DE69310549T2

DE69310549T2 - Vorrichtung zur behandlung von einrahmten membranen durch eine flüssigkeit

Info

Publication number: DE69310549T2
Application number: DE69310549T
Authority: DE
Inventors: Donald Brunk; David Regester; Charles Robertson; Anders Wellings
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1992-12-29
Filing date: 1993-12-22
Publication date: 1997-10-02
Anticipated expiration: 2013-12-23
Also published as: DK0677168T3; DE69310549D1; MX9400154A; GR3024162T3; EP0677168A1; JPH08505230A; US5350502A; JP3574657B2; WO1994015208A1; ATE152829T1; ES2100688T3; IL108153A0; EP0677168B1; AU5851694A; CA2151811A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Nachweis von Mikroben und insbesondere auf eine Membranverarbeitungsvorrichtung, die verwendet wird, um ein zuvor auf die Membran übertragenes chemilumineszentes Blottingmuster aus Molekülfragmenten zu entwickeln.

Hintergrund der Erfindung

Es gibt mehrere Techniken, die auf die Identifizierung von Molekülfragmenten gerichtet sind, wobei die Fragmente auf einer Membran abgeschieden werden (zum Beispiel nach elektrophoretischen Trennungsverfahren). Zum Beispiel beruhen mehrere Techniken auf dem Nachweis und der Identifizierung von Molekülfragmenten, die als Blot auf einer gerahmten Membran dargestellt sind, indem man den Blotfragmenten Chemilumineszenz verleiht und das davon ausstrahlende Leuchtmuster nachweist.
US 5,047,129 ist auf eine Einheit zur Behandlung von auf einem Rahmen montierten Elektrophoresestreifen gerichtet. Die Einheit umfaßt wenigstens ein Paar Becken und einen Kreislauf von Zufuhr, erzwungener Zirkulation und Entleerung. Verschiedene Flüssigkeiten einschließlich verschiedener Behandlungsflüssigkeiten und einer Spülflüssigkeit werden mit Hilfe von Pumpen durch Tanks entleert.
US 4,963,236 ist auf Vorrichtungen und Verfahren zum isoelektrischen Fokussieren amphoterischer Substanzen innerhalb von Flüssigkeiten, die Trägerampholyte enthalten, gerichtet. Es verwendet Mehrkanal-Recycling-isoelektrische-Fokussierungs- Techniken und ein duales Reservoirsysstem.
US 4,913,791 ist auf einen Blottingrahmen und ein Verfahren zu seiner Handhabung gerichtet. Blottingmembranen sind zur Handhabung während des Blottings, der Analyse und der Aufbewahrung trägergestützt.
In DE 30 41 637 ist eine automatische Vorrichtung zur Flüssigkeitsbehandlung einer Membran offenbart. Die Membran wird in einer geschlossenen Kammer in Flüssigkeit gelegt, uhd das gesamte Gefüge wird gedreht, um die Flüssigkeit über beide Flächen der Membran zu bewegen. Im Unterschied zur vorliegenden Erfindung gibt es keine Einrichtung bzw. wird kein Versuch unternommen, um für das definierte gleichmäßige Fließen zu sorgen (die strukturellen Merkmale des Verteilerstücks, der Verteilungslöcher, Wehre, Mischkammern usw.), und es gibt auch nicht die näher beschriebenen Einrichtungen zum Herstellen einer Strömung (die Spritzenpumpe und die Umlaufpumpe).

Kurzbeschreibung der Erfindung

Offenbart und beansprucht wird hier eine Vorrichtung für die Flüssigkeitsbehandlung einer Membran (92) mit einer ersten und einer zweiten Seite und einem Bereich, der ein latentes Blotting- Bild enthält, umfassend:
(a) eine Verarbeitungskammer (80), die den Bereich, der das latente Blotting-Bild der Membran (92) enthält, in einer Zelle (200) umschließt, wobei die Zelle (200) einen Eintrittsanschluß und einen Austrittsanschluß hat;
(b) Einrichtungen zum Einführen von Flüssigkeit in die Zelle (200) durch den Eintrittsanschluß in einer ausreichenden Menge, um den Bereich der Membran (92), der das latente Blotting-Bild enthält, ganz zu bedecken;
(c) Einrichtungen zum Zirkulieren der Flüssigkeit innerhalb der Zelle; und
(d) Einrichtungen zum Entnehmen von Flüssigkeit aus der Kammer durch den Austrittsanschluß;
dadurch gekennzeichnet, daß
(e) es sich bei Einrichtung (b) um eine Spritzenpumpe (61) in ventilvermittelter Fluidverbindung mit dem Eintrittsanschluß (230 oder 232) handelt;
(f) es sich bei Einrichtung (c) um eine Umlaufpumpe (83) in ventilvermittelter Fluidverbindung mit dem Eintrittsanschluß (230 oder 232) handelt, die entweder mit einem Verteilerstück (210) über die volle Breite der Zelle (200) in Fluidverbindung mit einer Vielzahl von Verteilungslöchern (212) in regelmäßigen Abständen oder mit einem Verteilerstück (234), das die Flüssigkeit zweidimensional in einer Mischkammer (234') ausbreitet, wobei sie gegebenenfalls durch eine Verteilungsplatte (238) fließt, die durch eine Vielzahl von Verteilungslöchern (236) mit kleinem Durchmesser gekennzeichnet ist, verbunden ist;
(g) es sich bei Einrichtung (d) um die Umlaufpumpe (83) handelt, in ventilvermittelter Fluidverbindung entweder mit einander gegenüberliegenden Anordnungen von Verteilungslöchern (206) in regelmäßigen Abständen in Fluidverbindung mit paarweise vorhandenen Verteilerstücken (208) oder mit einander gegenüberliegenden Wehren (218, 220), die Sammelbehälter (222, 220) speisen, die zu paarweise angeordneten Austrittsöffnungen (226, 228) führen, so daß die Flüssigkeit gleichmäßig über die erste und die zweite Seite der Membran und den Bereich, der das latente Blotting-Bild enthält, fließt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine Vorderansicht einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, die einen partiellen Querschnitt eines Teils davon umfaßt.
Figur 2 ist ein schematisches Flüssigkeitsströmungssystem für die Vorrichtung.
Figur 3 ist eine perspektivische Ansicht einer Membranverarbeitungskammer der Erfindung mit dem Vorderende teilweise im Querschnitt, um einen Aufriß des Innern zu zeigen.
Figur 4 ist ein perspektivischer Aufriß einer gerahmten Membran.
Figur 5 ist ein Aufrißquerschnitt einer offenzelligen Membranverarbeitungskammer ähnlich wie in Figur 3, aber fur eine andere Vorrichtung modifiziert.
Figur 6 ist eine Endansicht einer Transportklammer, die in der mehr bevorzugten Ausführungsform verwendet wird.
Figur 7 ist eine Ansicht der Transportklammer von Figur 6 in einem Querschnitt entlang der Linie 7-7 von Figur 6.
Figur 8 ist ein Aufrißquerschnitt einer offenzelligen Membranverarbeitungskammer ähnlich wie in Figur 5, aber für eine noch mehr bevorzugte Vorrichtung modifiziert.
Figur 9 ist eine Draufsicht, die die Vorrichtung von Figur 1 mit einem hinzugefügten Läufergefuge zeigt, das die Transportklammern von Figur 6 positioniert und die Kammern von Figur 8 verwendet.
Die Figuren 10, 11 und 12 sind Aufrißquerschnitte entlang der Mittellinie geschlossenzelliger Kammern mit Scharnieren in noch einer änderen Ausführungsform, die die Klammer von Figur 6 verwendet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

