponierte Ratten.
Fig. 8. Kombiniertes Alcianblau/PAS-Anfärben von Lungengewebe von Ratten, die aerosolisiertem H&sub2;O oder Natriummetabisulfit ausgesetzt waren. Die Gewebe von mit H&sub2;O behandelten Tieren (Tafel (a)) und von Tieren, die Natriummetabisulfit ausgesetzt wurden (Tafel (b)), wurden fixiert und mit Alcianblau/PAS angefärbt. Die Tafeln (a) und (b) zeigen Querschnittsflächen des linken Lappens, der einen sekundären Bronchius enthält. Die Pfeile auf Tafel (b) heben die Flächen mit intensiver Alcianblau/PAS- Anfärbung der Epithelzellschicht von mit Natriummetabisulfit behandelten Tieren hervor. AV = alveolärer Raum; L = bronchialer Luminalraum.
Fig. 9. Auswirkung von Natriummetabisulfitexposition auf den Rattenluftröhrenmuzingehalt. Die Luftröhren wurden Ratten entnommen, die für 3 Wochen entweder Raumluft, H&sub2;O oder 10%igem Natriummetabisulfitnebel ausgesetzt waren. Der Luftwegmuzingehalt wurde gemessen durch Sepharose CL- 6B-Chromatographie der Extrakte, Desaminierung der dotgeblotteten Membranen und Anfärbung der HMW-Mucusglykoproteine mit entweder PAS oder Alcianblau, wie vorangehend beschrieben. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Gesamtluftröhrenmuzine (Tafel a) oder Muzine pro Gramm Luftröhrengewebe (Tafel b). Kontrollwerte sind Mittelwerte ± SEM von 4 Tieren; Natriummetabisulfit-Werte sind Mittelwerte ± SEM von 3 Tieren. * Natriummetabisulfit gegen H&sub2;O-Kontrolle P< 0,01.
Fig. 10. Auswirkung von organischen Lösungsmitteln auf die Immobilon-P-Membran-Transluzenz. Immobilon-P-Membranen wurden in die angegebenen Lösungen eingetaucht und mit der Oberseite nach unten auf dem Boden einer 96-Mulden-Flachboden-ELISA-Platte plaziert, und die optische Dichte des Hintergrunds wurde bei den angezeigten Wellenlängen gemessen.
Fig. 11. Auswirkung von Natriummetabisulfit auf den Mucusglykoproteingehalt in Bronchiolarspülungsproben. Bronchiolarspülungen wurden ausgeführt an betäubten Ratten, die aerosolisiertem H&sub2;O oder Natriummetabisulfit für die angezeigten Zeiträume ausgesetzt worden waren. Die Spülungsproben wurden erhalten durch Vereinigung von 3 · 5 ml Spülflüssigkeit unter Verwendung von phosphatgepufferter Salzlösung. Die Proben wurden zentrifugiert, um zelluläres Material zu entfernen, und ein 1-ml- Aliquot des Überstands wurde an einer Sepharose CL-6B-Säule eluiert, und die Mucusglykoproteine wurden gemessen.
Fig. 12. Auswirkung von Atropin auf den Rattenmucusglykoproteingehalt. Atropin wurde den Ratten 30 Minuten zur Natriummetabisulfitnebelexposition verabreicht.
Fig. 13. Auswirkung von sechswöchiger SO&sub2; Exposition auf den Rattenlungen-Mucusglykoproteingehalt. Die Ratten wurden 250 ppm SO&sub2;-Gas ausgesetzt für 5 h/Tag, 5 d/Woche, für insgesamt 6 Wochen. Der Gehalt an neutralen und sauren Mucusglykoproteinen des Gewebes wurde gemessen. n = 6 Tiere für jede Behandlungsgruppe.
Fig. 14. Auswirkung von sechswöchiger SO&sub2;-Exposition auf den Rattenluftröhren-Mucusglykoproteingehalt. Die Ratten wurden 250 ppm SO&sub2;-Gas ausgesetzt für 5 h/Tag, 5 d/Woche, für insgesamt 6 Wochen. Der Gehalt an neutralen und sauren Mucusglykoproteinen der Luftröhren wurde gemessen. n = 6 für jede Behandlungsgruppe.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung ist ein rasches und einfaches Verfahren, mit dem die Niveaus an sauren und neutralen Muzinen im Lungengewebe abgeschätzt werden können. Es erweitert die Verwendung von PAS- und Alcianblau-Anfärbung von histologischen Schnitten auf Dot-blotting von Membranen, wie beispielsweise Immobilon-P-Membranen. Die quantitative Bestimmung von PAS-positiven. Glykoproteinen in Lösung wurde zuerst von Mantle und Allen gezeigt [Mantle, M. und A. Allen. (1978), Biochem. Soc. Trans. 6:607-609], das von ihnen beschriebene Verfahren erforderte jedoch mindestens 2 Stunden Inkubation mit Periodsäure zur vollständigen Probenoxidation und weitere 30 Minuten für die Farbentwicklung mit Schiffscher Lösung. Außerdem wurden die Reagenzien wiederholt für jede getestete Probe pipettiert.
Das vorliegende Verfahren nutzt eine feste Matrix, auf der die Proben aufgebracht werden, wobei die Zeitdauer, die für eine vollständige Oxidation der Probe erforderlich ist, auf 5 Minuten reduziert wird und sich eine stabile Farbe innerhalb von 5 Minuten entwickelt. Außerdem können bis zu 96 Proben getestet werden durch Eintauchen der Immobilon-P-Membranen in die PAS-Reagenzien, anstatt daß die Lösungen sauber in individuelle Röhrchen zu pipettieren sind.
Thornton et al. [(1989) Anal. Biochem. 182:160-164] beschreibt einen quantitativen PAS-Test, der das Blotten von Mucusglykoproteinen auf Nitrocellulose-Membranen umfaßt. Unter Verwendung einer Schwarzweiß-Kamera, die über eine Schnittstelle mit einem Mikrocomputer-basierten Bildanalysesystem verbunden war, waren sie in der Lage, so geringe Quantitäten an Muzinglykopeptiden wie 0,05 ug zu messen. Allerdings lag die Linearität der Messungen nur über einen 4-fachen Konzentrationsbereich vor. Der Mangel an Linearität in ihrem Test kann auf den inhärenten Mangel im dynamischen Bereich in der benutzten Kamera zurückzuführen sein.
Durch das Durchscheinendmachen der Membran mit Paraffinflüssigkeit oder Durchsichtigmachen mit 1-Heptanol oder einem anderen Niederalkanol (siehe Fig. 10) kann die vorliegende Erfindung ausgeführt werden in einem 96-Mulden-Plattenleser zur Messung der Anfärbungsintensität mit Linearität über einen 40-fachen Konzentrationsbereich für PAS-Anfärbung und einen 20- fachen Bereich für Alcianblau. Ferner vermeidet die Benutzung eines Plattenlesers die Notwendigkeit eines komplexen und teuren Bildgebungssystems.
Ein kolorimetrischer Test von Mucusglykoproteinen unter Verwendung von Alcianblau ist von Hall et al. [(1980), Biochem. Soc. Trans. 8:72 (Abstr.)] berichtet worden. Dieser Test basiert auf Bestimmungen in Lösung, und ähnlich den von Mantle und Allen [(1978) Biochem. Soc. Trans. 6:607-609] berichteten PAS-Bestimmungen schließt der Test eine Zahl von Zentrifugierungsschritten sowie ausgedehnte Inkubationszeiten ein. Das hier beschriebene Verfahren erfordert nur, daß die Proben auf die Membran aufgebracht und mit Alcianblau angefärbt werden. Die erforderliche tatsächliche Anfärbungs- und Entfärbungszeit beträgt weniger als 30 Minuten und schließt minimales Pipettieren von Reagenzien ein.
Die Messung von lediglich HMW-Mucusglykoprotein in den Gesamtlungenextrakten wird durch Verwendung des Materials erleichtert, das in das ausgeschlossene Volumen einer Größenausschlußsäule, wie z.B. Sepharose CL- 6B-Gel, eluiert wird. Es wird durch den Widerstand dieses Materials gegenüber enzymatischer Verdauung mit Hyaluronidase und Chondroitinase bestätigt, daß das PAS- und Alcianblau-Material Mucusprotein ist. Der Mangel an Alcianblauanfärbung zeigt, in Übereinstimmung mit Scott und Dorling [Scott, J.E. und J. Dorling, (1965), Histochemie 5:221-233], an, daß Heparin/Heparan- und Keratansulfate nicht im ausgeschlossenen Volumen gegenwärtig waren. Wie in Fig. 7 gezeigt, umfaßt das PAS- und Alcianblau- Anfärben von Material in dem Ausschlußvolumen Material, das größer als 250 kD ist.
Unter gemäßigten Reduktions- und Dissoziationsbedingungen kann eine signifikante Menge an Niedrigmolekulargewichtsprotein mit dem Muzin zusammen eluiert werden. Dieses zusätzliche Protein inhibiert Alcianblau- Anfärben des Mucus. Das Quenchen des Alcianblau-Anfärbens resultiert höchstwahrscheinlich aus dem Maskieren der Alcianblau-Bindungsstellen am Muzin durch Aminogruppen der kontaminierenden Proteine. Wir haben entdeckt, daß Desaminieren der Proben eine Verschiebung in der Probenverdünnungskurve verursacht (Fig. 4).
Luftröhrenspülungeproben zeigen auch die Anwesenheit von kontaminierenden Proteinen, die die Muzin-Messungen mittels eines auf einem fucosespezifischen Lektin basierenden Tests stören. Das beobachtete nichtlineare Verhalten der Proben nach Verdünnung wird überwunden durch Abtrennen der Muzine von dem kontaminierenden Protein an einer Größenausschlußsäule, wie etwa Sepharose CL-6B-Gel, unter dissoziierenden Bedingungen.
Die Nützlichkeit dieses Tests zur Untersuchung von Veränderungen im Muzingehalt in Luftwegen von Tiermodellen für Hypersekretion wird demonstriert durch Exponieren der Lungen von Ratten gegenüber Metabisulfit. Die Mengen an gesamtem neutralen und sauren Muzin, die in Vergleichslungen gemessen wurden, wurden als 1,1 mg bzw. 6,1 mg Muzin befunden. Das Verhält nis von saurem/neutralem Muzin (5,5:1) ist in Übereinstimmung mit dem aus Luftröhrengewebskulturen von Ratten (4,2:1) ausgeschiedenen [Kaizu, T., et al. (1978). Comp. Biochem. Physiol. 62B:195-200] und mit dem unter Verwendung von Differentialanfärbung von histologischen Schnitten gemessenen (2:1) [Sturgess, J. und L. Reid. (1973), Br. J. Exp. Path. 54:338-403].
Wir haben ferner die vorangehende Vorgehensweise für das Messen von sowohl sauren als auch neutralen Mucoglykoproteinen in einer Weise verfeinert, die eine größere Empfindlichkeit und Spezifizität, als zuvor zugänglich, erlaubt.
In einer Ausführungsform wird das lösliche Protein aus der Rattengesamtlunge extrahiert und mit 0,1% SDS und 10 mM Mercaptoethanol inkubiert. Die Probe wird auf eine Sepharose CL-6B-Säule aufgebracht und davon eluiert. Das Material, das in der Ausschlußfraktion der Säule eluiert, enthält beträchtliche Mengen an Niedrigmolekulargewichtsprotein, wenn das Ausschlußvolumenmaterial, das einer SDS-PAGE unterworfen und auf PVDF- Membranen elektrogeblottet worden war, mit Coomassieblau-Anfärben bestimmt wurde. Alcianblau-Anfärben von PVDF-Membranen, auf die das gleiche Material aus einer SDS-PAGE elektrogeblottet wurde, zeigte, daß 50-60% des gesamten anfärbbaren Materials von hohem Molekulargewicht (HMW) (> 205 kD) sind.
