DE68915788T2

DE68915788T2 - Membranaffinitätsvorrichtung und reinigungsverfahren.

Info

Publication number: DE68915788T2
Application number: DE68915788T
Authority: DE
Inventors: Charles Cohen; Randal Goffe; Stephen Kessler; James O'connor; Stephen Zale
Original assignee: Sepracor Inc
Current assignee: Hemasure Inc
Priority date: 1988-10-31
Filing date: 1989-10-30
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2009-10-31
Also published as: CA2001720C; EP0483143A1; DE68915788T3; CA2001720A1; AU4524789A; DE483143T1; ATE106272T1; WO1990005018A1; EP0483143B2; DE68915788D1; EP0483143B1; EP0483143A4

Description

1.0 Anwendungsbereich der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung eines Affinitätstrennverfahrens, bestehend aus:
(a) einer porigen Hohlfaser-Membran gekoppelt mit einem Liganden;
(b) Einrichtung zur Einfassung besagter poriger Hohlfaser-Membran;
(c) Einrichtung zum Einleiten eines ersten Fluids und Herbeiführen eines engen Kontakts zwischen demselben und einer Seite besagter poriger Hohlfaser- Membran; und
(d) Einrichtung zum Ableiten von solchen Fluids in ein Behältnis, die sich auf der Seite von besagter poriger Hohlfaser-Membran befinden, die der Seite gegenüber liegt, auf der besagtes erstes Fluid über die unter (c) genannte Einrichtung eingeleitet wurde.
Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Reinigung/Trennung eines Ligats in einem Membransystem mittels Affinität, gekennzeichnet durch die nachgenannten Verfahrensschritte:
(a) Einleiten einer ligathaltigen Einsatzflüssigkeit auf eine porige Hohlfaser-Membran, die mit einem Liganden für besagtes Ligat gekoppelt ist, wobei besagte Einsatzflüssigkeit unter einem Druck steht, der ausreicht, um einen Teil der besagten Einsatzflüssigkeit zu veranlassen, tangential über eine Außenseite besagter Membran zu strömen und um den Rest der Flüssigkeit zu veranlassen, in besagte porige Membran einzuströmen und durch diese hindurchzuströmen, wobei sich das in besagter Einsatzflüssigkeit enthaltene Ligat an besagten Liganden anlagert und dadurch aus besagter Einsatzflüssigkeit isoliert wird;
(b) Abwaschen besagter Membran mit einer Pufferlösung;
(c) Einleiten einer Elutionslösung auf eine Seite besagter Membran unter einem Druck, der ausreichend hoch ist, um besagte Elutionslösung zu veranlassen, in besagte Membran einzuströmen und durch diese hindurchzuströmen und die Disassoziierung sämtlicher in Schritt (a) gebildeter Ligat-Ligand-Verbindungen zu bewirken, wobei jedes an besagten Liganden gebundene Ligat mittels besagter Elutionslösung eluiert wird; und
(d) Isolieren besagten Ligats in reiner Form aus besagter Elutionslösung.

2.0 Hintergrund der Erfindung

2.1 Affinitätstrennverfahren

Von den heute verfügbaren Trenntechniken erfreuen sich die auf Affinitäts- Wechselwirkungen basierenden Techniken wachsender Popularität - insbesondere was den Laborbereich anbelangt. Das Affinitätstrennverfahren ist mittlerweile das bevorzugte Verfahren zur Isolierung von Proteinen und anderen Biomolekülen aus komplexen, biologisch gewonnenen Fluids. Affinity Chromatography and Biological Recognition, 1983, I.M. Chaiken, M. Wilchek and I. Parikh (Hrsg.), Academic Press, New York, Hill, E.A. and Hirtenstein, M.D., 1983. Affinity chromatography: its application to industrial scale processes, S. 31-66, in Advances in Biotechnological Processes, Alan R. Liss, Inc., New York. Der ausschlaggebende Grund für die Attraktivität dieses Verfahrens liegt in dessen beispiellosen Selektivitätsgrad.
Affinitätstrennverfahren, so wie sie heute praktiziert werden, beinhalten die nachgenannten Schritte: Eine Lösung, die die interessierende Verbindung enthält, wird durch eine Säule geschickt, die einen hochspezifischen Liganden enthält, der an einem festen Träger fixiert ist. Während das Fluid die Säule durchläuft, bindet sich die gewünschte Komponente selektiv - und reversibel - an den Liganden; die meisten verunreinigenden Substanzen passieren ungehindert. Etwaige verbleibende verunreinigende Substanzen werden durch Auswaschen der Säule mit einer geeigneten Pufferlösung entfernt. Die Verbindung, gereinigt aber noch gebunden, wird dann dadurch gewonnen, daß man durch die Säule eine Lösung schickt, die die Liganden-Bindungs-Wechselwirkung zerstört, z.B. durch Änderung der Ionenstärke oder des pH-Wertes.
Viele Arten von Molekülen können als Liganden dienen, so unter anterem Antikörper, Antigene, Enzyminhibitoren, isolierte Rezeptoren und neuerdings auch geklonte Rezeptoren. Bailon, O., Weber, D.V., Keeney, R.F., Fredericks, J.E., Smith, C., Familletti, P.C. and Smart, J.E., 1987, Receptor-affinity chromatography: a one-step purification for recombinant interleukin-2, Bio/Technology 5:1195. Demgegenüber jedoch beschränkt sich die Auswahl an Trägermaterialien für den Liganden auf Agarosegel-Teilchen einerseits und Silica-Partikel andererseits. Wenngleich sich auch beide Materialien für Affinitätstrennverfahren auf Laborebene recht gut eignen, lassen sie sich nicht gut [auf die Prozeßebene] übertragen. Die für Agarosegel-Teilchen charakteristische Kompressibilität erweist sich für technisch effiziente Trennsysteme auf Prozeßebene als großes Handicap. Arnold, F.H., Chalmers, J.J., Saunders, M.S., Croughan, M.S., Blanch, H.W., and Wilke, C.R., 1985; A rational approach to the scale-up of affinity chromatography, S. 113-122, in Purification of Fermentation Products, D. LeRoith, J. Shiloach and T.J. Leahy (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C..
Kompressibilität kann mehr als nur ein Handicap sein: sie wird sogar als eine große Belastung bei Anwendung in Affinitätssystemen auf Prozeßebene angesehen. Clonis, Y.D. 1987, Large-scale affinity chromatography, Bio/Technology 5:1290. Die Komprimierung und damit verbundene dichte Packung eines Agarosegel-Betts unter typischen Betriebsbedingungen kann den Durchsatz solcher Systeme oftmals ernsthaft gefährden. Silica-Träger, die eine höhere strukturelle Steifigkeit aufweisen, stellen eine Alternative zu Agarosegelen dar. In der Tat ist es so, daß Silica die Komprimierung niedrig häft und die hohen Durchsätze, die für ein System für kommerzielle Verfahren erforderlich sind, erlaubt. Hohe Durchsätze jedoch lassen sich nur auf Kosten von hohen Betriebsdrücken realisieren. Und hohe Betriebsdrücke bedeuten höhere Kosten der Grundausstattung.

2.2 Faktoren für die Prozeß-Auslegung

In dem wachsenden Bewußtsein um die sowohl bei Agarosegel-Teilchen als auch bei Silica-Partikeln gegebenen, im Material begründeten Beschränkungen richteten die Konstrukteure ihre Bemühungen statt dessen dahingehend aus, Änderungen an der Bett- Geometrie vorzunehmen, um die durch den Durchsatz und Druck sich ergebenden Nachteile zu umgehen.
Das Ergebnis der Bemühungen um eine Maximierung des Durchsatzes ist eine Tendenz zu kürzeren, breiteren Betten, da - bei einem gegebenen Druckabfall quer durch das Bett - der Durchsatz umgekehrt proportional zu der Betthöhe ist. Eine Reihe von unterschiedlich konfigurierten Kolonnen (Säulen) sind heute auf dem Markt erhältlich: die Konfigurationen reichen von geschichteten Anordnungen (bei denen mehrere kurze Betten in seriellen-parallelen Kombinationen zusammengefaßt sind) bis zu Radialströmungs- Anordnungen (bei denen ein kurzes, breites Bett in sich von einem Ende zum anderen aufgerollt ist).
Die "ideale" Säulen-Geometrie würde wie folgt aussehen: unendlich niedrige Betthöhe (zur Minimierung des Betriebsdrücke und Maximierung des Durchsatzes) bei gleichzeitig unendlicher Breite (zur Maximierung der Liganden-Aufnahme- und Bindungskapazität). In der Realität kommt eine im wesentlichen isotrope Mikroporen-Hohlfaser Membrankonfiguration mit "Betthöhen" im 300-um-Bereich und großen Innenoberflächen diesem Ideal recht nahe.
Ein kritischer Faktor bei der Auslegung von Affinitätstrennverfahren, der jedoch immer übersehen worden ist, ist die Liganden-Ausnutzung. Wenngleich auch einige Wissenschaftler die "Liganden-Ladungskapazität" als Maß für den Wirkungsgrad einer Affinitätskolonne heranziehen, ist es in Wirklichkeit die Liganden-Ausnutzung, die den Wirkungsgrad bestimmt.
In dem Falle, wo das System eine ausgedehnte Verweildauer erfordert, um einen hohen Lösungsprodukt/Liganden-Bindungsgrad zu erreichen, besteht der einzige Weg, auf dem sich eine solche ausgedehnte Verweildauer ohne Abstriche an dem Durchsatz erzielen läßt, darin, die Vorrichtung größer auszulegen. Eine größere Vorrichtung erfordert einen größeren Liganden-Einsatz. Dieser Aspekt ist dann von besonderer Bedeutung, wenn der Ligand relativ teuer ist (wie im Falle eines monoklonalen Antikörpers oder eines Rezeptors); der Preis des Liganden nimmt nun einen wesentlichen Teil der Gesamtkosten der Trennung/Reinigung ein. Wenn die Verweildauer reduziert werden kann, wird der Ligand mit maximaler Effizienz ausgenutzt.

2.3 Maximierung des Stoffaustauschs

Um die Liganden-Ausnutzung innerhalb einer Affinitätstrennvorrichtung zu maximieren, muß der Stoffaustausch maximiert werden. In Affinitäts-Kolonnen mit Füllkörperschüttung sind dem Stoffaustausch durch die Zeit, die die Lösungsprodukt-Moleküle zur Diffusion durch die Zwischenräume hin zum Liganden, der auf der Oberfläche oder innerhalb der Poren von Gel-Teilchen und Silica-Partikeln sitzt, benötigt, Grenzen gesetzt. Geht man von einer schnellen Bindungskinetik aus, dann würde der Ligand nur dann effizient ausgenutzt werden, wenn die durchschnittliche Zeit, die ein Lösungsprodukt- Molekül benötigt, um zu dem Liganden zu diffundieren, (tD), erheblich kürzer als die Verweilzeit (Retentionszeit) des Lösungsprodukt-Moleküls in der Kolonne, (tC), ist (Beziehung 1). Ausgehend davon läßt sich eine Art Peclet-Zahl, Pe, definieren. Kessler, S.B., Zale, S.E., und Bratzler, R.L., in 1987, Affinity device designs for process scale applications, vorgestellt anläßlich des 'Society for Industrial Microbiological Annual Meeting', Baltimore, MD. Boucher, D.F., und Alves, G.E., 1959, Dimensionless numbers, Chem. Eng. Progress 55: 55:
Beziehung 1
tD«tC
Gleichung 1
Pe = tD/tC = (LD²/D)/(V&sub0;/O)
Die Gleichung 1 (worin D für den Diffusionskoeffizienten des interessierenden Lösungsprodukts steht) kann als Hinweis für den Stoffaustausch-Wirkungsgrad herangezogen werden; die Pe-Werte für hohe Wirkungsgrade sind erheblich kleiner als 1.
Der Stoffaustausch-Wirkungsgrad hängt in hohem Maße von der Länge des Diffusionsweges (LD) ab. In einer Affinitäts-Kolonne mit Füllkörperschüttung wird dieser Wert notwendigerweise von dem mittleren Teilchenradius bestimmt, was den Trend in Richtung kleine Teilchengröße bei herkömmlichen Affinitäts-Trägern erklärt. Doch auch hier gibt es wieder einen Nachteil. Ein verbesserter Stoffaustausch läßt sich nur zum Preis höherer Betriebsdrücke erreichen.
Membrangestützte Trennsysteme jedoch mindern in hohem Maße die Stoffaustausch-Beschränkungen, die bei herkömmlichen Techniken festzustellen sind. Da Lösungsprodukt-Moleküle durch Konvektion den Membranträger hinter dem Liganden passieren, anstatt durch ein Teilchen oder einen Partikel diffundieren zu müssen, um den Liganden zu erreichen, werden die Längen der Diffusionswege minimiert und der Stoffaustausch-Wirkungsgrad erheblich erhöht. Doch selbst im Falle von Membranen gibt es einen Konflikt zwischen den Eigenschaften 'hohe Kapazität' und 'guter Stoffaustausch', was eine sorgfältige Membran-Auslegung erforderlich macht.
In dem US-Patent Nr. 4.163.714, herausgegeben am 7. August 1979, wird ein druckbetriebenes Membran-Affinitätssystem beschrieben. In diesem System wird das passend zusammengestellte Ligat sowohl auf der Membran absorbiert als auch von der Membran dissoziiert, indem die Einsatzflüssigkeit, Wasch- und Elutionslösung allesamt auf dieselbe Oberfläche der Membran aufgebracht werden. Dieser Prozeß jedoch führt dazu, daß das Ligat allmählich in einer irgendwie ineffizienten Weise assoziiert wird, wodurch es schwierig wird, das Ligat von der Elutionslösung zur trennen.
Sollte die Ligand/Lösungsprodukt-Assoziationsrate in einem speziellen Affinitätstrennverfahren zufällig unter der Lösungsprodukt-Diffusionsrate liegen, dann ist es denkbar, daß eine Verbesserung der Diffusionseigenschaften ohne Auswirkung auf den Wirkungsgrad des Prozesses bleibt. Untersucht man die Assoziationskinetik eines sepharose-gekoppelten Antigen-Liganden als Modell, so zeigt sich, daß die charakteristische Reaktionszeit der Antikörper/Antigen-Assoziation (tR) von der Konzentration der Bindungsstellen innerhalb des Sepharose-Teilchens (gm) abhängt. Die Reaktionszeit läßt sich anhand von Gleichung 2 rechnerisch ermitteln, worin k&sub1; für die Assoziationsratenkonstante 2. Ordnung und h für die Fraktionssättigung des Adsorptionsmittels stehen.

