FI112081B - Menetelmä uuden antineoplastisen sytokiinin valmistamiseksi ja puhdistamiseksi - Google Patents

Description

x 112081

Menetelmä uuden antineoplastlsen sytokilnin valmistamiseksi ja puhdistamiseksi

Keksinnön tausta 5 Keksinnön ala Tämä keksintö liittyy uuteen sytokiiniin, jolla on laaja antineoplastinen aktiivisuus. Tarkemmin keksintö koskee menetelmää ihmisen erytroblastoidisolujen erittämän on-koinhibiiniproteiinin valmistamiseksi ja puhdistamiseksi.

10 Aiheeseen liittyvän alan kuvaus

Solujen kasvua näyttää säätelevän kasvua stimuloiden ja kasvua inhiboivien molekyylien välinen tasapaino.

Epätasapainoa näissä kasvua säätelevissä sytokiineissä on ehdotettu kasvainten yhdeksi kasvumekanismiksi.

15 On kuvattu muutamia sytokiinejä, jotka stimuloivat kasvain- ja normaalisolujen kasvua. Niihin kuuluvat esimerkiksi epidermaalinen kasvutekijä (EGF), fibroblastikasvutekijä (FGF), verihiutaleperäinen kasvutekijä (PDGF), insuliinin kaltaiset kasvutekijät (IGF), interleukiinit (IL) , 20 pesäkkeitä stimuloivat tekijät (CSF) ja transformoivat kasvutekijät (TGF-a ja TGF-β).

» · φ ,···# Jotkut muut sytokiinit sitä vastoin inhiboivat se- * · lektiivisesti tiettyjen kasvainsolujen kasvua. Niihin kuu- • · » ' , luvat esimerkiksi interferonit (IFN), lymfotoksiini (LT) , » * · ··*! 25 tuumorinekroositekijä (TNF) , onkostatiini M, amfireguliini, ♦ · · ···· interleukiini-1 (IL-1) , interleukiini-6 (IL-6) ja TGF-β.

• * » ·.· · Nämä kasvua stimuloivat ja kasvua inhiboivat syto kiinit voidaan erottaa toisistaan lähteensä, kasvainkohdes- * · · • pesifisyytensä, fysiokemiallisten ominaisuuksiensa ja pri-30 maarirakenteensa perusteella. Niinpä kasvua säätelevien sy- tokiinien identifiointi ja karakterisointi on ratkaisevan tärkeää solujen, kasvainsolut mukaan luettuina, kasvun ym-’·;·* märtämisessä.

• ‘ . Keksinnön yhteenveto 35 Tämän keksinnön yhdessä suoritusmuodossa tarjotaan menetelmä uuden sytokiinin valmistamiseksi. Ainetta kutsu- 2 112081 taan onkoinhibiiniksi, ja sitä erittävät ihmisen erytro-blastoidisolut, sen moolimassa on noin 28 kDa, se on stabiili suunnilleen pH-alueella 2 - 8 ja suunnilleen lämpötila-alueella 4 - 100 °C ja sillä on antineoplastinen aktii-5 visuus.

Menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Menetelmä käsittää ihmisen erytro-blastoidisolujen inkuboinnin, onkoinhibiinituotannon in-dusoinnin ja soluviljelmäsupernatanttien talteenoton.

10 Keksinnön toisena suoritusmuotona tarjotaan käyt töön menetelmä ihmisen mainitun onkoinhibiinin puhdistamiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 7 esitetään. Tämä menetelmä käsittää vaiheet, jossa ultrasuodatetaan ihmisen onkoinhibiiniä sisältävät 15 soluviljelmäsupernatantit. Sitten tehdään ultrasuodatettu-jen supernatanttien dialysointi. Sitten toteutetaan DEAE Affigel Blue -kromatografia, natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja käänteisfaasisuurte-honestekromatografia ihmisen onkoinhibiinin puhdistamisek-20 si.

Keksinnön yhtenä suoritusmuotona valmistetaan uusi • · · immuunimodulaattori lymfosyyttien, monosyyttien ja neutro- » « • · fiilien aktivoimiseksi tappamaan kasvainsoluj a. Uusi im- *·' muunimodulaattori käsittää ihmisen onkoinhibiiniä. Voidaan ···: 25 myös valmistaa uusi kasvutekijä normaalisolujen kasvun sti- ....·’ rnuloimiseksi. Tämä kasvutekijä käsittää ihmisen onkoinhi- • * · V : biiniä.

Lisäksi tässä kuvataan farmaseuttisia onkoinhi-biinikoostumuksia ja menetelmiä neoplastisen solun käsitte-30 lemiseksi antamalla vaikuttava annos onkoinhibiiniä.

Piirustusten lyhyt kuvaus *,,/ Keksinnön edellä mainittujen samoin kuin muiden il- ’·;· mi käyvien piirteiden, etujen ja tavoitteiden saavuttami- seksi ja ymmärtämiseksi yksityiskohtaisesti voidaan yksi-35 tyiskohtaisempia kuvauksia keksinnöstä, josta on edellä esitetty lyhyt yhteenveto, saada tutustumalla sen tiettyi- 3 112081 hin suoritusmuotoihin, joita valaistaan liitteenä olevissa piirustuksissa. On kuitenkin huomattava, että liitteenä olevat piirustukset valaisevat keksinnön edullisia suoritusmuotoja eikä niitä tule siten pitää keksinnön suoja-alaa 5 rajoittavina. Keksintö koostuu yhtä tehokkaista vastaavista suoritusmuodoista.

Kuvio 1 valaisee sitä, että K-562-soluviljelmäsu-pernatantit inhiboivat MCF-7-solujen kasvua.

Kuvio 2 esittää tavanomaista biologista onkoinhi- 10 biinimääritystä.

Kuvio 3 esittää K-562-solujen onkoinhibiinituotan-toa seerumin läsnä ja poissa ollessa.

Kuvio 4 esittää forboliesterin vaikutuksia onkoin-hibiinin induktioon.

15 Kuvio 5 esittää ultrasuodatuksen vaikutuksia onko- inhibiiniaktiivisuuteen.

Kuvio 6 esittää onkoinhibiinin karakterisointia geelipermeaatiokromatografiällä.

Kuvio 7 esittää onkoinhibiiniaktiivisuuden eluoitu- 20 mistä SDS-polyakryyligeelielektroforeesissa.

Kuvio 8 esittää onkoinhibiinin SDS-PAGE-analyysiä.

Kuvio 9 esittää onkoinhibiiniaktiivisuuden sitomis- * · eluutiota DEAE Affigel Blue -kolonnista (ylempi kuva) ja *·* * Q-Sepharose-kolonnista (alempi kuva) .

25 Kuvio 10 esittää onkoinhibiinin ja TNF:n annoksesta riippuvia antiproliferatiivisia vaikutuksia.

• t : Kuvio 11 onkoinhibiinin annoksesta riippuvia proli- feratiivisia vaikutuksia ihmisen normaaleihin esinahkafib-*' roblasteihin.

30 Kuvio 12 esittää onkoinhibiinin vaikutusta aktino- mysiini D:llä käsiteltyihin hiiren L-929-soluihin.

“ Kuvio 12 esittää käsittelemättömien ja forbolieste- *.* reillä käsiteltyjen K-562-solujen Northern-täpläanalyysiä TNF:n ja LT:n suhteen.

I < : 4 112081

Kuviossa 14 verrataan onkoinhibiinin (kuva A) ja onkostatiini M:n (kuva B) kasvua inhiboivia vaikutuksia ihmisen melanooma A375 -soluihin.

Kuvio 15 esittää onkostatiini M:n ja IL-6:n kasvua 5 inhiboivia vaikutuksia normaaleihin fibroblasteihin.

Kuvio 16 esittää IL-6:n vaikutusta ihmisen rinta-syöpäsoluihin (MCF-7).

Kuvio 17 esittää interferoni-T: n vastaisten vasta-aineiden vaikutuksia onkoinhibiiniaktiivisuuteen ihmisen 10 rintasyöpäsolujen (MCF-7) suhteen.

Kuvio 18 osoittaa, että interferoni-T:11a on inhiboivia vaikutuksia TNF:ään (ylempi kuva), mutta onkoinhi-biinillä ei ole tällaisia vaikutuksia ihmisen esinahkafib-roblasteihin (alempi kuva).

15 Kuvio 19 esittää ihmisen rintasyöpäsolujen MCF-7 kasvunopeutta onkoinhibiinin poissa ja läsnä ollessa.

Kuvio 20 esittää MCF-7-solujen onkoinhibiinialtis-tusajan vaikutusta.

