DE69217969T2

DE69217969T2 - METHODE UND LöSUNG ZUR BESTIMMUNG DER WIRKUNGSDAUER EINER AUF DIE HORNHAUT AUFGEBRACHTEN SUBSTANZ

Info

Publication number: DE69217969T2
Application number: DE69217969T
Authority: DE
Inventors: Abhay Joshi; David Meadows; Jerry Paugh
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1992-09-08
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2012-09-09
Also published as: ATE149310T1; ES2100362T3; DE69217969D1; AU2670892A; WO1993005699A1; US5634458A; US5323775A; EP0603338A1; EP0603338B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Messen der Retentionszeit, d.h. der Zeit, über die ophtalmische Formulierungen auf der Oberfläche von einem Auge zurückgehalten werden.
Die Messung der Retentionszeit von ophthalmischen Formulierungen in dem Auge ist wichtig für die Optimierung von neuen Arten der ophthalmischen Dosierung und Gelsysteme zum Eintropfen, die pharmazeutische Mittel zur Behandlung vieler Zustände des Auges zusätzlich zum Befeuchten der Kontaktlinsen, der Heilung der Wunden und der unterstützten Freisetzung von Arzneimittel enthalten.
Bisher schließt eines der üblichsten Verfahren, welches für die Messungen der Retentionszeit verwendet wird, den Einsatz von Natrium Fluorescein ein, das einer ophthalmischen Formulierung zugesetzt wird und in den Tränensack von einem Tier oder einem Menschen eingefügt wird, um einen dünnen Film auf der Oberfläche von dem Auge auszubilden. Das Fluoreszenzsignal wird dann über die Zeit verfolgt, indem Spaltlampen mit Fluorophotometer verwendet werden. Unglücklicherweise wird dieses Natrium Fluorescein rasch von dem Film durch zwei vorherrschende Mechanismen entfernt: Es wird aus dem Auge durch neue Sekretion von Tränen ausgewaschen, oder es diffundiert, weil es ein relativ kleines Molekül ist, in das Gewebe des Auges und wird danach in dem systemischen Kreislauf absorbiert. Der zweite Typ der Eliminierung von dem Natrium Fluorescein aus dem dünnen Film ist eine Quelle von Irrtümern bei den Messungen der Retentionszeit, da es schwierig ist, zwischen Fluoreszenz des dünnen Films von der Fluoreszenz des Gewebes zu unterscheiden.
Dem Bemühen, die Diffusion von Fluorescein zu verhindern, sind Veranstaltungen unternommen worden, die Viskosität der eingefügten optischen Formulierungen zu erhöhen, was dazu führte, daß das Fluorescein länger in dem vor der Hornhaut gelegenen Tränenfilm (PTF) zurückgehalten wird (siehe Benedetto, D.A.; Sha, D.O.; und Kaufman, H.E., "The instilled fluid dynamics and surface chemistry of polymer in the preocular tear film", Investigative Ophthalmology, Dec. 1975). Obwohl der in Bezug genommene Artikel zeigt, daß die Retention von Fluorescein um einen leichten Betrag mit ansteigender Viskosität des Trägers ansteigt, spielt die Diffusion von Fluorescein in das Gewebe des Auges tatsächlich eine größere Rolle für die Eliminierung von Fluorescein von dem PTF, wie die Retentionszeit des Trägers ansteigt. Es ist auch in dem Artikel von Benedetto et al. berichtet worden, daß es wenig Verständnis für die relative Wichtigkeit der Rolle gibt, die jede physicochemische Eigenschaft von dem Polymer für die Eigenschaften der Retention von den Lösungen des Polymers spielt, und es ist wahrscheinlich, daß in jedem Fall verschiedene Eigenschaften eine größere Wichtigkeit für die Bestimmung der gesamten Retentionszeiten spielen.
Deshalb ist es nicht praktikabel, zu vorgeschlagenen oder vorhandenen Formulierungen für das Auge Bildner der Viskosität zuzusetzen, um die Diffusion von Fluorescein stark zu reduzieren, wenn die Retentionszeit von Formulierungen für das Auge gemessen und bewertet werden soll. Es ist auch sehr gut bekannt, daß durch Erhöhung der Viskosität der Formulierung für das Auge in einer Reizung des Auges und/ oder verschwommenen Visus führen kann. Deshalb reagieren Versuchspersonen/ Tiere typischerweise durch forciertes Blinzeln, wobei die Formulierung aus dem Sack der Bindehaut herausgedrückt wird und der Abfluß von der fluoreszierenden Nachweissubstanz beschleunigt wird.
