DE69121024T2 - Dns-segmente und das delta-1 des hydrogenasegen enthaltende mikroorganismen und ihre verwendung - Google Patents

Dns-segmente und das delta-1 des hydrogenasegen enthaltende mikroorganismen und ihre verwendung

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Clonierung des δ¹-Dehydrogenasegens von Pseudomonas testosteroni, die dieses Gen codierende Sequenz sowie durch Einschleusen dieses Gens transformierte Mikroorganismen und ihre Verwendung zur Produktion von δ¹-Dehydrogenase und für die Synthese und Bestimmung von Steroidsubstanzen.
  • Die Biotransformation von Steroiden durch Mikroorganismen oder durch aus diesen hervorgegangene Enzyme mit dem Ziel, Medikamente zu synthetisieren, wird gegenwärtig in der pharmazeutischen Industrie infolge der sehr großen Spezifität und der geringen Durchführungskosten der auf derartige Weise durchgeführten Reaktionen verwendet.
  • Beispielsweise wird die aus bestimmten Athrobacter-Stämmen erhaltene δ¹-Dehydrogenase gegenwärtig bei der Synthese von Sterinen zur therapeutischen Verwendung, wie beispielsweise Prednison und Prednisolon, aus Substraten, wie beispielsweise Cortison oder Hydrocortison, verwendet.
  • Pseudomonas testosteroni ist ein gramnegatives Bakterium, das sich im Boden befindet und das unter Verwendung von Sterinen als alleinige Kohlenstoffquelle wachsen kann. Dieser Organismus baut die Sterine vollständig ab, und mehrere Enzyme sind an diesem Metabolismus beteiligt:
  • - 3-(oder 17-)β-Hydroxysteroiddehydrogenase (EC 1.1.1.51), auch mit dem Namen β-Enzym bezeichnet,
  • - 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase (EC 1.1.1.50), bezeichnet auch mit dem Namen α-Enzym,
  • - 3-Ketosteroid-δ&sup4;-&&sup5;-Isomerase (EC 5.3.3.1), bezeichnet auch mit dem Namen Isomerase,
  • - 3-Ketosteroid-δ¹-dehydrogenase (EC 1.3.99.4), bezeichnet auch mit dem Namen δ¹-Dehydrogenase, sowie zwei weitere Dehydrogenasen (EC 1.3.99.5 und EC 1.3.99.6).
  • Die δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni besitzt, verglichen mit den Enyzmen von gleichen Typ, die gegenwärtig verwendet werden, den Vorteil einer großen physikalisch-chemischen Stabilität. Versuche zur Isolierung und Charakterisierung dieses Enyzms wurden durchgeführt [LEVY und TALALAY, Journal of biological Chemistry (1959), 234, 2014-2021]; jedenfalls führten sie nicht zur vollständigen Reinigung des Proteins, dessen Sequenz bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt unbekannt bleibt.
  • Weiterhin ist es wegen der Komplexität des Metabolismus der Sterine bei Pseudomonas testosteroni und der an diesem Metabolismus beteiligten unterschiedlichen Enyzme unmöglich, direkt Pseudomonas testosteroni in der Industrie für spezifische Synthesereaktionen zu verwenden.
  • Die Erfinder haben sich folglich zur Aufgabe gestellt, das Gen von δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni zu isolieren und zu donieren, um einerseits die Expression des Gens in einem geeigneten Wirt, wie einem Bakterium zur industriellen Verwendung, und andererseits den Erhalt von δ¹-Dehydrogenase in gereinigter Form zu erlauben.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft somit Nukleinsäuresegmente, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe:
  • a) eine Nukleotidsequenz, die δ¹-Dehydrogenase vom Pseudomonas testosteroni codiert,
  • b) eine Nukleotidsequenz, die die Expression des δ¹- Dehydrogenasegens von Pseudomonas testosteroni reguliert,
  • c) homologe oder teilweise oder vollständig einer der in a) oder b) definierten Sequenzen komplementäre Nukleotidsequenzen, umfassen.
  • Erfindungsgemäß werden unter "homologer Sequenz" nicht nur Sequenzen verstanden, die denjenigen, die in a) oder b) definiert sind oder einem Segment davon identisch sind, sondem auch diejenigen, die sich nur durch die Substitution, die Deletion oder Addition einer bestimmten Anzahl von Nukleotiden unterscheiden, mit der Maßgabe, daß die so modifizierten Sequenzen eine der betrachteten Sequenz oder dem betrachteten Segment äquivalente Funktion besitzen.
