DE69122850T2

DE69122850T2 - Konformationsepitope des humanen Immundefizienzvirus-Hüllprotein-gp120

Info

Publication number: DE69122850T2
Application number: DE69122850T
Authority: DE
Inventors: Alexander Robert Neurath
Original assignee: New York Blood Center Inc
Current assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1990-02-07
Filing date: 1991-02-12
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2011-02-13
Also published as: DK0498905T3; DE69122850D1; CA2035576A1; EP0498905A1; EP0498905B1; JPH0597895A

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Teil eines Konformationsepitops des menschlichen Immunschwäche Virushüllenglycoproteins gp120 (HIV-1). Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Sequenzen innerhalb des Bereichs (113 - 142) von HIV-1-gp120.

Beschreibung des Stands der Technik

Virusneutralisierende und schützende Antikörper gegen HIV-1 richten sich hauptsächlich gegen einen Bogen, umfassend die Reste (303 - 338) (Nummerierung der Reste nach Ratner, L., Haseltine, W., Patarca, R., Livak, K.J., Starchich, B., Josephs, S.F., Duran, E.R., Rafalski, JA., Whitehorn, E.A., Baumeister, K., Ivanoff, L., Peteway, Sr.R., Jr., Pearson, M.L., Lautenberger, JA., Papas, T.S., Ghrayeb, J., Chang, N.T., Gallo, R.C. and Wong-Staal, F., "Complete Nucloetide Sequence of The AIDS Virus, HTLV-III, Nature, 313:277-284, 1985) (Godsmit, J., (1988), "Immunodominant B-Cell Epitopes of the HIV-1 Envelope Recognized by Infected and Immunized Hosts., AIDS 2, S41 - S45; Goudsmit, J. Debouck, C., Meben, R.H., Smit, L., Bakker, M., Asher, D.M., Wolff, A.V., Gibbs, Jr., C.J. and Gajdusek, D.C., (1988), "Human Immunodeficiency Virus Type 1 Neutralization Epitope With Conserved Architecture Elicits Early Type-Specific Antibodies in Experimentally Infected Chimpanzees", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 4478 - 4482; Matsushita, S., Robert-Guroff, M., Rusche, J., Koito, A., Hatton, T., Hoshino, H., Javaherian, K., Takatsuki, K. and Putney, S.D., (1988), "Characterization of a Human Immunodeficiency Virus Neutralizing Monoclonal Antibody and Mapping of the Neutralizing Epitope", J. Virol., 62, 2107 - 2114; Palker, T.J., Clark, M.E., Langlois, A.J., Matthews, T.J., Weinhold, K.J., Randall, R.R., Bolognesi, D.P. and Haynes, B.F., (1988), "Type-Specific Neutralization of the Human Immunodeficiency Virus With Antibodies to Env-Encoded Synthetic Peptides", Proc. Natl. Acada. Sci. USA, 85, 1932 - 1936; Rusche, J.R., Javaherian, K., Mcdanal, C., Petro, J., Lynn, D.L., Grimaila, R., Langlois, A., Gaib, R.C., Arthur, L.O., Fischinger, P.J., Bolognesi, D.P., Putney, S.D. and Matthews, T.J., (1988), "Antibodies that Inhibit Fusion of Human Immunodeficiency Virus-Infected Cells Bind a 24- Amino Acid Sequence of the Viral Envelope, gp120, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 3198 - 3203; Neurath, A.R., Strick, N. and Lee, E.Y.S., (1990), "B-Ce11 Epitope Mapping of Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) Envelope Glycoproteins With Long (19 to 36-residue) Synthetic Peptides", J.Gen. Virol., in press; and Javaherian, K., Langluis, A.J., McDanal, C., Ross, K.L., Eckler, L.I., Jellis, C.L., Profy, A.T., Rusche, JA., Bolognesi, D.P., Putney, S.D. and Matthews, T.J., "Principal Neutralizing Domain of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Envelope Protein", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 6768 - 6772 (1989).
Diese Sequenz (303 - 338) ist Teil einer hypervariablen V3-Region, die sich wesentlich von bestimmten HIV-1-Isolaten unterscheidet (Myers, G., Rabson, A.B., Josephs, S.F., Smith, T.F. and Wong-Staal, F., (1988), "Human Retroviruses and AIDS 1988: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences", Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico) Daher sind die von dieser Region des HIV-l ausgewählten virusneutralisierenden Antikörper subtypenspezifisch (Neurath, A.R. and Strick, N. (1990), "Confronting the Hypervariability of an Immunodominant Epitope Eliciting Virus Neutralizing Antibodies From the Envelope Glycoprotein of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1)", Mol. Immunol., zur Veröffentlichung eingereicht).