Kuviossa 21 verrataan onkoinhibiinin ja TNF:n vai-20 kutusta ihmisen rintasyöpäsolujen MFC-7 muotoon.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Eri solulinjoja, joihin kuuluivat hiiren sidekudos-solulinja L929 (CCL 1), K-562 (CCL-243), U-937 (CRL-1543), f · , >, HL-60 (CCL-240), Raji (CCL-86), Jurkat (CRL-8163), BT 20 ’* 25 (HTB-1 9), MFC-7 (HTB-22), SK-BR-3 (HTB-30), ZR-75-1 (CRL- " ; 1500), RPMI 7951 (HTB-66), A375 (CRL-1619), A-431 (CRL- | 1555), ME 1 80 (HTB 83), OVCAR-3 (HTB-161), He La (CCL- 2), Hep-2 (HB-8065) ja NIH 3T3 (CRL-1618), saatiin American Type Culture Collectionista (Rockville, MD). TNF-re-' 30 sistentit NIH 3T3 -solut eristettiin tavalla, jota kuvaa vat K. Totpal, R. LaPushin, H. N. Ananthaswamy ja B. B. Aggarwal [Lymphokine and Cytokine Res. 10 (1991) 359 -367]. Solut testattiin mykoplasmakontaminaation suhteen käyttämällä DNA:han perustuvaa määritysvälineistöä, joka '· 35 ostettiin Gen-Probelta (San Diego, CA).

5 ' * 1

Kaikki soluviljelmät pidettiin jatkuvasti eksponentiaalisesti kasvavina viikottaisin siirrostuksin. Joistakin soluista tehtiin alaviljelmät kahdesti viikossa. Soluja kasvatettiin tavallisesti RPMI 1640 -alustassa, jota oli 5 täydennetty glutamiinilla (2 mmol/1), penisilliinillä (100 yksikköä/ml), streptomysiinillä (100 μg/ml) ja naudan si-kiöseerumilla (10 %) , kosteutetussa inkubaattorissa 5 % CO2:a sisältävässä ilmassa.

Ihmisen erytroblastoidisolulinjan K-562 viljeliö mäsupernatanteissa esiintyy aktiivisuutta, joka inhiboi ihmisen rintasyöpäsolulinjan MCF-7 kasvua. Koska tällä aktiivisuudella on kyky inhiboida kasvainsolujen muttei normaa-lisolujen kasvua, sitä kutsutaan "onkoinhibiiniksi".

Onkoinhibiinin tuottamiseksi ja indusoimiseksi ih-15 misen erytroblastoidisolulinjaa K-562 viljeltiin 10 % naudan sikiöseerumia sisältävässä RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty glutamiinilla (2 mmol/1), penisilliinillä (100 yksikköä/ml) ja streptomysiinillä (100 μg/ml). Solut otettiin talteen sentrifugoimalla, kun oli saavutettu tihe-20 ys 0,8.10s solua/ml, solut pestiin kerran seerumittomalla .. alustalla ja siirrettiin seerumittomiin olosuhteisiin glu- • t t tamiinia, pensilliiniä ja streptomysiiniä sisältävään RPMI- • · 1640 alustaan. Onkoinhibiinin tuottamiseksi näitä soluja *·* ’ (1.10s/ml) inkuboitiin 48 tuntia T175-pullossa (Falcon) sta- *·.: 25 tionaarivil j elmäolosuhteissa seerumittomassa RPMI 1640 ,-alustassa ja käsiteltiin sitten forboliesterillä * ·’ (100 ng/ml) 48 tuntia lämpötilassa 37 °C. Sen jälkeen solu- viljelmäsupernatantit otettiin talteen sentrifugoimalla, • ; suodatettiin 0,22 μπΐ:η suodattimen (Falcon) läpi ja säily- 30 tettiin lämpötilassa 4 °C jatkokarakterisointiin asti. Onkoinhibiinin konsentroimiseksi K-562-solulinjaviljelmä-alustat ultrasuodatettiin PM-10-kalvolla (Amicon Corp.) ja - ' dialysoitiin sitten Tris-liuosta (20 mmol/1, pH 8,0) vas taan.

" . 35 Viitaten kuvioon 1, onkoinhibiinin inhiboivaa ak tiivisuutta kasvainsolujen kasvun suhteen tutkittiin koi- 6 11208: mella eri menetelmällä. Näihin menetelmiin kuuluivat (1) solujen laskenta hemosytometrillä trypaanisinivärjäyksen jälkeen; (2) kristalliviolettivärin vastaanottoon perustuva menetelmä; (3) tritioidun tymidiinin sisällytykseen perus-5 tuva menetelmä. Onkoinhibiini inhiboi selvästi MCF-7-solu-jen kasvua kaikkien kolmen menetelmän mukaan annoksesta riippuvalla tavalla. Kätevyyden ja herkkyyden vuoksi on-koinhibiinin biologisen määrityksen kehittämisessä käytettiin kohteena MCF-7-solulinjaa. Onkobiinin aikaansaaman 10 tritioidun tymidiinin sisällytyksen inhibition havaittiin olevan hyvin herkkä menetelmä tämän sytokiinin detektoimi-seksi.

Biologinen onkoinhibiinimääritys koostuu 5.103 solun siirrostamisesta maljoihin, joissa on 96 tasapohjaista sy-15 vennystä, 0,1 ml:aan 10 % FCS:a sisältävään RPMI 1640 -alustaan ja inkuboinnista yön yli lämpötilassa 37 °C C02-inkubaattorissa. Sitten alusta poistetaan, lisätään tutkittavasta näytteestä suhteessa 1:2 tehty laimennussarja lopullisen kokonaistilavuuden ollessa 0,1 ml ja jatketaan in-20 kubointia 24 tuntia lämpötilassa 37 °C. Tritioitua tyrni -diiniä (0,5 μ<3ΐ/0,05 ml syvennystä kohden) lisätään viimeisten 6 tunnin ajaksi. 24 tunnin inkubointijakson lopussa ’1··' alusta kaadetaan pois ja solut irrotetaan käsittelemällä V ‘ 30 min lämpötilassa 37 °C 0,1 ml :11a liuosta, joka sisältää 25 trypsiiniä (0,5 %) ja EDTAa (5,3 mmol/1) . Solut otetaan talteen käyttämällä PHD Cambridge -solukerääjää ja soluihin : : sisällytetyksi tullut radioaktiivisuus määritetään beeta- laskurilla. Tulokset ilmoitettiin elävien solujen suhteel-lisena osuutena (%) , joka on määritelmän mukaan solujen on-30 koinhibiinin läsnä ollessa vastaanottama radioaktiivisuus (hajoamista/min) jaettuna pelkän alustan läsnä ollessa si-> " säilytetyksi tulleella radioaktiivisuudella (hajoamis- ...· ta/min) ja kerrottuna luvulla 100. Onkoinhibiinimäärä, joka [' t tarvitaan elinkykyisyyden 50-%:iseen inhibointiin, määri- .·1 , 35 teltiin yhdeksi sytokiiniyksiköksi. Kuten kuviosta 1 näh dään, onkoinhibiini inhiboi annoksesta riippuvalla tavalla 112081 7 kasvainsolujen kasvua kaikilla kolmella menetelmällä määritettynä .

Viitaten kuvioon 2 voitiin havaita MCF-7:n selvä annoksesta riippuva reagointi onkoinhibiiniin 24 tunnin ku-5 luessa. Tymidiinin sisällytyksen 50-%:iseen inhibitioon tarvittavan näytteen laimennussuhteen käänteisluku määriteltiin yhdeksi onkoinhibiiniyksiköksi.

Viitaten kuvioon 3, tutkittiin onkoinhibiinin tuotantoa seerumittomissa olosuhteissa. Seerumittomia olosuh-10 teitä käytettiin, koska proteiineja on vaikea puhdistaa seerumia sisältävistä näytteistä. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että K-562-solut erittävät onkoinhibiiniä jopa seerumin poissa ollessa.

Olemme tutkineet, voivatko eri aineet indusoida on-15 koinhibiinituotannon. Tutkittiin kalsiumionoforia, kon-kanavaliini A:ta, fytohemagglutiniinia ja forboliesteriä. Kuvio 4 osoittaa, että forboliesteri voi lisätä onkoinhibiinin tuotantoa. Niinpä forboliesteriä voidaan käyttää K-562-solujen onkoinhibiinituotannon optimointiin. Havait-20 tiin onkoinhibiinituotannon kasvu noin nelinkertaiseksi, kun solut saatettiin forboliesterin (100 ng/ml) vaikutuksen alaisiksi. Optimaalinen onkoinhibiinituotannon indusointi • · havaittiin, kun soluja inkuboitiin yhdessä forboliesterin * kanssa 48 tuntia (taulukko I) solutiheyden ollessa 1.106 so- 25 lua/ml alustaa (taulukko II) .

