JPH04505105A

JPH04505105A - デルタ↓１―デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むｄｎａ配列及びトランスホームされた微生物並びにそれらの利用

Info

Publication number: JPH04505105A
Application number: JP3504245A
Authority: JP
Inventors: ミシェルブリアン，イボン; プルジア，パトリク
Original assignee: ルセル　ユクラフ
Priority date: 1990-02-07
Filing date: 1991-02-07
Publication date: 1992-09-10
Also published as: DE69121024D1; FR2657882B1; GR3020614T3; EP0466901B1; DK0466901T3; EP0466901A1; WO1991012326A1; ES2090312T3; ATE140730T1; FR2657882A1; DE69121024T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】デルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ配列及びトランスホームされた微生物並びにそれらの利用本発明は、シニードモナステストステロニ（ＰｓｅｕｄｏＩＩｌｏｎａｓ　ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のデルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング、前記の遺伝子に対するコード配列、並びに前記の遺伝子の導入によりトランスホームされた微生物、及びデルタ１−デヒドロゲナーゼの製造及びステロイド物質の合成と分析のためのそれらの利用に関係する。

医薬を合成する目的で、微生物による又はそれに由来する酵素によるステロイドの生物変換は、この方法にＳいて行なわれる反応の非常に高い特異性と低コスト価格により、製薬工業において普通に用いられる。

例えば、ある種のアスロバクター（Ａｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）株は、医療用のステロールの合成（例えば、コーチシン又はヒドロコーチシンから出発してのプレドニゾン及びプレドニソロンの合成など）にＳいて普通に用いられる。

ラム陰性細菌であり、ステロールを唯一の炭素源として用いて生長することが出来る。この微生物はステロールを完全に分解し、幾つかの酵素がこの代謝に関与する：３（又は１７）−ベーターヒドロキシステロイド−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，５１）は又、ベーター酵素の名称でも知られており、３−アルファーヒドロキシステロイド−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，５０）は又、アルファ酵素の名称でも知られてあり、３−ケトステロイドデルタ４−デルタ１−イソメラーゼ（ＥＣ５，３，３，１）は又、イソメラーゼの名称でも知られており、３−ケトステロイドデルタ−１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，３，９９，４）は又、デルタ１−デヒドロゲナーゼの名称でも知られており、並びに、他の２種のデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，３゜９９．５及びＥＣ１，３，９９，６）が知られている。

シュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼは、現在用いられている同型の酵素に比較して、高い物理化学的安定性という利点を有する。

この酵素を単離し、特定する試みがなされた（　ＬＥＶＹとＴＡＬＡＬＡＹ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９５９）、ｉユＡ、２０１４−２０２１）　；　１．、かじながら、彼らは蛋白質の完全な精製をしておらず、その配列は未だ知られていない。

更に、シュードモナステストステロニのステロール代謝の複雑さ及び前記代謝に関与する異なる酵素のために、シュードモナステストステロニを特定の合成反応のために工業において直接利用することは不可能である。

従って、発明者は、一方で遺伝子を工業利用のために細菌等の適当なホストにおいて発現し、他方においてデルタ墓−デヒドロゲナーゼが精製された形態で得られることを可能にするような方法で、シュードモナステストステロニデルタ１− デヒドロゲナーゼ遺伝子を単離し、クローン化することを目指してきた。

それ故、本発明の主題は、下記より構成される群から選ばれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことで特徴づけられる核酸断片である：ａ）シェードモナステストステロニブルり１−デヒドロゲナーゼに対するヌクレオチドコード配列ｂ）シュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を制御するヌクレオチド配列ｃ）ａ）又はｂ）で定めた配列の一方又は他方の全部又は一部の相同又は相補的ヌクレオチド配列。

本発明においては、“相同配列′とは、ａ）又はｂ）で定めた配列又はそれらの断片と同一の配列だけではなく、数個のヌクレオチドの置換、削除又は付加によってのみ異なる配列をも意味する（但し、こうして改変された配列が機能的に考えている配列又は断片と同じである場合とする）。

同様に、“相補的配列“とは、ａ）又はｂ）で定めた配列又はその断片と厳密に相補的である配列のみではなく、上述のように改変された配列をも意味する（但し、それらが機能に前記の厳密に相補的な配列と同じである場合とする）。

そのような機能的に等しい配列は、例えば：デルタｌ−デヒドロゲナーゼ遺伝子と特異的にパイプリダイズすることの出来るＤＮＡ配列（クローン化に際し、前記の遺伝子を組み込んだ組換え体の選択を可能にするプローブを得るのに利用することが出来る）Ｐ、テストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼに対するＤＮＡクローン化配列、及び現実の記述に従ってこれ以後定義する配列（Ｉ）の誘導体（前記の配列（Ｉ）の１つ以上のコドンをその翻訳産物が同一である他のコドンにより置換することによる）。