Dies ist besonders zutreffend im Vergleich beim Testen von Formulierungen für das Auge, da, wie berichtet wurde, zugesetzte Bildner der Viskosität nicht einheitlich die Eigenschaften von Formulierungen für das Auge verbessern und deshalb Vergleichsversuche nicht sehr zuverlässig machen.
Es ist wichtig, sich zu vergegenwärtigen, daß mit oder ohne Bildner der Viskosität dieser Art, die Rate der Diffusion von Fluorescein aus dem PTF ernsthaft die Genauigkeit der Messung der Retentionszeit beschränkt.
Weil es keine Bindung zwischen Fluorescein und Polymeren gibt, diffundiert das Fluorescein frei in dem viskosen Träger (Ludwig, A; Unler, N., und Vanooteghem, M., "Evaluation of viscous ophthalmic vehides containing carbomer by slit-lamp fluorophotometry in humans", International Journal of Pharmaceutics, S. 15-25, Bd. 61, 1990. Und obwohl der Kohlenstoff-Polymer der spezifischen Untersuchung in dem Artikel von Ludwig die Retention von Natrium Fluorescein am Auge erhöhte, war die Retentionszeit kleiner als zehn Minuten.
Andere Verfanren für die Messung der Retentionszeiten von ophthalmischen Formulierungen im Auge schließen die Gamma-Scintigraphie ein. Diese Methoden beinhalten jedoch die Verwendung von Radioisotopen und machen deshalb teure Ausrüstung und ein Labor notwendig, das für die Behandlung von radioaktiven Substanzen geeignet ist. Wegen der spezialisierten Ausrüstung, die notwendig ist, Untersuchungen dieser Art durchzuführen, ist es für ein typisches Labor nicht kosten-effektiv, Messungen mit ihren okularen Formulierungen zu machen. Ebenso haben radioaktive Stoffe typischerweise geringe Molekulargewichte, so daß sie auch frei aus dem viskosen Träger hinein in das Gewebe des Auges diffundieren können oder auf den Rändern des Augenlides abgelagert werden können, was in fehlerhaften Messungen der Retention resultieren wird.
Deshalb gibt es einen Bedarf an einer Vorrichtung und an einem Verfahren,das für die Verwendung durch unabhängige Laboratorien geeignet ist, so daß wichtige quantitative Messungen in ihrer Entwicklung von neuen ophthalmischen Formen der Dosierung und Formulierungen gemacht werden können.Die Vorrichtung und das Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind für Anwendungen dieser Art geeignet und die optische Detektionsvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann tatsächlich leicht an vorhandene Spaltlampen befestigt und von diesen getrennt werden. Dies hat einen eindeutigen Vorteil für Kliniker, die die Leistung von einer spezifischen ophthalmischen Formulierung für einen besonderen Patienten mit Erkrankung ermitteln wollen. Weil beschränkte, zusätzliche Ausrüstung notwendig ist, um die Messungen zu machen, sind die Mehrkosten für die klinische Praxis minimal.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem ersten Grundgedanken stellt die Erfindung ein Verfahren zum Messen der Retentionszeiten von einer ophthalmischen Formulierung auf der Oberfläche von einem Auge bereit, wobei dieses Verfahren die folgende Schritte umfaßt:
ein fluoreszierendes Makromolekül, das ein Molekulargewicht von mehr als 2.000 Daltons hat, wird in einer ophthalmischen Formulierung gelöst, um eine durch Fluoreszenz markierte Formulierung zu bilden, wobei das Molekulargewicht von mehr als 2.000 Daltons die Diffusion von dem fluoreszierenden Makromolekül aus dem dünnen Film während der Belichtung des Auges verhindert und die Messung der Retentionszeiten der Formulierung für wenigstens 175 Minuten ermöglicht;
die durch Fluoreszenz markierte Formulierung wird oberflächlich auf ein Auge aufgebracht, wobei diese durch Fluoreszenz markierte Formulierung auf der Oberfläche des Auges einen dünnen Film ausbildet;
das Auge wird beleuchtet, um Fluoreszenz der durch Fluoreszenz markierten Formulierung hervorzurufen, während der dünne Film aus durch Fluoreszenz markierter Formulierung von dem Auge durch normales Blinzeln und Tränentätigkeit eliminiert wird; und
die Fluoreszenz von dem dünnen Film wird als eine Funktion der Zeit gemessen.
