DE69026153T2

DE69026153T2 - Downsyndrom-screening-methode

Info

Publication number: DE69026153T2
Application number: DE69026153T
Authority: DE
Inventors: James N Macri
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-01-17
Filing date: 1990-01-16
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2010-01-17
Also published as: JPH03505128A; DE69034111D1; DE69026153D1; DK0409956T3; EP0409956A1; AU5093690A; JP2644373B2; ES2084689T5; EP0666477B1; DK0409956T4; DE69034111T2; DE69026153T3; EP0409956B1; ES2210266T3; ATE252240T1; US5324668A; AU629908B2; DK0666477T3; ATE136121T1; EP0666477A1

Description

Ausgangssituation der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Methode zum Nachweis des fötalen Down-Syndroms (Trisomie 21) bei einem pränatalen Screening- bzw. Siebtest. Dieses Verfahren bezieht sich außerdem auf andere, seltenere, aber nachweisbare Chromosomenverdreifachungen bzw. Trisomien, wie z. B. Trisomie 13 und Trisomie 18. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung eine Methode zur Verbesserung der Nachweiseffizienz beim Down-Syndrom- Screening durch Messen des Anteils der freien Beta-Untereinheit von humanem Choriongonadotropin (hCG) im Blut schwangerer Frauen.
Das Down-Syndrom, auch als Trisomie 21 bezeichnet, ist die häufigste angeborene Ursache einer schweren geistigen Unterentwicklung. Im allgemeinen kann das fötale Down-Syndrom durch ein Diagnoseverfahren festgestellt werden, das eine Amniozentese und eine Karyotypisierung einschließt. Dieses Diagnoseverfahren ist jedoch invasiv und mit Gefahr für die Frau und den Fötus verbunden. Amniozentese und Karyotypisierung werden nicht routinemäßig bei allen Schwangerschaften durchgeführt. Stattdessen können eine oder mehrere Screening-Methoden benutzt werden, um festzustellen, wann die Gefahr für die Schwangerschaft das Risiko rechtfertigt, sich einem invasiven Diagnoseverfahren zu unterziehen.
Die Häufigkeit des Down-Syndroms nimmt mit steigendem Alter der Mutter signifikant zu. Historisch hat sich die pränatale Suche nach dem Down-Syndrom auf Schwangere im Alter von 35 Jahren und darüber konzentriert, in dem die Risiken des Down-Syndroms den Risiken der zum Nachweis des fötalen Down- Syndroms verwendeten Diagnoseverfahren nahekommen oder diese übersteigen. Daher erforderte das Standardverfahren für das pränatale Screening eine Auswahl von Frauen für die diagnostische Amniozentese auf der Basis des Alters der Mutter. Das Alter ist jedoch ein unzulängliches Screening-Kriterium, da nur etwa 20% aller Down-Syndrom-Schwangerschaften durch Ausführung einer Amniozentese und Karyotypisierung an den am stärksten gefährdeten 5% der Schwangeren, d. h. bei denjenigen im Alter von 35 Jahren oder darüber, nachgewiesen werden können. Und da in der konkreten klinischen Praxis nur etwa die Hälfte der 35- jährigen oder älteren Frauen sich einer Amniozentese und Karyotypisierung unterziehen, werden weniger als 10% der Down- Syndrom-Schwangerschaften pränatal nachgewiesen.
Im Jahre 1984 wurde ein Zusammenhang zwischen verminderten Alpha-Fötoproteingehalten (AFP-Gehalten) im mütterlichen Blut und dem fötalen Down-Syndrom entdeckt. Siehe z. B. die Arbeit von Merkatz, Macri u.a.: "An association between low maternal serum alpha-fetoprotein and fetal chromosomal abnormalities" (Zusammenhang zwischen niedrigem Alpha-Fötoproteingehalt im mütterlichen Serum und fötalen Chromosomenanomalien), Am. J. Obstet. Gynecol. 148 (1984) 886, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. In dieser Veröffentlichung wurde festgestellt, daß andere Chromosomenverdreifachungen, insbesondere Trisomie 13 und Trisomie 18, ebenfalls mit verminderten AFP-Gehalten im mütterlichen Blut verbunden waren. Die Häufigkeit dieser zusätzlichen Chromosomenverdreifachungen (1 zu 5000 Schwangerschaften bzw. 1 zu 6600 Schwangerschaften) ist wesentlich niedriger als das mit der Trisomie 21 (dem Down-Syndrom) verknüpfte allgemeine A-priori-Risiko. Wegen des Zusammenhangs dieser anderen Chromosomenverdreifachungen mit verminderten Alpha-Fötoproteingehalten im mütterlichen Serum (MSAFP-Gehalten) werden jedoch derartige Anomalien innerhalb eines Screening-Protokolls, das AFP-Gehalte im mütterlichen Blut und die freie Beta-Untereinheit von hCG und möglicherweise zusätzliche, hier beschriebene Marker verwendet, gleichfalls nachgewiesen. Für den Fachmann ist offensichtlich, daß bei Verwendung des hier beschriebenen Protokolls für Trisomie 21 auch der Nachweis für Trisomie 13 und 18 geführt werden kann. Der Zusammenhang zwischen verminderten AFP-Gehalten im mütterlichen Blut und dem fötalen Down-Syndrom bot die Gelegenheit zur Anwendung eines nichtinvasiven Blut- Screening-Tests beim Nachweis von Down-Syndrom-Fällen bei jungen, dem Anschein nach nicht betroffenen Familien, wo annähernd 80% der Down-Syndrom-Fälle auftreten. Es wird eingeschätzt, daß die Anwendung eines Screening-Tests, der auf einem niedrigen AFP-Gehalt im mütterlichen Blut (als Screening-Markierungssubtsanz) basiert, zum pränatalen Nachweis von annähernd 20% aller Fälle des fötalen Down-Syndroms führen würde.
Ein anderes Screening-Verfahren erfordert die Messung des Gehalts an nichtkonjugiertem Östriol (UE) im mütterlichen Blut. Siehe z. B. die Arbeit von Wald u.a.: "Maternal blood screening for Down syndrome in early pregnancy" (Down-Syndrom- Screening von mütterlichem Blut in der Frühschwangerschaft), British Journal of Obstetrics and Gynecology (BMJ) 95, April 1988, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Die UE-Messung liefert jedoch eine schlechte Basis für das Screening.
In letzter Zeit wurde ein Zusammenhang zwischen erhöhten hCG-Gehalten im mütterlichen Blut, einem erhöhten Gehalt der Alpha-Untereinheit von hCG im mütterlichen Blut (hCG setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen, die nachstehend als Alpha-hCG bzw. Beta-hCG bezeichnet werden) und dem fötalen Down- Syndrom entdeckt. Siehe z. B. die Arbeit von Bogart, Pandian und Jones: "Abnormal Maternal Serum Chorionic Gonadotropin Levels in Pregnancies with Fetal Chromosome Abnormalities" (Anomale Choriongonadotropin-Gehalte im mütterlichen Serum bei Schwangerschaften mit fötalen Chromosomenanomalien), Prenatal Diagnosis 7 (1987) 623-630, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. In dem Artikel von Bogart wird eingeschätzt, daß durch die Verwendung erhöhter hCG-Gehalte im mütterlichen Blut und erhöhter Gehalte der Alpha-Untereinheit von hCG im mütterlichen Blut annähernd 68% der Föten mit Chromosomenanomalien nachgewiesen würden. Diese Ergebnisse wurden jedoch aus einer Untersuchung von Schwangerschaften in der 18. bis 25. Schwangerschaftswoche gewonnen, und die betroffenen Fälle scheinen die von Frauen zu sein, die zuvor als Down-Syndrom-gefährdet erkannt wurden.
Gewöhnlich erforderte, wie oben angedeutet, der Screening-Test durch Auswertung des hCG-Gehalts im mütterlichen Blut nur die Messung des hCG-Gehalts im allgemeinen und zusätzlich die Messung des Alpha-hCG-Gehalts. Obwohl diese Screening-Me thoden den Nachweis des fötalen Down-Syndroms erbringen, bestehen ein Bedarf und ein Wunsch nach einem Verfahren, das einen höheren Prozentsatz fötaler Down-Syndrom-Fälle nachweist.
Die JP-A-54-126 723 offenbart die Herstellung eines spezifischen Antikörpers gegen hCG und gegen die Beta-Untereinheit von hCG.
Ich habe einen vorher unbekannten Zusammenhang zwischen erhöhten Gehalten des freien Beta-hCG im mütterlichen Blut und dem fötalen Down-Syndrom entdeckt. Außerdem habe ich einen vorher unbekannten Zusammenhang zwischen dem freien Beta-hCG- Gehalt im mütterlichen Blut sowie dem AFP-Gehalt im mütterlichen Blut und dem fötalen Down-Syndrom entdeckt, und ferner habe ich einen vorher unbekannten Zusammenhang zwischen dem Verhältnis des freien Beta-hCG-Gehalts im mütterlichen Blut zum Gehalt des intakten hCG-Moleküls im mütterlichen Blut und dem fötalen Down-Syndrom festgestellt. Darüberhinaus habe ich entdeckt, daß die Anwendung eines mehrdimensionalen bzw. multivariaten Diskriminanzanalyseverfahrens die Nachweiseffizienz einer Screening-Methode mit Verwendung des freien Beta-hCG-Gehalts im mütterlichen Blut oder des AFP-Gehalts im mütterlichen Blut oder des Logarithmus eines der beiden Werte oder des Logarithmus beider Werte für ein gewähltes Risiko-Abbruchniveau bzw. einen Riskogrenzwert verbessert, insbesondere wenn auch das Gestationsalter als Variable in das Diskrimanzanalyseverfahren einbezogen wird. Mit dem Gestationsalter ist das Alter des Föten der Schwangeren gemeint. Mit der Nachweiseffizienz ist der Prozentsatz der fötalen Down-Syndrom-Fälle gemeint, die für ein gewähltes Risiko-Abbruchniveau richtig nachgewiesen werden. Das Risiko-Abbruchniveau wird in einem folgenden Abschnitt ausführlicher erläutert. Die Diskriminanzanalyse ist ein allgemein bekannter Ansatz der mehrdimensionalen (multivariaten) Analyse, der die Zerlegung einer Population in zwei oder mehr Gruppen durch eine eindimensionale (univariate) Risikoabschätzung zur Folge hat. Die Diskriminanzanalyse wird manchmal auch als Konstruktionsmethode für eine Linearkombination unabhängiger Variabler beschrieben und reduziert somit das Problem der Messung von Gruppendifferenzen auf ein eindimensionales Problem. Die Diskriminanzanalyse kann auch dann durchgeführt werden, wenn in einem Problem nur eine Variable auftritt. Eine allgemeine Diskussion der Diskriminanzanalyse findet man in Churchill, G.A.: "Marketing Research", Dryden 1976, Kap. 15, S. 530 - 543, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Ich habe festgestellt, daß durch die Anwendung einer mehrdimensionalen Diskriminanzanalyse auf die freien Beta-hCG-Gehalte im mütterlichen Blut, die Gehalte des intakten hCG-Moleküls im mütterlichen Blut, das Verhältnis des freien Beta-hCG-Gehalts im mütterlichen Blut zum Gehalt des intakten hCG-Moleküls im mütterlichen Blut, den AFP-Gehalt im mütterlichen Blut, den UE-Gehalt im mütterlichen Blut und das Gestationsalter ein höherer Prozentsatz fötaler Down-Syndrom-Fälle bei einem niedrigeren Anteil falsch-positiver Ergebnisse nachgewiesen wird als durch irgendeine andere bekannte Screening-Methode für den pränatalen Nachweis des Down-Syndroms. Ich habe ferner festgestellt, daß eine noch größere Anzahl fötaler Down-Syndrom-Fälle nachgewiesen werden können, indem nur die Meßwerte der freien Beta-hCG-Gehalte im mütterlichen Blut und der AFP-Gehalte im mütterlichen Blut verwendet und der Logarithmus jedes Meßwerts sowie das Gestationsalter einer mehrdimensionalen Diskriminanzanalyse unterworfen werden. Diese und weitere Feststellungen werden im Abschnitt "Zusammenfassung der Erfindung" und im Abschnitt "Ausführliche Beschreibung der Erfindung" näher erläutert.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Methode und ein Verfahren für einen Screening-Test für das fötale Down-Syndrom zu schaffen, der bei einem gegebenen Anteil falsch-positiver Ergebnisse einen höheren Prozentsatz fötaler Down-Syndrom-Fälle nachweist als andere bekannte pränatale Screening-Methoden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Methode und ein Verfahren für einen Screening-Test für das fötale Down-Syndrom zu schaffen, der bei einem gegebenen Nachweisanteil einen niedrigeren Anteil falsch-positiver Ergebnisse aufweist als andere bekannte Methoden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die mehrdimensionale Diskriminanzanalyse auf Down-Syndrom-Screening-Methoden anzuwenden, um einen höheren Anteil fötaler Down-Syndrom-Fälle bei einem niedrigeren Anteil falsch-positiver Ergebnisse nachzuweisen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Methode und ein Verfahren für einen Screening-Test für das fötale Down-Syndrom durch Messung des freien Beta-hCG-Gehalts im mütterlichen Blut zu schaffen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Methode und ein Verfahren für einen Screening-Test für das fötale Down-Syndrom durch Messung des AFP-Gehalts im mütterlichen Blut und des freien Beta-hCG-Gehalts im mütterlichen Blut zu schaffen.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung hervorgehen.

