DE69207561T2

DE69207561T2 - Verfahren zum schnellen Nachweis des Mikroorganismusgehalts von Flüssigkeiten und Flüssigkeitslösungen und Gerät zur Implementierung dieses Verfahrens

Info

Publication number: DE69207561T2
Application number: DE69207561T
Authority: DE
Inventors: Franco Aiolfi; Edoardo Pasero; Carlo Rossetti
Original assignee: Biosensori SpA
Current assignee: Biosensori SpA
Priority date: 1991-11-20
Filing date: 1992-08-14
Publication date: 1996-06-05
Anticipated expiration: 2012-08-15
Also published as: US5348862A; AU2112292A; ITGE910150A1; JPH05281187A; EP0543090B1; ITGE910150A0; DE69207561D1; ES2082301T3; ATE132908T1; CA2079301A1; EP0543090A1; AU654197B2; IT1253176B; ZA926506B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die schnelle Messung oder Bestimmung der bakteriellen Aktivität in einer Medienprobe, wobei eine bio-elektrochemische Zelle verwendet wird. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Durchführung dieser Messung, wobei eine fühlbare Erhöhung der Empfindlichkeit der bakteriellen Messung erreicht werden kann, und wobei alle Störungen eliminiert werden, die durch den Basisstrom und/oder durch Substanzen bewirkt werden, die mit der zu bestimmenden Substanz reagieren könnten.
Die Bestimmung des bakteriellen Gehalts von Flüssigkeiten und von Flüssigkeitslösungen ist auf zahlreichen Anwendungsgebieten sehr wichtig, beispielsweise in der Ernähungsindustrie, bei der Überwachung der Umgebungsverschmutzung, beim Überwachen abgegebener Medien in der Industrie, bei der klinischen Analyse und bei der medizinischen Diagnose im allgemeinen.
Heute übliche Standardverfahren zum Bestimmen des bakteriellen Gehalts von Flüssigkeiten bestehen darin, daß eine Kultur der Probe unter bestimmten Umgebungsbedingungen und in einem geeigneten Kulturmedium angelegt wird, so daß anschließend die bakteriellen Kolonien gezählt werden können. Die größten Nachteile dieser bekannten Verfahren liegen in der Verfahrensdauer dieser Analyse, weil wenigstens 18 Stunden benötigt werden, bis sich sichtbare Kolonien ausgebildet haben, sowie darin, daß die Kolonien einzeln gezählt werden müssen.
Kürzlich vorgeschlagene Verfahren schließen alternative analytische Verfahren vom bio-elektrochemischen Typ ein, die auf der direkten Messung der metabolischen Aktivität der Bakterien beruhen, die in der Probe vorliegen, wobei diese Verfahren amperometrisch in bio-elektrochemischen Zellen und unter Verwendung geeigneter Vermittler (Mediatoren) durchgeführt werden.
Die Verwendung bio-elektrochemischer Zellen für die schnelle Bestimmung des bakteriellen Gehalts war in den letzten Jahren Gegenstand zahlreicher Forschungen. Beispielsweise sei verwiesen auf die Veröffentlichungen in Appl. Microbiol. Biotechnol. (1988) 28, 26 und J. Appl. Bacteriol. (1989) 66, 49.
Weitere Aspekte bio-elektrochemischer Nachweissysteme sind in der europäischen Offenlegungsschrift Nr. 221,663 mit dem Titel "Method and instrument for measuring the microbic activity in a bioelectrochemical cell" beschrieben sowie in der europäischen Offenlegungsschrift Nr. 219,247 mit dem Titel "Bioelectrochemical cell and associated eletrode", in der europäischen Offenlegungsschrift Nr. 238,322 mit dem Titel "Mediators for bioelectrochemical cells" und in der europäischen Offenlegungsschrift Nr. 352,138 mit dem Titel "Bioeletrochemical electrodes". In einigen der beschriebenen Systeme werden die Bakterien auf einem Filter konzentriert, bevor analysiert wird. Andere Systeme verwenden besondere Konfigurationen der Zellenelektroden, während abermals andere Systeme besondere Zusammensetzungen der Mediatoren diskutieren, die verwendet werden, um die Elektronen der Meßelektrode zuzuführen.
Alle diese bekannten Systeme haben aber den Nachteil, daß die mit diesen Systemen erhaltenen Meßergebnisse durch den Oxidationszustand des Mediators (Vermittlers) beeinflußt werden können, fernerhin durch Grundströme, und auch durch Interferenzen oder Störungen mit Substanzen, die Elektronen an den Mediator abgeben können und die in der betreffenden Probe und/oder im Filter vorhanden sein können.
Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein System zum Bestimmen oder zum Messen des bakteriellen Gehalts vorzuschlagen, wobei amperometrische Mittel in einer bio-elektrochemischen Zelle verwendet werden, wobei das System die Nachteile des Standes der Technik vermeiden kann.
Der Kern der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß der Mediator (Vermittler) für den Elektronentransfer in einer bioelektrochemischen Zelle, gelöst in geeigneten Salzlösungen, die alle notwendigen Ionen enthalten, um die Vitalität und das Wachstum der Bakterien zu unterstützen, zunächst dadurch oxidiert wird, daß er in die Meßzelle an die Elektroden zurückgeleitet wird, an denen eine geeignete Potentialdifferenz anliegt. Nachdem der Mediator, in Kontakt mit der Arbeitselektrode, vollständig oxidiert worden ist und nachdem der entsprechende Strom zwischen den Elektroden auf ein konstantes Niveau abgefallen ist, wird ein Filter, an dem die in der Probe enthaltenen Bakterien vorher gefangen worden sind, in den Kreislauf eingesetzt. Das Meßergebnis, das von dem Kontakt zwischen dem Mediator und den Bakterien erzeugt wird, wird an den Elektroden nachgewiesen und aufgezeichnet. An diesem Punkt wird das Filter wiederum aus dem Kreislauf ausgeschlossen und mit einem starken Biocid gewaschen. Nachdem die Bakterien abgetötet worden sind, wird das Filter wieder in den Kreislauf mit dem Mediator eingesetzt, wodurch sich eine neue Messung ergibt, abhängig vom Kontakt zwischen dem Mediator und jedweden störenden Substanzen, die vorher am Filter vorhanden waren, und zwar zusammen mit den Bakterien (einschließlich desjenigen Materials, aus dem der Filter selbst besteht). Die von dem Instrument durchgeführte Messung besteht aus der Differenzbildung zwischen den beiden vorstehend erwähnten Meßergebnissen.
Dadurch wird erreicht, daß die Messung sich lediglich auf den Gehalt an lebenden Bakterien bezieht, gefolgt vom Eliminieren jedweder Störung mit möglichen zusätzlichen Strömungen, die vom Zustand der Oxidierung des Mediators abhängt, und gefolgt von einem nachfolgenden Eliminieren aller möglichen Störungen mit Substanzen, die Elektronen an den Mediator abgeben können und die in der Probe oder im Filter vorhanden sein können.
Indem der Basisstrom begrenzt und konstant gehalten wird, können die Selektivität und das Meßniveau fühlbar erhöht werden, wie dies auch aus der folgenden Beispielsbeschreibung im einzelnen hervorgeht.
Eine Stabilisierung des Basisstroms auf einem sehr niedrigen und konstanten Wert wird, nachdem der Mediator oxidiert worden ist, darüber hinaus dadurch erreicht, daß eine geeignete Abscheidemembran (cut-off-Membran) als Schutz für die Referenzelektrode angewendet wird, so daß derjenige Strom hindurchgehen kann, der von kleinen Ionen transportiert wird, während gleichzeitig ein direkter Kontakt zwischen dieser Elektrode und dem Mediator verhindert wird und folglich auch eine Reduktion des letzteren durch die betreffende Elektrode.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus dem im folgenden beschriebenen Ausführungsbeispiel, und zwar unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung. Es zeigt:
Figur 1 ein Diagramm eines Systems zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Figur 2 ein Diagramm, wobei das von den Meßelektroden des Systems nach Figur 1 gemessene Signal dargestellt ist.
Insbesondere Figur 1 zeigt ein System zum Bestimmen oder Messen des bakteriellen Gehalts einer Medienlösung (Flüssigkeitslösung) nach der vorliegenden Erfindung, wobei eine bio-elektrochemische Zelle 1 vorgesehen ist, die in an sich bekannter Weise die Elektroden aufweist, zwischen denen die betreffende Lösung analysiert wird. Diese enthält den Mediator. Die Lösung zirkuliert im einzelnen zwischen der Arbeitselektrode 101, die vorzugsweise aus einer porösen Scheibe besteht, die aus gesintertem Graphit oder aus einem anderen stromleitenden Material besteht, und die vorzugsweise für die erwähnte Lösung durchlässig ist, und der Referenzelektrode 201, die typischerweise aus Silber und Silberchlorid besteht, welche Elektrode beispielsweise auf den Boden der Zelle durch Siebdruck aufgedruckt worden ist.