In Figur 4 ist die in der Erfindung verwendete trägergestützte Membran gezeigt. Der Rahmen 90 hält die Membran 92, die mit zwei einander gegenüberliegenden Kanten des Fensters 94 verbunden ist. Man beachte, daß die Membran 92 sowohl an den befestigten als auch än den freien, einander gegenüberliegenden Seiten ein wenig größer ist als das Fenster 94. Wir haben gefunden, daß eine größere Breite als die des Fensters an den beiden nicht befestigten Seiten den Vorteil hat, zu verhindern, daß Flüssigkeit von einer Fläche zur anderen gelangt und so das gleichmäßige Fließen stört, was zu einem weniger als zufriedenstellenden Bild führt. Ein verlängerter Teil 96 stellt einen bequemen Griffbereich zum manuellen oder maschinellen Einsetzen dar, wie wir sehen werden. Das Loch 102 dient zur Ausrichtung in der Verarbeitungsvorrichtung. Was diese Erfindung betrifft, so sei vorausgeschickt, daß die Membran 92 in einer Übertragung des Typs Southern Blot (wir bevorzugen direktes Blotting) oder dergleichen verwendet wurde und ein latentes Bild der aufgetrennten Fragmente trägt, die durch Gelelektrophorese erzeugt werden. Die Erfindung läßt sich auch auf andere Blot-Verarbeitungstechniken, wie Western und Northern Blots, anwenden.
Die Membranverarbeitungsvorrichtung 10 (siehe Figur 1) umfaßt die Basis 12, an der ein struktureller Rahmen 14 befestigt ist, bei dem es sich um eine dreidimensionale Struktur handelt, die ein umgekehrtes U bildet und in geeigneter Weise gestützt und versteift ist, um eine Anzahl von Elementen zu tragen. Das Gestell 16 hält einen oder mehrere (gezeigt sind zwei) Reagensbehälter 18. Jeder davon weist eine Anzahl von hintereinanderliegenden Zellen 20 auf, die die benötigten Reagentien für ein oder mehrere ausgewählte Verarbeitungsverfahren enthalten. Für die Anwendung der bevorzugten Ausführungsform, die später ausführlicher beschrieben wird, stellen wir neun Zellen pro Behälter bereit (der Experimentator kann jedoch im Einklang mit dem interessierenden Verarbeitungsverfahren eine Anzahl von Zellen auswählen). Weiterhin enthält jede Zelle 20 in unserem bevorzugten Verfahren 28 ml, was genug frisches Reagens aufträgt, um eine Membran zu verarbeiten. Wiederum soll die Menge des Reagens vom Experimentator ausgewählt werden. Von den neun Zellen 20 in einem gegebenen Reagensbehälter 18 für das bevorzugte Verfahren enthalten sechs gebrauchsfertige Reagentien, und drei sind für andere mögliche Ausführungsformen vorgesehen. Diese sechs Zellen 20 können in einer anderen Ausführungsform Reagentien enthalten, die mit Wasser aufbereitet werden müssen, was unter Verwendung der Zufuhr für entionisiertes Wasser der Vorrichtung erfolgen kann, wie wir sehen werden. In noch einer anderen Ausführungsform enthalten drei an sich gebrauchsfertige Reagentien, und drei dieser Zellen enthalten Reagentien, die innerhalb einer vernünftigen Gebrauchszeit mit Wasser aufbereitet werden müssen, und so werden drei Zellen 20 mit den erforderlichen Hydrationsmitteln versorgt, und das Mischen erfolgt in situ in drei für diesen Zweck bereitgestellten Zellen. Wir bevorzugen es, die Reagensbehälter als Verbrauchsgegenstände zur Verfügung zu stellen, die vollständig mit flüssigem Reagens beladen sind. Es gibt zwei Reagensbehälter 18, um insofern für einen ausgewogenen Arbeitsfluß für einen Operator zu sorgen, als die Membranverarbeitung, wie wir sie durchführen, mehrere Stunden dauert.
Querstäbe 22 sind an dem Rahmen 14 befestigt und stützen den Läufer 24 für eine lineare Bewegung, die horizontal steuerbar durch einen Zahnflachriemen, Rollen und einen Schrittmotor (nicht gezeigt), die ebenfalls am Rahmen 14 montiert sind, angetrieben wird. Die Saugnadel 26 ist am vertikal verschiebbaren Gefüge 28 montiert, das am Läufer 24 gehalten wird und steuerbar über das Gestell 30 bewegt wird, das durch ein Ritzel (nicht gezeigt) und einen Schrittmotor 32 angetrieben wird.
An dem oberen Teil des Rahmens 14 ist auch eine Nadelwaschstation 50 befestigt. Einzelheiten sind Figur 2 zu entnehmen. Sie umfaßt einen Waschnapf 70 mit einem größeren Durchmesser als die Übertragungsnadel 26. Der Napf 70 hat einen geschlossenen Boden und liegt in der Mitte eines Ablaufnapfes 72, der den Überlauf aus dem Waschnapf 70 auffängt und ein Ablaufloch 74 aufweist, das über das Rohr 76 mit einem Abfallbehälter verbunden ist. Bei der Verwendung wird die Nadel 26 in den Napf 70 eingeführt, und ausreichend Waschflüssigkeit wird durch die Nadel 26 gepumpt, so daß Napf 70 überläuft und das Eingangsrohr 36 und alle anderen Komponenten, die zur Nadel 26 führen, sowie die Innen- und Außenseite von Nadel 26 gespult werden. In einem effektiveren Verfahren wird die Nadel 26 zuerst in den Ablaufnapf 72 gebracht, während das Innere der Nadel und des Rohrs gespült wird, und dann wird die Nadel 26 in den Waschnapf 70 gebracht, um die Außenseite mit sauberer Flüssigkeit zu waschen.
Außer den oben besprochenen Reagentien stehen auf der Basis 12 unabhängig noch ein oder mehrere große Vorratsbehälter, wie der Behälter 34 (vorzugsweise 1 Liter). Der Behälter enthält typischerweise entionisiertes Wasser als allgemeine Waschflüssigkeit sowie spezielle Waschflüssigkeiten zur Verwendung nach der Hybridisierung und nach der Konjugation. In der bevorzugten Ausführungsform stellen wir drei solche Behälter bereit: eine allgemeine Waschflüssigkeit (entionisiertes Wasser), eine Waschflüssigkeit zur Verwendung nach der Hybridisierung (siehe Tabelle 1) und eine Waschflüssigkeit zur Verwendung nach der Konjugation (siehe Tabelle 1). Selbstverständlich sind alle Flüssigkeiten enthaltenden Komponenten in ein Verarbeitungssystem integriert, wie noch erläutert werden wird.
