DE69331231T2

DE69331231T2 - Ein neuartiges, antineoplastisches cytokin

Info

Publication number: DE69331231T2
Application number: DE69331231T
Authority: DE
Inventors: Bharat Aggarwal
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1993-04-23
Publication date: 2002-08-22
Anticipated expiration: 2013-04-24
Also published as: KR950701347A; FI944907A0; CA2118498A1; AU671637B2; NO943968D0; TW372873B; EP0637319A1; IL105473A0; US5241051A; CN1083389A; JPH07506364A; RU2139087C1; AU4113593A; EP0637319B1; NZ252429A; EP0637319A4; WO1993022346A1; NO313099B1; CN1068335C; ZA932830B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Cytokine. Insbesondere betrifft sie ein neues Cytokin mit breiter Antitumorwirksamkeit.
Das Zellwachstum wird anscheinend durch ein Gleichgewicht zwischen wachstumsstimulierenden und wachstumshemmenden Molekülen reguliert. Ein Ungleichgewicht dieser wachstumsregulierenden Cytokine ist als einer der Mechanismen von Tumorwachstum vorgeschlagen worden.
Es sind mehrere Cytokine beschrieben worden, die das Wachstum von Tumor- und Normalzellen stimulieren. Diese umfassen beispielsweise: epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblaswachstumsfaktor (FGF), Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGF), Interleukine (IL), kolonie-stimulierende Faktoren (CSF) und transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β).
Dagegen hemmen andere Cytokine selektiv das Wachstum bestimmter Tumorzellen. Diese umfassen beispielsweise: Interferone (IFN), Lymphotoxin (LT), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Oncostatin M, Amphiregulin, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL- 6) und TGF-β.
Diese das Wachstum stimulierenden und hemmenden Cytokine können auf der Basis ihrer Quelle, ihrer Spezifität gegen Tumortargets, ihrer physiochemischen Eigenschaften und ihrer Primärstruktur voneinander unterschieden werden. Damit sind die Identifizierung und die Charakterisierung von wachstumsregulierenden Cytokinen von kritischer Bedeutung für das Verständnis von Zellwachstum einschließlich des Tumorwachstums.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine neue Stoffzusammensetzung angegeben. Diese neue Stoffzusammensetzung, die als Oncoinhibin bezeichnet wird, wird von Human-Erythroblastzellen abgesondert, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 28 kDa gemäß SDA-PAGE und zeigt vielseitige Antitumorwirksamkeit. Das Oncoinhibin-Protein ist im wesentlichen frei von Verunreinigungen und im wesentlichen homogen gemäß der Bestimmung durch SDS-PAGE und ist in einem pH-Bereich von 2 bis 8 und einem Temperaturbereich von 4 bis 100ºC stabil.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Präparieren eines als Oncoinhibin bezeichneten neuen Human-Cytokins bereit. Das Verfahren umfaßt das Inkubieren von Human-Erythroblastzellen, das Induzieren der Produktion von Oncoinhibin und das Ernten von aufbereiteten Zellüberständen.
Bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Reinigen von Human-Oncoinhibin bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte der Ultrafiltration von Human-Oncoinhibin enthaltenden aufbereiteten Zellüberständen. Anschließend werden ultrafiltrierte Überstände dialysiert. Danach werden DEAE-Affigel-Blau-Chromatographie, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bzw. SDS-PAGE und Hochleistungs-Rückphasen-Flüssigkeitschromatographie durchgeführt, um Human-Oncoinhibin zu reinigen.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Immunmodulator zum Aktivieren von Lymphocyten, Monocyten und Neutrophilen angegeben, um Tumorzellen zu zerstören. Der neue Immunmodulator weist Human-Oncoinhibin auf. Ferner wird ein neuer Wachstumsfaktor angegeben, um das Wachstum von Normalzellen zu stimulieren. Dieser Wachstumsfaktor weist Human-Oncoinhibin auf.
Bei anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen von Oncoinhibin und Verfahren zum Behandeln einer Tumorzelle angegeben, die die Verabreichung einer wirksamen Dosis Oncoinhibin aufweisen.
Damit der Gegenstand, mit dem die oben angegebenen sowie andere, noch zu erläuternde Merkmale, Vorteile und Ziele der Erfindung erreicht werden, deutlich und im einzelnen verständlich wird, wird eine genauere Beschreibung der oben kurz umrissenen Erfindung durch Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen, die in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht sind, gegeben. Es ist jedoch zu beachten, daß die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zeigen und keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung oder von ebenso wirksamen äquivalenten Ausführungsformen darstellen.
Die Fig. 1A-C zeigen, daß mit K-562-Zellen aufbereitete Überstände das Wachstum von MCF-7-Zellen hemmen.
Fig. 2 zeigt den Standard-Bioassay für Oncoinhibin.
Fig. 3 zeigt die Erzeugung von Oncoinhibin durch K-562- Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit von Serum.
Die Fig. 4A und 4B zeigen die Auswirkungen von Phorbolester auf die Stimulation von Oncoinhibin.
Fig. 5 zeigt die Auswirkungen der Ultrafiltration auf die Wirksamkeit von Oncoinhibin.
Die Fig. 6A und 6B zeigen die Charakterisierung von Oncoinhibin durch Gel-Permeationschromatographie (GPC).
Fig. 7 zeigt die Elution der Aktivität von Oncoinhibin aus der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
Fig. 8 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von Oncoinhibin.
Die Fig. 9A und 9B zeigen die Bindungselution der Aktivität von Oncoinhibin aus DEAE-Affigel-Blau (obere Tafel) und aus einer Q-Sepharosesäule (untere Tafel).
Die Fig. 10A-P zeigen die dosisabhängigen Antivermehrungs- Wirkungen von Oncoinhibin und TNF.
Fig. 11 zeigt dosisabhängige Vermehrungseffekte von Oncoinhibin an normalen Human-Vorhautfibroblasten.
Fig. 12 zeigt die Wirkung von Oncoinhibin an mit Actinomycin D behandelten L-929-Mauszellen.
Fig. 13 zeigt eine Northern-Blot-Analyse auf TNF und LT von K-562-Zellen, die unbehandelt und mit Phorbolestern behandelt waren.
Die Fig. 14A und 14B zeigen den Vergleich von wachstumshemmenden Wirkungen von Oncoinhibin (Tafel A) und Oncostatin M (Tafel B) an Human-Melanomzellen A375.
Die Fig. 15A und 15B zeigen die wachstumshemmenden Wirkungen von Oncostatin M und 1L-6 an normalen Fibroblasten.
Die Fig. 16A und 16B zeigen die Wirkung von 1L-6 an Human- Brusttumorzellen (MCF-7-Zellen).