  • Ebenso versteht man unter "komplementärer Sequenz" nicht nur die strikt den in a) oder b) definierten Sequenzen oder deren Segmenten komplementäre Sequenzen, sondern auch, wie vorstehend angegeben, modifizierte Sequenzen mit der Maßgabe, daß sie den strikt komplementären Sequenzen funktionsäquivalent sind.
  • Derartige funktionsäquivalente Sequenzen sind beispielsweise:
  • - DNA-Sequenzen, die spezifisch mit dem Gen der δ¹-Dehydrogenase hybridisieren können, die zum Erhalt von Sonden verwendbar sind, die die Selektion von Rekombinanten erlauben, in die das Gen während deren Clonierung integriert wurde,
  • - DNA-Sequenzen, die die δ¹-Dehydrogenase von P. testosteroni codieren, und von der Sequenz (I) abgeleitet sind, die nachstehend in der folgenden ausführlichen Beschreibung definiert ist, durch Austausch von einem oder mehreren Codon(s) der genannten Sequenz (I) durch andere Codons, deren Translationsprodukt identisch ist.
  • Die erfindungsgemäßen DNA-Segmente können entweder nach einer in der Molekularbiologie verwendbaren Technik oder auf gentechnischem weg oder durch Assoziation mehrerer dieser Techniken erhalten werden.
  • Die Techniken umfassen, ohne daß dies eine beschränkende Aufzählung darstellen soll, die Extraktions- und Reinigungstechniken von Nukleinsäuren, die Techniken der Spaltung von Nukleinsäuremolekülen durch Restriktionsenzyme oder durch jedes andere geeignete Verfahren, die Techniken der Synthese oder Semisynthese von Nukleinsäuren, die Techniken der Mutagenese oder Transformation von Mikroorganismen, die Techniken der Markierung oder Hybridisierung von Sonden, die Techniken der Rekombination von Nukleinsäuren etc....
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen DNA-Segments umfaßt es mindestens eine der Sequenz (I) homologe oder komplementäre Sequenz (in dem Sequenzprotokoll im Anhang unter der Nr. SEQ ID No.1 bezeichnet), und dieses ist das des etwa 2,2 kb langen KpnI-Fragments der DNA von Pseudomonas testosteroni.
  • Besonders vorteilhaft umfaßt ein erfindungsgemäßes DNA-Segment eine Sequenz, die δ¹-Dehydrogenase von P. testosteroni codiert, wobei die Sequenz bei Nukleotid 248 beginnt und bei Nukleotid 1966 der Sequenz (I) endet.
  • Die Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuresegment, wie vorstehend definiert, enthalten.
  • Unter rekombinantem Vektor wird eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die das Ergebnis der Rekombination einer Nukleinsäuresequenz mit der Fähigkeit zur Autoreplikation und einer Nukleinsäuresequenz, die man donieren und amplifizieren möchte, ist. Die rekombinanten Vektoren können auch Expressionsvektoren sein, die Nukleotidsequenzen tragen, die die Transkription und die Translation einer codierenden Sequenz, die an einer geeigneten Stelle des Vektors insertiert wurde, steuern.
  • Vorteilhafterweise enthalten die Vektoren weiterhin Sequenzen, die die Regulierung der Expression dieses Gens gewährleisten, wie beispielsweise von Sequenzen, die die Expressionskontrolle des Gens als Funktion der Bedingungen des umgebenden Mediums, wie beispielsweise der Temperatur, erlauben.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht ein rekombinanter Vektor aus dem Plasmid mit der Bezeichnung pTEK21, wobei das Plasmid das Ergebnis der Insertion des vorstehend definierten 2,2 kb-DNA-Segments in das Plasmid pUC18 ist.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht ein derartiger Expressionsvektor aus dem rekombinanten Plasmid mit der Bezeichnung pLE689, das das Ergebnis der Insertion der Nukleotidsequenz, die δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni codiert, in Assoziation mit anderen Nukleotidsequenzen aus dem Genom von Pseudomonas testosteroni in das Plasmid pNM185 ist, wobei die Sequenzen eine Rolle bei der Expression und/oder der Regulation der Expression des Gens der δ¹-Dehydrogenase spielen.
  • Das Plasmid pNM185 ist in der Publikation von MERMOD et al. [J. Bacteriol., 167: 447-454 (1986)] beschrieben.
  • Die Erfindung betrifft auch durch einen der vorstehend definierten rekombinanten Vektoren transformierte Mikroorganismen.