Das Pumpengefüge 60 steht ebenfalls auf der Basis 12. Diese Einheit enthält einen steuerbaren reversiblen Antriebsmechanismus (nicht gezeigt), der den Kolben 62 der Spritzenpumpe 61 antreibt. Der Eintritt und Austritt von Flüssigkeiten wird durch ein assoziiertes elektrisches Ventil (vorzugsweise Drehventil) 38 gesteuert.
Auf der Basis 12 befinden sich auch eine oder mehrere Membranverarbeitungskammern 80. Eine davon ist in Figur 3 gezeigt. Die Kammer verarbeitet nacheinander eine Membran 90 in verschiedenen Flüssigkeiten in der oben offenen Zelle 200.
Die Verarbeitungskammer 80 kann die gesamte oder ein Teil der Membran 90 umschließen Solange der kritische Bereich der Membran 92, der das latente Blotting-Bild enthält, von der Kammer 80 umschlossen wird, können sich andere Teile der Membran 92 außerhalb der Kammer 80 befinden.
Der Rahmen 90 wird manuell oder wahlweise mit Einrichtungen zum Verschieben der trägergestützten Membran 92 in die und aus der Kammer 80 in die Zelle 200 eingeführt. Zum Beispiel können mechanische Einrichtungen verwendet werden, wie paarweise vorhandene, einander gegenüberliegende Gummiwalzen 202, die man am besten in Figur 3 erkennt und die auf den Schäften 204 montiert sind; sie werden von Einrichtungen (nicht gezeigt) wie einem Daumenrad oder einem Schrittmotor angetrieben, je nachdem, ob voll- oder teilautomatisiert gearbeitet wird. Die Walzen 202, falls vorhanden, haben einen solchen Abstand voneinander, daß die Kanten eines Rahmens 90 eingeklemmt werden. Alternativ dazu kann eine Klammer 108, wie sie in den Figuren 6 und 7 gezeigt ist, verwendet werden, um den Rahmen 90 zu verschieben. Die Klammer ist in geeigneter Weise in Beziehung zur Verarbeitungskammer 80 gestützt und wirkt so, daß sie den Rahmen 90 zur Kammer 80 hin oder von dieser weg verschiebt.
Ein weiterer Grad der Automatisierung kann bereitgestellt werden und wird noch mehr bevorzugt. In den Figuren 9 und 8 ist eine Verarbeitungskammer 80" gezeigt, die der von Figur 3 ähnlich ist, die aber keine Komponenten für eine vertikale Bewegung von Rahmen/Membran 90/92 aufweist. Das Einsetzen und Entnehmen von Rahmen und Membran erfolgt durch eine oder mehrere Klammern 108, die an einem zusätzlichen Läufer 24', der in einer Reihe mit wenigstens einer Kammer 80' und allen anderen erforderlichen Verarbeitungselementen bereitgestellt wird, befestigt sind und durch diesen horizontal und vertikal bewegt werden. Dieser Läufer 24' bewegt sich auf Querstäben 22 oder auf einem äquivalenten Rahmen und ist dem Läufer 24 ähnlich, außer daß die Nadel 26 durch die Klammer 108 ersetzt ist, die durch nicht gezeigte Befestigungsmittel durch Montierlöcher 110 gehalten wird. Siehe Figuren 6 und 7. Zwei Auslösekugeln 112 werden von einer doppelendigen Blattfeder 120, die ihrerseits durch das Befestigungsmittel 126 gehalten werden, in Löchern gehalten, die das Hinterelement 114 durchdringen, und haben eine solche Größe in bezug auf den Schlitz 116 zwischen dem Hinterelement 114 und dem Vorderelement 118, daß sie nicht herausfallen können. Ein Stößel 122 ist durch eine Feder 124, die durch die Schraube 126' festgehalten wird, nach unten verrückt und hat nach innen geformte Enden, die über eine zwischen den Elementen 114 und 118 gebildete aufnehmende Fläche übergreifen, um die Bewegung nach unten einzuschränken.
Die Klammer 108 wird mit einem Rahmen 90 und einer Membran 92 verwendet, wie sie in Figur 4 gezeigt sind. Der Rahmen weist an der Oberseite zwei Schlitze 104 auf, die von horizontalen Furchen 106 geschnitten werden. Das Indikatorloch 102 wird gegebenenfalls für die automatische Positionskontrolle verwendet.
Bei der Verwendung bringt die vertikale Bewegung der Klammer 108 in Richtung auf den Rahmen 90 gegen eine Gegenkraft (Hand oder strukturell) die Kugeln 112 in die Schlitze 104, wobei die Feder durch den Stößel 122 gedrückt wird, während die Kugeln 112 den Grund der Schlitze 104 erreichen. Durch horizontale Bewegung werden die Kugeln 112 dann in die Furchen 106 geschoben, so daß die beiden Komponenten miteinander verschränkt werden. Der Läufer 24' kann sich dann horizontal über eine Kammer 80' und dann nach unten bewegen, so daß der Rahmen 90 und die Membran 92 in die Kammer eingeführt werden, wo die Freisetzung durch die Umkehrung der oben beschriebenen horizontalen/vertikalen Bewegung erfolgt, unterstützt durch die Auswurfwirkung der Feder 124, wenn diese keinen Widerstand durch eine Gegenkraft mehr erfährt. Um eine richtige Plazierung des Rahmens 90 und der Membran 92 zu gewährleisten, kann das Oberteil der Kammern 80' im mittleren Bereich weggeschnitten sein (nicht gezeigt), so daß die Klammer 108 eintreten und sich bei der Freisetzung näher am Boden der Kammer befinden kann.
Wir beziehen uns nun auf Figur 9. Der Läufer 24' ist gezeigt, der auf verlängerten Schienen 22 installiert ist. Er trägt die Klammer 108, die mit den Eingängen der Kammern 80" ausgerichtet ist. Die Programmierung der Steuerung wird so eingestellt, daß die Läufer 24 und 24' sich nicht gegenseitig stören.