Zusammenfassung der Erfindung

Zur Lösung dieser und weiterer Aufgaben werden erfindungsgemäß im mütterlichen Blut einer Schwangeren (nachstehend als Patientin bezeichnet) die freien Beta-hCG-Gehalte nach herkömmlichen immunologischen Verfahren gemessen, zu denen Immuntestverfahren, wie z. B. die in den obigen Veröffentlichungen erwähnten, gehören können, sowie andere dem Fachmann bekannte Verfahren angewandt. Der freie Beta-hCG-Gehalt wird dann mit einem Bezugsdatensatz verglichen, um das Risiko zu bestimmen, daß die Patientin einen Fötus mit Down-Syndrom trägt. Zur Verbesserung der Nachweiseffizienz können der freie Beta-hCG-Gehalt und das Gestationsalter mit einem Bezugsdatensatz verglichen werden. Um die Nachweiseffizienz weiter zu verbessern, werden die Gehalte an freiem Beta-hCG und AFP (die als "Marker" bezeichnet werden) im mütterlichen Blut einer Patientin nach herkömmlichen immunologischen Verfahren gemessen, zu denen dem Fachmann bekannte Testverfahren gehören, wie z. B. die in den obigen Veröffentlichungen erwähnten Verfahren. Die Gehalte jedes Markers werden dann mit einem Bezugsdatensatz verglichen, um das Risiko zu bestimmen, daß die Patientin einen Fötus mit Down-Syndrom trägt. Zum Vergleich der Gehalte der Marker mit einem Bezugsdatensatz wird ein mehrdimensionales Diskriminanzanalyseverfahren angewandt. Genauer gesagt, ein patientenspezifisches Risiko wird dann mit Hilfe der Bayesschen Regel, des A-priori-Risikos der Patientin und der relativen Häufigkeiten für nicht betroffene und betroffene Schwangerschaften berechnet, die bestimmt werden, indem die Logarithmen der quantitativen Gehalte jedes Markers der Patientin in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen eingearbeitet werden, die mit Hilfe einer mehrdimensionalen Diskriminanzanalyse für die Bezugsdaten entwickelt wurden. Wenn das Risiko der Patientin, einen Fötus mit Down-Syndrom zu tragen, höher ist als ein gegebenes Risiko-Abbruchniveau, dann sollten der Patientin weitere diagnostische Tests empfohlen werden, um das Vorhandensein eines Down-Syndroms zu bestätigen. Die Einbeziehung des Gestationsalters als Marker zusammen mit dem freien Beta-hCG-Gehalt und dem AFP-Gehalt im mütterlichen Blut bewirkt eine weitere Verbesserung der Nachweiseffizienz. Da der freie Beta-hCG-Gehalt im mütterlichen Blut und der AFP-Gehalt im mütterlichen Blut für eine Anzahl von Proben die Neigung zur Verteilung nach einer logarithmischen Normalverteilungskurve aufweisen, kann die höchste Nachweiseffizienz durch Aufnahme des Logarithmus der quantitativen Gehalte jedes Markers der Patientin und des Gestationsalters in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen für die mit Hilfe der mehrdimensionalen Diskriminanzanalyse entwickelten Bezugsdaten erzielt werden.
Ein Vorteil der Methode und des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung ist, daß sie einen höheren Anteil fötaler Down-Syndrom-Fälle mit einem niedrigeren Anteil falsch-positiver Ergebnisse als andere bekannte Methoden und Verfahren richtig voraussagen.
Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden ausführlicheren Beschreibung und den an schließenden Beispielen ersichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine in Beispiel 2 erwähnte Tabelle, in der das Signifikanzniveau einzelner Marker für Trisomie 21 angegeben ist.
Fig. 2 zeigt eine in Beispiel 2 erwähnte Tabelle, in der die Effizienz einzelner Marker beim Down-Syndrom-Screening angegeben ist.
Fig. 3 zeigt eine in Beispiel 2 erwähnte Tabelle, in der die Effizienz zusammengesetzter Marker beim Down-Syndrom- Screening angegeben ist.
Fig. 4 zeigt eine in Beispiel 2 erwähnte Tabelle, die den Anteil von Down-Syndrom-Fällen darstellt, der oberhalb gegebener Perzentile der Verteilung der freien Beta-Untereinheit von hCG bei nicht betroffenen Schwangerschaften liegt.
Fig. 5 zeigt eine in Beispiel 2 erwähnte Tabelle, in der die Effizienz einzelner Marker beim Down-Syndrom-Screening angegeben ist.
Fig. 6 zeigt eine in Beispiel 2 erwähnte Tabelle, in der für den Logarithmus des AFP-Gehalts und den Logarithmus des Gehalts der freien Beta-Untereinheit von hCG als zusammengesetzten Marker die Effizienz beim Down-Syndrom-Screening angegeben ist.
Fig. 7 zeigt eine in Beispiel 2 erwähnte Tabelle, in der für den AFP-Gehalt, den freien Beta-hCG-Gehalt und das Alter der Mutter die auf die USA projizierte Effizienz beim Down-Syndrom-Screening angegeben ist.
Fig. 8, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, zeigt die Gehalte der freien Beta-Untereinheit von hCG in Fällen von Trisomie 21 in Beziehung zu verschiedenen Perzentilen der nicht betroffenen Schwangerschaften.
Fig. 9, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, zeigt die verteilungen der Gehalte der freien Beta-Untereinheit von hCG.
Fig. 10 zeigt eine in Beispiel 3 erwähnte Tabelle, in der die Effizienz beim Down-Syndrom-Screening für eine Reihe von Markerkombinationen angegeben ist.
Fig. 11 zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung, die bei der Ausführung der Methode zum Nachweis des Down-Syndroms verwendet wird.
Fig. 12 und 13 zeigen ein Ablaufdiagramm für ein Computerprogramm zum Berechnen von Bezugsparametern zur Verwendung im Zusammenhang mit der Bestimmung des spezifischen Risikos einer Patientin, einen betroffenen Fötus zu tragen.
Fig. 14 zeigt ein Ablaufdiagramm für ein Computerprogramm, das Bezugsparameter, die in dem in Fig. 12 und 13 dargestellten Programm berechnet werden, für die Bestimmung des spezifischen Risikos der Patientin benutzt, einen betroffenen Fötus zu tragen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird einer Patientin eine Probe des mütterlichen Bluts entnommen. Dann wird der freie Beta-hCG-Gehalt im mütterlichen Blut durch herkömmliche Analyseverfahren bestimmt, wie z. B. durch dem Fachmann bekannte immunologische Verfahren. Der freie Beta-hCG-Gehalt im mütterlichen Blut wird dann mit einem Bezugsdatensatz verglichen, um festzustellen, ob ein erhöhtes Risiko besteht, daß die Patientin einen Fötus mit Down-Syndrom trägt. Zur Erhöhung der Nachweiseffizienz können das Gestationsalter und der freie Beta-hCG-Gehalt im mütterlichen Blut mit einem Bezugsdatensatz verglichen werden, um festzustellen, ob ein erhöhtes Risiko besteht, daß die Patientin einen Fötus mit Down-Syndrom trägt.
Wie für den Fachmann offensichtlich, funktioniert bei der vorliegenden Erfindung zwar jedes der bekannten Analyseverfahren zur Messung des freien Beta-hCG-Gehalts im mütterlichen Blut, aber es muß das gleiche Analyseverfahren wie beim Erzeugen der Bezugsdaten für den freien Beta-hCG-Gehalt verwendet werden. Wenn ein neues Analyseverfahren für den freien Beta-hCG-Gehalt verwendet wird, dann muß ein neuer Bezugsdatensatz erzeugt werden, der auf Daten basiert, die mit dem Verfahren entwickelt worden sind.
Es ist auch allgemein als gegeben anzunehmen, daß bei der Erzeugung monoklonaler Antikörper, die für die Beta-Kette von hCG spezifisch sind, einige Antikörper für die proteinund einige für die kohlehydrat-assoziierten Antigenbindungsstellen spezifisch sein werden. Die Messung des freien Beta- hCG-Gehalts, auf die in der Beschreibung der Erfindung überall Bezug genommen wird, schließt die Verwendung von Antikörpern ein, die entweder für die protein- oder für die kohlehydratassoziierten Antigenbindungsstellen oder für irgendeine andere Stelle an freiem Beta-hCG spezifisch sind.
Ferner ist für den Durchschnittsfachmann einzusehen, daß zwar die freie Alpha-Untereinheit von hCG durch ein einziges Gen codiert wird, die freie Beta-Untereinheit aber durch eine komplexe Familie von mindestens sieben sehr ähnlichen Genen oder Pseudogenen codiert wird. Siehe z. B. Boorstein, Vamvakopoules und Fiddes: "Human chorionic gonadotropin beta-subunit is encoded by at least eight genes arranged in tandem and inverted pairs" (Die Beta-Untereinheit von humanem Choriongonadotropin wird durch mindestens acht Gene in Tandem-Anordnung und in invertierten Paaren codiert), Nature 300, 2. Dezember 1982, auf deren Lehre hiermit Bezug genommen wird. Es ist bekannt, daß nur drei von den sieben Genen des freien Beta-hCG bei der normalen plazentalen Produktion von freiem Beta-hCG exprimiert werden. Siehe z. B. Nishimura, Ide, Utsunomiya, Kitajima, Yuki und Mochizuki: "Fragmentation of the Beta-Subunit of Human Chorionic Gonadotropin Produced by Choriocarcinoma" (Fragmentierung der Beta-Untereinheit von durch Choriokarzinom erzeugtem humanem Choriongonadotropin), Endocrinology 123 Nr. 1 (1988), auf deren Lehren hiermit Bezug genommen wird. Ob dieselben drei Gene bei Erkrankungszuständen exprimiert werden, wie z. B. bei Vorhandensein des fötalen Down-Syndroms, ist nicht ermittelt worden. Es ist daher möglich, daß vielfältige Formen von freiem Beta-hCG mit geringen Unterschieden in den Aminosäuresequenzen oder anderen geringen Unterschieden synthetisiert werden können. Ferner ist es möglich, daß beim Down-Syndrom ein oder mehrere Gene des freien Beta-hCG exprimiert werden, wodurch eine einzige Variante oder mehrere Varianten des freien Beta-hCG produziert werden. Erfindungsgemäß werden diese Varianten, falls sie existieren, durch herkömmliche immunologische Verfahren zur Messung des freien Beta-hCG gemessen. Ein Probenmaterial, das zur Messung der mit dem Down-Syndrom verbundenen spezifischen freien BetahCG-Variante, oder gegebenenfalls der mehreren Varianten, hergestellt wird, kann zur weiteren Erhöhung der Nachweiseffizienz führen.