Diese Elektrode ist vorzugsweise durch eine spezielle Membran (cut-off-Membran; zeichnerisch nicht dargestellt) abgedeckt, die in Bezug auf kleine Ionen durchlässig ist, aber nicht für den in diesem Test benutzten Mediator.
Ein Behälter 2 enthält den Mediator. Sogenannte Mediatoren oder Vermittler bestehen vorzugsweise aus Substanzen mit relativ niedrigen Redox-Potentialen, die Elektronen aus Mikroorganismen annehmen, die eine reversible Elektrochemie haben, die chemisch stabil sind, die nicht auto-oxidierbar sind, und die normalerweise in wässrigen Lösungen löslich sind.
Typische Mediatoren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Natrium- oder Kalium-Ferrocyanid, Benzoquinon oder Mischungen dieser Substanzen.
Der Behälter 2 steht über das Rohr 3 und über das Elektro- Magnet-Ventil 4 mit dem Rohr 5 in Verbindung, das an die Saugseite einer peristaltischen Pumpe 6 angeschlossen ist. Die Abgabeseite der Pumpe 6 steht mit einer verzweigten Leitung 7 in Verbindung, in der ebenfalls ein Elektro-Magnet-Ventil 8 vorgesehen ist, und mit einer Umlaufleitung 9, in der auch ein Elektro-Magnet-Ventil 10 angeordnet ist, die ihrerseits mit der Einlaßseite eines Absolutfilters 11 in Verbindung steht, mit dem die in der Probe enthaltenen Bakterien zurückgehalten und konzentriert werden. Das Filter 11, das nach jedem Test erneuert werden muß, enthält ein Filterelement zum totalen Zurückhalten der Bakterien. Vor dem Filterelement kann sich ein Vorfilter befinden, sofern Proben analysiert werden, die nicht direkt dem Absolutfilter zugeleitet werden können.
Der Auslaß des Filters 11 ist an eine Leitung 12 angeschlossen, die an einer Seite an das Rohr 13 angeschlossen ist, und zwar über ein Elektro-Magnet-Ventil 14 mit einem Abgabegefäß 15. An der anderen Seite steht das Rohr 12 mit einem Rohr 17 in Verbindung, und zwar über ein Elektro-Magnet-Ventil 18. Das Rohr 17 steht seinerseits mit dem Einlaß der Zelle 1 in Verbindung. Der Auslaß der Zelle 1 steht über das Rohr 24 mit der Saugseite der Pumpe 6 in Verbindung.
Außerdem ist ein Behälter 19 für eine Biocid-Flüssigkeit vorgesehen, deren Zweck weiter unten noch näher erläutert wird. Es ist möglich, als Biocid-Präparat jedwede Substanz zu verwenden, die die zu analysierenden Bakterienstämme abtöten kann, beispielsweise Natrium-Hypochlorit, Formaldehyd und Chlordioxid.
Der Behälter 19 ist über die Leitung 16 und über das Elektro- Magnet-Ventil 20 an die Einlaßseite des Absolutfilters 11 angeschlossen.
Außerdem ist eine elektronische Schaltung 21 vorgesehen, um die Daten zu verarbeiten, die von den Elektroden 101 und 201 kommen, während Position 22 eine Anzeige für die Meßergebnisse darstellt. Außerdem ist ein Drucker 23 vorgesehen. Die Anzeige 22 und der Drucker 23 sind beide an die elektronische Schaltung 21 angeschlossen.
Das erfindungsgemäße Erfahren wird wie folgt durchgeführt. Eine Lösung, die den Mediator, das Ernährungssubstrat und einen geeigneten Puffer enthält, wird in den Behälter 2 eingegeben. Dann werden die Ventile 10 und 18 geschlossen, während gleichzeitig das Ventil 8 der verzweigten Schaltung 7 und das dem Behälter 2 zugeordnete Ventil 4 geöffnet werden und die Pumpe 6 aktiviert wird. Dadurch wird erreicht, daß die Lösung, die den Mediator enthält, in den Kreislauf eingegeben wird, der aus dem Rohr 5, der Pumpe 6, dem Rohr 7, dem Ventil 8, dem Rohr 17, der Zelle 1 und dem Rohr bzw. der Leitung 24 besteht. Die Lösung wird darin umgepumpt, bis der Mediator vollständig oxidiert ist. Gleichzeitig wird eine geeignete Menge der zu analysierenden Probe durch das Absolutfilter 11 gefiltert, das in sich die gesamte vorhandene bakterielle Population zurückhält.
