DE69129169T2

DE69129169T2 - herstellung einer peroxidase

Info

Publication number: DE69129169T2
Application number: DE69129169T
Authority: DE
Inventors: Michael Fowler; Debbie Ashgate Grey; Gagik Stepan-Sarkissian
Original assignee: Phytera Inc
Current assignee: Phytera Inc
Priority date: 1990-01-15
Filing date: 1991-01-15
Publication date: 1998-07-30
Anticipated expiration: 2011-01-16
Also published as: GB9000827D0; EP0463140B1; EP0463140A1; WO1991010729A1; DE69129169D1; JPH04504364A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peroxidase-Enzymen aus Pflanzenzellkulturen.
Peroxidase-Enzyme katalysieren Reaktionen, in welchen Wasserstoffperoxid ein spezifisches Oxidationsmittel ist und ein weiter Bereich von Substraten als Elektronendonor dient. Sie werden derzeit in großem Umfang in diagnostischen Kits verwendet und finden unter anderem starke Verwendung in anderen Industrien, wie bei der Papierrezyklisierung, bei der chemischen Abwasserbehandlung und in Detergenzien und Bleichmitteln.
Peroxidase-Enzyme sind in der Natur weit verbreitet und werden aus einer Vielzahl von Pflanzengattungen erzeugt. Derzeit ist jedoch Meerrettich die gewerbliche Hauptquelle. Bei der gewerblichen Produktion von Meerrettichperoxidase (HRP) werden die Meerrettichwurzeln geerntet, und die Wurzeltriebe werden mechanisch in Wasser zerkleinert, um ein Ausgangsmaterial zu bilden. Hieraus wird Peroxidase durch eine Reihe von Ammoniumsulfat- und Ethanolausfällungen gereinigt. Um hochreines Enzym zu erhalten, werden herkömmliche chromatographische Techniken angewendet. Leider führt dieses Verfahren zu großen Mengen an Abfallgewebe und entstehen Probleme mit der Entsorgung von Abfall. Außerdem gibt es einen wesentlichen irreversiblen Verlust an Enzymaktivität, der aus den Ausfällungen mit Ethanol und Ammoniumsulfat stammt, welche benutzt werden, um das Enzym aus dem Gewebe zu extrahieren. Die vorliegende Erfindung überwindet nicht nur viele dieser Probleme, die mit dem herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Peroxidase verbunden sind, sondern produziert auch eine neue Peroxidase mit verbesserten Eigenschaften in relativ hohen Ausbeuten.
Verschiedene andere Quellen wurden in der Literatur für die gewerbliche Produktion von Peroxidase vorgeschlagen. Beispielsweise wurden Rettichpflanzenzellkulturen aus einer Quelle für extrazelluläre Peroxidase vorgeschlagen (Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1989, 18: 321 - 327), doch sind die Ausbeuten und spezifische Aktivität des Produktenzyms gering.
Eine Pflanzenzellkulturmethode für die Produktion von HRPO ist in J. Fermentation Technology, 1989, 67: 31 - 34 beschrieben und basiert auf Kulturen, die aus genetisch modifizierten Meerrettichzellen erhalten wurden, welche so modifiziert wurden, daß sie die Stabilität des Enzyms erhöhen.
Es wurde auch bereits vorgeschlagen, aus verschiedenen Pflanzenarten gezüchtete Kalli als eine Quelle für die Produktion von Peroxidase zu verwenden, doch ist eine Kalluskultur ungeeignet für gewerbliche Produktion in großem Maßstab. Solche Vorschläge finden sich in den ungeprüften japanischen Offenlegungsschriften:
JP-A-1 222 778 (Ausgangsart: Glycyrrhiza glabra L. var Ipomoea betatas Lam. var deulis Makino Stevia rebaudiana Bertoni Beupleurum falcatum L.)