• « 1 · • » · » · • · 8 1 1208 :

Taulukko I

Forboliesterin aikaansaaman ihmisen K-562-solujen onkoinhibiinituotannon induktion eteneminen ajan funktiona 5 Aika (h) Indusoimattomat Indusoidut

Elävien solujen suhteellinen osuus (%) 0 94 6 100 60 24 84 33 10 48 67 16 72 41 40 K-562-soluja (l*106/ml) viljeltiin seerumittomassa alustassa (RPMI-1640) joko forboliesterin (100 ng/ml) läsnä tai poissa ollessa lämpötilassa 37 °C C02-inkubaattoris-15 sa eripituisia aikoja ja otettiin viljelmäalusta sitten talteen sentrifugoimalla. Näytteet testattiin MCF-7-so-luilla suhteessa 1:2 tehtynä laimennussarjana materiaalien ja menetelmien kuvauksen yhteydessä esitetyllä tavalla.

Taulukko II

20 Onkoinhibiinituotannon optimointi forboliesterin läsnä ja poissa ollessa solutiheyden vaihdellessa*

Solujen lukumäärä Indusoimattomat Indusoidut ;' *· (*106/ml) Elävien solujen suhteellinen osuus (%) .v. 0,01 76 83 25 0,1 89 56 0,5 65 41 : : 1,0 37 26 1,5 50 28 *K-562-soluja inkuboitiin solutiheyden ollessa ilmoitettu . ,’ 30 seerumittomassa alustassa (RPMI-1640) 72 tuntia lämpöti- , lassa 37 °C C02-inkubaattorissa. Viljelmän alusta otettiin talteen sentrifugoimalla ja testattiin MCF-7-soluilla suhteessa 1:2 tehtynä laimennussarjana materiaalien ja menetelmien kuvauksen yhteydessä esitetyllä tavalla.

9 11208';

Viitaten kuvioon 5, onkoinhibiinin puhdistamiseksi ja karakterisoimiseksi solujen kasvualusta konsentroitiin ultrasuodatuksella käyttämällä kalvoa (PM-10), jonka moo-limassaraja oli 10 000. Aktiivisuus oli alempi fraktiossa, 5 joka ei pidättynyt suodattimelle (läpivirtaus- eli FT-fraktiossa), kun taas pidättyneen fraktion eli konsentraatin (C) aktiivisuus oli vastaavasti korkeampi kuin standardipuskurin (lähtömateriaali, SM). Tulokset osoittavat, että onkoinhibiiniaktiivisuus pidättyy ja konsentroi-10 tuu. Nämä tulokset osoittavat myös, että onkoinhibiinin moolimassa oli suurempi kuin 10 000.

Kuvion 6 kuvien A ja B mukaisessa proteiinien gee-lipermeaatiopikanestekromatografiakokeessa laitettiin on-koinhibiininäyte Superose-6-kolonnille (Pharmacia), joka 15 oli tasapainotettu ennalta fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, joka sisälsi 0,1 % naudan seeru-mialbumiinia ja 0,01 % natriumatsidia. Kolonni eluoitiin huoneenlämpötilassa virtausnopeudella 0,5 ml/min ja kunkin fraktion koko oli 0,5 ml. Kolonni kalibroitiin moolimassa-20 standardeilla (Schwarz/Mann, Cambridge, MA). Viimeksi mainittuihin kuuluivat apoferritiini (480 kD), alfa-amylaasi (20 kD), gammaglobuliini (160 kD), naudan seerumialbumiini , (67 kD), ovalbumiini (45 kD), kymotrypsinogeeni (24 kD) ja * * sytokromi C (12,4 kD).

’ . 25 Kuviosta 6 käy ilmi, että onkoinhibiinin moolimassa “ ! on noin 25 kD. Onkoinhibiinin moolimassa tutkittiin pro- ; ; teiinien geelipermeaatiopikanestekromatografiällä Su- • ‘ perose-6-kolonnilla denaturoimattomissa olosuhteissa. Fos faattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, pH 30 7,4, tehdyn geelisuodatuksen tulokset osoittavat kahden .: suuren aktiivisuuspiikin läsnäolon, joista toinen osuu yhteen eksluusiotilavuuden kanssa ja toinen vastaa suunnilleen moolimassaa 25 kD (kuvio 6, kuva B). Kuvioiden 7 ja 8 mukaisissa natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliami-• 35 digeelielektroforeesikokeissa (SDS-PAGE) ajo tehtiin 112081 10 15-%:isessa polyakryyliamidigeelissä olennaisesti U. K. Laemmlin [Nature 227 (1970) 680 - 685, mainitaan tässä viitteenä] mukaisesti ja proteiinit visualisoitiin hopea-värjäyksellä. Preparatiivisen geelielektroforeesin toteut-5 tamiseksi ja aktiivisuuden eluoimiseksi osa geelistä vii-paloitiin ennen kiinnitystä ja värjäystä partaterällä yli 40 eri viipaleeksi, eluoitiin koeputkessa ammoniumvetykar-bonaattiliuoksella (50 mmol/1) antamalla diffusoitua yön yli, dialysoitiin fraktiot Tris-liuosta (20 mmol/1, pH 10 8,0) vastaan ja määritettiin niistä biologinen aktiivi suus.

Viitaten kuvioon 7, tehtiin SDS-PAGE-analyysi on-koinhibiinin moolimassan varmistamiseksi edelleen. Geelit viipaloitiin elektroforeesin jälkeen, eluoitiin ammonium-15 vetykarbonaattiliuoksessa (50 mmol/1) yön yli ja määritettiin onkoinhibiiniaktiivisuus. Yli 50 % käytetystä onkoin-hibiiniaktiivisuudesta saatiin talteen suunnilleen moolimassa-alueella 30 kD. Alle 10 % aktiivisuudesta löytyi väririntaman lähellä olevalta alueelta.

20 Viitaten kuvioon 8, biologisesti aktiivisen frak tion käsittely uudelleen SDS-PAGE:lla ja geelien hopeavär-; -it jäys antoi tulokseksi yhden suuren vyöhykkeen suunnilleen moolimassan 28 kD kohdalla.

* I

Viitaten kuvion 9 kuviin A ja B, tutkittiin onkoin- • * ·

25 hibiinin sitoutumista anioninvaihtohartseihin ia eluoitu-» » · J

* mistä niistä. Yhteen pylvääseen (1 x 5 cm) pakattiin v I · ; ; Q-Sepharose-anionivaihtohartsia ja tasapainotettiin se *·’ ’ Tris-liuoksella (20 mmol/1, pH 8,0, tasapainotuspuskuri).

Tasapainotuspuskuria vastaan dialysoitu onkoinhibiininäyte ; .· 30 syötettiin kolonnille virtausnopeudella 0,5 ml/min. Kolon- i i , ni huuhdottiin tasapainotuspuskurilla ja tehtiin sitten , ·. resolvointi portaittain kasvavilla NaCl-gradienteilla ... (0-1 mol/1). Eri fraktioista analysoitiin proteiinipi- toisuus ja biologinen aktiivisuus.

* » » i 112081 11 DEAE Affigel Blue -kromatografia: Toiseen kolonniin (1x5 cm) pakattiin DEAE Affigel Blue -hartsia ja tehtiin sitten tasapainotus Tris-liuoksella (20 mmol/1, pH 8,0, tasapainotuspuskuri). Tasapainotuspuskuria vastaan dialy-5 soitu onkoinhibiininäyte syötettiin kolonnille virtausnopeudella 0,5 ml/min. Kolonni huuhdottiin tasapainotuspus-kurilla ja tehtiin sitten resolvointi portaittain kasvavilla NaCl-gradienteilla (0-1 mol/1). Eri fraktioista analysoitiin proteiinipitoisuus ja biologinen aktiivisuus. 10 Kuvion 9 kuvat A ja B osoittavat, että onkoinhibii- ni sitoutuu anioninvaihtohartseihin ja on eluoitavissa niistä. Onkoinhibiiniaktiivisuus sitoutui sekä Q-Sepharo-se että DEAE Affigel Blue -hartseihin Tris-puskurissa (20 mmol/1, pH 8,0). Sitoutunut onkoinhibiini oli eluoita-15 vissa DEAE Affigel Bluesta liuoksella, joka sisälsi 0,2 mol/1 NaCl:a Tris-puskurissa (20 mmol/1), ja Q-Sepha-rosesta NaCl-pitoisuudella 0,5 mol/1.