Fig. 17 zeigt die Wirkung von Antikörpern gegen Interferon- T auf die Aktivität von Oncoinhibin an Human-Brusttumorzellen (MCF-7).
Die Fig. 18A und 18B zeigen die Hemmwirkungen von Interferon-T auf TNF (obere Tafel), jedoch nicht Oncoinhibin (untere Tafel), an Human-Vorhautfibroblasten.
Fig. 19 zeigt die Wachstumsrate von Human-Brusttumorzellen MCF-7 in Abwesenheit und in Anwesenheit von Oncoinhibin.
Fig. 20 zeigt die Wirkung der Dauer, während der MCF-7- Zellen Oncoinhibin ausgesetzt waren.
Fig. 21 zeigt den Vergleich der Wirkung von Oncoinhibin mit TNF auf die Morphologie von Human-Brusttumorzellen MCF-7.
Verschiedene Zellinien einschließlich der Maus- Bindegewebszellinie L929 (CCL 1), K-562 (CCL-243), U-937 (CRL-1543), HL-60 (CCL-240), Raji (CCL-86), Jurkat (CRL-8163), BT 20 (HTB-1 9), MCF-7 (HTB-22), SK-BR-3 (HTB-30), ZR-75-2 (CRL-1500), RPMI 7951 (HTB-66), A375 (CRL-1639), A-431 (CRL- 1555), ME-1 80 (HTB 83), OVCAR-3 (HTB-161), He La (CCL-2), Hep-2 (HB-8065) und NIH 3T3 (CRL-1618) wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) beschafft. TNF- resistente NIH 3T3-Zellen wurden isoliert, wie von K. Totpal, R. LaPushin, H. N. Ananthaswamy und B. B. Aggarwal, Lymphokine and Cytokine Res. 10 (1991) 359-367 beschrieben. Zellen wurden unter Verwendung des auf DNA basierenden Assay-Sets, das von Gen-Probe (San Diego, CA) erworben war, auf Mycoplasma- Verunreinigung untersucht.
Alle Zellkulturen wurden durch wöchentliche Passage in kontinuierlichem exponentiellem Wachstum gehalten. Einige Zellen wurden zweimal wöchentlich subkultiviert. Die Zellen wurden routinemäßig in RPMI-1640-Medium, das mit Glutamin (2 mM), Penicillin (100 E/ml), Streptomycin (100 ug/l) und fetalem Rinderserum (10%) ergänzt war, in einem befeuchteten Inkubator in 5% CO&sub2; in Luft gezüchtet.
Die aufbereiteten Überstände der Human-Erythroblastzellinie K- 562 erzeugen eine Aktivität, die für die Human- Brusttumorzellinie MCF-7 wachstumshemmend ist. Aufgrund ihrer Fähigkeit, das Wachstum von Tumorzellen und nicht das von Normalzellen zu hemmen, wird diese Aktivität als "Oncoinhibin" bezeichnet.
Zur Erzeugung und Induzierung von Oncoinhibin wurde die Human- Erythroblastzellinie K-562 in RPMI-1640-Medium gezüchtet, das 10% fetales Rinderserum, ergänzt mit Glutamin (2 mM), Penicillin (100 E/ml) und Streptomycin (100 ug/l), enthielt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugierung geerntet, wenn eine Dichte von 0,8 · 106 Zellen/ml erreicht war, die Zellen wurden einmal mit Medium ohne Serum gewaschen und in setumfreie Bedingungen in RPMI-1640-Medium, das Glutamin, Penicillin und Streptomycin enthielt, überführt. Zur Produktion von Oncoinhibin wurden 1 · 106/ml dieser Zellen für 48 h in einem T175- Kolben (Falcon) unter stationären Kulturbedingungen in RPMI- 1640-Medium ohne Serum inkubiert und dann für 48 h bei 37ºC mit Phorbolester (100 ng/ml) behandelt. Danach wurden die aufbereiteten Zellüberstände mittels Zentrifugierung geerntet, durch ein 0,22-um-Filter (Falcon) filtriert und bei 4ºC bis zur weiteren Charakterisierung aufbewahrt. Um das Oncoinhibin einzuengen, wurde aufbereitetes Medium von K-562-Zellinien mittels PM-10-Membran (Amicon Corp.) ultrafiltriert und dann mit 20 mM Trispuffer, pH 8,0, dialysiert.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 1A-C wurde die hemmende Wirkung von Oncoinhibin auf das Tumorzellwachstum nach drei getrennten Methoden untersucht. Diese Methoden umfaßten: (1) das Zählen von Zellen auf dem Hämocytometer nach Anfärben mit Trypanblau; (2) die Aufnahme von Kristallviolettfarbstoff; und (3) der Einbau von tritiummarkiertem Thymidin. Gemäß allen drei Methoden hemmt Oncoinhibin deutlich das Wachstum von MCF-7-Zellen auf dosisabhängige Weise. Wegen der Zweckmäßigkeit und Empfindlichkeit wurde die MCF-7-Zellinie als ein Target benutzt, um den Bioassay für Oncoinhibin zu entwickeln. Die Hemmung des Einbaus von tritiummarkiertem Thymidin durch Oncoinhibin erwies sich als eine hochempfindliche Methode zum Nachweis dieses Cytokins.
Der Bioassay für Oncoinhibin besteht aus dem Plattieren von 5 · 103 Zellen in Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen in 0,1 ml RPMI-1640-Medium mit 10% fetalem Kälberserum über Nacht bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator. Dann wird das Medium entfernt, eine zweifache serielle Verdünnung der Testprobe wird mit einem Gesamtendvolumen von 0,1 ml zugefügt, und die Inkubation wird für 24 h bei 37ºC fortgesetzt. Während der letzten 6 h wird tritiummarkiertes Thymidin (0,5 ucl/0,05 mi/Vertiefung) zugefügt. Am Ende der 24-h- Inkubationsperiode wird das Medium abgegossen, und die Zellen werden durch Aufbereiten mit 0,1 ml Trypsin (0,5%) und EDTA (5,3 mM) für 30 min bei 37ºC abgelöst. Die Zellen werden durch Anwendung von PHD Cambridge Zellerntemittel geerntet, und die zelleigene Radioaktivität wird mittels Betazähler bestimmt. Die Daten wurden als % relative Lebensfähigkeit ausgedrückt, die definiert ist als die Menge an Dpm, das von den Zellen in Anwesenheit von Oncoinhibin aufgenommen wurde, dividiert durch das Dpm, das in Anwesenheit des Mediums alleine eingebaut wurde, multipliziert mit 100. Die Menge an Oncoinhibin, die erforderlich war, um die Lebensfähigkeit um 50% zu hemmen, wurde als eine Einheit des Cytokins definiert. Wie Fig. 1 zeigt, zeigt Oncoinhibin eine dosisabhängige Hemmung von Tumorzellwachstum, was durch alle drei Methoden gezeigt wurde.
Unter Bezugnahme auf Fig. 2 konnte eine deutliche dosisabhängige Antwort von MCF-7 auf Oncoinhibin innerhalb von 24 Stunden beobachtet werden. Der Kehrwert der Verdünnung der Probe, der erforderlich war, um eine 50% Hemmung des Thymidineinbaus zu erreichen, wurde als eine Oncoinhibin-Einheit definiert.
Unter Bezugnahme auf Fig. 3 wurde die Produktion von Oncoinhibin unter serumfreien Bedingungen untersucht. Serumfreie Bedingungen wurden angewandt wegen der Schwierigkeit, die Proteine aus Serum enthaltenden Proben auszureinigen. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß das Oncoinhibin auch bei Abwesenheit von Serum von K-562-Zellen abgesondert wird.
