DE69403088T2

DE69403088T2 - Methode zum Nachweis der Neigung eines Patienten für eine thrombotische Krankheit

Info

Publication number: DE69403088T2
Application number: DE69403088T
Authority: DE
Inventors: Charles Esmon; Mikhail Smirnov
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1993-09-15
Filing date: 1994-09-15
Publication date: 1997-12-18
Anticipated expiration: 2014-09-16
Also published as: WO1995008121A1; DE69403088D1; AU695553B2; AU7729394A; US5472852A; EP0719415B1; EP0719415A1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der diagnostischen Untersuchung von Personen, bei denen ein Risiko thrombotischer Komplikationen vermutet wird.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das Blutgerinnungssystem ist ein natürlicher und notwendiger Prozeß, der in Menschen und anderen Vertebraten auftritt, um das Kreislaufsystem vor Blutverlust infolge einer Verletzung zu versiegeln. Der Thrombus oder das Blutgerinnsel bildet sich aufgrund einer komplexen Kaskade von Reaktionen, die eine Anzahl von Plasma-Glykoproteinen einbeziehen. In einem der letzten Schritte der Gerinnselbildung wird Thrombin durch Spaltung von Prothrombin gebildet; diese Reaktion wird durch aktivierten Faktor X (Faktor Xa) katalysiert. Aktivierter Faktor V (Faktor Va), Ca²&spplus; und Phospholipidmembranen verstärken die Aktivität von Faktor Xa bei der Aktivierung von Prothrombin. Thrombin katalysiert die Bildung von Fibrin (das unter Bildung eines weichen Gerinnsels polymerisiert) aus Fibrinogen.
Thrombin katalysiert die Proteolyse von Protein C, das Faktor Va inaktiviert. Dieser Rückkopplungsmechanismus ist von Bedeutung, da eine Gerinnselbildung in vivo begrenzt werden muß, um zu verhindern, daß sich Gerinnsel in Bereichen bilden, wo der Körper diese nicht nur nicht benötigt, sondern wo sie möglicherweise Schäden verursachen können, wie Schlaganfall, Herzinfarkt, Fehlgeburten und andere thrombotische Erkrankungen. Diese Schäden bedingen oftmals einen tödlichen Verlauf.
Protein C ist ein Vitamin K-abhängiges Protein-Plasmazymogen der gerinnungshemmenden Serinprotease, aktiviertes Protein C (hier auch als "APC" bezeichnet). Protein C wird in erster Linie auf der Endotheloberfläche durch einen Thrombin und Thrombomodulin umfassenden Komplex aktiviert. Die Wirkung von Thrombomodulin ist, Thrombin spezifisch zu binden. An Thrombomodulin gebundenes Thrombin erhält dadurch eine verringerte Fähigkeit, eine Gerinnselbildung zu verursachen. An Thrombomodulin gebundenes Thrombin erhält auch eine erhöhte Fähigkeit, Protein C zu aktivieren. Aktiviertes Protein C wirkt dann als ein Antikoagulans durch proteolytische Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa, ein Prozeß, der durch einen Vitamin K-abhangigen Cofaktor, Protein S, negativ geladene Membranoberflächen und Ca²&spplus;- Ionen verstärkt wird.
Eine Gruppe von Patienten, bei denen ein erhöhtes Risiko für thrombotische Erkrankungen vorliegt, sind jene, die Lupusantikoagulanzien aufweisen; dies sind Antikörper, die an anionische Phospholipide binden, die in Gerinnungsassays auf Grundlage der PTT (partielle Thromboplastinzeit)- oder APTT (aktivierte partielle Thromboplastinzeit)-Techniken verwendet werden. Siehe The Merck Manual (16. Auflage 1992), bei 1225; J. E. Ansell, Handbook of Hemostasis and Thrombosis (Little, Brown & Co., Boston) bei 19 (1986). Typische PTT-Testergebnisse bei Patienten, die das Lupusantikoagulans aufweisen, sind eine verlängerte Gerinnungszeit, die bei einer 1:1-Mischung des Patientenplasmas mit normalem Plasma nicht korrigiert wird, eine normale oder minimal verlängerte PT (Prothrombinzeit) und eine nichtspezifische Senkung jener Gerinnungsfaktoren, die durch eine PTT-Technik gemessen werden (Faktoren XII, XI, IX und VIII). Die Lupusantikoagulans-Antikörper können auch mit Cardiolipin reagieren, das mit Assays, die Cardiolipin als Reagens einsetzen, interferieren kann. Siehe The Merck Manual, a.a.O. Anti-Cardiolipin- oder Anti-Phosphatidylethanolamin-Antikörper können miteinander kreuzreagieren, wechselwirken aber nicht mit ausreichender Affinität zu prokoagulierend wirkenden Phospholipiden, um Antikoagulanzien zu sein. Aufgrund der Spezifität von Phospholipiden für aktiviertes Protein C würden solche Antikörper selektiv die gerinnungshemmende Aktivität von aktiviertem Protein C inhibieren, ohne die in Abwesenheit von aktiviertem Protein C ausgeführten Gerinnungstests zu beeinflussen, die verwendet werden, um die Gegenwart eines "Lupusantikoagulans" zu diagnostizieren.
Trotz der Wechselwirkung des Lupusantikoagulans mit prokoagulierend wirkenden Phospholipiden in Gerinnungstests in vitro ist berichtet worden, daß Personen mit den Antikörpern einem erhöhten Risiko für Thrombosen, entweder venösen oder arteriellen, ausgesetzt sind. Ferner ist auch über wiederholte Fehlgeburten in dem ersten Trimester der Schwangerschaft berichtet worden. Idem. Patienten sind mit entzündungshemmenden Langzeittherapien behandelt worden, um die Möglichkeit einer Thrombose zu verringern, aber es ist kein adäquates Verfahren zur überwachung der Wirksamkeit einer derartigen Therapie entwickelt worden. Es sollte auch festgehalten werden, daß bei anderen Patienten, bei denen der Test auf das Lupusantikoagulans nicht notwendigerweise positiv ausfällt, auch ein Risiko für thrombotische Erkrankungen bestehen kann. Ferner könnten nicht alle Personen, die das Lupusantikoagulans oder andere Risikofaktoren aufweisen, die identische Thrombose-Anfälligkeit haben.
Um zu versuchen, Patienten mit einem Thrombose-Risiko zu identifizieren, sind Standard-Gerinnungtests an Patientenplasma ausgeführt worden. Zusätzliche Untersuchungen sind, wie vorstehend beschrieben, vorgeschlagen worden, wenn PTT- und/oder PT- Testergebnisse sich als nicht normal erweisen, wie eine Wiederholung des Tests unter Zusatz von normalem Plasma. Jedoch ist kein Verfahren entwickelt worden, um zwischen Lupus-Patienten und anderen zu differenzieren, welche Patienten die höchste Anfälligkeit aufweisen, einen thrombotischen Vorfall zu haben.
In mehreren Gerinnungs-Assays hat es sich als nützlich erwiesen, eine Membranquelle einzusetzen, um die Reaktion zu vereinfachen. Es ist berichtet worden, daß die Aktivität des Faktors Xa hinsichtlich der Aktivierung von Prothrombin um ein Vielfaches in Gegenwart von Faktor Va, Ca²&spplus; und Phospholipidmembranen, die Phosphatidylserin enthalten, verstärkt wird.
Eine Analyse des Prothrombin-Aktivierungskomplexes, der als Prothrombinase bezeichnet wird, hat zu einem Modell geführt, bei dem eine Membranbeschleunigung von Koagulationsreaktionen als durch Binden von Enyzm, Cofaktor und Substrat an die Membranoberfläche vermittelt angesehen wird, wodurch die lokale Konzentration an Reaktanten erhöht wird und für eine optimale Katalyse erforderliche entscheidende Protein-Protein-Wechselwirkungen verstärkt werden. K.G. Mann et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 915-56 (1988). Dieses Modell ist konsistent mit jenem, das für den Faktor Va-Inaktivierungskomplex vorgeschlagen wurde. F. J. Walker, J. Biol. Chem. 256:11128-31 (1981). Sämtliche Studien haben gezeigt, daß eine Bindung dieser Proteine mit hoher Affinität negativ geladene Phospholipid-Oberflächen einschließt. G. L. Nelsestuen et al., Biochemistry 16: 4164-77 (1977); G. L. Nelsestuen et al., Biochemistry 17: 2134-38 (1978); und R. A. Schwalbe et al., J. Biol. Chem. 264:20288-96 (1989). Von den natürlich vorkommenden, negativ geladenen Phospholipiden ist Phosphatidylserin (hier auch als "PS" bezeichnet) das in funktionaler Hinsicht in dem Prothrombinasekomplex und hinsichtlich der Bindungswechselwirkungen mit den Faktoren Va und Xa wirksamste. G. Pei et al., J. Biol. Chem. 268:3226-33 (1993). Zusammengenommen haben diese Beobachtungen die meisten Forscher dazu geführt, anzunehmen, daß sämtliche der Komplexe ähnliche Phospholipiderfordernisse für eine optimale Funktion aufweisen würden. Diese Annahme wurde weiter durch die Tatsache gestützt, daß γ-Carboxyglutamat (Gla) enthaltende Bereiche der Vitamin K- abhängigen Proteine bedeutende Sequenzidentität aufweisen, P. Fernlund et al., J. Biol. Chem. 257: 12170-79 (1982), und daß es diese Domäne ist, die in erster Linie für die Wechselwirkung mit Membranen verantwortlich ist. Schwalbe et al., a.a.O. Frühere Forscher haben daher angenommen, daß die Membranerfordernisse für eine Inaktivierung von Faktor Va mit aktiviertem Protein C ähnlich zu jenen sein würden, die für Prothrombinase-Aktivität für eine Aktivierung von Thrombin erforderlich sind.