この発明に適合するＤＮＡ断片は、分子生物、学又は遺伝子工学において用いられる技術の任意の１つにより又はそれらの技術の幾つかの組み合わせにより得ることが出来る。

前記の技術は、制限的リストを構成することな（、核酸の抽出及び精製技術、制限酵素又は他の適当な方法による核酸分子の断片化の技術、核酸の合成又は半合成の技術、微生物の変異誘発又は形質転換の技術、プローブの標識又はハイブリダイゼーションの技術、核酸の組換え技術、等を含む。

この発明に適合するＤＮＡ断片は、それを生成するための好ましい方法により、少な（とも１つの配列（Ｉ）（添付の配列表において配列番号：１で示す）に相同又は相補的な配列を含み、それはシュードモナステストステロニＤＮＡの約２．２ｋｂのｍＩ断片の配列であ特に有利な方法において、この発明に適合するＤＮＡ断片は、Ｐ、テストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼに対するコード配列を含み、その配列は、配列（Ｉ）のヌクレオチド２４８から始まり、ヌクレオチド１９６６に終わる。

前記のように、この発明に適合する核酸断片を含むことにより特徴づけられる組換えベクターも又本発明の主題である。

組換えベクターの意味するところは、自己複製可能な核酸配列の組換えにより生成する核酸配列、及びクローン化し増幅することを所望する核酸配列である。前記ののベクターの適当な部位に挿入されたコード配列の転写と翻訳を制御するヌクレオチド配列を運ぶ。

有利な方法において、前記のベクターは、更に、この遺伝子の発現の制御を確実にする配列を含むが、例えば、周囲の環境条件（例えば、温度等）の関数として前記の遺伝子の発現を制御することを可能にする配列等である。

本発明を実施する好ましい方法によれば、組換えベクターは、ｐＴＥＫ２１と呼ばれるプラスミツドにより構成され、そのプラスミツトは上で定めた２、２ｋｂのＤＮＡ配列をプラスミツドｐｕｃ　１８へ挿入することにより生成する。

本発明の実施の他の好ましい方法によれば、そのような発現ベクターは、ｐＬＥ６８９と呼ばれる組換えプラスミツド（プラスミツドｐＮＭ１８５におけるシュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼに対するヌクレオチドコード配列の挿入により生成する）により構成され、デルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現及び／又はその制御において役割を演じるシュードモナステストステロニゲツム配列由来の他のヌクレオチド配列と組み合わせる。

プラスミツドＰＮＭ　Ｌ　８５は、ＭＥＲＭＯＤら（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

、１６７．４４７−４５４（１９８６））の発表に記載されている。

上記の組換えベクターの１つによりトランスホームされた微生物も又本発明の主題である。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１）　、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏ＋＊ｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）及びシェードモナスアエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のクローン（前記のベクターによりトランスホームされたもの）は、Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅ　ｄａ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄａ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）への、１９９０年１月２４日の寄託の対象でありニブラスミツドｐＴＥＫ２１によりトランスホームされた大腸菌クローンＤＨ５アルファは寄託番号ｌ−９２２を有し；プラスミツドｐＬＥ６８９によりトランスホームされた大腸菌クローンＲＲＩは寄託番号ｌ−９２３を有し；プラスミツドｐＬＥ６８９によりトランスホームされたＰ、プチダのクローンＫＴ２４４０は寄託番号ｌ−９２４を有し；プラスミツドｐＬＥ６８９によりトランスホームされたＰ、アエルギノサのクローンＰＡＯ１１６Ｌは寄託番号ｌ−９２５を有する。

この発明に適合する任意の１つのプラスミツドによりトランスホームされた微生物は、前記のプラスミツドをクローン化し、増幅するために用い得るが、それはシュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子を運ぶ、更に、適当な微生物（その中で複製可能なプラスミツドによりトランスホームされ、デルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が可能なもの）を、ステロイドの生物変換において有利に用いることが出来る。

何故なら、これらの微生物により発現されるデルタ１−デヒドロゲナーゼ活性は、他のステロイド分解活性により汚染されないからである。

シュードモナステストステロニ又はそのような遺伝子を運ぶ他の微生物において、デルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子又は関連遺伝子の検出を可能にする核酸プローブも又１本発明の主題である。そのプローブは、前に定めたようなこの発明に適合する少なくとも１つの核酸断片を含むことにより特徴づけられ、少なくとも１つの適当な検出手段と組み合わされる。