Wir haben erfolgreich Testverfahren mit monoklonalen Antikörpern zur Messung der freien Beta-Untereinheit von hCG verwendet, um zwischen Schwangerschaften zu unterscheiden, die von Trisomie 21 betroffen bzw. nicht betroffen sind. Es wurde eine hohe Nachweiseffizienz von 83% für Trisomie 21 erreicht. Wie dem Fachmann wohlbekannt, kann die Verwendung von Antikörpern zur quantitativen Bestimmung spezieller Analyten in gewissem Umfang zu einem Kreuzreaktionsvermögen mit einer unterschiedlichen, aber ähnlichen Substanz führen. Daher kann die Unterscheidung zwischen betroffenen und nicht betroffenen Fällen auf das Vorhandensein einer abweichenden Form der freien Beta-Untereinheit von hCG zurückzuführen sein, die wegen eines gewissen Kreuzreaktionsvermögens mit den verwendeten Antikörpern nachgewiesen wird. Wenn eine solche abweichende Form der freien Beta-Untereinheit von hCG erkannt wird, kann sie als eine neue biochemische Substanz gekennzeichnet werden. Tatsächlich lassen Informationen aus der wissenschaftlichen Literatur darauf schließen, daß abweichende Formen von Beta-hCG erkannt worden sind (siehe z. B. Nishimura u.a., unten).
Von Trisomie 21 betroffene Fälle können auch durch eine abweichende Form der freien Beta-Untereinheit von hCG charakterisiert sein. Wenn Trisomie 21 durch die Produktion einer abweichenden Form der freien Beta-Untereinheit von hCG gekennzeichnet ist, dann ist der Fachmann in der Lage, spezifische Antikörper für solche abweichenden Formen zu entwickeln, die zu einer weiteren Steigerung der Nachweiseffizienz für dieses Syndrom führen.
Die Bezugsdaten spiegeln den freien Beta-hCG-Gehalt im mütterlichen Blut für Schwangere, die Föten mit Down-Syndrom tragen (auch als "Betroffene" bezeichnet), und/oder den freien Beta-hCG-Gehalt im mütterlichen Blut für Schwangere, die normale Föten tragen (auch als "nicht Betroffene" bezeichnet), wider. Wie der Fachmann allgemein verstehen wird, handelt es sich bei Screening-Methoden für das fötale Down-Syndrom um Entscheidungsprozesse anhand von Vergleichen. Für jeden Entscheidungsprozeß werden Bezugswerte benötigt, die auf Patientinnen, welche die interessierende Krankheit oder den interessierenden Zustand aufweisen, und/oder auf Patientinnen basieren, welche die interessierende Krankheit oder den interessierenden Zustand nicht aufweisen. Bei der vorliegenden Erfindung sind die Bezugswerte der Gehalt des gemessenen Markers oder der gemessenen Marker, z. B. von freien Beta-hCG im mütterlichen Blut sowohl von Schwangeren, die Föten mit Down-Syndrom tragen, als auch von Schwangeren, die normale Föten tragen. Durch Erfassen der Bezugswerte für eine Anzahl von Proben wird ein Versuchsdatensatz aufgestellt. Wie für den Fachmann offensichtlich, verbessert sich der Bezugsdatensatz durch die Aufnahme zunehmender Anzahlen von Bezugswerten.
Um festzustellen, ob für die Patientin eine erhöhtes Risiko besteht, einen Fötus mit Down-Syndrom zu tragen, muß ein Abbruchniveau festgesetzt werden. Für den Fachmann ist offensichtlich, daß ein Abbruchniveau, welches festgesetzt wird, um zu ermitteln, ob für die Patientin eine erhöhtes Risiko besteht, einen Fötus mit Trisomie 13 oder Trisomie 18 zu tragen, auch beim Erkennen von Fällen von Trisomie 21 wirksam sein kann. Dieses Abbruchniveau kann durch das Laboratorium, den Arzt oder von Fall zu Fall bei jeder einzelnen Patientin festgesetzt werden. Das Abbruchniveau kann auf verschiedenen Kriterien basieren, zu denen die Anzahl der Frauen, die weitere invasive diagnostische Tests ausführen lassen, das mittlere Risiko für das Tragen eines Föten mit Down-Syndrom bei allen Frauen, die weitere invasive diagnostische Tests ausführen lassen, eine Entscheidung, daß jede Frau, deren patientenspezifisches Risiko größer ist als ein bestimmtes Risikoniveau, wie z. B. 1 zu 400, weitere invasive diagnostische Tests ausführen lassen sollte, oder andere, dem Fachmann bekannte Kriterien gehören. Das Abbruchniveau könnte unter Anwendung mehrerer Methoden festgesetzt werden, zu denen die folgenden gehören: Perzentile, Mittelwert plus oder minus Standardabweichung(en); Vielfache des Medianwertes; patientenspezifisches Risiko oder andere, dem Fachmann bekannte Verfahren.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung, das zum Nachweis einer größeren Anzahl von Fällen des fötalen Down-Syndroms führt, wird einer Patientin eine Probe des müt terlichen Bluts entnommen. Dann werden die Gehalte des intakten hCG-Moleküls, des freien Beta-hCG, des nichtkonjugierten Östriols (UE) und des Alpha-Fötoproteins (AFP) (im folgenden als "Marker" bezeichnet) im mütterlichen Blut durch herkömmliche Analyseverfahren gemessen, wie z. B. durch dem Fachmann bekannte immunologische Verfahren. Wie für den Fachmann offensichtlich, funktioniert bei der vorliegenden Erfindung zwar jedes der bekannten Analyseverfahren zur Messung der Gehalte dieser Marker im mütterlichen Blut, aber für jeden Marker muß das gleiche Analyseverfahren verwendet werden wie bei der Erzeugung der Bezugsdaten für den betreffenden Marker. Wenn für einen bestimmten Marker ein neues Analyseverfahren verwendet wird, dann muß ein neuer Bezugsdatensatz erzeugt werden, der auf Daten basiert, die mit dem Verfahren entwickelt wurden.
Ein patientenspezifisches Risiko für das Tragen eines Föten mit Down-Syndrom wird dann mit Hilfe der Bayesschen Regel, des A-priori-Risikos der Patientin und der relativen Häufigkeiten für nicht betroffene und betroffene Schwangerschaften berechnet, die bestimmt werden, indem die quantitativen Gehalte jedes Markers der Patientin (des intakten hCG-Moleküls, des freien Beta-hCG, des UE und des AFP) und das Verhältnis des freien Beta-hCG-Gehalts zum Gehalt des intakten hCG-Moleküls zusammen mit dem Gestationsalter der Patientin in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen eingearbeitet werden, die mit Hilfe einer mehrdimensionalen Diskriminanzanalyse für die Bezugsdaten entwickelt wurden. Die mehrdimensionale Diskriminanzanalyse kann mit dem handelsüblichen Computerprogramm-Statistikpaket "Statistical Analysis System" (hergestellt und vertrieben von der SAS Institute Inc.) oder nach anderen Methoden der mehrdimensionalen statistischen Analyse oder mit anderen, dem Fachmann bekannten statistischen Software-Paketen ausgeführt werden.
Die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion bietet ein Verfahren zum Vergleich des Gehalts jedes Markers der Patientin mit einem Bezugsdatensatz. Ein Typ der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion ist unten angegeben, wobei allerdings, wie für den Fachmann offensichtlich, andere Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen Ähnliches leisten und daher ihre Aufgabe in der vorliegenden Erfindung entsprechend erfüllen.
Formel für das Risiko eines Down-Syndroms:
(1/ COV ) EXP(-0,5(Xa-Ma)Tcov&supmin;¹(Xa-Ma*A-prior-Risiko/[1/ COV ) EXP(0,5(Xa-Ma)Tcov&supmin;¹(Xa Ma)) * A-prior-Riskio + (1/ COV )EXP(-0,5(Xu-Mu)Tcov&supmin;¹(Xu-Mu))*(1 - A-prior-Risikio)]
Der Index "a" bezeichnet die betroffenen Fälle.
Der Index "u" bezeichnet die nicht betroffenen Fälle. (X-M) ist ein Vektor, wobei jede Komponente der Wert der jeweiligen Variablen abzüglich des Mittelwerts der Variablen ist.
cov&supmin;¹ ist die Inverse der zusammengefaßten Kovarianzmatrix der betroffenen und nicht betroffenen Fälle aller Variablen in dem Modell, (X - T ist die Transponierte des Vektors (X - M). EXP bezeichnet die Exponentialfunktion COV bezeichnet die Determinante der Kovarianzmatrix aller Variablen in dem Modell für die Bezugsdaten.
Wie für den Fachmann offensichtlich, kann die zusammengefaßte Kovarianzmatrix durch individuelle Kovarianzmatrizen für nicht betroffene und betroffene Schwangerschaften ersetzt werden. Die Formel für das Risiko eines Down-Syndroms würde dann die folgende Form annehmen:
(1/ COV a)*Exp(-0,5(Xa-Ma)TCOVa&supmin;¹(Xa-Ma) * A-priori-Risiko/[(1/ COV a)*EXP(-,5(Xa-Ma)TCOVa&supmin;¹(Xa-Ma))*A-prior-Risiko + (1/ COV u)*EXP(-0,5(Xu-Mu)TCOVu&supmin;¹(Xu-Mu)*(1-A-priori-Risiko)]
COV bezeichnet die Determinante der Kovarianzmatrix aller Variablen in dem Modell für die Bezugsdaten.
Für die Zwecke der Diskriminanzanalyse macht man eine Annahme über die A-priori-Wahrscheinlichkeit des Down-Syndroms in der allgemeinen, nicht selektierten Population. Im allgemeinen ist die A-priori-Wahrscheinlichkeit annähernd gleich 1 zu 800. Für die mehrdimensionale Diskriminanzanalyse wird eine Entscheidung darüber getroffen, welches Risiko-Abbruchniveau ein positives Testergebnis bildet. Wenn man z. B. weitere diagnostische Tests bei einer Schwangeren durchführen möchte, bei der die Möglichkeit, einen Fötus mit Down-Syndrom zu tragen, mindestens gleich 1 zu 400 ist, dann wird das Testergebnis einer Schwangeren als positiv angesehen, wenn die Ergebnisse der Diskriminanzanalyse zeigen, daß die Möglichkeit bei der Schwangeren, einen Fötus mit Down-Syndrom zu tragen, mindestens gleich 1 zu 400 ist. Wird ein positives Testergebnis angezeigt, dann sollten der Patientin weitere diagnostische Tests empfohlen werden, um das Vorhandensein des Down-Syndroms zu bestätigen.