Figur 8 zeigt die am meisten bevorzugte Form der Kammer 80", die gegenüber der in den Figuren 2 und 3 gezeigten so modifiziert ist, daß sie entweder mit Handeinfügung oder am meisten bevorzugt mit der Klammer 108 und einer assoziierten Vorrichtung arbeitet, so daß man eine sehr gleichmäßige zweiseitige Strömung relativ zu der verarbeiteten gerahmten Membran erhält. Gleichmäßige zweiseitige Strömung bedeutet ein laminares Strömungssystem, bei dem beide Seiten der Membran an allen Punkten mit Flüssigkeit in Kontakt gebracht werden, die sich mit gleicher Geschwindigkeit bewegt, und bei dem die Strömungslinien in der Nähe der beiden Seiten des eingetauchten Blot-Bereichs parallel zur Ebene der Membran sind. Vorzugsweise tritt die Flüssigkeit in eine der beiden Eintrittsöffnungen 230 und 232 ein, von denen eine eng mit dem Ventil 81 und der Umlaufpumpe 83 im Rohr 82 verbunden ist und die andere mit dem Rohr 42 und daher mit der Spritzenpumpe 61 verbunden ist. Die Eintrittsöffnung liegt in der Mitte des Verteilerstücks 234. Das Verteilerstück 234 breitet die Strömung zweidimensional in der Mischkammer 234' aus, die konturierte Ecken hat, um eine glatte Strömung zu erhalten, die sich über die volle Breite der Zelle 200 ausbreitet, so daß die Flüssigkeit gleichmäßig und gleichermaßen über beide Seiten der Membran strömt. Gegebenenfalls macht die Verteilungsplatte 238 mit einer Vielzahl von Verteilungslöchern 236 mit kleinem Durchmesser in regelmäßigen Abständen die Strömung in die Zelle 200 noch gleichmäßiger. Die nach oben gerichtete Flüssigkeitsströmung in der Zelle 200 ergießt sich gleichermaßen über die einander gegenüberliegenden Wehre 218 und 220 in die Sammelbehälter 222 und 224 und durch die Austrittsöffnungen 226 und 228, die mit nicht gezeigten Mitteln mit dem Rohr 82 zu verbinden sind, so daß die Kammer entleert wird. Diese Konfiguration behält die gleichmäßige laminare Strömung bis weit über die Membran hinaus bei und stellt auch ein Mittel bereit, um Blasen oder Schaum, die sich bei ausgedehnter Zirkulation bilden können, zu verteilen.
Kammer 80', die in Figur 5 gezeigt ist, ist eine weitere Ausführungsform, bei der das Einströmen durch wenigstens ein Verteilerstück 210, die volle Breite der Zelle 200, durch eine Vielzahl von Verteilungslochern 212 in regelmäßigen Abständen in die Zelle 200 und gleichmäßig nach oben erfolgt. Das Ausströmen erfolgt durch einander gegenüberliegende Anordnungen von Verteilungslöchern 206 in regelmäßigen Abständen in paarweise vorhandene Verteilerstücke 208 und von dort durch nicht gezeigte Verbindungen in das Rohr 82.
Eine geschlossenzellige Kammer, noch eine weitere Ausführungsform, kann ebenfalls zusammen mit der Klammer 108 von Figur 6 verwendet werden. Die Verarbeitungskammer 80"' umfaßt einen ersten und einen zweiten Einschlußteil 402 bzw. 404, die so angepaßt sind, daß sie die trägergestützte Membran 92 dazwischen aufnehmen können. Die Einschlußteile 402 und 404 nehmen den Rahmen 90 entlang wenigstens einer Randkante auf. Am meisten bevorzugt sind der erste und der zweite Einschlußteil 402 und 404 miteinander verbunden, etwa mit einem Scharnier 406, so daß sie sich öffnen lassen, um die Membran aufzunehmen, und sich dann schließen lassen, so daß die Membran für Verarbeitungsoperationen befestigt ist. Eine solche Kammer 80"' ist in den Figuren 10, 11 und 12 zu sehen, die in dieser Reihenfolge nacheinander zeigen, wie ein Rahmen 90 eingesetzt wird. Die Dichtungen 408 und 408' liegen am Rahmen 90 an, wenn die Teile geschlossen werden, so daß sie die Kammer 80"' vollständig umschließen und flüssigkeitsdicht verschließen. Die mit Scharnieren versehenen Teile 402 und 404 sind jeweils auf einem Stab 410 bzw. 412 montiert, und jeder solche Stab befindet sich in einer Kurvenschiebernut 414 bzw. 416 in einem doppelseitigen Rahmen 418. Die Kurvenschiebernute 416, von denen es einen auf jeder Seite des Rahmens 418 gibt, wie oben angegeben, sind zum Scharnier 406 hin geneigt (oder gekrümmt). Die Schlitze 414 sind vertikal. Durch die Konvergenz der Schlitze 414 und 416 werden die Teile 402 und 404 umschlossen, wenn ein Rahmen 90 nach unten geschoben wird (siehe Figur 11, die einen teilweisen Einschub zeigt), bis die Kammer 80"' bei vollem Einschub dicht verschlossen ist. Siehe Figur 12. Das Schieben erfolgt durch die Klammer 108, die wie zuvor beschrieben mit dem Rahmen 90 verschränkt ist. Die Abwärtsbewegung der Kammer 80"' drückt die Rückholfeder 420 zusammen. Wenn die Kammer 80"' vollständig eingeschoben ist, wie in Figur 12 zu sehen, wird die Kugel 422 der Kugelauslösung 424 in eine Vertiefung (nicht gezeigt) auf der Seite der Kammer 80"' gestoßen und gegen den nach oben gerichteten Druck der zusammengedrückten Feder 420 in Position gehalten. Gegebenenfalls können mechanische Einrichtungen, wie solenoidal zusammengedrückte Federn, bereitgestellt werden, um den Teilen 402 und 404 eine weitere Schließkraft zu vermitteln, wenn sie sich in der vollständig geschlossenen Position befinden. Wenn die Klammer 108 nach oben bewegt wird, werden ausreichend Kräfte erzeugt, um die Kugelauslösung 424 zu überwinden, während ein Rahmen 90 durch die Dichtungen 408 und 408' gehalten wird. Wenn sich die Teile 402 und 404 öffnen, bringt die Feder 420 die Kammer 80"' in die in Figur 10 gezeigte Position zurück.