Die Entdeckung von Mutanten, die sich der Neutralisation entziehen, mit hypervariablen V3 -Bogensequenzen, die identisch zu HIV-1-Isolaten sind, welche neutralisiert werden können (Willey, R.L., Ross, E.K., Buckler-White, A.J., Theodore, T.S. and Martin, M.A., (1989), "Functional Interaction of Constant and Variable Domains of Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120", J. Virol., 63, 3595 - 3600; Nara, P. Dunlop, N., Hatch. W., Waters, D., Merges, M., Smit, L., Gallo, R. and Goudsmit, J., (1990), "Sequence Variation of the HIV-1 Neutralization Determinant, in Vaccines 90 (Edited by R.A. Lerner, H. Ginsburg, R.M. Chanock and F. Brown), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (in press) zeigt, daß Aminosäureersatz außerhalb des hypervariablen Bogens die Erkennung durch Antikörper der Epitope im hypervariablen Bogen dramatisch beeinflussen kann. Diese Ergebnisse lassen weiterhin darauf schließen, daß virusneutralisierende und schützende Antikörper gegen konformationsabhängige Epitope gerichtet sind, von denen nur ein Teil Seqenzen im Bereich 303 - 338 von HIV-1 gp120 entspricht. Das Beschreiben von anderen Sequenzen, umfassend dieses Epitop, ist wesentlich für das Verständnis des Prozesses der Virusneutralisation und zur Entwicklung schützender Immunogene gegen HIV-1-Infektion. Definitionen Aminosäurensymbole
WO-A-90/00901 schlägt ein Peptidantigen vor, welches in Individuen von einer großen Anzahl von verschieden großen histokompatiblen Typen die Wucherung von T-Zellen stimuliert, die zum Erkennen von Zellen des HIV- Hüllenproteins befähigt sind. Solche Peptide sind Peptide HP 6 bis 8, welche die Aminosäurenreste 112 bis 134 (HEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCV) überbrücken.
Die oben erwähnten Aufgaben und andere Aufgaben, Ziele und Vorteile werden durch die vorliegende Erfindung erfüllt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, umfassend
(a) die Aminosäuresequenz
des Hüllenglycoproteins gp120 des BH-10-Isolats des menschlichen Immunschwäche-Virus oder eine analoge Aminosäuresequenz eines menschlichen Immunschwäche-Virus gp120-Isolats anderer Art als BH-10;
verbunden durch eine Aminosäurespacersequenz mit:
(b) einer Aminosäuresequenz, umfassend 5 bis 36 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz:
des Hüllenglycoproteins gp120 des BH-10-Isolats des menschlichen Immunschwäche-Virus oder einer analogen Aminosäuresequenz eines menschlichen Immunschwäche-Virus gp120o-Isolats anderer Art als BH-10;
besagtes Polypeptid, das nicht mehr als 302 Aminosäuren und keine Sequenz umfaßt, die identisch mit der des ganz natürlichen gp120 ist.
Entsprechend einer Ausführungsform umfaßt das Polypeptid die Aminosäuresequenz 113 bis 338 des Hüllenglycoproteins gp120 des BH-10-Isolats des menschlichen Immunschwäche- Virus oder eine analoge Aminosäuresequenz eines menschlichen Immunschwäche-Virus gp120-Isolats anderer Art als BH-10.
Figuren 1a, 1b und 1c sind drei Graphen, welche die Wirkung des monoklonalen Antikörpers NEA-9305 auf die Haftung an HIV-1 GP160 von bestimmten Hasen- Antipeptidantiseren darstellen. Figur 1a gilt für das Antipeptid (113 bis 142) Aba133 Antiserum. Figur 1b gilt für das Antipeptid (306 bis 338) Antiserum. Figur 1c gilt für das Antipeptid (303 bis 338) Antiserum.
Figuren 2a, 2b und 2c sind drei Graphen, welche die Wirkung von Ziegen-Anti-SP10 auf das Binden an HIV-1 gp160 von bestimmten Hasen-Antipeptidantiseren darstellen. Figur 2a gilt für Anti- (113 bis 142) Aba133. Figur 2b gilt für Anti- (306 bis 338). Figur 2c gilt für Anti- (303 bis 338).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid eines Konformationsepitops des menschlichen Immunschwäche-Virus (HIV-1) Hüllenglycoproteins gp120, umfassend die Sequenz (113 bis 142)