Wir untersuchten, ob andere Agenzien die Produktion von Oncoinhibin induzieren können. Calciumionophor, Concanavalin A, Phytohämagglutinin und Phorbolester wurden untersucht. Die Fig. 4A und 4B zeigen; daß Phorbolester die Produktion von Oncoinhibin steigern kann. Somit kann Phorbolester eingesetzt werden, um die Produktion von Oncoinhibin aus K-562-Zellen zu optimieren. Eine ungefähr vierfache Steigerung der Produktion von Oncoinhibin wurde beobachtet, wenn die Zellen Phorbolester (100 ng/ml) ausgesetzt wurden. Eine optimale Induzierung von Oncoinhibin wurde beobachtet, wenn Zellen mit Phorbolester für 48 h inkubiert wurden(Tabelle I), und bei einer Zelldichte von 1 · 10&sup6; Zellen/ml des Mediums (Tabelle II). TABELLE I Zeitlicher Verlauf der Induzierung von Oncoinhibin aus Human-Zellen K-562 durch Phorbolester
K-562-Zellen (1 · 106/ml) wurden in serumfreiem Medium (RPMI- 1640) entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit des Phorbolesters (100 ng/ml) bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator für unterschiedliche Zeitdauern gezüchtet, und dann wurde das aufbereitete Medium mittels Zentrifugierung geerntet. Proben wurden an MCF-7-Zellen in 1:2fachen Verdünnungsreihen gemäß Materials and Methods getestet. TABELLE II Optimierung der Produktion von Oncoinhibin in Anwesenheit und Abwesenheit von Phorbolester bei verschiedenen Zelldichten*
*K-562-Zellen wurden mit der angegebenen Zelldichte in serumfreiem Medium (RPMI-1640) für 72 h bei 37ºC in einem CO&sub2;- Inkubator inkubiert. Das aufbereitete Medium wurde durch Zentrifugierung geerntet und mit der zweifachen seriellen Verdünnung an MCF-7-Zellen getestet, wie in Materials and Methods beschrieben wird.
Unter Bezugnahme auf Fig. 5 wurde das mit Zellen aufbereitete Medium durch Ultrafiltration unter Anwendung einer Membran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10.000 (PM-10) eingeengt. Die Wirksamkeit in der Fraktion, die von dem Filter nicht zurückgehalten wurde (Durchfluß oder FT), war geringer, wogegen diejenige der zurückgehaltenen Fraktion bzw. des Konzentrats (C) verhältnismäßig höher als diejenige des Standardpuffers (Startmaterial, SM) war. Die Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität von Oncoinhibin zurückgehalten und konzentriert wird.
Diese Ergebnisse zeigen auch ein Molekulargewicht für Oncoinhibin, das höher als 10.000 ist.
Bei dem Gelpermeations-/Schnelle-Protein- Flüssigkeitschromatographie- bzw. GPC/FPLC-Experiment von Fig. 6, Tafeln A und B, wurde eine Probe von Oncoinhibin auf eine Superose-6-Säule (Pharmacia) aufgebracht, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,1% Rinderserumalbumin und 0,01% Natriumazid enthielt, vorher äquilibriert worden war. Der Durchlauf durch die Säule erfolgte bei Raumtemperatur mit einer Durchflußrate von 0,5 ml/min. und die Größe jeder Fraktion war 0,5 ml. Die Säule war mit Molekulargewicht-Standards (Schwarz/Mann, Cambridge, MA) kalibriert. Die letzteren umfaßten Apoferritin (480 kDa), Alpha-Amylase (20 kDa), Gamma- Globulin (160 kDa), Rinderserumalbumin (67 kDa), Ovalalbumin (45 kDa), Chymotrypsinogen (24 kDa) und Cytochrom C (12,4 kDa).
Unter Bezugnahme auf Fig. 6 hat Oncoinhibin anscheinend ein ungefähres Molekulargewicht von 25 kDa. Das Molekulargewicht von Oncoinhibin wurde mittels GPC/FPLC auf einer Superose-6- Säule unter nichtdenaturierenden Bedingungen untersucht. Die Ergebnisse der Gelfiltration, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,4, erfolgte, zeigen zwei Hauptpeaks der Aktivität, wobei der eine mit dem Ausschlußvolumen koinzident ist und der zweite Peak einem ungefähren Molekulargewicht von etwa 25 kDa entspricht (Fig. 6, Tafel B).
Bei den SDS-PAGE-Experimenten der Fig. 7 und 8 wurde ein Experiment mit 15% Polyacrylamidgel im wesentlichen gemäß U. K. Lämmli (Nature 227 (1970) 680-685, die hier summarisch eingeführt wird) ausgeführt, und Proteine wurden durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Für die vorbereitende Gelelektrophorese und die Elution der Aktivität wurde ein Teil des Gels vor dem Fixieren und Anfärben mit einer Rasierklinge in mehr als 40 verschiedene Scheibchen geschnitten, in einem Testrohr mit 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat durch Diffusion über Nacht eluiert, die Fraktionen wurden gegen 20 mM Trispuffer, pH-Wert 8,0, dialysiert und dann auf biologische Wirksamkeit analysiert.
Unter Bezugnahme auf Fig. 7 wurde, um das Molekulargewicht von Oncoinhibin noch weiter zu bestätigen, eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in Scheiben geschnitten, in 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat über Nacht eluiert und auf Oncoinhibin-Aktivität analysiert. In dem Molekulargewichtsbereich von ungefähr 30 kDa wurde mehr als 50% der angewandten Oncoinhibin-Aktivität rückgewonnen. Weniger als 10% Aktivität wurde ferner in einem Bereich nahe der Farbstoff-Front festgestellt.
Unter Bezugnahme auf Fig. 8 zeigte ein erneuter Durchlauf der biologisch wirksamen Fraktion bei SDS-PAGE und Silberfärben von Gelen ein einziges Hauptband mit einem Molekulargewicht von ungefähr 28 kDa.
Unter Bezugnahme auf Fig. 9, Tafeln A und B, wurde die Oncoinhibin-Bindung an und die Elution aus Anionenaustauschharzen untersucht. Eine Säule (1 cm · 5 cm) wurde mit einem Anionenaustauschharz Q-Sepharose gepackt und dann mit 20 mM Trispuffer, pH-Wert 8,0 (Äquilibrierungspuffer) äquilibriert. Eine Probe Oncoinhibin, die gegen den Äquilibrierungspuffer dialysiert war, wurde mit einem Durchsatz von 0,5 ml/min auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer gespült und dann mit einem Aufwärtsgradienten von NaCl (0- 1 M) aufgelöst. Verschiedene Fraktionen wurden auf Proteinkonzentration und Bioaktivität analysiert.
DEAE-Affigel-Blau-Chromatographie: Eine zweite Säule (1 cm · 5 cm) wurde mit DEAE-Affigel-Blau-Harz gepackt und dann mit 20 mM Trispuffer, pH-Wert 8,0 (Äquilibrierungspuffer) äquilibriert. Eine Probe von Oncoinhibin, die vorher mittels Dialyse gegen den Äquilibrierungspuffer äquilibriert worden war, wurde auf die Säule mit einem Durchsatz von 0,5 ml/min aufgegeben. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer gespült und dann mit aufsteigenden Gradienten von NaCl (0-1M) aufgespalten. Verschiedene Fraktionen wurden auf Proteinkonzentration und Bioaktivität analysiert.
