DE69133054T2

DE69133054T2 - Verfahren zur modifizierung von dna und zur detektion der wirkungen auf die interaktion von modifizierten polypeptiden und zielsubstraten

Info

Publication number: DE69133054T2
Application number: DE69133054T
Authority: DE
Inventors: David Botstein; Timothy Palzkill
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1990-10-22
Filing date: 1991-10-21
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2011-10-22
Also published as: ATE220113T1; WO1992007090A1; CA2094495A1; DK0555357T3; US5677153A; EP0555357A1; CA2094495C; ES2179818T3; EP0555357B1; DE69133054D1; EP0555357A4

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren und Mutationslinker zur Modifizierung von DNA, Verfahren zur Erzeugung von eine Vielzahl von modifizierte DNA enthaltenden Bibliotheken und Verfahren zur Verwendung dieser Bibliotheken zum Screening von mit einer solchen DNA kodierten Proteinen.

Hintergrund der Erfindung

Bekannt sind zwei allgemeine Wege zur Identifizierung von Domänen und spezifischen Aminosäureresten innerhalb eines Polypeptids, die für seine Struktur und funktion wichtig sind. Einer dieser Wege ist der Vergleich der Aminosäuresequenzen einer Familie natürlich vorkommender Polypeptidvarianten, die homolog sind und dieselbe oder eine ähnliche Funktion ausüben. Die Restpositionen, die konserviert werden, gelten als entscheidend für die Struktur und Aktivität jedes Polypeptids innerhalb dieser Familie. Dieser Weg wird für eine ganze Reihe von Proteinen einschließlich der Globin-Familie beschritten (Bashford, D. et al. (1987), J. Mol. Biol., 196: 199-216; Lesk, A. M. et al. (1980), J. Mol. Biol., 136: 225-235). Der zweite Weg besteht in der Sondierung der Bedeutung der einzelnen Bereiche eines Polypeptids durch Austausch oder Deletierung einzelner Aminosäuren oder einer Gruppe von Aminosäureresten und Prüfung der funktionellen Konsequenzen. Beispiele für diesen Weg sind die Random-Mutagenese des lac-Repressors (Miller, J. H. et al. (1979), J. Mol. Biol., 131: 191-200) und der Staphylokokkennuclease (Shortle, D. et al. (1985), Genetics, 110: 539-555), die systematische sitespezifische Mutagenese wie die "Alanin-scanning"-Mutagenese von hGH (Cunningham, B. C. et al. (1989), Biochemistry, 28: 5703-5707) und die "Segmentsubstitution" von hGH mit homologen Segmenten (Cunningham, B. C. et al. (1989). Science 243: 1330-1336).
Der Mutagenese-Weg hat den Vorteil, dass die Analyse nicht auf existierende natürliche Varianten beschränkt ist. Die meisten Random-Mutagenese-Versuche hängen jedoch von der Erzeugung von Punktmutationen ab. Da Codone drei Nucleotide enthalten, ist es im allgemeinen nicht möglich, alle übrigen neunzehn Aminosäuren in einer Restposition mit Punktmutationen zu prüfen. Dies führt zu einer Abweichung bei der Ermittlung der Toleranz eines Restes gegenüber unterschiedlichen Aminosäuresubstitutionen.
Ein dritter Weg wurde vor einiger Zeit beschrieben und als "kombinatorische Kassettenmutagenese" oder einfach als "Kassettenmutagenese" bezeichnet (Kaiser, C. A. et al. (1987), Science, 235: 312-317; Reidhaar-Olson, J. F. et al. (1988), Science, 241: 53-57). Dieses Verfahren umfasst typischerweise die Substitution eines DNA-Segments zwischen zwei Restriktionssites durch eine Kassette, welche ein oder mehrere Codone enthält, die vollständig randomisiert sind, so dass sie sämtliche möglichen Aminosäurereste codieren. Die Kassettenmutagenese wird zur Untersuchung von Signalsequenzen (Kaiser et al., ibidem), des Dimer-Interface, zweier α-Helices und des hydrophoben Kerns des X-Repressors (Reidhaar-Oltson et al., ibidem); Reidhaar-Olson, J. F. et al. (1990), Proteins Struc. Funct. Genet., 7: 306-316; Lim et al. (1989) Nature (London), 339: 32-36), eines Bereichs in der Umgebung des katalytischen Serinrestes von TEM-β-Lactamase (Dube und Loeb, 1989); Biochemistry 2: 5703-5707, und von Proteasen wie Subtilisin (EPO Publication Nr. 0 251 446, veröff. 7. Juni, 1988) verwendet.
Die Bereitstellung von Oligonucleotidlinkern, die an ein geklontes DNA-Segment angeheftet werden, um die gewünschten funktionellen Eigeschaften dem durch die geklonte DNA kodierten Protein zu verleihen, wird in der US-A-4769326 beschrieben.
Die Technik der Linkerinsertionsmutagenese wurde von Heffron, F. et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 6012- 6016 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird ein einen einzigen synthetischen Restriktionssite kodierender Linker in DNA an zufälligen Sites inseriert und danach mit einem Enzym verdaut, das für diesen Synthesesite kognat ist, um die Insertionsstelle zu kartieren. Diese Technik kann zu sauberen Additionen an die Target-DNA führen, welche die synthetischen Restriktionssite-Nucleotide sowie zusätzliche im Linker enthaltene Nucleotide umfassen. Diese Technik kann aber auch zur Substitution oder zu einer sauberen Deletion führen, und zwar jeweils abhängig von der Zahl der aus der Target-DNA nach der ersten Stufe der DNaseI-Verdauung und vor der Linkerinsertion entfernten Nucleotide. Trotz der deutlichen Änderung der Größe der Target-DNA führt dieses Verfahren zwangsläufig zur Aufnahme von Basenpaaren in das Mutantengenom, welche den hinzugefügten Restriktionssite codieren.
Ein weiteres Verfahren, bekannt als "Linkerscanning-Mutagenese" (McKnight, S. L. et al. (1982), Science, 217: 316-324) beginnt mit Bibliotheken, welche Mutationen aufweisen, die entsprechend der oben beschriebenen Linkerinsertionstechnik erzeugt wurden. Die Mutationen werden kartiert und dann an den hinzugefügten Syntheserestriktionssites gespalten, um mutante DNA-Fragmente zu bilden. Geeignete Mutantenfragmente, die der 5'- und 3'-Richtung des Syntheserestriktionssite entsprechen und jeweils einen Teil des hinzugefügten Restriktionssites kodieren, werden dann miteinander ligiert, um mutierte DNA tragende Substitutionen, Additionen oder Deletionen zu bilden, die entsprechend der Linkerinsertionstechnik gebildet wurden. Natürlich codieren diese Mutationen notwendigerweise auch den hinzugefügten Syntheserestriktionssite.
Ein unidirektional spaltender Adapter für die Verwendung zusammen mit Restriktionsenzymen der Klasse II bzw. III wird in der US-A-4935357 beschrieben.
Bidirektional spaltende Exzisionslinker, welche zwei Erkennungssequenzen BspMI codieren, wurden in mit ScaI gespaltenes pBR322 inseriert und dann mit BspMI gespalten. Die Enden der dabei erhaltenen DNA werden dann entweder mit Exonuclease oder DNA-Polymerase behandelt, um die Nucleotide zu entfernen oder aufzufüllen. Dies führt, wie beschrieben, zur Deletion von 2 bis 16 Nucleotiden, je nach der Anordnung der Erkennungssequenz für BspMI im Exzisionslinker und des Spaltungssites für diese Erkennungssequenzen in der Umgebung des ScaI-Insertionssites (Mormeneo, S. et al. (1987), Gene, 61: 21-30). Vorgeschlagen wird auch ein Schema zur Deletion von 3 Nucleotiden unter Substitution eines Nucleotids sowie die Verwendung eines bidirektional spaltenden Linkers, wobei gleiche Zahlen von Nucleotiden auf der einen Seite des Linkers entfernt und auf der anderen Seite hinzugefügt werden. Eine derartige Substitution ist jedoch zwangsläufig auf die Zahl von Nucleotiden zwischen der Erkennungsequenz und dem Spaltungssite der Endonuclease der Klasse IIS beschränkt. Ferner wird in jedem Fall lediglich ein bidirektional spaltender Linker verwendet, um zum Endprodukt zu gelangen.
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von verbesserten Verfahren zur Modifizierung von DNA, wobei die Modifizierung die Substitution eines oder mehrerer Nucleotide durch vorgegebene zufällige Nucleotide auf einer Target- DNA oder an einem vorgegebenen Site innerhalb der Target-DNA umfasst.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Vektoren, welche die nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte modifizierte DNA codieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung transformierter Zellen, welche modifizierte Polypeptide, welche durch die nach den erfindungsgemäßen Verfahren modifizierte DNA codiert sind, exprimieren.
Eine Aufgabe ist insbesondere die Bereitstellung von Zellpopulationen, die nach den obigen Verfahren transformiert wurden, um modifizierte Formen von β-Lactamase mit Random- Mutationen auf der ganzen Fläche oder an vorbestimmten Sites innerhalb des β-Lactamase-Gens zu exprimieren und Antibiotika auf Empfindlichkeit gegenüber Hydrolyse durch die modifizierten Lactamasen, die von solchen Zellpopulationen exprimiert werden, einem Screening zu unterwerfen.
Die oben diskutierten Druckschriften dienen lediglich der Offenbarung dessen, was vor dem Einreichungsdatum der vorliegenden Anmeldung geoffenbart worden war. Nichts geht daraus hervor, das den Schluss zuließe, dass die Erfinder nicht berechtigt wären, diese Veröffentlichung aufgrund von früheren Erfindungen vorwegzunehmen.