更に、シュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼに対するヌクレオチドコード配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖は本発明の主題である。

更に、シュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼの製造方法は本発明の主題であり、その方法は、下記の段階からなることにより特徴づけられる：ａ）シュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を可能にするベクターを含む微生物の培養ｂ）前記の培養からの酵素産物の分離。

この方法で生成されたデルタ１−デヒドロゲナーゼはステロイドの分析又は生合成のために有利に用い得る。

本発明は、下記の追加の説明の助けによりより良く理解されるであろう、それは、この発明に適合する核酸断片の製造の実施例に言及する。しかしながら、それらの実施例は、単に、この発明の詳細な説明として与えられるのであり、それらは如何なる方法においても制限を構成するものではないということは理解されなくてはならない。

■　シュードモナステストステロニブル　１−デヒドロゲナーゼに・　るコード　ぶ　の　びり旦：二２」ムエｍユ：シュードモナステストステロ−デルタ１−デヒドロゲナーゼのコード配列の局所限定を可能にするプローブの製造。

このプローブは、番号ＡＴＣＣｌ　７４１０で呼ばれるＰ、テストステロニ株の変異誘導体のＤＮＡから得られた。

ａ）変異の誘発Ｐ、テストステロニ株ＡＴＣＣｔ　７４１０の変異の誘発は、カナマイシン耐性遺伝子を運ぶトランスファーＴｎ５　（自殺ベクターｐｓＵＰ２０２１に挿入されたもの）を用いることにより行なう、このベクターは大腸菌５１７−１からトランスファーする。大腸菌５１７−１とＰ、テストステロニＡＴＣＣ１７４１０の接合の間に、ベクターｐｓＵＰ２０２１のトランスファーが高頻度で起こる。

トランスポゾンＴｎ旦を含むＰ、テストステロニの選択は５ｍＭのバラヒドロキシ安息香酸ナトリウム及び５０マイクログラム／　ｍ　１のカナマイシンを含む最小培地（培地Ｍ９）において行なう。

カナマイシン耐性のＡＴＣＣ１７４１０株５２００クローンが単離される。これらのクローンから、テストステロンを唯一の炭素源として利用するのではない４１クローンを選択する。これらの４１クローンの１つ（クローン０６）は、非常に弱いデルタ１−デヒドロゲナーゼ活性を有する。

クローン０６の全ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで加水分解する。こうして得られたＥｃｏＲｒ断片を、リガーゼＴ４を用いたランダム再結合手順により、ｐＵＣ１９に挿入した。こうして得られた結合混合物は、大腸菌ＤＨ５アルファ　（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、１４．ｒｕｅ　ｄｅｓ　０ｚｉｅｒｓ　−９５０５１ＣＥＲＧＹ　ＰＯＮＴＯＩＳＥ　ＣＥＤＥＸから供給されるもの）のコンピテント細胞をトランスホームするのに役立つ、トランスポゾンＴｎ旦を含む細菌クローンを、それらのカナマイシン耐性により選択する。これらのクローンの１つ（約１４ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入物を含む組換えプラスミツドｐＵＣ１９のキャリアー）が選択される。

Ｔｎ旦に隣接する０、８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ■断片をプローブとして用いるために選択した。この断片を下記の手順によりプラスミツドｐＵＣ１９においてサブクローン化する：１４ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入物のＢａｍＨＩを用いた加水分解、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片のアガロースゲル中での電気泳動似よる分離、ゲル電気泳動による精製、その次の、いわゆるニックトランスレーション法による［”Ｐ］　ｄＣＴＰでの標識。

１１旦ユニデルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子を運ぶ８．３ｋｂ断片を得ること。

シュードモナステストステロニの全ＤＮＡを、細菌をＳＤＳで溶菌させてからエタノール沈殿により抽出する、このＤＮＡを制限酵素５ａｌＩで、下記の条件の下で加水分解する：　ＤＮＡの酵素を伴う３７℃２時間のインキ二ベーション（３単位／ＤＮＡμｇの比）。

得られた断片を、リガーゼＴ４の作用によりプラスミツドｐＵｃ１９に挿入する。

得られた組換えプラスミツドな、細菌株大腸菌ＤＨεアルファをＧＩＢＣＯＢＲＬ　（コンピテント細胞の供給者）較より定められた条件下でトランスホームするために用しる。こうして得られた銀行は、実施例１に記載された４順により得られた０、８ｋｂのプローブとのハイブリタイゼーションにより大腸菌型である。