Onkoinhibiini inhiboi monien erilaisten kasvainso-lujen kasvua (taulukko III). Onkoinhibiinin antiprolifera-20 tiivistä aktiivisuutta tutkittiin tritioidun tymidiinin sisällytyksen kautta.

• * • * · • t · I * · * ‘ · · * < * » ' * * 1 * » « f t t t I » I 1 · t * I > 12 112081

Taulukko 111

Erot kasvainsoluspesifisyydessä TNF:n ja onkoinhibiinin välillä

Solulinjat Elävien solujen suh- 5 teellinen osuus (%) TNF Onkoinhibiini

Erytroblastoidisolulinja (K562) 94 2

Histiosyyttinen lymfooma (U-937) 54 1

Histiosyyttinen lymfooma (U-937-CF-1) 13 0 10 Promyelosyyttinen lymfooma (HL-60) 100 1

Burkittin lymfooma (Raji) 76 0 T-solylymfooma (Jurket) 74 36

Myelogeeninen leukemia (KG-1) 43 8

Myelogeeninen leukemia (KG-la) 60 13 15 Myelogeeninen leukemia (ML-la) 59 0,1

Myelogeeninen leukemia (ML-lb) 35 0,1

Monosyyttinen leukemia (THP-1) 81 1

Rintakarsinooma (BT20) 24 2

Rintakarsinooma (BT20TNFR) 60 3 20 Rintakarsinooma (MCF7) 10

Rintakarsinooma (SK-BR3) 52 0

Rintakarsinooma (ZR-75-1) 6 1 *·· Melanooma (RPMI 7951) 73 0

Melanooma (A375) 76 0 : i : 25 Epidermoidikarsinooma (A-431) 82 0 -·· Kohdunkaulakarsinooma (ME-1 80) 20 0

Munasarjakarsinooma (OVCAR-3) 27 1

Kohdunkaulakarsinooma (HeLa) 55 14

Hepatooma (HepG-2) 83 20 30 Retinoblastooma (Weri-Rb-1) 60 33 ; Retinoblastooma (Y-79) 92 46 ·’ Glioblastooma (LG) 84 2,3

Hiiren fibroblastit (NIH 3T3) 11 35 ; Hiiren fibroblastit (LTR1 000) 85 27 35 Hiiren fibroblastit (L929) 0 1

Ihmisen normaalit esinahkafibroblastit 311 189 * 13 1 12081

Kasvainsoluja (5000/syvennys) inkuboitiin yhdessä TNF:n (0,2 pg/ml) tai onkoinhibiinin (indusoitu forboliesterillä ja konsentroitu) kanssa 72 tuntia lämpötilassa 37 °C ja määritettiin sitten elävien solujen suhteellinen osuus (%) 5 tymidiinin sisällytyksen kautta edellä kuvatulla tavalla.

Viitaten kuvion 10 kuviin A - D, tutkittiin onkoinhibiinin annos-vastevaikutuksia joihinkin taulukossa VII luetelluista solulinjöistä ja verrattiin niitä TNF:ään. Taulukossa VII ja kuviossa 10 esitettyjen tulosten perus-10 teella on selvää, että onkoinhibiini pystyy MCF-7:n ohella inhiboimaan muutamien erilaisten leukemia-, melanooma-, karsinooma- ja hepatoomatyyppien kasvua. Myös hiiren solujen kasvu estyi. Niinpä näyttää siltä, että onkoinhibiini ei ole lajispesifinen toisin kuin interferonit.

15 Viitaten kuvioihin 11 ja 12 solut siirrostettiin kasvumäärityksiä varten yöksi 1 ml:aan alustaa (10 % FBS:a sisältävä RPMI-1640) 96-syvennyksisiin Falcon-maljoihin. Sen jälkeen alusta poistettiin ja lisättiin ihmisen onkoinhibiini -laimennussarja tilavuuden ollessa 0,1 ml. Kun 20 oli inkuboitu 72 tuntia lämpötilassa 37 °C, alusta poistettiin ja elävät solut tutkittiin kristalliviolettivär-jäyksellä noudattamalla B. B. Aggarwalin kuvaamaa menettelyä [Human lymphotoxin, Meth. of Enzymol. 116 (1985) t · * * ’ ” 441 - 448, mainitaan tässä viitteenä]. Värinvastaanottome- 25 netelmä solujen elinkyky isyyden tutkimiseksi korreloi so-·’ lulukumäärän kanssa, joka on määritetty tekemällä irrotus *;· trypsiiniliuoksella ja mikroskooppilaskenta hemosytomet- ··· rillä. Elävien solujen suhteellinen prosentuaalinen osuus . laskettiin jakamalla tutkittavan näytteen läsnä ollessa 30 mitattu optinen tiheys tutkittavan näytteen poissa ollessa ·_ (alusta) mitatulla optisella tiheydellä ja kertomalla lu- ! vulla 100. LT:n ja TNF:n kohdalla sytotoksisuusmääritykset toteutettiin samalla tavalla kuin kasvunestomääritykset, paitsi että käsiteltiin 20·103 L-929-solua aktinomysiini 35 D:llä (1 pg/ml) ja sytokiinillä 24 tuntia.

14 1 1208';

Solujen kasvun stimulointimääritykset: Solujen kasvun stimulointia koskevat määritykset tehtiin noudattamalla olennaisilta osiltaan Vilcekin et ai. kuvaamia menettelyjä [J. Exp. Med. 163 (1986) 632 - 643, mainitaan tässä 5 viitteenä]. Lyhyesti esitettynä solujen kasvun stimuloin-timäärityksiin käytettiin yhteenkasvaneita ihmisen diploi-disia esinahkafibroblasteja siirrostustasolla 12 - 16 (vastaa suunnilleen populaation kaksinkertaistumistasoja 24 - 32). Ihmisen onkoinhibiinin vaikutuksen määrittämi-10 seksi solut (8 · 103/syvennys) siirrostettiin 0,1 ml:aan alustaa (RPMI-1640 + 10 % FBS:a) 96-syvennyksisiin Falcon-maljoihin. Kun oli inkuboitu yön yli C02-inkubaattorissa lämpötilassa 37 °C, alusta poistettiin ja lisättiin syto-kiinilaimennussarja tilavuuden ollessa 0,2 ml. Kun oli 15 inkuboitu 5 vuorokautta, alustat kaadettiin pois ja solut värjättiin kristallivioletilla. Kaikki määritykset tehtiin kolmena rinnakkaismäärityksenä. Elossa olevien solujen suhteellinen prosentuaalinen osuus laskettiin kasvunesto-määritysten yhteydessä esitetyllä tavalla.

20 [3H]TDR:n sisällytysmäärityksissä ihmisen fibroblas- teja viljeltiin ja käsiteltiin sytokiinillä 5 vuorokautta. Kuhunkin maljaan lisättiin viimeisten 24 tunnin ajaksi tritioitua tymidiiniä (6,7 Ci/mmol; New England Nuclear, • » : ’* Boston, MA; 0,5 pCi/syvennys). Sen jälkeen kasvualusta ·...· 25 poistettiin, syvennykset pestiin kahdesti fosfaattipusku- ' roidulla fysiologisella suolaliuoksella ja solut irrotet- I* tiin lisäämällä 0,5 % trypsiiniä ja 5,3 mmol/1 EDTAa si- j* sältävää liuosta. Solususpensio otettiin sitten talteen PHD-solukerääjällä (Cambridge Technology Inc., Watertown, 30 MA) ja hajotettiin solut pesemällä tislatulla vedellä.

;· ·_ Suodattimeen sitoutunut radioaktiivisuus mitattiin neste- tuikelaskurissa (Model 1600 TR, Packard Co., Meriden, CT). Tällä menetelmällä mitattu tymidiinin sisällytys ihmisen fibroblasteihin korreloi hyvin solujen kasvun kanssa. Kas-: 35 vainsolujen kasvuninhibointitutkimuksissa soluja inkuboi- 15 1 12081 tiin yhdessä sytokiinin kanssa 3 vuorokautta lopullisen kokonaistilavuuden ollessa 0,1 ml ja tutkittiin sitten tymidiinin sisällytys.

Viitaten kuvioon 11, onkoinhibiini näyttää stimu-5 loivan normaalien esinahkatibroblastien kasvua.