  • Clone von Escherichia coli, von Pseudomonas putida und Pseudomonas aeruginosa, die durch die vorstehend genannten Vektoren transformiert wurden, sind Gegenstand einer Hinterlegung bei Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) vom 24. Januar 1990:
  • der Clon E. coli DH5α, transformiert durch das Plasmid pTEK21, trägt die Hinterlegungsnummer I-922;
  • - der don E. coli RR1, transformiert durch das Plasmid pLE689, trägt die Hinterlegungsnummer I-923;
  • - der don P. putida KT2440, transformiert durch das Plasmid pLE689, trägt die Hinterlegungsnummer I-924;
  • - der don P. aeruginosa PAO1161, transformiert durch das Plasmid pLE689, trägt die Hinterlegungsnummer I-925.
  • Die durch ein erfindungsgemäßes Plasmid transformierten Mikroorganismen sind für die donierung und Amplifikation des Plasmids, das das δ¹-Dehydrogenasegen von Pseudomonas testosteroni trägt, verwendbar. Weiterhin können geeignete Mikroorganismen, die durch ein Plasmid mit der Fähigkeit zur Replikation in ihnen transformiert wurden und die die Expression des δ¹-Dehydrogenasegens erlauben, vorteilhafterweise bei der Biotransformation von Steroiden verwendet werden, da die durch diese Mikroorganismen exprimierte δ¹- Dehydrogenaseaktivität nicht durch andere Aktivitäten zum Abbau von Steroiden kontaminiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresonden, die die Detektion des δ¹-Dehydrogenasegens oder eines verwandten Gens bei Pseudomonas testosteroni oder bei anderen Mikroorganismen, die ein derartiges Gen tragen, erlauben, wobei die Sonden dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens eines der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresegmente, die vorstehend definiert wurden, zusammen mit mindestens einem geeigneten Detektionsmittel enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Polypeptidkette, umfassend eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz, die δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni codiert, abgeleitet ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es die nachstehenden Stufen umfaßt:
  • a) Züchtung eines Mikroorganismus, der einen Vektor enthält, der die Expression des δ¹-Dehydrogenasegens von Pseudomonas testosteroni erlaubt,
  • b) Isolierung des gebildeten Enzyms aus der genannten Kultur.
  • Die so gereinigte δ¹-Dehydrogenase kann vorteilhafterweise zur Bestimmung oder zur Biosynthese von Steroiden verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beschreibungsergänzung besser verstanden, die sich auf Beispiele zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresegmente bezieht. Es ist jedoch zu verstehen, daß diese Beispiele nur der Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung davon darstellen.
    • I) REINIGUNG UND CLONIERUNG VON SEGMENTEN, DIE DIE SEQUENZ TRAGEN, DIE δ¹-DEHYDROGENASE VON PSEUDOMONAS TESTOSTERONI CODIERT
  • BEISPIEL 1: Herstellung einer Sonde, die die Lokalisation der Sequenz erlaubt, die δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni codiert.
  • Diese Sonde wurde von DNA von Mutanten, die von dem Stamm Pseudomonas testosteroni mit der Bezeichnung ATCC 17410 abgeleitet sind, erhalten.
    • a) Mutagenese
  • Die Mutagenese des Stammes P. testosteroni ATCC 17410 wird unter Verwendung des Transposons Tns, das ein Kanamycinresistenzgen trägt, insertiert in den Selbstmordvektor pSUP2021, durchgeführt. Dieser Vektor wird aus E. coli S17- 1 transferiert. Während der Konjugation zwischen E. coli S17-1 und P. testosteroni ATCC 17410 erfolgt der Transfer des Vektors pSUP2021 mit einer erhöhten Frequenz.
  • Die Selektion von donen von P. testosteroni, die das Transposon Tn5 enthalten, wird in einem Minimalnährmedium (Medium M9), das 5 mM Natriumparahydroxybenzoat und 50 µg/ml Kanamycin enthält, durchgeführt.
  • 5200 done des Stamms ATCC 17410, die kanamycinresistent sind, werden isoliert. Unter diesen donen werden 41, die kein Testosteron als alleinige Kohlenstoffquelle verwerten, selektioniert. Einer dieser 41 Clone (Clon 06) besitzt eine sehr geringe δ¹-Dehydrogenaseaktivität.