Gleichung 2

tR = 1/k&sub1; . qm (1 - θ)
Olsen und Yarmush (Olson, W.C., and Yarmush, M.L., 1987, Electrophoretic elution from monoclonal antibody immunoadsorbents: A theoretical and experimental investigation of controlling parameters, Biotech. Progress 3:177) haben errechnet, daß sich Rinder-Serum-Albumin (IBSA) mit Sepharose-Teilchen, die mit monoklonalem Antikörper beschichtet sind, in der Größenordnung von 5 Sekunden verbinden. Demgegenüber ist die durchschnittliche Zeit, die BSA benötigt, um zur Oberfläche der Teilchen zu diffundieren, weit größer - nämlich 41 Sekunden. Diese Zeit ergibt sich aus LD²/D (siehe Gleichung 1), worin LD für den mittleren Teilchenradius (5 x 10&supmin;³ cm) und D für den Diffusionskoeffizienten für BSA (6 x 10&supmin;&sup7; cm²/s) steht. Die durchschnittliche Diffusionszeit ist fast um eine Größenordnung größer als die Lösungsprodukt/Ligand-Assoziationzeit. Somit sind herkömmliche Affinitätstrennverfahren für dieses System diffusionsbeschränkt: für Prozesse im großen Rahmen ist dies ineffizient.

2.4 Membrangestützte Affinitäts-Träger

Auf der Suche nach besseren Affinitäts-Substraten war es unausbleiblich, daß Membranen als Alternative zu Kolonnen mit Füllstoffschüttung auftauchen würden. Bis heute jedoch sind der Entwicklung der membrangestützten Affinitäts-Trenn-/Reinigungstechnik durch die Verfügbarkeit von zu diesem Zweck systematisch konzipierten Membranen Grenzen gesetzt. Gregor (US V-A-4.163.714) und Degan u.a. (US V-A- 4.693.985) haben, als Konsequenz daraus, eingehend untersucht, inwieweit sich Platten- (oder Flächen-) Filter ("flat sheet filters") für eine Verwendung als Affinitäts-Abscheider eignen.
Gregor (US V-A-4. 163.714) macht Ansprüche geltend, die Filter zur Ultrafiltration (UF) mit einer durchschnittlichen Porengröße von ca. 15 bis 200 Angström zum Gegenstand haben. Bei der derzeitigen Technik der Herstellung von Ultrafiltrations- Membranen entsteht unweigerlich eine anisotrope Struktur mit Außenhaut. Während die relativ kleine Porengröße wegen der großen Innenoberfläche von Vorteil ist, würde in einem Affinitäts-Prozeß ein Herausfiltern von Proteinen während des Verfahrensschritts der Bindung (oder Beladung) die Brauchbarkeit solcher Membranen stark einschränken. Schon kurz nach einer Druckbeaufschlagung des ligathaltigen Fluids kommt es zur Verschmutzung und Verstopfung der Membran.
Ein Verfahren, das zur Reinigung und Freisetzung der Poren von Ultrafiltern angewandt wird, ist das Rückspülen ("backflushing" oder "back-washing"). Hierbei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem Filtrat in umgekehrter Richtung durch das Filter hindurchgepreßt wird. Nach einigen Jahren der Anwendung dieses Spülverfahrens ist in den letzten Jahren die Anwendungshäufigkeit dramatisch zurückgegangen, zum Teil auf Grund von Totalausfällen der Membran in Verbindung mit dieser Praxis. Das Rückspülen (häufig unter Anwendung von höheren Drücken als den Drücken, die bei dem Schritt der Ultrafiltration zur Anwendung kommen), führt häufig zu:
- einer Ablösung der Außenhaut der Membran von dem Matrixbereich,
- Brüchen (d.h. Sprüngen und Rissen) in der gesamten Membranwand,
- kompletter und irreversibler Verstopfung, da eingefangenes Material die anisotrope Matrix in umgekehrter Richtung durch immer kleiner werdende Poren nicht passieren kann.
Hohlfaser-Membranen sind beim Rückspülen (und unter den Belastungen der Anlauf/Abschalt-Zyklen) besonders schadensanfällig, weil sie selbsttragend sind. Platten- Membranen weisen gewöhnlich ein poriges (hydrophobes) Stützmaterial zur mechanischen Unterstützung auf.
In der Unterlage US V-A-4.693.985 werden Platten-Polyamid-Membranen für Affinitäts-Anwendungen beschrieben. Hierbei handelt es sich um feinporige, hautlose Membranen mit einem Porendurchmesser von > 0,1 bis < 0,45 um. Sie stellen zwar eine bedeutende Verbesserung gegenüber den Ultrafiltrations-Platten-Membranen dar, sind jedoch in ihrer Anwendung dadurch beschränkt, daß sie sich in einem System schwer konfigurieren lassen (und dies, weil sie nicht selbsttragend sind). Außerdem erweist sich die Auslegung von Systemen mit hoher Oberfläche/geringem Totvolumen als zunehmend schwierig. In der Unterlage US V-A-4.693.985 wird das Faltenfilter ("pleated filter") als die beste verfügbare Ausführung bei zunehmender Prozeßgröße beschrieben. Bei der in der Unterlage US V-A-4.693.985 beschriebenen Konfiguration der Platten-Membran-Packung handelt es sich um eine Konfiguration mit großer Oberfläche.
Die ideale Membrankonfiguration für die absteigende Aufbereitung ist eine Hohlfaser, und dies auf Grund
- des Verhältnisses von großer Oberfläche zu Totvolumen, das sich je System erzielen läßt, und
- der Vorteile, die sich bei der Fluid-Handhabung ergeben, wenn Einsatzfluid- Ströme in absteigender Richtung durch den Hohlraum einer Faser geleitet werden.
Stimpson, D.E., ACS Polymer Preprints, Vol. 27, No. 2, S. 424, (Sept. 1986), untersuchte anisotrope Hohlfaser-Membransysteme über einen großen Porengrößenbereich als Affinitäts-Träger und kam zu dem Schluß, daß Poren in der Größenordnung von ca. 0,1 mm zu bevorzugen sind, wenn es darum geht, den bestmöglichen Kompromiß zwischen Oberfläche und Porengröße zu erzielen.
Die Unterlage WO-A-8806899 enthüllt eine Vorrichtung zur Durchführung eines Affinitätstrennverfahrens und betrifft ein System zur simultanen Diffusions-Hämodialyse und enzymbeschleunigten Umwandlung von Heparin oder Derivaten mit geringem Molekulargewicht von Heparin in Vollblut unter Verwendung von immobilisienten Enzymen wie z.B. Heparinase. In einer bevorzugten Verkörperung ist das Enzym auf der Lumenaußenfläche von Zellulose-Hohlfasern fixiert. Das Verfahren und die Vorrichtung dieses Patents basieren auf der transmembranen Diffusion von in Vollblut vorliegenden Komponenten mit geringem Molekulargewicht.