Viitaten kuvioon 12, onkoinhibiini sytolysoi TNF:n ja LT:n tavoin aktinomysiini D:llä käsiteltyjä L-929-solu-ja. Onkoinhibiinin kasvaintenvastaista aktiivisuutta L-929-solujen suhteen ei voi kumota Anti-LT- eikä anti-10 TNF-vasta-aineilla (taulukko VI). Tämä tarkoitaa, ettei merkittäviä TNF- eikä LT-määriä detektoitu ELISA-määrityk-sellä onkoinhibiinivalmisteissa (taulukko V). Taulukko III osoittaa, että muutamat kasvainsolutyypit (esimerkiksi SK-BR-3, HeLa, A-431, OVCAR-3, A375 ja RPMI-7951), jotka ovat 15 resistenttejä TNF:lle/LT:lie, ovat erittäin herkkiä onko- inhibiinille. Onkoinhibiini voidaan myös erottaa TNF:stä/LT:stä sen perusteella, että TNF/LT-resistenssin perusteella eristettyjen solulinjojen (NIH 3T3-LTR ja BT-20 TNFR) havaittiin olevan herkkiä onkoinhibiinille 20 (taulukko III).

Taulukko IV

Onkoinhibiiniaktiivisuuden kumoutumattomuus tuumori-nekroosi teki jän ja lymfotoksiinin vastaisten t » monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksesta* 25 Näyte Vasta-aine Elävien solujen suh- Kumoutu- .teellinen osuus (%) minen (%) ;* Onkoin- Ei vasta-ainetta 58 0 hibiini + Anti-TNF 58 0 30 + Anti-LT 60 0 + Anti-TNF + Anti-LT 56 4 TNF Ei vasta-ainetta 39 0 + Anti-TNF 100 100 : 35 + Anti-LT 44 5 LT Ei vasta-ainetta 35 0 + Anti-LT 90 90 + Anti-TNF 38 0 16 11208', *Onkoinhibiiniä, TNFrää ja LT:a inkuboitiin anti-TNF- tai anti-LT-vasta-aineiden kanssa lämpötilassa 37 °C 1 tunti ja määritettiin sitten suoraan jäljellä oleva kumoutumaton TNF- tai LT-aktiivisuus aktinomysiini D:llä käsitellyillä 5 L-929-soluilla aiemmin kuvatulla tavalla (4).

Taulukko V

Eri sytokiinien määritys K-562-soluista saadusta epäpuhtaasta onkoinhibiinivalmisteesta*

Sytokiini Pitoisuudet (pg/ml) 10 TNF-a 3+6 TNF-β (LT) 2+0 IL-1B 0 IL-6 155 ± 7 IL-8 >2000 15 *Seerumitonta K-562-soluviljelmäalustaa käytettiin onko- inhibiinilähteenä ja eri sytokiinien pitoisuudet määritettiin tavanomaisilla ELISA-määrityksillä (R&D System). ND = ei määritetty.

TNF ja LT ovat monosyyttien ja vastaavasti lymfo- 20 syyttien tuotteita ja inhiboivat monien erilaisten solujen kasvua. Samoin kuin onkoinhibiini inhiboivat lymfotoksiin! ja TNF MCF-7-solujen kasvua, mutta tarvitaan suuria TNF- ja LT-pitoisuuksia (10 000 yksikköä/ml).

: " Sen varmistamiseksi edelleen, ettei onkoinhibiini ·...· 25 ole TNF eikä LT, tehtiin Northern-täpläanalyysi näitä kum- ·,· ·* paakin sytokiinia vastaavan geenin etsimiseksi. Nothern- :* täpläanalyysissä inkuboitiin forboliesterillä käsiteltyjä ;* ja käsittelemättömiä soluviljelmiä, jotka oli siirrostettu .'j·. tiheydeksi 1*10® solua/ml 75 cm:n pulloihin, yhdessä pro- i

30 teiinikinaasi C -aktivaattorin kanssa 24 tuntia ja otet-tiin ne sitten talteen sentrifugoimalla. Kokonais-RNA

* * .! uutettiin soluista guanidiniumisotiosyanaatti-fenoli-klo- roformimenetelmällä, jonka ovat esittäneet Chirgwin et ai.

• *· [Biochem. 18 (1979) 5294 - 5299] ja Maniatis et ai. (Mole- : : 35 cular Cloning 1982, s. 188 - 209), jotka julkaisut maini- 17 1 1208', taan tässä viitteinä. Normaalisti saatiin RNA:ta, jonka absorbanssisuhde 260 nm/280 nm oli yli 1,9 ja jonka saanto oli noin 100 pg RNA:ta/20*106 solua.

Elektroforeesissa fraktioitiin 20 pg RNA:ta 5 0,8-%:isillä agaroosigeeleillä, jotka sisälsivät 2,2 mol/1 formaldehydiä, käsittelemällä noin 3 tuntia jännitteellä 75 - 100 V. Sen jälkeen geelejä käsiteltiin dietyylipyro-karbonaatilla käsitellyllä vedellä 1 tunti lämpötilassa 68 "C ja siirrettiin sitten RNA Hybond-nailonkalvoihin 10 (Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Siirron (3 tuntia) jälkeen suodatin huuhdottiin kahdesti SSC:llä (SSC: 0,15 mol/1 natriumkoridia, 15 mmol/1 natriumasetaattia, 15 mmol/1 natriumsitraattia, pH 7,0) ja laitettiin mikro-sulkupussiin.

15 Esihybridisaatio tehtiin pitämällä 1 tunti lämpöti lassa 65 °C puskurissa, joka sisälsi 7 % SDS:a, 500 mmol/1 natriumfosfaattia ja 1 mmol EDTAa, pH 7,2 (hybridisaatio-puskuri). Sitten suodattimia hybridisoitiin TNF- tai LT-cDNA-koettimien kanssa [ominaisaktiivisuus 2·108 puls-20 sia/(min*pg DNA:ta)]. Hybridisaation jälkeen kalvot pestiin muutamaan kertaan lämpötilassa 95 °C hybridisaatio-puskurissa, joka sisälsi lohen maidin DNA:ta (200 pg/ml). Kalvoilla säteilytettiin Kodak XAR-5 -filmiä lämpötilassa : ·· -70 eC 1 - 3 vuorokautta. Tehtiin peräkkäisiä esihybridi- 25 saatio-, hybridisaatio-, pesu- ja suodattimeltapoistosyk-: lejä. Kaistojen samanlainen kuormitus osoitettiin tutki- :* maila geelit etidiumbromidivärjäyksen jälkeen ja myös re- • |· hybridisoimalla samat suodattimet joko aktiinia tai gly- seraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasia (GAPDH) vastaavien 30 cDNA:iden kanssa. Vyöhykkeiden densitometria tehtiin joko , . tekemällä radioaktiivisuuden pyyhkäisylaskenta täpläanaly- t saattorilla Betascope 603 (Betagen Corp., Waltham, MA) tai ;* autoradiogrammin optisen tiheyden pyyhkäisymittaus käyttä- mällä Scanning Densitometer -laitetta (Helena Laboratories 35 Inc., Beaumont, TX). Kuten kuviossa 13 esitetään, mRNA:n

1 1 O o Q

18 I UJO , ilmentymistä ei havaittu LT:n eikä TNF:n suhteen K-562-soluissa. Lisäksi geelisuodatus- ja SDS-PAGE-kokeet vahvistavat, että onkoinhibiinin moolimassa eroaa sekä TNF:n että LT:n moolimassasta.

5 Kuvion 19 mukaisesti ihmisen rintasyöpäsolut kasva vat nopeasti viljemänä alustassa. Kun viljelmään lisättiin onkoinhibiiniä, ei kuitenkaan havaittu ollenkaan näiden solujen kasvua. Näiden solujen kasvun inhiboinnin vaatiman vaikutusajan määrittämiseksi soluja käsiteltiin onkoinhi-10 biinillä eripituisia aikoja. Kuvion 20 mukaisesti onkoinhibiinin kasvunestovaikutukset päättyvät, kun sytokiini poistetaan alustasta. Nämä tulokset viittaavat onkoinhibiinin jatkuvan läsnäolon tarpeeseen.

Viitaten kuvioon 21, tutkittiin MCF-7-solujen muo-15 toa onkoinhibiinikäsittelyn jälkeen käyttäen vertailuaineena TNF:ää. Tulokset osoittavat eron tavassa, jolla TNF ja onkoinhibiini inhiboivat rintasyöpäsolujen kasvua. TNF indusoi solujen pyöristymisen, joka johtaa niiden irtoamiseen maljasta, kun taas onkoinhibiini indusoi solujen suu-20 renemisen tai turpoamisen. Viimeksi mainittu voi olla seurausta onkoinhibiinin vaikutuksista solujen läpäisevyyteen. Onkoinhibiini inhiboi myös ihmisen rintasyöpäsolujen pesäkkeenmuodostusta.