des BH-10-Subtyps, das nicht mehr als 302 Aminosäuren und analoge Sequenzen von anderen HIV-1-Subtypen umfaßt, von denen einige wie folgt gezeigt werden: ZAIREAN CONSENSUS
In einer Ausführung der Erfindung ist das Cystein ("C") in Position 133 durch γ-Aminobutylsäure (Aba) auf Position 133 ersetzt worden.
In einer Ausführung der Erfindung wird die gesamte Sequenz der 30 Aminosäuren der Sequenz (113 bis 142) verwendet und in einer anderen Ausführung der Erfindung wird diese gesamte Sequenz (113 bis 142) verwendet und das Cystein in Position 133 wird durch γ-Aminobutylsäure ersetzt.
In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung umfaßt das Epitop die Sequenz (126 bis 137) CVKLTPLCVSLK.
Im allgemeinen hat das erfindungsgemäße Peptid nicht mehr als 302 Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als 100 Aminosäuren.
Die erfindungsgemäßen Peptide können entweder synthetische Peptide (Peptide, die durch eine Aneinanderreihung individueller Aminosäuren hergestellt sind durch chemische Mittel oder durch Verwendung von Expressionsvektoren [DNA-Weg]) oder Peptide, die aus natürlichen Quellen erhalten werden, sein. Bei der Bildung eines Peptids, erhalten aus natürlichen Quellen, wird ein Protein, enthaltend die gewünschte Amonosäuresequenz, einer selektiven Proteolyse unterzogen, wie Spaltung des Proteins mit chemischen Reagenzien oder unter Verwendung von Enzymen.
Die Länge der einzelnen Amonosäuresequenz ist abhängig vom Verfahren zur Herstellung der Sequenz. Wenn die Sequenz durch zusammensetzung einzelner Aminosäuren durch chemische Mittel hergestellt wird, wird die Sequenzlänge im allgemeinen nicht mehr als 50 Aminosäuren betragen. Wird das Peptid über den DNA-Weg erhalten, so kann die Kettenlänge größer sein, beispielsweise 100 oder mehr Aminosäuren. Sie ist jedoch normalerweise kürzer und wesentlich kürzer als das natürlich vorkommende Human- Immunschwäche -Virushüllenprotein gp120.
Wenn die Aminosäuresequenz jedoch Teil einer langen Kette ist, wenn beispielsweise mehr als eine Sequenz von Aminosäuren vorhanden ist, kann die Kette Reste von verschiedenen Anteilen enthalten, beispielsweise Segmente von Polyaminosäuren oder Polysacchariden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführung können ein oder mehrere Peptide in Verbindung mit mindestens 5 bis 36 aufeinanderfolgenden Aminosäuren in der BH-10-HIV-1-Sequenz (303 bis 338) verwendet werden:
oder analoge Sequenzen, entsprechend den HIV-1-Subtypen anderer Art als BH-10, von denen einige im nachfolgend aufgelistet sind:
In einer weiteren Ausführungsform kann ein künstliches Peptid mit γ-Aminobutylsäure anstelle von Cystein in Position 133 in Verbindung mit wenigstens sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren in der HIV-1-Sequenz (303 bis 338) verwendet werden.
Sequenzen, umfassend (113 bis 142), können mit Sequenzen, umfassend (303 bis 338) durch Verwendung eines Spacers, beispielsweise Spaceraminosäure, durch Verwendung eines gemeinsamen Trägers, durch Verwendung verschiedener Träger oder durch Verwendung eines Aminosäuresequenz, überbrückend sowohl (113 bis 142) und (303 bis 338), kombiniert werden.
Anti-HIV-1 wirksame Mengen von (1) einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Peptide oder (2) der vorher erwähnten Zusammensetzungen, die (a) eines oder mehrere erfindungsgemäße Pepptide und (b) eine oder mehrere Aminosäuresequenzen in der HIV-1-Sequenz (303 bis 338) umfassen, können mit einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel gemischt werden, beispielsweise phosphatgepufferter Salzlösung zur Bildung von Anti-HIV-1-Impfstoffen.
Die erfindungsgemäßen Peptide (Sequenzen) können verwendet werden, um die Produktion von HIV neutralisierenden Antikörpern durch Gabe einer anti-HIV- 1-wirksamen Menge eines künstlichen Peptids (Sequenz) an ein Tier, beispielsweise einen Warmblüter, beispielsweise einen Menschen, anzuregen.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch in der HIV-1- Diagnostik angewendet werden, um beispielsweise HIV-1- Antikörper zu entdecken.