JP-A-1 222 777 (Ausgangsart: Zoysia japonica Zoysia macrostachchya)
JP-A-1 222 776 (Ausgangsart: Trifollum repens L. Carica papaya L. Phellodendron armurense Rupr. Oenothera lamarchiana Ser. Scopolia japonica Maxim Lithospermum erythrorhizon Sieb et Zucc. Glycine max Merrill Gynastema pentaphyllum Makino)
JP-A-63 233 782 (Ausgangsart: allgemein)
JP-A-62 138 188 (Ausgangsart: Ipomoea aquatica forsk.)
Unter anderen Pflanzen, die bekanntermaßen Peroxidase produzieren, sind Pflanzen der Gattung Acer (Sykomore), obwohl, soweit die vorliegenden Anmelder Kenntnis haben, bislang niemand vorschlug, Peroxidase gewerblich aus Acer zu produzieren, und bestimmt nicht mit Hife einer Zellsuspensionskultur. So berichtet J. de Microscopie, 1970, 9:1089 - 1102, über die mikroskopische Prüfung von Sykomore-Blattgewebe und gezüchteten Zellabschnitten von Sykomore-Gewebe, welche unter Verwendung eines chromogenen Peroxidasesubstrats angefärbt wurden, um die mikroskopischen intrazellulären Strukturen aufzuzeigen.
In einem Papier, das bei dem Vierten Europäischen Kongreß für Biotechnologie, 1987 präsentiert und in den Kongreßunterlagen, 1987, 2:342 - 344 veröffentlicht wurde, berichteten die vorliegenden Erfinder über die Ergebnisse einer Vergleichsuntersuchung bezüglich der Wirkung von Peroxidase in Pflanzenzellkulturen aus vier verschiedenen Arten unter aderem einschließlich Acer unter spezieller Bezugnahme auf die Produktion von intrazellulärer Peroxidase und ihre Rolle beim Abbau von Sekundärprodukten der Zellsuspensionskultur, doch identifizierten sie nicht Suspensionskulturen von Acer als eine mögliche gewerbliche Quelle extrazellulärer Peroxidase mit hoher Aktivität und hoher Ausbeute.
In Physiologia Plantarum, 1970, 23:1212 - 1222 berichten die Authoren über eine Untersuchung von intrazellulärer Peroxidaseaktivität in Sykomorezellen, die im Hinblick auf verschiedene Stoffwechselwege im Pflanzenstoffwechsel durchgeführt wurde, jedoch ohne Vorschlag für eine gewerbliche Brauchbarkeit oder selbst irgendwelche Aktivität extrazellulärer Peroxidase.
Schließlich wurde über die Produktion einer intrazellulären Glutathionperoxidase in Sykomore-Zellen in Plant Science, 1985, 42: 35 - 40 berichtet.
Im Gegensatz zu dem Obigen wurde nun gefunden, daß ein sehr aktives, äußerst stabiles Peroxidase-Enzym extrazellulär in hoher Ausbeute durch Suspensionspflanzenzellkulturen von Pflanzenzellen aus Pflanzen der Gattung Acer und speziell aus Pflanzenzellkulturen von Acer pseudoplatanus und besonders aus Wurzelzellkulturen erzeugt wird. Die Tatsache, daß die Peroxidase extrazellulär in hoher Aubeute produziert wird (wobei etwa 80 % der gesamten Peroxidase extrazellulär produziert werden), ist äußerst überraschend und vereinfacht die Produktgewinnung stark. In der Tat ist es für viele gewerbliche Zwecke ausreichend, lediglich die obenschwimmende Flüssigkeit, die die extrazelluläre Peroxidase aus der Kultur enthält, entweder ansatzweise oder kontinuierlich abzutrennen, um eine Rohperoxidase enthaltende Flüssigkeit zu bekommen, die als solche verwendet werden kann oder die gegebenenfalls weiter konzentriert werden kann, wie durch Eindampfen, Gefriertrocknen oder Ultrafiltration. Wenn jedoch eine im wesentlichen reine Peroxidase gefordert