Am Ende des Filterns wird das Filter 11 mit einer geeigneten Lösung gewaschen, beispielsweise mit einer wässrigen Lösung von Na&sub2;HPO&sub4; 40 mM; NaH&sub2;PO&sub4; 20 mM; (NH&sub4;)&sub2;S0&sub4; 7,6 mM und NaCl 20 mM (pM = 6,5). Dann wird es in den Mediatorstrom dadurch einge schaltet, daß die Ventile 10 und 18 geöffnet werden und das Ventil 8 geschlossen wird. In dieser Phase sind auch die Ventile 14 und 20 geschlossen. Während dieser Phase strömt daher der Mediator von der Pumpe 6 zur Leitung 9 und über das Ventil 10 in das Absolutfilter 11 und von diesem Filter durch die Leitung 12, durch das Ventil 18 und durch die Leitung 17 in die Zelle 1, wo es durch die poröse Elektrode 101 hindurchströmt und den Auslaß 24 erreicht, nachdem er über die Referenzelektrode 201 geströmt ist. Dadurch ist es möglich, eine Verschmutzung der Zelle durch die Bakterien zu vermeiden, weil der Mediator, nachdem er in engen Kontakt mit letzterem gekommen ist, filtriert wird, sobald er durch das Absolutfilter hindurchströmt, bevor er in die Zelle zurückkommt. Innerhalb weniger Sekunden nach dem Einsetzen des Filters wird das Ansprechen des Instruments an den Elektroden 101, 201 nachgewiesen und aufgezeichnet. Das Filter wird dann aus dem Kreislauf ausgeschlossen, indem die Ventile 10 und 18 geschlossen werden. Nach dem Öffnen der Ventile 20 und 14 wird es von der Biocid-Lösung im Vorratsbehälter 19 durchströmt, die dann in den Vorratsbehälter 15 abgegeben wird. Anschließend werden die Ventile 14 und 20 geschlossen und der Kreislauf wird dadurch wieder hergestellt, daß die Ventile 10 und 18 geöffnet werden. Dadurch ergibt sich ein neues Ansprechen und damit eine neue Messung an den Elektroden. Die Differenz zwischen den beiden erwähnten Messungen wird vom Instrument automatisch in die Messung des bakteriellen Gehalts umgewandelt.
Figur 2 zeigt ein Diagramm, wobei auf der Abszisse die Zeit aufgetragen ist und auf der Ordinate der Strom an den Elektroden 101, 102, gemessen in µA. Der erste Abschnitt des Diagramms vom Zeitpunkt 1 zum Zeitpunkt 2 gibt die Absetzphase für die Oxidation des flüssigen Mediators wieder. Der Abschnitt a vom Zeitpunkt 2 zum Zeitpunkt 3 gibt die erste Messung bzw. den ersten Meßparameter an den Eletroden wieder, nachdem das Filter mit den lebenden Bakterien eingesetzt worden ist. Vom Zeitpunkt 3 zum Zeitpunkt 4 erfolgt das Waschen mit dem Biocid und beim Zeitpunkt 4 wird das gewaschene Filter eingesetzt. Der Abschnitt b entspricht dem gemessenen Parameter bzw. der hier erfolgenden Messung an den Elektroden der reduzierenden Substanzen, die nicht auf den lebenden Bakterien auf dem Filter beruhen. Die Differenz a-b entspricht der Messung des bakteriellen Gehalts der betreffenden Probe. Diese Differenz wird von der Verarbeitungseinheit 21 geeignet verarbeitet und dann, wie üblich, in der Anzeige 22 bzw. durch den Drucker 23 angezeigt.
Weiter unten werden einige Messungen wiedergegeben, die mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Vorrichtung erhalten worden sind, und zwar für individuelle Bakterienstämme, die in einem geeigneten Medium unterschiedlich verdünnt worden sind. Die von der Vorrichtung erhaltenen Meßergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben, und zwar in Bezug auf die gesamte Menge der Bakterien am Filter (bestimmt unter Verwendung der üblichen Platten-Zähl-Methode): Tabelle: Bakterienstamm Bakterien am Filter (CFU) Meßergebnis (µA) Pseudomonas fluorescens Escherichia coli Enterobacter cloacae Serratia marcescens Lactobacillus bulgaricus
Bei einer abgeänderten Ausführungsform der vorliegenden Erfindund wird das Filter nach dem Filtrieren der Probe unter geeigneten Kulturbedingungen eine bestimmte Zeit lang inkubiert und anschließend in den Kreislauf eingesetzt, so daß dann gemessen werden kann. Dadurch kann die Nachweisempfindlichkeit des Instruments fühlbar erhöht werden und das Instrument kann für bestimmte Bakterienstämme selektiv empfindlich gemacht werden, indem es an spezifische Kulturbedingungen und Medien angepaßt wird.