Bei der Bildung eines synthetischen Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise sicherzugehen, daß die Aminosäure eine sterische Konfiguration besitzt, welche durch den HIV-1-Antikörper erkannt wird. Deshalb kann die gegebene Aminosäurenkette als Teil der Aminosäurenkette eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren an einem oder an beiden Enden der Kette gebunden haben. Diese zusätzlichen Aminosäuren können als Hilfsaminosäuren dienen, um die Stabilität der Aminosäurekette zu verstärken, so daß sie durch HIV-1- Antikörper einfach zu erkennen ist. Die zusätzlichen Aminosäuren können die gleichen Aminosäuren in der gleichen Sequenz wie in natürlichen Proteinen sein, es können aber auch andere Aminosäuren verwendet werden.
Ein Träger kann für das synthetische Peptid gemäß der Erfindung bereitgestellt werden. Dabei soll jedoch verstanden werden, daß ein Träger zur Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht verwendet werden muß, d. h. ein Träger muß nicht verwendet werden, um eine Immunantwort zu erhalten.
Der "Träger" ist einfach eine physiologisch verträgliche Masse, an welcher das Peptid gebunden ist und welcher die Imunantwort verstärken soll. Ein Träger kann einfach eine Kette von Aminosäuren oder andere Bestandteile umfassen. Es ist vorzuziehen, daß alternative Träger eine Substanz, tierisch, vegetativ oder mineralisch, umfassen, welche physiologisch akzeptabel ist und welche das Peptid so präsentiert, daß es vom Immunsystem eines Gasts erkannt wird und eine zufriedenstellende immunologische Antwort stimuliert.
So erhält man eine große Auswahl von Trägern und diese umfassen Materialien, welche träge sind, biologische Aktivität besitzen und/oder eine immunulogische Antwort fördern. Beispiele von Proteinträgern sind u. a. Tetanustoxoid und Lympethemocyanin.
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch Vernetzungsmittel, die zur Verbindung einer Vielzahl von enthaltenden synthetischen Peptiden eingesetzt werden, verbunden werden. Quervernetzende Mittel, welche als funktionelle Gruppe ein Aldehyd (beispielsweise Glutaraldehyd), Carboxyl, Amin, Amid, Imid oder eine Azidophenylgruppe haben, werden bevorzugt.
Ein Träger für die erfindungsgemäßen Peptide kann auch ein Lipidvesikel sein. Lipidvesikel können durch Beschallen eines Lipids in einem wässrigen Medium, durch Resuspendieren von getrockneten Lipidschichten in einem Puffer oder durch Dialyse von in einem organischen Lösungsmittel gelösten Lipiden gegen einen Puffer der Wahl gebildet werden.
Die chemische Synthese von Peptiden ist in folgenden Veröffentlichungen beschrieben: S.B.H. Kent, Biomedical Polymers, eds. Goldberg, E.P. and Nakajima, A. (Academic Press, New York), 213 -242, (1980); AR. Mitchell, S.B.H. Kent, M. Engelhard, and R.B. Merrifield, J.Org. Chem., 43, 2845 - 2852, (1978); J.P. Tam, T.-W. Wong, M. Riemen, F.-S. Tjoeng and R.B. Merrifield, Tet. Letters, 4033 - 4036, (1979); 5. Mojsov, A.R. Mitchell and R.B. Merrifield, J. ORQ. Chem., 45 555 - 560, (1980); J.P. Tam, R.D. Dimarchi and R.B. Merrifield, Tet. Letters, 2851 - 2854, (1981) and S.B.H. Kent, M. Riemen, M. Le Doux and R.B. Merrifield, Proceedings of the IV International Symposium on Methods of Protein Sequence Analysis, (Brookhaven Press, Brookhaven, N.Y.), 1981.
In dem chemischen Syntheseverfahren an festen Trägermaterialien nach Merrifield wird die gewünschte L-Aminosäurensequenz von der endständigen Carboxylaminosäure zur endständigen Aminoaminosäure aufgebaut. Ausgehend von der geeigneten terminalen Carboxylaminosäure, die an ein Polystyrol (oder anderes geeignetes) -Harz über eine chemische Verbindung an eine Chlormethylgruppe, Benzhydrylamingruppe oder andere reaktive Gruppe des Harzes gebunden ist, wird eine Aminosäure nach der anderen unter Einsatz des folgenden Verfahrens addiert. Das Peptidharz wird:
(a) mit Methylenchlorid gewaschen;
(b) durch zehnminütiges Mischen bei Raumtemperatur mit 5 % (V/V)-Diisopropylamin (oder einer anderen sterrisch gehinderten Base) in Methylenchlorid neutralisiert;
(c) mit Methylenchlorid gewaschen;