Die Tafeln A und B von Fig. 9 zeigen, daß Oncoinhibin an Anionenaustauschharze bindet und daraus eluiert werden kann. Sowohl an die Q-Sepharose- als auch die DEAE-Affigel-Blau-Harze band die Oncoinhibin-Aktivität in 20 mM Trispuffer, pH-Wert 8,0. Das gebundene Oncoinhibin konnte mit 0,2 M NaCl in 20 mM Trispuffer aus DEAE-Affigel-Blau und mit 0,5 M NaCl aus Q- Sepharose eluiert werden.
Oncoinhibin hemmt das Wachstum von vielen verschiedenen Tumorzellen (Tabelle III). Die Antivermehrungs-Wirksamkeit von Oncoinhibin wurde durch den Einbau von tritiummarkiertem Thymidin untersucht. TABELLE III Unterschiede der Tumorzellspezifität zwischen TNF- und-Oncoinhibin
Tumorzellen (5000/Vertiefung) wurden mit TNF (0,2 ug/l) oder Oncoinhibin (durch Phorbolester induziert und eingeengt) für 72 h bei 37ºC inkubiert, und dann wurde die relative Zell- Lebensfähigkeit (%) durch Einbau von Thymidin wie bereits beschrieben bestimmt.
Unter Bezugnahme auf Fig. 10, Tafeln A bis P, wurden die Dosis-Aktivitäten von Oncoinhibin auf einige der in Tabelle VII angegebenen Zellinien untersucht und mit TNF verglichen. Aus den Ergebnissen gemäß Tabelle VII und Fig. 10 geht hervor, daß Oncoinhibin zusätzlich zu MCF-7 das Wachstum von mehreren verschiedenen Typen von Leukämie, Melanomen, Karzinomen und Hepatomen hemmen kann. Das Wachstum von Mäusezellen wurde ebenfalls gehemmt. Somit hat es den Anschein, daß Oncoinhibin anders als die Interferone nicht artspezifisch ist.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 11 und 12 wurden für Wachstums- Assays Zellen über Nacht in 0,1 ml des Mediums (RPMI-1640 mit 10% fetalem Rinderserum) in Falcon-Platten mit jeweils 96 Vertiefungen plattiert. Danach wurde das Medium entfernt, und eine serielle Verdünnung von Human-Oncoinhibin wurde in 0,1 ml des Volumens überschichtet. Nach 72 h Inkubation bei 37ºC wurde das Medium entfernt, und lebensfähige Zellen wurden durch Kristallviolettfärben gemäß der Vorgehensweise kontrolliert, die von B. B. Aggarwal, Human Lymphotoxin, Meth. of Enzymol., 116: 441-448 (1985), beschrieben und hier summarisch eingeführt wird. Eine Farbstoffaufnahmemethode zur Untersuchung der Zell-Lebensfähigkeit korreliert mit der Zellzahl, die durch Ablösen mit einer Trypsinlösung und mikroskopische Zellzahlbestimmung mit einem Hämocytometer bestimmt wird. Der Prozentsatz der relativen Zell-Lebensfähigkeit wurde als die optische Dichte in Anwesenheit der Testprobe, dividiert durch die optische Dichte in Abwesenheit der Testprobe (Medium), multipliziert mit 100, errechnet. Für LT und TNF wurden Cytotoxizitäts-Assays ähnlich den Wachstumshemmungs-Assays durchgeführt mit der Ausnahme, daß 20 · 10³ L-929-Zellen mit Actinomycin D (1 ug/ml) zusammen mit dem Cytokin für 24 h aufbereitet wurden.
Zellwachstumsstimulations-Assays: Zellwachstumsstimulations- Assays wurden im wesentlichen entsprechend der Vorgehensweise durchgeführt, die von Vilcek et al., J. Exp. Med. 163: 632-643 (1986), beschrieben und hier summarisch eingeführt wird. Um dies kurz zu erläutern: Konfluente diploide Human- Vorhautfibroblasten mit Passagezahlen 12-16 (entsprechend ungefähren Bevölkerungs-Verdopplungszahlen 24-32) wurden für Zellwachstumsstimulations-Assays eingesetzt. Um die Wirkung von Human-Oncoinhibin zu bestimmen, wurden Zellen (8 · 103/Vertiefung) in 0,1 ml des Mediums (RPMI-1630 plus 10% fetales Rinderserum) in Falconplatten mit jeweils 96 Vertiefungen plattiert. Nach Inkubation über Nacht in einem 002- Inkubator bei 37ºC wurde das Medium entfernt, und eine serielle Verdünnung des Cytokins wurde in 0,2 ml des Volumens überschichtet. Nach einer Inkubationsdauer von 5 Tagen wurde das Medium dekantiert, und die Zellen wurden mit Kristallviolett angefärbt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt. Der Prozentsatz der relativen Zell-Lebensfähigkeit wurde ebenso errechnet, wie das für die Wachstumshemmungs-Assays angegeben ist.
Für Assays in bezug auf den Einbau von [³H] TdR wurden Human- Fibroblasten gezüchtet und für 5 Tage mit dem Cytokin behandelt. Während der letzten 24 h wurde tritiummarkiertes Thymidin (6,7 Ci/mmol; New England Nuclear, Boston, MA) jeder Vertiefung zugefügt (0,5 uCi/Vertiefung). Danach wurde das Kulturmedium entfernt, die Vertiefungen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, und die Zellen wurden durch Zugabe einer Lösung aus Trypsin (0,5%) mit EDTA (5,3 mM) abgelöst. Die Zellsuspension wurde dann mit Hilfe von PHD-Zellerntemittel (Cambridge Technology Inc., Watertown, MA) geerntet und durch Waschen mit destilliertem Wasser lysiert. Die an den Filter gebundene Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler (Modell 1600 TR; Packard Co., Meriden, CT) gemessen. Der nach dieser Methode bestimmte Einbau von Thymidin in Human-Fibroblasten korreliert mit dem Zellwachstum. Bei Untersuchungen der Hemmung von Tumorzellwachstum wurden Zellen mit dem Cytokin für 3 Tage in insgesamt 0,1 ml Endvolumen inkubiert und dann in bezug auf den Einbau von Thymidin kontrolliert.
Unter Bezugnahme auf Fig. 11 scheint Oncoinhibin das Wachstum von normalen Human-Vorhautfibroblasten zu stimulieren. Oncoinhibin hemmte zwar das Wachstum von. Tumorzellen, es verstärkte jedoch die Proliferation von normalen Human- Vorhautfibroblasten.
Unter Bezugnahme auf Fig. 12 cytolysiert Oncoinhibin ähnlich wie TNF und LT L-929-Zellen, die mit Actinomycin D behandelt sind. Die Antitumorwirksamkeit von Oncoinhibin gegen L-929- Zellen kann weder mit Anti-LT- noch Anti-TNF-Antikörpern neutralisiert werden (Tabelle IV). Das heißt, es wurden keine signifikanten Mengen von TNF oder LT durch ELISA-Assay in Oncoinhibin-Präparaten nachgewiesen (Tabelle V). Tabelle III zeigt, daß mehrere Tumorzelltypen (z. B. SK-BR-3, HeLa, A-431, OVCAR- 3, A375 und RPMI-7951), die gegenüber TNF/LT resistent sind, für Oncoinhibin außerordentlich empfindlich sind. Oncoinhibin kann auch von TNF/LT auf der Basis von Zellinien, die in bezug auf Resistenz gegenüber TNF/LT isoliert sind und als gegenüber Oncoinhibin empfindlich festgestellt wurden (NIH 3T3-LTD und BR-20 TNFR), unterschieden werden (Tabelle III). TABELLE IV Mangel an Neutralisierung der Oncoinhibin-Aktivität durch monoklonale Antikörper gegen Tumor-Nekrose-Faktor und Lymphotoxin*
*Oncoinhibin, TNF und LT wurden entweder mit Anti-TNF- oder Anti-LT-Antikörpern bei 37ºC für 1 h inkubiert und dann direkt auf restliche nichtneutralisierte TNF- oder LT-Aktivität an mit Actinomycin D behandelten L-929-Zellen wie vorher beschrieben (4) analysiert.