In Fig. 11-14 sind die Vorrichtung und ein Ablaufdiagramm für ein Computerprogramm zur Berechnung der Bezugsparameter und des spezifischen Risikos dargestellt.
Wie in Fig. 11 gezeigt, werden zur Entwicklung von Bezugsdaten das Gestationsalter GA, der AFP-Gehalt und der freie Beta-hCG-Gehalt durch herkömmliche Verfahren von betroffenen und nicht betroffenen Schwangerschaften bestimmt. Zur Erhöhung der Zuverlässigkeit wird eine große Stichprobenanzahl gewählt. Die Messungen zur Entwicklung von Bezugsparametern sind schematisch bei 10 angedeutet.
Sobald nach der Eingabe über eine geeignete Eingabevorrichtung 15 die Bezugsparameter 22 von der Verarbeitungseinheit 20 berechnet worden sind, kann für eine bestimmte Patientin das spezifische Risiko 25 auf der Basis der spezifischen Marker-Meßwerte für diese Person, die bei 30 angedeutet sind, berechnet werden.
Das Programm zur Bestimmung der Bezugsparameter ist in Fig. 12 und 13, und das Programm zur Berechnung des spezifischen Risikos ist in Fig. 14 dargestellt.
Wie aus Fig. 12 und 13 erkennbar, liest das Programm in einer ersten Schleife 100 von einer Bezugsgruppe Kennummern ID, das Gestationsalter GA, Werte des AFP- und des freien Beta-hCG-Gehalts sowie einen CODE ein, der anzeigt, ob die Schwangerschaft von Trisomie 21 betroffen oder nicht betroffen ist, um Bezugsdaten zu entwickeln. Dies ist im Schritt 102 dargestellt. In dem Ablaufdiagramm wird das Gestationsalter GA durch die Variable X&sub1; bezeichnet, der Logarithmus von AFP ist durch die Variable X&sub2; gegeben, und der Logarithmus des freien Beta-hCG ist durch X&sub3; gegeben, wie in Schritt 104 dargestellt. Dann werden ausgehend von den Größen X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; die Summen- und die Summen-Produkt-Matrix berechnet. Dann wird die Variable NCODE inkrementiert, welche die Anzahl der betroffenen und der nicht betroffenen Fälle in der Bezugsgruppe zählt. Sobald die Schleife beendet ist, wie durch die Ablauflinie 110 dargestellt, werden dann in einer Reihe von Schleifen, die durch die Größen I, J und K definiert sind, die Mittelwerte berechnet, wie durch das Bezugszeichen 112 angedeutet. In diesen Schleifen wird unter Verwendung der in Schleife 100 definierten Summenmatrix und der in Schleife 100 berechneten Summen-Produkt-Matrix die Kovarianzmatrix berechnet. Nach diesen Schleifen wird eine Wahl getroffen, ob die Kovarianzmatrizen für die betroffenen und die nicht betroffenen Fälle zusammenzufassen sind oder nicht. Diese Wahl wird in den Schritten 114, 116 und 118 eingegeben. Wenn eine Zusammenfassung gewählt wird, dann werden die Kovarianzen zusammengefaßt, um eine konzentrierte oder zusammengefaßte Kovarianzmatrix zu bilden, wie durch den Schritt 120 angegeben; die zusammengefaßte Kovarianzmatrix wird invertiert und ergibt die invertierte zusam mengefaßte Kovarianzmatrix IPCM, wie bei 122 gezeigt, und die Mittelwerte sowie die invertierte zusammengefaßte Kovarianzmatrix werden in den Schritten 124 und 126 in einer Datei gesichert und ausgedruckt. Wenn keine Zusammenfassung der Kovarianzmatrizen gewählt wird, dann wird in den Schritten 121 bzw. 123 jede der beiden Kovarianzmatrizen invertiert, und in den Schritten 125 und 127 werden die Mittelwerte und die invertierten Kovarianzmatrizen in einer Datei gesichert und ausgedruckt. Diese Größen bilden die Bezugsparameter für die Berechnung des spezifischen Risikos dafür, daß eine Einzelperson einen betroffenen Fötus trägt.
Wie in Fig. 14 bei 130 dargestellt, werden die Bezugsparameter eingelesen, die bei der Ausführung des in Fig. 12 und 13 dargestellten Programms bestimmt werden, wobei die Bezugsparameter die Mittelwerte und die invertierte zusammengefaßte Kovarianzmatrix aufweisen. Dann wird, wie bei 132 gezeigt, der spezifische Datensatz der Patientin eingelesen, der die Patientenkennummer, das Gestationsalter GA, den AFP-Gehalt und den freien Beta-hCG-Gehalt aufweist. Bei 134 wird dann das Gestationsalter genauer berechnet, und eine Berechnung des mütterlichen Alters wird bei 136 ausgeführt. Bei 138 wird ausgehend vom mütterlichen Alter und von Häuf igkeitsdaten das A- priori-Risiko berechnet. In den weiter unten diskutierten Beispielen ist das Ergebnis dieser Berechnungen der Faktor 1/800, eine typische Zahl.
Bei 140 wird das Produkt aus dem A-priori-Risiko und der relativen Häufigkeit des Tragens eines betroffenen Föten (ABT) bestimmt, das den Zähler in den oben erörterten Gleichungen (1) oder (2) darstellt. Bei 142 wird das Produkt (NT) aus der relativen Häufigkeit des Tragens eines nicht betroffenen Föten und (1 - A-priori-Risiko) bestimmt, das den zweiten Faktor im Nenner der obigen Gleichungen (1) oder (2) darstellt. Bei 144 wird unter Anwendung der Bayesschen Regel das spezifische Risiko bestimmt, d. h. ABN = ABT/(ABT + NT) (Gleichungen (1) und (2)). Bei 146 werden die Ergebnisse, d. h. das patientenspezifische Risiko ABN und die Kennummer der Patientin, ausgedruckt.
Wie für den Fachmann offensichtlich, können für die Berechnung der Bezugsparameter auch andere statistische und mathematische Verfahren als ein lineares Diskriminanzanalyseverfahren angewandt werden.
Nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird einer Patientin eine Probe des mütterlichen Blutes entnommen. Dann werden nach herkömmlichen Analyseverfahren, zu denen dem Fachmann bekannte immunologische Verfahren gehören, der freie Beta-hCG-Gehalt und der AFP-Gehalt (im folgenden als "Marker" bezeichnet) gemessen. Wie für den Fachmann offensichtlich, funktioniert bei der vorliegenden Erfindung zwar jedes der bekannten Analyseverfahren für die Messung der Gehalte dieser Marker im mütterlichen Blut, aber für jeden Marker muß das gleiche Analyseverfahren verwendet werden wie bei der Erzeugung der Bezugsdaten für den betreffenden Marker. Wenn für einen bestimmten Marker ein neues Analyseverfahren verwendet wird, dann muß ein neuer Bezugsdatensatz erzeugt werden, der auf Daten basiert, die mit dem Verfahren entwickelt wurden.
Ein patientenspezifisches Risiko für das Tragen eines Föten mit Down-Syndrom wird dann mit Hilfe der Bayesschen Regel, des A-priori-Risikos der Patientin und der relativen Häufigkeiten für nicht betroffene und betroffene Schwangerschaften berechnet, die bestimmt werden, indem die quantitativen Gehalte jedes Markers der Patientin zusammen mit dem Gestationsalter der Patientin in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen eingearbeitet werden, die mit Hilfe einer mehrdimensionalen Diskriminanzanalyse für die Bezugsdaten entwickelt wurden. Um die Nachweiseffizienz weiter zu erhöhen, werden die Logarithmen der quantitativen Gehalte des freien Beta-hCG und des AFP der Patientin zusammen mit dem Gestationsalter der Patientin in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen eingearbeitet, die unter Verwendung der mehrdimensionalen Diskriminanzanalyse für die Bezugsdaten entwickelt wurden. Die mehrdimensionale Diskriminanzanalyse kann mit dem handelsüblichen Computerprogramm-Statistikpaket "Statistical Analysis System" (hergestellt und vertrieben von der SAS Institute Inc.) oder durch andere Methoden der mehrdimensionalen statistischen Analyse oder andere, dem Fachmann bekannte, statistische Softwarepakete ausgeführt werden.
Für die Zwecke der Diskriminanzanalyse macht man eine Annahme über die A-priori-Wahrscheinlichkeit des Down-Syndroms in der allgemeinen, nicht selekierten Population. Im allgemeinen beträgt die A-priori-Wahrscheinlichkeit annähernd 1 zu 800. Für die mehrdimensionale Diskriminanzanalyse wird eine Entscheidung darüber getroffen, welches Risiko-Abbruchniveau ein positives Testergebnis darstellt. Wenn man z. B. weitere diagnostische Tests bei einer Schwangeren ausführen möchte, bei der die Möglichkeit, einen Fötus mit Down-Syndrom zu tragen, mindestens 1 zu 400 beträgt, dann wird das Testergebnis einer Schwangeren als positiv angesehen, wenn die Ergebnisse der Diskriminanzanalyse zeigen, daß die Möglichkeit der Schwangeren, einen Fötus mit Down-Syndrom zu tragen, mindestens gleich 1 zu 400 ist. Wenn ein positives Testergebnis an gezeigt wird, sollte der Patientin empfohlen werden, weitere diagnostische Teste ausführen zu lassen, um das Vorhandensein des Down-Syndroms zu bestätigen.
Wie für den Fachmann offensichtlich, könnte bei jedem der oben diskutierten Ausführungsbeispiele eine Änderung des Risiko-Abbruchniveaus für ein positives Ergebnis oder die Verwendung verschiedener A-priori-Risiken, die für verschiedene Untergruppen in der Population gültig sein können, die Ergebnisse der Diskriminanzanalyse für jede Patientin verändern.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die oben diskutierten Ausführungsbeispiele beschränkt, sondern schließt alle möglichen Ausführungsbeispiele und Marker-Kombinationen ein, die in den folgenden Beispielen offenbart werden.