Zusammenfassung der Erfindung

Entsprechend den oben angeführten Aufgaben werden Verfahren zur Modifizierung von Target-DNA bereitgestellt. In spezifischen Ausführungsformen codiert dann eine solche modifizierte Target-DNA modifizierte Polypeptide. Die erwünschten Nucleotidsubstitutionen, -insertionen oder -deletionen werden vorzugsweise in die Target-DNA durch aufeinanderfolgende (1) Insertion und Entfernung eines bidirektional spaltenden Exzisionslinkers der Klasse IIS zur Entfernung von Targetnucleotiden, durch (2) Insertion und Entfernung eines bidirektional spaltenden Mutationslinkers der Klasse IIS zur Hinzufügung von Mutationsnucleotiden und (3) durch Ligation zur Bildung von modifizierter Target-DNA eingeführt.
Der Schwerpunkt der Erfindung liegt auf der Konstruktion der Exzisions- und Mutationslinker zur Erzeugung der erwünschten DNA-Modifikationen. Zu diesem Zweck umfasst der bidirektional spaltende Exzisionslinker zwei Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonucleasen der Klasse IIS, von denen jeweils einer am Ende des Exzisionslinkers oder in dessen Umgebung vorliegt. Gewöhnlich wird eine unterschiedliche Zahl von Spacer-Nucleotidbasenpaaren zwischen zwei Erkennungssequenzen der Klasse IIS dazwischengeschaltet. Die beiden Erkennungssequenzen der Klasse IIS sind so ausgerichtet und angeordnet, dass die Spaltungssites für die kognate Restriktionsendonuclease der Klasse IIS nicht innerhalb des Exzisionslinkers selbst zu liegen kommt. Ist der Exzisionslinker in die Target-DNA inseriert, um eine erste modifizierte DNA zu bilden, liegen die Spaltungssites innerhalb des ersten und zweiten Bereichs der Target-DNA zu beiden Seiten des Insertionssites des Exzisionslinkers. Die genaue Anordnung des Spaltungssites hängt vom Typ der verwendeten Endonuclease der Klasse IIS und von der Position der Erkennungssequenzen im Exzisionslinker ab. Ist der Exzisionslinker auf der gesamten Target-DNA zufällig inseriert, führen die nachfolgenden Stufen zur Modifizierung eines oder mehrerer Nucleotide in der gesamten Target-DNA. Der Exzisionslinker kann jedoch an einen vorgegebenen Site in der Target-DNA so inseriert sein, dass es zur Modifizierung der Nucleotidsequenz in der Target-DNA an einem vorgegebenen Site kommt.
Nach der Insertion des Exzisionslinkers in die Target-DNA wird die auf diese Weise gebildete erste modifizierte DNA mit der kognaten Restriktionsendonuclease der Klasse IIS gespalten. Dadurch wird eine zweite stumpfe oder stufenförmige Enden enthaltende modifizierte DNA gebildet, was von der spezifischen Restriktionsendonuclease abhängt, die durch jede Erkennungssequenz im Exzisionslinker codiert wird. Da der Spaltungssite für jede Endonucleasen-Erkennungssequenz der Klasse IIS innerhalb des ersten und zweiten DNA-Anteils, welche in der ersten modifizierten DNA enthalten sind, angeordnet ist, wird durch die Verdauung mit den Restriktionsendonucleasen der Klasse IIS ein oder mehrere Nucleotide aus der Target-DNA im allgemeinen auf jeder Seite des Insertionssites des Exzisionslinkers entfernt, um den dritten und vierten DNA-Anteil zu bilden.
Werden die ein stumpfes Ende aufweisenden Restriktionsendonucleasen-Erkennungssites der Klasse IIS an beiden Enden des Exzisionslinkers codiert, hängt die Zahl der aus jedem Ende des ersten und zweiten DNA-Anteils entfernten Nucleotide zur Bildung des dritten und vierten DNA-Anteils von der Position der Spaltungssites im ersten und zweiten DNA-Anteil ab. Wird eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuclease der Klasse IIS, welche stufenförmige Enden produziert, codiert, werden diese durch Behandlung mit Exonuclease oder DNA-Polymerase modifiziert, um einen dritten und vierten DNA-Anteil zu bilden, welcher stumpfe Enden enthält.
Die stumpfen Enden des dritten und vierten DNA-Anteils werden dann mit einem bidirektional spaltenden Mutationslinker ligiert, um die dritte modifizierte DNA zu bilden. Der Mutationslinker codiert zwei Erkennungssequenzen für die Klasse IIS und einen oder mehrere Mutationsnucleotide, die in einem Mutationsnucleotid-Endbereich enthalten sind, die an jedem Ende des Mutationslinkers angeordnet ist. Was den Exzisionslinker betrifft, so sind die Erkennungssequenzen für die Klasse IIS so ausgerichtet, dass es zu keiner Spaltung durch die kognate Endonuclease der Klasse IIS zwischen den Erkennungssequenzen kommt. Diese sind jedoch so angeordnet, dass die Mutationsnucleotid-Bereiche bei Verdauung mit der kognaten Endonuclease der Klasse IIS aus dem Mutationslinker abgespalten werden. wird daher die dritte modifizierte DNA mit der kognaten Endonuclease der Klasse IIS zur Bildung der vierten DNA gespalten, bleiben die in jedem Mutationsnucleotid-Endbereich enthaltenen Nucleotide kovalent mit dem dritten und vierten Anteil der Target-DNA verknüpft und bilden dadurch den fünften und sechsten Anteil.
Enthalten die Enden des fünften und sechsten Anteils stufenförmige Enden, was von den Erkennungssites der Endonuclease der Klasse IIS, die im Mutationslinker codiert sind, abhängt, werden sie mit Exonuclease oder DNA-Polymerase zur Bildung der stumpfen Enden behandelt.
Die stumpfen Enden der fünften und sechsten Position der Target-DNA werden anschließend ligiert, um die modifizierte Target-DNA zu bilden, wobei ein oder mehrere Nucleotide verglichen mit der Ausgangs-Target-DNA substituiert, inseriert oder deletiert werden.
Zur Substitution eines oder mehrerer Nucleotide kommt es, wenn die Gesamtzahl der durch Entfernung des Exzisionslinkers nach der Behandlung mit Typ IIS-Endonuclease (gegebenenfalls unter nachfolgender Modifizierung mit Exonuclease oder DNA-Polymerase) deletierten Nucleotide der Zahl der durch Entfernung eines Teils des Mutationslinkers durch Typ IIS-Endonuclease (gegebenenfalls unter nachfolgender Modifizierung mit Exonuclease oder DNA-Polymerase) hinzugefügten Nucleotide entspricht. Saubere Insertionen oder Deletionen werden erzeugt, wenn die Zahl der entfernten und hinzugefügten Nucleotide ungleich ist.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird der Mutationslinker so konstruiert, dass wenigstens drei Randommutationsnucleotide in den Mutationsnucleotid-Endbereichen angeordnet sind, so dass die Targetnucleotide in der Target-DNA durch diese Randommutationsnucleotide ersetzt sind. Wenn die Randomnucleotide in die modifizierte Target-DNA eingebaut sind und die Target-DNA ein Polypeptid codiert, so vermögen die auf diese Weise modifizierten Codone sämtliche möglichen Aminosäuresubstitutionen zu codieren.
Nach der Modifizierung der Target-DNA wird die Wirkung einer solchen Modifikation ermittelt. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung codiert die modifizierte Target-DNA im allgemeinen ein oder mehrere modifizierte Polypeptide. Dazu kommt es im allgemeinen, wenn der Mutationslinker Randommutationsnucleotide codiert und/oder der Exzisionslinker statistisch in die Target-DNA inseriert wird. Wird die modifizierte Target-DNA in einem Expressionsvektor gebildet, können geeignete Zellen so transformiert werden, dass eine Bibliothek entsteht, welche die durch diese modifizierte Target-DNA codierten modifizierten Polypeptide zu exprimieren vermag. Derartige modifizierte Polypeptide können anschließend analysiert werden, um die Wirkung dieser Modifizierungen zu ermitteln. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wird das modifizierte Polypeptid mit einem Target in Kontakt gebracht, das gewöhnlich mit dem nicht modifizierten Polypeptid zusammenwirkt. Ermittelt wird die Wechselwirkung, sofern vorhanden, zwischen einem oder mehreren modifizierten Polypeptiden und dem Target. Eine Veränderung in der Wechselwirkung zwischen einem oder mehreren modifizierten Polypeptiden und dem Target verglichen mit derselben Wechselwirkung seitens des nicht modifizierten Polypeptids in Verbindung mit der Ermittlung des bzw. der im Polypeptid modifizierten Aminosäurereste(s) ergibt einen Hinweis darauf, welche Aminosäurereste im nicht modifizierten oder modifizierten Polypeptid mit dem Target zusammenwirken.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung werden Bibliotheken aus transformierten Zellen, welche modifizierte antibiotische Hydrolasen wie modifizierte β-Lactamasen codieren, verwendet, um die Empfindlichkeit eines Antibiotikums gegenüber der Neutralisierung durch Wildtyp-Mutanten der antibiotischen Hydrolasen zu ermitteln. Derartige Bibliotheken enthalten vorzugsweise die Substitution einzelner Bereiche der antibiotischen Hydrolase. Solche Bereiche befinden sich vorzugsweise innerhalb des aktiven Sites der Enzyme, die an der Katalyse, Bindung und/oder Spezifität des Enzyms mit dem antibiotischen Substrat beteiligt sind. Im allgemeinen codieren solche Bibliotheken praktisch alle Kombinationen von Substitutionen, die unter den Aminosäureresten innerhalb jedes modifizierten Bereichs durchgeführt werden können. Auf diese Weise gewährleisten solche Bibliotheken allein oder in Kombination mit anderen Bibliotheken eine ganze Palette an modifizierten antibiotischen Hydrolasen, die für die einzelnen Mutationen, die sich in der antibiotischen Wildtyp-Hydrolase ereignen können, repräsentativ sind. Die Empfänglichkeit des konkreten Antibiotikums gegenüber der Neutralisierung durch eine der modifizierten antibiotischen Hydrolasen in der Bibliothek liefert einen Hinweis auf die Empfänglichkeit gegenüber der Neutralisation durch Wildtyp-Mutationen in der antibiotischen Precursor- Hydrolase.
Die Erfindung betrifft außerdem bidirektional spaltende Mutationslinker für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, Gemische, welche nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte modifizierte DNA's und modifizierte Polypeptide umfassen, mit modifizierter Target-DNA transformierte Zellpopulationen sowie neue Verfahren für die gerichtete Insertion des bei der Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Exzisionslinkers.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 beschreibt die Erkennungs- und Spaltungssites für typische Typ IIs-Restriktionsendonucleasen;
Fig. 1A den Spaltungssite für die mit stumpfem Ende spaltende Typ IIS-Endonuclease;
Fig. 1B zeigt den Spaltungssite für eine Typ IIS-Endonuclease, die stufenförmige Enden produziert, sowie die Beziehung zwischen dem Exzisionslinker und dem ersten ung zweiten DNA-Anteil bei Insertion in Target-DNA.
Fig. 2 zeigt schematisch das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Typ IIS-Restriktionsendonuclease, die unter Bildung von stumpfen Enden spaltet.
Fig. 3 zeigt schematisch das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Typ IIS-Restriktionsendonuclease, die unter Bildung von stufenförmigen Enden spaltet.
Fig. 4 zeigt schematisch eine Ausführungsform mit PCR-vermittelter gerichteter Insertion eines Exzisionslinkers in die Target-DNA.
Fig. 5 zeigt die Modifizierung eines Bereichs des β-Lactamase-Gens unter Verwendung von Exzisions- und Mutationslinkern mit Erkennungssequenzen für die Typ IIS-Restriktionsendonuclease BspMI.
Fig. 6 zeigt das zur Erzeugung von blaC66-Mutanten verwendete PCR-Verfahren der gerichteten Insertion des Linkers.
Fig. 7 zeigt das Nucleotid und die Aminosäuresequenz des bla-Gens und die Insertionspositionen des Exzisionslinkers BspMI. Die Pfeile geben die Insertionsstellen der Linker an. Die eingerahmten Nucleotide geben die Nucleotide an, die randomisiert wurden. Die zwei Pfeile aufweisenden Inserte geben die mit der Insertion des BspMI-Linkers verknüpften Deletionen an. Die Nucleotide zwischen den Pfeilen wurden deletiert und ebenfalls durch randomisierte Nucleotide ersetzt.
Fig. 8 zeigt den Prozentanteil an Mutanten mit funktionell akzeptablem Ersatz bei 10 ug/ml bzw. 1 mg/ml Ampicillin gegen modifizierte Restpositionen. Jede Kombination von Balken steht für einen getrennten Versuch des statistischen Ersatzes.
Fig. 9 zeigt die Aminosäuresequenzen für den blaC66-Ersatzversuch für die Reste 72-74. Die Sequenz der Wildtyp-TEM-β- Lactamase ist an der Spitze angegeben, gefolgt von funktionellen Ersatzmutanten bei 1 mg/ml bzw. 10 ug/ml.
Fig. 10 zeigt die Aminosäuresequenzen für den blaC31-Ersatzversuch für die Reste 196-200. Die Sequenz der Wildtyp-TEM- β-Lactamase ist an der Spitze angegeben, gefolgt von funktionellen Ersatzmutanten bei 1 mg/ml bzw. 10 ug/ml.
Fig. 11 zeigt die Aminosäuresequenzen für den blaC14-Ersatzversuch für die Reste 37-42. Die Sequenz der Wildtyp-TEM-β- Lactamase ist an der Spitze angegeben, gefolgt von funktionellen Ersatzmutanten bei 1 mg/ml bzw. 10 ug/ml. Die Sequenz der nichtfunktionellen Mutanten ist unten angegeben.
Fig. 12A zeigt den Prozentanteil an Mutanten mit funktionell akzeptablen Ersatz bei 1 mg/ml Ampicillin gegen die mutagenisierten Restpositionen;
Fig. 12B zeigt die durchschnittliche evolutionäre Variabilität für die entsprechenden Restpositionen in Fig. 12A.
Fig. 13 zeigt die Position der Aktivsite-Bibliotheken innerhalb des bla-Gens. Die eingerahmten Nucleotide zeigen die Nucleotide, die bei jeder Bibliothek randomisiert wurden.
Fig. 14 zeigt die Position der Aktivsite-Bibliotheken innerhalb der dreidimensionalen Struktur der β-Lactamase der homologen Klasse A aus S. aureus. Die dunklen Bereiche entsprechen den in den Bibliotheken randomisierten Aminosäurepositionen. Die Identität jeder Bibliothek ist durch Pfeile angegeben. Die Position des katalytischen Serinrestes im aktiven Site ist ebenfalls dargestellt (abgeändert nach Hertzberg, O. et al. (1987), Science, 23: 694-701).
Fig. 15 zeigt die Aminosäuresequenzen für die BlaC71-Bibliothek in den Positionen 235-237. Die Sequenz der Wildtyp-TEM- 1-β-Lactamase ist an der Spitze angegeben, gefolgt von den Mutanten mit den angegebenen Substratspezifitäten.
Fig. 16 zeigt die Aninosäuresequenzen für die blaC74-Bibliothek in den Positionen 238-241. Die Sequenz der Wildtyp-TEM- 1-β-Lactamase ist an der Spitze angegeben, gefolgt von den Mutanten mit den angegebenen Substratspezifitäten.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Verfahren werden zur Modifizierung von Target-DNA eingesetzt. Kodiert die Target-DNA ein Precursor- Polypeptid, wird sie gewöhnlich modifiziert, um eine Vielzahl von Target-Nucleotiden mit Random-Mutations-Nucleotiden zu substituieren. Die auf diese Weise gebildete modifizierte Target-DNA wird im allgemeinen verwendet, um Bibliotheken aus transformierten Zellen zu erzeugen, die zur Exprimierung der modifizierten DNA zur Bildung modifizierter Polypeptide befähigt sind. Insbesondere sind solche Bibliotheken für die rationelle Konstruktion und das Screening von neuen Arzneimitteln geeignet. So z. B. kann die Neutralisierung eines oder mehrerer Antibiotika durch modifizierte β-Lactamasen in einer erfindungsgemäß hergestellten Bibliothek, gekoppelt mit der Ermittlung der modifizierten β-Lactamase-Sequenz, die geeigneten Informationen für die Konstruktion von Antibiotika liefern, welche gegenüber der Neutralisierung durch natürlich vorkommende β-Lactamase-Mutanten resistent sind. Außerdem können potentielle Antibiotika einem Screening gegenüber solchen Bibliotheken unterworfen werden, um die Wahrscheinlichkeit der Empfindlichkeit des Antibiotikums gegenüber der Neutralisierung durch natürliche Mutationen des β-Lactamase-Gens vorherzusagen. Weitere erfindungsgemäße Verwendungszwecke gehen aus der nachfolgenden deatillierten Beschreibung hervor.
Die erfindungsgemäßen Verfahren beruhen auf den einzigartigen Eigenschaften der Typ IIS-Restriktionsendonucleasen. Unter "Typ IIS-Restriktionsendonuclease" bzw. "Typ IIS-Endonuclease" versteht man ein Enzym, welches die nichtpalindromische doppelsträngige Nucleotidsequenz erkennt und beide Stränge in einem genauen Abstand von der Erkennungssequenz spaltet (Szbalski, W. (1985), Gene, 40: 169-17). Beispiele für die Erkennungssequenzen und die Spaltungssites für typische Typ IIs-Restriktionsendonucleasen sind in Fig. 1 schematisch dargestellt. Wie aus Fig. 1A hervorgeht, sind die 5'- und 3'-Strang-Spaltungssites für MnlI jeweils sieben Nucleotide von der Erkennungssequenz entfernt und jeweils auf derselben Seite angeordnet. Dies führt zu einer stumpf endenden Spaltung der doppelsträngigen DNA in einem Abstand von sieben Nucleotiden von der Erkennungssequenz. Die meisten Typ IIS-Restriktionsendonucleasen spalten auf derselben Seite der Erkennungssequenz, aber in unterschiedlichen Abständen für den 5'-Strang und den 3'-Strang. So spaltet z. B., wie aus Fig. 1B ersichtlich ist, BspMI den 5'-Strang in einem Abstand von 4 Nucleotiden und den 3'-Strang in einem Abstand von.8 Nucleotiden von der Erkennungssequenz Bs pMI, um stufenförmige Enden zu erzeugen. Gegenwärtig unterscheidet man 13 Typ IIS-Restriktionsendonucleasen, die beschrieben wurden (Tabelle I), von denen 12 nach der Spaltung stufenförmige Enden erzeugen, während eine stumpfe Enden erzeugt. Die Erfindung ist, wie zu ersehen ist, nicht auf das spezifische Typ IIS-Enzym, das in der bevorzugten Ausführungsform verwendet wird, oder auf die bekannten Typ ITS- Enzyme aus Tabelle I beschränkt, d. h. für die Durchführung der Erfindung kann jede Typ IIS-Restriktionsendonuclease verwendet werden, die als Restriktionsendonuclease funktionell definiert ist und außerhalb der Erkennungssequenz für das Enzym spaltet. Derartige Enzyme sind dem Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet bekannt, da die Ermittlung der Erkennungssites und der Spaltungssites für die Restriktionsendonucleasen Routine sind. Tabelle I
Die erfindungsgemäßen Verfahren dienen der Modifizierung der DNA-Sequenz der "Target-DNA". Im allgemeinen kann jede DNA- Sequenz nach den erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert werden. Voraussetzung ist im allgemeinen lediglich, dass die Target-DNA in einem replizierbaren Vektor enthalten ist, der entsprechend den einzelnen erfindungsgemäßen Stufen gehandhabt werden kann. Obwohl die hier beschriebenen konkreten Ausführungsformen die Modifizierung von im Strukturanteil eines Precursor-Gens enthaltenen Codonen beschreiben, ist die Target-DNA somit nicht auf derartige neue DNA-Sequenzen beschränkt. Es können demnach DNA-Sequenzen wie Expressionsregulationssequenzen, Introne, Enhancersequenzen und dergleichen erfindungsgemäß modifiziert werden. In den hier beschriebenen Ausführungsformen codiert die Target-DNA vorzugsweise ein Precursorpolypeptid. Wird ein oder werden mehrere Target-DNA enthaltene(s) Nucleotid(e) erfindungsgemäß modifiziert, codiert die "modifizierte Target-DNA" ein "modifiziertes Polypeptid", wobei ein oder mehrere angrenzende(s) Codon(e) so modifiziert werden, dass sie einen vom Precursor-Polypeptid unterschiedlichen Aminosäurerest codieren. Die hier beschriebenen Verfahren eignen sich jedoch auch für die nachfolgenden Zyklen, wobei das Produkt der modifizierten Target-DNA eines Mutagenesezyklus zur Target- DNA für den nächsten Mutagenesezyklus wird.
Beispiele für Precursorpolypeptide, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert werden können, sind Enzyme, Proteinhormone, Proteinrezeptoren, Strukturproteine und Regulatorproteine. Spezifische Klassen von Enzymen sind antibiotische entgiftende Enzyme wie TEM-β-Lactamasen der Klassen A, B, C und D sowie Chloramphenicolacetyltransferase, Carbonylhydrolasen wie Serin und Carboxylproteasen, z. B. Subtilisin, Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypeptidase und dergleichen, Lipasen wie Phospholipase A, Lipoproteinlipase, Pancreaslipase und Lysosomenlipase, Endo- und Exoglycosidasen wie Endoglycosidase H, Nucleasen wie Exonucleasen, z. B. menschliche DNAse I und RNAse A, Endonucleasen wie EcoRI und BamHI, entgiftende Enzyme wie Catalase, Peroxidase und Superoxid-Dismutase und Proteinkinasen wie Proteinkinase C. Beispiele für Proteinhormonrezeptoren sind Wachstumshormone, z. B. menschliches Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon und Proteinhormonrezeptoren wie somatogene und diabetogene Rezeptoren für Wachstumshormone. Weitere wichtige Rezeptoren sind mit G-Protein gekoppelte Rezeptoren wie B-adrenerge Rezeptoren und Muscarinrezeptoren. Beispiele für Strukturproteine, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert werden können sind Collagen, Myosin, Tubulin und Actin. Die oben genannten Vertreter stehen exemplarisch für erfindungsgemäß modifizierbare Precursor-Polypeptide.
Ist ein konkretes Precursor-Polypeptid für die Modifizierung gewählt, wird die das gewählte Polypeptid codierende DNA im allgemeinen isoliert und in einen Vektor geklont, der zur Replikation und Selektion im gewählten Mikroorganismus für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet ist. Im allgemeinen werden für das Klonen und die Modifizierung der Target-DNA Prokaryonten wie E. coli, Bacillus, Salmonella sowie einfache Eukaryonten wie Hefe (Saccharomyces) gewählt und für jeden konkreten Klonungswirt wird ein entsprechender Vektor gewählt. Die Proteine können außerdem unmittelbar in komplexeren eukaryontischen tierischen Zellen exprimiert werden. Derartige Organismen und Vektoren sind dem Fachmann allgemein bekannt.
In vielen Fällen ist es wünschenswert, die ein Polypeptid codierende Target-DNA in einer exprimierbaren Form zu klonen, um das durch die modifizierte Target-DNA codierte modifizierte Polypeptid zu analysieren. Je nach dem für die Modifizierung gewählten konkreten Precursor-Polypeptid und den für die Klonung und/oder Exprimierung zu verwendenden Wirt können die zur Exprimierung der Target-DNA und der modifizierten Target-DNA befähigten replizierbaren Expressionsvektoren vom Fachmann leicht ausgewählt werden. Erfolgen die Klonung und die Modifizierungen in einem einzigen Zelltyp unter nachfolgender Exprimierung in einem anderen Zelltyp, d. h. zum Beispiel bei einer Klonung und einer Modifizierung in einem Prokaryonten unter nachfolgender Exprimierung in Eukaryontenzellen, wie z. B. in einer Gewebekultur und dergleichen, können vom Fachmann geeignete Shuttlevektoren konstruiert werden. Es kann aber auch eine die Target-DNA enthaltende DNA-Kassette in einen replizierbaren Vektor inseriert, modifiziert und danach entfernt und in einen geeigneten Vektor für die Exprimierung des modifizierten Polypeptids inseriert werden.
Ist die Target-DNA ausgewählt und geklont, können verschiedene Modifizierungen durchgeführt werden, um die Target-DNA- Sequenz mit den erfindungsgemäßen Verfahren herzustellen. Je nach der Struktur des Exzisionslinkers und des Mutationslinkers, wie sie nachfolgend näher beschrieben werden, führt das erfindungsgemäße Verfahren zur Substitution, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Targetnucleotide in der Target-DNA. Umfasst die Target-DNA Codone, ist es möglich, eines oder mehrere Targetnucleotide so zu ersetzen, dass eine vorgegebene Modifizierung eines oder mehrerer Codone erfolgt. So ist es z. B. bis zu einem gewissen Grad wünschenswert, praktisch sämtliche möglichen Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren angrenzenden Codonen durchzuführen, innerhalb deren ein oder mehrere Bereiche, die den gesamten aktiven Site eines Enzyms oder einen Teil davon umfassen, die Exzisions- und Mutationslinker ausgewählt werden, welche die Targetnucleotide eines oder mehrerer angrenzender vorbestimmter Codone innerhalb jedes Bereichs durch Randommutationsnucleotide ersetzen. Andererseits können die Targetnucleotide aus einem oder mehreren angrenzenden Codonen auf einer Target-DNA durch Randommutationsnucleotide substituiert werden. Wie weiter unten näher beschrieben werden wird, führt die Randomintegration des erfindungsgemäßen Exzisionslinkers in die Target-DNA zur Randommodifizierung der Targetnucleotide in der Target-DNA. Zur Modifizierung der vorgegebenen Targetnucleotide kommt es jedoch, wenn der Exzisionslinker in die Target-DNA einer der vorgegebenen Insertionssites innerhalb oder angrenzend an das zu modifizierende Targetnucleotid eingeführt wird. Wie weiter unten näher beschrieben werden wird, wird ein äußerst einfaches und wirksames Verfahren unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) geoffenbart, welches die Insertion des Exzisionslinkers an einem vorgegebenen Site in der Target-DNA erleichtert.
Fig. 2 stellt eine Ausführungsform der Erfindung dar, bei der nach der Spaltung alle Produkte der Typ IIS-Endonuclease mit stumpfem Ende erzeugt werden. wie Fig. 2A zeigt, umfasst die Target-DNA zwei Anteile, und zwar einen ersten DNA-Anteil und einen zweiten DNA-Anteil, die durch den Insertionssite eines Exzisionslinkers getrennt sind. Auf der ersten Verfahrensstufe wird ein "Exzisionslinker" in die Target-DNA entweder zufällig an irgendeiner Stelle in der Target-DNA oder an einem vorgegebenen Insertionssite eingeführt. Der Exzisionslinker dient dazu, die Targetnucleotide aus der Target-DNA "herauszuschneiden" und umfasst eine doppelsträngige DNA, welche eine erste Erkennungssequenz und eine zweite Erkennungssequenz für dieselbe oder zwei unterschiedliche Typ IIS-Restriktionsendonucleasen kodiert (Fig. 2B). Die Erkennungssequenzen (R) sind an jedem Ende des Exzisionslinkers oder nahe dem Ende angeordnet und so ausgerichtet, dass die kognate Typ IIS-Restriktionsendonuclease für jede Erkennungssequenz zwischen den beiden Erkennungssequenzen nicht spaltet (Fig. 2B). Der Pfeil bei R im Exzisionslinker in Fig. 2 gibt die Richtung des durch jede Erkennungssequenz codierten Spaltungssite an. Gewöhnlich sind mehrere Spacernucleotide zwischen den beiden Erkennungssequenzen angeordnet, um die Effizienz der nachfolgenden Entfernung Exzisionslinkers zu erhöhen. Außerdem können zwischen den Erkennungssequenzen wie den Restriktionssites unterschiedliche Marker und/oder Selektionseigenschaften codiert werden, um die Ermittlung des Sites der Insertion des Exzisionslinkers bzw. die Selektion erfolgreicher, den Exzisionslinker enthaltender Transformanten zu erleichtern. In den meisten Fällen ist die Erkennungssequenz für jede Typ IIS-Nuclease an jedem Ende des Exzisionslinkers angeordnet. Für bestimmte Verwendungszwecke kann die Erkennungssequenz jedoch auch ein oder mehrere Nucleotide hinter dem Ende des Exzisionslinkers angeordnet sein. Bei einer solchen Positionierung kann eine Modifizierung der Zahl der auf den nachfolgenden Stufen entfernten Targetnucleotide erreicht werden. Die Positionierung einer oder mehrerer Erkennungssequenzen in einem gewissen Abstand vom Ende des Exzisionslinkers kann z. B. wünschenswert sein, wenn dieser an einem vorgegebenen Site inseriert wird und nur Targetnucleotide von vorgegebenen Codonen einer Target-DNA zu modifizieren sind. Eine derartige Variierung in der Positionierung der Erkennungssequenz ist für einen Fachmann, der den Lehren dieser Anmeldung folgt, durchaus einsichtig. Die hier verwendeten Ausdrücke "Exzisionslinker" und "bidirektional spaltender Exzisionslinker" bedeuten eine DNA der erwähnten Struktur.
Durch die Insertion des Exzisionslinkers in den Insertionssite der Target-DNA entsteht eine erste modifizierte DNA, welche den ersten DNA-Anteil, den Exzisionslinker und den zweiten DNA-Anteil umfasst (Fig. 2C). Wird so inseriert, codieren die erste und die zweite Erkennungssequenz des Exzisionslinkers den ersten bzw. zweiten Spaltungssite im ersten und zweiten DNA-Anteil der ersten modifizierten DNA. Diese Nucleotide der Target-DNA, die zwischen jedem Spaltungssite und dem Site für die Insertion des Exzisionslinkers enthalten sind, umfassen einen ersten und einen zweiten Targetnucleotid-Endbereich (als ersten und zweiten TNEB bezeichnet). Diese Targetnucleotide werden nun aus der Target- DNA mit den erfindungsgemäßen Verfahren entfernt.