Überraschenderweise ist jetzt gefunden worden, daß ein Einbau von Phosphatidylethanolamin (hier auch als "PE" bezeichnet) in Membranvesikel die APC-Inaktivierung von Faktor Va dramatisch verstärkt, ohne die Prothrombinase-Aktivität zu beeinflussen. Es ist jetzt auch gefunden worden, daß Patientenplasma gescreent werden kann, indem es in einem Einstufen-Assay in Gegenwart und Abwesenheit von aktiviertem Protein C mit einer Membranquelle, umfassend eine wirksame Menge an PE, untersucht wird. Indem PE in solchen Assays eingesetzt wird, ist gefunden worden, daß Patientenplasma, das Lupusantikoagulanzien enthält, verlängerte Gerinnungszeiten im Vergleich zu einer normalen gepoolten Plasmakontrolle in Abwesenheit von aktiviertem Protein C aufweist, aber eine geringere Gerinnungszeit als normales Kontrollplasma in Gegenwart von aktiviertem Protein C bei geeigneten Phospholipidkonzentrationen aufweist. Indem die Zusammensetzung der in Assays eingesetzten Membran verändert wird, kann dementsprechend die Identifizierung von Patienten mit höchstem Thrombose-Risiko erfolgen und die Wirksamkeit von entzündungshemmenden Arzneimitteln, die zur Verringerung von Antikörper-Titern verwendet werden, wie z.B. Prednison (17,21-Dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trion), oder von Antikoagulationstherapien überwacht werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wird ein Assay zur Bestimmung der Anfälligkeit eines Patienten für eine thrombotische Erkrankung beschrieben, der eine wirksame Menge einer Phospholipid-Membranquelle einsetzt, um an die Reaktanten zu binden, wobei die Phospholipid-Membranquelle einen Phospholipid-Bestandteil hat, der eine wirksame Menge von Phosphatidylethanolamin (PE), um eine differenzielle, nachweisbare Wirkung zwischen normalem (Kontroll-) Plasma und Plasma von Patienten mit einer Anfälligkeit für thrombotische Episoden zu bewirken, und eine wirksame Menge von Phosphatidylserin (PS) umfaßt, um das PE in einem Gerinnungs-Assay zu komplementieren. Vorzugsweise werden mindestens etwa 10% bis etwa 50% PE und mindestens etwa 5% bis etwa 50% PS eingesetzt. Bevorzugter wird der PS-Bestandteil auf einen Höchstwert von 25 Gew.- % des Phospholipid-Bestandteils der Membranquelle begrenzt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Membranquelle einen Phospholipidbestandteil, umfassend etwa 40% PE, etwa 20% PS und etwa 40 Gew.-% Phosphatidylcholin (PC). Die Phospholipid-Membranguelle wird vorzugsweise in einem Gerinnungs-Assay eingesetzt, der ein Faktor X-aktivierendes Enzym aus Russell's Vipern-Gift einsetzt, wobei eine Gerinnung durch Zugabe von Ca²&spplus; initiiert wird. Eine mit Citrat behandelte Plasmaprobe eines Patienten wird in Gegenwart und Abwesenheit von exogenem aktiviertem Protein C (APC) untersucht und die Ergebnisse mit jenen, die für normales Kontrollplasma erhalten wurden, verglichen. Patientenplasma, das APC selektiv inhibiert, wird durch eine verlängerte Gerinnungszeit in Abwesenheit von exogenem APC im Vergleich zu normalen Kontrollen nachgewiesen, das auch eine geringere Gerinnungszeit als normales Kontrollplasma in Gegenwart von exogenem APC bei optimalen Phospholipid-Konzentrationen zeigt.
Es wird auch ein Verfahren zum Überwachen der Wirksamkeit eines entzündungshemmenden Arzneimittels oder einer gerinnungshemmenden Therapie bei Patienten mit Lupusantikoagulanzien oder Patienten mit anti-Phospholipid-Antikörpern beschrieben, das die Schritte umfaßt:
(a) Bilden einer ersten, mit Citrat behandelten Plasmaprobe aus einer von den Patienten zu einem ersten Zeitpunkt erhaltenen Blutprobe,
(b) Untersuchen der ersten, mit Citrat behandelten Plasmaprobe hinsichtlich der Gerinnungseigenschaften in Gegenwart und Abwesenheit von aktiviertem Protein C und in Gegenwart einer Membranquelle, umfassend einen Phospholipidbestandteil, der eine wirksame Menge von Phosphatidylethanolamin, um die Beobachtung von Unterschieden in der Gerinnung zwischen normalem Plasma und Patienten mit Thrombose-Anfälligkeit zu ermöglichen, und eine wirksame Menge von Phosphatidylserin zur Komplementierung der Wirkung des Phosphatidylethanolamin in einem Gerinnungs-Assay umfaßt, und Vergleichen der Gerinnungseigenschaften der ersten, mit Citrat behandelten Plasmaprobe mit Kontrollplasma,
(c) Wiederholen von Schritt (b) an einer zweiten Probe von mit Citrat behandeltem Plasma, das von dem Patienten zu einem zweiten Zeitpunkt erhalten worden ist,
(d) Vergleichen der Untersuchungsergebnisse, um Ergebnisse der entzündungshemmenden oder gerinnungshemmenden Therapie anzugeben.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung von Daten betreffend die Wirkung einer Phospholipid-Zusammensetzung auf die Inaktivierung von Faktor Va durch APC. Auf der X-Achse ist Phospholipid in µg/ml aufgetragen. Auf der Y-Achse ist der Prozentsatz der Inaktivierung von Faktor Va aufgetragen. Die offenen Kreise repräsentieren 20% Phosphatidylserin (PS) /80% Phosphatidylcholin (PC); die gefüllten Kreise repräsentieren 20% PE/20% PS/60% PC; die gefüllten Dreiecke repräsentieren 20% Phosphatidylinositol/20% PS/60% PC; die offenen Quadrate repräsentieren 20% Cardiolipin/20% PS/60% PC; die offenen Dreiecke repräsentieren 20% Cholesterol/20% PS/60% PC und die umgekehrten gefüllten Dreiecke repräsentieren 20% Phosphatidylglycerol/20% PS/60% PC.
Fig. 2A ist eine graphische Darstellung von Daten betreffend die Wirkung des PE-Gehalts auf die Liposomenaktivität bei der Prothrombinaktivierung. Auf der X-Achse ist die Verdünnung von Cephalin aufgetragen. Auf der Y-Achse ist die Prothrombin- Aktivierung in nM/min aufgetragen. Die offenen Kreise repräsentieren 20% PS/80% PC; die offenen Dreiecke repräsentieren 10% PE/20% PS/70% PC; die umgekehrten offenen Dreiecke repräsentieren 20% PE/20% PS/60% PC; die offenen Quadrate repräsentieren 30% PE/20% PS/50% PC; die gefüllten Quadrate repräsentieren 40% PE/20% PS/40% PC und die gefüllten Kreise repräsentieren Cephalin aus Rinderhirn.
Fig. 28 zeigt die Inaktivierung von Faktor Va durch APC. Auf der X-Achse ist Phospholipid in µg/ml aufgetragen. Auf der Y-Achse ist der Prozentsatz der Inaktivierung von Faktor Va aufgetragen. Die offenen Kreise repräsentieren 20% PS/80% PC; die offenen Dreiecke repräsentieren 10% PE/20% PS/70% PC; die umgekehrten offenen Dreiecke repräsentieren 20% PE/20% PS/60% PC; die offenen Quadrate repräsentieren 30% PE/20% PS/50% PC; die gefüllten Quadrate repräsentieren 40% PE/20% PS/40% PC und die gefüllten Kreise repräsentieren Cephalin aus Rinderhirn.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung von Daten betreffend die Wirkung von PE auf die Inaktivierung von Faktor Va auf großen und kleinen Phospholipidvesikeln. Auf der X-Achse ist APC in pM aufgetragen. Auf der Y-Achse ist die verbleibende Aktivität von Faktor Va in Prozent angegeben. Die Phospholipid-Konzentration beträgt 4 µg/ml. Für beschallte Vesikel: offene Kreise repräsentieren 20% PS/80% PC; die gefüllten Kreise repräsentieren 40% PE/20% PS/40% PC. Für große dialysierte Vesikel: die offenen Quadrate repräsentieren 20% PS/80% PC; die gefüllten Quadrate repräsentieren 40% PC/20% PS/40% PC und die offenen Dreiecke repräsentieren Cephalin aus Rinderhirn.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung von Daten betreffend die Wirkung eines PE-Einbaus in PS/PC-Vesikel auf die gerinnungshemmende Aktivität von APC in Plasma. Auf der X-Achse ist APC in µg/ml aufgetragen. Auf der Y-Achse ist die Gerinnungszeit in Sekunden aufgetragen. Beschallte Vesikel: die gefüllten Kreise repräsentieren 20% PS/80% PC; die offenen Kreise repräsentieren 40% PE/20% PS/40% PC.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung von Daten betreffend die Wirkung von humanem APC auf die Gerinnung von normalem Plasma und Plasma aus einem Patienten mit Thrombose und einem Lupusantikoagulans als Funktion der Phospholipidkonzentration. Auf der X-Achse ist [PL] in µg/ml aufgetragen. Auf der Y-Achse ist die Gerinnungszeit in Sekunden aufgetragen. Die gefüllten Kreise repräsentieren normales gepooltes humanes Plasma ohne APC; die gefüllten Dreiecke repräsentieren Plasma aus einem Patienten mit Thrombose und einem Lupusantikoagulans ohne APC; die offenen Kreise repräsentieren normales gepooltes humanes Plasma mit APC und die gefüllten Quadrate repräsentieren Plasma aus einem Patienten mit Thrombose und einem Lupusantikoagulans mit APC.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung von Daten betreffend die Unterschiede in der Thrombinbildung zwischen normalem Plasma und Plasma, das Lupusantikoagulanzien enthält, in Gegenwart von APC. Auf der X-Achse ist die Zeit in Minuten aufgetragen. Auf der Y-Achse ist [Thrombin] in nM aufgetragen. Die offenen Quadrate reprasentieren normales gepooltes humanes Plasma ohne APC; die gefüllten Kreise repräsentieren Plasma aus einem Patienten mit Thrombose und einem Lupusantikoagulans ohne APC; die gefüllten Quadrate repräsentieren normales gepooltes humanes Plasma mit APC und die offenen Kreise repräsentieren Plasma aus einem Patienten mit Thrombose und einem Lupusantikoagulans mit APC.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Es wird ein Assay offenbart, der verwendet werden kann, um Patienten hinsichtlich Thrombose-Anfälligkeit zu screenen.