Um ausschließlich nur das HMW-Material anzufärben, haben wir Bedingungen eingestellt, die die Dissoziation der Niedrigmolekulargewichts- (LMW)-Proteine von HMW-Proteinen, die im Säulenausschlußvolumen eluieren, erlaubt. Aliquots des Luftwegsextrakts werden inkubiert mit 10 mM Mercaptoethanol und zunehmenden Konzentrationen an SDS von 0,1% bis 2,0%. Die Proben werden auf 68ºC für 2 Minuten erhitzt und dann an Sephacryl S300 HR in einer wassergekühlten Säule chromatographiert, die bei 37ºC gehalten wird. Protein, das von der Säule eluiert, wird bei 280 nm beobachtet. Die Menge an Protein, das in der Ausschlußfraktion eluiert, vermindert sich mit zunehmenden Konzentrationen an SDS, beurteilt nach der Peakhöhe im Elutionsprofil. Da Mucusglykoproteine keine Extinktion bei 280 nm zeigen, indizieren diese Ergebnisse, daß Nicht-Muzin-LMW-Proteine nicht zusammen mit den HMW-Mucusglykoproteinen eluiert wurden. Diese Schlußfolgerung wird ferner gestützt durch Ergebnisse, die durch Coomassieblau-Anfärben des Ausschlußvolumenmaterials nach SDS-PAGE erhalten werden. Die Mengen an LMW-Protein (< 205 kD), die im Ausschlußvolumen eluieren, werden mit progressiver Zunahme an SDS vermindert. Die Mengen an HMW-Mucusglykoprotein wurden in keinem signifikanten Ausmaß betroffen, wenn dieselben Ausschlußvolumenfraktionen einer Elektrophorese auf 2%-Agarose-Gelen unter zogen, auf PVDF-Membranen überführt und mit entweder PAS oder Alcianblau angefärbt werden.
Wir versuchten, andere ionische und nichtionische Detergenzien als SDS zu verwenden, aber diese Detergenzien waren nicht in der Lage, die dissoziativen Eigenschaften zu bieten, die für die teilweise Reinigung der Mucusglykoproteine aus den Luftwegsextrakten erforderlich sind.
Wenn sie mit den gleichen Proben, die mit 0,1% SDS behandelt wurden, verglichen werden, zeigen solche Proben, die mit 2,0% SDS inkubiert wurden, in den Extrakten, die aus Tieren hergestellt wurden, die SO&sub2; ausgesetzt worden waren, größere Unterschiede zur Luftexposition. Diese Unterschiede sind höchstwahrscheinlich das Ergebnis der Verminderung an LMW-Proteinen, die in der Ausschlußvolumenfraktion der Säule eluieren, die mit PAS- oder Alcianblau-Anfärbungsmitteln reagieren können. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung Luftwegsextrakte mit etwa 2% SDS vor der Größenfraktionierung des Extrakts und der Immobilisierung behandelt.
Die Gesamtmengen an Muzin, die in den Luftwegen mit unserem Test gemessen wurden, können eine Unterschätzung des wahren Mucusglykoproteingehalts im Luftwegsgewebe sein. Das Fehlen einer radiomarkierten Muzinsonde macht es schwierig abzuschätzen, wieviel Mucusglykoprotein mit den Feststoffteilchen verbunden ist, die nach dem Zentrifugieren verworfen werden. Trotzdem ist der hypotonische Puffer, der für die Muzinextraktion verwendet wird, im Vergleich mit einem isotonischen Medium eindeutig 4mal effizienter. Dieser Unterschied kann zurückzuführen sein auf günstigere Bedingungen für das Aufbrechen und Entleeren von Zellen und Sekretgranula, die Mucusglykoproteine enthalten. Trotz dieser Schwierigkeit ist es klar, daß sich die gemessenen Zunahmen an Gesamtmuzin (Hypertrophie, Hyperplasie) und an Muzin pro Gramm Gewebe (hyperplastisch) in Übereinstimmung mit den beobachteten histologischen Veränderungen befinden. Die Feststellung, ob eine Eins-zu-Eins-Beziehung zwischen dem gemessenen Muzin und den morphometrischen Bestimmungen erhalten bleibt, würde eine Untersuchung jedes einzelnen Gewebeschnitts und die Bestimmung des Muzingehalts jeder Zelle erfordern. Allerdings berichten Lamb und Reid [(1968), J. Path. Bact. 96:97-111], die kombiniertes PAS/Alcianblau-Anfärben der histologischen Schnitte anwendeten, Veränderungen der Luftwege, die den von uns gemessenen Veränderungen ähnlich sind. Diese Forscher benutzten SO&sub2; statt Metabisulfitnebel, aber es wird berichtet, daß die aktive Komponente in Metabisulfitnebel SO&sub2;-Gas ist [Fine, J.M., et al. (1987), Am. Rev. Respir. Dis. 136:1122-1126], und daher können ähnliche Veränderungen mit den beiden Reizstoffen erwartet werden. Während Bronchiokonstriktion bei Meerschweinchen nach Exposition gegenüber Metabisulfitnebel beschrieben worden ist [Lotval, J.O., et al. (1990), Am. Rev. Respir. Dis. 142:1390- 1395], ist die Verwendung von Metabisulfit als Auslöser metaplastischer Veränderungen nicht berichtet worden.
SO&sub2; ist ein Agens, das sowohl in Zigarettenrauch als auch bei städtischer Luftverschmutzung weit verbreitet ist. Basbaum und Mitarbeiter [(1991), Biochem. Biophys. Res. Comm. 181:1-8] haben gezeigt, daß die Exposition von Ratten gegenüber SO&sub2; einen Anstieg der Muzingentranskription, der Mucoproteinexpression und der Transdifferenzierung von Nicht- Mucus-enthaltenden Zellen in Zellen, die Mucus produzieren und ausscheiden, verursachen. Ein offensichtlicher Nachteil des Gebrauchs von SO&sub2; als mucuszelleninduzierendes Agens bei kleinen Laboratoriumstieren ist seine inhärente Toxizität für den Menschen. Die sichere Handhabung und der Gebrauch von Gasflaschen, die konzentriertes SO&sub2; enthalten, erfordern besondere Vorsichtsmaßnahmen und Einrichtungen, die bestimmte Institutionen von der Anwendung dieses Agens für die Entwicklung von Tiermodellen ausschließen können. Fine et al. [(1987), Am. Rev. Respir. Dis. 136:1122- 1126] haben gezeigt, daß Natriummetabisulfitlösung bei pH 3,5 SO&sub2;-Gas freisetzt. Die SO&sub2;-Niveaus, die von einer 1%igen Natriummetabisulfitlösung generiert wurden, wurden als größer als 5 ppm, die obere Nachweisgrenze, bestimmt. Auf Grund der Leichtigkeit der Handhabung dieses Auslösers ist er eine überlegene Verbindung für diesen Zweck.
Dieser Test kann daher erfolgreich eingesetzt werden, ebenso wie mit Mucusglykoprotein-spezifischen Antikörpern und cDNA-Sonden, als Hinweis auf hypertrophische und hyperplastische Veränderungen.
Somit ist diese Erfindung ein nützlicher Test für die Messung von Tierluftwegsmucusglykoproteingehalt. Der Test ist schnell, einfach und erfordert keine Sonden, die spezies- und modellspezifisch sein können. Der Test ist insbesondere nützlich für Forscher, die neurohumorale Komponenten zu studieren wünschen, die in hochregulierter Mucusglykoproteinexpression in Kleintier-Modellen der chronisch-obstruktiven Atemswegserkrankung involviert sind.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren für die rasche Bestimmung hyperplastischer und hypertropher Veränderungen in Tierluftwegen, bei dem saure und neutrale Mucoproteine spezifisch gemessen werden, das die Schritte umfaßt:
a) ein Versuchstier einem vermutlichen metaplastischen Auslöser auszusetzen;
b) Entfernen der Lungen des Versuchstiers und Homogenisieren der Lungen in einer geeignet gepufferten hypotonischen Lösung, die Reduktionsmittel und Proteaseinhibitoren enthält;
c) Entfernen der Feststoffteilchen und Größenfraktionierung des löslichen Extrakts;
d) Immobilisieren des Hochmolekulargewichts-Materials;
e) Anfärben des immobilisierten Materials auf entweder saure oder neutrale Mucosubstanzen; und
f) quantitative Bestimmung der spezifischen Anfärbung.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren für die quantitative Bestimmung von Glykoproteinen, das 5 Minuten für die vollständige Oxidation und 5 Minuten für die Entwicklung einer stabilen Farbe für das PAS-Anfärben und 30 Minuten für das Alcianblau-Anfärben erfordert, das umfaßt:
a) Blotten von Proben, die Hochmolekulargewichts-Glykoprotein enthaltenden, auf eine Membran;
b) Desaminierung des geblotteten Materials;
c) Anfärben mit PAS oder Alcianblau;
d) die Membran mit Paraffinflüssigkeit durchscheinend oder mit einem niederen Alkanol, ausgewählt aus 1-Heptanol-, Dodecanol- und Octanol- Flüssigkeit (1-Heptanol ist bevorzugt, siehe Fig. 10), durchsichtig machen; optimalerweise wird die Membran, nachdem die Membran durchsichtig gemacht wurde, in Paraffinflüssigkeit getaucht, die die Membran durchsichtig erhält, wahrscheinlich durch Verzögerung der Verdampfung des flüchtigeren Alkanols; und
e) quantitative Bestimmung der spezifischen PAS- oder Alcianblau-Anfärbung.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren für die Bestimmung der hyperplastischen und hypertonischen Veränderungen in Tierluftwegen, in dem saure und neutrale HMW-Mucoproteine spezifisch gemessen werden, das die Schritte umfaßt:
a) ein Versuchstier einem vermutlichen metaplastischen Auslöser auszusetzen;
b) Entfernen der Lungen des Versuchstiers und Homogenisieren der Lungen in einer geeignet gepufferten hypotonischen Lösung, die Reduktionsmittel, Proteaseinhibitoren und SDS enthält;
c) Entfernen der Feststoffteilchen und Größenfraktionung des löslichen Extrakts;
d) Immobilisieren des Hochmolekulargewichts-Materials;
e) Anfärben des immobilisierten Materials auf entweder saure oder neutrale Mucosubstanzen; und
f) quantitative Bestimmung der spezifischen Anfärbung.
Die folgenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt, um die Erfindung weiter zu beschreiben, ohne die Erfindung auf die dortigen Einzelheiten zu beschränken. Für die folgenden Beispiele gilt folgendes, soweit nichts anderes angegeben ist:

Materialien und Verfahren

Tiere

Krankheitserregerfreie männliche Fisher-344-Ratten mit einem Gewicht von 250-300 g wurden erhalten von Charles River Breeders (Que., Can.) und verwendet innerhalb von 3 Tagen nach dem Eintreffen. Sie wurden in krankheitserregerfreien Unterkünften untergebracht und mit Nagetier-Laboratoriumsfutter mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten.

Chemikalien und Enzyme

Periodsäure-Lösung, Schiffsches Reagenz, Muzin (Typ I, III) und Chondroitinase AC und ABC wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Sepharose CL-6B wurde von Pharmacia (Montreal, QUE) und Alcianblau 8GX von Allied Chemical (Morristown, NJ) erhalten. DL-Dithiothreitol (DTT), Leupeptin, Natriummetabisulfit und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) wurden ebenfalls von Sigma bezogen. Natriumazid wurde von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WIS) und Benzamidin von Calbiochem Corp. (La Jolla, CA) bezogen. Rinderalbumin (Fraktion V) (BSA) wurde von Gibco Laboratories (Grand Island, NY) bezogen. Paraffinflüssigkeit stammte von BDH (Montreal, QUE). Alle anderen Chemikalien wurden von normalen kommerziellen Quellen erhalten und waren analysenrein.

BEISPIEL 1

Exposition von Ratten gegenüber Metabisulfit

Die Tiere wurden in Plexiglaskammern plaziert und für 3 Wochen entweder einem Nebel von mit Milli-Q behandeltem Wasser oder einer Lösung, die 10% (Gew./Vol.) Na&sub2;S&sub2;O&sub5;, pH 2,5, enthielt, ausgesetzt. Die Tiere wurden exponiert für 1h · 5 Tage in der ersten Woche, 1,5h · 5 Tage in der zweiten Woche und schließlich 2h · 5 Tage in der letzten Woche. Alle Ratten wurden unter kranheitserregerfreien Bedingungen für die Dauer der Exposition gehalten und 5 Tage nach der letzten Metabisulfit-Behandlung getötet.

Exposition der Ratten gegenüber SO&sub2;

Die Tiere wurden in Plexiglaskammern plaziert und SO&sub2;-Gas (250 ppm) für 5h/Tag, 5 Tage/Woche, für insgesamt 6 Wochen ausgesetzt. Alle Ratten wurden unter krankheitserregerfreien Bedingungen für die Dauer der Exposition gehalten und 4 Tage nach der letzten Exposition getötet.

BEISPIEL 2

Extraktion von Mucusglykoproteinen aus Rattenluftwegsgewebe

Die Tiere wurden betäubt mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumpentobarbital (65 mg/kg). Die Luftröhre und die Lungen wurden rasch entfernt und getrennt polytroniert (40 Sek.) in einer eiskalten Lösung (1,5 ml/Luftröhre; 5 ml/g Lungengewebe), die (in mM) enthielt: NaH&sub2;PO&sub4;, 20; EDTA, 2; DTT, 10; 0,05% Natriumazid und 1 mg/ml Leupeptin; pH 7,4. Lösliches Protein wurde erhalten durch Zentrifugieren des gesamten Homogenats bei 39000 · g für 60 Minuten in einer Sorval RC-5B-Zentrifuge bei 4ºC. Der Überstand wurde von den Membranpellets abgetrennt und bei -70ºC aufbewahrt.