Beispiel 1

Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen dem fötalen Down-Syndrom und den freien Beta-hCG-Gehalten im mütterlichen Blut in Verbindung mit dem AFP-Gehalt im mütterlichen Serum (MSAFP), dem UE-Gehalt und dem Gehalt an intakten hCG-Molekülen wurden über 400 Patientenproben verwendet. Zu diesen Proben gehörten 25 Proben des mütterlichen Bluts von Schwangeren, von denen bekannt war, daß sie Föten mit Down-Syndrom trugen, sowie an die betroffenen Fälle angepaßte Kontrollproben.
Für jede Blutprobe wurden durch die folgenden Testverfahren quantitative Werte des AFP-Gehalts, des Gehalts an intakten hCG-Molekülen, des freien Beta-hCG-Gehalts und des UE- Gehalts (im folgenden jeweils als "Marker" bezeichnet) bestimmt: Marker Testverfahren MSAFP Festphasen-Enzymimmuntest (ELISA) UE Radioimmuntest Intaktes hCG Perlentyp-ELISA freies Beta-hCG ELISA
Der Gehalt jedes Markers wurde zu einer Variablen in dem schrittweisen Diskriminanzanalyseverfahren und in dem linearen Diskriminanzanalyseverfahren, die mit dem handelsüblichen Computersoftware-Statistikpaket "Statistical Analysis System" (SAS Institute Inc.) ausgeführt wurden, um einen Bezugsdatensatz zu erzeugen. Das Verhältnis des freien Beta-hCG-Gehalts zum Gehalt an intakten hCG-Molekülen sowie das Gestationsalter der Patientin wurden gleichfalls als Variable einbezogen. Mit dem schrittweisen Diskriminanzanalyseverfahren wurde ermittelt, daß alle Variablen in das lineare Diskriminanzanalyseverfahren aufgenommen werden konnten. Dann wurde das lineare Diskriminanzanalyseverfahren an jeder Variablen für sich und an verschiedenen Variablenkombinationen ausgeführt. Die Ergebnisse dieser Diskriminanzanalysen sind in der untenstehenden Tabelle zusammengefaßt. Die Empfindlichkeit ist der Prozentsatz der Fälle mit fötalem Down-Syndrom, die ein positives Testergebnis zeigen. Als "falsch-positive Ergebnisse" ist der Prozentsatz normaler Föten bezeichnet, die ein positives Testergebnis zeigen Variable Empfindlichkeit falsch-positive Testergebnisse Intaktes freies Beta-hCG Zusammengesetzter Marker ohne Verhältnis Zusammengesetzter Marker ohne Marker ohne freies Beta-hCG *log intaktes + (log freies Beta-hCG + intaktes hCG) log intaktes hCG, log + (log freies Beta-hCG + intakes hCG
Zusammengesetzter Marker = MSAFP + freies Beta-hCG + intaktes hCG + UE + Verhältnis. Gestationsalter wird zusammen mit jeder Variablen einbezogen. Risiko-Abbruchniveau = 1 zu 400, außer für (*), wo das Abbruchniveau gleich 1 zu 365 ist.
Wie für den Fachmann offensichtlich, werden durch eine Änderung des Risiko-Abbruchniveaus für ein positives Ergebnis oder durch die Verwendung verschiedener A-priori-Risiken, die für verschiedene Untergruppen in der Population gültig sein können, die Ergebnisse des Diskriminanzverfahrens für die Patientin verändert.