Die Verdauung der ersten modifizierten DNA mit der kognaten Typ IIS-Restriktionsendonuclease für jede Erkennungssequenz führt zu einer zweiten, den dritten und vierten DNA-Anteil umfassenden modifizierten DNA. Dieser dritte und vierte Anteil entsprechen dem ersten und zweiten DNA-Anteil, nur dass die Targetnucleotide jeder TNER entfernt wird. Wie aus Fig. 2D hervorgeht, werden die Targetnucleotide jeder TNER durch die Verdauung zusammen mit dem Exzisionslinker entfernt. Der dritte DNA-Anteil entspricht somit dem ersten DNA-Anteil minus Targetnucleotid N&sub1; bis Nx. Genauso entspricht der vierte DNA-Anteil dem zweiten DNA-Anteil minus Targetnucleotide. Ny bis N&sub2;. Obwohl die geoffenbarte konkrete Ausführungsform die Targetnucleotide aus dem ersten und dem zweiten DNA-Anteil entfernen, versteht es sich von selbst, dass es auch möglich ist, Targetnucleotide lediglich entweder aus dem ersten oder dem zweiten DNA-Anteil mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zu entfernen.
Danach wird ein "Mutationslinker" (manchmal auch als "bidirektional spaltender Mutationslinker" bezeichnet) (Fig. 2E) mit den Enden des dritten und vierten Anteils der zweiten modifizierten DNA ligiert, um eine dritte modifizierte DNA zu bilden (Fig. 2F). Wie der oben beschriebene Exzisionslinker codiert auch der Mutationslinker zwei Erkennungssequenzen für dieselbe oder zwei unterschiedliche Typ IIS-Restriktionsendonucleasen (Fig. 2E). Diese beiden Erkennungsequenzen (manchmal auch als dritte und vierte Erkennungssequenz bezeichnet) sind jedoch im Mutationslinker so ausgerichtet und angeordnet, dass zwischen jeder Erkennungssequenz und dem Ende des Mutationslinkers ein Spaltungssite (manchmal auch als dritter und vierter Spaltungssite bezeichnet) zu liegen kommt (siehe Fig. 2E). Diese Nucleotide zwischen jedem Spaltungssite und dem Ende des Mutationslinkers werden als "Mutationsnucleotide" bezeichnet und umfassen die "Mutationsnucleotidendregionen" (MNER) des Mutationslinkers. Wie aus der nachfolgenden Diskussion bezüglich der Verwendung der Typ IIS-Endonucleasen, welche stufenförmige Spaltungsenden erzeugen, hervorgeht, werden alle in einer oder in beiden Mutationsnucleotidendregionen enthaltenen Mutationsnucleotide oder ein Teil davon in die modifizierte Target-DNA aufgenommen. Wird so konstruiert, enthält die Mutationsnnucleotidendregion an jedem Ende des Mutationslinkers die Mutationsnucleotide M&sub1; bis Mx und My bis Mz. Diese Mutationsnucleotide können vorgegeben sein, d. h. eine vorgegebene Sequenz oder ein oder mehrere zufällige Nucleotide umfassen. Je nach dem konkreten Typ von Typ IIS-Endonuclease, die durch die dritte und vierte Erkennungssequenz codiert werden, werden zwischen jede Erkennungssequenz und Mutationsnucleotidendregion Spacernucleotide S&sub1; bis Sn aufgenommen, so dass der Spaltungssite für die kognate Typ II-Endonuclease im Mutationslinker entsprechend positioniert ist. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform kann der Bereich zwischen den beiden Erkennungssequenzen auch einen selektierbaren Marker wie lacO codieren, der durch entsprechende Färbung nachweisbar ist, um die erfolgreichen, den Mutationslinker enthaltenden Transformanten zu ermitteln und die Größe der Bibliothek zu messen.
Nach der Ligation des Mutationslinkers mit der zweiten modifizierten DNA wird die auf diese Weise gebildete dritte modifiziert DNA (Fig. 2F) mit der kognaten Typ IIS-Restriktionsendonuclease verdaut, um zur vierten, den fünften und sechsten DNA-Anteil umfassenden modifizierten DNA zu gelangen (Fig. 2G). Der fünfte und sechste Anteil entsprechen dem dritten und vierten DNA-Anteil, nur dass die Mutationsnucleotide M&sub1; bis Mx und/oder My bis Mz, die zuvor in den MNER enthalten waren, jetzt dem dritten und/oder vierten DNA-Anteil hinzugefügt werden. Die Enden des fünften und sechsten Anteils werden dann zusammen ligiert, um die modifizierte Target-DNA zu ergeben, bei der die Nucleotide N&sub1; bis Nx und/ oder Ny bis Nz aus der Target-DNA entfernt wurden und die Mutationsnucleotide M&sub1; bis Mx und/oder My bis Mz hinzugefügt wurden.
Wie oben angegeben, betrifft das bevorzugte erfindungstemäße Verfahren die Verwendung der Erkennungssequenzen, welche die Spaltungssites für Typ IIS-Endonucleasen zur Bildung von stumpfen Enden codieren. Werden Erkennungssequenzen für Typ IIS-Endonucleasen verwendet, die infolge der Spaltung stufenförmige Enden bilden, können diese während der Entfernung des Exzisionslinkers und/oder des Mutationslinkers weiter modifiziert werden. Einer solchen Modifizierung bedarf es im allgemeinen in den meisten Fällen, um die Ligation zu erreichen. Fig. 3 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, wobei jede der Erkennungssequenzen im Exzisionslinker sowie im Mutationslinker die Spaltung für die Typ IIS- Endonuclease unter Bildung von stufenförmigen Enden codieren. Fig. 3 illustriert die Verwendung einer Typ IIS-Endonuclease, für die die Spaltungsstelle sechs Nucleotide in 5'-Richtung und drei Nucleotide in 3'-Richtung vom Ende ihres Erkennungssites entfernt ist. Bisher wurde keine einzige Typ IIS-Endonuclease für diese genaue Spaltungscharakteristik beschrieben (siehe Tabelle I); dieses Beispiel dient jedoch der Illustration der Prinzipien, auf denen das erfindungsgemäße Verfahren beruht, wenn durch die konkret verwendete Typ IIS-Endonuclease stufenförmige Enden erzeugt werden. Wie Fig. 3 zeigt, werden die Nucleotide am ersten Spaltungssite in der ersten modifizierten DNA mit X&sub1; bis X&sub6; mit den entsprechend gepaarten Nucleotiden X&sub1;' bis X&sub6;' bezeichnet. Die Nucleotide X&sub7; bis X&sub1;&sub2; und die Komplementärnucleotide X'&sub7; bis X'&sub1;&sub2; sind in ähnlicher Weise etwa am zweiten Spaltungssite angeordnet. Nach der Spaltung mit einer Typ IIS- Endonuclease wird ein dritter DNA-Anteil gebildet, bei dem die Nucleotide X1, X2 und X3 einzelstängige DNA bilden. In ähnlicher Weise wird ein vierter DNA-Anteil mit drei Nucleotiden (X10, X11 und X1) aus einzelsträngiger DNA am Ende gebildet. Eine Modifizierung des dritten und vierten Anteils umfasst die Behandlung einer derartigen DNA mit einer entsprechenden DNA-Polymerase, wie dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I von E. coli in Anwesenheit von Nucleotidtriphosphaten. Durch diese Behandlung wird die einzelsträngige DNA mit dem entsprechenden dazugehörigen Basenpaar aufgefüllt. Der auf diese Weise erhaltene modifizierte dritte und vierte DNA-Anteil sind in Fig. 3C durch die gepaarten Basen
X&sub1;'X&sub2;'X&sub3;' X&sub1;&sub0;'X&sub1;&sub1;'X&sub1;&sub2;'
X&sub1;X&sub2;X&sub3; und X&sub1;&sub0;X&sub1;&sub1;X&sub1;&sub2;
dargestellt.
Die Wirkung einer solchen DNA-Polymerase-Behandlung besteht in der Beschränkung der durch den Exzisionslinker effektiv entfernten Nucleotide auf die Targetnucleotide, die durch den dem Exzisionslinker am nächsten kommenden Spaltungssite definiert sind.
Die Enden des dritten und vierten DNA-Anteils können jedoch auch mit einer einzelsträngigen Exonuclease behandelt werden, um die nicht basengepaarten Nucleotide zu entfernen. Bei einer solchen Behandlung werden X&sub1;, X&sub2;, X&sub3; und X&sub1;&sub0;, X&sub1;&sub1;, X&sub1;&sub2; entfernt und auf diese Weise wird aus der Target-DNA die maximale Zahl von Targetnucleotiden entfernt. Wird z. B. ein Exzisionslinker verwendet, der zwei BspMI-Erkennungssequenzen am Ende des Linkers positioniert enthält, wird die erste in Fig. 1B dargestellte modifizierte Target-DNA erzeugt. Durch die Verdauung mit BspMI werden vier Targetnucleotide aus einem Strang und acht Targetnucleotide aus dem anderen Strang des ersten und zweiten DNA-Anteils mit dem Exzisionslinker entfernt. Werden die Enden des ersten und zweiten DNA-Anteils mit der DNA-Polymerase behandelt, werden auf jeder Seite des Insertionssites aus der Target-DNA genau vier Nucleotide entfernt. Werden der erste und zweite DNA- Anteil jedoch mit Exonuclease behandelt, werden von jeder Seite des Insertionssites insgesamt acht Nucleotide entfernt. Unter Verwendung von BspMI kann, je nach dem Modifizierungsverfahren eine Gesamtheit von acht oder sechzehn Nucleotiden im Verlauf der Vorstufen des erfindungsgemäßen Verfahrens entfernt werden.
In ähnlicher Weise weisen, wenn der Mutationslinker die Spaltung durch Typ IIS-Endonuclease unter Bildung von stufenförmigen Enden codiert, der dritte und vierte Spaltungssite im Mutationslinker einen Spaltungssite auf, der in Fig. 3 schematisch für die Mutationsnucleotide M&sub1; bis M&sub6; und M&sub7; bis M&sub1;&sub2; mit entsprechenden Basenpaar-Mutationsnucleotiden M&sub1;' bis M&sub6;' und M'&sub7; bis M'&sub1;&sub2; dargestellt ist. Wie daraus zu ersehen ist, werden, wenn der Mutationslinker mit dem dritten und vierten Anteil (oder dem dritten und vierten modifizierten Anteil) ligiert wird und die auf diese Weise gebildete dritte modifizierte DNA mit kognater Typ IIS-Endonuclease verdaut wird, der in Fig. 3(e) dargestellte fünfte und sechste DNA-Anteil erhalten. Wie ferner daraus zu erkennen ist, sind die Nucleotide M&sub1;, M&sub2; und M&sub3; bzw. M'&sub1;&sub0;, M'&sub1;&sub1; und M'&sub1;&sub2; einzelsträngig. Diese Enden können mit DNA-Polymerase zur Auffüllung der einzelsträngigen Mutationsnucleotide M'&sub1;, M'&sub2; und M'&sub3; bzw. M&sub1;&sub0;, M&sub1;&sub1; und M&sub1;&sub2; behandelt werden. Bei der Auffüllung wird in die Target-DNA die maximale Zahl an Mutationsnucleotiden eingefügt. Bei Entfernung von Einzelstrangbasen durch Behandlung mit Exonuclease werden weniger Mutationsnucleotide für die konkrete Typ IIS-Endonuclease in die Target-DNA eingeführt. In ähnlicher Weise wird bei Codierung der BspMI-Spaltung sowohl durch die dritte als auch die vierte Erkennungssequenz des Mutationslinkers ein Maximum von 16 und ein Minimum von acht Mutationsnucleotiden, je nach der Modifizierungsstufe, durch den Mutationslinker hinzugefügt.
Der Ausdruck "Substitution" bedeutet hier einen 1 : 1-Ersatz eines oder mehrerer Targetnucleotide der Target-DNA durch dieselbe Zahl von zufälligen oder vorgegebenen Mutationsnucleotiden. Die Zahl der durch den Exzisionslinker entfernten Targetnucleotide entspricht somit der Zahl der durch den Mutationslinker hinzugefügten Mutationsnucleotide. Der Ausdruck "Insertion" bedeuetet, dass mehrere Mutationsnucleotide durch den Mutationslinker hinzugefügt werden als durch den Exzisionslinker entfernt werden. Analog dazu bedeutet der Ausdruck "Deletion", dass die Zahl der durch den Exzisionslinker entfernten Nucleotide höher ist als die Zahl der durch den Mutationslinker hinzugefügten Nucleotide.
Es versteht sich von selbst, dass diese Technik modifiziert, werden kann, um Kombinationen unterschiedlicher Typ IIS-Restriktionsendonucleasen verwenden zu können. So z. B. kann der Exzisionslinker (Fig. 2B) mit Erkennungssequenzen für die Typ IIS-Restriktionsendonucleasen konstruiert werden, welche zu einer Spaltung mit stufenförmigen Enden führen, während die durch den Mutationslinker codierten Typ IIS-Restriktionsendonucleasen zu einer Spaltung unter Bildung von stumpfen Enden führen. Analog dazu kann ein Linker (Fig. 2E und 2F) eine Kombination von Typ IIS-Endonucleasen codieren, die eine Spaltung unter Bildung eines stumpfen Endes einerseits und eine Spaltung unter Bildung eines stufenförmigen Endes andererseits an entgegengesetzten Enden des Linkers erzeugen.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen codiert der Mutationslinker Random-Mutationsnucleotide. Zudem sind die Exzisions- und Mutationslinker so konstruiert, dass die Zahl der entfernten Targetnucleotide vorzugsweise dieselbe ist wie die Zahl der hinzugefügten Mutationsnucleotide, so dass es zu einer 1 : 1-Substitution der Targetnucleotide kommt. Da bei den bevorzugten Ausführungsformen die Target-DNA ein Precursor-Polypeptid codiert, wird vorzugsweise die Gesamtheit der Targetnucleotide wenigstens eines Targetcodons durch Random-Mutationsnucleotide ersetzt. In vielen Fällen wird jedoch mehr als ein Targetcodon auf diese Weise modifiziert. Die Exzisions- und Mutationslinker werden in solchen Fällen so gewählt, dass mehr als ein angrenzendes Codon modifiziert wird. In dieser Hinsicht ist aus Tabelle I zu ersehen, dass bei Verwendung eines BbvI codierenden Exzisionslinkers eine Gesamtheit von 12 Nucleotiden auf jeder Seite des Insertionssites (bei nachfolgender Behandlung mit Exonuclease) für eine Gesamtheit von 24 entfernten Nucleotiden entfernt werden kann. Wird ein spezifisches Target gewählt, so dass der Insertionssite zwischen Codonen zu liegen kommt, kann eine Gesamtheit von acht angrenzenden Codonen entfernt und durch 24 im Mutationslinker enthaltene Random- Mutationsnucleotide substituiert werden. Bei Verwendung von BbvI nach dem obigen Verfahren werden somit maximal acht angrenzende modifizierbare Codone erreicht. Bei der Ausführung der Erfindung sollten jedoch vorzugsweise ein bis acht angrenzende Targetcodons, ganz besonders zwei bis sechs angrenzende Targetcodons und insbesondere zwei bis vier Targetcodons modifiziert werden. Andererseits sollten vorzugsweise zwei bis vierzig Nucleotide, insbesondere zehn bis zwanzig Nucleotide und ganz besonders fünfzehn bis zwanzig Nucleotide modifiziert werden.
Das oben beschriebene Verfahren kann natürlich von einem Fachmann so angepasst werden, dass mehr als 24 Nucleotide ersetzt werden. Derartige Modifizierungn umfassen Standardverfahren zur Entfernung von Nucleotiden aus der gespaltenen Insertionsstelle vor der Ligation mit dem Exzisions- oder Mutationslinker. Diese Nucleotide werden dann durch zufällige Nucleotide ersetzt, die den Mutationslinker im Überschuß, bezogen auf die Zahl der aus der Target-DNA durch den Exzisionslinker entfernten, hinzugefügt werden.
Wie ober angegeben, werden die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren modifizierten Targetnucleotide durch den Insertionssite des Exzisionslinkers ermittelt. Ist der Insertionssite auf der gesamten Target-DNA zufällig verteilt, werden gegebenenfalls alle Nucleotide in der Target-DNA modifiziert. Da es im allgemeinen nur an einem einzigen Insertionssite für jeden einzelnen die Target-DNA enthaltenden Vektor zur Insertion des Exzisionslinkers kommt, wird bei Ausführung der Erfindung eine Vielzahl modifizierter Target- DNA erzeugt. Natürlich kommt es bei einer zufälligen Insertion auch zur Modifizierung des die jeweilige Target-DNA enthaltenden Vektors und nicht alle durch das erfindungsgemäße Verfahren verursachten Modifizierungen können innerhalb der jeweilig konkreten DNA durchgeführt werden. Solche Nebenreaktionen vermindern jedoch nicht die Verwendbarkeit der Erfindung, da Replikationsvektoren, welche lediglich die Modifizierung der Target-DNA enthalten, den Hauptanteil der Replikations- und Selektionssequenzen außerhalb des die Target-DNA enthaltenden Bereichs beibehalten. Bei zufälliger oder halbzufälliger Insertion eines Exzisionslinkers kann jedes dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden. Bei Random-Insertion wird der Exzisionslinker an irgendeiner Stelle auf der Target-DNA angeordnet. Auf diese Weise kann gegebenenfalls jeder Satz aus 1 bis 24 angrenzenden Nucleotiden durch Random-Sequenzen ersetzt werden. Derartige Verfahren der Random-Insertion umfassen die Insertion nach der DNAseI-Spaltung der Target-DNA, wie von Heffron et al. (siehe oben) beschrieben, und die Insertion eines Exzisionslinkers nach der teilweisen Verdauung mit Restriktionsendonuclease, wie von Kwoh et al. beschrieben (siehe oben). Die DNaseI-Spaltung führt zu einer echten Random-Insertion, während das Verfahren nach Kwoh zu einer halbzufälligen Insertion führt. In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck "halbzufällige Insertion" die Insertion an einem einzigen Spaltungssite außerhalb mehrerer codierter Spaltungssites für eine Endonuclease oder für ein ganzes Gemisch von Endonucleasen. Die erste Einzelspaltung erreicht man durch Steuerung der Reaktionsbedingungen für die Begünstigung einer einzigen Spaltung pro Molekül. Für eine wirksame Insertion des Exzisionslinkers können auch transponierbare Elemente, bekannt auch unter der Bezeichnung "Transposone" verwendet werden. So z. B. ist bekannt, dass eine DNA-Sequenz, welche Transposontarget-Wiederholungen, die in der Nähe der Enden und nicht genau an den Enden eingebettet sind, kodiert, erfolgreich in die DNA inseriert werden können (Phadnis, S. H. et al., PNAS 86: 5908-5912, 1989). Dieses Verfahren kann auch erfindungsgemäß angewandt werden, wodurch der Exzisionslinker Typ IIS Erkennungssequenzen an den Enden sowie Transposontarget-Wiederholungen, die von den Enden zurückgesetzt sind, codiert. Der Mechanismus der Transposoninsertion bewirkt dann die Insertion des Exzisionslinkers, je nach der Art der verwendeten Transposontarget-Wiederholung entweder zufällig oder an den Targetsequenz-Sites.
In vielen Fällen codiert die Target-DNA ein Precursorpolypeptid, das vorgängig gekennzeichnet wurde, wie z. B. durch eine Aminosäuresequenz und/oder eine Nucleinsäuresequenz, eine dreidimensionale Kristallstruktur und/oder mit Hilfe anderer Verfahren, um zu einer Vorinformation bezüglich der. Struktur und der Funktion dieses Polypeptids zu gelangen. In diesen Fällen kann es wünschenswert sein, die Modifikationen in der Target-DNA in Bereichen anzuordnen, welche bekannte oder vermutete Aminosäurereste codieren, welche zur Funktion des Polypeptids beitragen. So können z. B. im Falle von Enzymen ein oder mehrere Bereiche, die Aminosäurereste umfassen, die an der Katalyse, Substratbindung und/oder anderen Eigenschaften des Enzyms, wie Hitzebeständigkeit, teilhaben, die Kofaktor-Bindungssites und dergleichen modifiziert werden. Im Falle von Polypeptiden wie Hormonen können bekannte oder vermutete Bereiche innerhalb des Peptids, die mit spezifischen Hormonrezeptoren zusammenwirken, in ähnlicher Weise zur Modifizierung als Target verwendet werden. Der Ausdruck "Aktivsite" bedeutet hier Aminosäurereste, die mit dem Targetliganden bzw. dem Targetsubstrat durch Bindung oder Positionierung des Substrats zusammenwirken oder die Reaktion mit einem Substrat katalysieren oder sekundäre Mechanismen nach der Ligandenbindung bewirken. Es versteht sich von selbst, dass die Aminosäurereste des Aktivsites aufeinanderfolgen können und/oder in ihrer Abfolge voneinander getrennt sein können, wobei deren räumliche Ausrichtung von der Tertiärstruktur des Polypeptids abhängt. So können die Aminosäuren des Aktivsites in einem oder in mehreren Bereichen des Polypeptids enthalten sein und durch einen oder mehrere Bereiche der Target-DNA codiert werden.
Ferner kann eine Vielzahl von Bibliotheken erzeugt werden, von denen jede modifizierte Target-DNA enthält, die entsprechend den spezifischen Aminosäureresten oder -bereichen angeordnet ist. Die mit diesen Bibliotheken exprimierten modifizierten Polypeptide können zum Nachweis von Veränderungen in der Wechselwirkung zwischen den modifizierten Polypeptiden mit einem Target verwendet werden, das gewöhnlich mit dem nichtmodifizierten Polypeptid, wie weiter unten näher ausgeführt, in Wechselwirkung tritt. Es versteht sich von selbst, dass die modifizierten Polypeptide einer bestimmten Bibliothek nicht von einem Precursorpolypeptid durch Modifizierung des Precursorpolypeptids per se abgeleitet werden. Derartige modifizierte Polypeptide werden gewöhnlich eher durch Modifizierung der das Precursorpolypeptid codierenden Precursor-Target-DNA erhalten. Die derartige modifizierte Polypeptide codierende modifizierte DNA wird vorzugsweise mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren abgeleitet.
Ist es erwünscht den Insertionssite des Exzisionslinkers festzulegen, kann man sich einer Reihe von Verfahren bedienen. In bestimmten Fällen können als Insertionssites geeignete Restriktionssites verwendet werden, um den Exzisionslinker einzuführen, wenn der Restriktionssite in dem zu modifizierenden Bereich angeordnet ist. Der Exzisionslinker kann aber auch, und das wird bevorzugt, als Target für die Insertion an einem vorgegebenen Site unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet werden.
Beim erfindungsgemäßen PCR-Verfahren werden vier PCR-Primer verwendet, um an einem vorgegebenen Site den Exzisionslinker zu erzeugen. Der erste PCR-Primer besteht aus einem ersten Bereich, welcher den gesamten ersten Strang des ersten DNA- Anteils, der angrenzt und oberhalb des vorgegebenen Insertionssite oder einen Teil davon codiert. Der erste PCR-Primer umfasst außerdem einen zweiten Bereich, der einen ersten Anteil des zu verwendenden Exzisionslinkers codiert. Ein zweiter PCR-Primer codiert die gesamte DNA oberhalb des zweiten DNA-Strangs, der den ersten DNA-Anteil enthält, oder einen Teil davon (siehe Fig. 4). Dieser zweite PCR- Primer kann innerhalb des ersten DNA-Anteils enthalten sein oder im die Target-DNA enthaltenden replizierbaren Vektor bestehen. Die durch den ersten und den zweiten PCR-Primer codierte und zwischen diesen liegende DNA wird danach mit Hilfe der üblichen Zyklen der Behandlung mit DNA-Polymerase und Denaturierung amplifiziert. Dieser Anteil des ersten einen ersten Anteil des Exzisionslinkers codierenden PCR- Primers wird in die amplifizierte DNA aufgenommen.
Analog dazu werden ein dritter und ein vierter PCR-Primer zur Erzeugung einer zweiten amplifizierten DNA verwendet. Der dritte PCR-Primer umfasst einen ersten Bereich, welcher den gesamten ersten Strang des zweiten DNA-Anteils der Target-DNA, die an den vorgegebenen Insertionssite angrenzt und unterhalb desselben angeordnet ist, oder einen Teil davon codiert. Dieser dritte PCR-Primer umfasst außerdem einen zweiten, einen zweiten Anteil des Exzisionslinkers codierenden Bereich. Die zweiten Bereiche des ersten und dritten PCR-Primers codieren jeweils zusammen den gesamten zu inserierenden Exzisionslinker. Zur Verbindung mit dem dritten PCR-Primer wird ein vierter PCR-Primer verwendet, um die zweite amplifizierte DNA zu bilden. Dieser vierte PCR-Primer codiert die gesamte unterhalb auf dem zweiten Strang der den zweiten DNA-Anteil enthaltenden DNA angeordnete DNA oder einen Teil davon. Was den zweiten PCR-Primer betrifft, so kann der vierte DNA-Primer einen Teil der Target-DNA codieren oder außerhalb der Target-DNA im Replikationsvektor bestehen. Was die durch den ersten und zweiten PCR-Primer beschleunigte Amplifizierung betrifft, so wird durch den dritten und vierten PCR-Primer die DNA amplifiziert, die von den Primern codiert wird und zwischen diesen angeordnet ist, wobei zusätzlich durch die nachfolgenden Amplifizierungsstufen der zweite Bereich des dritten PCR-Primers aufgenommen wird.
Die durch die obigen PCR-Amplifikationen erhaltene erste und zweite amplifizierte DNA wird dann so ligiert, dass die Enden des ersten und zweiten Anteils des Exzisionslinkers zur Bildung der ersten modifizierten DNA ligiert werden. Die auf diese Weise gebildete erste modifizierte DNA (oder ein Anteil davon, je nach der Wahl des zweiten und vierten PCR- Primers) wird dann, wie oben beschrieben, entsprechend den erfindungsgemäßen Verfahren zur Modifizierung der TNER in der ersten modifizierten DNA verwendet.
Die modifizierte Polypeptide exprimierenden Bibliotheken der modifizierten Target-DNA werden im allgemeinen verwendet, um die Beziehung zwischen Struktur und Funktion zu analysieren. Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen, wie sie in den Beispielen dargestellt sind, wird die die antibiotische Hydrolase TEM-β-Lactamase codierende Target-DNA zur Erzeugung von modifizierte β-Lactamase codierender modifizierter Target- DNA verwendet. In Beispiel 3 wird ein spezifisches Verfahren für das Screening von Antibiotika gegen Bibliotheken modifizierter β-Lactamasen angeführt, die Modifikationen von zwei oder mehr Codonen in unterschiedlichen Bereichen der β-Lactamase enthalten. Derartige Bibliotheken können durch Modifizierung des Targete-bla-Gens hergestellt werden, das an einem Plasmid einer ganzen Reihe allgemein bekannter und leicht zugänglicher Plasmide codiert wird. Die Bibliotheken in Beispiel 3 wurden durch die Modifizierung des bla-Gens hergestellt, das an pBG66, einem Derivat von pJ1519 codiert worden war. Bei diesem Beispiel wurde der Wirt E. coli, der das Plasmid beherbergte, welches unterschiedliche modifizierte bla-Gene enthielt, auf Platten gezüchtet, die eine, die minimale inhibierende Konzentration des zu testenden Antibiotikums übersteigende Konzentration enthielt, so dass lediglich die Zellen, welche die modifizierte β-Lactamase bei verstärkter Aktivität gegen das Antibiotikum beherbergten, überlebten. Die die aktivierte modifizierte β-Lactamase kodierenden Plasmide wurden sequenziert, um die Anordnung und die Art der Mutation festzustellen.
Zusätzlich wurde festgestellt, dass diese β-Lactamase-Bibliotheken zur Ermittlung der Empfänglichkeit eines konkreten Antibiotikums gegenüber Neutralisierung durch Wildtyp- Mutanten verwendet werden können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten die Bibliotheken der nach diesem Verfahren hergestellten Randommutationen in einem oder mehreren vorgegebenen Bereichen der β-Lactamase jeweils praktisch sämtliche möglichen Aminosäuresubstitutionen und praktisch sämtliche möglichen Kombinationen dieser Substitutionen. Das gewährleistet ein wirksames Sampling der möglichen Mutationen. Ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Möglichkeit, erfolgreiche Transformanten zu ermitteln, welche den Mutationslinker enthalten, um die Zahl der einzelnen in der Bibliothek enthaltenen Kolonien zu ermitteln. Die Zahl der positiven Wirtskolonien wird dann verwendet, um die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, dass die meisten oder wenigstens die allgemein üblichen Codonkombinationen in der Bibliothek vorhanden sind. Die Aminosäuren, die durch mehr als eine mögliche Kombination von Nucleotiden codiert werden, sind statistisch mit größerer Wahrscheinlichkeit durch Randommutationen codiert, als dies bei Aminosäuren wir Triptophan und Methionin der Fall ist, die durch lediglich durch eine mögliche Kombination codiert werden. In diesem Zusammenhang bedeuten die Ausdrücke "praktisch alle möglichen Substitutionen" oder "praktisch alle Kombinationen von Substitutionen" die berechnete Wahrscheinlichkeit, dass bei mehr als ca. 50%, vorzugsweise bei 90% und insbesondere bei 99% die statistisch am wahrscheinlichsten Substitutionen und Kombinationen von Substitutionen, z. B. unter Ausschluß von Tryptophan und Methionin, in der Bibliothek enthalten sind.
Gemäß anderen Ausführungsformen der Erfindung können Bibliotheken, die modifizierte Polypeptide wie Hormone codieren, erzeugt und einem Screening unterworfen werden, um die Beziehung zwischen der Struktur und der Funktion derartiger Proteine zu ermitteln. Das für die Modifizierung als Target dienende Polypeptid kann z. B. menschliches Waschstumshormon (hGH) sein. Derartige modifizierte hGH's können mit einem Target, wie dem somatogenen hGH-Rezeptor, oder dem diabetogenen hGH-Rezeptor in Berührung gebracht werden, um die Wirkung derartiger Modifikationen, sofern vorhanden, zu ermitteln. Die dadurch gewonnenen Informationen können dann für eine rationelle Konstruktion von hGH-Analoga mit spezifischer anabolischer oder metabolischer Aktivität verwendet werden. Die mutierenden hGH-Analoga können aber auch unmittelbar auf Aktivität in einer Zellkultur oder in Tierversuchen geprüft werden. Umgekehrt kann das als Target dienende Polypeptid auch einer der hGH-Rezeptoren sein. Gemäß dieser Ausführungsform werden die Mutationen im hgH-Rezeptor einem Screening auf Aktivität bei Kontaktierung mit dem normalen hGH-Liganden unterworfen werden. Die Ermittlung der Wirkung der Aminosäure und der homologen Segmentsubstitution von Polypeptiden wie Hormonen und dergleichen wird in der PCT- Veröffentlichung Nr. WO/89-04778, veröffentlicht am 30. Oktober 1989, auf die hier Bezug genommen wird, diskutiert. Derartige Verfahren können analog dazu zur Ermittlung und zur Analyse von Veränderungen in der Aktivität eines oder mehrerer modifizierter Polypeptide verglichen mit dem nicht modifizierten Polypeptid verwendet werden.
Es folgt ein Beispiel, durch das der Erfindungsumfang jedoch nicht eingeschränkt wird.