Wir beziehen uns nun auf Figur 5. Flüssigkeiten werden zugeführt, und die Zelle 200 wird am Boden durch eine Vielzahl von Verteilungslöchern 212, die die Flüssigkeit über die Breite der Zelle verteilen und von einem Verteilerstück 210 gespeist werden, entleert. Zusätzlich umfaßt die Einrichtung (d) zum Entnehmen von Flüssigkeit aus der Kammer 80 während der Zirkulation der Flüssigkeit paarweise vorhandene Verteilerstücke 208, die so positioniert sind, daß die Flüssigkeit aus der Kammer 80 durch eine Vielzahl beabstandeter Verteilungslöcher 206 abläuft, so daß die Flüssigkeit die erste und die zweite Seite der Membran in gleichmäßiger Strömung berührt. Die Verteilerstücke 208 und 210 sind mit einer Vielzahl von Flüssigkeitsquellen verbunden. Dazu gehören wenigstens eine Behandlungsflüssigkeit sowie typischerweise wenigstens eine Waschflüssigkeit.
Dosierungseinrichtungen (e) können ebenfalls in Fluidverbindung mit den Verteilerstücken 210 positioniert sein. Dosierungseinrichtungen dienen dazu, Flüssigkeiten von einer Anzahl von Flüssigkeitsquellen zu übertragen, ohne daß es zu einer Kreuzkontamination kommt. Sie dienen auch dazu, Flüssigkeit innerhalb der Kammer 80 zu zirkulieren Diese Zirkulation kann durch die Aufnahme von Pumpeinrichtungen (f) in das System unterstützt werden. Die Pumpeinrichtungen (f) wären in Fluidverbindung mit den Verteilerstücken 208 und 210 und würden Flüssigkeiten von Verteilerstück 208 zu 210 und umgekehrt zirkulieren lassen. Außerdem können die Tätigkeiten des gesamten Systems durch Steuereinrichtungen, wie einen Computer, koordiniert werden.
Elektrische Heizgeräte 214, eines auf jeder Seite, werden in den Hohlräumen 216 gehalten. Thermoelemente, nicht gezeigt, regeln die Zellentemperatur auf zuvor eingestellte Werte. Die Umlaufpumpe 83 (vorzugsweise eine reversierbare Zahnradpumpe) ist auf der Kammer 80 montiert, so daß das Rohrsystem 82 einschließlich des Ventils 81 (das ebenfalls auf der Kammer 80 montiert ist) kurz ist und eng an die Zelle 200 gekoppelt ist.
Wir beziehen uns nun auf Figur 2. Die Zellen 20 des Behälters 18 werden von der Saugnadel 26 versorgt, die sich unter der Kontrolle der Steuervorrichtung 300 linear bewegt, wie es durch den Doppelpfeil gezeigt ist. Man beachte, daß die Steuervorrichtung elektrisch mit allen elektrisch betriebenen oder gesteuerten Vorrichtungen verbunden ist, wie es durch die gestrichelten Linien gezeigt ist. Die Nadel 26 wird auch unter Kontrolle vertikal bewegt, wie oben besprochen wurde. Die Nadel 26 ist durch einen Metallschlauch 36 mit dem elektrisch gesteuerten Ventil 38 und von dort durch das Rohr 40 mit der Spritzenpumpe 61 verbunden. Das Ventil 38 ist außerdem über das Rohr 42 mit dem Verteilerstück 210 und dem Rohrsystem 82 wenigstens einer Membranverarbeitungskammer 80 (die oben im einzelnen beschrieben wurde) verbunden. Das Ventil 81 ist außerdem selektiv über das Rohr 78 mit dem Abfallbehälter verbunden. In der Figur könnte das Ventil 81 je nach den Entleerungserfordernissen über oder unter die Umlaufpumpe 83 (und vorzugsweise auf beide Positionen) positioniert werden. Das Ventil 38 ist außerdem selektiv über das Rohr 44 mit der Waschflüssigkeitsvorratsflasche 34, über das Rohr 48 mit der Waschflasche zur Verwendung nach der Hybridisierung 52 und über das Rohr 54 mit der Waschflasche zur Verwendung nach der Konjugation 56 verbunden.
Die Verfahrensschritte bei der Membranbehandlung sind nacheinander:
Nadel und Kammer vorreinigen; Membran einsetzen; Denaturieren; Hybridisieren; Waschung nach der Hybridisierung; Blockieren; Konjugieren; Waschung nach der Konjugation; Spülen mit Wasser; Behandeln mit Assaypuffer; Behandeln mit Substrat; und Herausnehmen der Membran.
Tabelle 1 gibt die Verarbeitungsvorschrift einschließlich der Zusammensetzung und des Volumens der Lösung und der Dauer der Behandlung an.
Alle Schritte außer der Anfangsreinigung erfordern, daß die Kammer auf eine geregelte Temperatur geheizt wird. Wie man sehen wird, wird eine Reihe von Prozeduren bei 65ºC durchgeführt, worauf Schritte bei 37ºC folgen. Wir stellen Heizeinheiten 214 mit assoziierten Thermoelementen bereit. Der hier verwendete Heizer ist ein Minco HK5164R78.4L122B von Minco aus Minneapolis, MN. Das Thermoelement ist ein Self-Adhesive Thermocouple Assembly No. M951-K, das von Marlin Manufacturers Co., Cleveland, OH, geliefert wurde. Beide werden an ein 1/8 inch dickes Aluminiumblech geklebt. In empirischen Untersuchungen haben wir gefunden, daß eine Einstellung der Temperaturregelung auf 72ºC die gewünschte Kammertemperatur von 65ºC ergibt und daß eine Einstellung von 39-40ºC 37ºC ergibt. Alternativ dazu kann ein Heizsystem verwendet werden, das die tatsächliche Temperatur mißt.
Bei der Verwendung werden die Reagensbehälter 18 mit den Zellen 20 versehen, die wie folgt von links nach rechts eingesetzt werden, wie man in Figur 2 erkennt:
Denaturierung; Sonde; Blockierung; Konjugat; Assay; Substrat; leer; leer; und leer.
Die drei leeren Zellen werden so bereitgestellt, daß man wahlweise auch eines oder mehrere der Reagentien lyophilisieren kann. In diesem Fall würde man ein Reagens, wie die Sonde und/oder das Konjugat, gefriertrocknen, um seine Lagerbeständigkeit zü verbessern, und in situ rekonstituieren, indem man die entsprechende Flüssigkeit aus einer der zur Zeit leeren Zellen überträgt, und durch abwechselndes Ansaugen und Entleeren durch die Nadel 26 mischen.
Ein typischer Kreislauf ohne die Verwendung eines Rekonstitutionsverfahrens wird beschrieben:

Nadel und Kammer vorreinigen

Der Heizer wird angeschaltet (so daß er 65ºC ergibt). Die Kammer 80 und die Spritzenpumpe 61 werden mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Spritzenpumpe 61 saugt über die Rohre 44, 40 und das Ventil 38 Flüssigkeit aus dem Waschwasserbehälter 34. Die Nadel 26 wird seitwärts und hinunter in den Napf 72 bewegt (siehe Figur 2), und das Ventil 38 verbindet sie über die Rohre 36, 40 mit der Spritzenpumpe 61. Durch eine kurze Entleerung werden das Rohr und das Innere der Nadel 26 gesäubert. Dann wird die Nadel 26 nach oben, seitwärts und hinunter in Napf 70 bewegt, wo eine weitere Entleerung die Außenseite reinigt. Das Ventil 38 verbindet die Nadel 26 mit der Spritzenpumpe 61 über die Rohre 36 und 40. Die Spritzenpumpe 61 saugt Flüssigkeit aus dem Behälter 34 und entleert sie in die Kammer 80. Die Pumpe 83 zirkuliert die Waschflüssigkeit im lokalen Kreislauf des Rohres 82 und des Ventils 81, und dann wird das Ventil betätigt, so daß die Flüssigkeit in das Rohr 78 und in den Abfallbehälter geleitet wird. Dies wird vorzugsweise zweimal wiederholt. Anmerkung: im folgenden wird dieser Schritt als "spritzen/Nadel-Waschung" bezeichnet.

Membran einsetzen

Der Operator setzt eine Membran, die übertragene Molekülfragmente trägt, in eine Zelle 200 einer Kammer 80 ein.

Denaturieren

Die Nädel 26 bewegt sich seitwärts und hinunter in die Denaturierungsflüssigkeit. Die Spritzenpumpe 61, die über Rohr 40, Ventil 38 und Rohr 36 verbunden ist, füllt sich mit 22 ml Flüssigkeit. Die Spritzenpumpe 61, die über Rohr 40, Ventil 38 und Rohr 42 verbunden ist, füllt abwechselnd die Kammer 80, entleert sie, füllt sie, entleert sie und füllt sie. Anmerkung: Dieses Mischen ist für alle solche Beladungen programmiert und wird in den weiteren Schritten einfach als "füllt und entleert zweimal" beschrieben. Dann wird die Kammer durch die Pumpe 81 und das Rohr 78 in den Abfallbehälter entleert.