Claims

1. Verfahren zum Messen des Gehalts an lebenden Bakterien in Flüssigkeiten in einer bio-elektrochemischen Zelle unter Verwendung amperometrischer Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vermittler (Mediator) zunächst vollständig in der Zelle (1) oxidiert wird, dann mit einem Absolutfilter (11) in Kontakt gebracht wird, das die Bakterien der Probe enthält, wodurch sich ein erstes Meßergebnis an den Elektroden (101, 201) ergibt, worauf er wiederum in Kontakt mit dem Filter (11) gebracht wird, nachdem die vorhandenen Bakterien abgetötet worden sind, wodurch ein zweites Meßergebnis erzeugt wird, das auf den interferierenden Substanzen beruht, welches zweite Meßergebnis vom ersten Meßergebnis subtrahiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mediator in einer Salzlösung gelöst wird, die alle Ionen enthält, die notwendig sind, um die Bakterien lebend zu erhalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzelektrode (201) der bio-elektrochemischen Zelle (1) mit Hilfe einer Membrane abgedeckt wird, die in Bezug auf kleine Ionen durchlässig ist, die aber in Bezug auf herkömmliche Mediatoren undurchlässig ist, die für den amperometrischen Nachweis der metabolischen Aktivität des Mikroorganismus verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode (101) der bio-elektrochemischen Zelle (1) aus gesintertem Graphit oder aus einem anderen, porösen, stromleitenden Material besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu analysierende Probe durch ein Absolutfilter (11) gefiltert wird, das anschließend gewaschen und in den Meßkreislauf eingesetzt wird, nachdem der Mediator oxidiert worden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die auf dem Filter (11) zurückgehaltenen Bakterien unter geeigneten Kulturbedingungen inkubiert werden, bevor das Filter (11) in den Meßkreislauf eingesetzt wird.

7. Verfahren zum Messen des bakteriellen Gehalts von Flüssigkeiten unter Verwendung amperometrischer Mittel in einer bio-elektrochemischen Zelle (1) nach einem der Patentansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Phasen vorgesehen werden: Eingeben der Lösung, die den Mediator enthält, in den Zellenkreislauf; Zirkulieren der Lösung, bis der Mediator vollständig oxidiert worden ist; getrenntes Filtrieren der Probe über das Absolutfilter (11); Waschen des Filters (11); Einsetzen des Filters (11) in den Zellenkreislauf; Nachweis einer ersten amperometrischen Messung; weiteres Waschen des Filters (11) mit einem Biocid; abermaliges Einsetzen des Filters (11) in den Kreislauf; Nachweis einer zweiten amperometrischen Messung, die von der ersten Messung subtrahiert wird; Umwandlung des Meßergebnisses in die Messung des bakteriellen Gehalts.

8. Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, gekennzeichnetdurch eine bio-elektrochemische Zelle (1) ; einen ersten Strömungs-Kreislauf (24,7,8,17), der den Auslaß der Zelle (1) mit dem Einlaß der Zelle (1) verbindet; Mittel (6) zum Umpumpen eines flüssigen Mediators in diesem Kreislauf (24,7,8,17); ferner durch einen zweiten Flüssigkeits-Kreislauf (24,9,10,ll,12,18,17) parallel zum ersten Flüssigkeits- Kreislauf (24,7,8,17), der den Auslaß der Zelle (1) an den Einlaß eines Absolutfilters (11) anschließt sowie den Auslaß dieses Filters (11) an den Einlaß der Zelle (1) fernerhin durch Ventile (8,10,18), um den ersten oder den zweiten Strömungskreislauf alternativ zu aktivieren; durch ein Vorratsgefäß (2) für einen flüssigen Mediator, der mit dem ersten Strömungskreislauf (24,7,8,17) in Verbindung steht, um diesen mit einer bestimmten Menge einer Mediator-Lösung zu versorgen; weiterhin durch ein Vorratsgefäß (19) für ein flüssiges Biocid, das mit dem Absolutfilter (11) in Verbindung steht, so daß eine Biocid-Flüssigkeit darin zirkuliert; und durch eine Datenverarbeitungseinheit (21), die an den Ausgang der Elektroden (101, 201) der bio-elektrochemischen Zelle (1) angeschlossen ist, um die amperometrischen Daten zu verarbeiten, die von den Elektroden (101, 201) abgegeben werden.