BEISPIEL I

Erzeugung von Bibliotheken auf der Basis von Randomsubstitution im β-Lactamase-Gen

Drei bis sechs Codone wurden als Einheiten randomisiert, um den Prozentanteil an möglichen funktionellen Aminosäurekombinationen zu ermitteln. Das Verfahren würde dann mehrmals für die einzelnen Bereiche des Gens wiederholt, um zu einem Überblick über die Bereiche des Proteins zu gelangen, die für Struktur und Aktivität von Bedeutung sind.

Stoffe und Verfahren:

Die für die Konstruktion der "Exzisionslinker" und "Mutationslinker" verwendeten Oligonucleotide (Fig. 6) sowie die für die DNA-Sequenzierung und für die PCR verwendeten Primer wurden wie üblich an einer Anlage für die Oligonucleotidsynthese von der Firma Genentech, Inc. unter Anwendung von Standardmethoden synthetisiert. Das Plasmid pJ1519 (Cunningham and Wells, ibid.) stammte von J. Wells. Das Plasmid pBG66 wurde für alle Experimente, wie sie hier beschrieben werden, verwendet. Es ist ein Derivat von pJ1519, das man durch Deletion des 210 bp-BglI-Fragments erhält. Die Bakterienstämme E. coli HB101 (hsdS20 (rB mW supE44, ara14, λ, galK2, lacY1, proA2, rspL20, xyl-5, mtL1, recA13, mcrA(+) und mcrB(-)) wurden für die Konstruktion einer Random-Bibliothek verwendet und TG1 (K12, A[lacpro], supE, thi, hsdDS/F'traD36, proA+B+, lagI, lacZM15) wurden zum Testen der Ampicillinresistenz und für die Herstellung einer einzelsträngigen DNA verwendet.

Nährmedien und Reagenzien:

Der E. coli-Stamm HB101 wurde in LB-Medium (Miller, J. H. (1972), "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory) gezüchtet. Der E. coli-Stamm TG1 wurde auf Minimalmedium-Platten aus Glukose gehalten (Maniatis, T. et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Gold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory)) und das Wachstum erfolgte in Flüssigkultur für die Isolierung einer einzelsträngigen DNA in einem Minimalmedium M9 sowie in 2X YT-Medium (Miller, ibid.). Alle Enzyme stammten von New England Biolabs, mit Ausnahme der Kälberdarmphosphatase, die von Boehringer Mannheim bezogen wurde. Die DNAseI stammte von Worthington. XGAL stammte von Clontech Laboratories, Inc.

Plasmidisolierung:

Plasmid-DNA wurde aus E. coli durch alkalische Lyse hergestellt (Maniatis et al., ibid.). Die DNA wurde in Cäsiumchlorid-Stufengradienten (Garger, S. et. al. (1983), Biochem. Biophys. Res. Comm., 117: 835-842) gereinigt. Plasmid- Minipräparate wurden aus einer 1,5 ml-Kultur nach dem Alkalilyse-Protokoll von Birnboim, H. C. et al. (1979), Nucl. Acids Res., 7 : 1513-1523 hergestellt. Die einzelsträngige Plasmid-DNA wurde für die DNA-Sequenzierung, wie von Maniatis et al., ibid., beschrieben, hergestellt.

DNA-Sequenzierungsreaktionen:

Das Verfahren des Didesoxy-Kettenabbruchs für die DNA-Sequenzierung wurde auf einzelsträngige Plasmid-DNA-Matrizen angewandt. Für die Ausgangssynthese aus definierten Sites innerhalb des bla-Gens wurden üblicherweise synthetisierte Oligonucleotide verwendet.