2.5 Derzeitiger Stand der Technik bei den Verfahren zur Herstellung von Mikroporen-Membranen

Was diesen speziellen Bereich der Membran-Technik anbelangt, so bringen die derzeitigen Verfahren der Herstellung von Mikroporen-Membransystemen im allgemeinen anisotrope Strukturen mit Außenhaut hervor, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Poren in ihrer Größe von der Membranaußenseite zur Membraninnenseite hin stark variieren.
So wurde insbesondere die Herstellung von isotropen Hohlfaser-Membransystemen durch vorherrschende Ausrichtungen auf diesem Gebiet sowie existierende Strangpreßverfahren - neben den allgemeinen Fertigungstechniken - erschwert.
Erstens wurden die zur Herstellung von Membransystemen verwendeten Werkstoffe oder Polymere generell, wie oben bereits erwähnt, in zwei allgemeine Gruppen eingeteilt, nämlich in reaktive oder hydrophile Stoffe einerseits und inerte Stoffen andererseits (siehe z.B. Cabasso, I., in "Membranes", Encyclopedia of Polymer Science and Eng., 1987, 9, 509-579, von Wiley Interscience Publication; Kesting, R.E., Synthetic Polymeric Membranes 1985, 2. Aufl., Wiley; Pusch, W., und Walch, A., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1982, 21(9), 660-685). Beispiele der erstgenannten Gruppe sind entweder charakteristischerweise hydrophil oder lassen sich auf einfache Art und Weise modifizieren, um Hydrophilie zu erreichen. Eine hohe Hydrophilie bewirkt eine Minimierung der nichtspezifischen Bindung von Proteinen an die Polymer-Oberfläche. Der größte Nachteil bei charakteristischerweise hydrophilen Membransystemen, insbesondere bei solchen, die aus Materialien wie Zellulose hergestellt sind, liegt in deren begrenzten mechanischen und thermischen Eigenschaften. Demgegenüber sind Membranen, die zu der zweitgenannten, "inerten", Gruppe gehören, zwar in bezug auf ihre physikalische, thermische und chemische Festigkeit überlegen, zugleich aber extrem hydrophob und somit anfällig für eine nichtspezifische Bindung von Proteinen und für eine Membranverschmutzung oder -verstopfung.
Als ein reaktives/hydrophiles Membranmaterial findet Zellulose zwar breite Anwendung in verschiedenen Formen, jedoch weist sie einige schwerwiegende Nachteile auf. Diese Nachteile sind u.a. eingeschränkte pH- und chemische Beständigkeit (z.B. gegenüber chlorhaltige Desinfektionsmittel) sowie ein allgemeiner Mangel an in vielen Anwendungen erforderlichen physikalischen Eigenschaften (siehe Kesting, Syn. Polym. Memb., Ref. wie oben). Polysulfon (PS) ist der Polymer-Typ mit der weitverbreitetsten Anwendung in Ultrafiltrations-(UF-)Membranen, und dies auf Grund seiner relativen Vielseitigkeit, und zwar sowohl in bezug auf die physikalischen/chemischen Eigenschaften als auch auf seine Verarbeitbarkeit, die die Herstellung eines breiten Spektrums von Strukturen und Porengrößen ermöglicht (d.h. mit Beschränkungen hinsichtlich des Molekulargewichts ("molecular weight cutoffs", MWc) von ca. 2.000 kD bis ca. 1 kD).
Polysulfone haben erst in den letzten Jahren Bedeutung als ein wichtiges Polymer für die Herstellung von Mikrofilter-(MF-)Membransystemen erlangt. Solche Mikrofilter- Membransysteme nehmen in der Ausführung als Platten-Systeme zahlenmäßig zu, sind jedoch noch relativ selten in der Ausführung als Hohlfaser-Systeme anzutreffen. Allgemein gesprochen, jedoch, tendieren Polysulfon-Membransysteme dazu, leicht zu verschmutzen, und Verfahren zur kovalenten Modifizierung der Oberflächen dieser Membranen wurden bis heute noch nicht entwickelt. Darüber hinaus gehören diese Membranen unweigerlich der Gattung der anisotropen Membranen an.
Üblicherweise müssen die in diesem Bereich Tätigen den interessierenden Porengrößenbereich bei der Auswahl des Membran-Polymers berücksichtigen. Gewisse Polymere, so die Überzeugung, lassen sich zum Zwecke der Herstellung von Membranen in bestimmen Porengrößenbereichen leichter als andere verarbeiten (siehe Kesting, Syn. Polym. Memb., Ref. wie oben). Fachleute wie Strathmann, u.a., Desalination 1977, 21, 241-255, und Desalination 1975, 16, 179-203; Tanny, u.a., J. Appl. Polym. Sci. 1974, 18, 2149-2163; Koenhen, D.M., u.a., J. App. Polym. Sci. 1977, 21, 199-215; Broens, I., u.a., Desalination 1977, 22, 205-219; Altena, F.W. und Smolders, C.A., J. Polym. Sci.: Polymer Symposium 1981, 69, 1-10; Broens, L. u.a., Desalination 1980, 32, 33-45; Bokhorst, H., u.a. Desalination 1981, 38, 349-360; Wijmans, J.G., u.a., J. Memb,. Sci 1983, 14, 263- 274; und Kesting lenkten die Bemühungen hin zu einem größeren Verständnis der Mechanismen der Membranbildung und der Wege der Manipulierung von strukturellen Eigenschaften. Was das Gebiet der Membranentwicklung anbelangt, so hat man sich im allgemeinen damit abgefunden, daß viele kritische Fertigungsparamter geändert und mühsam neu optimiert werden müssen, um von einem Platten-System zu einem Hohlfaser-Produkt zu gelangen. Die Entwicklung schreitet somit nur langsam voran, insbesondere was die Herstellung von isotropen Hohlfaser-Membransystemen anbelangt.
Andere haben sich mit dem Aspekt der Verwendung von Gemischen (Blends) aus hydrophilen und hydrophoben Polymeren als Formmassen ("dopes") zur Herstellung von Membranen befaßt (siehe Cabasso, I., Encyclopedia of Polymer Science and Eng., Ref. wie oben; Pusch, W., und Walch, A., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Ref. wie oben). Ihr Hauptziel bestand darin, hydrophile Polymere als Verarbeitungshilfsstoffe zu verwenden; d.h. die hydrophilen Polymere werden zur Erhöhung der Viskosität der Formmasse eingesetzt. Extraktionsschritte, die zur Entfernung der hydrophilen Komponente während des Koagulationsprozesses und im Anschluß daran vorgesehen werden, fördern sowohl die Porendichte als auch den Bereich der erreichbaren Porengrößen. Die zitierten Fachleute vermeiden folglich hydrophile Polymere mit hohem Molekulargewicht als Blend- Komponenten, da diese Polymere in höherem Maße dazu neigen, in der Membranmatrix eingefangen zu werden. Darüber hinaus lehrt die Literatur zur Membran-Technologie, daß mit steigendem Molekulargewicht eines hydrophilen Additivs, insbesondere bis zu einem Bereich von 100.000 und darüber, die in der fertigen Membran erhaltene Porengröße dramatisch abnimmt (siehe Cabasso, I, u.a., J. Appl. Polym. Sci. 1976, 20, 2377-2394; Nguyen, Q.T., u.a., J. Mem. Sci. 1985, 22, 245-255). Cabasso beispielsweise hat gezeigt, daß durch eine Erhöhung des Molekulargewichts (MW) von Polyvinylpyrrolidon (PVP) von 10.000 auf 40.000 in einer experimentellen PS/PVP-Blend die Wasserdurchlässigkeit (Lp) der resultierenden Hohlfaser um den Faktor 5 verringert wird. Darüber hinaus leiden auch das Anfangsmodul und die anfängliche Zugfestigkeit. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das PVP in der fertigen Membran mit steigendem Molekulargewicht zurückgehalten wird. Offensichtlich gewinnt das Phänomen der Verhakung von Ketten mit steigendem Molekulargewicht eines wasserlöslichen Polymeradditivs in der Blend an Bedeutung. D.h., das Additiv mit hohem Molekulargewicht läßt sich weniger leicht extrahieren und die Dichte der fertigen Membran nimmt zu, womit verhindert wird, daß Wasser leicht passieren kann.
Auch ein Hohlfaser-Fertigungsverfahren ist beschrieben worden (siehe Cabasso, I., u.a., J. Appl. Polym. Sci., Ref. wie oben), bei dem optisch klare (d.h. einphasige) Spinnmassen ("dopes") aus einer Blend aus PS und PVP oder PEG (Polyethylenglycol) (Molekulargewicht = 600), gelöst in entweder Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, zum Einsatz kamen. In der zitierten Quelle wird betont, daß diese Spinnmassen kein Cloudpoint-Verhalten zeigen, noch nicht einmal dann - bei Einhaltung der typischen oberen kritischen Lösungstemperatur (UCST) -, wenn ein inaktives Lösungsmittel in ein Polymer/Lösungsmittel-Gemisch titriert wird. Diese klaren Spinnmassen werden bei Kontakt mit einem inaktiven Lösungmittel im Zuge der nach innengerichteten Diffusion des inaktiven Lösungsmittels phasengetrennt. Forscher vermuten, daß die Größe der resultierenden Lösungsmittel/PVP-angereicherten Bereiche wahrscheinlich von den thermodynamischen Phasen-Beziehungen sowie von der Kinetik der Phasentrennung bestimmt wird (siehe Cabasso, I., u.a., J. Appl. Poly. Sci. 1977, 21, 165-180). Diese Beobachtungen finden sich im wesentlichen im Einklang mit den Ergebnissen, die von anderen berichtet wurden (siehe Kesting, Syn. Polym. Memb., Ref. wie oben; Kamid, K., und Manabe, S., Material Science of Synthetic Membranes, ACS Symposium Series 1985, 269,197-228, Lloyd, D.R., Ed.).
Wo hydrophile Polymere mit sehr hohem Molekulargewicht (z.B. Poly(ethylenoxid) (PEO) mit einem Molekulargewicht von 4 bis 5 Mio.) mit Polymeren vom Polysufon-Typ gemischt wurden, war die Absicht, sich die Kompatibilität zwischen den gemischten Polymeren zunutze zu machen und das hydrophile Polymer in einer homogen gemischten transparenten Folie zu bewahren (siehe US V-A-4.387.187 und EP V-A-37.181 an Newton und abgetreten an Imperial Chemical Industries, Ltd.). Wie in dem US-Patent Nr. 4.387.187 offenbart, werden solche PES/PEO-Folien oder semipermeablen Membranen hauptsächlich durch Lösungsmittel-Verdampfung hergestellt, mit einem Laugungs- Verfahrensschritt zur Entfernung des restlichen Lösungsmittels aus der bereits gebildeten Folie. Von dem in einer solch dichten Membran erreichten Porositätsgrad wird erwartet, daß er eine Durchlässigkeit für Moleküle mit einem Molekulargewicht von weit größer als 1.000 ausschließt. Jedoch würde der Membran infolge der Bewahrung von PEO in der Endstruktur eine gewisse Hydrophilie zuteil werden.
Bei der Verwendung von hydrophilen Polymeren als Verarbeitungshilfsstoffe liegt das Handicap in der Kompatibilität. Im allgemeinen können Polymere mit geringem Molekulargewicht Formmassen ("dopes") in viel höheren Konzentrationen zugesetzt werden (siehe das Japanische Patent Nr. 57.035.906). Dieses japanische Patent lehrt uns, wie sich in Abhängigkeit vom Molekulargewicht die größtmögliche Beladung einer homogenen Formmasse mit PEG für das Membran-Gießen erreichen läßt. PEG-Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 100.000 sind ausdrücklich ausgenommen.
Entsprechend lehren Klein und Smith (US-Patent Nr. V-A-4.051.300) die Verwendung von PVP mit geringem Molekulargewicht (von durchschnittlich mindestens 2.000) in einer Blend-Lösung mit Polysulfon zur Erzielung hoher Formmassen-Viskositäten für die Hohlfaser-Herstellung. Das Gewichtsverhältnis von Polysulfon zu PVP wird spezifiziert als nicht kleiner als 0,5 und nicht größer als 55. D.h. das hydrophile Polymer- Additiv mit relativ geringem Molekulargewicht (von Klein und Smith als "non-solvent", d.h. "inaktives Lösungsmittel" oder "Nicht-Lösungsmittel", bezeichnet) wird in ausreichenden Mengen verwendet, um als Verarbeitungshilfsstoff zu dienen. Die Menge des Verarbeitungshilfsstoffs ist beschränkt, um sicherzustellen, daß:
(i) die Formmasse keine Phasengrenze unter normalen Prozeßbedingungen zeigt, z.B. Temperatur (Cabasso, I. u.a., J. Appl. Polym. Sci., Ref. wie oben), und
(ii) PVP nicht in der Hohlfaser zurückgehalten bleibt, um entweder das Hohlraumvolumen (oder vielmehr die Porosität) der fertigen Membran oder die Wasserdurchlässigkeit (Lp) und Porengröße zu verringern.
Membran-bildende PS/PVP-Formmassen von Cabasso (Cabasso, I., u.a., J. Appl. Polym. Sci., Ref. wie oben) und von Klein und Smith (US-Patent Nr. V-A-4.051.300) erfordern Kontakt mit einem inaktiven Lösungsmittel entweder in der Dampfphase oder der Flüssigphase, um eine Phasentrennung zu erfahren. Unter diesen Bedingungen steuern die relativen Diffusionsgeschwindigkeiten des inaktiven Lösungsmittels in die Formmasse und des echten Lösungsmittels aus der Formmasse den Prozeß der Phasentrennung in derartigen Systemen. Das zur Einleitung der Phasentrennung eingesetzte inaktive Lösungsmittel bewirkt eine Ausfällung des Polysulfons während der Aufspaltung und Extraktion des PVP aus der Polysulfon-Faser während deren Entstehung.
Verläßt man sich ausschließlich auf das Abkühlen (Quenchen) einer Formmasse mit einem inaktiven Lösungsmittel, so führt dies häufig zur Bildung einer stark anisotropen Struktur mit Außenhaut, und dies zum Teil als Folge der Beschränkungen, die durch einen ineffizienten oder langsamen Stoffaustausch auferlegt werden. Höhere Diffusionsraten von Nicht-Lösungsmittel-Molekülen durch die Formmassen-Zusammensetzung lassen sich manchmal durch Lösen geringerer Mengen an Feststoffteilchen in der Formmasse erreichen. Das Quenchen dieser wenige Feststoffteilchen enthaltenden Formmassen in Gemischen aus echten Lösungsmitteln/inaktiven Lösungsmitteln ist ein Hilfsmittel zur Beherrschung der Hautbildung und Anisotropie. Die resultierenden Membranen jedoch, wenngleich auch stärker isotrop, sind häufig schwach und sind nicht selbsttragend. Dieser langsame Diffusionsprozeß - entsprechend dem derzeitigen Stand der Technik - liefert kleinere Poren in der Nähe der Membranoberfläche, die zuerst mit dem inaktiven Lösungsmittel in Berührung kommt, und zunehmend größere Poren, je weiter man in die Membranmatrix hineindringt.
Im Gegensatz zu der durch ein inaktives Lösungsmittel eingeleiteten Flüssig/Fest- Phasentrennung zur Herstellung von im wesentlichen anisotropen feinporigen Membranen hat Castro (US-Patent Nr. 4.247.498) die thermische Phasenumkehrung (d.h. Flüssig/Flüssig-Phasentrennung, erreicht durch Temperaturänderungen) bei der Herstellung von isotropen feinporigen Membranen erforscht. Die thermische Phasenumkehrung, so wie sie heute praktiziert wird, erfordert eine Polymer-Schmelze und eine kompatible Flüssigkeit, um eine homogene Lösung zu gewinnen, in der das Polymer in dem schwachen Lösungsmittel löslich ist. Ein nachfolgendes Kühlen dieser Schmelzen führt zur Ausfällung des Polymers. Die Struktur wird somit durch den Kühlungsprozeß "eingefroren".
Verschiedene Verfahren des Faserspinnens sind Stand der Technik und bekannt. Zu diesen Verfahren zählt u.a. das Trocken-/Naßspinnen ("dry-wet spinning"), bei dem zwischen der Extrusionsvorrichtung oder Spinndüse und dem Spinn-(Quench-)Bad ein Luftspalt besteht, und das Naß-/Blasspinnen ("wet-jet spinning"; (siehe Cabasso, I., Encyclopedia of Chem. Tech., 3. Aufl., Vol. 12, S. 501). Beim Naß-/Blasspinnen wird die Spinndüse in das Spinnbad eingetaucht, so daß absolut kein Luftspalt besteht. Werden starke Lösungsmittel in dem Spinnbad verwendet, dann kann die weichmachende Wirkung auf eine neugebildete Faser die Spinnbarkeit begrenzen.

2.6 Spinndüsen - Stand der Technik

Die derzeitigen Spinndüsen-Baugruppen zur Hohlfaser-Herstellung sind ganz und gar ungeeignet und unflexibel für die Herstellung von im wesentlichen isotropen feinporigen Membranen. Die zur Zeit im Gebrauch befindlichen Extruderdüsen bieten nicht die Möglichkeiten der Steuerung der Porenstruktur und Porengrößenverteilung in den resultierenden feinporigen Hohlfasern, die man zu haben wünscht. Typische "Rohr-in Mundstück"- Spinndüsen-Systeme ("tube-in-orifice spinnerettes") werden beschrieben in den US- Patenten Nr. 4.198.363 (Noel, G. u.a.) und Nr. 4.229.154 (Chaban und Hawkins); in Borneman, Z. u.a., Proceedings, 4th British Oxygen Company Conference, Sept, 1986, S. 145-157; und in Aptel, P. u.a., J. Memb. Sci. 1985, 22 199-215. Desweiteren werden Spinndüsen-Frontplatten-Konfigurationen in einem Artikel von Cabasso in "Hollow Fiber Membranes", Encyclopedia of Chem. Tech., 3. Aufl., Vol. 12, S. 499, Kirth-Othmer, Hrsg., beschrieben.
Zahlreiche andere Spinndüsen-Baugruppen und Extruderdüsen sind an anderer Stelle beschrieben worden. So u.a. in den US-Patenten Nr. 4.370.114 (zur Herstellung von mehradrigen Filamenten), Nr. 1.541.528 (eine Vorrichtung zum Hohl-Fließpressen, nicht von Hohlfasern), Nr. 2.574.555 (Doppelring-Frontplatte, aber offenkundig keine zentrale Hohlbohrung) und Nr. 3.321.803 (Mundstück zum Beschichten eines Metallrohres). Noch andere Vorrichtungen werden beschrieben in den US-Patenten Nr. 3.121.254 (erwähnt Inertgas in Hohlbohrung), Nr. 3.357.051 (zum Strangpressen von doppelwandigen Schlauchleitungen), Nr. 3.690.806 (Vorrichtung mit internen, für 'Reverse Flow'-(Umkehr- Strom-) und 'Adjustable Chock'-Anwendungen nützlichen Bauteilen) und Nr. 3.716.317 (Vorrichtung zum Spinnen von Filamenten aus zwei Polymer-Strömen).
Eine Spinndüsen-Baugruppe neuesten Datums, beschrieben in dem US-Patent Nr. 4.493.629 (im folgenden "das Patent '629" bezeichnet), ist eine modular aufgebaute Einheit, konzipiert für das gleichzeitige Strangpressen von drei Fluids während der Hohlfaser-Herstellung, die als besonderes Merkmal eine tangentiale Einlaßöffnung aufweist. Es gibt zwei entscheidende Faktoren, warum die in dieser Vorveröffentlichung beschriebene Vorrichtung für die Herstellung von im wesentlichen isotropen Strukturen schlecht geeignet ist:
(1) Das Patent '629 beschreibt eine Spinndüse mit nur einem Ringraum, der an der Front der Spinndüse austritt (d.h. der Oberfläche der Vorrichtung, aus der die stranggepreßte Faser austritt). D.h., Fluids innerhalb der Vorrichtung tendieren dazu, sich zu vermischen, bevor sie aus der Spinndüse als eine Hohlfaser austreten. Das Ausmaß der Vermischung hängt von den relativen Viskositäten sowie den relativen Strömungsgeschwindigkeiten ab. Daher können zwei von drei in die Vorrichtung gelangenden Strömen nicht unabhängig voneinander über einen bedeutenden Strömungsbereich geändert werden.
(2) Die Vielzahl von Öffnungen in dem Ring-Abstandshalter laut der Beschreibung der Abbildungen 4 und 5 des Patents '629 ist lästig. Darüber hinaus ist die Gleichförmigkeit der Gesamtströmung über diesen geteilten Strömungsweg eine direkte Funktion der Maße einer jeden einzelnen Öffnung. Probleme ergeben sich dann, wenn eine Feinsteuerung langsamer und/oder erheblich unterschiedlicher Strömungsgeschwindigkeiten erforderlich ist. Ebenso werden sich Schwierigkeiten ergeben, wenn bedeutende Viskositätsunterschiede zwischen den beiden Fluidströmen, die durch den einen Ringraum gepreßt werden, vorliegen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher, eine membrangestützte Affinitätstrennvorrichtung vorzustellen, die die Wirkungsgrade des Stoffaustauschs und der Liganden-Ausnutzung verbessert und die sich von der Laborebene auf die Prozeßebene übertragen läßt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine Vorrichtung vorzustellen, die über eine Verarbeitungsfähigkeit verfügt, die der einer herkömmlichen agarosegestützten Affinitätstrennvorrichtung entspricht.
Desweiteren ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung vorzustellen, deren hoher Einsatzfluid-Durchsatz und effiziente Liganden-Ausnutzung kurze Bindungs-/Elutions-Zykluszeiten gestattet.
Und schließlich ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine Membran- Vorrichtung vorzustellen, deren geringes Volumen und bevorzugte Elutionsweise eine Produkt-Aufkonzentration gestatten.