Waschen

Die Spritzenpumpe 61 wird mit entionisiertem Wasser gewaschen, indem man sie über Rohr 40, Ventil 38 und Rohr 44 füllt und über Rohr 40, Ventil 38 und Rohr 36 in Nadel 26 (die hoch und seitwärts und hinunter in die Waschstation 50 bewegt worden ist) durch die Waschstation 50 und das Rohr 76 in den Abfallbehälter entleert. Anmerkung: Dieses Waschen erfolgt nur einmal und ist nach jeder Operation programmiert und wird im folgenden als "Sprit zen/Nadel-Waschung" bezeichnet.

Hybridisieren

Nadel 26 wird angehoben, seitwärts bewegt und in die Hybridisierungszelle gesenkt, und die Spritzenpumpe 61 saugt 22 ml der Flüssigkeit an und füllt und entleert die Kammer 80 zweimal wie zuvor. Eine Spritzen/Nadel-Waschung wird durchgeführt. Nach 40 Minuten entleert das Ventil 81 die Kammer 80 wie zuvor in den Abfallbehälter. Eine Spritzen/Nadel-Waschung wird durchgeführt. Der Heizer wird auf den unteren Einstellungspunkt 37ºC neu eingestellt.

Waschung nach der Hybridisierung

Die Spritzenpumpe 61 ist über Rohr 48, Ventil 38 und Rohr 40 mit dem Behälter 52 verbunden, füllt sich und entleert sich dann über Rohr 40, Ventil 38 und Rohr 42 in die Kammer 80. Das Waschen wird sichergestellt, indem man drei 37-ml-Portionen Waschflüssigkeit jeweils 150 Sekunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 400 ml pro Minute rezirkulieren läßt. Dann wird eine Spritzen/Nadel- Waschung durchgeführt.

Blockieren

Die Nadel 26 und die Spritzenpumpe 61 saugen Flüssigkeit aus der Blockierungszelle 20 und füllen und entleeren die Kammer 80 zweimal. Dann wird eine Spritzen/Nadel-Waschung durchgeführt. Nach einer Behandlung von fünf Minuten wird über die Umlaufpumpe 83, das Ventil 61 und das Rohr 78 in den Abfallbehälter entleert.

Konjugatinkubation

Die Konjugatinkubation wird durch die Nadel 26 und die Spritzenpumpe 61 durchgeführt, die aus der entsprechenden Zelle 20 zieht. Die Kammer 80 wird zweimal gefüllt und entleert, und anschließend wird eine Spritzen/Nadel-Waschung durchgeführt. Nach 30 Minuten wird über das Ventil 81 und das Rohr 78 in den Abfallbehälter entleert.

Waschung nach der Konjugation

Die Spritzenpumpe 61 ist über Rohr 40, Ventil 38 und Rohr 54 mit dem Behälter 56 und dann über Rohr 40, Ventil 38 und Rohr 42 mit der Kammer 80 verbunden. Das Waschen wird sichergestellt, indem man drei 37-ml-Portionen Waschflüssigkeit jeweils 150 Sekunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 400 ml pro Minute rezirkuheren läßt. Dann wird eine Spritzen/Nadel-Waschung durchgeführt.

Spülen mit Wasser

Die Kammer wird zwei Durchflußwaschungen unter Verwendung der Spritzenpumpe 61 unterzogen (Ein- und Ausströmen mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 ml pro Minute), wobei schließlich unter Verwendung der Umlaufpumpe 83 entleert wird.

Behandeln mit Assaypuffer

Die Nadel 26 wird so gesteuert, daß sie Assaypuffer aus der entsprechenden Zelle 20, Rohr 36, Ventil 38, Rohr 40 und Spritzenpumpe 61 aufnimmt. Dann wird die Kammer 80 unter Verwendung der Pumpe a, des Ventils 38 und der Rohre 40, 42 zweimal gefüllt und entleert und über die Umlaufpumpe 83, das Ventil 81 und das Rohr 78 in den Abfallbehälter entleert. Anschließend erfolgt eine Spritzen/Nadel-Waschung.

Substratinkubation

Die Kammer 80 wird wie oben zweimal gefüllt und entleert, wobei jedoch Substrat aus der entsprechenden Zelle 200 gezogen wird. Nach 5 Minuten zur Behandlung wird eine Spritzen/Nadel-Waschung durchgeführt. Über die Umlaufpumpe 83, das Ventil 81 und 78 wird in den Abfallbehälter entleert.

Herausnehmen der Membran

Das Verarbeiten einer Membran nach dem obigen Verfahren dauert etwa 2 Stunden. Wie beschrieben behandelte gerahmte Membranen können dann entnommen und zu einem Nachweismodul übergeführt werden, in dem eine CCD-Kamera die Chemilumineszenzsignale mißt, die digitalisiert und in einem computerisierten Identifizierungssystem verwendet werden. Dies wird nach irgendeinem einer Vielzahl herkömmlicher Verfahren erreicht, was dem Fachmann geläufig ist. Tabelle 1 Membranverarbeitungsvorschrift
* 22 ml ist die aktive Menge.
¹ Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, von Biorad Laboratories, Richmond, CA
² 4-Methoxy-4-(3-phosphatphenyl)spirol[1,2-dioxetan-3,2'- adamantin]-Dinatriumsalz, von Lumigen, Inc., Detroit, MI
Die obigen Tests wurden unter Verwendung von Biodyne -Transfermembranen, Teil Nr. BNBZF3RT, einem Handelsprodukt von Pall Biosupport Division, Glencove, NY, durchgeführt.