Erzeugung von Exzisionslinker-Insertionen in bla:

Ein Beispiel für dieses Verfahren ist der Versuch der bla- C66-Mutagenese, bei dem die Codone 72, 73 und 74 randomisiert wurden, wie dies Fig. 6 zeigt. Das als Ausgangsmaterial verwendete Plasmid pBG66 enthält keinerlei Sites für BspMI, die für diesen Versuch verwendete Typ IIS-Restriktionsendonuclease.
Auf der ersten Stufe der Mutagenese-Experimente wurde ein Exzisionslinker, der an jedem Ende BspMI-Sites (Fig. 6b) enthielt, in das bla-Gen inseriert (Fig. 6a und 6c), um ein erstes modifiziertes bla-Gen zu bilden. Zwischen den beiden BspMI-Erkennungssequenzen war eine 18bp-Spacersequenz angeordnet, die einen EcoR1-Spaltungssite enthielt. Die Exzisionslinker-Insertionen, die zu den blaC66-Mutationen führten, wurden durch Ligation des Linkers mit dem Plasmid hergestellt, das durch teilweise Restriktionsendonuclease- Verdauung halbstatistisch linearisiert wurde (Kwoh, T. J. et al. (1983), J. Mol. Appl. Genet., 2: 191-200). Neben dem bla C66 ergab dieses Verfahren auch noch die mit bla C80, bla C86, bla C83, bla C82, bla C81, bla C84 und bla C85 bezeichneten Insertionen (s. Fig. 7). Die Insertionen bla C14, bla C1, bla C7 und bla C31 wurden nach der statistischen Insertion (Randominsertion) des Exzisionslinkers nach der Spaltung mit DNAseI wie von Heffron et al. (1978), ibid., beschrieben, erhalten. Die Insertionen bla C67, bla C75, bla C76, bla C73, bla C70, bla C71 und bla C74 wurden durch sitespezifische Insertion des Exzisionslinkers, wie in Beispiel 2 beschrieben, erhalten. Sämtliche Plasmide, die einen Exzisionslinker enthielten, der mit einer dieser Methoden inseriert wurde, wurden auf ähnliche Weise wie unten beschrieben, behandelt:

Erzeugung von Bibliotheken durch Randomsubstitution:

Die oben beschriebenen, den Exzisionslinker enthaltenden Plasmide wurden an CsCl&sub2;-Gradienten gereinigt. Jede einzelne Linkerinsertion wurde der folgenden Prozedur unterzogen:
1,5 ug des Linkerinserts, das das Plasmid enthielt, wurde mit 2 E Restriktionsendonuclease BspMI in 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 ug/ml Rinderserumalbumin (BSA) mit einem Gesamtvolumen von 40 ul bei 37ºC über Nacht (ca. 16 Stunden) verdaut. Nach der Verdauung wurde 1 E Kalbsdarmphosphatase (CIP) zugesetzt, wonach das Reaktionsgemisch bei 37ºC während 30 min lang inkubiert wurde. Die CIP wurde dann durch Inkubierung bei 70ºC während 15 min inaktiviert. Dem Reaktionsgemisch wurden dann dNTP's bis zu einer Konzentration von 0,05 mM zusammen mit 10 E Klenow- DNA-Polymerase zugesetzt, wonach das Reaktionsgemisch bei 15ºC 30 min inkubiert wurde. Danach wurden die Reaktionsprodukte an einem 4%igen Acrylamidgel aufgetrennt. Das linearisierte Plasmid wurde durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht, wonach die Bande aus dem Gel herausgeschnitten und einer Elektroelution in einem Dialyserohr unterzogen wurde (Maniatis et al., ibid.). Die eluierte DNA wurde dann in Ethanol ausgefällt und erneut in 10 ul TE suspendiert. Ein 50facher molarer Überschuss eines Mutationslinkers mit einer Random-DNA an seinen Enden (Fig. 6F) wurde dann mit der gesamten eluierten Plasmid-DNA (ca. 1,2 ug) über Nacht bei 23ºC in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl&sub2;, 1 nM ATP, 20 mM DTT, 100 ug/ml BSA und 100 E T4 DNA-Ligase bei einem Gesamtvolumen von 50 ul ligiert. Danach wurde das Reaktionsgemisch durch Inkubieren bei 70ºC während 10 min inaktiviert. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf 150 mM NaCl eingestellt, wonach 80 E XhoI zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37ºC 2 Stunden lang inkubiert. In den Ausgangslinker ist ein XhoI-Site eingeschlossen. Auf diese Weise gewährleistet die Verdauung, dass jedes Plasmid, das nicht mit BspMI verdaut wurde, nicht unter die Mutationslinkerinserte aufgenommen wird. Das durch die Verdauung mit XhoI erhaltene Produkt wurde dann mit Phenol : Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und erneut in 4 ul TE suspendiert. Diese DNA wurde dann mit Hilfe der Apparatur des Typs Gene Pulser (Bio-Rad) für die Elektroporation von E. coli-HB101 herausgezogen. Die Wirksamkeit der Transformation unter Verwendung dieser Methode betrug gewöhnlich 5 · 10&sup8; Transformanten pro ug Plasmid-DNA. Die Transformanten wurden dann an LB-Platten selektiert, die 12,5 ug/ml Chloramophenicol und 100 ug/ml XGAL enthielten. Der Mutationslinker enthält einen lacO-Site, so dass die Transformanten, die einen Mutationslinker enthalten, blau sind (Herrin, G. L. et al. (1984), Gene 32: 349-353). Weiße Kolonien stellen dabei rezirkularisierte Plasmide ohne den Mutationslinker dar. Dies wurde durch Isolierung der Plasmid-DNA aus blauen und weißen Kolonien und Überprüfung auf den Mutationslinker mit Hilfe von Verdauungsprodukten des Restriktionsenzyms bestätigt. Bei allen Versuchen machten die blauen Kolonien 95% oder mehr der Transformanten aus. Sämtliche Transformanten wurden dann gesammelt und die Plasmid-DNA isoliert und an einem CsCl&sub2;-Gradienten gereinigt.
2 ug des gesammelten plasmidhaltigen Mutationslinkers wurden mit 2 E BspMI unter denselben Pufferbedingungen, wie oben beschrieben, über Nacht bei 37ºC bei einem Gesamtvolumen von 50 ul verdaut. Anschließend wurden bis zu einer Konzentration von 0,05 mM dNTPs und danach 10 E Klenow-DNA-Polymerase zugesetzt und bei 15ºC während 30 min inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 10 ul TE erneut suspendiert. Das verdaute, stumpf endende Plasmid wurde dann unter Ligationsbedingungen, wie oben beschrieben, rezirkularisiert. Das Reaktionsgemisch wurde bei 70ºC während 10 min hitzeinaktiviert und auf 50 mM KCl eingestellt. Danach wurden 50 E NruI zugefügt, wonach das Verdauungsprodukt bei 37ºC 2 St. lang inkubiert wurde. In den Mutationslinker war ein NruI-Site eingeschlossen, weshalb durch diese Verdauung jeder Mutationslinker entfernt wurde, der Plasmide enthielt, die nicht durch BspMI verdaut worden waren. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 4 ul TE erneut suspendiert. Die rezirkularisierte DNA wurde durch Elektroporation in E. coli-HB101 eingeführt und auf LB-Platten ausgebracht, die 12,5 ug/ml Chloramphenicol und 100 ug/ml XGAL enthielten. Die Platten enthielten bei allen Versuchen mehr als 99% weiße Kolonien, was darauf hindeutete, dass der lagO-Anteil des Mutationslinkers freigesetzt wurde, wodurch mutierte β-Lactamase-Gene zurückblieben, die lediglich den Random-DNA-Ersatz enthielten. Sämtliche Transformanten wurden dann gesammelt, wonach die Plasmid-DNA extrahiert und an einem CsCl&sub2;-Gradienten gereinigt wurde. Diese Plasmidsammlung bildete dann die schließlich erhaltene Random-Substitutionsbibliothek, die eine große Zahl von Random-DNA anstelle der bla-DNA codierte.

Selektion der funktionellen Ersatzmutanten:

Zur Selektion der funktionellen Ersatzmutanten wurde die Bibliothek verwendet, die Random-DNA auf einem definierten Bereich enthielt, um den E. coli-Stamm TG1 durch eine CaCl&sub2;- Behandlung umzuwandeln (Maniatis et al., ibid.). Das Transformationsgemisch wurde dann auf LB-Platten ausplattiert, die 1 mg/ml Ampicillin, 10 ug/ml Ampicillin und 12,5 ug/ml Chloramphenicol enthielten.

Berechnungen:

Der bla C66-Versuch (Fig. 6; Tab. II) dient als Beispiel für die durchgeführten Berechnungen.
Der prozentuale funktionelle Ersatz bei 10 ug/ml bzw. 1 mg/ml Ampicillin pro Versuch wurde durch Division der Zahl der Transformanten auf den 10 ug/ml- bzw. 1 mg/ml-Platten durch die Zahl der Transformanten unter Verwendung von 12,5 ug/ml Chloramphenicol nach Einstellung der Chloramphenicol- Zahl für die Zahl der ein STOP-Codon enthaltenden Ersatzvorgänge berechnet. Für bla C66 beträgt die Wahrscheinlichkeit des Fehlens eines STOP-Codons [(61/64) · (61/64) · (1)] = 0,9. Die 1 für die dritte Position steht für die Tatsache, dass lediglich das erste Nucleotid des Codons randomisiert wurde, was die Möglichkeit eines STOP-Codons ausschließt. Die eingestellte Zahl an Chloramphenicol-Transformanten für blaC66 ergibt sich aus dem Wert von 0,9 · absolute Zahl der Chloramphenicol-Transformanten.
Die Umwandlung der absoluten prozentualen funktionellen Ersatzvorgänge in den prozentualen funktionellen Ersatz pro Codon errechnete sich unter Verwendung der nten Wurzel des absoluten Bruchfunktionals, wobei n die Zahl der randomisierten Codone bedeutet. Für bla C66 ergibt dies einen Wert n von 2,2. Der Bruch gibt lediglich wieder, dass ein Nucleotid der dritten Position randomisiert wurde, was lediglich vier unterschiedliche Aminosäuren ergibt, wobei man den Wert 4/20 = 0,2 erhält.
Die gesamte mögliche Zahl an unterschiedlichen Aminosäuresequenzen für einen Ersatzversuch errechnete sich ausgehend von der Zahl der einzelnen pro randomisiertes Codon erhaltenen Aminosäuren. Bei bla C66 ergab die Berechnung 20 · 20 · 4 = 1600 unterschiedliche mögliche Ersatzmutanten. Der Faktor 4 berücksichtigt die Teilmutagenese der dritten Position.
Die Poolgröße in Tabelle II gibt die Zahl der einzelnen Random-Substitutionsmutanten in der Bibliothek wieder. Einfach ausgedrückt ist sie die Zahl der gesammelten, blaue Kolonien enthaltenden Mutationslinker. Die Zahl der nach Freisetzung des Mutationslinkers gesammelten weißen Kolonien ist ebenfalls insofern von Bedeutung, als sie, wenn sie die obige Poolgröße unterschreiten würde, die Bibliotheksgröße beschränken würde. Bei allen durchgeführten Versuchen war jedoch die Zahl der weißen Kolonien auf der Endstufe mindestens dreimal höher als der Poolgröße der blauen Kolonien entspricht. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Poolgröße bei jedem Versuch groß genug war, um die wahrscheinlichsten Ersatzmutanten (d. h. Leu Leu Leu) und die am wenigsten wahrscheinlichen (d. h. Trp Trp Trp) zu enthalten (Tabelle II), wurde unter Verwendung der Poissonschen Verteilung nach der Formel:
errechnet, wobei λ np, n Poolgröße, p die Wahrscheinlichkeit des geringsten oder häufigsten Ersatzes und x die Zahl der Häufigkeit der Sequenz in der Poolgröße n bedeuten. Bei diesen Berechnungen ist x = 0. Die Wahrscheinlichkeit, dass die jeweilige Sequenz 0 mal vorkommt, wird dann errechnet und von 1 subtrahiert, um die Wahrscheinlichkeit zu errechnen, dass die Sequenz einmal oder mehrmals im Pool vorkommt.
Der durchschnittliche Prozentanteil der funktionellen Ersatzvorgänge für die 66 mutagenisierten Codone wurde durch Addition der prozentualen funktionellen Ersatzvorgänge pro Codonzahl für jedes der 66 Codone und Division durch 66 errechnet. TABELLE II Tabelle II (Fortsetzung)
W. - Wahrscheinlichkeit
In Spalte 1 ist der Name des Mutageneseversuchs angegeben. Spalte 2 gibt die Position der mutagenisierten Codone innerhalb des bla-Gens an. Spalte 3 gibt die mögliche Gesamtzahl an unterschiedlicher Aminosäuresequenzen an, die durch die randomisierten Codone codiert werden können. Spalte 4 gibt die Zahl der einzelnen Randomersatz-Mutamen in der erzeugten Random-Bibliothek an. Spalte 5 und 6 geben die Wahrscheinlichkeit an, dass die am wenigsten und am meisten wahrscheinlichen Aminosäuresequenzen die Bibliotheksgröße des Versuchs ausmachen. Spalte 7 und 8 geben den absoluten Prozentanteil des funktionellen Ersatzes bei 10 ug/ml bzw. 1 mg/ml Ampicillin an. Spalte 9 und 10 geben den Prozentanteil an funktionellem Ersatz bei 10 ug/ml bzw. 1 mg/ml Ampicillin, standardisiert jeweils auf Codonbasis, an.
Die evolutionäre Variabilität unter den Typ A β-Lactamasen wurde als die Zahl der einzelnen Aminosäuren definiert, die in dieser Position festgestellt wurden, dividiert durch die Frequenz der am meisten vorliegenden Aminosäure (Wu, T. T. et al. (1970), J. Exp. Med., 132: 211-250).

Ergebnisse:

In diesem Beispiel diente die "Random-Ersatz"-Mutagenese zur Prüfung der Bedeutung der 19 66 Codone umfassenden Bereiche der TEM-Lactamase, welche das bla-Gen codiert. Zu Illustrationszwecken wurden oben die Methoden beschrieben, die zur Erzeugung von Mutationen in einem Bereich, und zwar von bla- C66 verwendet wurden. Zur Beschreibung der Methode der Analyse der Ergebnisse insgesamt zeigt Fig. 7 die Sammlung der nach den einzelnen in dieser Anmeldung beschriebenen Methoden erhaltenen Modifizierungen. Die einzelnen Linkerinsertionen in die einzelnen Bereiche des bla-Gens wurden mit Hilfe der drei oben bzw. in Beispiel 2 beschriebenen Methoden erhalten. Die Position der einzelnen Exzisionslinkerinserte wurde durch DNA-Sequenzierung ermittelt (oder im Fall der durch PCR erzeugten Insertionen bestätigt). Nach der Sequenzierung wurde gefunden, dass die durch die DNAseI-Behandlung erzeugten Inserte (bla C14, bla C1, bla C7, bla C31) tatsächlich kleine Deletionen von bla-DNA enthielten, die mit der Linkerinsertion zusammenfielen (Fig. 7). Wie unten beschrieben, wurden diese Versuche leicht abgeändert, um die deletierte DNA zu kompensieren. Wie in Fig. 6 dargestellt, diente die nächste Stufe des Verfahrens zur Verdauung des das Linkerinsert enthaltenden Plasmids mit BspMI.
Durch das Verdauungsmuster im Zusammenhang mit BspMI wurden infolge der Verdauung der Exzisionslinker und kleine Mengen an Bla-DNA, welche den Exzisionslinker flankierte, freigesetzt (Mormeneo et al., ibid). Die gespaltene DNA wurde dann mit Klenow-DNA-Polymerase behandelt, um ein stumpf endendes linearisiertes Plasmid zu erzeugen. Das Endergebnis ist eine 8 bp-Deletion im bla-Gen (Fig. 6e). Zum Ersatz der deletierten Nucleotide durch Random-Nucleotide wurde ein Mutationslinker mit der stumpf endenden DNA ligiert. Dieser Mutationslinker enthielt 4 bp Random-Sequenz an jedem Ende zusammen mit den eingebetteten BspMI-Sites und der lacO-Sequenz. Nach der Ligation wurde das Gemisch in E. coli durch Elektroporation transformiert, um die maximale Zahl an Transformanten zu erzeugen. Die einen Linker enthaltenden Kolonien waren aufgrund der lacO-Sequenz, welche das lacI-Gen-Produkt bindet und aus dem chromosomalen lacO-Site titriert (Herrin et al., ibid.) blau. Jede blaue Kolonie stelllte einen unabhängigen Randomsubstitutionsmutanten dar. Alle sich aus der Transformation ergebenden Kolonien wurden dann gesammelt, wonach die Plasmid-DNA extrahiert wurde. Die weißen Kolonien, die das rezirkularisierte Plasmid ohne einen Linker darstellten, wurden in den Pool aufgenommen, betrugen jedoch bei jedem Versuch weniger als 5% der Gesamtzahl der Kolonien und diese 5% wurden im Verlauf der Behandlung entfernt. Die Zahl der gesammelten blauen Kolonien ist ein Hinweis auf die Komplexität der Random-Bibliothek. Die Komplexität der Bibliothek zu kennen ist wichtig, um die Wahrscheinlichkeit ermitteln zu können, dass eine bestimmte Aminosäuresequenz in die Bibliothek aufgenommen wird. Beim bla C66-Versuch waren 1,6 · 10³ unterschiedliche Aminosäuresubstitutionen möglich und es wurden 1,6 · 10&sup4; blaue Kolonien gesammelt (Tabelle II). Die Wahrscheinlichkeit, dass der am wenigsten wahrscheinliche Ersatz, d. h. WWW in der Bibliothek vertreten ist, beträgt daher 62,5%, und die Wahrscheinlichkeit, dass der häufigste Ersatz, d. h. LLL in der Bibliothek vorliegt, beträgt 99,9% (Tab. II).
Auf der nächsten Verfahrensstufe wurde die gesamte Plasmid- DNA mit BspMI verdaut, um den lacO-Abschnitt des Linkers freizusetzen, wobei die mit dem Plasmid verbundene Random- DNA zurückbleibt (Fig. 6H). Das Plasmid wurde dann mit Klenow-DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, sowie mit DNA-Ligase zur Rezirkularisierung des Plasmids. Dies führte zum Ersatz des 8 bp des bla-Gens durch 8 bp Random-DNA. Bei den Inserten des Exzisionslinkers, die mit geringen Deletionen verbunden waren (Fig. 7), war die Deletion nach der Verdauung mit BspMI größer als 8 bp. Dies wurde durch Verwendung eines Mutationslinkers kompensiert, der eine erhöhte Menge an Random-DNA an den Enden aufwies, so dass nach der Verdauung mit BspMI die mit dem Plasmid zurückbleibende Menge an Random-DNA der erhöhten Deletionsgröße gleichkam. In diesen Fällen wurden somit mehr Codone randomisiert. Nach der Rezirkularisierung des Plasmids wurde die Random-Bibliothek verwendet, um E. coli zu transformieren. Das Transformationsgemisch wurde dann auf 10 ug/ml Ampicillin, 1 mg/ml Ampicillin bzw. 12,5 ug/ml Chloramphenicol enthaltende Agarplatten ausplattiert. 10 ug/m1 Ampicillin ist die minimale Ampicillinkonzentration, durch die noch auf β-Lactamase-Funktion selektiert. 1 mg/ml Ampicillin ist die maximale Ampicillinkonzentration, bei der E. coli gedeiht, die eine Wildtypkopie des bla-Gens auf dem Plasmid pBG66 enthält, weshalb es auf die gesamte β-Lactamase-Aktivität selektiert. Die Chloramphenicolplatten selektieren auf Anwesenheit des Plasmids pBG66, jedoch nicht auf β-Lactamase- Funktion. Die Selektionen bei niedrigen und hohen Ampicillinkonzentrationen ermöglichten die Unterteilung der funktionellen Random-Substitutionsmutanten in zwei Phenotypklassen, und zwar einerseits mit Wildtypfunktion und andererseits mit Teilfunktion. Aus den Chloramphenicolplatten wurden auch die nichtfunktionellen Mutanten isoliert, welche nicht auf die β-Lactamase-Funktion selektierten.
Die Katalyse der Spaltung der β-Lactam-Bindung des Ampicillins durch β-Lactamase erfordert es, dass das Enzym zu einer ganz bestimmten dreidimensionalen Struktur gefaltet wird, um die entsprechenden Kontakte mit dem Antibiotikum herzustellen. Modifizierte Enzyme, die gerade noch minimale Aktivität gegen Ampicillin besitzen, müssen daher die Ausgangsfaltung von β-Lactamase beibehalten, obowhl die Struktur bis zu einem gewissen Grad destabilisiert sein kann. Dennoch codieren die minimalfunktionellen Mutanten Eigenschaften, die der Proteinfaltung entsprechen. Das Vermögen von bei hohen Ampicillinkonzentrationen selektierten Mutanten bei einem gewissen Niveau mit Wildtyp-β-Lactamase zu funktionieren, legt nahe, dass diese Mutanten beständig sind und die Fähigkeit haben, zu binden und die Spaltung des Ampicillins zu katalysieren, wie dies dem Wildtyp entspricht. Diese Mutanten enthalten tatsächlich neutrale Aminosäuresubstitutionen. Durch Zählen der Zahl der Transformanten auf jedem Plattentyp war es möglich, den Prozentanteil der Random-Substitutionsmutanten, die den Wildtyp und die minimale Lactamase-Aktivität beibehielten, zu ermitteln. Der Zähler bei diesen Berechnungn war die Zahl an Transformanten auf den Ampicillinplatten und der Nenner die Zahl der Transformanten auf den Chloramphenicolplatten nach der Einstellung zur Berechnung der Wahrscheinlichkeit eines STOP-Codons in den nicht selektierten Substitutionen.
Der Prozentanteil an funktionellen Randomsubstitutionen war ein Indiz für die Bedeutung des randomisierten Bereichs für die Struktur und/oder die Funktion des Proteins. Ein größerer Prozentanteil an aktiven Substitutionen würde bedeuten, dass ein weiter Bereich von unterschiedlichen Aminosäuren die Rolle von Wildtypresten in der Struktur und Funktion des Proteins spielen könnte. Demgegenüber würde ein geringerer Prozentanteil an aktiven Substitutionen bedeuten, dass der konkrete Enzymbereich zur Struktur und Funktion des Proteins beiträgt und eine spezifische Aminosäuresequenz erforderlich macht. Das Vermögen einer Restposition, Aminosäuresubstitutionen zu tolerieren, kann anhand des Informationsgehalts interpretiert werden, der als Wert definiert ist, der mit zunehmender Zahl der zugelassenen Substitutionen abnimmt (Reidhaar-Olson et al., ibid.). So kodieren Bereiche, die einen hohen Prozentanteil an Substitutionen tolerieren, geringe Informationen im Hinblick auf Struktur und Funktion des Proteins, während Bereiche, die wenige Substitutionen tolerieren, einen hohen Informationsgehalt aufweisen.