wird, kann diese aus der Kulturflüssigkeit durch einfache Trennmittel, wie Chromatographie, gewonnen werden. Auf jedem Weg wird die Gefahr einer Deaktivierung des Enzyms während der Gewinnung und Reinigung wesentlich vermindert. Da ein solch hoher Anteil des Enzyms extrazellulär produziert wird, werden auch Abfallentsorgungsprobleme vereinfacht, da das Volumen an Zellgewebe, das am Ende der Kultur und Gewinnung der Peroxidase zurückbleibt, relativ gering ist. Wenn erwünscht, kann jenes Zellgewebe nach Beendigung der Kultur und Abtrennung der gezüchteten Zellen von der obenschwimmenden Flüssigkeit weiter verarbeitet werden, um intrazelluläre Peroxidase aus ein zusätzliches Produkt zu gewinnen und so zu der Gesamtwirtschaftlichkeit des Verfahrens wesentlich beizutragen. Jene intrazelluläre Peroxidase kann beispielsweise durch die bekannten Verfahren gewonnen werden, bei denen man die Zellen zerlegt, um die intrazelluläre Peroxidase freizusetzen, worauf man mit Ethanol und Ammoniumsulfat in der üblichen Weise extrahiert und ausfällt.
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung bekommt man somit ein Verfahren zur Erzeugung von Peroxidase-Enzym, bei dem man eine Pflanzenzellkultur von exrazelluläre Peroxidase produzierenden Zellen aus einer Pflanze der Gattung Acer in Suspension in einem Kulturmedium erzeugt, welches in der Lage ist, das Wachstum der extrazelluläre Peroxidase produzierenden Zellen zu unterstützen, das Züchten dieser Zellen in Suspension in dem Kulturmedium mit der gleichzeitigen Ansammlung von extrazellulärer Peroxidase in dem Kulturmedium fortsetzt und die angesammelte Peroxidase aus dem Kulturmedium gewinnt.
Die resultierende extrazelluläre Peroxidase hat vorteilhafte Eigenschaften gegenüber der herkömmlichen Meerrettichperoxidase. Unter diesen Eigenschaften findet sich eine hohe Anfangsaktivität und eine verbesserte Wärmebeständigkeit bei hohen Temperaturen. Dies ist in einigen Industrien sehr brauchbar, wo eine Reaktion bei einer höheren Arbeitstemperatur wirksamer ist, aber infolge der sehr empfindlichen Natur von Enzymen, die unter nachteiligen Wärmebedingungen denaturieren, nicht angewendet werden kann. Außerdem hat die Peroxidase nach dieser Erfindung eine hohe Lagerbeständigkeit.
Diese Erfindung liefert somit Peroxidase-Enzym in im wesentlichen reiner Form mit den folgenden Eigenschaften:
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung beginnt mit der Einleitung und Fortführung einer Kultur der extrazelluläre Peroxidase produzierenden Acer-Pflanzenzellen, vorzugsweise von Acer pseudoplatanus, in Suspension. Dies erreicht man am besten durch Keimenlassen der Acer-Samen, vorzugsweise von Samen von Acer pseudoplatanus, auf einem geeigneten Wachstumsmedium, z. B. Agar, Herausschneiden des Wurzelgewebes aus den gekeimten Samen, Überführung des herausgeschnittenen Wurzelgewebes auffrisches Wachstumsmedium und Fortsetzen der Züchtung des Wurzelgewebes in diesem frischen Medium unter Erzeugung von Wurzelgewebekallus, welcher dann zerkleinert und in ein frisches flüssiges Wachstumsmedium überführt werden kann, um eine Suspensionskultur des Wurzelgewebes zu bekommen. Von dieser Anfangskultur können dann Subkulturen gezüchtet werden, um die Produktion in großem Maßstab und Ansammlung von extrazellulärer Peroxidase in dem Kulturmedium zu erzielen.