Beispiel 2

Zur Untersuchung des Zusammenhangs des fötalen Down- Syndroms mit den freien Beta-hCG-Gehalten im mütterlichen Blut wurden über 550 Patientenproben verwendet. Zunächst wurden 29 Proben von Schwangeren, von denen bekannt war, daß sie Föten mit Down-Syndrom trugen, und 520 nicht betroffene Proben analysiert, die in Bezug auf das Gestationsalter (gleiche Woche), das Alter der Mutter (innerhalb von 3 Jahren) und die Aufbewahrungszeit im Gefrierschrank (innerhalb eines Monats) angepaßt waren. Alle Proben stammten von erstgebärenden, nichtdiabetischen, weißen schwangeren Frauen.
Um eine Trainingsmengen-Verfälschung bei Schätzwerten der Screening-Effizienz zu vermeiden, wurde die Konzeption einer Validierungsmenge verwendet. Eine Validierungsmenge ist ein Datensatz, der vom Bezugsdatensatz unabhängig ist. Die Ergebnisse von Patientinnen in der Validierungsmenge werden bei der Gewinnung von Bezugsdaten nicht verwendet. Vielmehr werden Ergebnisse von Patientinnen in der Validierungsmenge mit den Bezugsdaten verglichen, um die Screening-Effizienz zu bestimmen. Diese zweite Validierungsmenge bestand aus 26 weiteren, bestätigten Fällen von Trisomie 21 (insgesamt 55 Fälle) und einer zufällig ausgewählten Gruppe von 159 Kontrollproben. Diese Kontrollproben wurden auf ähnliche Weise von erstgebärenden, nicht diabetischen, weißen schwangeren Frauen entnommen.
Die gesamte Untersuchung bestand aus 4388 Bestimmungen in 7 verschiedenen Tests der Gehalte der unten angegebenen Marker im mütterlichen Blut: Marker Test intaktes hCG + freies Beta-hCG freies Beta-hCG ELISA (Radioimmuntest) Verfahren, Festphasen-Enzymimmuntest & RIA ELISA = Festphasen-Enzymimmuntest
Die Konzentration jedes Markers wurde zu einer Variablen in dem schrittweisen Diskriminanzverfahren und dem linearen Diskriminanzverfahren in dem handelsüblichen Computersoftware-Statistikpaket "Statistical Analysis System (SAS Institute Inc.) zur Erzeugung eines Bezugsdatensatzes. Das Gestationsalter wurde gleichfalls als Variable aufgenommen. Dann wurde das lineare Diskriminanzverfahren an jeder Variablen für sich und an verschiedenen Variablenkombinationen durchgeführt. Die Patientinnen wurden auf der Basis eines Down-Syndrom-Risiko-Abbruchniveaus von 1 zu 365 als betroffen bzw. nicht betroffen klassifiziert. Nicht betroffene, als betroffen klassifizierte Fälle wurden als falsch-positiv angesehen. Das Down- Syndrom-Risiko jeder Patientin wurde mit Hilfe der Bayesschen Regel, der mehrdimensionalen bzw. multivariaten normalverteilten Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen für betroffene und nicht betroffene Fälle und eines allgemeinen A-priori-Risikos von 1 zu 800 berechnet. Für jede Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion wurde eine zusammengefaßte Kovarianzmatrix verwendet.
Die Ergebnisse, die in den in Fig. 1 - 3 dargestellten Tabellen 1 bis 3 angegeben sind, beziehen sich auf die ursprüngliche Untersuchungsmenge. Die Ergebnisse in den Tabellen - 7, Fig. 5 - 7, basieren auf der Klassifikation von Patien tinnen in der Validierungsmenge. Tabelle 4, die in Fig. 4 dargestellt ist, sowie Fig. 8 und 9 basieren auf der ursprünglichen Untersuchungsmenge und allen betroffenen Fällen.
Die Ergebnisse der Testverfahren wurden analysiert, um festzustellen, ob signifikante Unterschiede in den Gehalten jedes Markers zwischen betroffenen und nicht betroffenen Fällen existierten. Tabelle 1 (Fig. 1) läßt erkennen, daß sich betroffene Fälle von nicht betroffenen in allen Markergehalten bis auf UE signifikant unterschieden. Außerdem wurden die Rate der falsch-positiven Ergebniese und die Nachweiseffizienz jedes Markers bestimmt, wie in Tabelle 2 (Fig. 2) dargestellt. Die höchste Nachweiseffizienz wurde mit einem hCG-Test erzielt, bei dem die Gehalte sowohl des intakten Moleküls als auch der freien Beta-Untereinheit gemessen wurden. Eine weitere Steigerung der Nachweiseffizienz wurde bei einer Kombination individueller Marker zu zusammengesetzten Markern beobachtet. Der zusammengesetzte Marker, der den hCG-Test enthielt, bei dem die Gehalte sowohl des intakten hCG-Moleküls als auch der freien Beta-Untereinheit gemessen wurden, lieferten die höchste Nachweiseffizienz unter den in Tabelle 3 (Fig. 3) angegebenen zusammengesetzten Markern.
Die individuelle Auswertung der Beta- und der Alpha-Untereinheit von hCG zeigte, daß zwischen betroffenen und nicht betroffenen Fällen bei der Alpha-Untereinheit keine signifikanten Unterschiede auftraten (p = 0,23), während ein signifikanter Anstieg der Beta-Untereinheit bei betroffenen Fällen beobachtet wurde (p = 0,001). Wie dem Fachmann allgemein bekannt, mißt p die Beweiskraft bei wissenschaftlichen Untersuchungen, indem es die Wahrscheinlichkeit dafür angibt, daß ein mindestens so extremes Ergebnis wie das beobachtete zufällig auftritt. Je niedriger der p-Wert, desto stärker ist der Beweis, daß die Beobachtung kein zufälliges Ereignis ist.
Fig. 8 zeigt das 10., 50. und 90. Perzentil des freien Beta-hCG-Gehalts in Abhängigkeit vom Gestationsalter. Bei nicht betroffenen Schwangerschaften beobachtet man einen anhaltenden Abwärtstrend mit dem Gestationsalter. Die Analyse der freien Beta-hCG-Gehalte in Fällen des fötalen Down-Syndroms zeigt, wie in Tabelle 4 (Fig. 4) dargestellt, daß 86% über dem Medianwert der nicht betroffenen Fälle liegen.
Die freien Beta-hCG-Gehalte sowohl bei den betroffenen als auch bei den nicht betroffenen Fällen passen zu einer logarithmischen Normalverteilung (p = 0,78 und 0,86). Fig. 9 veranschaulicht diese Verteilungen. In Tabelle 5 (Fig. 5) sind Nachweiseffizienzdaten für die freie Beta-hCG-Untereinheit und die freie Alpha-hCG-Untereinheit einzeln angegeben. Die hohe Nachweiseffizienz des freien Beta-hCG ist in Tabelle 5 dargestellt.
Eine noch höhere Nachweiseffizienz wurde mit einem aus AFP und freiem Beta-hCG zusammengesetzten Marker erzielt. Durch Aufnahme des Logarithmus des freien Beta-hCG-Gehalts und des Logarithmus des MSAFP-Gehalts in das lineare Diskriminanzverfahren in dem handelsüblichen Computersoftware-Statistikpaket "Statistical Analysis System (SAS Institute Inc.), wie oben beschrieben, wurde eine hervorragende Nachweiseffizienz erzielt, wie in Tabelle 6 (Fig. 6) gezeigt.
Eine hohe Nachweiseffizienz wiirde man auch bei Verwendung des freien Beta-hCG-Gehalts und des AFP-Gehalts im Gegensatz zum Logarithmus jeder Größe erreichen.
Bei der weiteren Analyse der Daten unter Verwendung von Kruskal-Wallis-Tests oder H-Tests über vier verschiedene Altersgruppen der Mütter (Alter = 30, 31 - 35, 36 - 40 und 40) für den AFP-Gehalt bzw. den freien Beta-hCG-Gehalt wurde festgestellt, daß sowohl der AFP-Gehalt als auch der freie BetahCG-Gehalt vom Alter der Mutter unabhängig sind (p = 0,8394 bzw. 0,5214). Außerdem war die Korrelation (r) der Gehalte der freien Beta-hCG-Untereinheit und von AFP nicht signifikant von null verschieden (r = 0,04, p = 0,39 bzw. r = -0,06, p = 0,81 für betroffene bzw. nicht betroffene Fälle).
Die anhand unserer Daten gemachte grundlegende Beobachtung bestätigt die Tatsache, daß die freie Beta-hCG-Untereinheit den höchsten Beitrag zur Nachweiseffizienz für das Down Syndrom liefert. Tatsächlich ergab die Verwendung eines Tests, bei dem allein der freie Beta-hCG-Gehalt gemessen wurde, eine Nachweiseffizienz bzw. eine Rate falsch-positiver Ergebnisse von 65,4% bzw. 5,2%. Diese Raten sind mit denen vergleichbar, die von anderen Autoren angegeben wurden, die eine Kombination von drei Tests verwendeten. Folglich liegt ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, wie weiter oben dargelegt, in der Verringerung der Testanzahl.
Unsere Erkenntnisse zum Beitrag des freien Beta-hCG basieren auf den folgenden Tatsachen: (a) den höchsten Einzelbeitrag zur Nachweiseffizienz für das Down-Syndrom lieferte ein Test des freien Beta-hCG-Gehalts, (b) ein Test des Gehalts an intakten hCG-Molekülen liefert wesentlich niedrigere Nachweisraten, (c) ein Test, der eine Kombination aus dem Gehalt an intakten hCG-Molekülen und dem freien Beta-hCG-Gehalt mißt, liefert eine höhere Nachweiseffizienz als ein Test, der den Gehalt an intakten hCG-Molekülen allein mißt.
Es ist erwiesen, daß das Risiko des fötalen Down-Syn droms mit dem Alter der Mutter zunimmt. Daher wird, wie oben beschrieben, ein für das Alter der Mutter spezifisches A- priori-Risiko in das mehrdimensionale Diskriminanzanalyseverfahren einbezogen, um patientenspezifische Risiken für die klinische Anwendung der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Da sowohl der AFP-Gehalt als auch der freie Beta-hCG-Gehalt vom Alter der Mutter unabhängig sind, haben wir unsere Daten analysiert, um zu erkennen, wieviele nicht betroffene und betroffene Frauen bei Vorgabe eines A-priori-Risikos für jedes verschiedene Alter positive Ergebnisse aufweisen. Die vorstehende Information wurde verwendet, um auf der Basis der mütterlichen Altersverteilung von Lebendgeburten in den Vereinigten Staaten die Rate falsch-positiver Ergebnisse und die Empfindlichkeitsrate für einen umfassenden, landesweiten Screening-Test zu projizieren. Wie in Tabelle 7 (Fig. 7) dargestellt, lassen die Projektionen darauf schließen, daß eine Nachweiseffizienz von 80% bei 5% falsch-positiven Ergebnissen erreichbar ist.
Die in Beispiel 2 beschriebenen Proben wurden weiter analysiert, um die Nachweiseffizienz anderer Markerkombinationen festzustellen. Genauer gesagt, das lineare Diskriminanz verfahren von Beispiel 2 wurde mit dem gleichen Risiko-Abbruchniveau und dem gleichen A-priori-Risikoniveau bei verschiedenen Markerkombinationen, Vielfachen des Medianwerts (MOM) für den Marker und Logarithmen der Marker ohne und mit Einbeziehung des Gestationsalters durchgeführt. Das lineare Diskriminanzverfahren wurde unter Verwendung sowohl der Bezugsdaten als auch der Validierungsdaten ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8, Fig. 10, zusammengefaßt.