Prozentanteil des funktionellen Ersatzes

Die Ergebnisse der 18 Mutagenese-Experimente aus Fig. 7 sind in Tabelle II zusammengefasst. Da die Zahl der randomisierten Codone bei jedem Experiment unterschiedlich war und bestimmte Codone nur teilweise randomisiert wurden, konnte der absolute Prozentanteil an funktionellen Substitutionen nicht von Versuch zu Versuch verglichen werden. Die absoluten Prozentanteile wurden demnach standardisiert, um die prozentualen funktionellen Substitutionen pro Codon für jedes Mutageneseexperiment wiedergeben zu können. Wie zu erwarten war, war die Frequenz der Randomsubstitutionen nach der Selektion bei 1 mg/ml Ampicillin geringer als bei 10 ug/ml Ampicillin. Der Prozentanteil an aktiven Substitutionen für 10 ug/ml und 1 mg/ml Ampicillin gegenüber der Position des Ersatzversuchs ist in Fig. 8 dargestellt. Es konnte festgestellt werden, dass ein überraschend großer Anteil an Substitutionen funktioneller Natur war. Was die minimale Selektion betrifft, so variierte der Prozentanteil an funktionellen Substitutionen pro Codon in einem Bereich von 5,7% für blaC84 bis 85,1% für blaC7. Der durchschnittliche Prozentanteil an Substitutionen, die bei 10 ug/ml Ampicillin für die in den Versuchen mutagenisierten 66 Codons aktiv waren, betrug 48%. Dies ergibt durchschnittlich ca. (20 · 0,48) = 9,6 unterschiedliche Aminosäuren, welche die Wildtyp-Aminosäure an jeder Restposition zu ersetzen und die β-Lactamase-Faltung noch beizubehalten vermögen. Diese Zahl sollte als die Zahl unterschiedlicher Aminosäuren betrachtet werden, welche als Restposition fungieren, wenn das übrige Protein die Wildtyp- Sequenz beibehält, da eine Kombination der Substitutionen, von denen jede die Aktivität des Proteins etwas vermindert, vermutlich zu einem inaktiven Protein führt. Dennoch legt die Zahl nahe, dass die Faltung des β-Lactamase-Proteins gegenüber Mutationen sehr tolerant ist.
Bei der Selektion mit 1 mg/ml Ampicillin variiert der Prozentanteil an funktionellen Substitutionen pro Codon in einem Bereich von 2,1% für bla C70 und bla C85 bis 46,1% für bla C83. Der durchschnittliche Prozentanteil an aktiven Substitutionen für die 66 mutagenisierten Codone lag bei 20, was durchschnittlich ca. (20 · 0,2) = 4 unterschiedlichen Aminosäuren pro Restposition entsprach, die an einer Restposition zu fungieren vermögen. Da diese Mutanten phänotypisch dem Wildtyp ähneln, geben diese Ergebnisse an, dass die Zahl der möglichen neutralen Mutationen im bla-Gen extrem groß ist.

DNA-Sequenz der bla-Mutanten

Die DNA-Sequenzen der einzelnen Substitutionsmutanten aus drei unterschiedlichen Mutageneseversuchen wurden ermittelt, um:
1) zu bestätigen, dass die Mutagenesetechnik tatsächlich zum genauen Ersatz eines Abschnitts des bla-Gens durch eine Random-DNA-Sequenz führt und
2) um genauere Informationen über die Restposition und die Art der Sequenzen zu erhalten, die in bestimmten Bereichen der β-Lactamase zulässig sind. Durch das Mutageneseverfahren werden Codonblöcke randomisiert und die relative Bedeutung dieses Blocks für die Struktur und die Funktion des Proteins ermittelt. Innerhalb des Codonblocks ist es jedoch nicht möglich zu sagen, welchen Beitrag die einzelnen Positionen zur festgestellten Bedeutung des Blocks leisten. Durch DNA- Sequenzierung mehrerer funktioneller Substitutionen aus einem Mutageneseversuch und Annahme der Aminosäuresequenzen ist es möglich, für den Bereich eine Konsenssequenz zu definieren und dadurch die Beiträge der einzelnen Positionen zu ermitteln.
Mutanten wurden sequenziert aus den bla C66-, bla C31- und bla C14-Mutageneseexperimenten. blaC66 umfasst die Restpositionen 72-74 (Zählschema gemäß Ambler, R. P. (1980), "The structure of B-lactamases", Phil. Trans. Rv. Soc. London, Ser. B, 289: 321-331). Die Sequenz der aktiven Mutanten von bla C66 ist in Fig. 9 dargestellt. Alle sequenzierten Mutanten enthielten wie erwartet 8 bp-Ersatz der bla-DNA-Sequenz durch die Random-DNA-Sequenz, was dafür sprach, dass das Verfahren wie erwartet funktionierte. Die Prüfung des Spektrums der zulässigen Aminosäuresubstitutionen ergab, dass Lys-73 eine stringente Sequenzforderung aufweist. Alle vier Mutanten, die bei 1 mg/ml Ampicillin funktionell sind und zwölf der vierzehn 10 ug/ml Ampicillin-Mutanten enthalten ein Lys in Position 73. Demgegenüber können Phe-72 und Val- 74 zumindest einige Substitutionen tolerieren. So z. B. kann Val Phe 72 ersetzen und phänotypisch ein Wildtyp sein. Analog dazu kann Leu Val-74, ohne dass sich eine Wirkung einstellt, ersetzen. Es ist möglich, dass bei Sequenzierung von über 1 mg/ml Substitutionen andere Substitutionen identifizieren würden. Die teilweise funktionellen Mutanten variierten in Postition 72 innerhalb eines weiten Bereichs, wobei wenigstens elf unterschiedliche Aminosäuren der minimalen Funktion entsprachen. Position 74 variierte ebenfalls, aber es ist festzustellen, dass, da lediglich das erste Nucleotid im Codon randomisiert wurde, Val, Leu, Ile und Phe die einzig möglichen Substitutionen darstellen. Die Ergebnisse legen nahe, dass von diesen 4 Möglichkeiten lediglich Phe in Position 74 erlaubt ist.
Eine Überprüfung der dreidimensionalen Struktur der β-Lactamasen der Klasse A legt eine Erklärung für die Ergebnisse der bla C66-Substitution nahe. Obwohl die Röntgenstruktur der TEM-β-Lactamase noch nicht mit brauchbarer Auflösung bekannt ist (Knox, J. R. et al. (1976), J. Mol. Appl. Genet., 2: 191-200), wurden die TEM-Mutanten durch Prüfung der Struktur der homologen Klasse A aus B. licheniformis analysiert (Moews, P. C. et al. (1990), Proteins Struc. Funct. Genet., 7: 156-171). Die Annahme, dass β-Lactamasen der Klasse A eine ähnliche Faltung annehmen, wird durch die Sequenzhomologie (Ambler, ibid.; Boissinot, M. et al. (1990), J. Biol. Chem., 265: 1225-1230) sowie durch Vergleich der Röntgenstrukturen der Strukturen der Enzyme der Klasse A von B. licheniformis und S. aureus (Auflösung zu 2,5 Å) gestützt (Hertzberg et al., ibid.). Die RMS-α-Kohlenstoff-Differenz für die Strukturen beträgt 1,3 Å (Moews et al., ibid.). Es kann somit mit Recht angenommen werden, dass die Faltung der TEM-β-Lactamase derjenigen der übrigen Enzyme der Klasse A ähnelt.
Bei der Struktur von B. licheniformis ist Lys-73 im aktiven Sitebereich angeordnet, wobei die Ammoniumgruppe in der Seitenkette der Bindungstasche des Substrats zugewandt ist, und zwar innerhalb der Wasserstoffbindungsdistanz des katalytischen Ser-70 (Moews et al., ibid.). Es wird angenommen, dass Lys-73 in die Katalyse unmittelbar eingreift, und zwar dadurch, dass es den Protonentransport vom katalytischen Ser- 70 zum Stickstoff des β-Lactamrings erleichtert. Obwohl die Ergebnisse der Random-Substitution nicht der Rolle von Lys- 73 entspricht, entsprechen diese dennoch einer Rolle, die eine Seitenkette mit sehr spezifischen chemischen Parametern erforderlich macht.
Obwohl Phe-72 und Val-74 in der Nachbarschaft des aktiven Sites angeordnet sind, sind ihre Seitenketten dennoch von der Bindungstasche abgewandt und dem Körper des Proteins zugewandt, so dass man annehmen kann, dass sie zur Struktur des Enzyms beitragen. Die verborgene Natur der Seitenketten ist eine mögliche Erklärung für die Hydrophobizität der Wildtypsequenzen und die Substitutionsmutanten mit Wildtyp- Funktion. Die Aufrechterhaltung der Hydrophobizität unter den Substitutionen an den verborgenen Positionen ist für das λ-Repressorprotein belegt (Reidhaar-Olson et. al., ibid.). Es ist von Interesse, eine Korrelation zwischen der Toleranz der Restpositionen gegenüber den Substitutionen unter evolutionärer Konservierung der Sequenzidentität an diesen Positionen herzustellen. Lys-73 ist eine der 28 Aminosäurepositionen, die in bekannten Sequenzen der β-Lactamasen der Klasse A invariabel sind(Ambler, ibid.; Boissinot et. Al., ibid.). Die evolutionäre Konservierung von Lys-73 wird durch die direkte Evolution des Randomsubstitutionsversuchs nachgeahmt. Für die Position Phe-72 gibt es fünf unterschiedliche Aminosäuren und für die Position Val-74 gibt es vier unterschiedliche Aminosäuren unter den elf Sequenzen der Lactamase der Klasse A, was darauf hindeutet, dass diese Positionen evolutionär nicht genau konserviert werden. In diesen Positionen wird der Mangel an streng evolutionärer Konservierung durch die Vaiierung in den funktionellen Random-Substitutionen nachgeahmt.
Die Sequenz der aktiven Substitutionsmutanten von bla C31 ist in Fig. 10 dargestellt. bla C31 umfasst die Restpositionen 196-200. Wie aus Tabelle II zu ersehen ist, ist der Prozentsatz an funktionellen Substitutionen pro Codon für bla C31 sehr hoch und beträgt 79,1% an bei 10 ug/ml Ampicillin funktionierenden Mutanten und 38,3% bei 1 mg/ml Ampicillin funktionierenden Mutanten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass β-Lactamase einen großen Bereich an Substitutionen im Bereich 196-200 zu tolerieren vermag. Die Ergebnisse der Sequenzierung untermauern noch diese Schlussfolgerung. Keine der Restpositionen ist unter den bei 1 mg/ml bzw. 10 ug/ml Ampicillin selektierten Mutanten genau konserviert worden. Die funktionellen Substitutionen für Gly-196 sind in Richtung der kleineren Seitenketten verlagert, woraus angenommen werden kann, dass das Seitenkettenvolumen hier von Bedeutung ist. Das erste Nucleotid von Codon 196 wurde jedoch nicht mutagenisiert, was die möglichen Substitutionen auf Gly, Ala, Val, Asp und Glu beschränkt, wodurch dieses Argument eine Abschwächung erfährt. Die Mutantensubstitutionnen für Glu-197 und Leu-198 zeigen keine deutliche Konservierung vom Aminosäuretyp, was nahelegt, dass diese Positionen keiner spezifischen Sequenz bedürfen, um ihre Rolle in Struktur und/oder Aktivität zu spielen. Die Mutantensubstitutionen mit dem Wildtypgrad an Aktivität bei Leu-199 scheinen in die größeren hydrophoben Gruppen verlagert zu sein. Eine Ausnahme dabei bildet Arg in der Mutante MC-8. Unter den 10 ug/ml-Substitutionen ist keine eindeutige Sequenzkonservierung festzustellen. Die Mutantensubstitutionen mit Wildtyp-Phänotyp bei Thr-200 scheinen ein Volumen angenommen zu haben, das dem von Threonin ähnlich ist, was eine Größeneinschränkung nahelegt. Die 10 ug/ml-Mutanten zeigen diese Einschränkung nicht. Die Reste 196-200 bilden eine mittelgroße Schleife, welche die beiden α-Hlices in der verwandten Struktur von B. licheniformis (Moews et al., ibid.) verbindet. Tramontano A., et al. (1989), Proteins Struc. Funct. Genet., 6: 382-394) haben die Hauptdeterminante der Struktur einer gestreckten Schleife, wie der 196-200-Schleife als Packung eines konkreten Restes gegenüber dem restlichen Protein definiert. Leu-199 scheint diese Funktion beim Protein von B. licheniformis zu spielen. Interessanterweise wird Leu-199 bei allen elf Klasse A-Enzymen konserviert (Boissinot et al., ibid.). Dies kann erklären, warum unter den Mutanten in Position 199 eine Verschiebung in Richtung der größeren hydrophoben Reste festgestellt wird. Insgesamt legen jedoch die Substitutionsergebnisse für die Reste 196- 200 nahe, dass zur Bildung einer mittelgroßen Schleife nur wenige Sequenzforderungen notwendig sind. Daraus kann geschlossen werden, dass die Hauptantriebskraft für die Bildung dieser Schleifen von außerhalb der Schleife kommt und den Bereich "veranlasst", die Schleifenkonformation anzunehmen. Die Ergebnisse der Random-Substitution stimmen mit der evolutionären Konservierung der Positionen 196-200 gut überein. Die Positionen 196, 197, 198 und 200 sind unter den elf Sequenzen der Klasse A nicht konserviert (Boissinot et al., ibid.). Diese Positionen könnten außerdem die Aminosäuresubstitutionen in den Substitutionsversuchen tolerieren. Leu- 199 ist jedoch unter den Sequenzen der Klasse A vollständig konserviert. Im Gegensatz zu Lys-73, das konserviert wird und außerdem durch Random-Substitution stark begünstigt wird, könnte Leu-199 eine Reihe von Substitutionen tolerieren und die Wildtyp-Aktivität beibehalten.
Die Sequenzen der aktiven Substitutionsmutanten von blaC14 sind in Fig. 11 dargestellt. blaC14 umfasst die Restpositionen 37-42. Wie bei bla C31 ist der Prozentsatz an funktionellen Substitutionen pro Codon für blaC14 hoch und beträgt 52,1% an bei 10 ug/ml Ampicillin funktionierenden Mutanten und 20,9% bei 1 mg/ml Ampicillin funktionierenden Mutanten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Enzym einen großen Bereich an Substitutionen im Bereich 37-42 zu tolerieren vermag. Die Sequenzen in Fig. 11 untermauern noch diese Schlußfolgerung. Es ist festzustellen, dass Position 37 stark verschoben ist, da lediglich ein Nucleotid des Codons randomisiert ist, so dass lediglich vier Aminosäuren erhalten werden. Die Position 42 ist ebenfalls verschoben, es können jedoch 12 unterschiedliche Aminosäuren erhalten werden. Offensichtlich besteht hier keine strange Sequenzkonservierung in keiner der Positionen unter den Mutanten. Aufgrund der fehlenden Konservierung wurde eine Reihe von inaktiven Mutanten sequenziert. Überraschenderweise wurden unter den nichtfunktionellen Mutanten in Position 42 lediglich Lys und Arg festgestellt. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die einzige Forderung in den Positionen 37-42 zur Aufrechterhaltung der minimalen β-Lactamase-Aktivität lediglich darin besteht, in Position 42 kein Lys oder Arg aufzuweisen.
Die Reste 37-39 sind Teil einer α-Helix und die Reste 40-42 liegen in einer Windung, die zu einem Strang eines α-Blatts in der Struktur von B. licheniformis führt. Ala-42 wird im Enzym von B. licheniformis konserviert, wobei seine Seitenkette in den Körper des Proteins in einer vertieft liegenden Position gerichtet ist. Es ist nicht möglich, Lys oder Arg in die Position 42 der Struktur von B. licheniformis einzuführen, ohne dass man größere Einstellungen vornimmt. Dies legt nahe, im Protein die langen geladenen Seitenketten von Lys und Arg anzupassen.
Glu-37 und Ala-42 werden unter den Klasse A-Lactamasen konserviert. Glu-37 ist invariabel und nur Gly vermag Ala-42 in den elf Klasse A-Enzymen zu ersetzen. Ähnlich der Situation bei Leu-199, Glu-37 und Ala-42 liegen Beispiele von evolutionär konservierten Resten vor, die beim Random-Substitutionsversuch variieren. Glu-37 kann durch Ala ersetzt werden und Ala-42 kann durch Gln und Ser ersetzt werden und behalten die Wildtyp-Aktivität noch bei. Die Positionen 38 bis 41 werden innerhalb der Klasse A-Familie nicht konserviert und variie-ren ebenso beim Random-Substitutionsversuch.