Als die Kulturmedien für den Kallus und Suspensionskulturen kann jedes für Pflanzenzellenkulturen geeignete Kulturmedium benutzt werden, z. B. Medium Gamborgs B5 oder Medium Murashige und Skoog (MS), die eine geeignete Kohlenstoffquelle, z. B. eines oder mehrere von Glucose, Saccharose und Fructose in einer Menge von 1 bis 15 Gew.%, vorzugsweise von etwa 2 bis 5 Gew.% und am meisten bevorzugt von etwa 3 Gew.%, und die erforderlichen Phytohormone, z. B. Dichlorphenoxyessigsäure und Kinetin, enthalten. Für die Kalluskultur wird vorzugsweise Medium Gamborgs B5 verwendet. Für die Suspensionskultur (Produktion) ist das bevorzugte Medium das MS-Medium.
Ein charakteristisches Merkmal der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Pflanzenzellkulturen, besonders der Wurzelzellkulturen von Acer pseudoplatanus, besteht darin, daß es sich als möglich erwies, Kohlenhydratabfallmaterialien, die Glucose und/oder Saccharose enthalten, wie sie in großen Mengen in der Süßwarenindustrie erzeugt werden, als die Kohlenstoffquelle in dem Kulturmedium statt der üblicherweise verwendeten gereinigten Glucose und/oder Saccharose zu benutzen. Glucose und/oder Saccharose enthaltende Abfälle, die in der Süßwarenindustrie erzeugt werden, z. B. Fußbodenkehricht, verformte Süßwaren und Abfälle aus unterbrochenen Leitungen, stellen ein wesentliches Entsorgungsproblem in der Süßwarenindustrie dar, da es gewöhnlich nicht wirtschaftlich ist, den Abfall aufzuarbeiten, und einfaches Wegwerfen des Abfalles Umweltprobleme erzeugt. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß solche Abfälle eine billige Quelle für Glucose und/oder Saccharose für die Pflanzenzell kulturen liefern, die einfach zugeführt werden können, indem man den Süßwarenabfall mit Wasser extrahiert und dem Kulturmedium den Rohextrakt ohne weitere Reinigung oder Klärung zuführt, wobei die Pflanzenzellkultur die anderen wasserlöslichen Bestandteile, Farbstoffe usw. in dem Süßwarenabfall bemerkenswert toleriert.
Die in dem Medium verwendeten notwendigen Phytohormone sind 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure bei etwa 1 mg/l&supmin;¹ und 6-Furfurylaminopurin (Kinetin) bei etwa 0,1 mg/l&supmin;¹.
Aerobe Kulturbedingungen werden vorzugsweise bei einem pH-Wert von 5,6 bis 5,8 und bei einer Temperatur von etwa 25 ºC verwendet, wobei man optimale Peroxidaseaktivität in dem Kulturmedium nach etwa 8 Tagen kontinuierlichen Züchtens bekommt.
Eine bevorzugte Methode nach dieser Erfindung wird nun im einzelnen unter Bezugnahme auf die Produktion von extrazellulärer Peroxidase aus Acer pseudoplatanus-Zellkulturen und unter Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung beschrieben, worin
Fig. 1 das Wachstumsprofil von A. pseudoplatanus-Wurzelzellkulturen in MS-Medium zeigt, das mit 3 % Saccharose/Glucose in einem 30 l-Luftheberfermentiergerät zugeführt wird,
Fig. 2 das Produktionsprofil für extrazelluläre Peroxidase einer A. pseudoplatanus-Wurzelzellkultur in MS-Medium zeigt, das mit 4 % Saccharose/Glucose in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben zugeführt wird,
Fig. 3 das Wärmebeständigkeitsprofil der extrazellulären Peroxidase von A. pseudoplatanus zeigt und
Fig. 4 das Eluierprofil zeigt.