In einem anderen Grundgedanken ergibt die Erfindung eine ophthalmische Formulierung für die Messung der Retention der ophthalmischen Formulierung in einem Auge, wobei diese ophthalmische Formulierung ein pharmazeutisches Mittel für ein Auge und ein fluoreszierendes Makromolekül beinhaltet, das ein Molekulargewicht von mehr als ungefähr 2.000 Daltons hat.
Die Vorrichtung für die Messung der Retention der ophthalmischen Formulierung auf der Oberfläche von dem Auge schließt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung im allgemeinen Mittel zur Unterstützung der Versuchsperson (des Versuchstieres) und zur Ermöglichung des Zutritts von Licht zu dem Auge der Versuchsperson (des Versuchstieres), sowie Einrichtungen zur Beleuchtung des Auges von der Versuchsperson (des Versuchstieres) ein. Wichtig ist, daß die Mittel zur Erleuchtung des Auges der Versuchsperson (des Versuchstieres) Filtereinrichtungen für die Beleuchtung des Auges der Versuchsperson (des Versuchstieres) mit Licht von einem ausgewählten Bereich der Frequenz beinhalten, um Fluoreszenz von einer fluoreszierenden Formulierung hervorzurufen, die oberflächlich auf die Oberfläche von dem Auge der Versuchsperson (des Versuchstieres) aufgetragen wird und einen dünnen Film darüber bildet. Wie nachfolgend in größerer Genauigkeit beschrieben wird, können die Filtereinrichtungen in eine gewöhnliche Spaltlampe eingebaut werden, wodurch es möglich wird, daß die Vorrichtung aus einem üblichen System einer Spaltlampe erstellt wird, wobei die Gesamtkosten der Vorrichtung reduziert werden.
Zusätzlich schließt die Vorrichtung, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, Messeinrichtungen für den dünnen Film von fluoreszierendem Licht ein, wobei diese Einrichtungen Filtereinrichtungen zur Unterbindung des Messens von Hintergrund- Licht- Signalen einschließt, die "verrauschte" Fluoreszenz- Signale hervorrufen können.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung für das Messen der Retention der ophthalmischen Formulierung auf der Oberfläche von einem Auge schließt im allgemeinen die Schritte ein, daß das fluoreszierende Makromolekül in einer ophthalmischen Formulierung gelöst wird, so daß eine durch Fluoreszenz markierte Formulierung gebildet wird und danach die durch Fluoreszenz markierte Formulierung oberflächlich auf das Auge gegeben wird, worauf die durch Fluoreszenz markierte Formulierung einen dünnen Film vor der Hornhaut auf der Oberfläche des Auges bildet.
Danach wird das Auge beleuchtet, um Fluoreszenz der durch Fluoreszenz markierten Formulierung hervorzurufen, wobei der dünne Film der durch Fluoreszenz markierten Formulierung von dem Auge durch normales Blinzeln und Tränentätigkeit entfernt wird. Während dieser Zeit wird die Fluoreszenz von dem dünnen Film gemessen.
Im einzelnen schließt das Verfahren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung den Schritt ein, daß ein fluoreszierendes Makromolekül in der ophthalmischen Formulierung gelöst wird, wobei das fluoreszierende Makromolekül ein ausreichend großes Molekulargewicht hat (das heißt größer als 2.000 Daltons), damit die Diffusion desselbigen aus dem dünnen Film während der Beleuchtung des Auges verhindert wird, und dadurch die Messung der Fluoreszenz von nur dem dünnen Film vor der Cornea sichergestellt wird. Die Diffusion in das Gewebe des Auges wird durch die große Größe des fluoreszierenden Makromoleküles verhindert, und vorzugsweise wird die Diffusion des Makromoleküles aus dem dünnen Film durch Verwicklungen zwischen dem Makromolekül und dem großen Molekulargewicht des Auszugsmittels in der Formulierung verhindert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt das Verfahren des weiteren den Schritt ein, daß ein fluoreszierender Stoff mit einem Molekulargewicht von weniger als 2.000 Daltons an einen Stoff kovalent angebracht wird, um ein fluoreszierendes Makromolekül zu bilden.