  • Die Gesamt-DNA des dons 06 wird extrahiert und durch EcoRI hydrolysiert. Die so erhaltenen EcoRI-Fragmente werden in pUC19 gemäß dem Zufallsreligierunqsverfahren durch T4-Ligase insertiert. Das so erhaltene Ligierungsgemisch dient der Transformation von kompetenten E. coli-DH5α-Zellen [bezogen von GIBCO BRL, 14, rue des Oziers - 95051 CERGY PONTOISE CEDEX]. Die Bakteriendone, die das Transposon Tn5 enthalten, werden durch ihre Kanamycinresistenz selektioniert. Einer dieser Clone, der ein rekombinantes Plasmid pUC19 trägt, das eine EcoRI-Insertion von etwa 14 kb enthält, wird ausgewählt.
  • Ein 0,8 kb-BamHI-EcoRI-Fragment, das Tn5 benachbart ist, wird zur Verwendung als Sonde selektioniert. Dieses Fragment wird in das Plasmid pUC119 gemäß dem nachstehenden Verfahren subcloniert: Hydrolyse der 14 kb-EcoRI-Insertion durch BamHI, Trennung des BamHI-EcoRI-Fragments durch Agarosegelelektrophorese, Reinigung durch Elektroelution des Gels, anschließend Markierung durch [³²P]-DCTP nach dem sogenannten Nick-Translationsverfahrens.
  • BEISPIEL 2: Erhalt eines 8,3 kb-Fragments, das das δ¹-Dehydrogenasegen trägt.
  • Die Gesamt-DNA von Pseudomonas testosteroni wird durch Ethanolfällung nach Lyse des Bakteriums mittels SDS extrahiert. Diese DNA wird durch das Restriktionsenzym SalI unter den folgenden Bedingungen hydrolysiert: 2stündige Inkubation bei 37ºC der DNA mit dem Enyzm in einer Konzentration von 3 Einheiten pro Mikrogramm DNA.
  • Die so erhaltenen Fragmente werden in das Plasmid pUC19 durch die Wirkung der T4-Ligase insertiert.
  • Die so erhaltenen rekombinanten Plasmide werden zur Transformation des Bakterienstammes E. coli-DH5α unter den von GIBCO BRL, Lieferant von kompetenten Zellen, definierten Bedingungen verwendet. Die so erhaltene Bank wird durch Hybridisierung init der gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhaltenen 0,8 kb-Sonde abgesucht.
  • 5 Clone, die ein 8,3 kb langes SalI-Fragment enthalten, werden so erhalten.
  • BEISPIEL 3: Herstellung des Plasmids pTEK21.
  • Das 2,1 kb lange KpnI-Fragment aus dem 8,3 kb langen SalI- Fragment wird subcloniert: das 8,3 kb lange Fragment wird durch das Enyzm KpnI hydrolysiert. Das freigesetzte 2,1 kb lange Fragment wird durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt und gereinigt. Es wird anschließend in ein zuvor mit KpnI linearisierten pUC18-Vektor religiert.
  • Die Restriktionskarte der 2,1 kb-Insertion ist in Figur 1 gezeigt.
  • Die Anwesenheit des δ¹-Dehydrogenasegens in diesem 2,1 kb- Fragment wird durch die Detektion der Produkte als Ergebnis dieses Enyzins nachgewiesen. Das für diesen Nachweis verwendete Arbeitsprotokoll ist nachstehend ausführlich angegeben (Beispiel 3).
    • II) SEQUENZIERUNG DES δ¹-DEHYDROGENASEGENS VON PSEUDOMONAS TESTOSTERONI
  • Die Sequenzierung des 2,1 kb langen KpnI-Fragments wird unter Verwendung des SANGER-Verfahrens der enzymatischen Markierung mit Didesoxynukleotiden in Gegenwart von mit [³&sup5;S] markierten Desoxyribonukleotiden durchgeführt.
    • III) NACHWEIS DER EXPRESSION DES δ¹-DEKYDROGENASEGENS VON PSEUDOMONAS TESTOSTERONI IN TRANSPORMIERTEN BAKTERIENZELLEN
  • Der Stamm E. coli-DH5α, der das rekombinante Plasmid pTEK21 beherbergt, wird in Nährbrühe bei 30ºC in Gegenwart des δ¹- Dehydrogenasesubstrats (1,75 mM δ&sup4;-Androsten-3,17-dion) gezüchtet. Nach 16stündiger Inkubation werden die Steroide mit Ethylacetat extrahiert und dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Dichlormethan/Dioxan analysiert. Der δ¹-dehydrogenierte Metabolit (δ1,14-Androstadien-3,17-dion) erscheint unter UV- Strahlen in Form eines charakteristischen Flecken.