Beginn und Weiterführung der Zellkultur

Sykomore-Zellkulturen werden mit Wurzelgewebe von Acer pseudoplatanus eingeleitet, indem zunächst Samen von A. pseudoplatanus auf Agarmedium gekeimt werden. Die Samen werden zunächst durch Eintauchen in 15 %ige Hypochloritlösung unter Schütteln auf einem Kreiselschüttler während etwa 40 min bei 24 ºC sterilisiert. Nach diesem Sterilisieren werden die Samen mit reichlichen Mengen an sterilem destilliertem Wasser gewaschen, um alle Spuren von Hypochlorit zu entfernen. Die Samen werden dann auf Agar gegeben und bei 25 ºC inkubiert. Nach dem Keimen werden kleine Wurzelabschnitte aseptisch herausgeschnitten und auffrisches Agarmedium überführt. Das Gewebe wird hinsichtlich der Kallusbildung periodisch geprüft. Durch Routinesubkultur werden dann Kalluskulturen eingeleitet und fortgeführt, wonach Anteile des Kalluskulturgewebes in ein flüssiges Kulturmedium überführt werden, um die Zellsuspensionskultur zu bekommen. Während der Durchführung der Suspensionskultur werden Lebensfähigkeitstests mit den Zellinien unter Verwendung der Fluorescendiacetatmethode (nachfolgend beschrieben) durchgeführt. Auf diese Weise können von den Suspensionskulturen Volumensubkulturen auf vierzehntägiger Basis angelegt werden, d.h. sie können routinemäßig durch die aseptische Überführung von 20 ml Mengen von 14 Tage alten Kulturen in 100 ml-Anteile von sterilisiertem Kulturmedium in 250 ml-Erlenmeyer- Kolben weitergeführt werden. Die Kolben werden auf einem Kreiselschüttler mit 150 U/min in dem Licht bei 25 ºC plaziert.
Die Zellinie wird auf Medium B5 (Gamborg et al., Exp. Cell. REs. 50, 148 - 151, 1968) mit 3 %iger Saccharose als die Kohlenstoffquelle eingeleitet, wird aber später auf Medium Murashige & Skoog (MS) (Murashige et al. Physiol Plant 15, 473 - 497, 1962) mit 3 % Glucose als Kohlenstoffquelle überführt. Die dem Medium zugeführten Phytohormone sind 1 mg.l&supmin;¹ 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und 0,1 mg.l&supmin;¹ 6-Furfurylaminopurin (Kinetin). Der pH- Wert des Wachstumsmediums wird auf 5,6 bis 5,8 vor der Sterilisation eingestellt.

Einzelheiten der Sykomorekultur

Für experimentelle Arbeiten in kleinem Maßstab werden von den Kulturen Gewichtssubkulturen abgenommen, d. h. 3 g Frischgewicht je 100 ml Medium. Für Experimente mit mittlerem Maßstab (bis zu 10 l) können 2 l einer 14 Tage alten Kultur als Beimpfung von 8 l frischem Medium in einem Reaktionsgehälter, der mit einem Rührer ausgestattet ist, verwendet werden. Geeignete Kulturbedingungen für mittleren Maßstab schließen einen pH-Wert von 5,6 bis 5,8, eine Temperatur von 25 ºC und eine Preßluftbeschickung von etwa 1 l.min&supmin;¹ ein.
Kulturen in großem Maßstab können in ähnlicher Weise in einem 30 l-Luftheberfermentiergerät LH (eingetragene Marke) beispielsweise durch Beimpfung mit genügend 14 Tage alten Wurzelzellkulturen, um ein Frischgewicht von 20 g.l&supmin;¹ (etwa 2,0 g.l&supmin;¹ Trockengewicht) zu ergeben, durchgeführt werden. Der Behälter wird mit Druckluft in einer Merige von 6 l.min&supmin;¹ und bei einer Temperatur von 25 ºC belüftet.
Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung zeigt ein Wachstumsprofil für eine Sykomorekultur, die in einem 30 l-Luftheberfermentiergerät gezüchtet wird. Dies zeigt eine optimale Zellebensfähigkeit nach 9 Tagen in dem Fermentiergerät, ein optimales Zellfrischgewicht nach 11 Tagen in dem Fermentiergerät und ein optimales Zelltrockengewicht nach 10 Tagen in dem Fermentiergerät.