In Kombination umfaßt die vorliegende Erfindung auch ein System zur Messung der Retention von ophthalmischen Formulierungen auf der Oberfläche von einem Auge, das wenigstens eine durch Fluoreszenz markierte ophthalmische Formulierung, die ein fluoreszierendes Makromolekül enthält, das ein Molekulargewicht von mehr als ungefähr 2.000 Daltons hat, Einrichtungen zur Beleuchtung des Auges und zum Erzeugen einer Fluoreszenz von der durch Fluoreszenz markierten ophthalmischen Formulierung, wenn dieselbige oberflächlich auf ein Auge gegeben wird, und Einrichtungen für die Messung der Fluoreszenz von der oberflächlich aufgebrachten durch Fluoreszenz markierten ophthalmischen Formulierung einschließt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Der Vorteil und die Eigenschaften der vorliegenden Erfindung erscheinen von der folgenden Beschreibung, wenn sie im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet wird, in welchen:
Figur 1 ein Schema der Vorrichtung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist, das im allgemeinen eine Halterung für eine Versuchsperson (ein Versuchstier) zeigt, die die Beleuchtung von einem Auge mit einer Quelle aus Licht ermöglicht, so daß Fluoreszenz von einer fluoreszierenden Formulierung hervorgerufen wird, die auf der Oberfläche von einem Auge aufgebracht ist, zusammen mit einem Empfänger zur Messung der Fluoreszenz, die von dem Auge emittiert wird.
Figur 2 eine schematische Darstellung von einem Empfänger für Fluoreszenz- Licht von einem Auge von einer Versuchsperson (von einem Versuchstier) ist, die eine Anordnung einer Linse zeigt;
Figur 3 eine graphische Darstellung ist, die die Auswirkung von verschiedener Viskosität von Hydroxy Propyl Methyl Cellulose (HPMC) und Poly Vinyl Alkohol (PVA) auf die Retention von Fluorescein in dem PTF aufzeigt; und
Figur 4 - 5 graphische Darstellungen sind, die Messung der Retentionszeiten von ophthalmischen Formulierungen in Kaninchen für bis zu 175 Minuten durch fluoreszierende Makromoleküle der vorliegenden Erfindung ermöglicht werden.

Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen

Indem nun zu Figur 1 gegangen wird, wird dort die Vorrichtung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gezeigt, die im allgemeinen eine Basis 12 und eine Halterung 14 für eine Versuchsperson (ein Versuchstier) einschließt, die daran angebracht ist, die ein Hilfsmittel zum Halten von einer Versuchsperson (Versuchstier) bereitstellt und den Zugang von Licht zu dem Auge 16 von der Versuchsperson (von dem Versuchstier) ermöglicht.
Es ist zu erkennen, daß die Halterung 14 von irgendeinem gewöhnlichen Typ sein kann und die Elemente 18 einschließt, die üblicherweise zum Halten von entweder einem menschlichen oder einem tierischen Kopf angeglichen sind, und eine Halterung für ein Kinn oder dergleichen einschließen. Im Falle einer menschlichen Versuchsperson kann die Halterungsgruppe 14 eine Stimhalterung 22 für einen Ständer 24 zur Stützung der Halterung 20 bei geeigneter Höhe beinhalten.
Eine Licht- Projektions- Baugruppe 30 schließt eine Lichtquelle 32 und Linsen 34 zusammen mit einem Spiegel 36 ein, die zusammen Einrichtungen zur Beleuchtung des Auges 16 der Versuchsperson (des Versuchstieres) durch Licht mit einem ausgewählten Frequenzbereich bereitstellen, um Fluoreszenz einer fluoreszierenden Lösung hervorzurufen, die oberflächlich auf die Oberfläche des Auges einer Versuchsperson (eines versuchstieres) aufgebracht wird.Die Durchlasskennlinien des Filters hängen selbstverständlich von der Frequenz zum Anregen des fluoreszierenden Stoffes ab, und als ein Beispiel für die Verwendung mit fluoreszierenden Stoffen, die hier nachher besprochen werden, wurde ein geeigneter Erregungs- Interferrenz- Filter, wie zum Beispiel ein Filter mit einer Wellenlänge von 490 nm mit einer Bandbreite von 10 nm, den speziell Omega Optical of Brattleboro, Vermont, herstellt, verwendet. Eine optische Standard- Spaltlampe, wie zum Beispiel eine FS II Spaltlampe von Nikkon, kann durch geeignete Filter 34 verändert werden.