3.0 Zusammenfassung der Erfindung

Bei der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Gegenstrom-Hohlfaser-Affinitätsmembransystem zur Trennung von hochwertigen Produkten wie z.B. therapeutischen Proteinen. Das zentrale Merkmal dieses Systems ist eine im wesentlichen isotrope feinporige Hohlfaser-Membran, die so ausgelegt ist, daß sie die Beladungskapazität und das geringe Totvolumen optimiert und zugleich hohe Stoffaustauschgeschwindigkeiten erreicht. Ein großes System mit einem 600-ml-Modul ist ausgelegt für die Aufbereitung von bis zu 10.000 Liter Zellkulturenernten je Woche. Mehrere Affinitäts- Systeme oder -Moduln können parallel geschaltet werden, um noch größere Mengen von Einsatzmaterial zu verarbeiten.
Die Adsorption (oder Beladung) wird dadurch erreicht, daß das Fluid mit hohen Geschwindigkeiten im Kreislauf durch den Faser-Hohlraum geleitet wird. Ein Teil (typischerweise 20 %) des Umlaufstroms durchdringt die Hohlfaser-Membran. Ein hochspezifischer Ligand ist innerhalb der porigen Struktur der Membran immobilisiert. Während das Fluid die Membran passiert, bindet sich die gewünschte Komponente, d.h. das Ligat oder Ziel-Molekül, selektiv - und reversibel - an den Liganden; die meisten Verunreinigungen passieren ungehindert.
Nach der Adsorption des Ligats werden die Fasern mit einer Pufferlösung gewaschen, um alle ungebundenen Verunreinigungen zu entfernen. Hierbei wird die Waschlösung zunächst über den Fasermantel und sodann zurück durch den Faserhohlraum geleitet. Die gebrauchte Waschlösung wird zu einem Ablauf geleitet.
Dem Waschvorgang schließt sich ein Elutionsvorgang zum Eluieren des Produkts an. Hierbei wird eine Pufferlösung, die der Anziehungskraft des Liganden an das Produkt entweder entgegenwirkt oder mit dieser konkurriert, vorzugsweise - ohne aber darauf beschränkt zu sein - durch den Mantel und dann zurück durch den Hohlraum gespült. Wahlweise kann der Elutions-Schritt auch auf die gleiche Art und Weise wie der Beladungs-Schritt durchgeführt werden. Das Vorhandensein von Produkt wird durch eine UV-Adsorptionsspitze angezeigt; das Produkt wird in ein Aufnahmegefäß geleitet.
Nach Abschluß des Elutionsvorgangs wird die Membran mit einer dritten Pufferlösung, der die Membran in ihren Ausgangszustand zurückführt, regeneriert. Auch diese Lösung wird zunächst durch den Mantel und anschließend zurück durch den Hohlraum geleitet. Das System ist nun für den nächsten Zyklus bereit.
Die Vorrichtung ist so ausgelegt, daß Kriterien wie hoher Volumendurchsatz, hohe Zuverlässigkeit, leichte Übertragbarkeit [auf die Prozeßebene], hohe Selektivität und große Produktausbeute erfüllt werden. Der hohe Volumendurchsatz wird durch hohe Filtrat- Strömungsgeschwindigkeiten erreicht, die durch die einzigartige Eigenschaft des Membranverfahrens, nämlich dem geringen Druckabfall, insbesondere jedoch durch die im wesentlichen isotrope feinporige Hohlfaser-Membran mit Poren im um-Bereich dieser Erfindung ermöglicht werden.
Allgemein gesprochen beinhaltet diese Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung eines Affinitätstrennverfahrens wie oben definiert, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil besagten durch Einrichtung (d) austretenden Fluids aus besagtem ersten Fluid aus Einrichtung (c) stammt, und desweiteren dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran durch und durch in alle Richtungen eine im wesentlichen isotrope feinporige Struktur aufweist, mit Poren, die groß genug sind, um die Konvektionsströmung von Makromoleküle enthaltenden Lösungen durch die Membran hindurch zu gestatten.
In einer anderen Verkörperung der vorliegenden Erfindung ist die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran eine mittlere Porengröße von mindestens 0,20 um aufweist.
In noch einer anderen Verkörperung dieser Erfindung ist die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Membran eine Dicke von mindestens 200 um aufweist.
Die Grenzflächeneigenschaften der Membran dieser Vorrichtung lassen sich, allgemein gesprochen, wie folgt herleiten:
(a) Herbeiführen des Kontakts zwischen besagter Membran und einer Lösung, die ein nicht lösungsfähiges Lösungsmittel und eine Linker-Hälfte enthält, die in der Lage ist, eine kovalente Brückenverbindung zwischen besagter Membran und einem Liganden herzustellen, der eine Vielzahl von funktionellen Gruppen aufweist und der in der Lage ist, die gewünschten Grenzflächeneigenschaften darzubieten, wobei dieser Kontakt für eine Zeitspanne zu gewährleisten ist, die ausreichend lang ist, damit eine kovalente Bindung zwischen einem Kettenende des Polymers, aus dem besagte Membran besteht, und besagter Linker-Hälfte aufgebaut werden kann, um eine 'schwebende' Linker-Hälfte zu bilden;
(b) Herbeiführen des Kontakts zwischen der Membran aus Schritt (a) und einer Lösung, die ein nicht lösungsfähiges Lösungsmittel und besagten Liganden enthält, wobei dieser Kontakt für eine Zeitspanne zu gewährleisten ist, die ausreichend lang ist, damit eine kovalente Bindung zwischen einer funktionellen Gruppe von besagtem Liganden und besagter schwebender Linker-Hälfte aufgebaut werden kann, um als Produkt letztlich eine Membran zu erhalten, die hergeleitete Grenzflächeneigenschaften aufweist.
Die obengenannte Vorrichtung kann darüber hinaus eine zweite Ablaßeinrichtung zum Ableiten von besagtem ersten Fluid in ein zweites Behältnis aufweisen. Außerdem kann besagte Vorrichtung eine zweite Einrichtung zur Einleitung eines zweiten Fluids in besagte einfassende Einrichtung auf der der Einleitungsseite des ersten Fluids gegenüber liegenden Seite besagter Membran aufweisen. Ferner kann diese zweite Einrichtung zur Einleitung eine umkehrbare Pumpe sein, die in der Lage ist, ein Fluid abzusaugen oder den Abfluß besagten Fluids aus besagter einfassenden Einrichtung zu regeln. Zusätzlich kann die unter (d) genannte Ablaßeinrichtung geschlossen sein und kann besagte Membran eine Platten-Membran sein. Desweiteren kann die Platte bestehen aus: (a) Polyethersulfon als primärer hydrophoben Polymer-Komponente mit funktionalisierbaren Phenolkettenenden; (b) Hydroxyalkylcellulose mit funktionellen Hydroxyl-Gruppen; und (c) einer Linker-Hälfte, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglycol-diglycidylether, 1,4-Butandiol-diglycidylether, Epichlorhydrin und chlorsaurer Säure, wobei besagte Linker-Hälfte in der Lage ist, ein Phenolkettenende von besagtem Polyethersulfon mit mindestens einer Hydroxyl-Gruppe von besagter Hydroxyalkylcellulose kovalent zu überbrücken.
Desweiteren beinhaltet diese Erfindung das nachgenannte Verfahren zur Reinigung/Trennung eines Ligats in einem Membransystem mittels Affinität:
(a) Einleiten einer ligathaltigen Einsatzflüssigkeit auf eine porige Hohlfaser- Membran, die mit einem Liganden für besagtes Ligat gekoppelt ist, wobei besagte Einsatzflüssigkeit unter einem Druck steht, der ausreicht, um einen Teil der besagten Einsatzflüssigkeit zu veranlassen, tangential über eine Außenseite besagter Membran zu strömen und um den Rest der Flüssigkeit zu veranlassen, in besagte porige Membran einzuströmen und durch diese hindurchzuströmen, wobei sich das in besagter Einsatzflüssigkeit enthaltene Ligat an besagten Liganden anlagert und dadurch aus besagter Einsatzflüssigkeit isoliert wird;
(b) Abwaschen besagter Membran mit einer Pufferlösung;
(c) Einleiten einer Elutionslösung auf eine Seite besagter Membran unter einem Druck, der ausreichend hoch ist, um besagte Elutionslösung zu veranlassen, in besagte Membran einzuströmen und durch diese hindurchzuströmen und die Disassoziierung sämtlicher in Schritt (a) gebildeter Ligat-Ligand-Verbindungen zu bewirken, wobei jedes an besagten Liganden gebundene Ligat mittels besagter Elutionslösung eluiert wird; und
(d) Isolieren besagten Ligats in einer gereinigten Form aus besagter Elutionslösung;
dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran durch und durch und in alle Richtungen eine im wesentlichen isotrope feinporige Struktur aufweist, wobei die Poren groß genug sind, um die Konvektionsströmung von Makromoleküle enthaltenden Lösungen durch die Membran zu ermöglichen.
In einer anderen Verkörperung der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß besagte Elutionslösung auf der der Einleitungsseite der Einsatzflüssigkeit gegenüber liegenden Seite der Membran eingeleitet wird, wobei die Einspeisung unter ausreichend hohem Druck erfolgt, um besagte Elutionslösung zu veranlassen, in besagte Membran hineinzuströmen und durch diese hindurchzuströmen.
In einer weiteren Verkörperung dieser Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß besagte Pufferlösung auf der der Einleitungsseite der Einsatzflüssigkeit gegenüber liegenden Seite eingeleitet wird, wobei die Einspeisung unter ausreichend hohem Druck erfolgt, um besagte Lösung zu veranlassen, in besagte Membran hineinzuströmen und durch diese hindurchzuströmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verfahren, die angewandt werden zur Affinitätsreinigung/Trennung von Faktor VIII mit einem monoklonalen Antikörper zu Faktor VIII; Fibronektin mit Gelatine vom Schwein; Faktor IX mit monoklonalem Antikörper zu Faktor IX; und IgG mit Protein A.
Dieses Verfahren läßt sich mit verschiedenen Arten von Liganden zusätzlich zu Antikörpern durchführen, verschiedene natürliche oder synthetische Bindungsproteine eingeschlossen.
Ein bevorzugter Ligand oder ein bevorzugtes Makromolekül, der bzw. das für die vorliegende Erfindung von Nutzen ist, ist ein einkettiges multifunktionales biosynthetisches Protein, ausgedrückt durch ein einzelnes Gen, das durch rekombinante DNA-Techniken gewonnen werden kann. Das Protein beinhaltet eine biosynthetische Antikörper-Bindungsstelle (BABS - "biosynthetic antibody binding site"), die in der Lage ist, als ein Ligand zu fungieren, und die mindestens eine zur Verbindung mit einervorabbestimmten Antigen- Determinanten fähige Protein-Domäne, einen Abstandshalter ("Spacer") und eine Effektor- Region ("effector region") einschließt. Die Aminosäuresequenz des BABS-Bereichs ist homolog mit mindestens einem Abschnitt der Sequenz einer variablen Region eines Immunglobulin-Moleküls, der in der Lage ist, die vorabbestimmte Antigen-Determinante zu binden. Das Effektor-Protein besitzt eine Aminosäuresequenz, die zur selektiven kovalenten Bindung an eine Linker-Hälfte, ein anderes Makromolekül oder einen anderen Liganden oder an einen abgeleiteten Grenzflächenbereich des Membran-Polymers selbst in der Lage ist.
In einer anderen Erscheinung kann dieses multifunktionale biosynthetische Protein eine Bindungsregion aufweisen, die zwei Domänen einschließt, die über eine Polypeptid- Bindungsregion miteinander verbunden sind. Die Aminosäuresequenz jeder dieser Domänen beinhaltet einen Satz von komplementarität-determinierenden Regionen (CDRs - "complementarity determining regions"), eingebettet in einen Satz von Rahmen-Regionen (FRs - "framework regions"), von denen jede ihrerseits homolog mit mindestens einem Abschnitt der CDRs und FRs eines Immunglobulins ist. Die beiden Domänen zusammen definieren eine gemischt synthetische Bindungsstelle, die eine Spezifität für ein vorabgewähltes, durch die ausgewählten CDRs bestimmtes Antigen besitzt und die die Struktur von Fv nachahmt.
Die Polypeptid-Bindungsregion umfaßt viele peptid-gebundene Aminosäuren, die ein Polypeptid einer Länge definieren, die ausreicht, um die Distanz zwischen dem C- terminalen Ende einer der Domänen und dem N-terminalen Ende der anderen Domäne zu überspannen, wenn das Bindungsprotein eine Konformation einnimmt, die sich zur Bindung eignet. Die Bindungsregion umfaßt vorzugsweise Aminosäuren, die zusammen eine unstrukturierte Polypeptid-Konfiguration in wäßriger Lösung einnehmen. Das Bindungsprotein ist in der Lage, sich an eine vorabgewählte Antigen-Stelle, bestimmt durch die kollektive tertiäre Struktur der CDR-Sätze, die von den FR-Sätzen in der richtigen Konformation gehalten werden, zu binden.
Das Bindungsprotein kann eine Spezifität besitzen, die im wesentlichen mit der Bindungs- Spezifität des Immunglobulin-Moleküls identisch ist, das als Muster für die Auslegung der komplementarität-determinierenden Regionen (CDRs) herangezogen wurde.
In bevorzugten Erscheinungen wird die als Abstandshalter ("Spacer") in das multifunktionale Protein eingefügte Polypeptid-Sequenz zwischen der Bindungsstelle und dem zweiten Polypeptid eingefügt. Die bevorzugten Polypeptid-Abstandshalter sind cysteinfrei und beinhalten Aminosäuren. die zusammen eine unstrukturierte Konformation in wäßriger Lösung einnehmen. Die Funktion des Abstandshalters ("Spacer") besteht darin, die ungehinderte Bindungsaktivität der BABS-Domäne nach Immobilisierung auf der Membran zu fördern.
Bei dem Verfahren und der Vorrichtung dieser Erfindung kommt eine porige Membran zum Einsatz, die mit einem vorabgewählten Liganden gekoppelt ist. Eine solche Membran wird ausgehend von einem geeigneten Polymer hergestellt und ist im wesentlichen isotrop in der Größenverteilung ihrer Poren. Darüber hinaus werden die Oberflächeneigenschaften besagter Membran vorzugsweise so geändert, daß sie den gekoppelten Liganden besser unterbringen. Ein solches Verfahren zur Oberflächenänderung macht sich bevorzugterweise die funktionalisierbaren Kettenenden des Polymers zunutze. Das Verfahren wird unter heterogenen Bedingungen vorzugsweise auf einer vorgeformten Membran (z.B. Hohlfasern) durchgeführt. D.h., ist die Möglichkeit gegeben, daß es zwischen dem an der Polymer-Oberfläche verfügbaren funktionalisierbaren Polymer-Kettenende und einem Linker-Molekül, das in der Lage ist, als kovalente Brücke zu dienen, zur kovalenten Bindung kommt, dann läßt sich ein Ligand oder ein Makromolekül, der oder das in der Lage ist, die Grenzflächeneigenschaften oder Oberflächeneigenschaften des Polymers zu verändern, über im wesentlichen die gesamten Grenzen ("interfacial boundaries") des Polymers einführen. Das enthüllte Verfahren ist besonders wirkungsvoll zur Änderung von Oberflächen von aus hydrophoben Polymeren hergestellten Artikeln, wenngleich auch Materialien aus jedem anderen Polymer mit funktionalisierbaren Kettenenden gleichermaßen für eine Änderung nach denselben Verfahren empfänglich sind.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Oberflächenveränderung von Membranen, die aus hydrophoben polymeren Materialien bestehen. D.h. eine Membran aus Polyethersulfon, einem hydrophoben Konstruktionsmaterial mit wünschenswerten Verarbeitungseigenschaften und nützlichen Blockeigenschaften ("bulk properties"), das jedoch unerwünschterweise Proteine unspezifisch durch Adsorption bindet, läßt sich ableiten oder kovalent modifizieren durch Verwendung der Phenol-Endgruppen, die in jeder Polymerkette vorhanden sind. In den Fällen, wo die Polymer-Endgruppen weniger reaktiv sind, können diese Kettenenden in reaktivere funktionelle Gruppen durch ein geeignetes Reaktionsmittel umgewandelt werden (siehe z.B. die Umwandlung von endständigen Chlorid-Gruppen in endständige Hydroxyl-Gruppen in Abbildung 1). Ein brauchbarer Anteil dieser Gruppen wird an der Membranoberfläche freigelegt, und durch Herbeiführen eines engen Kontakts zwischen dieser Membran und einer Lösung, die eine Linker-Hälfte enthält, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit der Polymerketten- Endgruppe und mindestens einer funktionellen Gruppe eines Makromoleküls oder eines Liganden aufzubauen, wird die Polymer-Oberfläche für die Änderung durch die nachfolgende Einführung von besagtem Makromolekül oder Liganden, ausgewählt wegen seiner Fähigkeit, die Oberflächeneigenschaften des Blockpolymers zu verändern, empfänglich gemacht. Nachfolgende Schichten aus einer Vielzahl von Makromolekül- oder Ligand- Arten können sodann durch Wiederholung sämtlicher Verfahrensschritte kovalent angefügt werden, wenngleich auch die Verwendung einer Linker-Hälfte in diesen zusätzlichen Schichten nicht immer erforderlich ist.
Eine bevorzugte Linker-Hälfte ist ein Diepoxid, ein Epoxyhalogenid oder ein Dihalogenid, und die Makromolekül-Art oder Ligand-Art kann eine hydrophile oder hydrophobe synthetische oder natürliche polymere Substanz oder sogar auch eine Verbindung mit geringem Molekulargewicht sein. Biologisch aktive Proteine, Polypeptide und Polynukleotide können auf gleiche Weise ebenso kovalent an die Polymer-Oberfläche gebunden werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner die einzigartigen Eigenschaften einer Vierkomponenten-Formmassen-("Dope-")Zusammensetzung, die thermische Phasenumkehrungsgrenzen bei der sogenannten unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST - "lower critical solution temperature") sowie bei der sogenannten oberen kritischen Lösungstemperatur (UCST - "upper critical solution temperature") zeigt. Diese Eigenschaften werden bei einem Herstellungsverfahren ausgenutzt, das ein temperaturgeregeltes Nichtlösungsmittel-Quenchbad nutzt, um das temperaturabhängige Phänomen der Phasenumkehrung einzuleiten und um die resultierende Struktur "einzufrieren" oder auszufällen und zu erhalten.
In Verbindung mit dem vorgestellten Verfahren der Herstellung von anisotropen sowie isotropen Platten- oder Hohlfaser-Membranen beschreibt die vorliegende Erfindung desweiteren eine verbesserte Spinndüsen-Baugruppe bestehend aus zwei unabhängigen konzentrischen Ringräumen um eine mittige Bohrung, welche optional einen auswechselbaren Hohldorn enthält. Diese verbesserte Spinndüse, die mit Hilfe einer Einrichtung zur Erwärmung von außen auf einer gewünschten Temperatur gehalten werden kann, ist so ausgelegt, daß sie drei separate Einlaßöffnungen zur Regelung des Durchflusses von drei separaten Fluids beherbergen kann: nämlich einer Spinnlösung, einem Innenring-Fluid und einem Außenring-Fluid. Die Auslegung dieser verbesserten Spinndüse ist recht einfach und wirtschaftlich und bedarf keiner tangentialen Einlaßöffnungen.
Die Möglichkeit, das Außenring-Fluid über die äußere Oberfläche einer stranggepreßten Hohlfaser zu leiten, erlaubt under anderem die Herstellung von Hohlfaser- Membranen mit einer im wesentlichen isotropen feinporigen Struktur in allen Richtungen durch die gesamte Membran. Wie im weiteren noch enthüllt wird, lassen sich anhand der Verfahren der vorliegenden Erfindung auch andere Membranstrukturen (z.B. mit Außenhaut, mit doppelter Außenhaut, anisotropisch) realisieren.