Experimentelle Methoden

Durch aseptische Abnahme kleiner Kulturproben aus dem Kulturbehälter in regelmäßigen Abständen und Überwachung des Frischgewichtes und Trockengewichtes durch Messungen der Zellebensfähigkeit, des Kultur-pH-Wertes und der Peroxidaseaktivität ist es möglich, eine optimale Kulturzeit und optimale Bedingungen für die effiziente Peroxidaseproduktion zu bestimmen. Diese Experimente finden sich nachfolgend im Einzelnen. Frisch- und Trockengewichtmessungen Eine Whatman (eingetragene Marke)-Filterpapierscheibe Nr.1 mit einem Durchmesser von 2,5 cm wird direkt nach ihrer Entfernung aus einem Ofen, wo sie bei 60 ºC während wenigstens 24 h getrocknet wurde, gewogen. Die Scheibe wird dann auf einem Filterbett aus rostfreiem Stahl, das auf einem Gummistopfen in einem Buchner-Kolben ruht, plaziert. Die Scheibe wird mit destilliertem Wasser befeuchtet, und ein Vakuum wird an dem Kolben während etwa 10 sec angelegt, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Die feuchte Filterscheibe wird dann unmittelbar gewogen. Die Scheibe wurde auf dem Filterbett ersetzt, und die Filterspitze wird direkt über der Scheibe positioniert. Ein Kulturanteil von 3 ml wird durch das System filtriert, und ein Vakuum wird angelegt, um überschüssiges Medium zu entfernen. Die Scheibe mit den Zellen darauf wird unmittelbar gewogen und in einem Ofen bei 60 ºC während etwa 24 h vor erneutem Wiegen plaziert. Berechnungen der Frisch- und Trockengewichte der Kulturen erfolgen unter Verwendung der folgenden Gleichungen:
Naßgewicht (g/l) = {Naßgewicht (Scheibe + Zellen) - Gewicht der nassen Scheibe} Probenvolumen (ml) x 1000
Trockengew. (g/l) = {Trokengew. (Scheibe + Zellen) - Gew. der trockenen Scheibe} Probenvolumen (ml) x 1000

Lebensfähigkeitstest

Ein Tropfen Kultur zusammen mit einem Tropfen Fluorescendiacetatlösung (Verdünnung 1 : 50 mit Wasser einer Vorratslösung von 5 mg Fluorescendiacetat in 1 ml Aceton) werden auf einem Mikroskopobjektträger mit Vertiefung plaziert, und ein Deckglas wird darübergelegt. Nach etwa 2 min wird die resultierende Fluoreszenz unter Verwendung eines mit einem Erregerfilter ausgestatteten Fluoreszenzmikroskops beobachtet. Lebensfähige Zellen zeigen eine hellgrüne Fluoreszenz. Kulturlebensfähigkeit wird geschätzt, indem man die Anzahl der Zellen, die in einem bestimmten Feld fluoreszieren, auszählt und sie als einen Prozentsatz der Gesamtzahl von Zellen in jenem Feld ausdrückt.