Es sollte leicht eingesehen werden, daß die Filter 34 sorgfältig gewählt werden, um angeregtes Streulicht auszuschließen, das die Sensitivität der Apparatur signifikant beschränken kann. Wie in Figur 1 und 2 gezeigt ist, wird das Licht 42 zur Anregung auf das Auge 16 der Versuchsperson ( des Versuchstieres) zur Anregung der durch Fluoreszenz markierten ophtalmischen Firmulierung gerichtet, die oberflächlich auf das Auge 16 der Versuchsperson ( des Versuchstieres) gegeben wird. Bei der Anregung tritt Fluoreszenz auf, wobei nicht polarisiertes Licht von unterschiedlicher Wellenlänge von der ophtalmischen Formulierung emittiert wird, wobei dieses Licht 42 durch den Spiegel 36 zu einer Betrachtungs-Baugruppe 50 geleitet wird, die einen Arm 52 beinhaltet, der von der Basis 12 aufragt,die mit Hilfe eines Steuerhebels 54 beweglich ist,um das emittierte Licht 42 in ein Objektivsystem 56 einzustellen, das durch eine Halterung 58 gehaltert ist, die mit dem Arm 52 verbunden ist. Das Objektivsystem 52 ist zur Halterung von Ernissions- Filter 60 ausgebildet, wie ein Filter mit einer Mitten- Wellenlänge von 530 nm und einer Bandbreite von 20 nm, der speziell von Omega Optical hergestellt wurde.
Ein Photo- Vervielfacher- Rohr 64, wie das von Oriel Corporation Stratford,Connecticut, Modell Nummer 77349, kann am Gehäuse des Objektivsystems angebracht werden.
Andererseits ist das Photo- Vervielfacher- Rohr 64 mit einem üblichen Detektor 66, wie einem Oriel Modell Nummer 7070 verbunden, der mit einem Aufzeichnungsgerät 72 in üblicher Weise verbunden ist.In Kombination ergibt das Objektivsystem 56 die Linsen 60, das Photo- Vervielfacher- Rohr 64, der Detektor 70 und das Aufzeichnungsgerät 72 Einrichtungen zum Messen des Fluoreszenz-Lichtes von dem dünnen Film der Tränen vor der Cornea (nicht gezeigt) und die Filter 60 bilden des weiteren Einrichtungen, so daß meßbares Licht mit einer Frequenz des Lichtes, das nicht fluoresziert, von dem Photo- Vervielfacher- Rohr 64 ferngehalten wird.
Ophthalmische Formulierungen zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Messung der Retention ophthalmischer Formulierungen in einem Auge können ein pharmazeutisches Mittel in einem wäßrigen Träger für ein Auge und ein fluoreszierendes Makromolekül einschließen, das ein Molekulargewicht von mehr als ungefähr 2.000 Daltons hat, das in dem Träger gelöst ist. Eine große Zahl von Makromolekülen ist für die Kombination mit dem pharmazeutischen Mittel geeignet und schließt FITC-Dextran, TRITC-Dextran, Phycobiliproteine und synthetische Polymere oder Proteine, die durch FITC markiert wurden, ein. Diese Polymere sind von kommerziellen Anbietern, wie zum Beispiel Molecular Probes, Eugene, Oregon erhältlich.
Die durch Fluoreszenz markierte Lösung ist, falls oberflächlich auf das Auge 16 eingebracht, gleichmäßig wirksam über der Oberfläche von dem Auge durch den blinzelnden Mechanismus verteilt. Dieser fluoreszierende Film wird schrittweise von dem Auge durch Blinzeln und Sekretion von Tränen entfernt. Da das Molekulargewicht von dem Markierungsstoff ausreichend groß ist, wird die Diffusion der fluoreszierenden Substanz in das Gewebe des Auges vollständig unterbunden. Demzufolge ist die fluoreszierende Markierung in dem Film der Tränen vor der Cornea lokalisiert, was überragende räumliche Auflösungen der Fluoreszenz- Messungen ermöglicht.