TABELLE V

Bestimmung verschiedener Cytokine in einem Rohpräparat von aus K-562-Zellen* stammendem Oncoinhibin

Cytokin Spiegel (pg/ml)

TNF-α 3 ±6
TNF-β (LT) 2 + 0
IL-1β 0
IL-6 155 ±7
IL-8 > 2000
*Serumfreies, mit K-562-Zellen aufbereitetes Medium wurde als Oncoinhibinquelle verwendet, und der Spiegel verschiedener Cytokine wurde mit Standard-ELISA-Assays (R&D System) bestimmt. ND bedeutet 'nicht bestimmt'.
TNF und LT sind Produkte von Monocyten bzw. Lymphocyten und hemmen das Wachstum von vielen verschiedenen Zellen. Ähnlich wie Oncoinhibin hemmen Lymphtoxin und TNF das Wachstum von MCF-7-Zellen, aber es sind hohe Konzentrationen von TNF und LT (10.000 E/ml) erforderlich.
Um noch weiter zu bestätigen, daß Oncoinhibin weder TNF noch LT ist, wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt, um das Gen für jedes der Cytokine zu suchen. Bei der Northern-Blot- Analyse wurden mit Phorbolester behandelte sowie unbehandelte K-562-Zellkulturen, die in einer Menge von 1 · 106 Zellen/ml in 75-cm-Kolben geimpft waren, für 24 h mit Proteinkinase-C- Aktivator inkubiert und dann durch Zentrifugieren geerntet. Die Gesamt-RNA wurde aus den Zellen mit der Guanidinium- Isothiocyanatphenol-Chloroform-Methode extrahiert, die von Chirgwin et al., Biochem. 18: 5294-5299 (1979), und Maniatis et al., Molecular Cloning 188-209 (1982), die hier summarisch eingeführt werden, beschrieben wird. Routinemäßig wurde RNA mit einem 260 nm/280 nm Extinktionsverhältnis von größer als 1,9 und einer Ausbeute von ungefähr 100 ug RNA je 20 · 106 Zellen erhalten.
Für die Elektrophorese wurden 20 ug RNA auf 0,8% Agarosegelen, die 2,2 M Formaldehyd enthielten, für ungefähr 3 h bei 75-100 V fraktioniert. Danach wurden die Gele mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser mit einer Temperatur von 68ºC für 1 h ausgesetzt, und dann wurde die RNA auf Hybond- Nylonmembranen überführt (Amersham Corp., Arlington Heights, IL.). Nach der Überführung (3 h) wurde der Filter zweimal mit SSC (SSC: 0,15 M Natriumchlorid, 15 mM Natriumacetat, 15 mM Natriumcitrat, pH-Wert 7,0) gespült und in einen dicht verschließbaren Mikrobeutel verbracht.
Die Vorhybridisierung wurde bei einer Temperatur von 65ºC für 1 h in einem Puffer durchgeführt, der 7% SDS, 500 raN Natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH 7,2 (Hybridisierungspuffer) enthielt. Dann wurden Filter mit TNF- oder LT-cDNA-Sonden (spezifische Aktivität 2 · 10&sup8; cpm/ug DNA) hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen mehrfach bei 65ºC in Hybridisierungspuffer gewaschen, der DNA von Lachssamen enthielt (200 ug/ml). Die Filter wurden für 1 bis 3 Tage mit Kodak-XAR- 5-Film bei -70ºC belichtet. Die Abläufe für sequentielle Zyklen der Vorhybridisierung, Hybridisierung, Waschgänge und Filterstrippen wurden durchgeführt. Die gleiche Beladung von Banden wurde durch Untersuchung von Gelen nach Anfärben mit Ethidiumbromid und außerdem durch erneute Hybridisierung gleicher Filter mit cDNA sowohl in bezug auf Actin als auch Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) demonstriert. Die Band- Dichtemessung erfolgte entweder durch Scannen des Filters nach radioaktiven Zählwerten mit dem Blot-Analysator Betascope 603 (Betagen Corp., Waltham, MA) oder durch autoradiographischen Scan der optischen Dichte unter Anwendung des Scanning Densitometer (Helena Laboratories Inc., Beaumont, TX). Wie Fig. 13 zeigt, wurde in K-562-Zellen keine Exprimierung von mRNA sowohl für LT als auch TNF beobachtet. Ferner bestätigen Experimente mit Gelfiltration und SDS-PAGE, daß das Molekulargewicht von Oncoinhibin von demjenigen von TNF und LT verschieden ist.
Unter Bezugnahme auf Fig. 19 wachsen Human-Brusttumorzellen sehr rasch in Kultur in dem Medium. Wenn der Kultur Oncoinhibin zugefügt wurde, wurde jedoch kein Wachstum dieser Zellen beobachtet. Um die Expositionsdauer zu bestimmen, die erforderlich ist, um das Wachstum dieser Zellen zu hemmen, wurden die Zellen für unterschiedliche Dauern Oncoinhibin ausgesetzt. Gemäß Fig. 20 sind die wachstumshemmenden Wirkungen von Oncoinhibin beendet, wenn das Cytokin aus dem Medium entfernt wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Anwesenheit des Oncoinhibins kontinuierlich erforderlich ist.
Gemäß Fig. 21 wurde die Morphologie der MCF-7-Zellen nach Behandlung mit Oncoinhibin untersucht und mit TNF verglichen. Die Ergebnisse zeigen einen Unterschied der Methode, nach der TNF und Oncoinhibin das Wachstum von Brusttumorzellen hemmen. TNF induziert ein Zusammentreiben der Zellen, was zu ihrer Ablösung von der Schale führt, wogegen Oncoinhibin eine Vergrößerung oder ein Anschwellen von Zellen induziert. Letzteres kann daraus resultieren, daß Oncoinhibin Auswirkungen auf die Permeabilität der Zellen hat. Oncoinhibin hemmt ferner die Koloniebildung von Human-Brusttumorzellen.
Oncoinhibin-Stabilitätsuntersuchungen: Oncoinhibin wurde mit organischem Lösungsmittel (Acetonitril oder Methanol oder Propanol), sauren Lösungsmitteln (HCl, Trichloressigsäure oder Essigsäure), alkalischen Lösungsmitteln (NaOH, Ammouniumydroxid) oder Detergenzien (SDS, Tween 10) für zwei Stunden bei Raumtemperatur behandelt, dann gegen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, über Nacht in einem kalten Raum dialysiert und auf biologische Aktivität analysiert (Tabellen VII und VIII).
Für Experimente hinsichtlich der Thermostabilität wurde Oncoinhibin verschiedenen Temperaturen während verschiedener Zeitdauern ausgesetzt, und die biologische Aktivität wurde direkt bestimmt. Es zeigte sich, daß die biologische Aktivität von Oncoinhibin bis zu 80ºC für 60 min stabil war, aber ein Aktivitätsverlust von ungefähr 50% wurde beobachtet, wenn es für 30 min bis zu 100ºC ausgesetzt war (Tabelle VI). TABELLE VI Thermostabilität von Oncoinhibin bei verschiedenen Temperaturen
In der Tabelle VII wurde Oncohibin mit Pronase E, Trypsin, Chymotrypsin und V8 Staph Protease behandelt und dann auf seine biologische Aktivität analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß die Oncoinhibin-Aktivität durch Pronase E vollständig aufgehoben werden kann, was zeigt, daß es ein Protein ist. Es wurde gefunden, daß seine Aktivität gegenüber der Trypsinbehandlung teilweise empfindlich war und gegenüber Chymotrypsin und V8 Protease vollständig resistent war. Auch Desoxyribonuclease hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von Oncoinhibin. TABELLE VII Wirkung von proteolytischen Enzymen auf die Aktivität von Oncoinhibin
Oncoinhibin wurde mit verschiedenen Enzymen bei 37ºC für 24 h in 20 mM Tris-Puffer mit pH 8,0 inkubiert, dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 10% Serum abgebrochen und die Analyse in bezug auf Oncoinhibin-Aktivität durchgeführt.
Stabilität von Oncoinhibin gegenüber Detergenzien: Eine Oncoinhibinprobe wurde mit verschiedenen Konzentrationen entweder von SDS, einem negativ geladenen Detergens, oder Tween 20, einem neutralen Detergens, für 2 h behandelt, dialysiert und dann auf biologische Aktivität analysiert. Rinderserumalbumin, das mit demselben Detergens behandelt worden war, wurde als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der Tabelle VIII gezeigt. Bei Behandlung des Proteins entweder mit SDS oder mit Tween 20 wurde kein Verlust der biologischen Aktivität beobachtet. Im Fall von SDS tritt anscheinend eine signifikante Steigerung der biologischen Aktivität von Oncoinhibin auf eine dosisabhängige Weise ein. Die Steigerung war im Fall von Tween 20 nicht signifikant. TABELLE VIII Auswirkung von Detergens, pH-Wert und Behandlung mit organischem Lösungsmittel auf die Stabilität von Oncoinhibin
Oncoinhibin-Proben wurden bei Raumtemperatur mit den verschiedenen Agenzien für 1 h in 20 mM Trispuffer, pH 8,0, behandelt, über Nacht dialysiert und dann auf biologische Restaktivität analysiert. S und P bezeichnen Überstand- und Pellet- Fraktionen.