BEISPIEL 3

Sepharose CL-6B-Chromatographie der Rattenluftwegsextrakte

Ein 1-ml-Aliquot des wie in Beispiel 2 erhaltenen Überstands wurde rasch aufgetaut in Gegenwart von 0,1% SDS und 10 mM Mercaptoethanol und auf eine Säule (1,0 · 20 cm) aufgebracht, die mit Sepharose CL-6B-Gel gepackt und mit Laufpuffer äquilibriert war. Ein automatischer Bio-Rad AS- 100-HRLC-Probennehmer wurde benutzt, um Luftwegsextraktproben auf die Säule zu injizieren. Die Probe(n) wurde(n) eluiert mit phosphatgepufferter Salzlösung, die 0,05% Natriumazid, 10 mM DTT und 2 mM EDTA, pH 7,4, enthielt. Säulenfraktionen wurden gesammelt bei einem Durchsatz von 0,5 ml/Minuten und auf Protein bei 280 nm unter Verwendung einer UV-2-Pharmacia-Durchflußzelle mit Schreiber untersucht. Die Säule wurde kalibriert durch Bestimmung der Elutionsvolumina von Dextranblau 2000 (Pharmacia) und Gelfiltrationsstandards, die von Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) erhalten wurden. Die gesamte Säulenchromatographie wurde in einem Kühlraum, der bei 4ºC gehalten wurde, ausgeführt.
Rattengesamtlungen wurden aus den Tieren entfernt und von Nichtluftwegsgewebe gereinigt. Die Homogenisierung wurde ausgeführt in einem hypotonischen Puffer, der Reduktionsmittel und Proteaseinhibitoren, wie in Beispiel 2 beschrieben, enthielt. Ein vierfach größerer Ertrag an Mucusglykoprotein aus den Lungen wurde erreicht unter Verwendung eines hypotonischen Puffers gegenüber einer phosphatgepufferten Salzlösung.
Alcianblau- und PAS-Anfärben (siehe Beispiel 4) der Membranen, die mit Fraktionen geblottet wurden, die von der Säule eluiert wurden, offenbart eine hohe Konzentration an Glykoprotein im Ausschlußvolumen der Säule mit einigem Glykoprotein in den nachlaufenden Fraktionen. Die molekulare Größe des Materials, das in der Ausschlußfraktion eluiert wurde, wurde als größer als 670000 Daltons abgeschätzt, wie berechnet aus den Elutionsprofilen bekannter Standards und von Dextranblau 2000 (Fig. 2).
Um zu bestimmen, ob das PAS- und Alcianblau-reaktive Material, das im Ausschlußvolumen eluiert wurde, Hochmolekulargewichts(HMW)-Makromoleküle und/oder Großaggregate kleinerer Moleküle enthielt, wurde das im Ausschlußvolumen enthaltene Material einer SDS-Elektrophorese auf 4-20% -Polyacrylamid- und 2%-Agarose-Gelen unterworfen. Polyacrylamidgele, die mit Coomassieblau angefärbt wurden, zeigten eine beträchtliche Menge an Protein in Spuren, wo Proben aufgetragen wurden, die aus der Ausschlußfraktion hergestellt wurden (Fig. 3a). Gele, die mit denselben Proben beladen und mit Alcianblau angefärbt wurden auf Glykoprotein, zeigten kein positives Anfärben von Material im Größenbereich von 250 kD und kleiner (Fig. 3b). Anfärben wurde beobachtet für HMW-Glykoprotein im Sammelbereich des Gels. Die Ergebnisse, die mit PAS-Anfärben erhalten wurden, waren ähnlich denen mit Alcianblau. Diese Ergebnisse indizieren, daß unter moderaten Reduktions- (10 mM DTT und Mercaptoethanol) und Dissoziationsbedingungen (0,1% SDS) extrahiertes Lungenmaterial, das von dem Sepharose CL-6B-Gel ausgeschlossen wurde, aus HMW-Makromolekülen besteht, die von PAS und Alcianblau positiv gefärbt und mit. Niedermolekulargewichts-Proteinen gemeinsam eluiert werden, die nicht nachweisbar sind mit glykoproteinsensitiven Anfärbemitteln, wenn sie einer SDS-PAGE unterworfen werden.

BEISPIEL 4

Quantitative Bestimmung der Luftwegmuzine durch PAS- und Alcianblau- Anfärben

Die Bestimmung von Alcianblau- und PAS-positivem Material erfolgte durch Aufbringen der Muzinstandards oder Säulenfraktionen (25-100 ul) auf eine vorbefeuchtete Immobilon-P Membran (Millipore, Bedford, MA) unter Verwendung eines 96-Mulden-Dot-Blot-Filtrationsapparats von Gibco (Burlington, ONT) unter einem Vakuum von 300mmHg. Jede Mulde wurde zweimal mit 250 ul einer Lösung gewaschen, die 50 mM Natriumbicarbonat enthielt. Die Membran wurde aus dem Apparat entnommen und 2 · 5 Minuten mit mit Milli-Q behandeltem Wasser gewaschen. Um das Alcianblau-reaktive Material quantitativ bestimmen zu können, wurde die Membran in einer 5%igen (Gew./Vol.) Lösung von BSA für 5 Minuten inkubiert. Die Membran wurde dann 2 · 5 Minuten in mit Milli-Q behandeltem Wasser gewaschen und in eine Hybridisierungsflasche (Gibco) überführt, die eine Alcianblau-Farbstoff-Lösung (1 g Alcianblau 8GX/100 ml 3%ige (Vol./Vol.) Essigsäure, pH 2,5) enthielt, überführt. Nach fünfminütiger Inkubation wurde die Membran aus der Flasche entfernt und 3 · 5 Minuten mit Milli-Q-Wasser gewaschen. Die Membran wurde im Dunkeln getrocknet und durchsichtig gemacht durch Eintauchen in 1-Heptanol.

Transparentmachen von Immobilon-P-Membranen mit Lösungsmitteln

Um die quantitative Bestimmung des dot-geblotteten Alcianblau- und PAS-positiven Materials auf der Immobilon-P-Membran mit einem 96-Mulden- Plattenleser zu erleichtern, wurden verschiedene Lösungsmittel ausprobiert, um die Membran durchsichtig zu machen (Fig. 10). Durch Befeuchten der Membranen mit Paraffinflüssigkeit wurde die Membran durchscheinend mit gemessenen Extinktionen von 0,65 und 0,81 O.D.-Einheiten bei 655 nm bzw. 550 nm. Anfärben bekannter Muzinstandards mit Hintergrundextinktionen in diesem Bereich ergaben ein extrem schlechtes Signal-Rauschverhältnis von etwa 1:1. Kurzkettige Alkohole, wie z.B. Dodecanol, Octanol und Heptanol, verminderten signifikant die gemessenen Hintergrundextinktionen der Membran und erhöhten konsequenterweise das Signal-Rauschverhältnis der Anfärbungsmessungen auf 8:1 mit Heptanol. Heptanol ist bevorzugt gegenüber Dodecanol wegen der Neigung des letzteren, bei Raumtemperatur zu kristallisieren. Heptanol ist auch gegenüber kürzerkettigen Alkanolen bevorzugt wegen deren Flüchtigkeit und der Beobachtung, daß Ethanol tatsächlich die Membran auflöst. Nachdem die Membran mit einem dieser niederen Alkanole (C&sub5;-C&sub1;&sub2;) durchsichtig gemacht worden ist, wird die Membran in Paraffinflüssigkeit getaucht. Das hält die Membran in einem durchsichtigen Zustand, wahrscheinlich durch Verzögerung der Verdampfung des flüchtigen niederen Alkanols, lange genug, um mit der quantitativen Bestimmung ohne Veränderung des Hintergrundsignals fortfahren zu können.

Quantitative Bestimmung

Die Membran wurde mit der Oberseite nach unten auf dem Boden einer 96-Mulden-Flachboden-ELISA-Platte plaziert, und die optische Dichte der Alcianblau-Anfärbung wurde bei 655 nm mit einem Bio-Rad-Plattenleser gemessen. Die quantitative Bestimmung des Alcianblau-reaktiven Materials wurde erreicht durch Vergleichen der optischen Dichte der Probe mit der von bekannten Mengen an bovinem Unterkieferdrüsenmuzin (Sigma Typ-I). Anfärben auf Heparin/Heparan- und Keratansulfate wurde durchgeführt, wie von Scott und Dorling [(1965) Histochemie 5:221-233] beschrieben. Kurz gesagt wurden die Membranen in ähnlicher Weise behandelt wie die für das Alcianblau, mit der. Ausnahme, daß die Alcianblaufarbstofflösung ersetzt wurde durch eine Lösung, die 0,05 g Alcianblau in 200 mM Acetatpuffer und 60 mM bis 900 mM MgCl&sub2; enthielt.
PAS-positives Material wurde bestimmt durch Aufbringen des Muzinstandards und von Säulenfraktionen auf die Immobilon-P-Membran wie oben beschrieben. Die Membran wurde 2 · 5 Minuten in mit Milli-Q behandeltem Wasser gewaschen und dann in eine Hybridisierungsflasche, die 50 ml Periodsäurelösung enthielt, plaziert. Nach 5 Minuten Inkubation wurde die Membran 2 · 5 Minuten in mit Milli-Q behandeltem Wasser gewaschen, getrocknet und in eine andere Hybridisierungsflasche, die 50 ml Schiffsreagenz enthielt, plaziert und für weitere 15 Minuten inkubiert. Die Membran wurde dann 3 · 5 Minuten mit einer 5%igen Natriummetabisulfitlösung in einem luftdichten Behälter gewaschen und 3 · 5 Minuten mit Milli-Q-Wasser abgespült. Nach dem Trocknen wurde die Membran mit 1- Heptanol durchsichtig gemacht und der Grad an PAS-Anfärbung wurde wie oben beschrieben bei 550 nm gemessen. Die quantitative Bestimmung des PASpositiven Materials in den Säulenfraktionen erfolgte unter Verwendung von Schweinemagenmuzin (Sigma Typ-III) als Standard.