Beispiel 3

Das folgende Beispiel veranschaulicht die Vorbereitung eines einstufigen Tests des freien Beta-hCG und eines zweistufigen Tests des freien Beta-hCG sowie deren Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Vorbereitung eines einstufigen Tests des freien Beta-hCG

1. Eine Mikrotiterplatte mit sechsundneunzig Vertiefungen wird mit einem "Einfang"-Antikörper beschichtet, der für die freie Beta-Untereinheit des humanen Choriongonadotropin(hCG-)Moleküls spezifisch ist. Der Antikörper kann entweder monoklonal oder polyklonal sein. Die Konzentration des zum Beschichten der Platte verwendeten Antikörpers beträgt 0,8 µg pro Vertiefung, könnte aber auf Wunsch einen anderen Wert haben. Die Platte wird mindestens 16 Stunden bei 4ºC inkubiert.
2. Die Platte wird mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2, die 0,05% Tween 20 enthält, gewaschen. Dann wird die Platte mit einer Lösung "blockiert", die 3% hydrolysiertes tierisches Protein und 0,05% Tween 20 in einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 enthält. Es können auch andere, dem Fachmann bekannte Lösungen verwendet werden, wie z. B. eine 1%-ige Rinderserumalbuminlösung. In jede Vertiefung werden dreihundert Mikroliter der Blockierlö sung gegeben, und man läßt die Platte eine Stunde bei Umgebungstemperatur inkubieren. Andere Blockierverfahren sind ebenfalls anwendbar, z. B. "Glasieren".
3. Die Platte wird dann gewaschen, wie weiter oben beschrieben, und in jede Vertiefung werden 100 µl eines Testpuffers gegeben, der einen biotinylierten Antikörper enthält, der für die freie Beta-Untereinheit von hCG spezifisch ist. Der verwendete Testpuffer besteht aus 3% hydrolysiertem tierischem Protein und 0,05% Tween 20 in einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2, kann aber auch irgendeine aus einer Anzahl geeigneter, dem Fachmann bekannter Lösungen sein. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und, nach Wahl des Ausführenden, mit einer anderen Substanz als Biotin konjugiert sein, wie z. B. mit Meerrettichperoxidase oder alkalischer Phosphatase. Die Konzentration des Antikörpers in dem Testpuffer kann so eingestellt werden, daß man optimale Extinktionswerte erhält.
4. Dann werden in jede Vertiefung zwanzig Mikroliter der Probe gegeben. Die Probe kann sein: Testpuffer, der als Blindprobe analysiert wird, um die Leistungsfähigkeit des Tests zu prüfen; eine Lösung von freiem Beta-hCG, die zum Standardisieren der Werte unbekannter Proben dient; oder eine Serumprobe von einer Schwangeren im zweiten Vierteljahr der Schwangerschaft. Die Platte wird 30 Sekunden lang verwirbelt und dann auf eine Drehscheibe mit 200 U/min gesetzt, wo sie 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert wird.
5. Die Platte wird dann gewaschen, wie weiter oben beschrieben. Dann werden in jede Vertiefung hundert Mikroliter Testpuffer gegeben, der mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Streptavidin enthält. Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn der verwendete zweite Antikörper mit einer anderen Substanz als Biotin konjugiert ist. Die Konzentration der Streptavidin-Peroxidase im Testpuffer beträgt 2,0 µg/ml. Die Platte wird fünf Minuten lang bei Umgebungstemperatur auf eine Drehscheibe mit 200 U/min gesetzt.
6. Dann wird die Platte gewaschen, wie weiter oben beschrieben. In jede Vertiefung werden hundert Mikroliter o-Phenylendiamin-Substratlösung gegeben. Diese Substratlösung kann wahlweise irgendein aus einer Anzahl geeigneter, dem Fachmann bekannter Farbstoffe sein, in Abhängigkeit davon, welche Substanz mit dem zweiten Antikörper konjugiert ist. Die Platte wird auf eine Drehscheibe mit 200 U/min gesetzt und im Dunklen 8 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert.
7. In jede Vertiefung werden dann hundert Mikroliter (1,0 N) Schwefelsäure gegeben, um die Reaktion des Substrats anzuhalten.
8. Die Extinktion jeder Vertiefung wird spektrophotometrisch bei 492 nm bestimmt.

Vorbereitung eines zweistufigen Beta-hCG-Tests

1. Eine Mikrotiterplatte mit sechsundneunzig Vertiefungen wird mit einem "Einfang"-Antikörper beschichtet, der für die freie Beta-Untereinheit des humanen Choriongonadotropin(hCG-)Moleküls spezifisch ist. Der Antikörper kann entweder monoklonal oder polyklonal sein. Die Konzentration des zum Beschichten der Platte verwendeten Antikörpers beträgt 0,8 µg pro Vertiefung, kann aber auf Wunsch einen anderen Wert haben. Die Platte wird mindestens 16 Stunden bei 4ºC inkubiert.
2. Die Platte wird mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2, die 0,05% Tween 20 enthält, gewaschen. Dann wird die Platte mit einer Lösung "blockiert", die 3% hydrolysiertes tierisches Protein und 0,05% Tween 20 in einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 enthält. Es können auch andere, dem Fachmann bekannte Lösungen verwendet werden, wie z. B. eine 1%-ige Rinderserumalbuminlösung. In jede Vertiefung werden dreihundert Mikroliter der Blockierlösung gegeben, und man läßt die Platte eine Stunde bei Umgebungstemperatur inkubieren. Andere Blockierverfahren sind ebenfalls anwendbar, z. B. "Glasieren".
3. Die Platte wird dann gewaschen, wie weiter oben beschrieben, und in jede Vertiefung werden 100 µl eines Testpuffers gegeben. Der verwendete Testpuffer besteht aus 3% hydrolysiertem tierischem Protein und 0,05% Tween 20 in einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung mit einem pH- Wert von 7,2, kann aber auch irgendeine aus einer Anzahl geeigneter, dem Fachmann bekannter Lösungen sein.
4. Dann werden in jede Vertiefung zwanzig Mikroliter der Probe gegeben. Die Probe kann sein: Testpuffer, der als Blindprobe analysiert wird, um die Leistungsfähigkeit des Tests zu prüfen; eine Lösung von freiem Beta-hCG, die zum Standardisieren der Werte unbekannter Proben dient; oder eine Serumprobe von einer Schwangeren im zweiten Vierteljahr der Schwangerschaft. Die Platte wird 30 Sekunden lang verwirbelt und dann auf eine Drehscheibe mit 200 U/min gesetzt, wo sie 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert wird.
5. Die Platte wird dann gewaschen, wie weiter oben beschrieben, und in jede Vertiefung werden 100 Mikroliter Testpuffer gegeben, der einen biotinylierten Antikörper enthält, welcher für die freie Beta-Untereinheit von hCG spezifisch ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und, nach Wahl des Ausführenden, mit einer anderen Substanz als Biotin konjugiert sein, wie z. B. mit Meerrettichperoxidase oder alkalischer Phosphatase. Die Konzentration des Antikörpers kann so eingestellt werden, daß man optimale Extinktionswerte erhält. Die Platte wird 30 Sekunden verwirbelt und dann auf eine Drehscheibe mit 200 Ulmin gesetzt, wo sie 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert wird.
6. Die Platte wird dann gewaschen, wie weiter oben beschrieben. Dann werden in jede Vertiefung hundert Mikroliter Testpuffer gegeben, der mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Streptavidin enthält. Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn der verwendete zweite Antikrper mit einer anderen Substanz als Biotin konjugiert ist. Die Konzentration der Streptavidin-Peroxidase im Testpuffer beträgt 2,0 µg/ml. Die Platte wird fünf Minuten lang bei Umgebungstemperatur auf eine Drehscheibe mit 200 U/min gesetzt.
7. Dann wird die Platte gewaschen, wie weiter oben beschrieben. In jede Vertiefung werden hundert Mikroliter o-Phenylendiamin-Substratlösung gegeben. Diese Substratlösung kann wahlweise irgendein aus einer Anzahl geeigneter, dem Fachmann bekannter Farbstoffe sein, in Abhängigkeit davon, welche Substanz mit dem zweiten Antikörper konjugiert ist. Die Platte wird auf eine Drehscheibe mit 200 U/min gesetzt und im Dunklen 8 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert.
8. In jede Vertiefung werden dann hundert Mikroliter (1,0 N) Schwefelsäure gegeben, um die Reaktion des Substrats anzuhalten.
9. Die Extinktion jeder Vertiefung wird spektrophotometrisch bei 492 nm bestimmt.
Diese beiden Tests werden bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen dem fötalen Down-Syndrom und den freien Beta-hCG-Gehalten im mütterlichen Blut wurden hundertachtundsiebzig (178) Patientenproben verwendet. Sechsundzwanzig (26) Proben von Schwangeren, von denen bekannt war, daß sie einen Fötus mit Down-Syndrom trugen, und 152 unbekannte, nicht betroffene Proben wurden analysiert. Alle Proben stammten von erstgebärenden, nicht diabetischen, weißen schwangeren Frauen.
Die Patientenproben wurden dann durch einen ELISA-Test auf quantitative Gehalte von MSAFP und unabhängig voneinander durch den einstufigen Test und den zweistufigen Test auffreie Beta-hCG-Gehalte analysiert. Der MSAFP-Gehalt und der durch jeden Test bestimmte freie Beta-hCG-Gehalt wurden dann zu Variablen bei dem linearen Diskriminanzverfahren in dem handelsüblichen Computersoftware-Statistikpaket "Statistical Analysis System" zur Erzeugung eines Bezugsdatensatzes. Das Gestationsalter der Patientin wurde gleichfalls als Variable in das Diskriminanzverfahren einbezogen. Die Ergebnisse dieser Diskriminanzanalysen für alle Gestationsalter und für Gestationsalter zwischen 14 und 16 Wochen sind in der untenstehenden Tabelle zusammengefaßt. Alle Wochen Falschpositiv Nachweiseffizienz Kontrollen Betroffen. Log (beta-1) + Log (AFP) Log (beta-2) + Log (AFP) Woche Anmerkung: Alle Analysen enthielten das Gestationsalter. * Bei den mit gekennzeichneten Analysen wurden 2 Ausreißer mit Werten von 260 und 316 entfernt.