Stabilität von Oncoinhibin gegenüber Reduktionsmitteln:

Oncoinhibin wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Dithiothreitol für 2 h behandelt, dann dialysiert und auf biologische Aktivität analysiert. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der Tabelle IX gezeigt. Es ist ersichtlich, daß die Aktivität von Oncoinhibin gegenüber der Behandlung mit DTT instabil ist. Ein Aktivitätsverlust von 50% mit 1 mM DTT und ein Verlust von 67% mit 100 mM DTT wurden beobachtet. TABELLE IX Stabilität von Oncoinhibin gegenüber verschiedenen Behandlungen
Oncoinhibin-Poben wurden mit verschiedenen Agenzien behandelt, dialysiert und dann auf biologische Aktivität analysiert.
Oncoinhibin kann mit Trichloressigsäure und Ammoniumsulfat eingeengt werden. Oncoinhibin wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen sowohl von TCA als auch NH&sub4;SO&sub4; behandelt, zentrifugiert, resuspendiert, dialysiert und dann auf biologische Aktivität analysiert. Die in der Tabelle IX angeführten Ergebnisse zeigen, daß die gesamte Aktivität von Oncoinhibin entweder mit 5% TCA oder mit 70% (SAS) Ammoniumsulfat ausgeschieden werden kann. Diese Ergebnisse weisen also ebenfalls auf die Protein-Beschaffenheit von Oncoinhibin hin.
Amphiregulin ist ein Glykoprotein, das aus mit Phorbolester behandelten MCF-7-Zellen isoliert wurde und das Wachstum von A431-Zellen hemmt. Amphiregulin hat ein scheinbares Molekulargewicht von 22,5 kDa. Sowohl Oncoinhibin als auch Amphiregulin hemmen das Wachstum von Tumorzellen. Oncoinhibin wird jedoch nicht von mit Phorbolester behandelten MCF-7-Zellen erzeugt. Zweitens zeigen zwar sowohl Oncoinhibin als auch Amphiregulin eine Antivermehrungs-Aktivität gegen A431-Zellen (Tabelle III), aber im Gegensatz zu Oncoinhibin ist Amphiregulin gegen Human-Melanom (A375), Human-Adenokarzinom der Lunge (A-549), Human-Dickdarmkarzinom (H3347), Human-Lymphoblast-T-Zellen (CEM), durch EBV transformierte Human-B-Zellen, epidermales Human-Speiseröhrenkarzinom (Hep 2), fetale Rinderherz- Endothelzellen (CRL-1395), Mäuse-BALB/3T3- und Nerzlungenzellen (CCL-64) unwirksam. Ähnlich wie Oncoinhibin stimuliert Amphiregulin die Vermehrung von Human-Fibroblasten. Abgesehen von Human-Fibroblasten stimuliert Amphiregulin auch das Wachstum bestimmter Tumorzellen, was Human-Hypophysentumorzellen (CRL 7386), Human-Ovarialkarzinomzellen (HTB 77), Nierenzellen vom afrikanischen Grünaffen (BSC-1) und Rattennierenzellen (NRK) einschließt. Das Molekulargewicht von Oncoinhibin ist jedoch ebenfalls deutlich von demjenigen von Amphiregulin verschieden, und die reife Form des Letzteren ist ein Protein mit einer Länge von 84 Aminosäuren.
Oncoinhibin ist gegenüber sauren und alkalischen Bedingungen in einem pH-Bereich von 2,0 bis 10,0 stabil (Tabelle VIII). Es ist von mehreren Cytokinen berichtet worden, die gegenüber pH 2 stabil sind, sie umfassen IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4, IL-8, CSF-1, GM-CSF, TGF-β, Oncostatin M und Amphiregulin. Von Oncostatin M, Amphiregulin, CSF-1 und IL-4 wurde ferner gefunden, daß sie gegenüber alkalischen Bedingungen (pH 12) stabil sind. Vor kurzem wurde der Lipolyseanregungsfaktor (LPF), ein Protein mit einem ungefähren Molekulargewicht von 6 kDa, aus der A375-Melanomzellinie isoliert, der gegenüber Wärme (96ºC für 10 min), Protease K (10 ug/ml), Trypsin, Proriase, RNase, DNase und Periodatoxidation stabilist. LPF kann mit Trichloressigsäure (10%) ohne jeglichen Verlust an biologischer Aktivität ausgefällt werden. Man hat gefunden, daß Oncoinhibin gegenüber Wärme bis zu 80ºC für 30 min stabil ist und daß bei 100ºC nur ein Teil der Aktivität verlorengeht (Tabelle VI). Eine Behandlung von Oncoinhibin mit Trypsin 10% (w/w) für 24 h bei 37ºC führte zu einem Teilverlust der biologischen Aktivität. Das ist ähnlich mit dem, was im Zusammenhang mit CSF-1, GM-CSF und LT beobachtet wurde. Es wurde ferner gefunden, daß die biologische Aktivität von Oncoinhibin gegenüber 0,5% SDS stabil war.
Oncoinhibin unterscheidet sich von Tumorkiller-Faktor (TKF), einem Cytokin, das aus Human-Makrophagen-Monocytenhybridom identifiziert wird, dadurch, daß TKF ein basisches Protein (pI 8-9,0) ist, ein scheinbares Molekulargewicht von 56 kDa nach Gelfiltration hat und aus Conconavalin-A-Sepharose mit 0,4 M α-Methylmannosid eluiert werden kann.
Oncostatin M ist ein Cytokin, das aus mit Phorbolester behandelten U-937-Zellen isoliert wird und das Wachstum der Human- Melanomzellinie A375 in einem Thymidin-Einbau-Assay hemmt. Nichtstimulierte U-937-Zellen exprimieren weder das Gen noch sondern sie diese Aktivität ab. Phytohämagglutinin-aktivierte Human-T-Lymphocyten aus peripherem Blut exprimieren das Gen ebenfalls und sondern dieses Cytokin ebenfalls ab. Oncostatin M ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 28 kDa gemäß SDS-PAGE und 18 kDa gemäß Gelfiltration. Es wirkt mit TGF-β, jedoch nicht mit Interferonen zusammen. Es ist gezeigt worden, daß Oncostatin M die Vermehrung von HTB 10- Neuroblastomzellen, A-549-Lungenkarzinomzellen sowie A375- und SKMEL-28-Melanomzellen hemmt; es hemmt jedoch nicht die Vermehrung von L-929-Zellen. Dagegen wird Oncoinhibin von K-562- Zellen (nicht von U-937-Zellen) sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von Phorbolester produziert und wirkt auf L- 939-Zellen. Ferner ist Oncostatin M im Gegensatz zu Oncoinhibin ein relativ schwacher Hemmer von A375-Zellen (Fig. 14).
Der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) ist Cytokin, das ein Homodimeres mit einem Molekulargewicht von 25 kDa gemäß SDS-PAGE ist, und hemmt das Wachstum von mehreren Zelltypen mit Endothel- und Mesenchym-Ursprung einschließlich der Human-Gefäßendothelzellen, T- und B-Lymphocyten. A-549-, MCF- 7-Zellen werden ebenfalls von TGF-0 auf autokrine Weise gehemmt. Anders als Oncoinhibin wird TGF-β jedoch von vielen verschiedenen Zellen einschließlich Thrombocyten, Knochengewebe und Lymphocyten erzeugt und erfordert eine Aktivierung durch Säure, bevor seine Aktivität untersucht werden kann. Ferner hat TGF-β ein Molekulargewicht von 12,5 kDa gemäß SDS- PAGE unter reduzierten Bedingungen.