·' Onkoinhibiinin stabiiliuden tutkiminen: Onkoinhi- 25 biiniä käsiteltiin orgaanisella liuotteella (asetonitrii- :J : Iillä, metanolilla tai propanolilla), happamilla liuot- :* teillä (HC1, trikloorietikkahappo tai etikkahappo), emäk- ·>· sisillä liuotteilla (NaOH, ammoniumhydroksidi) tai deter- . genteillä SDS, Tween 10) kaksi tuntia huoneenlämpötilassa, 30 dialysoitiin sitten Tris-HCl-liuosta (20 mmol/1, pH 8,0) vastaan yön yli kylmähuoneessa ja määritettiin biologinen ; aktiivisuus (taulukot VI ja VIII).

» » Lämpöstabiiliuskokeissa onkoinhibiiniä pidettiin ·· erilaisissa lämpötiloissa eripituisia aikoja ja määritet- : 35 tiin suoraan biologinen aktiivisuus. Onkoinhibiinin biolo- t I · 112081 j. y gisen aktiivisuuden havaittiin olevan stabiili 60 min:n käsittelyssä lämpötilaan 80 °C asti, mutta noin 50 %:n aktiivisuushäviö havaittiin, kun sitä pidettiin 30 min lämpötilassa 100 °C (taulukko VI).

5 Taulukko VI

Onkoinhibiinin lämpöstabiilius eri lämpötiloissa Lämpötila Aika Jäljellä oleva % (°C) (min) aktiivisuus (yksikköä/ml) 4 60 256 100 10 80 30 210 82 60 230 9 90 30 200 78 60 190 74 100 30 128 50 15 60 110 43

Taulukon VII yhteydessä onkoinhibiiniä käsiteltiin pronaasi E:llä, trypsiinillä, kymotrypsiinillä ja V8 Staph -proteaasilla ja analysoitiin sitten sen biologinen aktiivisuus. Tulokset osoittavat, että pronaasi E pystyy hävit-20 tämään kokonaan onkoinhibiiniaktiivisuuden, mikä viittaa siihen, että onkoinhibiini on proteiini. Sen aktiivisuuden havaittiin olevan osittain herkkä trypsiinikäsittelylle ja täysin resistentti kymotrypsiinille ja V8-proteaasille.

; · Deoksiribonukleaasilla ei myöskään ollut vaikutusta on- -25 koinhibiiniaktiivisuuteen.

Taulukko VII

:· Proteolyyttisten entsyymien vaikutus onkoinhibiiniaktiivisuuteen Entsyymit Pitoisuus Jäljellä oleva 30 aktiivisuus(%)

Ei entsyymejä 10 paino-% 100

Pronaasi E 10 paino-% 0,2

Trypsiini 10 paino-% 50 V8 Staph -proteaasi 10 paino-% 100 35 Kymotrypsiini 10 paino-% 100

Deoksiribonukleaasi 10 paino-% 100 20 119081

Onkoinhibiiniä inkuboitiin eri entsyymien kanssa lämpötilassa 37 °C 24 tuntia Tris-puskurissa (20 mmol/1, pH 8,0), keskeytettiin sitten reaktio lisäämällä 10 % seerumia ja määritettiin onkoinhibiiniaktiivisuus.

5 Onkoinhibiinin stabiilius detergenttien suhteen:

Onkoinhibiininäyte käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla SDS:a, negatiivisesti varautunutta detergenttiä, tai Tween 20:ä, neutraalia detergenttiä, 2 tunnin ajan, dialysoitiin ja määritettiin sitten biologinen aktiivisuus. Vertailu-10 näytteenä käytettiin samalla detergentillä käsiteltyä naudan seerumialbumiinia. Näiden kokeiden tulokset esitetään taulukossa V. Biologisen aktiivisuuden häviämistä ei havaittu käsiteltäessä proteiini joko SDS:llä tai Tween 20:llä. SDS:n ollessa kyseessä näyttää siltä, että tapahtuu 15 onkoinhibiinin biologisen aktiivisuuden merkittävä nousu annoksesta riippuvalla tavalla. Nousu ei ollut merkittävää Tween 20:n ollessa kyseessä.

i · 1 · * · · » · * ♦ · » » ·

» I I

· * 1 21 112081

Taulukko VIII

Detergentin, pH:n ja orgaanisen liuotteen vaikutus onkoinhibiinin stabiiliuteen Aine Pitoisuus Jäljellä oleva % 5 aktiivisuus (yks./ml)

Detergentinkestävyys:

Natriumdode- - 19 100 kyylisulfaatti 0,01 % 23 124 0,05 % 45 243 10 0,10 % 61 330 0,50 % 59 319

Tween 20 0,01 % 24 130 0,05 % 24 130 0,10 % 16 88 15 pH:n kestävyys:

Glysiini, pH 2,0 0,1 mol/1 240 300

Etikkahappo, 1,0 mol/1 256 320 pH 2,4

Natriumasetaatti, 0,1 mol/1 83 104 20 pH 4,0

Natriumasetaatti, 0,1 mol/1 76 95 pH 6,0

Tris-HCl, pH 8,0 0,08 mol/1 80 100 :*'*: NaHC03, pH 10,0 0,1 mol/1 92 115 :*·*: 25 NH40H, pH 11,4 1,0 mol/1 185 231

Ogaanisten liuotteiden kestävyys S/P

Ei liuotetta - 42 100 '!, Metanoli 50 % 81/2 198

Propanoli 50 % 56/3 140 30 Asetoni 70 % 23/26 117

Etanoli 70 % 56/4 143 <’ Asetonitriili 50 % 153/4 374

Onkoinhibiiininäytteitä käsiteltiin huoneenlämpötilassa eri aineilla 1 tunti Tris-puskurissa (20 mmol/1, pH 8,0), 35 dialysoitiin yön yli ja määritettiin sitten jäljellä oleva 22 112081 biologinen aktiivisuus. S ja P tarkoittavat supernatantti-ja pellettifraktioita.

Onkoinhibiinin pelkistimenkestävyys: Onkoinhibiiniä käsiteltiin erilaisilla ditiotreitolipitoisuuksilla 2 tun-5 tia, dialysoitiin ja määritettiin biologinen aktiivisuus. Näiden kokeiden tulokset esitetään taulukossa IX. On selvää, että onkoinhibiiniaktiivisuus on epästabiili DTT-kä-sittelyssä. Havaittiin 50 %:n aktiivisuushäviö DTT-pitoi-suuden ollessa 1 mmol/1 ja 67 %:n häviö, kun DTT-pitoisuus 10 oli 100 mmol/1.

Taulukko IX

Onkoinhibiinin kestävyys erilaisissa käsittelyissä Aine Pitoisuus Aktiivisuus %

Pelkistimet (DTT) - 256 100 15 1 mmol/1 128 50 10 mmol/1 96 38 100 mmol/1 84 33

Trikloorietikkahappo 5 %, sup. 11 4 sakka 256 96 20 Ammoniumsulfaatti 70 %, sup. 11 2 sakka 538 98

Onkoinhibiininäytteet käsiteltiin eri aineilla, dialysoi-j tiin ja määritettiin sitten biologinen aktiivisuus.

Onkoinhibiini voidaan konsentroida trikloorietikka-25 hapon ja ammoniumsulfaatin avulla. Onkoinhibiini käsitel-.|. tiin erilaisilla pitoisuuksilla TCA:a tai NH4S04:a, sentri-

M I I

fugoitiin, suspendoitiin uudelleen, dialysoitiin ja määri-tettiin sitten biologinen aktiivisuus. Taulukossa IX esitetyt tulokset osoittavat, että onkoinhibiiniaktiivisuus 30 voidaan saostaa kokonaan käyttämällä joko 5 % TCA:a tai 70 % (SAS) ammoniumsulfaattia. Niinpä nämä tulokset viit-’' taavat myös onkoinhibiinin proteiiniluonteeseen.