Natürliche Selektion gegenüber der Random-Substitution

Aufgrund des Ergebnisses, dass nicht alle evolutionär konservierten Reste bei den Random-Substitutionsversuchen konserviert werden, beschlossen wir zu versuchen, die prozentualen funktionellen Ergebnisse zur evolutionären Variabilität der mutagenisierten Bereiche in Korrelation zu setzen. Die Ergebnisse dieser Vergleiche sind in Fig. 12 dargestellt. Die Variabilitätsdaten wurden für die 11 Klasse A-β- Lactamasen nach der Methode von Wu et al., ibid. ermittelt. Da durch die Mutageneseversuche die Codons zu Blöcken randomisiert werden, war es notwendig, die einzelnen evolutionären Variabilitätsmessungen für die einzelnen Glieder eines Blocks zu addieren und durch die Gesamtzahl der Positionen zu dividieren, um zu einer durchschnittlichen Variabilität innerhalb des verglichenen Bereichs zu gelangen. Die Zahlenwerte der prozentualen Funktion gegenüber der durchschnittlichen genetischen Variabilität können nicht unmittelbar verglichen werden, und zwar aufgrund der unterschiedlichen Maßeinheiten, verglichen werden kann jedoch der relative Variabilitätsgrad. Die Variabilitätsmessungen sind z. B. sehr ähnlich für die Positionen 37-42, 69-71, 72-74, 102-104, 146-148, 157-160, 168-171, 196-200, 208-210, 224-227, 233- 235, 235-238, 238-241 und 250-252. Mehrere Variabilitätsmessungen korrelieren jedoch nicht gut miteinander. Dies sind die Positionen 130-132, 134-137, 182-184, 250-262 und 287- 289. Im Gegensatz zu den Sequenzierungsergebnissen sind die Diskrepanzen nicht immer das Ergebnis einer größeren Variabilität unter den Random-Substitutionsmutanten. Die Bereiche 260-262 und 287-289 werden evolutionär jedoch nicht streng konserviert und es wurden bei den Random-Substitutionsversuchen noch sehr wenige funktionelle Substitutionen toleriert. Die Bereiche 130-132, 134-136 und 182-184 zeigen jedoch einen höheren Prozenanteil an funktionellen Substitutionen bei den Mutageneseversuchen als ausgehend von der strengen evolutionären Konservierung der Sequenzen zu erwarten war. Diese Ergebnisse verdeutlichen noch die Gefahr der Annahme, dass der Grad der evolutionären Konservierung eines Restes immer ein genauer Indikator, für die funktionelle Bedeutung sein muss.

BEISPIEL II

Erzeugung von Aktivsite-Bibliotheken durch PCR-Exzisionslinkerinsertion

Es wurden acht unterschiedliche Plasmidbibliotheken erzeugt, von denen jede drei Codons der DNA-Sequenz des bla-Gens randomisiert waren. Von den neun in Fig. 13 identifizierten Bibliotheken wurde eine, bla C66, und zwar wie in Beispiel I beschrieben, erzeugt. Die restlichen 8 Bibliotheken wurden durch eine Modifizierung der in Beispiel I beschriebenen Technik erzeugt, wodurch an vorgegebenen Sites Mutationen erzeugt wurden. Dies erfolgte durch Einführung des Exzisionslinkers auf folgende Weise:
Das Target-Gen bla war im Plasmid PBG66, wie in Beispiel I beschrieben, enthalten. Der Exzisionslinker hatte dieselbe DNA-Sequenz wie in Beispiel I, nur erfolgte die Insertion des Exzisionslinkers in die Target-DNA durch gerichtete PCR- Linkerinsertion (Fig. 5). Zwei PCR-Primer wurden synthetisiert, die zu den gegenüberliegenden Strängen des Target- Gens mit ihren 5'-Enden in derselben Nucleotidposition homolog waren (Primer a in Fig. 5b und Primer c in Fig. 5d). Diese Position definierte die Insertionsstelle des aus diesen Primern zu synthetisierenden Linkers. An dem 5'-Ende der Primer a und c befand sich ein "Schwanz", von denen jeder eine Hälfte eines Strangs des zu inserierenden Linkers codierte (Fig. 5b und d). In diese Figur steht die Marke "Bsp- MI" für die Erkennungssequenz für die bei diesem Versuch verwendete Typ IIS-Erkennungsendonuclease. Ein zweiter Satz von PCR-Primern wurde mit dem ersten Satz gepaart, und zwar jeweils einer für die "geschwänzten" Primer (Primer b und d in Fig. 5b und 5d). Diese Primer führten zur Paarung der Nucleotidsequenzen an jedem Ende des Target-Gens und wurden in Verbindung mit den "geschwänzten" Primern in den PCR-Reaktionen zur Synthese von zwei DNA-Fragmenten verwendet (Fig. 5c und 5e). Ein Ende jedes Fragments codierte eine Hälfte des zu inserierenden Linkers. Das andere Ende codierte einen Restriktions- bzw. Spaltungssite jeweils für NdeI oder EcoR1, welche das 5'- und das 3'-Ende des bla-Gens miteinander verbindet (Fig. 5c und 5e). Die beiden PCR-Fragmente überlappten somit das 5'- und 3'-Ende des Targetgens. Danach erfolgte die Verdauung der PCR-Fragmente mit EcoR1 und NdeI und anschließend die Gelreinigung der Fragmente (Maniatis et al., s. oben). Das Plasmid, welches das bla-Gen enthielt, wurde ebenfalls mit EcoR1 und NdeI verdaut und das Vektorfragment wurde gelgereinigt (Maniatis et al., s.o.). Eine 3-Weg-Ligation zwischen dem gespaltenen Plasmidfragment und den amplifizierten PCR-DNA-Fragmenten wurde dann durchgeführt, um den vollständigen DNA-Vektor mit dem Exzisionslinker an den vorgegebenen Positionen, je nach der Wahl der PCR-Primer zu bilden (Fig. 5 G). Die nachfolgenden Stufen bei der Erzeugung der Bibliotheken waren dieselben wie in Beispiel 1.

BEISPIEL III

Screening von TEM-1-β-Lactamase-Aktivsite- Bibliotheken auf potentielle β-Lactam-Antibiotika

Bakterielle Pathogene erwerben Resistenz gegenüber spezifischen Antibiotika durch Erzeugung von β-Lactamasen, welche die Amidbindung im β-Lactamring der Antibiotika hydrolysieren, wodurch ein unwirksames antimikrobielles Mittel entsteht. In diesem Beispiel wurde ein Screeningsystem angewandt, um ein potentielles Arzneimittel gegen jede mögliche einzelne Aminosäuresubstitution und außerdem ein Subset der möglichen Doppel- und Dreifachaminosäuresubstitutionen im Aktivsite der TEM-1-β-Lactamase (Gen bla) herauszufinden.
Durch Erzeugung von neun unterschiedlichen Bibliotheken (die Bibliothek C66 aus Beispiel I und 8 Bibliotheken aus Beispiel II) war es möglich jeden Aminosäurerest im Bereich des Aktivsites mindestens einmal zu randomisieren (Fig. 13). Die Entscheidung darüber, ob ein konkreter Rest im Aktivsite vorlag, basierte auf den dreidimensionalen Röntgenstrukturen der homologen Klasse A-β-Lactamasen aus S. aureus und B. licheni-formis (Hertzberg et al., s. oben; Moews et al., s. oben). Vierundzwanzig Reste aus 5 nicht aneinander angrenzenden Bereichen, welche die Aktivsitetasche enthielten, wurden randomisiert. Die Position der in den Randombibliotheken mutagenisierten Reste ist auf der homologen Struktur von S. aureus in Fig. 14 dargestellt. Die Wahrscheinlichkeit, dass jede der neun Randombibliotheken alle möglichen Aminosäuresubstitutionen für den Bereich kodieren, ist in Tabelle II (s. oben) angegeben.
Es wurden sechs Antibiotika ausgewählt, um die vorhergesagten Fähigkeiten der Randombibliotheken zu testen. Im Aktivsite der TEM-1-β-Lactamase existieren Mutationen, die zu erhöhten Arzneimittelresistenz-Phänotypen für die β-Lactamantibiotika Cefotaxin (Sougakoff, W. et al., (1989), Gene, 78: 339-348; Collatz, E. et al., (1989), Gene, 78: 349-354), Cephalosporin C (Hall, A. et al., (1976), Nature, 318: 478- 480) und Cephalothin führen. Diese Arzneimittel wurden als Test für das System ausgewählt, da sie, wenn die Bibliotheken einen vorhergesagten Wert aufweisen, schon minimal in der Lage sein sollten, vorgängig gekennzeichnete Substratspezifität-Mutationen zu identifizieren. Cephalexin und Cefoxitin wurden für den Test ausgewählt, da keine TEM-1-Mutationen bekannt sind, die zu einer erhöhten Aktivität ihnen gegenüber führen, obwohl diese Arzneimittel für einige Zeit klinisch verwendet wurden. Dies legt nahe, dass diese Arzneimittel gegenüber β-Lactamase-Mutationen unempfindlich sind. Diese Hypothese wurde unmittelbar anhand der Random- Bibliotheken getestet. Schließlich wurde für das Screening als Kontrolle auch das Penicillin Ampicillin herangezogen.
Die Screeningversuche wurden so durchgeführt, dass man zuerst die minimale inhibierende Konzentration jedes Antibiotikums gegenüber dem Stamm TG1 von E. coli ermittelte, der ein Plasmid beherbergte, welches das bla-Gen enthielt. Für alle Arzneimittel mit Ausnahme von Ampicillin wurden Agarplatten hergestellt, die eine etwas höhere Konzentration an Antibiotikum aufwiesen als der minimalen inhibierenden Konzentration entsprach, so dass E. coli, das die Wildtyp-TEM- 1-β-Lactamase enthält, nicht überleben würde. Jede Ramdombibliothek wurde dann in E. coli transformiert und auf das Antibiotikum enthaltende Agarplatten ausplattiert. Aufgrund der Selektion überlebten nur die Mutanten mit erhöhter Aktivität gegenüber dem Antibiotikum. Die Überlebenden aus einer konkreten Antibiotikumselektion wurden dann auf Wachstum auf den anderen Antibiotika hin getestet und einem Screening unterworfen, um zu ermitteln, ob die Mutanten genauso erhöhte Aktivität gegenüber den übrigen Antibiotika aufweisen. Danach wurden die Mutanten auch gegen die minimale inhibierende Konzentration von Ampicillin getestet. Da Ampicillin bereits ein ausgezeichnetes Substrat für TEM-1-β-Lactamase abgibt, wurde es zu Vergleichszwecken herangezogen, um festzustellen, ob die Mutanten, die erhöhte Aktivität gegenüber den Cephalosporinen oder Cefoxitin aufweisen, ihre hohe Aktivität auch gegenüber Ampicillin behalten. Sämtliche Mutanten wurden außerdem gegen 10 ug/ml Ampcillin getestet, um festzustellen, ob sie die minimale Aktivität gegen Ampicillin behalten.
Die Ergebnisse des Screeningversuchs sind in Tabelle III zusammengefasst. TABELLE III
Phänotypklassen von Mutanten, die aus den Aktivsite-Bibliotheken mit erhöhter Aktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika gewonnen wurden.
a) Abkürzungen und Konzentrationen der Antibiotika: 10 amp, 10 ug/ml Ampicillin, 1 mg/ml Ampicillin; cmp, 12,5 ug/ml Chloramphenicol; cefox, 5 ug/ml Cefoxitin; cephC, 100 ug/ml Cephalosporin C; cphal, 20 ug/ml Cephalothin; cftx, 0,5 ug/ml Cefotacim.
b) Die Aktivsite-Bibliotheken befinden sich auf dem Plasmid pBG66, welches das Chloramphenicol-Resistenz-Gen zusätzlich zu bla enthält. Es wurden alle Mutanten getestet, um sicherzugehen, dass sie diesen Marker enthalten und das Plasmid vorliegt. "+" bedeutet die Bibliothek, welche das angegebene Antibiotikum überlebt hat und "-" gibt an, dass das Antibiotikum gegen die Bibliothek wirksam war.
Bei fünf unterschiedlichen Bibliotheken wurden acht Klassen von Spezifitätsmutanten mit unterschiedlichen Substratprofilen entdeckt. Wie zu erwarten war, enthielten die Bibliotheken Mutanten mit erhöhter Aktivität gegenüber Cefotamim, Cepholasporin C und Cephalothin. Dieses Ergebnis untermauert eindeutig die Tatsache, dass die Bibliotheken die vorhergesagte Fähigkeit besitzen. Außerdem enthielten die Bibliotheken entsprechend dem Fehlen der vorgängig identifizierten Mutanten keine Mutanten mit erhöhter Aktivität gegenüber Cephalexin oder Cefoxitin.
Die Ergebnisse legten nahe, dass die identifizierten Phänotyp-Klassen der Mutanten auf spezifischen Wechselwirkungen beruhten. So z. B. enthielten drei Random-Bibliotheken keine Mutanten, die erhöhte Aktivität gegenüber den getesteten Antibiotika aufwiesen, wobei lediglich ein einziger begrenzter Untersatz von Resten die Enzymspezifität gegenüber den Antibiotika verändern kann. Außerdem wies jede Mutantenklasse veränderte Aktivität gegenüber lediglich einem oder zwei Antibiotika auf. War ein nichtspezifischer Effekt, wie z. B. erhöhte Beständigkeit des Enzyms, verantwortlich für die Phänotyp-Aktivität, konnte erwartet werden, dass diese gegenüber mehreren Antibiotika gleichzeitig ansteigt.
Da die Random-Bibliotheken in definierten Positionen waren, war die Restposition einer neuen Spezifitätmutation unmittelbar innerhalb eines Dreiaminosäurefensters bekannt. Deshalb ist bekannt, dass Aminosäuresubstitutionen zwischen den Positionen 235-237 zu erhöhter Cephalosporin C-Resistenz, Substitutionen zwischen den Positionen 102-104 und 238-241 zu erhöhter Cefotaxim-Resistenz und Substitutionen im gesamten obigen Bereich eine erhöhte Cephalothin-Resistenz hervorrufen können.
Zur Identifizierung der genauen Natur der Mutationen, die zu erhöhter Aktivität gegenüber den Antibiotika führen, wurde Plasmid-DNA aus repräsentativen Gliedern jeder Phänotypklasse gewonnen und es wurde die DNA-Sequenz der geeigneten drei Codons ermittelt. Die Sequenz der Mutanten aus der blaC71- Bibliothek mit erhöhter Aktivität gegenüber Cephalosprin C und Cephalothin ist in Fig. 15 dargestellt. Die erhöhte Aktivität beruhte auf den Substitutionen in Ala-237 des TEM-1-Enzyms. Das ist dieselbe Position, in der Mutanten mit erhöhter Aktivität gegenüber Cephalosporin C und Cephalothin vorgängig identifiziert wurden (Hall et al., ibid.). Die Tatsache, dass lediglich die blaC71-Bibliothek Mutanten mit erhöhter Cephalosporin C- Aktivität enthielt, legte nahe, dass lediglich Substitutionen in Ala-237 die Aktivität gegenüber dem Arzneimittel zu erhöhen vermögen.
Es wurden mehrere Cefotaxim-resistente Mutanten aus der bla- C74-Bibliothek sequenziert (Fig. 16). Glu-240 und Arg-241 tolerierten einen weiten Bereich unterschiedlicher Aminosäure-Substitutionen. Eine Korrelation zwischen den Substitutionen und den beobachteten Phänotypen war nicht festzustellen. Es bestand jedoch eine starke Korrelation zwischen Substitutionen und Phänotyp in Gly-238. Es wurden sieben unterschiedliche Cefotaxim-resistente Mutanten sequenziert. Sie alle enthielten anstelle von Clycin Serin oder Cystein. Die Korrelation wird noch dadurch verstärkt, dass Mutanten sowohl mit hoher (1 mg/ml) als auch minimaler (10 ug/ml) Resistenz gegenüber Ampicillin, aber ohne Resistenz gegenüber Cefotaxim in Position 238 kein Serin bzw. Cystein enthielten (Fig. 16). Serin anstelle von Glycin in Position 238 wurde außerdem unter klinischen Isolaten des TEM-Enzyms mit erhöhter Resistenz gegenüber Cefotaxim gefunden (Sougakoff, W. et al., (1988), FEBS Microbiol. Lett., 56: 343-348; Sougakoff et al. (ibid.). Dies unterstreicht wiederum die Fähigkeit der Bibliotheken, die Empfindlichkeit von β-Lactam-Antibiotika gegenüber β-Lactamase-Mutationen vorherzusagen, dadurch nämlich, dass die Bibliotheken Resistenz gegenüber Cefotaxim aufgrund der Mutationen in Position 238 vorhersagten, wie dies bei klinischen Isolaten beobachtet wurde.
Die Sequenzierung von Cefotaxim-resistenten Mutanten aus der blaC75-(Positionen 2-104)-Bibliothek befindet sich in Entwicklung. Ein klinisches Isolat mit erhöhter Resistenz gegenüber Cefotaxim wurde isoliert, das eine Lysinsubstitution in Glu-104 des TEM-Enzyms aufwies. Diese Substitution ist eher unter den Mutanten mit erhöhter Cefotaxim-Resistenz, wie sie in der bla C75-Bibliothek identifiziert wurde, zu beobachten. Diese Tatsache legt nahe, dass klinische Isolate mit Subsitutionen im 130-132-Bereich nach fortgesetztem Einsatz von Cefotaxim entstehen. Die Sequenzierung von Cephalothin-resistenten Mutanten aus den bla C71-, bla C74- und bla C75-Bibliotheken befindet sich ebenfalls in Entwicklung.
Das Screening der Aktiv-Site-Bibliothek garantiert nicht, dass ein Antibiotikum, das als unempfindlich gegenüber β- Lactamase-Mutanten befunden wurde, unbegrenzt unempfindlich bleibt, da die Bibliotheken nicht die Wirkungen aller möglichen Doppel- und Dreifachmutationen im Aktivsite belegen. Über längere Zeit sind Mehrfachmutationen möglich, welche den Aktivsite grundlegend modifizieren, um neue Aktivitäten zu bewirken. Das System ergibt jedoch einen guten Hinweis darauf, ob die einzelnen Aminosäuresubstitutionen, die nach der klinischen Einführung rasch entstehen, es einer β-Lactamase ermöglichen, ein neu eingeführtes Antibiotikum zu hydrolysieren. Die Aktiv-Site-Bibliotheken geben daher ein wirksames neues Werkzeug für die Konstruktion von Antibiotika an die Hand.
Zusätzlich zur Bereitstellung eines Screeningsverfahrens für neue Antibiotika vermögen die Aktiv-Site-Bibliotheken auch, Informationen bezüglich der Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität in β-Lactamasen bereitzustellen. So konnte z. B. gezeigt werden, dass Substitutionen sowohl in Ala-237 als auch in Gly-238 des TEM-1-Enzyms zur Änderung in der Substratspezifität führen. Bezüglich der Beziehung zwischen Struktur und Aktivität von β-Lactam-Antibiotika im Hinblick auf die Beständigkeit gegenüber Hydrolyse durch β-Lactamase ist viel bekannt. Relativ wenig bekannt ist jedoch bezüglich der chemischen und strukturellen Merkmale des Enzyms, welche den Abbau einiger β-Lactam-Antibiotika verursachen, bei anderen jedoch nicht. Durch das Screening einer großen Zahl chemisch unterschiedlicher β-Lactam-Antibiotika und Feststellung der Substitutionen, welche die Aktivität gegenüber Arzneimitteln erhöhen, ist es möglich geworden, die chemischen Wechselwirkungen, welche für die Ermittlung der Empfindlichkeit von β-Lactamen gegenüber Abbau durch β-Lactamase bestimmen, genau kennenzulernen. Diese Informationen sollten die rationelle Konstruktion neuer, gegenüber β-Lactamasen resistenter Antibiotika ermöglichen.
Die obige Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung haben lediglich illustrierenden Charakter. Sie sind nicht erschöpfend und schränken die Erfindung nicht auf die geoffenbarte konkrete Form ein. Im Lichte der obigen Lehre sind viele Modifikationen und Variationen möglich. Derartige Modifikationen und Variationen, die für einen Fachmann in Frage kommen, bewegen sich innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.