Cytokin-ELISA-Assays: Eine handelsübliche (R&D Systems) quantitative Sandwich-Enzymimmunoassaytechnik wurde angewandt, um die Anwesenheit von bekannten Cytokinen (TNF, LT, IL-1, IL-6 und IL-8) in dem Oncoinhibinpräparat zu untersuchen. Es wurde das vom Hersteller gelieferte Standardprotokoll benutzt. Kurz gesagt wurde ein monoklonaler Antikörper, der für verschiedene Cytokine spezifisch ist, auf die Mikrotiterplatten aufgetragen, und man ließ ihn über Nacht erhärten, um die Antikörper zu immobilisieren. Dann wurden die Proben in die Vertiefungen pipettiert, und das Cytokin, falls vorhanden, wurde durch den immobilisierten Antikörper eingefangen. Nach Abwaschen von etwaigen ungebundenen Probenproteinen wurde den Vertiefungen ein enzymgekoppelter polyklonaler Antikörper, der für ein gegebenes Cytokin spezifisch war, hinzugefügt, und man ließ ihn das Cytokin binden, das während der ersten Inkubation gebunden wurde. Nach einem Waschvorgang zum Entfernen von etwaigem ungebundenem polyklonalem Antikörper-Enzymreagens wurde den Vertiefungen eine Substratlösung zugefügt, und Farbe wurde proportional zu der Menge an in dem Anfangsschritt gebundenem Cytokin entwickelt. Zusammen mit den untersuchten Proben wurde eine Serie von Vertiefungen unter Einsatz bekannter Konzentrationen der Cytokin-Standards präpariert. Eine Kurve, die die optische Dichte gegenüber der Konzentration von Cytokin in diesen Standard-Vertiefungen zeigte, wurde präpariert durch Vergleichen der optischen Dichte der Proben mit dieser Standard-Kurve. Die Konzentration des Cytokins in den unbekannten Proben wurde dann errechnet (Tabelle V).
Interleukin-1 ist ein Cytokin, das von aktivierten Monocyten und Fibroblasten erzeugt wird, ein Molekulargewicht von 17 kDa hat und das Wachstum von Tumorzellinien einschließlich Ovarialkarzinom-, A375-Melanom-, K-562- und bestimmten Brusttumor- Zellinien hemmt. Oncoinhibin unterscheidet sich jedoch von Interleukin-1 in bezug auf seine Quelle, sein Molekulargewicht und seine Tumorspezifität. Rohpräparate von Oncoinhibin wurden auf die Anwesenheit von IL-1 mittels ELISA untersucht. Die in der Tabelle V gezeigten Ergebnisse demonstrieren ein Nichtvorhandensein des IL-1-Proteins in unserem Oncoinhibin-Präparat.
Interleukin-6 ist ein Cytokin, das von vielen verschiedenen Zelltypen als Antwort auf sehr verschiedene Stimuli erzeugt wird und ein Molekulargewicht von 26 dKa gemäß SDS-PAGE hat.
Insbesondere wird IL-6 auch von normalen Human-Fibroblasten, U-937, Human-Melanomzellinien A375, RPMI-7951 usw. erzeugt. IL-6 hemmt das Wachstum von Knochenmarkleukämie- und Brustkrebs-Zellinien. Auf der Basis der Quelle, der Erzeugungsmethode und der Tumorzellen-Targetspezifität scheint IL-6 ein Cytokin zu sein, das von demjenigen von Oncoinhibin verschieden ist. Ferner sind MCF-7-Zellen, die routinemäßig als ein Target für Oncoinhibin eingesetzt werden, für die Auswirkungen von Interleukin-6 unempfindlich (Fig. 16). Ebenfalls im Gegensatz zu Oncoinhibin wurde gefunden, daß IL-6 das Wachstum von normalen Human-Fibroblasten hemmt (Fig. 15).
Interferon-T, ein Cytokin mit einem Molekulargewicht von 20-25 kDa gemäß SDS-PAGE, wird von T-Lymphocyten produziert, wenn sie mit verschiedenen Mitogenen aktiviert sind, und hemmt das Wachstum bestimmter Tumorzellinien. Dieses Cytokin ist gegenüber pH-Bedingungen im sauren Bereich hochempfindlich. Oncoinhibin unterscheidet sich von Interferon-T in bezug auf seine Quelle, die Erzeugungsmethode und die pH-Stabilität. Interferon-T unterscheidet sich außerdem von Oncoinhibin in bezug auf seine Wirkung auf normale Human-Fibroblasten. Oncoinhibin stimuliert die Vermehrung, wogegen Interferon-T die TNF- induzierte Fibroblastvermehrung hemmt, jedoch nicht die von Oncoinhibin induzierte hemmt (Fig. 18). Ferner verringern Antikörper gegen Interferon-T die Aktivität von Oncoinhibin nicht, sondern steigern sie (Fig. 17).
Somit gibt die vorliegende Erfindung ein neues Cytokin an, das eine breit gestreute Antitumor-Wirksamkeit zeigt. Das Cytokin, Oncoinhibin, wird von Human-Erythroblastzellen abgesondert und hat ein Molekulargewicht von ungefähr 28 kDa gemäß SDS-PAGE. Die Erzeugung von Oncoinhibin scheint in Anwesenheit von Phorbolester verstärkt zu sein. Oncoinhibin erscheint gegenüber einem großen Bereich von Substanzen stabil und ist in einem großen pH-Bereich und gegenüber einer hohen Temperatur stabil.
Aufgrund seiner breit gestreuten Tumor-Aktivität wird davon ausgegangen, daß Oncoinhibin bei der Behandlung einer großen Vielfalt von Tumorerkrankungen einschließlich Karzinomen und Lymphomen therapeutisch anwendbar ist. Oncoinhibin kann Menschen oder anderen Tieren als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung zugeführt werden, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält. Aufgrund seiner breit gestreuten Antitumor-Wirksamkeit ist Oncoinhibin bei der Vermeidung eines erneuten Auftretens von Tumorerkrankungen einsetzbar. Außerdem ist es wahrscheinlich, daß die Verabreichung von Oncoinhibin an Wirte mit Tumorzellen die Überlebensdauer des Wirts verlängert. Alternativ könnten Tumorzellen mit Oncoinhibin in vitro behandelt werden, z. B. durch Behandeln und Reinigen von Knochenmark, das Tumorzellen enthält. Diese Verfahren der Behandlung von Tumorzellen, wie sie hier beschrieben werden, sind auf dem Gebiet der Krebstherapie wohlbekannt, und somit kann jemand mit dem Normalwissen auf diesem Gebiet ohne übermäßiges Experimentieren die geeigneten Dosierungen und Verabreichungswege von Oncoinhibin bestimmen.
Oncoinhibin kann ferner als ein neuer Immunmodulator nützlich sein. Oncoinhibin aktiviert Lymphocyten, Monocyten und neutrophile Leukocyten zum Abtöten von Tumorzellen. Zusätzlich kann Oncoinhibin als ein Wachstumsfaktor therapeutisch nützlich sein. Oncoinhibin stimuliert das Wachstum von Normalzellen.
Zusammenfassend ist ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung und die hier beschriebenen Ausführungsbeispiele gut geeignet sind, um die Ziele auszuführen und die in der vorliegenden Anmeldung ausgeführte Aufgabe zu lösen. Bestimmte Änderungen können hinsichtlich des Verfahrens und der Vorrichtung vorgenommen werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Es ist ersichtlich, daß Änderungen möglich sind und daß weiterhin beabsichtigt ist, daß jedes Element oder jeder Schritt in jedem der anschließenden Ansprüche sich auf sämtliche äquivalenten Elemente oder Schritte bezieht, um im wesentlichen die gleichen Ergebnisse auf im wesentlichen die gleiche oder eine äquivalente Weise zu erzielen. Die Erfindung soll in jeder Form, in der ihre Prinzipien nutzbar gemacht werden können, umfassend abgedeckt sein. Die vorliegende Erfindung eignet sich somit gut zur Durchführung der Ziele und zum Erreichen der angegebenen sowie auch weiterer Aufgaben und Vorteile, die inhärent darin enthalten sind.