Amfireguliini on glykoproteiini, joka on eristetty forboliesterillä käsitellyistä MCF-7-soluista ja estää 35 A431-solujen kasvua. Amfireguliinin näennäinen moolimassa t » » ilo n p"

I I L O I

23 on 22,5 kD. Sekä onkoinhibiini että amfireguliini inhiboivat kasvainsolujen kasvua. Forboliesterillä käsitellyt MCF-7-solut eivät kuitenkaan tuota onkoinhibiiniä. Toisekseen, vaikka sekä onkoinhibiinillä että amfireguliinilla 5 on antiproliferatiivinen aktiivisuus A431-solujen suhteen (taulukko III), amfireguliini on toisin kuin onkoinhibiini inaktiivinen ihmisen melanoomasoluja (A375), ihmisen rin-ta-adenokarsinoomasoluja (ZR-75-1 tai MCF-7), ihmisen keuhkoadenokarsinoomasoluja (A-549), ihmisen paksusuoli-10 adenokarsinoomasoluja (H3347), ihmisen lymfoblastoidi-T-soluja (CEM), ihmisen EBV-transformoituja B-soluja, ihmisen kurkunpään epidermikarsinoomasoluja (Hep 2), naudan sikiön sydämen endoteelisoluja (CRL-1395), BALB/3T3-hiiren soluja ja minkin keuhkosoluja (CCL-4) vastaan. Samoin kuin 15 onkoinhibiini amfireguliini stimuloi ihmisen fibroblastien proliferaatiota. Ihmisen fibroblastien ohella amfireguliini stimuloi myös tiettyjen kasvainsolujen, ihmisen aivoli-säkekasvainsolut (CRL 7386), ihmisen munasarjakarsinooma-solut (HTB 77), afrikkalaisen viherapinan munuaissolut 20 (BSC-1) ja rotan munuaissolut (NRK) mukaan luettuina. Myös onkoinhibiinin moolimassa on kuitenkin merkittävästi erilainen kuin amfireguliinin, ja viimeksi mainitun valmis muoto on 84 aminohapon pituinen proteiini.

Onkoinhibiini on stabiili sekä happamissa että . 25 emäksisissä olosuhteissa pH-alueella 2,0 - 10,0 (taulukko VIII). On kuvattu muutamia sytokiinejä, jotka ovat stabiili leja pHtssä 2, mukaan luettuina IFN-α, IFN-B, IL-2, IL-4, i ! L-8, CSF-1, GM-CSF, TGF-β, onkostatiini M ja amfiregulii- t ' ni. Onkostatiini M, amfireguliini, CSF-1 ja IL-4- havait- 30 tiin stabiileiksi myös emäksisissä olosuhteissa (pH 12). Jokin aika sitten on A-375-melanoomasolulinjasta eristetty . ,· lipolyysiä edistävä tekijä (LPF), proteiini, jonka mooli massa on noin 6 kD ja joka kestää lämpöä (96 °C 10 min), proteaasi K:ta (10 mg/ml), trypsiiniä, pronaasia, RNaasia, 35 DNaasia ja perjodaattihapetusta. LPF voidaan saostaa tri- 24 112031 kloorietikkahapolla (10 %) ilman biologisen aktiivisuuden häviämistä. Onkoinhibiinin on havaittu olevan lämmönkestä-vää lämpötilaan 80 °C asti 30 min:n ajan, ja sen aktiivisuus hävisi vain osittain lämpötilassa 100 °C (taulukko 5 VI). Onkoinhibiinin käsittely trypsiinillä (10 paino-%) 24 tuntia lämpötilassa 37 °C johti biologisen aktiivisuuden osittaiseen häviämiseen. Tämä vastaa CSF-l:n, GM-CSF:n ja LT:n yhteydessä havaittua. Onkoinhibiinin biologisen aktiivisuuden on havaittu olevan stabiili myös SDS:n (0,5 %) 10 läsnä ollessa.

Onkoinhibiini on eri aine kuin kasvaimia tappava tekijä (TKF), ihmisen makrofagi-monosyyttihybridomasta identifioitu sytokiini, koska TKF on emäksinen proteiini (pl 8 - 9,0), sen näennäinen moolimassa on 56 kD geelisuo-15 datuksellä määritettynä ja se voidaan eluoida konkanava-liini A -Sepharosesta a-metyylimannosidilla (0,4 mol/1).

Onkostatiini M on sytokiini, joka on eristetty for-boliesterillä käsitellyistä U-937-soluista, ja se estää ihmisen melanoomasolulinjan A375 kasvua tymidiininsisälly-20 tysmäärityksessä. Stimuloimattomat A-937-solut eivät il mennä kyseistä geeni eivätkä eritä tätä aktiivisuutta. Myös fytohemagglutiniinilla aktivoidut ihmisen ääreisveren T-lymfosyytit ilmentävät tämän geenin ja erittävät tätä sytokiiniä. Onkostatiini M on glykoproteiini, jonka mooli-25 massa on 28 kD SDS-PAGE:lla ja 18 kD geelisuodatuksella määritettynä. Se toimii synergistisesti TGF-6:n muttei « · r t interferonien kanssa. Onkostatiini M:n on osoitettu inhi-’! ! hoivan HTB 10 -neuroblastoomasolujen, A-549-keuhkokarsi- noomasolujen samoin kuin A375- ja SKMEL-28-melanoomasolu-30 jen proliferaatiota; se ei kuitenkaan inhiboi L-929-solu-jen proliferaatiota. Onkoinhibiiniä sen sijaan tuottavat K-562-solut (ei U-937-solut) sekä forboliesterin läsnä että poissa ollessa, ja se vaikuttaa L-929-soluihin. Lisäksi onkostatiini M on, toisin kuin onkoinhibiini, suh-35 teellisen heikko A375-solujen inhibiittori (kuvio 14).

Λ ΊΟ;· Ο I I L υ Ο ι 25

Transformoiva β-kasvutekijä (TGF-β) on sytokiini, joka on homodimeeri, jonka moolimassa on 25 kD SDS-PAGE:lla määritettynä ja joka inhiboi muutamien epiteliaa-lista ja mesenkymaalista alkuperää olevien solutyyppien 5 kasvua, mukaan luettuina ihmisen verisuonten endoteeliso-lut ja T- ja B-lymfosyytit. TGF-B inhiboi myös A-549- ja MCF-7-soluja autokriinisellä tavalla. Toisin kuin onkoin-hibiiniä TGF-β:aa tuottavat monet erilaiset solut, mukaan luettuina verihiutaleet, luukudos ja lymfosyytit, ja se 10 vaatii happaktivointia, ennen kuin sen aktiivisuutta voidaan tutkia. Lisäksi TGF-β:n moolimassa on 12,5 kD määritettynä SDS-PAGE:lla pelkistetyissä olosuhteissa.

Sytokiinin ELISA-määritykset: Käytettiin kaupallisesti saatavissa olevaa (R&D Systems) kvantitatiivista 15 "kerrosmenetelmää" entsyymi-immuunimäärityksen tekemiseksi tutkittaessa tunnettujen sytokiinien (TNF, LT, IL-1, IL-6 ja IL-8) läsnäoloa onkoinhibiinivalmisteissa. Käytettiin toimittajan tarjoamaa standardiohjelmaa. Lyhyesti esitettynä päällystettiin mikromaljat erilaisille sytokiineille 20 spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella ja annettiin seistä yön yli vasta-aineiden immobilisoimiseksi. Sitten syvennyksiin pipetoitiin näytteet, ja immobilisoitu vasta-: aine sitoo mahdollisen sytokiinit. Kun näytteen mahdolli- set sitoutumattomat proteiinit oli pesty pois, lisättiin 25 syvennyksiin jollekin määrätylle sytokiinille spesifistä entsyymiin kytkettyä polyklonaalista vasta-ainetta ja an- ! nettiin sen sitoa ensimmäisen inkuboinnin aikana sidottu * · !! sytokiini. Kun oli tehty pesu mahdollisen sitoutumattoman polyklonaalisesta vasta-aineesta ja entsyymistä koostuvan 30 reagenssin poistamiseksi, lisättiin syvennyksiin sub- straattiliuosta, jolloin väriä kehittyi verrannollisesti / ensimmäisessä vaiheessa sidotun sytokiinin määrään. Tut kittujen näytteiden ohella, valmistettiin sarja syvennyksiä käyttämällä tunnettuja sytokiinistandardipitoisuuksia. 35 Muodostettiin käyrä, joka kuvaa optista tiheyttä näissä 26 112 0 81 standardisyvennyksissä vallitsevan sytokiinipitoisuuden funktiona, vertaamalla näytteiden optista tiheyttä tähän standardikäyrään. Sitten laskettiin tuntemattomien näytteiden sytokiinipitoisuus (taulukko V).