4.0 Kurzbeschreibung der Abbildungen

Die ABBILDUNG 1 zeigt die bevorzugte für die Aufbereitung kleiner Mengen ausgelegte und unter nichtsterilen Bedingungen betriebene membrangestützte Affinitätstrennvorrichtung einschließlich Pumpeneinrichtung, Ventileinrichtung, Rohrleitungen und Lösungen, mit Angaben zu den Material-Strömungsrichtungen durch die Vorrichtung.
Die ABBILDUNG 2 zeigt die bevorzugte für die Aufbereitung großer Mengen ausgelegte membrangestützte Affinitätstrennvorrichtung einschließlich Pumpeneinrichtung, Ventileinrichtung, Rohrleitungen und Lösungen, mit Angaben zu den Material-Strömungsrichtungen durch die Vorrichtung.
Die ABBILDUNG 3 zeigt Schritte des membran-vermittelten Affinitäts- Trenn-/Reinigungsverfahrens, wo die Membran als Hohlfaser-Membran ausgeführt ist.
Die ABBILDUNG 4 zeigt ein groß ausgelegtes System für den Betrieb unter sterilen Bedingungen, wo das System stets unter positivem Druck gefahren wird, Pufferlösungen über sterilisierende Filter in Sammelbehälter geleitet werden und die Vorrichtung durch Bedampfung ("steamed-in-place") sterilisiert werden kann.
Die ABBILDUNG 5 zeigt die Verhältnisse der berechneten Translumen/Transmembran-Druckabfälle als eine Funktion der wirksamen Faserlänge.
Die ABBlLDUNG 6 zeigt eine Versuchseinrichtung, die zur Reinigung/Isolierung von Fibronectin aus Blutplasma anhand des Platten-Affinitätsmembranverfahrens sowie zur Bestimmung des Wirkungsgrades der Auffangens von humanem IgG aus einer schwachen Lösung eingesetzt wird.
Die ABBILDUNG 7 zeigt die Ergebnisse der Reinigung/Isolierung von Fibronectin aus Blutplasma mittels einer Platten-Affinitätsmembran.
Die ABBILDUNG 8 zeigt ein 'SDS PAGE'-Gel, eingesetzt zur Bestimmung der Fibronectin-Reinheit und des Abreicherungsgrades von mittels einer Affinitätsmembran aufbereitetem Blutplasma.
Die ABBILDUNG 9 zeigt die Versuchsergebnisse der Kreisführung eines protein- A-aktivierten Hohlfaser-Affinitätsmembranmoduls, das zur Isolierung eines monoklonalen Antikörpers von der Maus aus Zellkultur-Überstand eingesetzt wurde.
Die ABBILDUNG 10 zeigt ein Phasenzustandsdiagramm für eine Vierkomponenten-PES/PE-Spinnmasse.
Die ABBILDUNG 11 zeigt eine Spinndüse (kompl.) in schematischer Darstellung.
Die ABBILDUNG 12 zeigt eine alternative Verkörperung der Doppelring- Koextrusions-Spinndüse.
Die ABBlLDUNG 13 zeigt anhand einer Grafik das bei der Faserherstellung zur Anwendung kommende Verhältnis Wasserdurchlässigkeit zu Außenring-Durchsatz.
Die ABBILDUNG 14 zeigt in schematischer Darstellung eine nach einem Muster aufgebaute, für ein multifunktionales biosynthetisches Protein codierende DNA-Sequenz bestehend aus einem Anführer-("Leader"-)Peptid (als Expressionshilfe, wird anschließend gespalten), einer Bindungsstelle, einem Abstandshalter ("Spacer") und einem Effektor- Molekül, angehängt als Nachläufer-("Trailer"-)Sequenz.
Die ABBILDUNG 15 beschreibt ein multifunktionales Protein (und die dieses Protein codierende DNA), das aus einer einkettigen BABS (biosynthetischen Antikörper- Bindungsstelle) mit Spezifität für monoklonalen Antikörper 26-10 von der Maus, verknüpft über einen Abstandshalter ("Spacer") mit dem FB-Fragment von Protein A, hier als eine Anführer-Sequenz ("Leader") fusioniert, besteht und das eine Bindungsstelle für Fc darstellt. Das Abstandssegment beinhaltet die 11 C-terminalen Aminosäuren des FB gefolgt von Asp-Pro (einer Spaltstelle für eine schwache Säure). Die einkettige BABS umfaßt Sequenzen, die VH und VL 'nachahmen'. Das konstruierte VL-Gebilde ist an Rest 4 geändert, wo das in der elterlichen 26-10-Sequenz vorhandene Methionin durch Valin ersetzt wurde. Die Aminosäuresequenz des Expressions-Produkts beginnt nach der GAATTC-Sequenz, die für eine EcoRI-Spaltstelle kodiert, in der Zeichnung übersetzt mit Glu-Phe. Dieses konstruierte Gebilde beinhaltet Bindungsstellen sowohl für Fc als auch für Digoxin. Seine Struktur läßt sich wie folgt zusammenfassen:
FB-Asp-Pro-VH-(Gly&sub4;-Ser)&sub3;-VL,
worin (Gly&sub4;-Ser)&sub3; für eine Polypeptid-Bindungsregion steht. Es läßt sich in der Vorrichtung und in dem Verfahren dieser Erfindung zur affinitäts-chromatographischen Reinigung von Digoxin verwenden.
Die ABBILDUNG 16A ist ein Schaubild, das den Prozentsatz der maximal ausgezählten Bindungen von radioiodiertem Digoxin im Verhältnis zur Konzentration des auf der Platte gebundenen Bindungsproteins zeigt, und zwar durch vergleichende Gegenüberstellung der Bindung von nativem 26-10 (Kurve 1) und der Bindung des konstruierten Gebildes aus Abbildung 15, renaturiert anhand zweier unterschiedlicher Verfahren (Kurven 2 und 3). Die ABBILDUNG 16B zeigt anhand eines Schaubildes die Bifunktionalität der FB-(26-10)BABS, deren Haftung an Mikrotiter-Platten auf der spezifischen Bindung der Bindungsstelle mit der Digoxin-BSA-Beschichtung der Platte beruht. Die ABBILDUNG 16B zeigt die Hemmung (in Prozent) der Ankopplung von ¹²&sup5;I-markiertem IgB vom Kaninchen an die FB-Domäne der FB-BABS durch die Zugabe von IgG, Protein A, FB, IgG2a von der Maus und IgG1 von der Maus.