Claims

1. Stoffzusammensetzung, die aus einem Oncoinhibin-Protein besteht, das im wesentlichen frei von Verunreinigungen und im wesentlichen homogen gemäß der Untersuchung mittels SDS-Polyacrylamidcgel-Elektrophorese (SDS-page) ist, wobei das Oncoinhibin als ein von Human- Erythroblastoidzellen abgesondertes Protein mit einem Molekulargewicht von 28 kDa definiert ist, das antineoplastische Wirksamkeit zeigt, und wobei das Protein in einem pH-Bereich von 2 bis 8 und in einem Temperaturbereich von 4 bis 100ºC stabil ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Produktion des Proteins durch Phorbolester verstärkt wird.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Protein in Standardproben bei Oncoinhibin-Aktivität wirksam ist, und wobei die Proben eine Verringerung von Tumorzellwachstum messen und aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus dem Zählen von Zellen an einem Hämozytometer nach Anfärben mit Trypanblau, der Aufnahme von Kristallviolettfarbstoff und dem Einbau von tritiummarkiertem Thymidin besteht.

4. Verfahren zum Präparieren des Human-Oncoinhibins nach Anspruch 1, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

Inkubieren von Human-Erythroblastzellen;

Induzieren der Produktion von Onkoinhibin; und Entnahme von aufbereiteten Zellüberständen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, das ferner den folgenden Schritt aufweist: Anreicherung des Überstands.

6. Verfahren nach Anspruch 4, das ferner den folgenden Schritt aufweist: Steigerung der Produktion von Onkoinhibin mit Phorbolester.

7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Erythroblastzellen von der Zellzeile K562 sind.

8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zellen in RPMP1640- Medium inkubiert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Produktion von Oncoinhibin in einem serumfreien Medium induziert wird.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Zusammensetzung nach Anspruch 1 aufweist und ferner einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.

11. Verfahren zum Aufbereiten des Human-Oncoinhibins nach Anspruch 1, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

Ultrafiltrieren von Human-Onkoinhibin enthaltenden aufbereiteten Zellüberständen;

Dialysieren von ultrafiltrierten Überständen;

Durchführen der DEAE-Affigel-Blau-Chromatographie;

Durchführen der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese; und

Hochleistungs-Rückphasen-Flüssigkeitschromatographie.

12. Immunmodulator zum Aktivieren von Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen, um Tumorzellen zu zerstören, der das Human-Oncoinhibin nach Anspruch 1 aufweist.

13. Wachstumsfaktor zum Stimulieren des Wachstums von Normalzellen, der das Human-Oncoinhibin nach Anspruch 1 aufweist.

14. Wachstumsfaktor nach Anspruch 13, wobei die Normalzelle ein Fibroblast ist.