Ein Bestandteil des Assay ist eine Membranquelle, die einen Phospholipidbestandteil enthalten soll, der eine wirksame Menge von Phosphatidylethanolamin (PE), um eine differenzielle, nachweisbare Wirkung zwischen normalem (Kontroll-) Plasma und Plasma von Patienten, die eine Anfälligkeit für thrombotische Episoden aufweisen, zu erzielen, und eine wirksame Menge von Phosphatidylserin (PS) umfaßt, um das PE in einem Gerinnungs-Assay zu komplementieren. Vorzugsweise umfaßt der Phospholipidbestandteil etwa 10% bis etwa 50% Phosphatidylethanolamin (PE) und etwa 5% bis etwa 50% Phosphatidylserin (PS). Der Rest ist vorzugsweise Phosphatidylcholin (PC), kann aber aus jedem beliebigen Phospholipid ausgewählt werden, das eine Kopf gruppe hat, die zwitterionisch ist und keine Nettoladung bei neutralem pH hat. Vorzugsweise macht der PS-Bestandteil etwa 5% bis etwa 25% des Phospholipidbestandteils aus. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Phospholipidbestandteil der Membranquelle etwa 40% PE, etwa 20% PS und etwa 40% PC bezogen auf das Gewicht des Phospholipidbestandteils.
Die Membranquelle wird vorzugsweise in Form von Phospholipidvesikeln eingesetzt. Solche Vesikel können durch jedes beliebige Verfahren hergestellt werden und können jegliche Größe und Form aufweisen. Eine Form geeigneter Vesikel sind beschallte Vesikel (SV). Diese können beispielsweise durch eine Modifizierung veröffentlichter Verfahren hergestellt sein. Siehe z.B. Y. Barenholz, Biochemistry 16:2806-10 (1977). In einem bevorzugten Verfahren wurden Lipide (1 mg/ml) durch Vortexen in 20 mM Tris- HCl, 150 mM NaCl, 0,02% Natriumazid, pH 7,4 (TBS) suspendiert, bevor sie 20 min in einem Eisbad unter einem Argonstrom mit einer Einstellung von 20% Energie beschallt wurden (Bronson Sonic Power Co., Model 350). Nach der Beschallung wurden Suspensionen bei 8000 g 15 min zentrifugiert und durch einen 0,22 µm Millipore-Filter filtriert. 95-99% des anfänglichen Phospholipids wurden wiedergewonnen. Wenn die Vesikel gelagert wurden, wurden sie bei 4ºC unter Argon gehalten und unmittelbar vor einer Verwendung erneut 5 min beschallt. Die Lagerung veränderte die Vesikelaktivität nicht.
In einem anderen bevorzugten Verfahren wurden große Phospholipidvesikel (LV) durch Dialyse aus Octylglucosid, wie bereits früher beschrieben, hergestellt. L. T. Mimms et al., Biochemistry 20:833-40 (1981). Wie vorstehend beschrieben getrocknete Phospholipide wurden in 0,16 M Octylglucosid in TBS zu 5 mg/ml unter Erzeugung eines molaren Verhältnisses von Detergens zu Phospholipid von 25:1 gelöst. Suspensionen wurden 1 min gevortext, in einem Branson Ultrasonic labware cleaner (Model B3) 10 min beschallt und gegen 4 x 2 l TBS bei 4ºC 2 Tage dialysiert. Dialysierte Suspensionen wurden bei 8000 g 15 min zentrifugiert und durch einen 0,22 µm Filter filtriert. Die Rückgewinnung von LV-Phospholipid betrug 95-98%. LV wurde entweder sofort verwendet oder bis zu 5 Tage bei +4ºC unter Argon gelagert. Gelagerte LV wurden 1 min vor einer Verwendung gevortext.
Extrudierte große Phospholipidvesikel wurden gemäß veröffentlichten Verfahren hergestellt. R.W. Jackman et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 83: 8834-38 (1986). Kurz gesagt, wurden getrocknete Phospholipidmischungen zu 1 mg/ml in TBS suspendiert, 10 min gevortext und dreimal durch einen 0,22 µm Nucleopore-Polycarbonatfilter filtriert. 95% des anfänglichen Phospholipids wurden in der endgültigen Vesikelsuspension wiedergewonnen. Diese Vesikel wurden sofort verwendet.
Die Rückgewinnung in allen Fällen wurde durch Einsetzen von Tracer-Konzentrationen von ¹&sup4;C-PC in den Präparationen, wie 1- Palmityl-2-[1-¹&sup4;C-oleyl]-PC (New England Nuclear Products), überwacht. Der Phospholipidgehalt kann durch andere Verfahren, wie beispielsweise von G.R. Bartlett et al., J. Biol. Chem. 234:466-68 (1959) beschrieben, gemessen werden. Jedoch ist es angesichts der beobachteten hohen Rückgewinnungen nicht erforderlich, die Ausbeuten routinemäßig zu bestimmen.
Elektronenmikroskopie wurde, wie bereits früher in L.T. Mimms, a.a.O., beschrieben, mit geringfügigen Modifizierungen ausgeführt. Suspensionen von Phospholipidvesikeln wurden mit TBS auf 0,1 mg/ml verdünnt und mit einem gleichen Volumen einer 2%- igen Lösung von Osmiumtetroxid in Wasser für eine Fixierung gemischt. Nach 20 min wurden 3 µl der fixierten Proben auf mit Kohlenstoff beschichtete Probenträger für die Elektronenmikroskopie aufgetragen, 20 min inkubiert, mit Wasser gewaschen, 1 min mit einer 2%-igen Lösung von Uranylacetat in Wasser zur Negativkontrastierung gewaschen, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Es wurde ein JEOL-JEM-1200 EX-Elektronenmikroskop verwendet. Jeden Tag wurde ein Standard-Probenträger angewendet, um die Vergrößerung des Mikroskops zu kontrollieren. Die Vesikelgröße wurde aus den Mikrophotographien bestimmt.
Der Assay zum selektiven Nachweis einer Inhibition von aktiviertem Protein C durch ein Probenplasma eines Patienten wird unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Membranquelle ausgeführt. Eine Blutprobe wird in Citrat-Antikoagulans von dem Patienten abgenommen und das mit Citrat behandelte Plasma daraus gemäß Standardverfahren hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Gerinnungszeiten in einem Einstufen-Gerinnungs-Assay bestimmt, der in Gegenwart oder Abwesenheit von humanem aktiviertem Protein C, das gemäß F.B. Taylor, Jr. et al., J. Clin. Invest. 79:918-25 (1987) hergestellt wird, ausgeführt wird. Der Assay wird geeigneterweise bei 25ºC in Vertiefungen einer PVC-Platte mit 96 Vertiefungen (Costar), die mit einer Mischung von Ovalbumin und Gelatine beschichtet ist, um eine Adsorption an die Wände zu minimieren, ausgeführt, jedoch kann jede geeignete Reaktionskammer verwendet werden, die ein gründliches Mischen der Bestandteile ermöglicht und die gegenüber den Reaktanten inert ist. Etwa 10 µl von mit Citrat behandeltem Plasma eines Patienten und etwa 10 µl normales Kontrollplasma je jeweils 70 µl endgültige Reaktionsmischung werden den Testvertiefungen zugegeben und etwa 20 µl normales Kontrollplasma in Kontrollvertiefungen je jeweils 70 µl endgültige Reaktionsmischung gegeben.
Alternativ kann der Assay ohne Zusatz von normalem Plasma zu der Testprobe ausgeführt werden, jedoch wäre unter bestimmten Bedingungen der Zusatz von normalem Plasma wünschenswert, um die Gerinnung zu vereinfachen.
Etwa 0,1 bis etwa 3,0 µg/ml aktiviertes Protein C (APC) werden in die Vertiefungen, die eine Probe von Patientenplasma enthalten, und in die anderen Vertiefungen, die normales Kontrollplasma enthalten, das parallel zu dem Patientenplasma untersucht wird, gegeben. Am meisten bevorzugt wird eine Konzentration von 110 µg/ml APC eingesetzt. Zu einer ungefähr gleichen Anzahl von Vertiefungen, die Patientenplasma oder Kontrollplasma enthalten, wird kein APC zugesetzt.
Zu jeder Vertiefung wird eine vorstehend beschriebene Membranquelle, die etwa 0,2 µg/ml bis etwa 1 mg/ml Gesamtphospholipid enthält, zugegeben. Die optimale Phospholipidmenge kann durch einen Dosis-Wirkungs-Assay bestimmt werden. Die optimale Phospholipid (PL)-Konzentration ist jene Konzentration, die es ermöglicht, daß Patientenplasmen, die bekanntermaßen die APC-Funktion inhibieren, eine kürzere Gerinnungszeit als normales Plasma in Gegenwart der PL und APC zeigen. Ungefähr 1 ng/ml Faktor X-aktivierendes Enzym aus Russell's Vipern-Gift (C.T. Esmon, Dissertation, Washington University, St. Louis (1973)) wird auch zugegeben, um die Reaktionsmischung zu bilden. Faktor X-aktivierendes Enzym ist auch kommerziell erhältlich (American Diagnostic). Die verwendete Menge an Faktor X-aktivierendem Enzym wird ausgewählt. Die Gerinnung wird durch Zugabe von 25 µl 20 mM CaCl&sub2; zu jeder vorstehend beschriebenen Reaktionsmischung von 70 µl initiiert. Jede zu CaCl&sub2; äquivalente Ca²&spplus;-Quelle kann verwendet werden. Die Gerinnungszeiten werden in einem V-max Kinetic Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA) bestimmt, das die rasche Zunahme der Trübung als Zunahme der OD bei 405 nm und die Zeitdauer, bis die Geschwindigkeit der Änderung maximal ist (Zeit bis zu Vmax), mißt.
Die genauen Mengen der beschriebenen Reagenzien können unter Heranziehung dieser Offenbarung für verschiedene gewünschte Probenvolumina variiert werden. Anstelle des Faktor X-aktivierenden Enzyms aus Russell's Vipern-Gift kann jeder beliebige Aktivator von Faktor X (oder Faktor Xa selbst) verwendet werden. Eine Kontaktaktivierung der Gerinnung, Tissue Factor, Faktor IXa oder XIa können verwendet werden.
Die Gerinnungszeit kann durch manuelle Assays gemessen werden, in denen die Gerinnung ohne die Hilfe von Instrumenten beobachtet wird, oder durch Instrumente, die automatisiert sein können, die in der Lage sind, die Bildung von Gerinnseln nachzuweisen. Geeignete Instrumente würden beispielsweise eine Gerinnung durch Veränderungen der Trübung bei einer geeigneten Wellenlänge, Veränderungen der Farbe in einem chromogenen Assay oder jeden beliebigen anderen geeigneten Parameter nachweisen.
Die Gerinnungszeiten der Patientenproben werden mit jenen der normalen Kontrollen verglichen. Jene Patientenproben, die verlängerte Gerinnungszeiten in Abwesenheit von aktiviertem Protein C in Gegenwart einer Membranquelle, die PE enthält, zeigen, aber normale oder kürzere Gerinnungszeiten in Gegenwart von aktiviertem Protein C zeigen, werden dahingehend eingeschätzt, daß sie ein hohes Risiko einer selektiven Inhibierung des Protein C-Stoffwechselwegs und ein konsequentes Risiko für thrombotische Erkrankungen aufweisen.