(d) Eine Aminosäuremenge, die gleich der sechsfachen molaren Menge der wachsenden Peptidkette ist, wird aktiviert durch zehnminütiges Zusammenfügen bei 0ºC mit halb soviel Mol eines Carbodiimids (z. B. Dicyclohexylcarbodiimid oder die Isopropylcarbodiimid), um das symetrische Anhydrid der Aminosäure zu bilden. Die verwendete Aminosäure sollte ursprünglich als N-α-tert.-Butyloxycarbonylderivat bereitgestellt werden, mit Seitenketten, geschützt mit Benzylestern (beispielsweise Aspartin- oder Glutaminsäuren), Benzyläthern (beispielsweise Serin, Threonin, Cystein oder Tyrosin), Benzyloxycarbonylgruppen (beispielweise Lysin) oder anderen Schutzgruppen, wie sie gewöhnlich in der Peptidsynthese verwendet werden;
(e) die aktivierte Aminosäure läßt man mit dem Peptidharz zwei Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren, was zu einer Addition der neuen Aminosäure ans Ende der wachsenden Peptidkette führt;
(f) das Peptidharz wird mit Methylenchlorid gewaschen;
(g) die N-α-(tert.-Butyloxycarbonyl) Gruppe wird von der als letzte addierten Aminosäure durch Reaktion mit 30 bis 65%iger, vorzugsweise 50%iger (V/V) Trifluoressigsäure in Methylenchlorid 10 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur entfernt;
(h) das Peptidharz wird mit Methylenchlorid gewaschen und
(i) die Schritte (a) bis (h) werden wiederholt, bis die gewünschte Peptidsequenz konstruiert worden ist.
Das Peptid wird dann vom Harz entfernt und gleichzeitig werden die Seitenkettenschutzgruppen durch Reaktion mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure, enthaltend 10 % V/V- Anisol oder ein anderes geeignetes (aromatisches) Spülmittel, entfernt.
Im folgenden kann das Peptid durch Gelfiltration, Ionaustauscher, Hochdruckflüssigchromatographie oder andere geeignete Maßnahmen gereinigt werden.
In manchen Fällen kann die chemische Synthese ohne das Festphasenharz durchgeführt werden. In diesem Fall werden die synthetischen Reaktionen gänzlich in Lösung durchgeführt. Die Reaktionen sind ähnlich und in der Technik gut bekannt, und das Endprodukt ist im wesentlichen identisch.
Das gewünschte Peptid kann auch aus natürlichen Quellen isoliert werden. Wenn eine genügende Menge des ganzen Proteinantigens vorhanden ist, kann ein begrenzter Teil des Moleküls, der die gewünschte Aminosäuresequenz aufweist, durch eine der folgenden Verfahren extrahiert werden:
(a) Aufschluß des Proteins durch proteolytische Enzyme, insbesondere solche Enzyme, deren Substratspezifität zu einer Spaltung des Proteins an einem Ort direkt neben der gewünschten Aminosäuresequenz führt;
(b) Spaltung des Proteins durch chemische Mittel Bestimmte Bindungen zwischen Aminosäuren können durch Reaktion mit spezifischen Reagenzien gespalten werden. Beispiele sind unter anderem: Bindungen neben Methionin können durch Bromcyan gespalten werden; Asparaginglycinbindungen können durch Hydroxylamin gespalten werden;
(c) eine Kombination von proteolytischen und chemischen Spaltungen.
Es ist auch möglich, einen geringen Teil der DNA, der entweder aus natürlichen Qellen stammt oder durch synthetische Verfahren hergestellt ist oder durch Verfahren, die eine Kombination derselben beinhalten, zu klonieren, wobei die DNA für die erwünschte Aminosäuresequenz kodiert, was zu der Bildung des Peptids durch Bakterien oder andere Zellen führt.
Es können auch Ketten nach der folgenden Verfahrensweise gebildet werden: Eine wässrige Lösung eines Peptids oder von Peptiden wird mit einem wasserlöslichen Carbodiimid (beispielsweise Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid) vermischt. Dies führt zu einer Polymerisation der Peptide; abhängig von der Verwendung der Seitenkettenschutzgruppen, wie oben erwähnt, können entweder geradkettige oder verzweigte Polymere des Peptids hergestellt werden.