Claims

1. Verfahren zur Modifizierung von DNA, das folgende Stufen umfasst:

a) Einführung eines bidirektional spaltenden Typ IIS-Exzisionlinkers in einen Insertionssite einer Target-DNA zur Bildung einer ersten modifizierten DNA,

b) Kontaktierung der ersten modifizierten DNA mit einer Typ IIS-Restriktionsendonuclease zur Spaltung der ersten modifizierten DNA und zur Entfernung des Exzisionslinkers und einem oder mehreren Target-Nucleotiden, die ursprünglich in der Target-DNA vorliegen und auf einer Seite oder auf beiden Seiten des Insertionssites angeordnet sind, zur Bildung einer zweiten, ein erstes und ein zweites Ende aufweisenden modifizierten DNA,

c) Ligation eines bidirektionalen spaltenden Mutationslinkers mit dem ersten und dem zweiten Ende zur Bildung einer dritten modifizierten DNA, wobei der Mutationslinker ein oder mehrere Mutationsnucleotide an einem oder an beiden Enden des Mutationslinkers aufweist,

d) Kontaktierung der dritten modifizierten DNA mit der Typ IIS-Restriktionsendonuclease zur Entfernung jenes Anteils des Mutationslinkers, der nicht aus dem einen oder mehreren Mutationsnucleotiden besteht, zur Bildung einer vierten modifizierten DNA und

e) Ligation der Enden der vierten modifizierten DNA zur Bildung einer modifizierten Target-DNA, bei der ein oder mehrere Nucleotide verglichen mit der Target-DNA substituiert, inseriert oder deletiert sind.

2. Verfahren zur Modifiziereung von DNA, das folgende Stufen umfasst:

a) Einführung eines Exzisionslinkers in einen Insertionssite einer Target-DNA zur Bildung einer ersten modifizierten DNA, welche einen ersten DNA-Anteil der Target-DNA, den Exzisionslinker und einen zweiten DNA-Anteil der Target-DNA umfasst, wobei der Exzisionslinker eine erste und eine zweite Erkennungssequenz für eine Typ IIS-Restriktionsendonuclease umfasst, die im Exzisionslinker so ausgerichtet und angeordnet ist, dass der erste und der zweite Spaltungssite für die kognate Typ IIS-Restriktionsendonuclease sowohl für die erste als auch für die zweite Erkennungssequenz im ersten bzw. im zweiten DNA-Anteil angeordnet sind, wobei die Nucleotide des ersten Anteils, die zwischen den ersten Spaltungssites und einem Ende des Exzisionslinkers angeordnet sind, eine erste Target-Nucleotid-Endregion umfassen und die Nucleotide des zweiten, zwischen dem zweiten Spaltungssite und dem anderen Ende des Exzisionslinkers angeordneten Anteils eine zweite Target-Nucleotid-Endregion umfassen,

b) Kontaktierung der ersten modifizierten DNA mit der Typ IIS-Restriktionsendonuclease, die zur Erkennung der ersten und der zweiten Erkennungssequenz befähigt ist, zur Spaltung der ersten modifizierten DNA sowohl am ersten als auch am zweiten Spaltungssite zur Bildung einer zweiten modifizierten DNA, die einen dritten und einen vierten DNA-Anteil umfasst, wobei diese Anteile den ersten und den zweiten Anteil umfassen, wobei wiederum ein oder mehrere Target-Nucleotide sowohl mit der ersten als auch mit der zweiten Target- Nucleotid-Endregion und dem Exzisionslinker entfernt wurden,

c) gegebenenfalls Modifizierung der Enden des dritten und vierten DNA-Anteils zur Bildung des modifizierten dritten und vierten DNA-Anteils,

d) Ligation eines Mutationslinkers mit den Enden des dritten und vierten DNA-Anteils oder mit dem modifizierten dritten und vierten DNA-Anteil, sofern dieser erhalten wurde, zur Bildung einer dritten modifizierten DNA, wobei der Mutationslinker eine dritte und eine vierte Erkennungssequenz für die Typ IIS-Restriktionsendonuclease und eine erste und eine zweite Mutationsnucleotid-Endregion umfasst, wobei jede Mutationsnucleotidregion an einem Ende des Mutationslinkers angeordnet ist und ein oder mehrere Mutationsnucleotide umfasst, wobei die dritte und vierte Erkennungssequenz im Mutationslinker so ausgerichtet und angeordnet sind, dass der dritte und vierte Spaltungssite innerhalb des Mutationslinkers so angeordnet sind, dass die kognate Typ IIS-Spaltung die erste und zweite Mutationsnucleotid-Endregion aus dem Exzisionslinker entfernt,

e) Kontaktierung der dritten modifizierten DNA mit der Typ IIS-Restriktionsendonuclease, die zur Erkennung der dritten und vierten Erkennungssequenz befähigt ist, zur Spaltung der dritten modifizierten DNA am dritten und vierten Spaltungssite zur Bildung einer vierten modifizierten DNA, welche den fünften und sechsten DNA-Anteil enthält, von denen jeder den dritten bzw. vierten Anteil oder den modifizierten dritten und vierten Anteil und jeweils ein oder mehrere Mutationsnucleotide der ersten und zweiten Mutationsnucleotid-Endregion umfasst,

f) ggf. Modifizierung des fünften und sechsten DNA-Anteils zur Bildung eines modifizierten fünften und sechsten Anteils und

g) Ligation der Enden des fünften und sechsten DNA-Anteils bzw. des modifizierten fünften und sechsten DNA-Anteils, sofern dieser erhalten wurde, zur Bildung der modifizierten Target-DNA, welche die Target-DNA umfasst, wobei wenigstens ein oder mehrere an den Insertionssite angrenzenden Nucleotide substituiert, inseriert oder deletiert wurden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mutationsnucleotide vorbestimmt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Mutationsnucleotide zufällig sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Mutationslinker außerdem einen Marker umfasst, der zur Anzeige der Anwesenheit der dritten modifizierten DNA geeignet ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Marker lacO ist und die Anwesenheit der dritten modifizierten DNA durch Transformierung von Wirtszellen mit der dritten modifizierten DNA und Messung der Zahl der Wirtszellenkolonien, welche den lacO-Marker enthalten, bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Einführung des Exzisionslinkers durch zufällige Integrierung in die Target- DNA erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Mutationsnucleotide zufällig sind.

9. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Einführung des Exzisionslinkers an einem vorbestimmten Insertionssite der Target-DNA erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Mutationsnucleotide zufällig sind.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Einführung des Exzisionslinkers folgende Stufen umfasst:

h) Kontaktierung des ersten DNA-Anteils der Target-DNA mit einem ersten und einem zweiten PCR-Primer, wobei der erste PCR-Primer eine erste Region, welche den gesamten ersten Strang des ersten DNA-Anteils, der an den Insertionssite angrenzt und oberhalb desselben angeordnet ist oder einen Teil davon kodiert und eine zweite Region, welche einen ersten Anteil des Exzisionslinkers kodiert, umfasst, wobei der zweite PCR-Primer die gesamte DNA, die oberhalb des zweiten, den ersten DNA-Anteil enthaltenden DNA-Stranges enthalten ist, oder einen Teil davon kodiert und die DNA amplifiziert, die zwischen dem ersten und zweiten PCR-Primer kodiert wird, zur Bildung einer ersten amplifizierten DNA,

i) Kontaktierung des zweiten DNA-Anteils der Target-DNA mit dem dritten und vierten PCR-Primer, wobei der dritte PCR- Primer eine erste Region umfasst, welche den gesamten ersten Strang des zweiten DNA-Anteils der Target-DNA, die an den Insertionssite angrenzt und unterhalb desselben liegt, oder einen Teil davon kodiert, und eine zweite Region umfasst, welche einen zweiten Anteil des Exzisionslinkers kodiert, wobei die zweiten Regionen des ersten und dritten PCR-Primers zusammen den Exzisionslinker kodieren, und der vierte PCR-Primer die gesamte DNA, die unterhalb des zweiten Stranges der DNA enthalten ist, welche den zweiten DNA-Anteil enthält, oder einen Teil davon kodiert und die kodierte DNA zwischen dem dritten und vierten PCR-Primer amplifiziert, zur Bildung einer zweiten amplifizierten DNA und

j) Ligation der Enden der ersten und zweiten amplifizierten DNA, welche den ersten und zweiten Anteil des Exzisionslinkers enthält, zur Bildung einer ersten modifizierten DNA.

12. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Zahl der aus der Target-DNA durch den Exzisionslinker entfernten Target-Nucleotide dieselbe ist wie die Zahl der durch den Mutationslinker hinzugefügten Mutationsnucleotide infolge der Substitution eines oder mehrerer Target-Nucleotide der Target-DNA, wenn die modifizierte Target-DNA gebildet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Zahl der aus der Target-DNA entfernten Target-Nucleotide größer ist als die Zahl der durch den Mutationslinker hinzugefügten Mutationsnucleotide infolge der Deletion eines oder mehrerer Target- Nucleotide der Target-DNA, wenn die modifizierte Target-DNA gebildet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Zahl der aus der Target-DNA entfernten Target-Nucleotide kleiner als die Zahl der durch den Mutationslinker hinzugefügten Mutationsnucleotide infolge der Zugabe eines oder mehrerer Mutationsnucleotide zur Target-DNA ist, wenn die modifiziert DNA gebildet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Typ IIS-Restriktionsendonuclease der Stufe b) eine Endonuclease mit stumpfem Ende ist und die Ligation des Mutationslinkers der Stufe d) mit den Enden des dritten und vierten DNA-Anteils erfolgt.

16. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Typ IIS-Endonuclease der Stufe e) eine stumpf endende Endonuclease ist und die Ligation der Stufe g) an den Enden des fünften und sechsten DNA-Anteils erfolgt.

17. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Typ IIS-Restriktionsendonuclease der Stufe b) keine stumpf endende Endonuclease ist und die Modifizierung der Stufe c) die Kontaktierung der Enden des dritten und vierten DNA-Anteils mit einer Exonuclease oder DNA-Polymerase zur Entfernung bzw. Auffüllung der einsträngigen DNA des dritten und vierten DNA-Anteils zur Bildung des modifizierten dritten und vierten DNA-Anteils umfasst.

18. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Typ IIS-Restriktionsendonuclease der Stufe e) keine stumpf endende Endonuclease ist und die Modifizierung der Stufe f) die Kontaktierung des fünften und sechsten DNA-Anteils mit einer Exonuclease oder DNA-Polymerase zur Entfernung bzw. Auffüllung der einsträngigen DNA des fünften und sechsten DNA-Anteils zur Bildung des modifizierten fünften und sechsten DNA-Anteils umfasst.

19. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die erste Erkennungssequenz des Exzisionslinkers für eine stumpf endende Typ IIS-Endonuclease und die zweite Erkennungssequenz für eine Typ IIS-Endonuclease bestimmt sind, die nicht aus einer stumpf endenden Endonuclease besteht.

20. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die dritte Erkennungssequenz des Mutationslinkers für eine stumpf endende Typ IIS-Endonuclease und die vierte Erkennungssequenz für eine Typ IIS-Endonuclease bestimmt sind, die nicht aus einer stumpf endenden Endonuclease besteht.

21. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Target-DNA ein Precursor-Polypeptid kodiert.

22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das Precursor-Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Enzymen, Proteinhormonen, Proteinrezeptoren, Strukturproteinen und Regulatorproteinen.

23. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das Precursor-Polypeptid ein Enzym ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das Precursor-Enzym ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus antibiotischen Hydrolasen, Carbonylhydrolasen und Phosphorylasen.

25. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das Precursor-Enzym eine β-Lactamase ist.

26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die die Precursor-β- Lactamase kodierende Target-DNA modifiziert wird, um die Random-Mutations-Nucleotide in einem oder mehreren angrenzenden Kodonen innerhalb der Target-DNA zu ersetzen.

27. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem die Modifizierung an einer vorgegebenen Region in der Target-DNA erfolgt.

28. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem die Modifizierung eines oder mehrerer angrenzender Kodone in der gesamten Target-DNA zufällig erfolgt.

29. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Mutationsnucleotide zufällig sind und das Verfahren außerdem noch die Transformation einer Wirtszelle mit einer exprimierbaren Form der modifizierten Target-DNA zur Bildung einer Bibliothek umfasst, die eine Vielzahl modifizierter Polypeptide, die durch die modifizierte Target-DNA kodiert werden, zu exprimieren vermag.

30. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem das Polypeptid mit einem ersten Target zusammenwirkt und das Verfahren außerdem noch die Kontaktierung der gesamten modifizierten Polypeptide, die durch die Bibliothek produziert wurden, oder eines Teils davon mit dem ersten Target zur Ermittlung der Wechselwirkung, sofern vorhanden, zwischen dem ersten Target und einem oder mehreren modifizierten Polypeptiden und den Vergleich der Differenz zwischen der Wechselwirkung zwischen den modifizierten Polypeptiden mit derselben Wechselwirkung zwischen dem Precursor-Polypeptid und dem Target umfasst.

31. Verfahren nach Anspruch 30, das außerdem die Ermittlung bzw. Ableitung der Aminosäuresequenz eines oder mehrerer modifiziertere Polypeptide umfasst, um einen Hinweis auf einen oder mehrere Aminosäurereste im Polypeptid oder modifizierten Polypeptid, das mit dem ersten Target zusammenwirkt, zu erhalten.

32. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das Polypeptid ein Proteinhormon und das erste Target ein Rezeptor für das Proteinhormon sind.

33. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem das Proteinhormon menschliches Wachstumshormon und der Rezeptor ein Rezeptor für menschliches Wachstumshormon sind.

34. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das Polypeptid ein Proteinhormonrezeptor und das Target ein Hormon für den Proteinrezeptor sind.

35. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem der Proteinhormonrezeptor ein Hormonrezeptor für menschliches Wachstumshormon und das Target menschliches Wachstumshormon sind.

36. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem die modifizierte Target-DNA eine Vielzahl modifizierter antibiotischer Hydrolasen kodiert und das Verfahren außerdem noch die Kontaktierung der gesamten Bibliothek oder eines Teils davon mit einem Antibiotikum umfasst.

37. Verfahren nach Anspruch 36, das außerdem die Auswahl einer oder mehrerer transformierter Wirtszellen, welche die Kontaktierung überleben, umfasst.

38. Verfahren nach Anspruch 36, bei dem die antibiotische Hydrolase β-Lactamase ist.

39. Verfahren nach Anspruch 38, bei dem einer oder mehrere angrenzende Aminosäurereste im aktiven Site der Precursor-β- Lactamase durch unterschiedliche Aminosäurereste substituiert sind.

40. Verfahren nach Anspruch 37, das außerdem noch die Ermittlung bzw. Ableitung der Aminosäuresequenz der in wenigstens einer der ausgewählten Zellen enthaltenen modifizierten antibiotischen Hydrolase umfasst, um einen Hinweis auf einen oder mehrere Aminosäurereste in der modifizierten antibiotischen Hydrolase, die mit dem Antibiotikum zusammenwirken, zu bekommen.

41. Mutationslinker, der eine erste und eine zweite Erkennungssequenz für dieselbe oder unterschiedliche Typ IIS-Restriktionsendonuclease und eine erste und eine zweite Mutationsnucleotid-Endregion, die jeweils wenigstens ein Mutationsnucleotid kodieren, wobei der Mutationslinker von 5'- in 3'-Richtung an einem der Stränge des Mutationslinkers kodiert, ferner die erste Mutations-Endregion, die erste Erkennungssequenz, die zweite Erkennungssequenz und die zweite Mutations-Endregion umfasst, von denen die erste und zweite Erkennungssequenz im Mutationslinker so ausgerichtet und angeordnet sind, dass nach der Spaltung mit der kognaten Typ IIS-Restriktionserdonuclease die erste und die zweite Mutationsnucleotid-Endregion aus dem Mutationslinker freigesetzt werden.

42. Vielzahl von Mutationslinkern nach Anspruch 41, bei der jedes der Mutationsnucleotide der ersten und zweiten Mutationsnucleotid-Endregion randomisiert ist.

43. Vielzahl von Mutationslinkern nach Anspruch 42, bei dem jeder Mutationslinker außerdem noch zwischen den Erkennungssequenzen einen Marker umfasst, der einen Hinweis auf die Anwesenheit der durch Ligation des Mutationslinkers mit der replizierbaren DNA gebildeten modifizierten DNA zu geben vermag.

44. Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von Polypeptiden, das die folgenden Stufen umfasst:

a) Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 21 zur Erzeugung einer Vielzahl von modifizierte Polypeptide kodierenden modifizierten DNA-Molekülen und

b) Transformation von Wirtszellen mit einer exprimierbaren Form der modifizierten DNA-Moleküle zur Erzeugung einer Bibliothek, welche die Exprimierung einer Vielzahl von durch die modifizierten DNA-Moleküle kodierten modifizierten Polypeptide befähigt ist.

45. Verfahren zur Erzeugung einer Bibliothek aus modifizierter DNA, welche eine Bibliothek zu kodieren vermag, die eine Vielzahl von Polypeptiden umfasst, wobei das Verfahren die Konstruktion der modifizierten DNA-Bibliothek nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8 umfasst.

46. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die modifizierten Polypeptide eine modifizierte antibiotische Hydrolase darstellen.