Deshalb ist das System, das die ophthalmische Formulierung und die hierin vorher beschriebenen Vorrichtung beinhaltet, in der Lage, eine sehr genaue quantitative Bestimmung der ophthalmischen Formulierung, die sich auf der Oberfläche von einem Auge aufhält und die Rate, mit der sie über die Zeit entfernt wird,darzustellen. Die Entfernung der ophthalmischen Formulierung wird primär dem normalen Blinzeln und der Tränentätigkeit von dem Auge zugeschrieben und nicht der Diffusion von dem fluoreszierenden Markierungsstoff aus dem dünnen Film auf dem Auge 16. Es ist verständlich, daß das fluoreszierende Makromolekül ein Molekulargewicht von mehr als 2.000 Daltons hat und vorzugsweise bis zu 2.000.000 Daltons, wie zum Beispiel Phycobiliproteine, hat. Alternativ dazu können die fluoreszierenden Makromoleküle eine Kombination eines fluoreszierenden Stoffes sein, wie zum Beispiel Fluorescein Iso Thiocyanat, mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 2.000 Daltons, das an einen Stoff wie zum Beispiel Dextran gebunden ist, das ein Molekulargewicht von 70.000 Daltons hat, so daß das kombinierte Gewicht des Moleküls, das vorzugsweise kovalent gebunden ist, größer als 2.000 Daltons ist. Nicht nur verhindert die große Größe der fluoreszierenden Substanz die Diffusion in das Gewebe des Auges, sondern die fluoreszierende Substanz des Makromoleküls wird mit irgendwelchen anderen Makromolekülen in der ophthalmischen Formulierung verhakt, um die bevorzugte Diffusion der fluoreszierenden Substanz aus dem Film der Träne zu verhindern.
Vormalige Messungen der Retentionszeit wurden hinsichtlich ihrer Dauer beschränkt, zum Teil aufgrund der Diffusion von fluoreszierenden Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht von der PTF. Wie in Fig. 3 gezeigt wird, entsprechend der Berichte von Benedetto, Sha und Kaufman in Investigative Ophthalmology, Dezember 1975, wenn die fluoreszierende Substanz des Natrium- Fluorescein mit niedrigem Molekulargewicht verwendet wird, dann sind, falls die Viskosität des Trägers größer als ungefähr 20 cp ist, die Retentionszeiten kleiner als 10 Minuten. Wie hierin oben ausgeführt wurde, kann eine größere Retentionszeit oft mit Formulierungen von höherer Viskosität erreicht werden, aber falls die Viskosität zu groß ist, ist sie häufig durch einen verschwommenen Visus und Störungen des Auges begleitet.
Wie in den Figuren 4 - 5 für Albino-Kaninchen aus Neuseeland gezeigt wird, sind die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Messung der Retentionszeit bis zu 175 Minuten geeignet, indem die Viskosität der ophthalmischen Formulierung erhöht wird. Die Formulierungen A-B aus Figur 4 wurden mit 011 Gew.-% aus FITC-Dextran (70.000 Daltons) hergestellt und hatten Viskositäten von 5.000 cp bzw. 300 cp, die nicht durch die Zugabe von FITC-Dextran beeinflußt wurden. Bei Vergleich der Retentionszeiten, die in den Figuren 3 und 4 gezeigt werden, kann gesehen werden, daß die fluoreszierende Substanz des Makromoleküls der vorliegenden Erfindung keine Formulierung mit hoher Viskosität oder einen Träger benötigt, um in dem PTF gegenwärtig zu sein, womit eine zuverlässige Langzeitmessung der Retentionszeit durch Feststellung der emittierten Fluoreszenz ermöglicht wird.
Deshalb ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung idealerweise für die quantitative Bestimmung der Retentionszeiten für Formulierungen am Auge geeignet, weil die fluoreszierende Markierung vorzugsweise nicht aus der Formulierung diffundiert und deshalb keine fehlerhaften Messungen ergibt.
Figur 5 erläutert die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung, indem das Verhalten verschiedener Formulierungen verglichen wird. Der Vergleich von Kurve A (die Viskosität gleich 1.000 cp) mit Kurve B (Viskosität gleich 10 cp) einer im Handel erhältlichen künstlichen Tränenflüssigkeit, zeigt, daß die Formulierung der höheren Viskosität tatsächlich länger in dem Auge zurückbleibt.
Wie hierin oben beschrieben wurde, kann ein fluoreszierendes Makromolekül, das für die Verwendung mit der Vorrichtung und den Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, im Handel erhältliche fluoreszierende Markierungen einschließen, die ein Molekulargewicht von größer als ungefähr 2.000 Daltons haben. Jedoch kann ein fluoreszierendes Molekül in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung auch hergestellt werden, indem eine fluoreszierende Substanz mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 2.000 Daltons an eine Substanz mit einem Molekulargewicht kovalenz angefügt wird, das ausreicht, ein Makromolekül mit einem Molekulargewicht größer als 2.000 Daltons zu produzieren. Zum Beispiel
REAKTION A: - Löse 20 mg Dextran in Wasser, einge stellt auf pH 11 mit 0,2 M NaOH.