Schätzung der Peroxidaseaktivität

Zunächst werden die Proben aus der Kultur in Zell- und Mediumfraktionen unterteilt, um in jedem die Peroxidaseaktivität zu bestimmen. Die Zellen werden auf Eis unter Verwendung eines vorgekühlten Mörsers und Pistills mit etwa 10 % (Gewicht/Gewicht) vorgekühltem, mit Säure gewaschenem Sand und eiskaltem 0,1 M Mcllvaines-Zitronensäurephosphatpuffer* pH 5,5 zerteilt. Ein Eppendorf-System wurde verwendet, um das Zellhomogenat während 2 min zu zentrifugieren, um den Sand und Bruchstücke zu entfernen. Die resultierende obenschwimmende Flüssigkeit wurde in reine Röhrchen überführt und weitere 5 min zentrifugiert. Die obenstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig aus dem Zentrifugenrohr entfernt und vor der Verwendung auf Eis gehalten. Peroxidasetest
Peroxidase katalysiert einen Reaktionswirt, in welchem Wasserstoffperoxid ein spezifisches Oxidationsmittel ist und ein großer Bereich von Substraten als Elektronendonor dient.
H&sub2;O&sub2; x XH T XOH + H&sub2;O
Der in dem beschriebenen Versuch in dieser Anwendung benutzte Eletronendonor ist Guaiacol (Bergmeyer, 1983).
H&sub2;O&sub2; + 4 Guaiacol T H&sub2;O + Tetraguaiacal
In diesem Fall wird das Testgemisch folgendermaßen hergestellt:
Die Reaktion wird durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid gestartet. Obwohl das Zellextraktvolumen in Abhängigkeit von der Aktivität des Enzyms geändert wird, wird doch das Gesamttestvolumen durch entsprechende Veränderung des verwendeten Puffervolumens auf 3,0 ml gehalten. Das Aussehen von Tetraguaical, d.h. eine Steigerung der Absorption bei 436 nm, wird während der Reakion bei 25 ºC überwacht.
Die Peroxidaseaktivität (Einheiten/ml) in dem Zellextrakt und dem Medium wird gemäß der Formel berechnet:
Aktivitätseinheiten/ml = Δ/min x 4 x Reaktionsvolumen (ml)/ 25,5 x Probenvolumen (ml)
*) Mcllvaines Zitronensäure-Phosphatpuffer: 43,10 ml 0,1 M Zitronensäure und 56,90 ml 0,2 M Dinatriumphosphat
Eine Enzymaktivitätseinheit wird als uMol von je Minute benutztem Substrat definiert. Δ/min ist die Absorptionsveränderung je Minute bei 436 nm, und die Konstante 25,5 ist der molare Extinktionskoeffizient (cm²/mol) für Tetraguaiacal.
Fig. 2 der beiliegenden Zeichnung bedeutet eine Kurve, die das Peroxidaseproduktionsprofil im Medium aus einer Suspensions-Wurzelzellkultur von Acer pseudoplatanus in 250 ml- Erlenmeyer-Kolben zeigt. Am achten Tag der Züchtung gibt es eine wesentliche Steigerung der Medium-Peroxidaseaktivität, um 34 500 Einheitenil Medium zu erreichen. Dieser Aktivitätswert entspricht etwa 80 % der gesamten Peroxidaseaktivität in der Kultur. Somit ist ersichtlich, daß der achte Tag der Kultur optimal für die Peroxidaseextraktion ist.
Die Peroxidaseextraktion aus der Kultur erreicht man durch herkömmliche Abstromverarbeitungstechniken, und hier liegt der Vorteil dieses Verfahrens darin, daß etwa 80 % der Peroxidase in dem Kulturmedium vorliegen und daher relativ leicht extrahiert werden. Nach Abtrennung der Zellen von dem Medium wird letzteres unter Verwendung von Ultrafiltration konzentriert, indem man zunächst die Flüssigkeit durch ein Filter mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 100 000 und dann durch ein Filter mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 20 000 schickt. Für Enzym mit hoher Reinheit können herkömmliche Chromatographiemethoden angewendet werden.
Die Charakteristiken des erhaltenen Peroxidaseproduktes sind folgende:
Molekulargewicht (Gelfiltration): etwa 37 000
pH-Bereich: 4 bis 9
optimaler pH 5,5
optimaler Test: 45 ºC

Temperaturbeständigkeit:

Wie durch Fig. 3 gezeigt, behält die Peroxidase etwa 50 % ihrer ursprünglichen Aktivität beim Erhitzen auf 65 bis 70 ºC während 1 h nach einer anfänglichen Abnahme der Aktivität während der ersten 10 min. Andere Tests zeigten, daß etwas Aktivität selbst nach dem Erhitzen auf 95 ºC erhalten wird.