８．３ｋｂの５ａｌＩ断片を含む５クローンがこの方法で得られた。

Ｌ立立ユニプラスミツドｐＴＥＫ２１の製造。

８．３ｋｂＳａｌ　ｒ断片から出発する２、１ｋｂＬｚ工ｒ断片のサブクローン化：８．３ｋｂ断片を酵素ＬＬｒＬＩにより加水分解する。遊離した２、１ｋｂ断片をアガロースゲル中での電気泳動により分離し、精製する。それを、次いで、ベクターｐＵｃ１８（予め瓦エユＩで線形化してお（）に再結合させる。

２．１ｋｂの挿入物の制限地図を、図１により説明する。

この２．１ｋｂ断片上のデルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の存在は、この酵素の作用から生じる産物の検出により分かる。この検出のために用いられる操作プロトコールを、更に、（実施例３について）詳細に説明する。

ＩＩ　シュードモナステストステロニブル　１−デヒドロゲナーゼの　１゛　。

２．１ｋｂＬＬ二■断片の配列法定は、Ｃ”Ｓコで標５　識されたデオキシリボヌクレオチドの存在においてジブに　オキシヌクレオチドを用いて酵素的に標識するサンガーい　法を用いて行なう。

ｆ−ＩＩＩ　トランスホームされた　におもろシェダ　−゛モナステストステロニデル１−デヒドロゲナーゼ゛　の　の　。

ｄ　組換えプラスミツドｐＴＥＫ２１を含む大腸菌ＤＨ５アルファ株を栄養肉汁中で、３０℃で、デルタ２−デヒドロゲナーゼの基質（１，７５ｍＭのデルタ４ −アンドｂ　ロステン−３，１７−ジオン）の存在下で培養する。

ＩＩ　１６時間のインキュベーションの後、ステロイドを酢酸午　エチルで抽出し、シリカ上の薄層クロマトグラフィーにｉ　より、ジクロロメタン／ジオキサンの溶媒混合物を用いｌ　、　て分析する。デルタ１−脱水素された代謝物質（デルタト４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン）は、紫ｒ　外光の下で特徴的じみとして現れる。　前に述べたものに属していても、この発明は、より明ｆ　白に記載されたその実施方法、産物及び利用には全く制限されない；逆に、それは、本発明の範囲から離れることなく当業者に思い浮かび得るすべての変形を包含する。

閣ＣＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＧＡにＣＧ５：入’１’ＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＴＣＭ；Ｇ　５２Ｍａｔ　Ａｌａ　ＧｌｕＧｉｎ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｉｌｅ　ＶａｌＶａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＧｌｙＣ入Ａ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＴＣＧＴＣＧＴＧ　ＧにＴ　ＴＣＧ　ＧＧＧ　ＣＣＡ　ＧＧ７　２９５Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　入１ａ　Ｐｒｏ　工ｌｅ　Ａｒｇ　入１ａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＬａｑＧＣＣＴにＴ　ＴＧＧ　ＧＣＧ　ＣＣＡ　ＡＴＩ’　ＣＧＣＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＣＧＧＣＣＴＣ１４Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｙ入＾Ｇ　入ＣＴ　ＣＴＧ　ＧＴに　Ｃ；ＴＳ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＣＧＡＧ’−ＣＴＣＴｒＣＧＧＴ　ＧＧＣ３７５Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　入１ａ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　工１ａ　Ｔｒｐ　工ｍｅ　？ｒＣＪ　ＬｅｕＡＣＴ　ＴＣｏ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＧＧＧ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＡＴご　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＣＣＣ，ＣＴＣ４１２人ｓｎ　Ｔｙｒ　入ｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　入１ａ　ＧＩＹ　工１ｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ八Ａへ　ＴＡＣＧＡＣＣＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＣＧＣＴ　にＧこ　入ＴＣＡＡＡ　ＧＡＣＧＡＴ　ＣＴＧ　４５１Ｃ，ｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　ｈｒｑ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　入ｒｇ　ＧｌｙＧ入Ａ　ＡＣＣにＣＡ　ＴＴＴ　ＧＧＣＴＡＴ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　、ＣＧＣＴＧＴ　ＧＴＧ　ｃＧｃ　ＧＧＣ４９０９゜Ｍａｔ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｒｑ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　入１ａ　 ’！’ｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ八Ｔへ　ＧＣＡ　ＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣＴＡＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣ５２９１０゜Ａｌａ　Ｓｅｘ　Ｌｙｓ　Ｍａｔ　入１ａ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　工ｌａ　ＧＩＹ　工１ｅＧＣＳ　Ａ（、：　入ＡＧ　ＡＴＧ　ＧＣＣＧＡＧ　ＴＡＣＣＴＧ　ＣＧＣＣＡＧ　ＡＴＣＧＧＣＡＴＣ５６ＢＰｒｏ　Ｔｙｒ　入ｒｑ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒ。