Sofern erwünscht, kann ein erfindungsgemäßes Peptid an eine Kette von jeder der folgenden Verbindungen gebunden sein: Polypeptid, Polyaminosäure, Polysaccharid, Polyamid oder Polyacrylamid, welche als stabilisierende Kette oder als Brücke zwischen Aminosäuren der jeweiligen Ketten dienen können. Solche Ketten sind im Handel erhältlich oder im Fall der Polyaminosäuren durch ein Verfahren hergestellt, das das Mischen einer Lösung der gewünschten Aminosäuresequenz mit einer Lösung des N-carboxylanhydrids der Aminosäure mit anschließender basenkatalysierter Polymerisation, welche durch die Aminogruppen des Peptids initiiert wird, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf diagnostische Tests zum direkten Nachweis von HIV-1-Antigenen und HIV- 1-Antikörpern unter Verwendung gebräuchlicher Techniken, beispielsweise Radioimmunoassay (RIA), Enzymimmunoassay (ELISA) oder Fluoreszenztechniken gerichtet.
Das Labeln ("Markieren") von einer der Reaktionskomponenten in einem diagnostischen Versuch kann durch Verwendung eines "Markers", einer "Markersubstanz" oder eines "Labels", beispielsweise durch Einbau eines radioaktiven Atoms oder einer Gruppe oder durch Koppeln einer immunologischen Komponente an ein Enzym, einen Farbstoff, beispielsweise chromophobe Anteile oder an eine fluoreszierende Gruppe, erreicht werden.
Die betreffenden iminunologischen Komponenten werden vorzugsweise durch Koppeln an ein Enzym markiert, da eine solche Bestimmung wesentlich einfacher, als beispielsweise die Bestimmung von Radioaktivität ist, für die spezielle Apparate notwendig sind.
Die verwendeten Enzyme sind vorzugsweise solche, welche colorimetrisch, spektrofotometrisch oder fluorimetrisch bestimmt werden können. Nicht begrenzende Beispiele für Enzyme, welche in diagnostischen Versuchen verwendet werden, sind unter anderem Enzyme von der Gruppe der Oxidoreductasen, beispielsweise Katalase, Peroxidase, Glucoseoxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-Galactosidase, Urease und Galctoseoxidase. Weiterhin können die folenden Enzyme verwendet werden: alkalische Phosphatase und β-Lactamase.
Die Kopplung des Enzyms und der immunologischen Komponente kann auf bekannte Art erreicht werden, beispielweise durch Bildung einer Amidbindung durch Verfahren, die aus der Peptidchemie bekannt sind.
Markieren mit einem radioaktiven Isotop kann ebenfalls auf bekannte Weise durchgeführt werden. Nützliche Isotope für die Markierung sind hauptsächlich I¹²&sup5;, I¹³¹, C¹&sup4; und H³.
Im allgemeinen können alle bekannten Immunoassays durchgeführt werden. Diese Immunoassays schließen ein, die beschrieben sind bei Langone und Van Vunakis, Methods of Enzymology, Academic Press, Volumes 70, 73 und 74. Die Versuche in den Veröffentlichungen der folgenden US Patente: 4 459 359, 4 343 896, 4 331 761, 4 292 403, 4 228 240, 4 157 280, 4 152 411, 4 169 012, 4 016 043, 3 839 153, 3 654 090 und Re 31 006 und Volumes 70, 73 und 74 von Methods of Enzymology.
Der wirksame Bestandteil eines Impfstoffs, d. h. der ein erfindungsgemäßes Peptid umfaßt, kann mit einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel (Medium) z. B. phosphatgepufferte Salzlösung, verwendet werden. Im allgemeinen wird die Peptidkonzentration in einem physiologisch verträglichen Medium etwa zwischen weniger als 1 mg und mehr als 10 µg.pro Dosis liegen.
Der Impfstoff kann einem Warmblüter, einem Menschen, beispielsweise subcutan, intradermal oder intramuskular verabreicht werden. Während die bevorzugte Art von dem besonderen Impfstoff abhängt, wird angenommen, das die intramuskuläre Injektion allgemein anwendbar ist. Die Häufigkeit der Verabreichung wird in Abhängigkeit vom Impfstoff variieren. Im allgemeinen wird der Impfstoff in zwei Dosen, die zeitlich einen Monat auseinander liegen verabreicht werden, gefolgt von einer Auffrischung 6 Monate bis 1 Jahr nach der ersten Immunisierung. Die folgenden Dosen oder die Auffrischung sind abhängig vom Anteil der Antikörper im Blut als Resultat der ersten Immunisierung und kann in einigen Fällen überflüssig sein.
Hilfsstoffe konnen im Impfstoff auch verwendet werden.
Um die Erfindung und die Art der Ausführung weiter zu illustrieren, werden folgende nicht beschränkende Beispiele vorgestellt:

BEISPIELE

Beispiel 1

Die Strategie zum Erreichen eines geringen Abstands in der dreidimensionalen Struktur des GP120 der Aminosäurereste, welche in der primären Arüinosäuresequenz nicht benachbart waren, war wie folgt: Antiseren gegen Peptide von fast der gesamten Sequenz des GP120 wurden hergestellt, darunter auch Antiseren gegen die Sequenzen der V3 hypervariablen Schleife (Reste 303 bis 338); Modrow, S., Hanh, B.H., Shaw, G.M. Gallo, R.C., Wong- Staal, F. and Wolf, H., (1987), "Computer-assisted Analysis of Envelope Protein Sequences of Seven Human Immunodeficiency Virus Isolates: Prediction of Antigenic Epitopes in Conserved and Variable Region", J. Virol., 2:570 - 578). Es wurde erwartet, daß die gegen Sequenzen in der Nähe der dreidimensionalen Struktur des HIV-1 GP120; aber nicht benachbart in der primären Sequenz des GP120 zu den Resten 303 bis 338 gerichteten Antikörper, wenigstens teilweise die Haftung der Anti-303 bis 308 (Anti-306-338) Antikörper zum HIV-Hüllenglycoprotein GP120 oder GP 160 einschränken würden. Aufgrund von technischen Schwierigkeiten beim Nachweis des Konkurrierens zwischen Antikörpern von bestimmten Spezifizierungen, die aus der gleichen Tierart (Hasen) erhalten worden waren, wurde das Konkurrieren von monodonalen Maus-Antikörpern (McAbs), die gegen die V3 hypervariable Schleife (d. h. die Sequenz 315 bis 329) gerichtet sind, mit dem Binden von bestimmten Antipeptidantiseren (Tabelle 1) untersucht. Tabelle 1 Synthetisierte HIV-1 GP120 und GP41 Peptide
Ergebnisse dieser Studien zeigten, daß (a) gegen HIV-1 GP160 gerichtetes Maus Mcab das Binden von Hasen- Antipeptid-Antiserum, das gegen Anti- (303 - 338) und Anti-(306 - 338) gerichtet ist, hemmt (Fig. 1c und 1b); (b) von allen anderen beobachteten Antipeptid-Antiseren nur das Binden von Anti 113 bis 142 Aba133 zu GP120/GP160 durch das McAb gehemmt wurde (Fig. 1a).
Figuren 1a bis 1c zeigen die Wirkung von Mcab NEA-9305 auf das Binden von bestimmten Antipeptidantiseren an HIV- 1 GP160. Behälter aus Polystyrolplatten (Imulon II, Dynatech, Chantilly, VA) wurden mit Recombinat HIV-1 GP160 (500 ng/ml; MicroGeneSys Inc., West Haven, CT) beschichtet und anschließend mit dem Rinderserum-Albumin (10 mg/ml) und Gelatine (1 mg/ml) beschichtet. Mcab NEA- 9305 (DuPont, Boston, MA) wurde zu den Behältern bei einer Entverdünnung von 1 : 500 gegeben. Nach 3omin. Inkubation bei 20ºC wurden verdünnte Lösungen von Antipeptid-Antiseren in 1 % fötalem Rinderserum, 1 % Ziegenserum bei pH 8 in die Behälter gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 20ºC wurden die bindenden Hasenantikörper mittels ¹²&sup5;I-markierten Ziegen-Hasen-Anti- IgG gefunden. Die Behälter wurden mit dem radioaktiven Antikörper 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, gewaschen und die Radioaktivität gemessen. Die Radioaktivität auf der Ordinate von Figur 1 ist logarithmisch aufgetragen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Aminosäurereste in der Sequenz 113 bis 142 räumlich in der Nähe von Resten in der Sequenz 303 bis 338 sind und lassen vermuten, daß Reste von diesen nicht benachbarten Teilen der primären Aminosäuresequenz des GP120 ein funktionell wichtiges Komformationsepitop umfassen, welches durch die virusneutralisierenden Antikörper erkannt wird. Da der monoklonale Antikörper nicht mit den Antikörpern gegen die überlappenden Peptide 102 bis 126 und 138 bis 164 interferiert, spielen Reste innerhalb der Sequenz 127 bis 137 wahrscheinlich eine dominante Rolle in diesem Konformationsepitop. Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung überein, daß Punktmutationen in der Position 135 die Neutralisationsfähigkeit des HIV-l durch Antikörper beeinflußt (Willey et al, (1989), supra). In den synthetisierten Peptiden wurde entweder der C-Rest in Position 126 oder in positibn 133 durch γ-Aminobutylsäure (Aba) ersetzt. Da Antikörper gegen das Peptid 113 bis 142Aba126 keine Wechselwirkung zeigten, ist das Cystein in Position 126 wahrscheinlich wesentlich für dieses Epitop und kann durch Aminobutylsäure im Gegensatz zum Cystein am Rest 133 nicht ersetzt werden. Es ist wahrscheinlich, daß eine Disulfidbindung zwischen den Resten 126 und 137 zu dem Konformationsepitop beiträgt.

Beispiel 2

Ähnliche Ergebnisse, wie oben erwähnt, wurden erhalten, wenn die Hinderung des Bindens an GP160 der Hasenantipeptidantikörper durch Ziegenantiserum gegen das Peptid SP10 (Rest 308 bis 331) beobachtet wurde.
Figuren 2a bis 2c stellen die Wirkung von Ziegen Anti- SP10 auf die Haftung von bestimmten Hasenantipeptidantiseren auf HIV-1 GP160 dar. Behälter aus Polystyrolplatten (Imunolon II, Dynatech, chantilly, VA) wurden mit rekombinierter HIV-1 GP160 (500 ng/ml; MicroGeneSys Inc., West Haven, CT) beschichtet und anschließend mit Rinderserum Albumin (10 mg/ml) und Gelatine (1 mg/ml) beschichtet. Ziegen Ant-SP10 (AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, MD) wurde zu den Behältern bei einer Endverdünnung von 1 : 100 zugegeben. In Kontrollexperimenten wurde Ziegenantiserum gegen Maleinimidobenzoyl- N-hydroxysuccinimidester (NBS) derivatisiertes Tetanustoxoid verwendet. Nach Inkubation während 30 Minuten bei 20ºC wurden Verdünnungen von Hasenantipeptidantiseren in 1 %igem fötalem Rinderserum, pH 8, zu den Behältern gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 20ºC wurden die bindenden Hasenantikörper durch ¹²&sup5;I-markierte Ziegen-Hasen-Anti-IgG gefunden. Die Behälter wurden mit den radioaktiven Antikörpern 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, gewaschen und die Radioaktivität gemessen. Die Radioaktivität auf den Ordinaten von Figuren 2a bis 2c sind logarithmisch aufgetragen.