Lagerbeständigkeit:

Es zeigte sich, daß die Peroxidase ihre Aktivität über längere Zeitdauer, z. B. 12 Monate oder mehr, bei Temperaturen von 4 bis -20 ºC behält. Das Enzym kann in roher Form, als eine Suspension in Ammoniumsulfat oder gefriergetrocknet gelagert werden. Eluierprofil:
Beim Eluieren aus einer Whatman-lonentauschersäule CM 52 unter Verwendung eines Gradienten von 0,01 bis 1,0 M Natriumacetatpuffer bei pH 5,0 bekommt man ein charakteristisches Profil mit sechs Peaks, siehe Fig. 4.

Claims

1. Verfahren zur Hertellung von Peroxidase-Enzym, bei dem man eine Pflanzenzellkultur extrazelluläre Peroxidase produzierender Zellen aus einer Planze der Gattung Acer in Suspension in einem Kulturmedium, das das Wachstum der extrazelluläre Peroxidase produzierenden Zellen unterstützen kann, erzeugt, das Züchten dieser Zellen in Suspension in dem Kulturmedium mit der gleichzeitigen Ansammlung extrazellulärer Peroxidase in dem Kulturmedium fortsetzt und die angesammelte Peroxidase aus dem Kulturmedium gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die extrazelluläre Peroxidase produzierenden Pflanzenzellen Zellen der Art Acer pseudoplatanus sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die extrazelluläre Peroxidase erzeugenden Pflanzenzellen Wurzelzellen sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Suspensionskultur aus gekeimten Pflanzensamen erzeugt wird, indem man zunächst die Pflanzensamen auf einem ersten Wachstumsmedium keimt, Bereiche von Wurzelgewebe von den gekeimten Samen auf frisches Wachstumsmedium überführt, das überführte Wurzelgewebe einen Kallus bilden läßt, den Kallus zertrennt und die zertrennten Kalluszellen in dem Kulturmedium unter Bildung einer Suspensionskultur dispergiert.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das in der Suspensionskultur der extrazelluläre Peroxidase produzierenden Pflanzenzellen verwendete Kulturmedium als eine Kohlenstoffquelle 1 bis 15 Gew. % Fructose, Glucose oder Saccharose enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem als die kohlenstoffhaltige Quelle ein Glucose und/oder Saccharose enthaltendes Kohlenhydrat-Abfallmaterial verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Glucose und/oder Saccharose enthaltende Abfallmaterial ein Süßwarenabfall ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, bei dem die Zellen in der Suspensionskultur unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 25 ºC und einem pH-Wert im Bereich von 5,6 bis 5,8 gezüchtet werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem das extrazelluläre Peroxidaseprodukt aus der Kultur als ein Rohextrakt gewonnen wird, indem man die obenschwimmende peroxidasehaltige Flüssigkeit von der Kultur abtrennt und die Flüssigkeit unter Bildung eines Rohperoxidase enthaltenden Konzentrates konzentriert.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem nach dem Züchten in Suspension das gezüchtete Pflanzenzellengewebe von dem Kulturmedium abgetrennt wird, um eine die angesammelte extrazelluläre Peroxidase enthaltende obenschwimmende Flüssigkeit zu bekommen, wobei man die extrazelluläre Peroxidase aus der obenschwimmenden Flüssigkeit gewinnt und das abgetrennte Pflanzenzellengewebe weiter bearbeitet, um intrazelluläre Peroxidase als ein getrenntes Produkt zu gewinnen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die intrazelluläre Peroxidase aus dem abgetrennten Pflanzenzellengewebe gewonnen wird, indem man die Zellen in dem abgetrennten Pflanzenzellengewebe zertrennt, die intrazelluläre Peroxidase aus den zertrennten Pflanzenzellen durch Extraktion mit Ethanol extrahiert und die extrahierte intrazelluläre Peroxidase mit Ammoniumsulfat ausfällt.