Quantitative Bestimmung der Muzinstandards mit Alcianblau und PAS

Alcianblau- und PAS-Anfärbung wurde ausgeführt auf Immobilon-P-Membranen, die mit bekannten Mengen an gereinigtem Muzin geblottet worden waren. Die mit PAS angefärbten Membranen zeigten bevorzugtes Anfärben von gereinigtem Muzin aus Schweinemagen (PSM) gegenüber bovinem Unterkieferdrüsenmuzin (BSGM). Die Anfärbungsintensität von PSM war etwa zweimal größer als die für BSGM in Dots, bei denen 0,5 ug bis 10 ug des Muzins aufgetragen wurden (Fig. 1a). PAS-Anfärben von PSM war linear von 0,5 ug bis 20 ug. Eine lineare Anpassung von Ext. gegen ug Muzin (ug Muzin = 0,1 + 19,4 · O.D.) wurde für alle generierten Standardkurven beobachtet. Wenn die Membranen mit Alcianblau angefärbt wurden, wurde im Vergleich mit dem PSM über einen Bereich von 0,5 ug bis 10 ug ausschließlich das BSGM angefärbt (Figur b). Linearität für das Alcianblau-Anfärben von BSGM wurde über denselben Bereich beobachtet und routinemäßig in einer linearen Weise angepaßt (ug Muzin = 0,46 + 25,9 · O.D.). Diese Daten indizieren, daß Muzine variierender Acidität verschieden durch Alcianblau und PAS angefärbt werden. Neutrale Muzine werden bevorzugt durch PAS angefärbt, während die Muzine mit mehr Sialsäure oder Sulfat durch Alcianblau angefärbt werden. Verschiedene Typen von Blotting-Membranen wurden auf ihre Fähigkeit zur Muzinbindung untersucht. Obwohl die Zahl der untersuchten Membranen nicht erschöpfend war, wurde geschlossen, daß Immobilon-P die physikalische Stabilität und Muzinbindungskapazität zeigte, welche ein konsistentes Anfärben und eine quantitative Bestimmung von geblotteten Muzinen erlauben würden.

BEISPIEL 5

Desaminierung von dot-geblotteten Proteinen

Muzinstandards und/oder luftwegextrahiertes Material, das von Sepharose CL-6B-Gelchromatographie ausgeschlossen wurde, wurden dot-geblottet auf Immobilon-P-Membranen, wie oben beschrieben. Die Membranen wurden 2 · 5 Minuten in mit Milli-Q behandeltem Wasser gewaschen und dann über Nacht in einer Lösung, die 2 M NaNO&sub2; und 12,5% Eisessig (Vol./Vol.) enthielt, inkubiert. Die Membranen wurden vor dem Anfärben mit PAS oder Alcianblau 2 · 15 Minuten mit mit Milli-Q behandeltem Wasser gewaschen, wie in Beispiel 4 beschrieben.

Auswirkung der Probendesaminierung auf das PAS- und Alcianblau-Anfärben

Um die Anfärbungsintensität des ausgeschlossen Luftwegsmaterials in den linearen Bereich der Muzinstandards zu bringen, wurden Reihenverdünnungen der Proben durchgeführt. Es wurde beobachtet, daß ein gegebener Verdünnungsfaktor nicht zu derselben entsprechenden Verminderung der gemessenen Extinktion für das Alcianblau-Anfärben führte. Da die Luftwegsmuzinproben mit signifikanten Mengen an Fremdprotein assoziiert waren, war es möglich, daß geladene Aminogruppen, die in solchen Proteinen vorhanden sind, die Muzinbestimmungen störten. Wie in Fig. 4 gezeigt, führt eine Probenverdünnung von 1:2 nicht zu einer 50%igen Verminderung der Alcianblau-Extinktion. Weitere Verdünnungen von 1:4 bis 1:16 führten nicht zu entsprechenden Verminderungen der gemessenen Extinktionen. Obwohl es schien, daß das Alcianblau-Anfärben proportional mit den Verdünnungen abnahm, war die Unterbestimmung von unbekanntem Muzin möglich, wenn von der Standardkurve extrapoliert wurde. Desaminierung der Membranen führte zu einer Verschiebung in der Steigung der Probenkurve in Richtung derjenigen, welche für die gereinigten Muzinstandards erhalten wurde. Messungen von Probenmuzinen mit PAS-Anfärben wurden durch das Desaminierungsverfahren nicht bemerkenswert beeinflußt. Eine Erhöhung der Alcianblau- Anfärbung des BSGM-Muzinstandards wurde auch beobachtet nach dem Desaminierungsprozeß. Dies kann zurückzuführen sein auf die Gegenwart von Niedrigmolekulargewichtsproteinen, die im kommerziell erhältlichen Muzin zu finden sind.

BEISPIEL 6

Glykokonjugat-Analyse

Gehirn- und Luftwegsgewebe wurde aus Tieren entfernt, homogenisiert und einer Zentrifugation, wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist, unterworfen. Nach Sepharose CL-6B-Chromatographie wurde die Ausschlußvolumenfraktion auf Anwesenheit von Proteoglykanen durch Behandlung mit spezifischen Enzymen untersucht. Ein-Milliliter-Aliquots wurden in 5%- Vol./Vol.-Essigsäure auf den geeigneten pH-Wert eingestellt, der für die enzymatische Verdauung benutzt wird, und getrennt mit Hyaluronidase (30 E/ml) bei pH 7,0 und 37ºC für 24 Stunden und mit Chondroitin-AC-Lyase (0,4 E/ml) bei pH 7,3 und 37ºC für 24 Stunden behandelt. Eine Kontrolle wurde 24 Stunden lang bei pH 7,4 und 37ºC gehalten. Die Enzymverdauungsmischungen wurden dann an einer Sepharose CL-6B-Säule chromatographiert, und die Mengen an Alcianblau-reaktivem Material wurden quantitativ bestimmt, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist.
Inkubation von Luftwegsmaterial mit Hyaluronidase oder Chrondroitinase hatten keinen signifikanten Effekt auf die Menge von entweder PAS- oder Alcianblau-reaktivem Material in der ausgeschlossenen Fraktion (Fig. 5). Material, das aus Rattengehirn extrahiert und im Ausschlußvolumen der Säule eluiert wurde, wurde durch Inkubation mit Hyaluronidase und Chrondroitinase abgebaut, was anzeigte, daß geeignete Inkubationsbedingungen angewendet worden waren. Die mögliche Anwesenheit von Heparin- und Keratansulfaten wurde mit Alcianblau-Anfärbung überprüft, unter Anwendung der Technik der kritischen Elektrolytkonzentration, die von Scott und Dorling [Scott, J.E. und J. Dorling, (1965), Histochemie 5:221-233] beschrieben wurde. Keine Alcianblau-Anfärbung oberhalb den Hintergrundwerte wurde bei MgCl&sub2;-Konzentrationen von größer als 0,7 M gemessen, was die Abwesenheit sowohl von Heparin/Heparan- als auch von Keratan-Sulfaten in dem ausgeschlossenen Lungenextrakt anzeigte. Dies bestätigt, daß das von dem Sepharose CL-6B-Gel ausgeschlossene Material aus HMW-Mucosglykoproteinen gebildet wird, das durch PAS und Alcianblau angefärbt wird, wenn es auf eine Immobilon-P-Membran dot-geblottet wird. Kleinere Proteine, die nicht von PAS und nicht von Alcianblau angefärbt werden, sind allerdings mit dem eluierten Material assoziert.

BEISPIEL 7

SDS-Polyacrylamid-(PAGE)-und-Agarose-Gelelektrophorese (AGE) von Mucusglykoproteinen

SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese wurde ausgeführt in vorgegossenen 4- 12%-igen Tris-Glycin-Acrylamid-Gelen unter Verwendung eines Novex-Platten gel-Apparats. Die Proben wurden in einem Puffer, der 2% SDS mit 10 mM Mercaptoethanol enthielt, bei 100ºC für 4 Minuten inkubiert. Proben (70 ul) wurden einer Elektrophorese in den Gelen unter Verwendung des Laemmli- Puffersystems (15) bei 100 V für 2 Stunden unterzogen. Die Gele wurden 3 · 15 Minuten gewaschen und mit einer Lösung fixiert, die 40%iges (Vol./Vol.) Methanol und 10%ige (Vol./Vol.) Essigsäure enthielt. Proteine wurden angefärbt mit Coomassie-Brillantblau R250 oder Alcianblau. Die Proben wurden auch einer Elektrophorese in 2%igen Tris-Glycin-Agarosegelen unter Verwendung des Novex-Plattengel-Apparats unter Verwendung des Laemmli-Puffersystems unterworfen. Das Anfärben von Mucusglykoproteinen wurde ausgeführt durch Überführen der Proteine auf eine Immobilon-P-Membran bei 30 V für 12 h in einem Towbin-Puffer [Towbin, H., et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:4350-4354] unter Verwendung eines Bio-Rad-Transblotapparats. Mucusglykoproteine wurden sichtbar gemacht durch Anfärben der Membranen mit Coomassieblau oder Alcianblau, wie in Beispiel 4 beschrieben.

BEISPIEL 8

Gewebefixierung und -Anfärben

Die Tiere wurden betäubt, wie in Beispiel 2 beschrieben, und die Luftröhre, die extrapulmonalen Bronchien und die Lungen wurden entfernt und intratracheal durchtränkt mit einer phosphatgepufferten 10%igen Formalinlösung (Fisher, Montreal, CAN) bei 30 cm Fixierungsdruck für 24 Stunden, wie von Tyler, W.S. et al. (1985), Fund. Appl. Toxic. 5:405-422] beschrieben. Nach der Fixierung wurden 3 konsekutive Quer-Schnitte des linken Flügels, einschließlich des Hauptbronchius, ausgeführt und in Paraffin eingebettet. 4-um-Schnitte wurden geschnitten und mit Alcianblau, pH 2,5/PAS, PAS und Alcianblau, pH 2,5, angefärbt und mikroskopisch auf ihre Histopathologie untersucht.