Claims

1. In-vitro-Screening-Verfahren zu der Feststellung, ob eine Schwangere einen Fötus mit Down-Syndrom trägt, wobei das Verfahren aufweist:

Analysieren des Blutes einer Schwangeren auf freies humanes Beta-Choriongonadotropin (hCG), wobei die Ergebnisse der Analyse anzeigen, ob eine erhöhte Gefahr eines fötalen Down- Syndroms besteht.

2. In-vitro-Screening-Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich die Anzeige einer erhöhten Gefahr eines fötalen Down- Syndroms aus einem Vergleich des gemessenen freien Beta-(hCG)- Gehalts und des Gestationsalters der Schwangeren mit einem Bezugsdatensatz ergibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das ferner aufweist:

Analysieren des Blutes einer Schwangeren auf Alpha- Fötoprotein, wobei die Ergebnisse der Analyse auffreies Beta- (hCG) und der Analyse auf Alpha-Fötoprotein anzeigen, ob eine erhöhte Gefahr eines fötalen Down-Syndroms besteht.

4. Screening-Verfahren zur Bestimmung des Risikos, daß eine Schwangere einen Fötus mit Down-Syndrom trägt, mit den Schritten:

Messung des freien Beta-(hCG)-Gehalts im mütterlichen Blut der Schwangeren während einer Zeitspanne, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem ersten Vierteljahr der Schwangerschaft, dem zweiten Vierteljahr der Schwangerschaft und dem dritten Vierteljahr der Schwangerschaft besteht, und Vergleich des freien Beta-(hCG)-Gehalts mit Bezugswerten für den freien Beta-(hCG)-Gehalt während der Zeitspanne bei (1) Schwangeren, die Föten mit Down-Syndrom tragen, und (2) Schwangeren mit normalen Föten, wobei der Vergleich das Risiko anzeigt, daß die Schwangere einen Fötus mit Down-Syndrom trägt, wobei ein höherer freier Beta-(hCG)-Gehalt eine höhere Wahrscheinlichkeit für einen Fötus mit Down-Syndrom anzeigt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3 zu der Feststellung, ob eine Schwangere erhebliche Gefahr läuft, einen Fötus mit Down-Syndrom zu tragen, mit den Schritten:

Messung des freien Beta-(hCG)-Gehalts im mütterlichen Blut der Schwangeren und Vergleich der Meßdaten des Analyten mit einem Bezugsdatensatz, um das Risiko zu bestimmen, daß die Schwangere einen Fötus mit Down-Syndrom trägt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, das ferner die folgenden Schritte aufweist:

Messung des Alpha-Fötoproteingehalts im mütterlichen Blut der Schwangeren und Vergleich des gemessenen Beta-(hCG)- Gehalts, des gemessenen Alpha-Fötoproteingehalts und des Gestationsalters der Schwangeren mit einem Bezugsdatensatz.

7. Verfahren nach Anspruch 4, 5 oder 6, wobei der Vergleichsschritt die Einarbeitung der Meßdaten in eine Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion aufweist, die aus dem Bezugsdatensatz durch ein lineares Diskriminanzanalyseverfahren erzeugt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 4, 5, 6 oder 7, wobei der Vergleichsschritt einen Vergleich des Logarithmus der Meßdaten mit dem Bezugsdatensatz aufweist.

9. Verfahren zu der Feststellung, ob eine Schwangere erhebliche Gefahr läuft, einen Fötus mit Down-Syndrom zu tragen, mit den Schritten:

Messung des Gehalts eines Analyten, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem freien Beta-(hCG), einer Variante (oder mehreren Varianten) des freien Beta-(hCG) oder einer abweichenden Form (mehreren abweichenden Formen) des freien Beta-(hCG) besteht, im mütterlichen Blut der Schwangeren und Vergleich der Meßdaten des Analyten mit einem Bezugsdatensatz, um das Risiko zu bestimmen, daß die Schwangere einen Fötus mit Down-Syndrom trägt.

10. Testausrüstung zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, 2, 4 oder 5 zu der Feststellung, ob eine Schwangere erhebliche Gefahr läuft, einen Fötus mit Down-Syndrom zu tragen, mit:

einer Einrichtung zur Analyse des Blutes einer Schwangeren auffreies Beta-(hCG).

11. Verwendung einer Vorrichtung für das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Vorrichtung aufweist:

eine Einrichtung zum Empfang der Meßdaten für den freien Beta-(hCG)-Gehalt im mütterlichen Blut einer Schwange ren und eine Computereinrichtung zum Vergleich der Meßdaten für den freien Beta-(hCG)-Gehalt mit einem Bezugsdatensatz zur Bestimmung fötaler Chromosomenverdreifachungen bzw. Trisomien.

12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei die fötale Trisomie das Down-Syndrom ist.

13. Verwendung einer Vorrichtung für das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Vorrichtung aufweist:

eine Einrichtung zum Empfang der Meßdaten für den freien Beta-(hCG)-Gehalt im mütterlichen Blut der Schwangeren, eine Einrichtung zum Empfang der Meßdaten für den Alpha-Fötoproteingehalt im mütterlichen Blut der Schwangeren, und

eine Computereinrichtung zum Berechnen eines Normativdatensatzes aus einem Bezugsdatensatz, der Bezugswerte für den freien Beta-(hCG)-Gehalt und den Alpha-Fötoproteingehalt für verschiedene Gestationsalter bei (1) Schwangeren, die Föten mit Down-Syndrom tragen und (2) Schwangeren mit normalen Föten enthält, und zur Einarbeitung der Meßdaten für den freien Beta-(hCG)-Gehalt und den Alpha-Fötoproteingehalt sowie des Gestationsalters der Schwangeren in eine Wahrscheinlichkeits dichtefunktion, wodurch die Gehalte und das Gestationsalter der Schwangeren mit einem Normativdatensatz verglichen werden, um das Risiko zu bestimmen, daß die Schwangere einen Fötus mit Down-Syndrom trägt.

14. Verwendung einer Vorrichtung für das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Vorrichtung aufweist:

eine Einrichtung zum Empfang der Meßdaten für den freien Beta-(hCG)-Gehalt im mütterlichen Blut der Schwangeren, und

eine Computereinrichtung zum Berechnen eines Bezugsdatensatzes und zur Einarbeitung der Meßdaten für den freien Beta-(hCG)-Gehalt sowie des Gestationsalters der Schwangeren in eine Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, wodurch der freie Beta-(hCG)-Gehalt und das Gestationsalter der Schwangeren mit dem Normativdatensatz verglichen werden, um das Risiko zu bestimmen, daß die Schwangere einen Fötus mit Down-Syndrom trägt.

15. Verwendung gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei die Vorrichtung ferner eine Einrichtung zum Empfang der Meßdaten für den Alpha-Fötoproteingehalt im mütterlichen Blut einer Schwangeren aufweist, und

wobei die Computereinrichtung auch die Meßdaten für den Alpha-Fötoproteingehalt in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunk tion einbezieht und dadurch auch den Alpha-Fötoproteingehalt der Schwangeren mit dem Bezugsdatensatz vergleicht.

16. Verwendung gemäß Anspruch 13, 14 oder 15, wobei der Bezugsdatensatz aus dem Logarithmus (den Logarithmen) der Meßdaten des Gehalts (der Gehalte) berechnet wird und der Logarithmus (die Logarithmen) der Meßdaten verwendet wird (werden), um den (die) Gehaltswert(e) der Schwangeren mit dem Normativdatensatz zu vergleichen.

17. Verwendung einer Vorrichtung für das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Vorrichtung aufweist:

eine Einrichtung zum Empfang der Meßdaten des Gehalts eines Analyten, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem freien Beta-(hCG), einer Variante (oder mehreren Varianten) des freien Beta-(hCG) oder einer abweichenden Form (mehreren abweichenden Formen) des freien Beta-(hCG) besteht, im mütterlichen Blut einer Schwangeren, und

eine Computereinrichtung zum Berechnen eines Bezugsdatensatzes und zur Einarbeitung der Meßdaten für den Gehalt des Analyten sowie des Gestationsalters der Schwangeren in eine Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, wodurch der Gehalt des Analyten der Schwangeren und das Gestationsalter der Schwangeren mit dem Normativdatensatz verglichen werden, um das Risiko zu bestimmen, daß die Schwangere einen Fötus mit Down-Syndrom trägt.