5.0 Ausführliche Beschreibung der Erfindung

5.1 Allgemeine Beschreibung der Vorrichtung

Allgemein gesprochen beinhaltet diese Erfindung eine Vorrichtung, mit der sich ein Affinitätstrennverfahren zur Abtrennung von Ziel-Molekülen aus einem Einsatzstrom durchführen läßt. Ein Ligand mit Spezifität für das Ziel-Molekül oder Ligat ist fest an eine in dieser Vorrichtung befindlichen Membran gekoppelt. Die Kapazität der Vorrichtung für das Ziel-Molekül ergibt sich aus der Membrangeometrie, den Membraneigenschaften sowie dem Bindungswirkungsgrad des mit der Membran verbundenen Liganden. Die Vorrichtung verfügt vorzugsweise über getrennte Kammern auf beiden Seiten der Membran, wodurch eine einsatzseitige sowie eine filtratseitige Kammer definiert ist. Ein bevorzugter Prozeß zur Durchführung einer Affinitätstrennung in der Vorrichtung beginnt mit der Einleitung eines ersten das Ziel- oder Ligat-Molekül enthaltenden Fluids durch die Beschickungskammer der Membranvorrichtung. Ein spezifiziertes Volumen des Einsatzfluids durchdringt die Membran mit einer Strömungsgeschwindigkeit, die ausgehend von der Kapazität der Membranvorrichtung für das Ziel-Molekül bestimmt und von der Filtrat-Pumpe geregelt wird. Als nächster Verfahrensschritt zur Rückgewinnung des membrangebundenen Ziel- Moleküls folgt das Auswaschen der Filtratkammer der Vorrichtung mit einer Pufferlösung mit nachfolgendem Auswaschen der Membranstruktur und der Beschickungskammer. Die Filtratkammer wird mit Elutionsmittel gespült, und anschließend wird das Ziel-Molekül aus der Membranstruktur eluiert, vorzugsweise in die Beschickungskammer und aus der Vorrichtung heraus. Die Membranvorrichtung wird sodann mit einer Regenerations- Pufferlösung wieder ins Gleichgewicht gebracht, indem zunächst die Filtratkammer und anschließend die Membran und die Beschickungskammer gespült werden.
Vorzugsweise führt die Vorrichtung das Trennverfahren automatisch in wiederholten schnellen Zyklen durch. Die Membran der Trennvorrichtung besteht aus im wesentlichen isotropem feinporigem Membranmaterial, an das ein Ligand mit Spezifität für die Ziel-Moleküle gekoppelt ist. Die Vorrichtung ist ausgestattet mit Pumpen und Ventilen, die von einem Mikroprozessor angesteuert werden, und sie ist in ihrem Betrieb so programmiert, daß sie einen Zyklus mit den folgenden Schritten durchläuft: Beladen der Membran mit dem das Ziel-Molekül, z.B. ein Protein, enthaltenden Einsatzstrom, Waschen zur Entfernung von verbleibenden Verunreinigungen, Eluieren zur Gewinnung des Ziel- Moleküls und abschließend Regenerieren der Membran. Das das Ziel-Molekül enthaltende Fluid wird mit Hilfe einer Speisepumpe aus einem Behältnis und durch die Beschickungskammer der Vorrichtung im Kreislauf gepumpt. Ein Teil des Einsatzfluids durchdringt dabei die Membran - mit einer von einer Filtrat-Pumpe in Entsprechung mit der Geometrie der Vorrichtung und den Membraneigenschaften gesteuerten Durchflußgeschwindigkeit -,so daß das Ziel-Molekül von der Membran zurückgehalten werden kann. Die Filtratkammer wird sodann mit einem Elutionsmittel gespült, und anschließend wird das Ziel-Molekül durch Elution von dem membrangebundenen Liganden abgetrennt. Die Membranvorrichtung wird abschließend mit einer Regenerations-Pufferlösung wieder ins Gleichgewicht gebracht, wobei zunächst die Filtratkammer und anschließend die Membran und die Beschickungskammer gespült werden.
Die Übertragbarkeit [auf die Prozeßebene] wird wiederum durch die einzigartige Auslegung der Membran erleichtert. Das System wächst direkt mit dem Membranvolumen und dem Ligandengehalt. Der Betrieb läßt sich durch Maximierung der Automatisation des Prozesses vereinfachen.

5.2 Allgemeine Beschreibung des Affinitäts- Membranverfahrens zur Protein-Reinigung

Ein affinitätsmembran-vermitteltes Trenn-/Reinigungsverfahren zur Protein- Reinigung umfaßt vier grundlegende Prozeßschritte (Abbildung 3). Eine Hohlfaser-Affinitätsmembran-Trennvorrichtung enthält Hunderte oder Tausende von Fasern, die zu einem langen Bündel ("Cluster") innerhalb des Moduls oder Behältnisses zusammengefaßt sind. (1) Eine das Ziel-Protein enthaltende Einsatzlösung wird mit dem immobilisierten Affinitäts-Liganden in engen Kontakt gebracht, indem die Einsatzlösung durch die Poren der Membran hindurchgepreßt wird. Während die Einsatzlösung die Membran passiert, lagert sich das Ziel-Protein vorzugsweise an den gebundenen Liganden an den Porenwänden an (Absorption). Die Beladung kann in einem Durchgang erfolgen, wobei das Filtrat, von Ziel-Protein abgereichert, weggeschüttet wird; sie kann jedoch auch in mehreren Durchgängen erfolgen, wobei der Filtratstrom mit der AffinitätsMembran mehr als einmal in Kontakt gebracht wird. Der Beladungsschritt kann entweder im Gegenstrom- Verfahren, bei dem die Einsatzlösung im Kreislauf auf einer Seite der Membran gepumpt wird und ein Teil der Einsatzlösung die Membran passiert, oder im Durchlauf-Verfahren durchgeführt werden, bei dem der gesamte Einsatzstrom von einem Ende aus durch die Membranwand geleitet wird. (2) Ein oder mehrere Waschvorgänge zur Entfernung nichtspezifisch adsorbierter Proteine. Dieser Schritt kann entweder in Vorwärtsrichtung (d.h. die Strömungsrichtung entspricht der Konvektionsrichtung der Einsatzlösung durch die Membranwände) oder in Rückwärtsrichtung (d.h. Rückspülung -"Backflushing") durchgeführt werden. (3) Ein Elutionsmittel wird durch die Membran geschickt, wodurch die Ablösung des Ziel-Proteins von dem immobilisierten Affinitäts-Liganden bewirkt wird. Das in dem Eluat vorliegende Ziel-Protein wird im allgemeinen in gereinigter, konzentrierter Form gewonnen. (4) Eine Regenerationslösung wird zur Entfernung von restlichem Elutionsmittel eingesetzt, wodurch die Membran in einen Zustand zurückversetzt wird, der für die Bindung des Ziel-Proteins an den immobilisierten Liganden in einem nachfolgenden Zyklus förderlich ist. Wie im Falle des Waschvorgangs kann in den Schriften (3) und (4) der Fluidstrom sowohl in Vorwärtsrichtung als auch in Rückwärtsrichtung gerichtet sein.
In einer bevorzugten Verkörperung ist das Affinitätsmembransystem ein Hohlfaser- Modul, das in einem automatisierten, mikroprozessorgesteuerten System mit Pumpen auf der Beschickungs- und der Filtratseite und einer Reihe von Ventilen zur Steuerung der Durchflußmenge und -richtung des Fluidstroms angeordnet ist. In einem typischen Reinigungszyklus erfolgt die Beladung nach dem Querstrom-Verfahren mit einer Umlaufrate von 30 bis 100 Systemvolumina pro Minute und einer Filtrationsrate von 1 bis 20 Systemvolumina pro Minute. Die für diesen Schritt erforderliche Zeit hängt von der Ziel-Protein- Bindungskapazität des Systems, der Titer-Zahl des Ziel-Proteins in der Einsatzlösung und der Filtrationsrate ab. Typische Beladungszeiten liegen zwischen einer Minute und zwanzig Minuten.
Jeder Waschvorgang erfolgt typischerweise in zwei Stufen, wobei die erste Stufe dazu dient, das restliche Filtrat von der Mantelseite des Systems abzuspülen, und die zweite Stufe dazu dient, die Membran vom Mantel zum Hohlraum hin zu waschen (d.h. Rückspülung - "Backflushing"), um die nichtspezifisch adsorbierten Proteine zu entfernen und um Partikel in der Hohlraumseite der Membranwand zu lösen. Die Zeiten je Waschvorgang liegen zwischen 15 Sekunden und fünf Minuten, wobei auf das Waschen des Mantels und auf das Waschen des Hohlraums typischerweise 15 bzw. 60 Sekunden aufgewandt werden; die Durchflußvolumina liegen typischerweise bei 1 bis 20 Systemvolumina pro Minute. Die Wasch-Pufferlösungen werden nach dem Passieren des Membransystems im allgemeinen dem Ablauf zugeleitet und abgelassen.
Der Elutionsvorgang erfolgt auf ähnliche Weise wie die Waschvorgänge, d.h. in zwei Stufen, mit der Ausnahme jedoch, daß das eluierte Produkt in einen Produkt- Sammelbehälter geleitet wird. Die Durchflußrate beim Elutionsvorgang beträgt typischerweise 1 bis 20 Systemvolumina pro Minute, die Zeit beträgt typischerweise 1 bis 10 Minuten.
Der Regenerationsvorgang erfolgt auf dieselbe Weise wie die Waschvorgänge, nämlich in zwei Stufen: Regeneration von Mantel und Hohlraum, wobei die verbrauchte Regenerations-Pufferlösung im allgemeinen dem Ablauf zugeleitet und abgelassen wird. Die Zeiten und die Durchflußraten des Regenerationsschritts liegen im allgemeinen in der gleichen Größenordnung wie die Waschvorgänge.
Typische Zykluszeiten für den oben skizzierten Affinitäts-Trenn-/Reinigungsprozeß liegen zwischen zehn und sechzig Minuten.
In einer weiteren Ausführungsart eines Affinitätsmembranverfahrens ist die Affinitätsmembran Protein A und ist das Ziel-Protein ein monoklonaler Antikörper von der Maus, wie er in unreiner Form in Zellkultur-Überstand, Maus-Aszitesflüssigkeit oder einem aus Zellkultur-Überstand oder Aszitesflüssigkeit gewonnenen Fluid enthalten ist. Die Protein A enthaltende Affinitätstrennvorrichtung wird zunächst mit monoklonalem Antikörper beschickt. Das Waschen erfolgt mit einer gepufferten Lösung mit annähernd neutralem pH-Wert. Typische zum Waschen eingesetzte Puffer sind unter anderem phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PSB) mit pH 8,0 und 1,5 M Glycin, 3 M NaCl mit pH 8,9. Die Elution des Produkts erfolgt mit einer sauren gepufferten Lösung wie z.B. 0,1 M Citrat pH 3,0. Die Regenerationspuffer entsprechen typischerweise denen, die zum Waschen eingesetzt werden.

5.3 Modifizierte Membranen, die in der Vorrichtung zum Einsatz kommen sowie Verfahren zur Herstellung solcher Membranen

Das Membran-Modifizierungsverfahren dieser Erfindung nutzt die funktionalisierbaren Kettenenden, die in praktisch jedem Polymermaterial vorliegen. Dieses Verfahren sorgt dafür, daß die Vorbehandlung von geeigneten hydrophoben Polymer-Proben unter heterogenen Bedingungen mit Linker-Hälften, die zur Knüpfung einer kovalenten Bindung mit den hydrophoben Polymer-Endgruppen fähig sind, die Modifizierung der Oberflächeneigenschaften des Polymers unter Aufrechterhaltung wünschenswerter Blockeigenschaften ("bulk properties") gestattet. Anhand der Verfahren der vorliegenden Erfindung lassen sich die Oberflächeneigenschaften von jeden aus dem betreffenden Polymer gefertigten Artikel ändern unter Aufrechterhaltung der Gestalt und Mikrostruktur des gefertigten Artikels. D.h., Blockpolymere mit funktionalisierbaren Endgruppen können unter heterogenen Bedingungen abgeleitet oder geändert werden, ungeachtet dessen, ob das Polymer in Pulverform, in Form einer stranggepreßten Faser, einer feinporigen Membran, einem festen Streifen, als Rohr geformt, oder eingebettet in einem künstlichen Organ, in Haut oder in einer prosthetischen Vorrichtung vorliegt. Ein solcher Artikel kann anhand von Verfahren hergestellt sein oder werden, die Stand der Technik und somit bekannt sind. Beispiele für solche Herstellungsverfahren sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, Spritzgießen, Formpressen, Blasformen, Blasen, Kalandrieren, Gießen, Beschichten, Formen, Laminieren oder Strangpressen.
Desweiteren wird ein Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen isotropen feinporigen Membranen offenbart, das sich die besonderen Eigenschaften einer einzigartigen Vierkomponenten-Formmasse ("Dope") und eine verbesserte Doppelring- Mehrstrang-Spinndüse zunutze macht.