Beispiel 1: Einstufen-Gerinnungs-Assay zum Screening von Patientenplasmaproben hinsichtlich eines Risikos für thrombotische Erkrankungen (Variable Phospholipidkonzentration)

Phospholipidvesikel, die 40% PE/20% PS/40% PC enthielten, wurden gemäß einem Standardverfahren hergestellt.
Eine Reaktionsmischung von 70 µl wurde in einer Vertiefung einer PVC-Platte hergestellt, die 30 µl Phospholipidvesikel zur Bereitstellung einer Konzentration an Gesamtphospholipid von 0,1 bis 300 µg/ml, 10 µl 15 ng/ml Faktor X-aktivierendes Enzym aus Russell's Vipern-Gift, 10 µl zu untersuchendes, mit Citrat behandeltes Plasma und 10 µl humane Standardplasmapool-Kontrolle enthielt. 10 µl 16 nM aktiviertes humanes Protein C wurden zu einer Hälfte der Testvertiefungen gegeben. Parallel dazu wurden Reaktionsmischungen von 70 µl mit 20 µl normalem gepooltem Kontrollplasma hergestellt.
Die Gerinnung wurde mit 25 µl 20 mM CaCl&sub2; initiiert und auf einem V-max Kinetic Microplate Reader bei Raumtemperatur verfolgt. Die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse können graphisch in Fig. 5 betrachtet werden. Die Daten zeigten, daß Lupus-Antikoagulanzien die Gerinnung auf PE-Liposomen in Gegenwart von APC verstärken können. Beispielsweise ist bei 3 µg/ml Phospholipide die Gerinnungszeit für "Lupus + APC" in dramatischem Ausmaß niedriger als jene von normalen Kontrollpatienten.