  • Aus den vorstehenden Ausführungen folgt, daß die Erfindung sich in keiner Weise auf diese Ausführungsformen, Durchführungsformen und Anwendungsformen, die soeben ausführlicher beschrieben wurden, bezieht. Sie umfaßt im Gegensatz dazu alle Varianten, die einem Fachmann auf dem Gebiet einfallen können, ohne vom Umfang oder Gehalt der Erfindung abzuweichen.
    • SEQUENZPROTOKOLL
  • - SEQ ID NO : 1
  • - SEQUENZART : Nukleotid und das entsprechende Protein
  • - SEQUENZLÄNGE : 2230 Basenpaare
  • - ANZAHL DER STRÄNGE : Einzelsträngig
  • - KONFIGURATION : Linear
  • - MOLEKÜLTYP : Genomische DNA
  • - HERKUNFT : Pseudomonas testosteroni
  • - EXPERIMENTELLE HERKUNFT : Unmittelbar
  • - MERKMAL : Gen, das δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni codiert

Claims (18)

1. Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
a) einer Nukleotidsequenz, die δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni mit der Sequenz (I) SEQ ID Nr. 1 codiert, und
b) Nukleotidsequenzen, die der in a) definierten Sequenz homolog sind und ein Protein mit δ¹-Dehydrogenase- Aktivität codieren, und
c) den in a) und b) definierten Nukleotidsequenzen komplementären Sequenzen, umfaßt.
2. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die nachstehende Sequenz (I) (SEQ ID Nr.1) besitzt:
3. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die die δ¹-Dehydrogenase von P. testosteroni codierende Sequenz bei Nukleotid 248 beginnt und bei Nukleotid 1966 der Sequenz (I) (SEQ ID Nr. 1) endet.
4. Rekombinante Vektoren, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassen.
5. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er aus dem Plasmid mit der Bezeichnung pTEK21 besteht, wobei das Plasmid das Ergebnis der Insertion einer DNA-Sequenz mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 in das Plasmid pUC18 ist.
6. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er aus dem rekombinanten Plasmid mit der Bezeichnung pLE689 besteht, wobei das Plasmid das Ergebnis der Insertion der δ¹-Dehydrogenase von P. testosteroni codierenden Nukleotidsequenz in Verknüpfung mit anderen Nukleotidsequenzen aus dem Genom von P. testosteroni in das Plasmid pNM185 ist.
7. Clone von transformierten Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6 enthalten.
8. don nach Anspruch 7, hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) unter der Hinterlegungsnr. I-922 und bestehend aus Bakterienzellen des Stammes E. coli DH5α, die das Plasmid pTEK21 enthalten.
9. Clon nach Anspruch 7, hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) unter der Hinterlegungsnr. I-923 und bestehend aus bakteriellen Zellen des Stammes E. coli RR1, die das Plasmid pLE689 enthalten.
10. Clon nach Anspruch 7, hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) unter der Hinterlegungsnr. 1-924 und bestehend aus Bakterienzellen des Stammes P. putida KT2440, die das Plasmid pLE689 enthalten.
11. Clon nach Anspruch 7, hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) unter der Hinterlegungsnr. I-925 und bestehend aus Bakterienzellen des Stammes P. aeruginosa PA01161, die das Plasmid pLE689 enthalten.
12. Verwendung von mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 transformierten Mikroorganismen zur Biotransformation von Steroiden.
13. Verwendung von mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 transformierten Mikroorganismen zur Produktion von δ¹-Dehydrogenase.
14. Detektionssonden, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, in Verknüpfung mit mindestens einem geeigneten Detektionsmittel, enthalten.
15. Polypeptidkette, umfassend eine Aminosäuresequenz als Ergebnis der Translation der DNA-Sequenz nach Anspruch
16. Verfahren zur Produktion von δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:
a) Züchtung eines Mikroorganismus, der einen Vektor nach Anspruch 4 enthält, der die Expression des Gens von δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni erlaubt,
b) Isolieren der durch den Mikroorganismus produzierten δ¹-Dehydrogenase aus der Kultur.
17. Verwendung von nach dem Verfahren gemäß Anspruch 16 gereinigter δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni zur Synthese von Steroiden.
18. Verwendung von nach dem Verfahren nach Anspruch 16 gereinigter δ¹-Dehydrogenase von Pseudomonas testosteroni zur Bestimmung von Steroiden.
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