BEISPIEL 9

Auswirkung der Metabisulfitexposition auf den Rattenluftwegsmuzingehalt

Um zu bestimmen, ob der Test in der Lage ist, eine Veränderung des Luftwegsmuzingehalts in einem Tiermodell für Hypersekretion nachzuweisen, wurden Gesamtlungenextrakte von Ratten, die Metabisulfit ausgesetzt wurden, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, an Sepharose CL-6B chromatographiert, geblottet, desaminiert und wie oben beschrieben angefärbt. Ratten, die Metabisulfit ausgesetzt wurden, wogen weniger als ihre gegenüber H&sub2;O exponierten Gegenstücke (265,0 ± 7,1 g bzw. 351,5 ± 3,2 g). Das Gewicht der Lungen von mit Metabisulfit behandelten Tieren hatte allerdings von 0,44 ± 0,03% Körpergewicht auf 0,79 ± 0,08% Körpergewicht zugenommen. Wie in Fig. 6 gezeigt, verursachte Metabisulfit einen 7fachen Anstieg an gesamtem PAS-positivem Muzin und einen etwa 3,5fachen Anstieg an gesamtem, mit Alcianblau-anfärbbarem Muzin. Anstiege wurden auch für die Menge des mit PAS oder Alcianblau reagierenden Muzins pro Gramm an angefeuchtetem Gewebe (4fach und bzw. 2,3fach) beobachtet. Diese Daten legen sowohl hypertrophe als auch hyperplastische Veränderungen der Mucus absondernden Epithelien der Rattenluftwege nach Metabisulfit-Exposition nahe. Die Anstiege an PAS- und Alcianblau-positivem Material gehen vollständig auf HMW-Makromoleküle zurück, wie in Fig. 7 gezeigt. Ausgeschlossenes Material von Kontrolltieren und von mit Metabisulfit behandelten Tieren wurde einer SDS-Elektrophorese auf 2%-Agarose-Gelen unterworfen, auf eine Immobilon-P- Membran überführt und angefärbt, um auf Anwesenheit von HMW-Muzin zu testen. Vorangefärbte Proteinstandards mit hohem Molekulargewicht (Bio- Rad) wurden nicht aufgetrennt und wanderten mit der Farbstofffront auf dem 2%-Agarose-Gel. Eine gewisse Alcianblau-Anfärbung wurde in Spuren beobachtet, in denen Kontrollmaterial der Elektrophorese unterworfen wurde, allerdings wurde kein PAS-positives Material in denselben Proben nachgewiesen. Proben, die aus mit Metabisulfit behandelten Lungen präpariert wurden, zeigten hohe Werte sowohl an PAS- als auch an Alcianblau-HMW- Muzinmaterial. Kein Alcianblau-Anfärben wurde beobachtet für mit Muzin assozierten Niedermolekulargewichts-Proteine (Fig. 3b). Diese Ergebnisse indizieren, daß die erhöhte PAS- und Alcianblau-Anfärbung, die in der von der Sepharose CL-6B-Säule ausgeschlossen Fraktion beobachtet wurde, vollständig auf HMW-Mucusglykoprotein zurückzuführen ist, das in dem Luftwegsgewebe gegenwärtig ist, und nicht auf Niedermolekulargewichts-Proteine.
Histologische Schnitte der Lungengewebe wurden hergestellt, um zu bestimmen, ob die gemessenen Veränderungen genau die zellulären Veränderungen in den Luftwegen widerspiegeln. Wie in Fig. 8 gezeigt, zeigte Gewebe von mit Metabisulfit behandelten Tieren einen Anstieg an PAS/Alcianblau-Anfärbung der Epithelzellschicht. Der Anstieg an Anfärbung beruht auf der Zunahme von Zellen, die Mucus enthalten, und auch darauf, daß solche Zellen, die Mucus enthalten, im Vergleich zum Kontrollexperiment stärker mit dem Material beladen zu sein scheinen. Die Epithelzellen in den mit Metabisulfit behandelten Luftwegen nahmen außerdem eine hochprismatische Erscheinungsform an, im Gegensatz zur kubischen Morphologie, die häufig in Kontrollexperimenten zu sehen ist.
Diese Änderungen sind konsistent mit hypertrophen und hyperplastischen Veränderungen in den Mucus absondernden Epithelien. Eine dramatische Verdickung der Basalmembran ist ebenfalls zu sehen. Signifikante Mengen an mit PAS/Alcianblau-anfärbbarem Material waren auch gegenwärtig in den Lu men der Hauptbronchien, der Bronchiolen und in einigen alveolären Räumen. Individuelles Anfärben von Schnitten entweder mit PAS oder mit Alcianblau zeigte beides einen Anstieg der Zahl der Zellen, die dichtgepackte Mucusenthaltende Granula enthalten, nach Metabisulfit-Exposition.

BEISPIEL 10

Mengen an neutralen und sauren Mucusglykoproteinen, die aus der Luftröhre von Kontroll- und MBS-behandelten Tieren extrahiert wurden, wurden gemessen, wie in Fig. 9a gezeigt. Kontrollratten zeigten 40mal mehr mit Alcianblau als mit PAS anfärbbare Mucusglykoproteine pro Gramm Luftröhre, 11,70±0,81 mg/g gegenüber 0,27±0,05 mg/g. Bas Exponieren von Tieren gegenüber aerosolisiertem H&sub2;O für eine dreiwöchige Periode führte zu einem geringen, nicht-signifikanten Anstieg an neutralen Mucusglykoproteinen. Neutrale Luftröhren-Mucusglykoproteine pro Gramm Luftröhre waren 4fach erhöht in Ratten, die MBS ausgesetzt worden waren, verglichen zu ihren H&sub2;O- behandelten Gegenstücken (Fig. 9b). Keine signifikanten Unterschiede wurden gemessen für die sauren Luftröhren-Mucusglykoproteine.

BEISPIEL 11

Bronchial-alveoläre Spülungen wurden durchgeführt an Ratten, die für zwei und drei Wochen Natriummetabisulfitnebel ausgesetzt worden waren. Wie in Fig. 11 gezeigt, wurde ein etwa 10facher Anstieg sowohl an Alcianblau- als auch PAS-positivem Mucusglykoproteinmaterial in den Spülungsproben von Natriummetabisulfit ausgesetzten Tieren gemessen im Vergleich zu ihren entsprechenden Kontrollen. Diese Daten sind konsistent mit Luftwegsmucusverstopfungen, die in histologischen Schnitten, die von Metabisulfit ausgesetzten Tieren hergestellt wurden, beobachtet wurden. Es scheint, daß die Exposition von Ratten gegenüber aerosolisiertem Natriummetabisulfit zu ähnlichen Veränderungen in den Luftwegen führt wie solche, die bei Personen beobachtet werden, die von chronische-obstruktiver Atemwegserkrankung betroffen sind.

BEISPIEL 12

Um die neurogenen Komponenten zu untersuchen, die zu der Luftwegsmucuszellen-Metaplasie beitragen könnten, wurde ein muskarinischer Antagonist (Atropin) an die Ratten 30 Minuten vor der Natriummetabisulfitnebel- Exposition verabreicht. Wie in Fig. 12 gezeigt, verminderte Atropin, gegeben in einer Dosis von 2 mg/kg, sowohl die sauren als auch die neutralen Gesamt-Mucusglykoproteine im Lungengewebe der natriummetabisulfitausgesetzten Tiere. Diese Ergebnisse legen die Beteiligung eines cholinergen muskarinvermittelten Wegs in der durch Metabisulfitnebel induzierten Mucuszellenmetaplasie nahe und legen nahe, daß Verbindungen, die diese neurogene Reaktion inhibieren, unter Anwendung des in dieser Patentoffenbarung beschriebenen Tests identifiziert werden könnten.

BEISPIEL 13

Die Auswirkung einer 6wöchigen SO&sub2;-Exposition auf den Rattenluftweg- Mucusglykoproteingehalt wurde untersucht, um sie mit solchen Veränderungen zu vergleichen, die mit Natriummetabisulfitexposition beobachtet werden. Wie in den Fig. 13 und 14 gezeigt, wurden signifikante Anstiege sowohl der PAS- als auch Alcianblau-positiv-Ergebnisse in Lungengewebe von SO&sub2;-ausgesetzten Tieren gemessen. Luftröhren von Ratten, die SO&sub2; ausgesetzt wurden, zeigten nur einen signifikanten Anstieg an mit PAS anfärbbarem Material. Die Daten stimmen gut mit jenen überein, die von Natriummetabisulfit behandelten Tieren erhalten wurden, und unterstützen die Ansicht, daß aerosolisiertes Natriummetabisulfit eine äquivalente Substitutionsbehandlung für SO&sub2;-Gas im Hinblick auf metaplastische Veränderungen in mucusausscheidenden Luftwegszellen ist.

BEISPIEL 14

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Luftwegsextraktmaterial, das im Säulenausschlußvolumen eluiert

Lungenextrakte wurden hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Proben (150 ul), die erhalten wurden aus dem Ausschlußvolumen von an Sepharose CL-6B chromatographierten Luftwegsextrakten, wurden in einem Puffer, der 2% SDS mit 10 mM Mercaptoethanol enthielt, bei 100ºC für 4 Minuten inkubiert. Proben (70 ul) wurden auf 4-12%ige Tris-Glycin- Acrylamid-Gele aufgetragen und einer Elektrophorese bei 100 V für 2h unterworfen. Die Proteine wurden überführt auf Immobilon-P-Membranen und entweder mit Coomassieblau oder mit Alcianblau angefärbt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Coomassieblau-Anfärbung von Ausschlußvolumenmaterial indizierte, daß das Material, das in der Ausschlußfraktion der Säule eluiert wurde, beträchtliche Mengen an Niedermolekulargewichts-Protein enthält. Dies ist wahrscheinlich auf ionische Wechselwirkung von LMW-Protein mit Muzin zurückzuführen. Alcianblau-Anfärben des Ausschlußvolumenmaterials offenbarte, daß die Mehrheit des anfärbbarem Materials HMW ist.