Beispiel 2: Unterschiede in der Thrombinbildung zwischen normalen Plasma und Lupus-Antikoagulans-Plasma in Gegenwart und Abwesenheit von aktiviertem Protein C

Die Kinetiken der Prothrombinaktivierung mit und ohne 8 nM APC in normalem Plasma und Plasma aus einem Patienten mit Thrombose und einem Lupusantikoagulans wurden untersucht. Die 10 µl zu untersuchendes humanes Plasma, 10 µl TBS-Gelatine (0,1%) und 10 µl APTT-Reagens (Sigma) enthaltende Mischung wurde 5 min bei 25 ºC inkubiert. Dann wurden 10 µl Rinder-APC (5 µg/m1), 10 µl Rinder-PS (70 µg/ml) und 10 µl normales, gepooltes, humanes, mit Citrat behandeltes Plasma zugesetzt. Nach einer dreiminütigen Inkubation wurde die Prothrombinaktivierung durch Zugabe von 20 µl 25 mM CaCl&sub2; initiiert. Zu den auf der Abszisse der Fig. 6 angegebenen Zeitpunkten wurden 20 µl 50 mM EDTA, 200 mM MOPS, pH 7,4, zugesetzt, um die Reaktion abzubrechen. Der Zeitpunkt wurde durch die Zugabe von EDTA vor dem CaCl&sub2; bestimmt. Die Thrombinkonzentration wurde durch die Zugabe von 50 µl 0,5 mM Spectrozyme-PCA als Substrat für Thrombin bestimmt und die Hydrolyseraten auf einem V-max Kinetic Microplate Reader bei Raumtemperatur analysiert. Die Ergebnisse dieses Beispiels können Tabelle 2 und Fig. 6 entnommen werden. TABELLE 1 GERINNUNG AUF PHOSPHATIDYLETHANOLAMIN-LIPOSOMEN IN GEGENWART ODER ABWESENHEIT VON AKTIVIERTEM PROTEIN C (APC): LUPUS-PATIENT GEGEN KONTROLLE
a PL = Gesamtphospholipid-Konzentration; Phospholipidvesikel enthielten 40% Phosphatidylethanolamin, 20% Phosphatidylserin und 40% Phosphatidylcholin
b Kontrolle = humaner Standardplasmapool TABELLE 2 THROMBINBILDUNG IN GEGENWART ODER ABWESENHEIT VON AKTIVIERTEM PROTEIN C (APC): LUPUS-PATIENT GEGEN KONTROLLE [Thrombin] (nM)
a Kontrolle = humaner Standardplasmapool

Beispiel 3: Die Wirkung eines PE-Einbaus in PS/PC-Vesikel auf die gerinnungshemmende Aktivität von APC in Plasma

Beschallte Vesikel (SV), die 20% PS/80% PC (10 µg/ml) enthielten, oder SV, die 40% PE/20% PS/40% PC (10 µg/ml) enthielten, wurden eingesetzt, um den Einstufen-Gerinnungs-Assay in Gegenwart oder Abwesenheit varuerender Konzentrationen von humanem APC zu unterstützen. Experimentelle Mischungen (70 µl insgesamt vor Zusatz von CaCl&sub2;) enthielten verschiedene Konzentrationen von humanem APC, 10 µg/ml Gesamtphospholipid, Faktor X-aktivierendes Enzym aus Russell's Vipern-Gift (1 ng/ml für PE/PS/PC und 10 ng/ml für PS/PC) und humanen Standardplasmapool (20 µl). Die Menge an zu jeder Testprobe zugesetztem Russell's Vipern-Gift wurde so eingestellt, daß die gleiche Gerinnungszeit für die Testprobe ohne APC erzielt wurde. Die Gerinnung wurde durch Zugabe von 25 µl 20 mM CaCl&sub2; initiiert. Die Gerinnungszeiten wurden in einem V-max Kinetic Microplate Reader bestimmt. Tabelle 3 zeigt die Daten aus diesem Experiment und Fig. 4 gibt die erhaltenen Daten graphisch wieder. Das Experiment zeigte, daß der Einbau von PE in Vesikel eine Wirkung auf die APC-Aktivität hatte, da sich die Gerinnungszeiten gegenüber Assays, die PS/PC-Vesikel verwendeten, erhöhten. TABELLE 3 ANTIKOAGULATIONSAKTIVITÄT VON AKTIVIERTEM PROTEIN C (APC) IN PLASMA: EINBAU VON PE IN PS/PC-VESIKELa
a PS/PC = 20% Phosphatidylserin und 80% Phosphatidylcholin;
PE/PS/PC = 40% Phosphatidylethanolamin, 20% Phosphatidylserin und 40% Phosphatidylcholin

Beispiel 4: Gerinnung auf PE-Liposomen in Gegenwart oder Abwesenheit von APC in verschiedenen Konzentrationen

Ein im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschriebener Assay wurde ausgeführt. Die an Kontrollplasma oder Plasma von einer Person mit Lupusantikoagulans-Antikörpern untersuchten Parameter waren verschiedene Phospholipid (PL)-Konzentrationen und die Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener APC-Konzentrationen. Tabelle 4 liefert die Daten, die eine verlängerte Gerinnungszeit von Lupus-Plasma in Abwesenheit von APC, aber eine Abnahme der Gerinnungszeit bei 3 µg/ml PL bei Lupus-Patienten plus APC zeigt. Bei 10 µg/ml PL für Kontrolle + APC war die Gerinnungszeit so hoch, daß angenommen würde, daß diese nicht gerinnt. Optimale Konzentrationen [PL] und [APC] können auch durch einen solchen Dosis-Wirkungs-Assay bestimmt werden. TABELLE 4 ÄNEDERUNGEN DER KONZENTRATION AN AKTIVIERTEM PROTEIN C (APC) und PE/PS/PC: LUPUS-PATIENT GEGEN KONTROLLE
a PL = Gesamtphospholipidkonzentration; Phospholipidvesikel enthalten 40 % Phosphatidylethanolamin, 20% Phosphatidylserin und 40% Phosphatidylcholin
b Kontrolle = humaner Standardplasmapool

Beispiel 5: Kinetik der Prothrombinaktivierung in Gegenwart oder Abwesenheit von Protein C

Es wurde ein wie in Beispiel 2 beschriebener Assay in Gegenwart oder Abwesenheit von 8 nM oder 6 ug/ml APC ausgeführt. Es wurde gefunden, daß Thrombin in Lupus-Patientenplasma in Gegenwart von APC früher und in einer höheren Konzentration erzeugt wurde als in Kontrollplasma. TABELLE 5 KITETIK DER PROTHROMBINAKTIVIERUNG IN GEGENWART ODER ABWESENHEIT VON AKTIVIERTEM PROTEIN C (APC) LUPUS-PATIENTEN GEGEN KONTROLLE
a Gerrinungszeit nach Zugabe von Ca&spplus;&spplus; und vor dem Abbruch durch EDTA
b Normal = normales humanes Plasma
c SL"SP" = normales humanes gepooltes Plasma

Beispiel 6: Demonstration der Beschleuniauna der Faktor Va- Inaktivierung durch Membranoberflächen