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国際調査報告国際調査報告Ｔｌｊ＋＋　關−１ｈｅ　ｊＭ１９１１１’ｓ＋ｍｌｙ　請詐−−１＋ｍ＃１ｉｌ）Ｉ　Ｉｓ　６−ｇ−４試１−一嘘ａｍ　ｋｍ　ｔｋｍ−|ｗ−＋酔四自・− −−ｍｃｉｍｓｌ−ｉ−−ｔＴｋｗｎｎｋｍｗ＊ｍｅ拳−１−一９１ｋｍｔ１ｗＥｗ−ＰｍｅＭ動ＥＤＰｒｈａａｍｅｓＩｏｔｎ＋Ｔｈｅ　Ｅ−窄曽Ｐｓ＋−〇ｆｋｍ　ｍ　ｋｍ　齢ｍｙ−ｋ　ｔｋｍ　ｐ齢−劉１１−１−−ｆｖ　１ｗ−一甲噌ｄ　ｄ龍−帆

Claims

【特許請求の範囲】

１．下記より構成される群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことにより特徴づけられる核酸断片：ａ）シュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼに対するヌクレオチドコード配列ｂ）シュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を制御するヌクレオチド配列ｃ）ａ）又はｂ）において定めた配列の一方又は他方の全部又は一部の相同又は相補性ヌクレオチド配列。
２．下記の配列（Ｉ）（配列番号：１）を含むことにより特徴づけられる、請求項１に記載の核酸断片：（Ｉ）【配列があります】
３．Ｐ．テストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼのコード配列を含み、その配列が請求項２で定められた配列（Ｉ）のヌクレオチド２４８から始まり、ヌクレオチド１９６６で終わることにより特徴付けられる、請求項１又は２のいずれか１つに記載の核酸断片。
４．請求項１〜３のいずれか１つに記載の核酸断片を含むことにより特徴づけられる組換えベクター。
５．ｐＴＥＫ２１と呼ばれるブラスミッドにより構成され、そのブラスミッドが請求項２に記載のＤＮＡ断片をブラスミッドｐＵＣ１８に挿入することにより生じることを特徴とする、請求項４に記載の組換えベクター。
６．ｐＬＥ６８９と呼ばれる組換えブラスミッドにより構成され、そのブラスミッドが請求項１に記載のＤＮＡ断片をブラスミッドｐＮＭ１８５に挿入することにより生じることを特徴とする、請求項４に記載の組換えベクター。
７．請求項４〜６のいずれか１つに記載の少なくとも１つの組換えベクターを含むことにより特徴づけられるトランスホームされた微生物クローン。
８．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に、番号Ｉ−９２２で提出され、且つブラスミッドｐＴＥＫ２１を含む大腸菌ＤＨ５アルファ株の細菌細胞により構成される、請求項７に記載のクローン。
９．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に、番号Ｉ−９２３で提出され、且つブラスミッドｐＬＥ６８９を含む大腸菌ＲＲ１株の細菌細胞により構成される、請求項７に記載のクローン。
１０．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｅｓ（ＣＮＣＭ）に、番号Ｉ−９２４で提出され、且つブラスミッドｐＬＥ６８９を含むＰ．ブチダＫＴ２４４０株の細菌細胞により構成される、請求項７に記載のクローン。
１１．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に、番号Ｉ−９２５で提出され、且つブラスミッドｐＬＥ６８９を含むＰ．アエルギノサＰＡ０１１６１株の細菌細胞により構成される、請求項７に記載のクローン。
１２．請求項４に記載の組換えベクターによりトランスホームされた微生物のステロイドの生物変換のための利用。
１３．請求項４に記載の組換えベクターによりトランスホームされた微生物のデルタ１−デヒドロゲナーゼの製造のための利用。
１４．請求項１又は２のいずれか１つに記載の少なくとも１つの核酸断片を含み、少なくとも１つの適当な検出手段と組み合わされることにより特徴づけられる診断試薬。
１５．請求項３に記載のＤＮＡ配列の翻訳により生じるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖。
１６．下記の段階を含むことにより特徴づけられるシュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼの製造方法：ａ）シュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を可能にする請求項４に記載のベクターを含む微生物の培養ｂ）その培養からの、前記の微生物により生産されたデルタ１−デヒドロゲナーゼの単離。
１７．請求項１６に記載の方法により精製されたシュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼのステロイド合成のための利用。
１８．請求項１６に記載の方法により精製されたシュードモナステストステロニデルタ１−デヒドロゲナーゼのステロイド分析のための利用。