BEISPIEL 15

Densitometrisches Abtasten von Ausschlußvolumenmaterial aus Kontroll- und natriummetabisulfit-ausgesetzten Ratten, das 4-12%-SDS-PAGE - wie voranstehend in Beispiel 3 beschrieben - unterworfen wurde

Proben (150 ul), erhalten aus dem Ausschlußvolumen von an Sepharose CL-6B chromatographierten Luftwegsextrakten, wurden in einem Puffer, der 2% SDS mit 10 mM Mercaptoethanol enthielt, bei 100ºC für 4 Minuten inkubiert. Proben (70 ul) wurden auf 4-12%ige Tris-Glycin-Polyacrylamid-Gele aufgetragen und einer Elektrophorese bei 100 V für 2h unterworfen. Die Proteine wurden überführt auf Immobilon-P-Membranen unter Verwendung eines Bio-Rad-Trans-Blot-Apparats in einem Towbin-Puffer. Die Membranen wurden mit Alcianblau angefärbt, um HMW-Mucusglykoproteine, wie in Beispiel 4 beschrieben, zu identifizieren. Densitometrische Abtastungen jeder Probenspur wurden durchgeführt mit einem Abtastlaserdensitometer bei 633 nm. Die Ergebnisse zeigten, daß 50% des Gesamtmaterials, das mit Alcianblau angefärbt wurde, aus LMW-Material besteht. Aussetzen der Tiere gegenüber MBS ergab signifikante Veränderungen nur bei dem mit HMW-Alcianblau anfärbbaren Material. Ferner sind 15000 Einheiten/20000 Einheiten (75%) des Lungenproteins MBS-behandelter Ratten HMW. Desweiteren sind 6250 Einheiten/8100 Einheiten (77%) pro Gramm MBS-Rattengewebe HMW.

BEISPIEL 16

Auswirkung von SDS auf die Luftwegsextraktelutionsprofile.

1-ml-Aliquots von einem Extrakt, der aus einer MBS-ausgesetzten Ratte hergestellt wurde, wurde mit 10 mM Mercaptoethanol und variierenden Mengen an SDS (0,1% bis 2%) für 2 Minuten bei 68ºC inkubiert. Die Aliquots wurden dann an Sephacryl S-300 HR chromatographiert bei einem Durchsatz von 2 ml/min mit dem Salzpuffer, der in Beispiel 3 beschrieben ist. Von der Säule eluiertes Protein wurde bei 280 nm mit einem Pharmacia-UV-Monitor mit Schreiber kontrolliert. Die Ergebnisse zeigen, daß die Menge an Protein, die in der Ausschlußvolumenfraktion eluiert wird, mit zunehmenden Konzentrationen an SDS abnimmt, beurteilt nach der Peakhöhe im Elutionsprofil. Da Mucusglykoproteine keine Extinktion bei 280 nm zeigen, würden diese Ergebnisse indizieren, daß Nichtmuzin-LMW-Proteine nicht mit den HMW-Glykoproteinen zusammen eluiert werden.

BEISPIEL 17

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von SDS-behandeltem Luftwegsextraktmaterial, das im Säulenausschlußvolumen eluiert

Ausschlußvolumenfraktionen von Lungenextrakten, die mit verschiedenen Mengen an SDS (siehe Beispiel 16) behandelt wurden. Proben (70 ul) wurden auf 4-12%ige Tris-Glycin-Acrylamid-Gele aufgetragen und einer Elektrophorese bei 100 V für 2h unterworfen. Proteine wurden auf Immobilon-P- Membranen überführt und mit Coomassieblau angefärbt. Die Daten zeigten, daß die Menge an LMW-Protein, die im Ausschlußvolumen eluiert wurde, mit progressivem Ansteigen der SDS-Konzentrationen vermindert wird.

BEISPIEL 18

Agarose-Gelelektrophorese von SDS-behandeltem Luftwegsextraktmaterial das im Säulenausschlußvolumen eluiert

Ausschlußvolumenfraktionen von SDS-behandelten Luftwegsextrakten (siehe Beispiel 16) wurden in einem Puffer, der SDS und 10 mM Mercaptoethanol enthielt, bei 100ºC für 4 Minuten inkubiert. Proben (70 ul) wurden auf 2%-Agarose-Tris-Glycin-Gele aufgetragen und einer Elektrophorese bei 100 V für 2h unterworfen. Proteine wurden auf Immobilon-P-Membranen überführt und mit PAS oder Alcianblau, wie in Beispiel 3 beschrieben, angefärbt. Die Daten zeigten, daß HMW-Mucusglykoprotein nicht in irgendeinem signifikanten Ausmaß durch SDS-Behandlung beeinflußt wird.

BEISPIEL 19

Auswirkung von SDS auf gemessene Unterschiede des Luftwegmucusgehalts in luft- und SO&sub2;-ausgesetzten Tieren.

Luftwegsextrakte wurden hergestellt von Tieren, die Luft oder 250 ppm SO&sub2; für 5 h/Tag, 5 Tage/Woche ausgesetzt worden waren. Die löslichen Extrakte von jedem Tier wurden mit entweder 0,1% oder 2,0% SDS, wie in Beispiel 16 beschrieben, behandelt und an Sephacryl S-300 HR chromatographiert. Das Material, das in dem Ausschlußvolumen eluiert wurde, wurde auf neutrale und saure Mucoproteine mit PAS- bzw. Alcianblau-Anfärben angefärbt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Daten zeigten, daß die Proben von Tieren, die SO&sub2; ausgesetzt und mit 2,0% SDS behandelt worden waren, etwa 100% Zunahme an Muzingehalt (PAS und Alcianblau) im Vergleich zu luftausgesetzten Tieren zeigten. Ähnliche Proben von SO&sub2; ausgesetzten Tieren, die mit 0,1% SDS behandelt worden waren, zeigten kleinere Veränderungen im Muzingehalt im Vergleich zu luftausgesetzten Tieren.

BEISPIEL 20

Validierung des Testverfahrens als ein Modell für Bronchiokonstriktion.

Lungengewebe von Tieren, die SO&sub2; (250 ppm, 5 h/Tag, 5 Tage/Woche für 5 Wochen) ausgesetzt worden waren, wurden extrahiert und ihr Mucusglykoproteingehalt, wie in Beispiel 3 beschrieben, gemessen. Tests der Lungenfunktion wurden ausgeführt mit einer getrennten Gruppe von Tieren, die auch SO&sub2; ausgesetzt worden waren. Die Ergebnisse indizierten, daß die Veränderungen an gemessenem Mucus und der Lungenfunktion, die in den Luftwegen von behandelten Tieren induziert wurden, denjenigen ähnlich waren, die bei Patienten beobachtet werden, die von chronischer Bronchitis betroffen sind.

Claims

1. Ein Verfahren für die rasche Bestimmung von hyperplastischen und hypertrophen Veränderungen in Tierluftwegen, das 5 Minuten für die vollständige Oxidation und 5 Minuten für die Entwicklung einer stabilen Farbe für das PAS-Anfärben und 30 Minuten für das Alcianblau-Anfärben erfordert, in dem saure und neutrale Mukoproteine spezifisch gemessen werden, das die Schritte umfaßt:

a) ein Versuchstier einem vermutlichen Auslöser von Luftwegszellen- Hypertrophie oder -Hyperplasie auszusetzen;

b) Entfernen der Lungen des Versuchstiers und Homogenisieren der Lungen in einer geeignet gepufferten hypotonischen Lösung, die Reduktionsmittel und Proteaseinhibitoren enthält, um einen Extrakt herzustellen, der Feststoffteilchen und Lösliches enthält;

c) Entfernen der in dem gemäß Schritt (b) hergestellten Extrakt gegenwärtigen Feststoffteilchen, um einen löslichen Extrakt herzustellen, und Größenfraktionierung des löslichen Extrakts, um lösliches Material mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, um eine Fraktion herzustellen, die Hochmolekulargewichts-Material mit einem Molekulargewicht größer als oder gleich 250000 Dalton enthält;

d) Immobilisieren des Hochmolekulargewichts-Materials durch Blotten der das Hochmolekulargewichts-Material enthaltenden Proben auf eine Membran und Desaminieren des geblotteten Materials;

e) getrenntes Anfärben des immobilisierten Materials auf saure und neutrale Mukoproteine mit Alcianblau bzw. PAS; und

f) quantitative Bestimmung der spezifischen PAS- und Alcianblau- Anfärbung durch Messen der optischen Dichte der Anfärbung.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Membran in Schritt (d) Immobilon P ist.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Desaminieren in Schritt (d) vor dem Fortfahren mit dem Anfärben in Schritt (e) das Inkubieren des geblotteten Materials mit NaNO&sub2; und Essigsäure umfaßt.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1, das ferner umfaßt, die Membran mit dem geblotteten und angefärbten Hochmolekulargewichts-Material aus Schritt (e) mit Paraffinflüssigkeit durchscheinend oder mit einem niederen Alkanol mit C&sub5;-C&sub1;&sub2; durchsichtig zu machen und gegebenenfalls die durchsichtige Membran in Paraffinflüssigkeit einzutauchen, um die Durchsichtigkeit zu bewahren, bevor mit der quantitativen Bestimmung in Schritt (f) fortgefahren wird.

5. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin das niedere Alkanol ausgewählt ist aus 1-Heptanol, Octanol und Dodecanol.

6. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin das niedere Alkanol 1-Heptanol ist.

7. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin der metaplastische Auslöser Natriummetabisulfit ist.

8. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (b) ferner umfaßt Inkontaktbringen der überstehenden Flüssigkeit der homogenisierten Lunge mit einer geeignet gepufferten hypotonischen Lösung, die SDS enthält, und Erhitzen der Lösung auf etwa 68ºC für etwa 2 Minuten.

9. Ein Verfahren für die rasche Bestimmung von hyperplastischen und hypertrophen Veränderungen in Tierluftwegen, das 5 Minuten für die vollständige Oxidation und 5 Minuten für die Entwicklung einer stabilen Farbe für das PAS-Anfärben und 30 Minuten für das Alcianblau-Anfärben erfordert, in dem saure und neutrale Mukoproteine spezifisch gemessen werden, das die Schritte umfaßt:

b) Entfernen der Lungen des Versuchstiers und Homogenisieren der Lungen in einer geeignet gepufferten hypotonischen Lösung, die Reduktionsmittel, Proteaseinhibitoren und zwischen 0,1% und 2% SDS enthält, um einen Extrakt herzustellen, der Feststoffteilchen und Lösliches enthält;

c) Erhitzen des löslichen Extrakts auf etwa 68ºC für etwa 2 Minuten in Gegenwart von zwischen etwa 0,1% und 2% SDS;

d) Entfernen der in dem gemäß Schritt (b) hergestellten Extrakt gegenwärtigen Feststoffteilchen, um einen löslichen Extrakt herzustellen, und Größenfraktionierung des löslichen Extrakts, um lösliches Material mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, um eine Fraktion herzustellen, die Hochmolekulargewichts-Material mit einem Molekulargewicht größer als oder gleich 250000 Dalton enthält;

e) Immobilisieren des Hochmolekulargewichts-Materials durch Blotten der das Hochmolekulargewichts-Material enthaltenden Proben auf eine Membran und Desaminieren des geblotteten Materials mit NaNO&sub2; und Essigsäure;

f) getrenntes Anfärben des immobilisierten Materials auf saure und neutrale Mukoproteine mit Alcianblau bzw. PAS;

g) die Membran mit geblottetem und angefärbtem Hochmolekulargewichts- Material aus Schritt (f) mit Paraffinflüssigkeit durchscheinend oder mit einem niederen Alkanol mit C&sub5;-C&sub1;&sub2; durchsichtig zu machen und gegebenenfalls die durchsichtige Membran in Paraffinflüssigkeit einzutauchen, um die Durchsichtigkeit zu bewahren; und

h) quantitative Bestimmung der spezifischen PAS- und Alcianblau- Anfärbung durch Messen der optischen Dichte der Anfärbung.

10. Das Verfahren nach Anspruch 9, worin die hypotonische Lösung etwa 2% SDS enthält.

11. Ein in-vitro-Verfahren für die rasche Bestimmung von hyperplastischen und hypertrophen Veränderungen in Tierluftwegen, das 5 Minuten für die vollständige Oxidation und 5 Minuten für die Entwicklung einer stabilen Farbe für das PAS-Anfärben und 30 Minuten für das Alcianblau- Anfärben erfordert, in dem saure und neutrale Mukoproteine spezifisch gemessen werden, das die Schritte umfaßt:

i) Homogenisieren von Lungengewebe, das zuvor einem vermutlichen Auslöser von Luftwegszellen-Hypertrophie oder -Hyperplasie ausgesetzt worden war, in einer geeignet gepufferten hypotonischen Lösung, die Reduktionsmittel und Proteaseinhibitoren enthält, um einen Extrakt herzustellen, der Feststoffteilchen und Lösliches enthält;

ii) Entfernen der in dem gemäß Schritt (i) hergestellten Extrakt gegenwärtigen Feststoffteilchen, um einen löslichen Extrakt herzustellen, und Größenfraktionierung des löslichen Extrakts, um lösliches Material mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, um eine Fraktion herzustellen, die Hochmolekulargewichts-Material mit einem Molekulargewicht größer als oder gleich 250000 Dalton enthält;

iii) Immobilisieren des Hochmolekulargewichts-Materials durch Blotten der das Hochmolekulargewichts-Material enthaltenden Proben auf eine Membran und Desaminieren des geblotteten Materials;

iv) getrenntes Anfärben des immobilisierten Materials auf saure und neutrale Mukoproteine mit Alcianblau bzw. PAS; und

v) quantitative Bestimmung der spezifischen PAS- und Alcianblau-Anfärbung durch Messen der optischen Dichte der Anfärbung.

12. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin die Membran in Schritt (iii) Immobilon P ist.

13. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin das Desaminieren in Schritt (iii) vor dem Fortfahren mit dem Anfärben in Schritt (iv) das Inkubieren des geblotteten Materials mit NaNO&sub2; und Essigsäure umfaßt.

14. Das Verfahren nach Anspruch 11, das ferner umfaßt die Membran mit dem geblotteten und angefärbten Hochmolekulargewichts-Material aus Schritt (iv) mit Paraffinflüssigkeit durchscheinend oder mit einem niederen Alkanol mit C&sub5;-C&sub1;&sub2; durchsichtig zu machen und gegebenenfalls die durchsichtige Membran in Paraffinflüssigkeit einzutauchen, um die Durchsichtigkeit zu bewahren, bevor mit der quantitativen Bestimmung in Schritt (v) fortgefahren wird.

15. Das Verfahren nach Anspruch 14, worin das niedere Alkanol ausgewählt ist aus 1-Heptanol, Octanol und Dodecanol.

16. Das Verfahren nach Anspruch 14, worin das niedere Alkanol 1-Heptanol ist.

17. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin der metaplastische Auslöser Natriummetabisulfit ist.

18. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin Schritt (ii) ferner umfaßt Inkontaktbringen der überstehenden Flüssigkeit der homogenisierten Lunge mit einer geeignet gepufferten hypotonischen Lösung, die SDS enthält, und Erwärmen der Lösung auf etwa 68ºC für etwa 2 Minuten.

19. Ein in-vitro-Verfahren für die rasche Bestimmung von hyperplastischen und hypertrophen Veränderungen in Tierluftwegen, das 5 Minuten für die vollständige Oxidation und 5 Minuten für die Entwicklung einer stabilen Farbe für das PAS-Anfärben und 30 Minuten für das Alcianblau- Anfärben erfordert, in dem saure und neutrale Mukoproteine spezifisch gemessen werden, das die Schritte umfaßt:

i) Homogenisieren des Lungengewebes, das zuvor einem vermutlichen Auslöser von Luftwegszellen-Hypertrophie oder -Hyperplasie ausgesetzt worden war, in einer geeignet gepufferten hypotonischen Lösung, die Reduktionsmittel, Proteaseinhibitoren und zwischen 0,1% und 2% SDS enthält, um einen Extrakt herzustellen, der Feststoffteilchen und Lösliches enthält;

ii) Erwärmen des löslichen Extrakts auf etwa 68ºC für etwa 2 Minuten in Gegenwart von zwischen etwa 0,1% und 2% SDS;

iii) Entfernen der in dem gemäß Schritt (i) hergestellten Extrakt gegenwärtigen Feststoffteilchen, um einen löslichen Extrakt herzustellen, und Größenfraktionierung des löslichen Extrakts, um lösliches Material mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, um eine Fraktion herzustellen, die Hochmolekulargewichts-Material mit einem Molekulargewicht größer als oder gleich 250000 Dalton enthält;

iv) Immobilisieren des Hochmolekulargewichts-Materials durch Blotten der das Hochmolekulargewichts-Material enthaltenden Proben auf eine Membran und Desaminieren des geblotteten Materials mit NaNO&sub2; und Essigsäure;

v) getrenntes Anfärben des immobilisierten Materials auf saure und neutrale Mukoproteine mit Alcianblau bzw. PAS;

vi) die Membran mit dem geblotteten und angefärbten Hochmolekulargewichts- Material aus Schritt (v) mit Paraffinflüssigkeit durchscheinend oder mit einem niederen Alkanol mit C&sub5;-C&sub1;&sub2; durchsichtig zu machen und gegebenenfalls die durchsichtige Membran in Paraffinflüssigkeit einzutauchen, um die Durchsichtigkeit zu bewahren; und

vii) quantitative Bestimmung der spezifischen PAS- und Alcianblau- Anfärbung durch Messen der optischen Dichte der Anfärbung.

20. Das Verfahren nach Anspruch 17, worin die hypotonische Lösung etwa 2% SDS enthält.