Die Inaktivierung von Faktor Va wurde mit einem Drei-Stufen- Assay analysiert. In der ersten Stufe wurde Faktor Va durch APC an verschiedenen Membranoberflächen inaktiviert. In der zweiten Stufe wurde nach der Inaktivierung des APC die restliche Faktor Va-Aktivität durch Zugeben von optimalen Konzentrationen an Phospholipid, einem Überschuß an Faktor Xa und Prothrombin aufgezeichnet. Das resultierende Thrombin wurde in der dritten Stufe unter Verwendung eines chromogenen Assays gemessen. Sämtliche Reagenzien wurden in TBS, das 1 mg/ml Gelatine, 1 mg/ml Ovalbumin und 10 mg/ml BSA enthielt, verdünnt. Sämtliche Stufen wurden bei 25ac in denselben Vertiefungen von PVC-Platten mit 96 Vertiefungen (Costar), die mit einer Mischung von Ovalbumin und Gelatine beschichtet waren, um eine Adsorption an die Wände zu minimieren, ausgeführt. Die erste Stufe (70 µl) enthielt eine variable Phospholipid-Konzentration, 10 µg/ml Rinder-Protein 5, 7 ng/ml Rinder-APC, 3,6 TNM CaCl&sub2; und 1 ng/ml Faktor Va aus Rind. Nach 30 min wurden 10 µl 160 µM (p-Amidinophenyl)methansulfonylfluorid zugesetzt, um APC zu inhibieren. Der Inhibitor wird rasch abgebaut und in 20 min war weder APC- noch eine Inhibitoraktivität nachweisbar. In Abwesenheit von APC war die Aktivität von Faktor Va unter diesen Bedingungen für mindestens 1 h stabil. Um die restliche Faktor Va-Aktivität auszuwerten, wurden in der zweiten Stufe 4 µg/ml Phospholipid (Endkonzentration) zu sämtlichen Proben, die suboptimale Phospholipidkonzentrationen enthielten, und dann Faktor Xa (1,2 ng/ml) und Prothrombin (100 µg/ml) unter Einstellung der angegebenen Endkonzentrationen zugegeben. Nach 5 min Inkubation wurde die Prothrombin-Aktivierung durch Zugabe von 10 µl 50 mH EDTA, 200 mM MOPS, pH 7,4, abgebrochen. Die Thrombinaktivität wurde mit dem chromogenen Substrat Spectrozyme-PCA (50 µl, 0,5 mM) auf einem V-max Kinetic Microplate Reader bestimmt. Die Thrombinkonzentration wurde bestimmt durch Bezugnahme auf eine Standardkurve, die mit humanem a-Thrombin hergestellt worden war. Der Prozentsatz an Faktor Va Inaktivierung wurde dann berechnet, indem die Thrombinbildung in Gegenwart von APC durch die Thrombinbildung in dessen Abwesenheit dividiert und dieser Wert von 1 subtrahiert wurde. Unter diesen Bedingungen war die Thrombinbildung direkt proportional zu der Faktor Va-Konzentration.
In den Experimenten, die eine Inaktivierung einer höheren Faktor Va-Konzentration (1 nM, 170 ng/ml) bei 4 µg/ml Phospholipid umfaßten, wurde in der zweiten Stufe die Faktor Xa-Konzentration 20-fach erhöht (24 ng/ml). In der dritten Stufe wurden die Proben nach der Zugabe von EDTA vor der Messung der Thrombinaktivität 20-fach verdünnt. Bei höheren Faktor Va-Konzentrationen (10, 100 und 1000 nM) wurden die Umsetzungen wie vorstehend beschrieben ausgeführt mit der Ausnahme, daß 4 µg/ml des zu untersuchenden Phospholipids in der ersten Stufe eingesetzt wurden. Nach der Inaktivierung mit APC wurde die Probe auf 1 nM aktiven und inaktiven Faktor Va verdünnt und Phospholipid zu 4 µg/ml zugegeben. Der übrige Assay wurde wie vorstehend beschrieben ausgeführt.
Experimente wurden mit Vesikeln, die 20% Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol, PE, Cardiolipin oder Cholesterol und einen konstanten Prozentsatz von 20% PS und 60% PC enthielten, ausgeführt. Von diesen Vesikeln zeigten jene, die PE enthielten, den weitaus höchsten Anstieg an Aktivität betreffend die Unterstützung der Inaktivierung von Faktor Va durch APC (Fig. 1), obwohl sowohl Phosphatidylglycerol als auch Cardiolipin ein gewisses Maß an erhöhter Aktivität in diesem Assay zeigten. Die Gegenwart von PS oder anderen negativ geladenen Phospholipiden war notwendig, d.h. PE in Kombination mit PC würde eine Inaktivierung von Faktor Va nicht effektiv unterstützen.
Der Einfluß des PE-Gehalts auf die Prothrombinase-Aktivität (Fig. 2A) und auf die Inaktivierung von Faktor Va durch APC (Fig. 2B) wurde als Funktion der Phospholipidkonzentration untersucht. Es bestand geringer Einfluß von PE auf die Geschwindigkeit der Prothrombinaktivierung. Die Prothrombinaktivierungsgeschwindigkeiten nahmen als Funktion der ansteigenden Phospholipidkonzentration bei sämtlichen Phospholipidmischungen zu, nahmen aber in der Folge bei einem Überschuß an Phospholipid ab. Im Gegensatz dazu wurde die APC-abhängige Inaktivierung von Faktor Va im Verhältnis zu dem PE-Gehalt der Vesikel bis zu 40% PE, der höchsten mit stabiler Vesikelbildung kompatiblen Konzentration, erhöht. Wie bei der Prothrombinaktivierung inhibierten höhere Phospholipidkonzentrationen die Inaktivierung von Faktor Va. Vesikel mit 40% PE waren so wirksam wie rohes Hirn- Cephalin bei der Unterstützung der Inaktivierung von Faktor Va.
Gemäß einer Analyse durch Elektronenmikroskopie waren die PE enthaltenden Vesikel viel größer (150 nm) als jene ohne PE (PS/PC 20 nm) und dementsprechend stellten wir, um zu bestimmen, ob die Vesikelgröße für die Unterschiede verantwortlich sein könnte, zwei Sätze großer Vesikel her, einen durch Dialyse aus einer Detergenslösung und einen anderen durch Extrusion von Phospholipidsuspensionen. Die Fähigkeit, Prothrombinase- und APC-Aktivitäten zu unterstützen, wurden verglichen.
LV, umfassend 20% PS/80% PC, waren 250 nm mit gewissen multilamellaren Eigenschaften, wie aus erstellten Elektronenmikrophotographien entnommen wurde. LV, die 40% PE/20% PS/40% PC enthielten, ergaben Partikel von etwa 150 nm mit geringerem multilamellaren Charakter. Um Prothrombinase in aquivalenter Weise zu unterstützen, war eine ungefähr 5-fach höhere Konzentration an Phospholipid bei LV ohne PE erforderlich als bei jenen, die PE enthielten, was möglicherweise die geringere verfügbare Oberfläche bezogen auf das Gewicht wiederspiegelt. Sogar bei 100-fach höheren Konzentrationen konnten jedoch LV ohne PE die APC-abhängige Inaktivierung von Faktor Va nicht so gut unterstützen wie jene, die PE enthielten. Dementsprechend ist die Vesikelgröße nicht für den Aktivitätsunterschied verantwortlich. Dieser Sachverhalt wird weiter in Fig. 3 verdeutlicht. Extrudierte Vesikel ergaben qualitativ ähnliche Ergebnisse.
Der mögliche Beitrag ungesättigter Fettsäuren wurde gleichfalls untersucht. Cephalin aus Rinderhirn (Sigma Chemical Co.) wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers hergestellt. PE aus Rinderhirn enthält ungefähr 40% ungesättigte und 60% gesättigte Fettsäuren. Wir stellten beschallte Vesikel, die 40% Dioleoyl- oder Dilinoleoyl-PE enthielten, her. Bezogen auf PE aus Hirn erhöhten diese Vesikel die Prothrombinaktivierung um etwa 30%, beeinflußten aber die APC-Aktivität in Gegenwart von Protein S nicht.
Die früheren Studien wurde sämtlich bei sehr niedrigen Faktor Va-Konzentrationen durchgeführt. Um sicherzustellen, daß diese Beobachtung nicht allein auf diese Bedingungen zurückzuführen war, wurde die Faktor Va-Konzentration auf 1 nM erhöht. Die Inaktivierung von Faktor Va wurde nach wie vor ungefähr 10- fach durch PE enthaltende Liposome erhöht (Fig. 3) im Vergleich zu Liposomen ohne PE, was ähnlich zu der bei geringeren Faktor Va-Konzentrationen beobachteten Erhöhung ist. Wie vorstehend beschrieben, waren große dialysierte Vesikel, die PE enthielten, so wirksam wie kleine Vesikel bei sämtlichen APC-Konzentrationen bei der Inaktivierung von Faktor Va, jedoch waren große Vesikel, die nur PS und PC enthielten, geringfügig weniger aktiv als die kleinen Vesikel. Unter diesen Bedingungen erhöhte Protein 5 die Inaktivierung von Faktor Va ungefähr 10-fach unabhängig davon, ob die PS enthaltenden Vesikel auch PE enthielten. Eine ähnliche PE-abhängige Verstärkung der Inaktivierung von Faktor Va wurde sogar bei 10, 100 und 1000 nM Faktor Va beobachtet.