5.3.1 Aspekte der Membran- und Modulauslegung

Die Entwicklung einer membrangestützten Affinitäts-Trenn-/Reinigungsvorrichtung, die den Anforderungen der absteigenden Aufbereitung gerecht wird, erfordert einen einheitlichen Ansatz bei der Hohlfaser-Entwicklung und Modul-Auslegung.
Die wichtigsten Membran- und Vorrichtungs-Eigenschaften, die bei der Auslegung einer Hohlfaser-Affinitätstrennvorrichtung zu berücksichtigen sind, sind:
(i) translumenaler Druckabfall (ΔPTL) als eine Funktion der Modullänge;
(ii) ΔPTL im Verhältnis zum transmembranen Druckabfall ΔPTM;
und
(iii) Wanddicke und spezifische Oberfläche in einem gegebenen Volumen der Membranwand.
Der translumenale Druckabfall läßt sich ganz klar dadurch minimal halten, daß man Hohlfasern mit allmählich größer werdendem Innendurchmesser (ID) herstellt. Die nachgenannten Nachteile ergeben sich in Verbindung mit diesem Ansatz:
1. In einem gegebenen Mantelvolumen lassen sich weniger Fasern unterbringen; darunter würde die Liganden-Beladungskapazität des Systems leiden.
2. Zur Unterbringung der höheren Anzahl Fasern, die zur Aufrechterhaltung der vorabbestimmten Liganden-Beladungskapazität erforderlich wären, müßte ein größeres Mantelinnenvolumen vorgesehen werden, wodurch sich sowohl das mantelseitige als auch das hohlraumseitige Totvolumen erhöhen würde.
3. Fasern mit einem kleinen Wanddicke/Außendurchmesser-Verhältnis (d/AD) nehmen leicht körperlichen Schaden (z.B. Zusammenbruch der Faser während des Backflushing (Rückspülung)), wie es z.B. bei Fasern mit großem Innendurchmesser und dünner Wanddicke der Fall wäre.
4. Der heutige Stand der Hohlfaser-Spinntechnik (basierend auf einem Nichtlösungsmittel-Koagulations-Ansatz) erlaubt nicht die Herstellung von Fasern mit Wanddicken von weit über 100 um, ohne daß starke Widerstände, und zwarsowohl in der Matrix als auch auf der Außenseite der Faser, erwachsen.
Die Vorstellung einer dickwandigen Faser mit einem großen Innendurchmesser ist von großer Tragweite für die Modul-Auslegung. Die Abbildung 5 veranschaulicht, beispielsweise, die Entwicklung des Verhältnisses zwischen translumenalem und transmembranem Druckabfall als eine Funktion der Faserlänge bei verschiedenen Wandstärken für einen Faser-Durchmesser von 1.000 um. Eine Abnahme des ΔPTL/ΔPTM- Verhältnisses mit zunehmender Wandstärke bedeutet eine Verbesserung der Gleichförmigkeit der transmembranen Strömungen über die Länge des Moduls.
Ein anderer Vorteil von dickwandigen Fasern ist die Tatsache, daß für ein gegebenes Membran-Gesamtvolumen und eine gegebene Packdichte das Totvolumen mit zunehmender Wanddicke abnimmt.
Die nichtlineare Abnahme des Totvolumens mit zunehmender Wanddicke nähert sich über 300 um einem Punkt zurückgehender Gewinne (z.B. bei einem Innendurchmesser von 1000 um). Das Nettoergebnis dieser Überlegungen bei der Modul-Auslegung ist ein System, in dem das wandseitige Volumen nur um einen Faktor von 2 größer als das hohlraumseitige Volumen ist.
Die Morphologie und Isotropie von feinporigen Membranen sind kritisch für die Leistung von Hohlfasern, die bei Affinitätsreinigungsverfahren eingesetzt werden. Von Porengrößen in dem Bereich von 0,22 um bis einigen um wird nicht erwartet, daß sie Protein-Moleküle heraussieben/herausfiltern können. Membranen mit Poren dieses Größenbereichs werden auf Grund ihrer Fähigkeit, Feststoffteilchen zurückzuweisen, üblicherweise als Mikrofilter (MF) eingestuft.
Jede bedeutende Porengrößenstreuung (d.h. Anisotropie oder Asymmetrie) innerhalb der Membranwand kann zu einem Einschluß von Material und somit zur Verstopfung führen. Da von einer brauchbaren Affinitäts-Hohlfaser gefordert werden kann, daß sie reproduzierbar über mehrere hundert Zyklen arbeitet, um rentabel zu sein, sollte die Möglichkeit einer Membranverstopfung ausgeschlossen werden. Desweiteren sollte die strukturelle (und chemische) Integrität der Membran dergestalt sein, daß es während wiederholter Zyklusdurchläufe nicht zu Totalausfällen kommt.
Neben einer Verringerung der Verstopfungswahrscheinlichkeit ermöglicht die Isotropie den Fluids, in jeder Richtung durch die Membran frei und ungehindert zu strömen. Auf Grund ihres einheitlichen Widerstandes würden Membranen dieses Typs eine Strömung in der Betriebsart Rückspülung (Backflushing) weniger behindern als eine Membran mit Außenhaut. Ultrafilter weisen immer eine Außenhaut auf und hätten nur eine geringe Standzeit, wenn sie so eingesetzt würden.
Da die Porengröße zunimmt (d.h. von Ultrafiltrations-(UF-)Membranen zu Mikrofiltrations-(MF-)Membranen), nimmt die Innenoberfläche zwangsläufig ab. Jedoch haben Mikrofilter den Vorteil eines hohen Volumenflusses bei geringem transmembranen Druck und zeichnen sich durch eine viel geringere Verschmutzungs- und/oder Verstopfungswahrscheinlichkeit aus. Aus diesen Gründen ist eine isotrope feinporige Hohlfaser vom Mikrofiltertyp eine äußerst wünschenswerte Membran für Affinitäts-Reinigungs-Anwendungen.