- Löse 10 mg Brom Cyan in 0,2 ml Wasser.
- Mische Dextran und Brom Cyan Lösungen zusammen und halte den pH bei 11 für 5 Minuten.
- Entsalze aktiviertes Dextran unter Verwendung von 1 x 20 cm Säule mit Sephadex G-50 in 0,2 M Natrium Borat bei pH 8,0.
REAKTION B: - Vereinige die Fraktionen, die Dextran enthalten.
- Führe die vereinigten Proben mit Dextran sofort zu einer Reaktion mit 2 mg von Fluorescein (R) Amin.
- Lasse das Gemisch für 12-18 Stunden reagieren.
- Trenne das Fluorescein-Dextran von reaktionslosen Fluorescein-Amin unter Verwendung einer Säule (1 x 20 cm) mit Sephadex G-50, die in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung equilibriert ist.
Aus: Glabe, C.G.; Harty, P.K.; und Rosen, S.D. "Preparation and Properties of Fluorescent Polysaccharides", Analytical Biochemistry, 130 (1983), 187-294.
Obwohl die fluoreszierenden Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 2.000 Daltons nützlich sein können, wurde festgestellt, daß die Diffusion der Makromoleküle in das Gewebe des Auges bei Molekulargewichten von größer als ungefähr 2.000 Daltons gering ist, was die Messung der Retentionszeit so lange ermöglicht, wie die ophthalmische Formulierung in dem Bereich vor der Cornea zurückbehalten wird.
Getrennt und in Kombination mit der vorstehend beschriebenen Vorrichtung 10, schließt ein Verfahren für die Messung der Retention einer ophthalmischen Formulierung auf der Oberfläche von einem Auge die Schritte ein, daß ein fluoreszierendes Makromolekül, wie zum Beispiel FITC-Dextran, in einer ophthalmischen Formulierung gelöst wird, um eine durch Fluoreszenz markierte Formulierung mit einer Konzentration von 0,1 Gew.-% dieses fluoreszierenden Moleküles zu bilden. Danach wird die durch Fluoreszenz markierte Formulierung oberflächlich auf das Auge 16 gegeben, wobei die durch Fluoreszenz markierte Formulierung einen dünnen Film auf der Oberfläche des Auges ausbildet. Die Lichtquelle 30 wird verwendet, das Auge zu beleuchten, während die durch Fluoreszenz markierte Formulierung, die in dem dünnen Film enthalten ist, von dem Auge durch normales Blinzeln und Tränenflüssigkeit entfernt wird und das Objektivsystem 56 mit dem Photo-Vervielfacher-Rohr 64 und dem Detektor 70 wird für die Messung der Fluoreszenz als Funktion der Zeit von dem dünnen Film verwendet.
In dem Fall, wo das Makromolekül nicht fluoresziert, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung des weiteren den Schritt umfassen, daß ein fluoreszierender Stoff mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 2.000 Daltons an einen Stoff kovalent angebracht wird, um ein fluoreszierendes Molekül zu bilden, das ein Molekulargewicht von mehr als 2.000 Daltons wie vorstehend beschrieben wurde, hat.
Die Vorrichtung 10 in Kombination mit einem fluoreszierenden Makromolekül, wie zum Beispiel FITC-Dextran, stellt ein überlegenes Verfahren zum Erhalten genauer quantitativer Messungen von Retentionszeiten vor der Cornea für okulare Formulierungen dar. Seine Nützlichkeit liegt in dem Vergleich von neu formulierten okularen Formulierungen mit im Handel erhältlichen Produkten oder in dem Verfahren zum Absuchen neuer Formulierungen. Typische Ergebnisse von Vergleichsmessungen dieser Art werden in Figur 4 gezeigt, die die Tatsache erläutert, daß die Verwendung eines durch Fluoreszenz markierten Makromoleküles die Retentionszeiten für bis zu 175 Minuten messen kann.