Claims

1. Verfahren zum Untersuchen einer Plasmaprobe eines Patienten auf Anzeichen einer Thrombose-Anfälligkeit, bei dem man:

(a) eine erste Gerinnungszeit in einer ersten aliquoten Teilmenge einer mit Citrat behandelten Plasmaprobe eines Patienten in Gegenwart von aktiviertem Protein C und einer Membran-Quelle bestimmt, die einen Phospholipid-Bestandteil aufweist, dessen Gehalt an Phosphatidylethanolamin ausreicht, um den Nachweis von Unterschieden in der Gerinnung zwischen normalem Plasma und Plasma von Patienten mit einer Thrombose-Anfälligkeit zu ermöglichen, und dessen Gehalt an Phosphatidylserin ausreicht, um die Funktion von Phosphatidylethanolamin in dem Gerinnungsnachweis zu komplementieren;

(b) eine zweite Gerinnungszeit für eine zweite aliquote Teilmenge der mit Citrat behandelten Plasmaprobe des Patienten in Gegenwart einer Membran-Quelle, die einen Phospholipid-Bestandteil aufweist, dessen Gehalt an Phosphatidylethanolamin ausreicht, um den Nachweis von Unterschieden in der Gerinnung zwischen normalem Plasma und Plasma von Patienten mit einer Thrombose-Anfälligkeit zu ermöglichen, und dessen Gehalt an Phosphatidylserin ausreicht, um die Funktion von Phosphatidylethanolamin in dem Gerinnungsnachweis zu komplementieren, und in Abwesenheit von aktiviertem Protein C bestimmt;

(c) eine dritte Gerinnungszeit für eine Kontroll-Plasmaprobe in Gegenwart von aktiviertem Protein C und einer Membran-Quelle bestimmt, die einen Phospholipid-Bestandteil aufweist, dessen Gehalt an Phosphatidylethanolamin ausreicht, um den Nachweis von Unterschieden in der Gerinnung zwischen normalem Plasma und Plasma von Patienten mit einer Thrombose-Anfälligkeit zu ermöglichen, und dessen Gehalt an Phosphatidylserin ausreicht, um die Funktion von Phosphatidylethanolamin in dem Gerinnungsnachweis zu komplementieren;

(d) eine vierte Gerinnungszeit für eine zweite aliquote Teilmenge der Kontroll-Plasmaprobe in Gegenwart einer Membran-Quelle, die einen Phospholipid-Bestandteil aufweist, dessen Gehalt an Phosphatidylethanolamin ausreicht, um den Nachweis von Unterschieden in der Gerinnung zwischen normalem Plasma und Plasma von Patienten mit einer Thrombose- Anfälligkeit zu ermöglichen, und dessen Gehalt an Phosphatidylserin ausreicht, um die Funktion von Phosphatidylethanolamin in dem Gerinnungsnachweis zu komplementieren, und in Abwesenheit von aktiviertem Protein C bestimmt;

(e) die ersten, zweiten, dritten und vierten Gerinnungszeiten miteinander vergleicht und feststellt, daß die Probe des Patienten auf eine Gefährdung durch Thrombose hinweist, wenn bei optimaler Phospholipidkonzentration deren erste Gerinnungszeit kürzer als die dritte Gerinnungszeit ist und deren zweite Gerinnungszeit länger oder gleich lang wie die vierte Gerinnungszeit ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Membran-Quelle ferner Phosphatidylcholin in einer ausreichenden Menge enthält, um den Phospholipid-Bestandteil der Membran-Quelle auf 100 % bringen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Phospholipid-Bestandteil der Membran-Quelle etwa 40 % Phosphatidylethanolamin, etwa 20 % Phosphatidylserin und etwa 40 % Phosphatidylcholin enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die ausreichende Menge an Phosphatidylethanolamin etwa 10 bis etwa 50 Gew.-% des Phospholipid-Bestandteils der Membran-Quelle beträgt und bei dem die ausreichende Menge an Phosphatidylserin etwa 5 bis etwa 50 Gew.-% des Phospholipid-Bestandteils der Membran- Quelle ausmacht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die ausreichende Menge an Phosphatidylethanolamin etwa 10 bis etwa 50 Gew.-% des Phospholipid-Bestandteils der Membran-Quelle beträgt und bei dem die Menge an Phosphatidylserin etwa 5 bis etwa 25 % des Phospholipid-Bestandteils der Membran-Quelle ausmacht.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5, bei dem man die Gerinnungszeiten durch manuelle überwachung der Gerinnung bestimmt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5, bei dem man die Gerinnungszeiten mit einem Gerät bestimmt, das zum Nachweis der Gerinnung adaptiert wurde.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Gerät ein automatischer Plattenleser ist, der mit spektrophotometrischen Vorrichtungen zur Überwachung von Reaktionsmischungen bei einer zum Nachweis einer Gerinnungsrekation geeigneten Wellenlänge ausgerüstet ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5, bei man dem die Gerinnungszeiten mittels eines chromogenen Verfahrens bestimmt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man die Gerinnungszeiten mittels eines chromogenen Verfahrens bestimmt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man die Gerinnungszeiten bestimmt, indem man die zeitlichen Änderungen der Trübheit nachweist.

12. Verfahren zum Untersuchen einer Plasmaprobe eines Patienten auf Anzeichen einer Thrombose-Anfälligkeit, bei dem man:

(a) eine erste Gerinnungszeit in einer ersten aliquoten Teilmenge einer mit Citrat behandelten Plasmaprobe eines Patienten in Gegenwart von aktiviertem Protein C, einer Menge an normalem Plasma, die etwa der aliquoten Teilmenge der mit Citrat behandelten Plasmaprobe entspricht, und einer Membran-Quelle bestimmt, die einen Phospholipid-Bestandteil aufweist, dessen Gehalt an Phosphatidylethanolamin ausreicht, um den Nachweis von Unterschieden in der Gerinnung zwischen normalem Plasma und Plasma von Patienten mit einer Thrombose-Anfälligkeit zu ermöglichen, und dessen Gehalt an Phosphatidylserin ausreicht, um die Funktion von Phosphatidylethanolamin in dem Gerinnungsnachweis zu komplementieren;

(b) eine zweite Gerinnungszeit für eine zweite aliquote Teilmenge der mit Citrat behandelten Plasmaprobe des Patienten in Gegenwart einer Membran-Quelle, die einen Phospholipid-Bestandteil aufweist, dessen Gehalt an Phosphatidylethanolamin ausreicht, um den Nachweis von Unterschieden in der Gerinnung zwischen normalem Plasma und Plasma von Patienten mit einer Thrombose-Anfälligkeit zu ermöglichen, und dessen Gehalt an Phosphatidylserin ausreicht, um die Funktion von Phosphatidylethanolamin in dem Gerinnungsnachweis zu komplementieren, und einer Menge an normalem Plasma, die etwa der aliquoten Teilmenge der mit Citrat behandelten Plasmaprobe entspricht, sowie in Abwesenheit von aktiviertem Protein C bestimmt;

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Membran-Quelle ferner eine ausreichende Menge an Phosphatidylcholin enthält, um den Phospholipid-Bestandteil der Membran-Quelle auf 100 % zu bringen.

14. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Phospholipid-Bestandteil der Membran-Quelle etwa 40 % Phosphatidylethanolamin, etwa 20 % Phosphatidylserin und etwa 40 % Phosphatidylcholin enthält.

15. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die ausreichende Menge an Phosphatidylethanolamin etwa 10 bis etwa 50 Gew.-% des Phospholipid-Bestandteils der Membran-Quelle beträgt und bei dem die ausreichende Menge an Phosphatidylserin etwa 5 bis etwa 50 Gew.-% des Phospholipid-Bestandteils der Membran- Quelle ausmacht.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12, 13, 14 und 15, bei dem die ausreichende Menge an Phosphatidylethanolamin etwa 10 bis etwa 50 Gew.-% des Phospholipid-Bestandteils der Membran-Quelle beträgt und bei dem die Menge an Phosphatidylserin etwa 5 bis etwa 25 % des Phospholipid-Bestandteils der Membran-Quelle ausmacht.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 12, 13, 14, 15 oder 16, bei dem man die Gerinnungszeiten durch manuelle Überwachung der Gerinnung bestimmt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12, 13, 14, 15 oder 16 bei dem man die Gerinnungszeiten mit einem Gerät bestimmt, das zum Nachweis der Gerinnung adaptiert wurde.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Gerät ein automatischer Plattenleser ist, der mit spektrophotometrischen Vorrichtungen zur Überwachung von Reaktionsmischungen bei einer zum Nachweis einer Gerinnungsrekation geeigneten Wellenlänge ausgerüstet ist.

20. Verfahren nach Anspruch 18, bei man dem die Gerinnungszeiten mittels eines chromogenen Verfahrens bestimmt.

21. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem man die Gerinnungszeiten mittels eines chromogenen Verfahrens bestimmt.

22. Verfahren zur Überwachung der Effektivität eines anti-inflammatorischen Wirkstoffs oder einer Anti-Koagulans Therapie bei Patienten mit Lupus anticoagulans oder Patienten mit Anti-Phospholipid-Antikörpern, bei dem man:

(a) eine erste mit Citrat behandelte Plasmaprobe, die zu einem ersten Zeitpunkt von einem Patientens entnommen wurde zur Verfügung stellt;

(b) die Gerinnungseigenschaften der ersten mit Citrat behandelten Plasmaprobe in Gegenwart und Abwesenheit von aktiviertem Protein C und in Gegenwart einer Membran-Quelle bestimmt, die einen Phospholipid-Bestandteil aufweist, dessen Gehalt an Phosphatidylethanolamin ausreicht, um den Nachweis von Unterschieden in der Gerinnung zwischen normalem Plasma und Plasma von Patienten mit einer Thrombose- Anfälligkeit zu ermöglichen, und dessen Gehalt an Phosphatidylserin ausreicht, um die Funktion von Phosphatidylethanolamin in dem Gerinnungsnachweis zu komplementieren, und die Gerinnungseigenschaften der ersten mit Citrat behandelten Plasmaprobe mit einem Kontroll-Plasma vergleicht;

(c) Schritt (b) mit einer zweiten mit Citrat behandeltem Plasmaprobe wiederholt, die zu einem zweiten Zeitpunkt von dem Patienten gewonnen wurde;

(d) die Testergebnisse vergleicht, um die Ergebnisse einer anti-inflammatorischen oder Anti-Koagulans Therapie zu zeigen.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Membran-Quelle ferner eine ausreichende Menge an Phosphatidylcholin enthält, um den Phospholipid-Bestandteil der Membran-Quelle auf 100 % zu bringen.

24. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Phospholipid-Bestandteil der Membran-Quelle etwa 40 % Phosphatidylethanolamin, etwa 20 % Phosphatidylserin und etwa 40 % Phosphatidylcholin enthält.

25. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die ausreichende Menge an Phosphatidylethanolamin etwa 10 bis etwa 50 Gew.-% des Phospholipid-Bestandteils der Membran-Quelle beträgt und bei dem die ausreichende Menge an Phosphatidylserin etwa 5 bis etwa 50 Gew.-% des Phospholipid-Bestandteils der Membran- Quelle ausmacht.

26. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die ausreichende Menge an Phosphatidylethanolamin etwa 10 bis etwa 50 Gew.-% des Phospholipid-Bestandteils der Membran-Quelle beträgt und bei dem die Menge an Phosphatidylserin etwa 5 bis etwa 25 % des Phospholipid-Bestandteils der Membran-Quelle ausmacht.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 22, 23, 24, 25 oder 26, bei dem man vor der Bestimmung der Gerinnungseigenschaften die den Patienten entnommenen, mit Citrat behandelte Plasmaproben mit gleichen Mengen normaler Plasmaproben vermischt.

28. Verfahren zum Nachweis von Anzeichen einer Thrombose-Anfälligkeit in einer Plasmaprobe eines Patienten, bei dem man:

(a) in einer ersten Reaktionskammer eine Phospholipid- Membran-Quelle, die mindestens 10 % Phosphatidylethanolamin und mindestens 5 % Phosphatidylserin enthält, mit aktiviertem Protein C, einem Gerinnungsaktivator und einer mit Citrat behandelten Plasmaprobe eines Patienten vermischt;

(b) in einer zweiten Reaktionskammer eine Phospholipid-Membran-Quelle, die mindestens 10 % Phosphatidylethanolamin und mindestens 5 % Phosphatidylserin enthält, mit aktiviertem Protein C, einem Gerinnungsaktivator und einer normalen Kontroll-Plasmaprobe vermischt;

(c) in einer dritten Reaktionskammer eine Phospholipid-Membran-Quelle, die mindestens 10 % Phosphatidylethanolamin und mindestens 5 % Phosphatidylserin enthält, mit einem Gerinnungsaktivator und einer mit Citrat behandelten Plasmaprobe eines Patienten vermischt;

(d) in einer vierten Reaktionskammer eine Phospholipid-Membran-Quelle, die mindestens 10 % Phosphatidylethanolamin und mindestens 5 % Phosphatidylserin enthält, mit einem Gerinnungsaktivator und einer normalen Kontroll-Plasmaprobe vermischt; und

(e) eine ausreichende Menge an Ca²&spplus; jeweils der ersten, zweiten, dritten und vierten Reaktionskammer hinzufügt, um die Gerinnung auszulösen; und

(f) die Zeitspanne bis zur Gerinnung der Mischung in jeweils der ersten, zweiten, dritten und vierten Reaktionskammer bestimmt.

29. Verfahren nach Anspruch 28, bei dem man vor Stufe (e) eine gleiche Menge der mit Citrat behandelten, normalen Kontroll- Plasmabrobe jeweils der ersten, zweiten, dritten und vierten Reaktionskammer hinzufügt

30. Verfahren nach den Ansprüchen 28 oder 29, bei dem die Phospholipid-Membran-Quelle 10 bis 50 % Phosphatidylethanolamin, 5 bis 50 % Phosphatidylserin und den restlichen Teil Phosphatidylcholin enthält.

31. Verfahren nach den Ansprüchen 28 oder 29, bei dem die Phospholipid-Quelle etwa 40 % Phosphatidylethanolamin, etwa 20 % Phosphatidylserin und etwa 40 % Phosphatidylcholin enthält.

32. Verfahren nach den Ansprüchen 28 oder 29, bei dem der Gerinnungsaktivator ein Faktor X aktivierendes Enzym ist.

33. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem das Faktor X aktivierende Enzym Russell's Vipern-Gift ist.

34. Verfahren nach den Ansprüchen 28 oder 29, bei dem der Gerinnungsaktivator ein Aktivator des Kontaktsystems der Gerinnung ist.

35. Verfahren nach den Ansprüchen 28 oder 29, bei dem der Gerinnungsaktivator aus der Gruppe bestehend aus Faktor Xa, Faktor IXa, Faktor XIa und Gewebe-Faktor ausgewählt wurde.