Claims

1. Vorrichtung für die Flüssigkeitsbehandlung einer Membran (92) mit einer ersten und einer zweiten Seite und einem Bereich, der ein latentes Blotting-Bild enthält,umfassend:

(a) eine Verarbeitungskammer (80), die den Bereich, der das latente Blotting-Bild der Membran (92) enthält, in einer Zelle (200) umschließt, wobei die Zelle (200) einen Eintrittsanschluß und einen Austrittsanschluß hat;

(b) Einrichtungen zum Einführen von Flüssigkeit in die Zelle (200) durch den Eintrittsanschluß in einer ausreichenden Menge, um den Bereich der Membran (92), der das latente Blotting-Bild enthält, ganz zu bedecken;

(c) Einrichtungen zum Zirkulieren der Flüssigkeit innerhalb der Zelle; und

(d) Einrichtungen zum Entnehmen von Flüssigkeit aus der Kammer durch den Austrittsanschluß;

dadurch gekennzeichnet, daß

(e) es sich bei Einrichtung (b) um eine Spritzenpumpe (61) in ventilvermittelter Fluidverbindung mit dem Eintrittsanschluß (230 oder 232) handelt;

(f) es sich bei Einrichtung (c) um eine Umlaufpumpe (83) in ventilvermittelter Fluidverbindung mit dem Eintrittsanschluß (230 oder 232) handelt, die entweder mit einem Verteilerstück (210) über die volle Breite der Zelle (200) in Fluidverbindung mit einer Vielzahl von Verteilungslöchern (212) in regelmäßigen Abständen oder mit einem Verteilerstück (234), das die Flüssigkeit zweidimensional in einer Mischkammer (234') ausbreitet, wobei sie gegebenenfalls durch eine Verteilungsplatte (238) fließt, die eine Vielzahl von Verteilungslöchern (236) mit kleinem Durchmesser aufweist, verbunden ist;

(g) es sich bei Einrichtung (d) um die Umlaufpumpe (83) handelt, in ventilvermittelter Fluidverbindung entweder mit einander gegenüberliegenden Anordnungen von Verteilungslöchern (206) in regelmäßigen Abständen in Fluidverbindung mit paarweise vorhandenen Verteilerstücken (208) oder mit einander gegenüberliegenden Wehren (218, 220), die Sammelbehälter (222, 220) speisen, die zu paarweise angeordneten Äustrittsöffnungen (226, 228) führen, so daß die Flüssigkeit gleichmäßig über die erste und die zweite Seite der Membran und den Bereich, der das latente Blotting-Bild enthält, fließt;

(h) die Membran in einem Rahmen gehalten wird.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Verarbeitungskammer (a) weiterhin einen ersten und einen zweiten Einschlußteil in einander gegenüberliegender Verbindung umfaßt, wobei die in einem Rahmen gehaltene Membran entlang wenigstens einer Umfangskante davon dazwischen gehalten wird.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 2, wobei der erste und zweite Einschlußteil in Scharnierweise miteinander verbunden sind, so daß die Einschlußteile eine offene Position haben, so daß die in einem Rahmen gehaltene Membran aufgenommen werden kann, und eine geschlossene Position haben, so daß die in einem Rahmen gehaltene Membran dazwischen festgehalten wird.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Verarbeitungskammer (a) weiterhin eine Einrichtung zum Bewegen der in einem Rahmen gehaltenen Membran in die Kammer (a) und aus der Kammer (a) umfaßt.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, wobei die Einrichtung zum Bewegen der in einem Rahmen gehaltenen Membran wenigstens ein Paar einander gegenüberliegender Walzen umfaßt, die in geeigneter Weise relativ zu der Verarbeitungskammer (a) gelagert sind und die die in einem Rahmen gehaltene Membran entlang einer Umfangskante davon dazwischen halten und die zusammenwirken, so daß die Membran zur Verarbeitungskammer (a) hin oder von dieser weg verschoben wird.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, wobei die Einrichtung zum Bewegen der in einem Rahmen gehaltenen Membran eine oder mehrere Klammern umfaßt, die in geeigneter Weise relativ zu der Verarbeitungskammer (a) gelagert sind und die die in einem Rahmen gehaltene Membran festhalten und die so wirken, daß die Membran zur Verarbeitungskammer (a) hin oder von dieser weg verschoben wird.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Einrichtung (b) zum Einführen von Flüssigkeit in die Kammer eine Vielzahl von Verteilerstücken (i) umfaßt, die so positioniert sind, daß Flüssigkeit mit der ersten und der zweiten Seite der Membran in Kontakt steht, und die Einrichtung (d) zum Entnehmen von Flüssigkeit ein oder mehrere Verteilerstücke (ii) umfaßt, die so positioniert sind, daß Flüssigkeit aus der Kammer abläuft.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei die Verteilerstücke (i) jeweils gezielt mit einer Vielzahl von Flüssigkeitsquellen verbunden sind.

9. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, wobei die Flüssigkeitsquellen wenigstens eine Behandlungsflüssigkeit umfassen.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, wobei die Flüssigkeitsquellen wenigstens eine Waschflüssigkeit umfassen.

11. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, die weiterhin Dosierungseinrichtungen (e) umfaßt, die in Fluidverbindung mit den Verteilerstücken (ii) positioniert sind und Flüssigkeiten aus einer Vielzahl von Flüssigkeitsquellen ohne Kreuzkontamination übertragen und Flüssigkeit in der Kammer zirkulieren.

12. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, die weiterhin Pumpeinrichtungen (f) umfaßt, die in Fluidverbindung mit den Verteilerstücken (i) und (ii) positioniert sind und so angepaßt sind, daß sie Flüssigkeiten aus Verteilerstück (i) bzw. (ii) zu Verteilerstück (ii) bzw. (i) zirkulieren.

13. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, die über Steuereinrichtungen betrieben wird.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Einrichtung (b) zum Einführen von Flüssigkeit in die Kammer wenigstens ein Verteilerstück (1) umfaßt, das so positioniert ist, daß Flüssigkeit mit der ersten und der zweiten Seite der Membran in Kontakt steht, und die Einrichtung (d) zum Entnehmen von Flüssigkeit ein Paar Überlaufwehre (ii) umfaßt, die so positioniert sind, daß Flüssigkeit gleichmäßig von beiden Seiten der Membran aus der Kammer abläuft.