In diesem Verfahren werden die Proben, die getestet werden sollen, mit einer geeigneten Menge eines fluoreszierenden Markierungsmaterials hergestellt und in den Tränensack des Versuchs tieres oder der Versuchsperson eingefügt. Eine Messung der Basislinie wird vor der Einfügung der Probe durch Angleichung der Sensitivität des Systems des Detektors auf den geeigneten Pegel gemacht, der in dem Experiment erwartet wird, und der Strahl der Spaltlampe wird auf den Film der Träne vor der Cornea der Versuchsperson (des Versuchstieres) fokussiert.
Die Intensität des Signales der Basislinienmessung kann abgezogen werden, indem instrumentelle Kontrollen auf gewöhnliche Weise eingesetzt werden. Die Intensität des Lichtes und die Strahlbreite und die Höhe werden auch auf vorgeschriebene Werte eingestellt. Nachfolgend zu den Einstellungen für die Basislinie wird eine Probe in das Auge eingebracht und sofort, nachdem die Probe gleichmäßig über die Oberfläche des Auges durch mehrere schnelle Blinzer verteilt wurde, wird eine Messung zum Zeitpunkt Null genommen. Diese Messung wird gemacht, indem der Strahl der Spaltlampe schnell auf den Film der Träne vor der Cornea fokussiert wird und das Signal des Photovervielfachers auf dem Ausdruck des Aufzeich - nungsgerätes 72 dokumentiert wird. Dieses Verfahren kann so oft wie notwendig wiederholt werden, bis das Signal zu der Basislinie zurückgekehrt ist, was darauf hinweist, daß die gesamte Probe aus dem Auge entfernt wurde.
Obwohl vorstehend eine spezifische Anordnung und ein Verfahren für die Messung der Retention einer ophthalmischen Formulierung auf der Oberfläche eines Auges in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zur Darstellung der Art, in welcher die Erfindung vorzugsweise verwendet werden kann, beschrieben wurde, ist es verständlich, daß die Erfindung nicht darauf beschränkt ist. Demgemäß sollen jegliche und alle Veränderungen, Variationen, oder equivalente Anordnungen, die der Fachmann kennt, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung angesehen werden, wie er in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.

Claims

1. Verfahren zum Messen der Retentionszeit einer ophthalmischen Formulierung auf der Oberfläche eines Auges, wobei dieses Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

fluoreszierende Makromoleküle, die ein Molekulargewicht von mehr als 2.000 Daltons haben, werden in einer ophthalmischen Formulierung gelöst, um eine durch Fluoreszenz markierte Formulierung zu bilden, wobei das Molekulargewicht von mehr als 2.000 Daltons die Diffusion der fluoreszierenden Makromoleküle aus dem dünnen Film während der Beleuchtung des Auges verhindert und die Messung der Retentionszeiten der Formulierung für wenigstens 175 Minuten ermöglicht;

die durch Fluoreszenz markierte Formulierung wird oberflächlich auf ein aufgebracht, wobei diese durch Fluoreszenz markierte Formulierung auf der Oberfläche des Auges einen dünnen Film ausbildet;

das Auge wird beleuchtet, um eine Fluoreszenz der durch Fluoreszenz markierten Formulierung hervorzurufen, während der dünne Film der durch Fluoreszenz markierten Formulierung aus dem Auge durch normales Blinzeln und Tränentätigkeit entfernt wird; und

die Fluoreszenz von dem dünnen Film wird als eine Funktion der Zeit gemessen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das des weiteren den Schritt beinhaltet, daß ein fluoreszierender Stoff mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 2.000 Daltons an einen Stoff kovalent gebunden wird, um die fluoreszierenden Makromoleküle zu bilden.

3. Ophthalmische Formulierung zur Messung der Retentionszeit der ophthalmischen Formulierung in einem Auge, wobei diese ophthalrnische Formulierung ein pharmazeutisches Mittel für ein Auge und fluoreszierende Makromoleküle aufweist, die ein Molekulargewicht von mehr als ungefähr 2.000 Daltons haben.

4. Ophthalmische Formulierung nach Anspruch 3, worin dieses pharmazeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Mittel zur Behandlung des trockenen Auges, einem Mittel zum Befeuchten von Kontaktlinsen, einem Mittel zum Heilen von Wunden und einem Mittel zur Aufrechterhaltung der Freisetzung anderer pharmazeutischer Mittel am Auge ausgewählt ist.

5. Ophthalmische Formulierung nach Anspruch 3, worin die fluoreszierenden Makromoleküle einen fluoreszierenden Stoff aufweisen, der ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 2.000 Daltons kovalent gebunden an einen nicht- fluoreszierenden Stoff aufweist.