Claims

1. Ein Polypeptid, umfassend

(a) die Amihosäuresequenz:

des Hüllenglycoproteins gp120 des BH-10-Isolats des menschlichen Immunschwäche-Virus oder eine analoge Aminosäuresequenz eines gp120-Isolats aus einem menschlichen Immunschwäche-Virus anderer Art als BH-10;

verbunden durch eine Aminosäurespacersequenz mit:

(b) einer Aminosäuresequenz, umfassend 5 bis 36 Aminosauren in der Aminosäuresequenz:

des Hüllenglycoproteins gp120 des BH-10-Isolats des menschlichen Immunschwäche-Virus oder eine analoge Aminosäuresequenz eines menschlichen Immunschwäche-Virus gp120-Isolats anderer Art als BH-10;

wobei dieses Polypeptid nicht mehr als 302 Aminosäuren umfaßt und dieses Polypeptid keine Sequenz umfaßt, die identisch mit der des gesamten natürlichen gp120 ist.

2. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz 113 bis 338 des Hüllenglycoproteins gp120 des BH-10-Isolats des menschlichen Immunschwäche Virus oder eine analoge Aminosäuresequenz eines gp120-Isolats aus einem menschlichen Immunschwäche-Virus anderer Art als BH-10.

3. Ein Polypeptid, umfassend

(a) die Aminosäuresequenz (126 bis 137) des Hüllenglycoproteins gp120 des BH-10-Isolats des menschlichen Immunschwäche-Virus oder eine analoge Aminosäuresequenz eines gp120-Isolats aus einem menschlichen Immunschwäche-Virus anderer Art als BH-10;

verbunden durch eine Aminosäurespacersequenz mit

(b) einer Aminosäuresequenz, umfassend 5 bis 36 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz:

wobei dieses Polypeptid nicht mehr als 302 Aminosäuren umfaßt und dieses Polypeptid keine Sequenz umfaßt, die identisch mit der der gesamten natürlichen gp120 ist.

4. Ein Polypeptid, entsprechend einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin γ-Aminobutansäure C in Position 133 ersetzt.

5. Ein Anti-HIV-1-Impfstoff, umfassend eine gegen HIV-1 wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4 in Mischung mit einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel

6. Ein Verfahren zur Anregung der Produktion von menschlichen Immunschwäche-Virus neutralisierenden Antikörpern, umfassend die Verabreichung einer gegen HIV-1 wirksamen Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4 an ein Tier.

7. Eine Zusammensetzung, umfassend

(a) ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz:

im Gemisch mit

(b) einem Polypeptid, umfassend 5 bis 36 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz:

des Hüllenglycoproteins gp120 des BH-10-Isolats des menschlichen Immunschwäche-Virus oder einer analogen Aminosäuresequenz eines gp120-Isolats aus einem menschlichen Immunschwäche-Virus anderer Art als BH-10;

wobei die Zusammensetzung keine Peptide mit mehr als 302 Aminosäuren umfaßt und diese Zusammensetzung keine Sequenz umfaßt, die identisch mit der der gesamten natürlichen gp120 ist.

8. Eine Zusammensetzung, umfassend:

(a) ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz (126 - 137) des Hüllenglycoproteins gp120 des BH-10-Isolats des menschlichen Immunschwäche- Virus oder eine analoge Aminosäuresequenz eines gp120- Isolats aus einem menschlichen Immunschwäche-Virus anderer Art als BH-10;

im Gemisch mit:

(b) einem Polypeptid, umfassend 5 bis 36 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz

wobei diese Zusammensetzung keine Peptide mit mehr als 302 Aminosäuren umfaßt und diese Zusammensetzung keine Sequenz umfaßt, die identisch mit der der gesamten natürlichen gp120 ist.

9. Eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, worin im Polypeptid (a) γ-Aminobutansäure C in Position 133 ersetzt.

10. Eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 9, worin Polypeptid (a) und Polypeptid (b) mit einem gemeinsamen Träger verbunden sind.

11. Eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 9, worin Polypeptid (a) mit einem Träger verbunden ist und Polypeptid (b) mit einem anderen Träger verbunden ist.

12. Ein Impfstoff gegen HIV-1, umfassend eine gegen HIV-1 wirksame Menge einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7, 8, 9, 10 oder 11 im Gemisch mit einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel.

13. Ein Verfahren zur Anregung der Produktion von menschlichen Immunschwäche-Virus neutralisierenden Antikörpern, umfassend die Verabreichung einer gegen HIV-1-wirksamen Menge einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7, 8, 9, 10 oder 11 an ein Tier.