5 Interleukiini-1 on sytokiini, jota tuottavat ak tivoidut monosyytit ja fibroblastit, sen moolimassa on 17 kD, ja se inhiboi kasvainsolulinjojen kasvua, mukaan luettuina munasarjakarsinooma-, Α-375-melanooma-, K-562-ja tietyt rintasyöpäsolulinjat. Onkoinhibiini eroaa kui-10 tenkin interleukiini-1:stä lähteensä, moolimassansa ja kasvainspesifisyytensä suhteen. Onkoinhibiiniraakavalmis-teista tutkittiin IL-l:n läsnäolo ELISA-menetelmällä. Taulukossa V esitetyt tulokset osoittavat IL-l-proteiinin poissaolon onkoinhibiinivalmisteestamme.

15 Interleukiini-6 on sytokiini, jota tuottavat monet erilaiset solutyypit reaktiona hyvin moninaisiin ärsykkeisiin, ja sen moolimassa on 26 kD SDS-PAGE:lla määritettynä. Tarkemmin määrieltynä IL-6:a tuottavat myös ihmisen normaalit fibroblastit, U-937, ihmisen melanoomasolulinjat 20 S375 ja RPMI-7951 jne. IL-6 inhiboi myeloidinen leukemia -solulinjojen ja rintakarsinoomasolulinjojen kasvua. Lähteen, induktiomenetelmän ja kasvainsoluspesifisyyden pe-• rusteella IL-6 on ilmeisesti eri sytokiini kuin onkoinhi- *··' biini. Lisäksi MCF-7-solut, joita käytetään rutiininomai- *.· ’ 25 sesti kohteena onkoinhibiinille, ovat epäherkkiä interleu- kiini-6:n vaikutuksille (kuvio 16). Samoin havaittiin, f :* että, toisin kuin onkoinhibiini, IL-6 inhiboi ihmisen nor- : : maalien fibroblastien kasvua (kuvio 15).

Interferoni-Τ':aa, sytokiiniä, jonka moolimassa on , 30 20 - 25 kD määritettynä SDS-PAGE:11a, tuottavat T-lymfo- syytit, kun ne aktivoidaan erilaisilla mitogeeneilla, ja se inhiboi tiettyjen kasvainsolulinjojen kasvua. Tämä sytokiini on hyvin herkkä happamille pH-olosuhteille. Onkoinhibiini eroaa interferoni-T: sta lähteensä, induktiomene-35 telmänsä ja pH-stabiiliutensa suhteen. Interferoni-Teroaa 27 112 0 81 onkoinhibiinistä myös vaikutukseltaan ihmisen normaaleihin fibroblasteihin. Onkoinhibiini stimuloi proliferaatiota, kun taas interferoni-γ inhiboi TNF:llä indusoitua mutta ei onkoinhibiinillä aikaansaatua fibroblastien proliferaatiota 5 (kuvio 18). Lisäksi interferoni-γ:n vastaiset vasta-aineet eivät vähennä onkoinhibiinin aktiivisuutta vaan edistävät sitä (kuvio 17).

Niinpä tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän uudenlaisen sytokiinin valmistamiseksi, jolla on moninainen 10 antineoplastinen aktiivisuus. Tätä sytokiiniä, onkoinhi- biiniä, erittävät ihmisen erytroblastoidisolut, ja sen moolimassa on noin 28 kD SDS-PAGE:lla määritettynä. Onkoinhibiinin tuotanto näyttää edistyvän forboliesterin läsnä ollessa. Onkoinhibiini näyttää olevan monia erilaisia aineita 15 kestävä, stabiili laajalla pH-alueella ja korkeita lämpötiloja kestävä.

Ajatellaan, että onkoinhibiinillä on moninaisen neoplastisen aktiivisuutensa ansiosta terapeuttista käyttöä monien erilaisten kasvainsairauksien, karsinoomat ja lym-20 foomat mukaan luettuina, hoidossa. Onkoinhibiiniä voidaan antaa ihmisille ja muille eläimille osana farmaseuttista ί’·#> koostumusta, joka sisältäisi farmaseuttisesti hyväksyttävää .···. kantajaa. Moninaisen antineoplastisen aktiivisuutensa ansi- osta onkoinhibiini lienee käyttökelpoista kasvainsairauksi-25 en uusiutumisen estämisessä. Lisäksi onkoinhibiinin anto isännille, joissa esiintyy kasvainsoluja, pidentää todennä-*;;; köisesti isännän elinaikaa. Vaihtoehtoisesti voitaisiin kä- ’·' sitellä kasvainsoluj a onkoinhibiinillä in vitro, esimerkki nä on kasvainsoluja sisältävän luuytimen käsittely ja puh-; ,· 30 distus. Nämä tässä kuvatun kaltaisen kasvainsolujen käsit- telymenetelmät ovat syövän kemoterapian alalla hyvin tun-;·, nettuja, ja siten tämän alan ammattimies pystyisi ilman tarpeettomia kokeiluja määrittämään onkoinhibiinin sopivat annostukset ja antotavat.

* ’·· 35 Onkoinhibiini voi olla myös käyttökelpoista uuden- laisena immuunimodulaattorina. Onkoinhibiini aktivoi lym- 28 112081 fosyyttejä, monosyyttejä ja neutrofiilejä tappamaan kas-vainsoluja. Lisäksi onkoinhibiini voi olla terapeuttisesti käyttökelpoista kasvutekijänä. Onkoinhibiini stimuloi nor-maalisolujen kasvua.

5 Johtopäätöksenä havaitaan, että tämä keksintö ja tässä esitetyt suoritusmuodot soveltuvat hyvin tässä hakemuksessa esitettyjen päämäärien saavuttamiseen. Menetelmään ja laitteistoon voidaan tehdä tiettyjä muutoksia poikkeamatta tämän keksinnön hengen ja suoja-alan piiristä. Ymmär-10 rettäneen, että muutokset ovat mahdollisia ja että lisäksi on tarkoitus, että missä tahansa patenttivaatimuksista esitettävä kukin elementti tai vaihe on ymmärrettävä siten, että se tarkoittaa kaikkia ekvivalenttisia elementtejä tai vaiheita olennaisesti samojen tulosten saavuttamiseksi 15 olennaisesti samalla tai vastaavalla tavalla. Tarkoituksena on kattaa keksintö laajasti hyödynnettiinpä sen periaatteita missä tahansa muodossa. Tämä keksintö soveltuu siksi hyvin mainittujen samoin kuin muiden, siihen luontaisesti liittyvien tarkoitusten toteuttamiseen ja päämäärien ja 20 etujen saavuttamiseen.

t * f I

* a • · · • * · * i t • < · I t » » f I » I ·

Claims (7)

1. Menetelmä ihmisen erytroblastoidisolujen erittämän onkoinhibiiniproteiinin valmistamiseksi, jonka pro- 5 teiinin moolimassa on noin 28 kDa, ja joka on stabiili suunnilleen pH-alueella 2 - 8 ja suunnilleen lämpötila- alueella 4 - 100 °C, ja jolla on antineoplastinen aktiivisuus, tunnettu siitä, että inkuboidaan ihmisen erytroblastoidisoluja; 10 indusoidaan onkoinhibiinituotanto; ja otetaan talteen soluviljelmien supernatantit.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini on olennaisesti vapaa epäpuhtauksista.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että forboliesteri edistää proteiinin tuotantoa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini on aktiivinen tavan- 20 omaisissa onkoinhibiinimäärityksissä ja olennaisesti homogeenista SDS-PAGE:n mukaan. J*·^

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ,···. tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisen onkoinhi- * · biini, joka sisältää immuunimodulaattorin lymfosyyttien, ’ . 25 monosyyttien ja neutrofiilien aktivoimiseksi tappamaan kas- vainsoluja.

*;;; 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • · ‘ tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisen onkoinhibiini, joka sisältää kasvutekijän normaalisolujen kasvun • · * ί ’,· 3 0 stimuloimiseksi. • t

/· 7. Menetelmä ihmisen erytroblastoidisoluj en erittä- män onkoinhibiiniproteiinin puhdistamiseksi, jonka proteii-nin moolimassa on noin 28 kDa, ja joka on stabiili suunni 1-leen pH-alueella 2 - 8 ja suunnilleen lämpötila-alueella ; ’*· 35 4 - 100°C, ja jolla on antineoplastinen aktiivisuus, tunnettu siitä, että 119. r - ultrasuodatetaan ihmisen onkoinhibiiniä sisältävät soluvilj elmäsupernatantit; dialysoidaan ultrasuodatetut supernatantit; toteutetaan DEAE Affigel Blue -kromatografia; 5 toteutetaan natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyli- amidigeelielektroforeesi ja käänteisfaasisuurtehonestekro-matografia. Paten tkrav 1 1208'·