5.3.2 Modifizierung von hydrophoben Polymer-Oberflächen

Fast alle bekannten Polymere weisen mindestens eine funktionelle Endgruppe auf, die ursprünglich in dem Monomer-Precursor vorliegt oder die durch den Polymerisationsprozeß eingefügt wird. Dementsprechend finden sich bei Poly(ethylenoxid) endständige Hydroxyl-Gruppen, bei Polyethersulfine ein Halogenid an einem Ende und ein substituiertes Phenol an dem anderen Ende, bei Polyimiden endständige Carboxyl- und Amino- Gruppen und bei Polyester endständige Carboxyl- und Hydroxyl-Gruppen, um nur einige wenige Polymere zu nennen. Darüber hinaus enthalten Polymere, die durch radikalische Polymerisation hergestellt werden, ein funktionalisiertes Initiator-Fragment an einigen der Polymerkettenenden. Ein Vinylhalogenid, beispielsweise, das in Gegenwart von Azobis(isobutyronitril) polymerisiert würde, würde eine tertiäre Nitril-Gruppe in einigen der Kettenenden enthalten. Der Anteil der das Initiator-Fragment tragenden Polymerketten läßt sich durch Änderung der Zusammensetzung des Ausgangs-Monomer/Initiator-Gemischs oder der Polymerisationsbedingungen steuern.
Das Modifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung ist auf die funktionalisierbaren Gruppen ausgerichtet, die an den Polymerkettenenden vorliegen. Desweiteren findet die vorliegende Erfindung ihren größten Nutzen in der Ableitung von hydrophoben synthetischen Homopolymeren, Copolymeren oder Blends mit relativ inerten Monomer- Einheiten in dem Polymer-Gerüst. Diese Polymertypen werden im allgemeinen durch schrittweise Polymerisation, durch als Kettenreaktion ablaufende radikalische Polymerisation, durch als Kettenreaktion ablaufende, durch Ionen eingeleitete Polymerisation, durch Ringöffnungs-Polymerisation oder durch durch Ziegler-Natta-Katalysatoren eingeleitete Polymerisation hergestellt und werden im allgemeinen als vollständig inert und unzugänglich für eine Derivatisierung oder Modifizierung durch die milden Bedingungen, die in dieser Erfindung offenbart werden, angesehen. Beispiele für solche Polymere sind, ohne sich jedoch auf diese zu beschränken Polysulfone, Polyethersulfone, Polyimide, Poly(arylenoxid), Polyarylensulfid, Polyquinoxalin, Polysilan, Polysiloxan, Polyurethane, Poly(etheretherketone), Polycarbonate, Polyester, Poly(vinylhalogenide) und Poly(vinyliden-polyhalogenide) sowie Derivate, Blends, Gemische oder Copolymere derselben.
Desweiteren gilt, daß, wenngleich auch nur eine funktionalisierbare Endgruppe in einer Polymerkette vorhanden zu sein braucht, sich die Anzahl der verfügbaren Gruppen durch chemische Umwandlung von inhärent weniger reaktiven oder weniger brauchbaren Endgruppen in brauchbarere Funktionalitäten erhöhen läßt. Endständige Nitril-Gruppen, beispielsweise, eingeführt durch die mittels nitrilhaltiger Initiatoren eingeleitete radikalische Polymerisation, können mit Hilfe einer großen Vielzahl von in der Praxis verfügbaren Reduktionsmitteln zu Aminen reduziert werden. Metallhydrid-Reagenzien, zum Beispiel, eignen sich hierfür. Aromatische Halogenid-Gruppen von Polyarylsulfonen können durch Aufbereitung mit einer wäßrigen Base in Aryloxy-Gruppen umgewandelt werden. Ebenso lassen sich Isocyanat-Gruppen von Polyurethanen in Amine umwandeln. Auf diese Weise läßt sich die Anzahl brauchbarer Endgruppen erhöhen, ohne die Integrität des Polymer- Gerüsts anzutasten.
Außerdem hat man festgestellt, daß eine Vorbehandlung von Polymer-Proben oder daraus gefertigten Artikeln durch Waschen oder Erwärmen der Proben in wäßrigen oder nichtlösungsfähigen organischen Lösungsmitteln den Wirkungsgrad der nachfolgenden Derivatisierungsschritte erhöht. Da man es nicht einfach bei der Theorie belassen will, geht die Vermutung dahin, daß die Polymer-Schnittstelle oder die Oberfläche des gefertigten Artikels möglicherweise mit Fremdpartikeln oder Verarbeitungshilfsmitteln verschmutzt ist, die die funktionalisierbaren Endgruppen abschirmen. Das Waschen der Polymer-Proben kann ein einfaches Mittel sein, um diese Schmutzpartikel mechanisch zu entfernen und mehr von den an der Oberfläche oder den Grenzflächengrenzen vorliegenden Polymerkettenenden freizulegen. Bevorzugte organische Lösungsmittel sind u.a. Acetonitril und Isopropanol. Ebenso können wäßrige Lösungen dieser Lösungsmittel verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsart dieser Erfindung werden feinporige Platten-Membranen, die Polyethersulfon (PES) als primäre oder Blockpolymerkomponente beinhalten, über Nacht bei Raumtemperatur in eine basische wäßrige Lösung eingetaucht, die eine Diepoxid-Linker-Hälfte enthält. Wahlweise können die Membran- Proben durch Erwärmung in wäßrigen Lösungen oder durch Waschen in Acetonitril oder Isopropanol vorbehandelt werden. Die an der Membranoberfläche freigelegten substituierten Phenol-Gruppen der PES-Keftenenden werden durch die Base deprotoniert, was eine nucleophile Phenoxid-Gruppe liefert. Dieses Nukleophil greift eine Epoxid-Gruppe der Linker-Hälfte an, die eine kovalent (d.h. über eine Ether-Bindung) gebundene Linker-Hälfte bildet. Weil die kovalent gebundenen Linker-Hälften in der Lage sind, mindestens eine weitere kovalente Bindung (z.B. über eine zweite Epoxid-Gruppe) mit einer anderen chemischen Einheit einzugehen, kann nun irgend ein Molekül, Makromolekül oder Ligand an die Membranoberfläche kovalent gebunden werden. Das kovalent gebundene Makromolekül wird auf diese Weise sehr gut festgehalten und läßt sich nicht durch Waschen oder auf andere mechanische Weise entfernen.
Die Linker-Hälfte, dies ist klar, dient dazu, eine Brückenbindung zwischen verfügbaren funktionalisierbaren Polymerkettenenden und in dem Makromolekül der Wahl vorliegenden funktionellen Gruppen herzustellen. Das Verbindungsglied kann also vorzugsweise jedes beliebige polyfunktionale organische Molekül sein, wie z.B. aliphatische oder aromatische Verbindungen mit Epoxid-, Carbonyl-, Carboxyl-, Amino-, Halo-, Hydroxyl-, Sulfonylhalogeniden, Acylhalogeniden, Isocyanat oder Kombinationen aus diesen oder anderen funktionellen Gruppen, solange die Linker-Hälfte stabil, kompatibel und zur Bildung von kovalenten Bindungen mit dem Blockpolymer-, Makromolekül- oder Ligandentyp in der Lage ist. Diese Linker-Hälfte kann sogar anorganische Funktionalität beinhalten, wie z.B. Silizium, Bor, Aluminium, Zinn, Phosphor, Schwefel oder Stickstoff-Gruppen. Auch die Verwendung anderer, z.B. Silikate, Aluminate, Borate, Stannate, Phosphate oder Sulfonate enthaltenden Varianten als primäre überbrückende Gruppe fällt in den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Bevorzugte Ausführungsarten der Linker-Hälfte sind jedoch Ethylenglycol-diglycidylether (EGDGE), 1,4-Butandiol-diglycidylether, Epichlorhydrin, aliphatische Dihalogenide, zweibasige Säuren, zweibasige Säurehalogenide, Disulfonylhalogenide und Triazine.
Wie oben bereits erwähnt, sollte der zur Modifizierung der Membranoberfläche oder, allgemeiner ausgedrückt, irgend einer hydrophoben Polymer-Oberfläche ausgewählte Makromolekül- oder Liganden-Typ vorzugsweise in der Lage sein, die Oberflächeneigenschaften des hydrophoben Polymers, der hydrophoben Membran oder des hydrophoben Artikels zu ändern, und mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit der Linker-Hälfte einzugehen. In einigen Fällen kann schon eine Art von Funktionalität ausreichen. Die -OH-Gruppen von Hydroxyethylcellulose (HEG), beispielsweise, verleihen der hydrophoben Membranoberfläche Hydrophilie und bilden zugleich Ether-Bindungen mit den schwebenden Epoxid-Gruppen des kovalent gebundenen Ethylenglycol-diglycidylether (EGDGE). Abhängig von der letztlichen Anwendung kann das Makromolekül somit aus Molekülen mit geringem Molekulargewicht, Oligomeren mit mittlerem Molekulargewicht oder polymeren Substanzen mit hohem Molekulargewicht zusammengesetzt sein. Das Makromolekül hat vorzugsweise ein hohes Molekulargewicht und kann u.a. oberflächenaktive Stoffe, Kohlenhydrate, Lektine, Polypeptide Polysaccharide, Liposome, Proteine, Glycoproteine, Oligonucleotide synthetische Farbstoffe, natürliche Farbstoffe, Polynucleotide sowie Derivate oder Gemische daraus enthalten. Moleküle oder Polymere, die in der Lage sind, eine Ladung zu tragen, entweder kationisch oder anionisch, oder solche, die nichtionisierbare Gruppen tragen, sind ebenso brauchbar. Ein Teil der grundlegenden Prozesse dieser Erfindung sind in der Abbildung I schematisch dargestellt.
Bevorzugte makromolekulare Typen sind u.a. Polysilane, Polysiloxane Hydroxyalkylcellulose, Dextran, Carboxymethylcellulose Poly(ethylenimin), Poly(carboxymethylethylenimin) Poly(vinylalkohol) sowie Derivate, Blends, Gemische oder Copolymere daraus. Die Makromoleküle können auch biologisch wichtige Makromoleküle sein und können u.a. monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Antigen- Substanzen, Enzyme, Träger-Proteine Koagulationsfaktoren Cofaktoren, Inhibitoren, Hormone, Immunglobuline Histone, Plasmide sowie Derivate oder Gemische daraus sein.
Es sollte klar sein, daß der Prozeß der kovalenten Bindung des Makromoleküls an die polymerkettenenden mehrere Male wiederholt werden kann. Nachfolgende Beladungsschritte werden sich wahrscheinlich jedoch funktionalisierbare Gruppen der ersten Makromolekularschicht zunutze machen, da diese Gruppen in weit größeren Konzentrationen als die verbleibenden ungenutzten Polymerkettenenden vorliegen. Jeder nachfolgende Bindungsschritt impliziert somit eine wachsende Anzahl von Linker-Hälften, was zu einer festeren Verbindung sowie zu größeren Beladungsmengen auf der Membranoberfläche führt. Aus diesem Grunde kann es manchmal vorteilhafter sein, die oberflächen-funktionalisierbaren Gruppen, die an einer Membranoberfläche vorliegen, zu "vermehren", indem man zunächst ein oder mehrere Schichten einer leicht verfügbaren Makromolekülart aufbringt, bevor man eine wertvollere Ligandenart auf die oberste Schicht aufbringt. In dem Fall, wo Schichten von hydrophilen Makromolekülen kovalent angelagert sind, geht die nichtspezifische Protein-Bindung der modifizierten Oberfläche gegenüber der jungfräulichen hydrophoben Oberfläche drastisch zurück.
Die kovalente Bindung der Oberflächen-Liganden-Schichten braucht nicht unbedingt die Zwischenschaltung einer Linker-Hälfte zu implizieren, obgleich in bestimmten Fällen besser ein "Linker-Molekül" eingesetzt wird. Es ist z.B. möglich, bestimmte funktionelle Gruppen von Makromolekülen, die bereits an der Polymer-Oberfläche gebunden sind, durch Einsatz von aktivierenden Reagenzien für funktionelle Gruppen eines hinzugegebenen Liganden reaktiver zu machen. Diese Verfahren, die zu aktiven Stellen in dem Makromolekül führen, sind Stand der Technik und wohlbekannt und implizieren die Verwendung von solchen Reagenzien wie Dialkylcarbodiimide (zur Bildung von Amid- Bindungen), Diazotierung (zur Kopplung von aromatischen Gruppen), Cyanogenbromid (sehr häufig eingesetzt zur Aktivierung fester Träger), Epoxide, Sulfonylchloride, oder andere Verfahren wie die Verwendung von 2-Fluor-1-methylpyridinium-p-toluensulfonat (FMP), das die Kopplungsreaktion durch Einführen einer höheren sich trennenden Gruppe ("leaving group") erleichtert. Andere nicht einschränkende Reagenzien, die zur kovalenten Bindung des Liganden an das Makromolekül oder die Polymer-Oberfläche verwendet werden können, sind u.a. Diepoxide, Haloepoxide, 2,4,6-Trichlor-S-triazine, zweibasige Säurechloride, Dialdehyde, Diisocyanate oder Haloalkylcarboxyl-Säuren.
In einer speziellen bevorzugten Ausführungsart dieser Erfindung können Protein- A-Moleküle durch Verwendung von EGDGE als Linker-Hälfte direkt an die Polymerkettenenden einer hydrophoben PES-Membran angelagert werden. Vorzugsweise wird die PES- Membran zuerst durch Aufbringen einiger Schichten Hydroxyethylcellulose modifiziert. Andere hydroxyl-haltige Makromoleküle wie Dextran, Agarose, Hydroxypropylcellulose oder Poly(vinylalkohol) lassen sich mit gleicher Wirksamkeit einsetzen. Nachdem nun die Anzahl der Hydroxyl-Gruppen auf der Membranoberfläche so erhöht wurde, wird die Membran mit FMP behandelt, um aktive Stellen auf der Membranoberfläche zu erzeugen. Die Membranen werden dann einer geringfügig basisch-gepufferten Lösung von Protein A ausgesetzt, um eine wirksame kovalente Anlagerung dieses wertvollen Liganden zu veranlassen.
Membran-Proben mit kovalent gebundenem Protein A sind z.B. recht nützlich für die selektive Bindung und Isolierung von humanem Immunglobulin G (IgG) aus einem Gemisch aus Serumproteinen. Diese Nützlichkeit wird in dem Beispiel-Teil dieser Patentbeschreibung aufgezeigt.
Es ist offensichtlich, daß viele Arten von Liganden an die hydrophobe Membran nach den Verfahren dieser Erfindung gekoppelt werden können. Natürliche Produkte und biologisch aktive Komponenten ebenso wie synthetische polymerische Materialien können verwendet werden. Die Molekülarten, die oben als mögliche makromolekulare Typen genannt wurden, können, beispielsweise, allesamt auch die Liganden-Typen umfassen. Weitere Beispiele sind u.a. Farbstoffe, Enzym-Inhibitoren, amphoterische Moleküle, hydrophobe langkettige aliphatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe und dergleichen. Silan-Derivate können ebenso brauchbar sein, und zwar nicht nur als einfache Liganden, sondern auch als potentiell polymerisierbare Typen. Beispiele für solche Silane sind u.a. endständige aliphatische Kohlenwasserstoff-trialkyloxy-silane, wie z.B. Aminoethyl-aminopropyl-trimethoxysilan, carboxyl-substituierte Silane, langkettige aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffsilane und dergleichen. Selbstverständlich können viele Arten von funktionellen Gruppen in den Silanverbindungen vorkommen.
Zu den bevorzugten Liganden gehören natürliches oder rekombinantes Protein A, Avidin, Biotin Heparin, tierische, pflanzliche, bakterielle Zelloberflächenrezeptoren, Antikörper gegen IgG, IgM, IgA, IgE, Gewebeplasminogenaktivator (TPA), Human-Interleukin- (IL-)Proteine Human-Chorion-Gonadotropin (HCG), Schilddrüsenhormon (TSH), karzinogenoembryonales Antigen (CEA),transformierender Wachstumsfaktor (TGF), Interferone und Blutkoagulationsfaktoren wie Faktor VIII oder IX. Im allgemeinen werden Liganden, die in der Lage sind, spezifische Ligate aus einer Probenlösung oder aus einem Probengemisch mit einer Dissoziationskonstanten von ca. 10&supmin;² bis 10&supmin;¹² M zu binden, bevorzugt. Solche mit Bindungskonstanten kleiner als ca. 10&supmin;&sup6; M werden besonders bevorzugt. Andere bevorzugte Liganden und mögliche Substrate oder Ligate sind in dem US-Patent Nr. 4.693.985 aufgelistet. Die in der zitierten Unterlage offenbarte Erfindung ist in ihrem gesamten Umfang durch die Bezugnahme in der vorliegenden Unterlage Bestandteil der vorliegenden Unterlage.
Weitere Beispiele für brauchbare Liganden lassen sich leicht in Katalogen zu Produkten finden, die für die molekular-biologische Forschung von Nutzen sind (siehe z.B. Liganden-Verzeichnis in dem Katalog "Pharmacia Affinity and Chromatography Media", der durch Bezugnahme in der vorliegenden Unterlage Bestandteil derselben ist). Hier eine gekürzte Liste zur Illustration: Acetylglucosamin, Anti-A-Lectin, Arginin, Butylamin, Castornuß-Lectin, Cibacron Blau, Coenzym A, Decylamin, Diadenosin-pentaphosphat, Gelatin, Hämoglobin, zweisäurige Iminosäuren, HMG-CoA, Lysin, NADP, Oligo(dA, dC, dG, dI oder dT), PHA-L, Polyriboguanylsäure, Poly(I)poly(C), Procion Rot, Uridin-Nucleotide oder daraus gebildete Konjugate. Die einzige Beschränkung in bezug auf die Ligandenart ist die, daß der Ligand mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen muß, mit dem eine kovalente Bindung mit der Linker-Hälfte oder den aktiven Stellen in dem Makromolekül geknüpft werden kann.
Ein für eine Verwendung in dieser Erfindung bevorzugter Ligandentyp ist ein einkettiges multifunktionales biosynthetisches Protein, ausgedrückt durch ein einzelnes Gen und hergestellt durch rekombinante DNA-Techniken. Diese neuartigen biosynthetischen, bifunktionalen Proteine beinhalten biosynthetische Antikörperbindungsstellen, d.h. "BABS", und ein biosynthetisches Polypeptid, das einen Membranbindungsbereich definiert. Der eine Bereich ist in der Lage zur selektiven Antigenerkennung und bevorzugten Antigenbindung. Seine Struktur ist einem Muster nachgebildet und ahmt die Eigenschaften von natürlichen FV-Regionen von Immunglobulinen oder einer Kette davon nach. Der andere Bereich umfaßt ein oder mehrere peptidgebundene zusätzliche Effektor-Protein- oder -Polypeptid-Regionen, die so konzipiert sind, daß sie eine oder mehrere funktionelle Gruppen aufweisen, die zur kovalenten Bindung an eine Linker-Hälfte, ein anderes Makromolekül oder einen Liganden oder an den derivatisierten Grenzflächenbereich des Membranpolymers selbst in der Lage sind. Diese zweite Effektor-Protein- oder - Polypeptid-Sequenz kann einfach als Abstandshalter zwischen der Membranoberfläche und der Ligandenbindungsstelle dienen. Daneben kann sie selbst als ein Ligand fungieren, wie z.B. Protein A. Die Verwendung eines multifunktionalen biosynthetischen Proteins, in dem sowohl das Makromolekül als auch der interessierende Ligand als eine einzige Einheit gebunden sind, reduziert die Anzahl der zur kovalenten Anlagerung erforderlichen Schritte, ermöglicht die Anlagerung zahlreicher potentiell unterschiedlicher Ligandenbindungsstellen und zeigt noch weitere Vorteile. Die geringere molekulare Größe der BABS im Vergleich zu intakten Antikörpern und anderen natürlichen Bindungsproteinen erlaubt die Auslegung der Affinitäts-Trennvorrichtung mit einer höheren Oberflächendichte an Bindungsstellen; die Effektor-Domäne kann Aminosäuren umfassen, die jede für sich die Bildung permanenter oder reversibler kovalenter Bindungen gestattet, oder kann Aminosäurebereiche mit einer tertiären Struktur umfassen, die das Zustandekommen der Bindung erleichtern soll.

5.3.2.1 Auslegung und Herstellung von einkettigen multifunktionalen biosynthetischen Proteinen

Die zur Herstellung von einkettigen Bindungsstellen mit Affinität und Spezifität für eine vorabbestimmte Antigendeterminante anhand rekombinanter Techniken erforderliche Technologie wird im einzelnen in der Unterlage U588/01737 (WO-A-0009344) sowie in der gleichzeitig anhängigen US-Anmeldung mit der Serien-Nr. 052.800, eingereicht am 21. Mai 1987, offenbart. Angesichts dieser Beschreibung und der der genannten Anwendungen können Fachleute auf den Gebieten der rekombinanten DNA-Technik, Protein- Entwicklung und Chemie der Proteine solche Stellen hervorbringen, die, wenn in Lösung angeordnet, hohe Bindungskonstanten und ausgezeichnete Spezifität aufweisen. Da diese Strukturen auf der DNA-Stufe konstruiert werden, lassen sich Bindungsstellen und Effektor-Proteine im wesentlichen unbegrenzt kombinieren, wobei sich jede Kombination, wie hierin enthüllt, verfeinert läßt, um die Bindungsaktivität in jeder Region des synthetischen Proteins zu optimieren. Die synthetischen Proteine lassen sich in Prokaryonten wie z.B. E. coli exprimieren und sind somit günstiger in der Herstellung als Immunglobuline oder Fragmente derselben, die eine Expression in kultivierten Tierzellinien erfordern.
Die BABS, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, werden auf der DNA-Stufe konzipiert. Die chimärischen oder synthetischen DNAs werden dann in einem geeigneten Wirt-System exprimiert, und die exprimierten Proteine werden gesammelt und bei Bedarf renaturiert. Eine allgemeine Struktur der die Proteine codierenden DNA ist in Abbildung 14 dargestellt. Wie gezeigt, codiert sie eine optionale Anführer-("Leader"-) Sequenz, die dazu dient, die Expression in Prokaryonten zu fördern, die mit einer eingebauten Spalt-("Cleavage"-)Stelle versehen sind, die für ein ortsspezifisch wirkendes Spalt- Mittel, z.B. eine Endopeptidase, erkennbar ist, das verwendet wird, um die Leader- Sequenz nach der Expression zu entfernen. Daran schließen sich an eine DNA, die für eine VH-ähnliche Domäne codiert und die komplementarität-determinierende Regionen (CDRs - "complementarity determining regions") und Rahmenregionen (FRs - "framework regions") umfaßt, eine Verbindungssequenz ("connector sequence"), eine VL-ähnliche Domäne, die wiederum CDRs und FRs umfaßt, ein Abstandshalter ("Spacer") sowie ein Eftektor-Protein oder Fragment. Alternativ kann die Effektor-Protein-DNA der DNA der VH- ähnlichen Domäne vorangehen. Ebenso kann die Bindungsstelle aus einer einzelnen VH- oder VL-ähnlichen Domäne bestehen, wenn eine geringere Affinität toleriert werden kann. Nach der Expression, Faltung und Abspaltung der Leader-Sequenz, sofern vorhanden, erhält man ein bifunktionales Protein, das eine Bindungsregion, deren Spezifität durch die CDRs bestimmt wird, sowie eine peptid-gebundene unabhängig funktionelle Effektor- Region aufweist.
Die Auslegung der BABS-Sequenz erfolgt ausgehend von der Beobachtung, daß die drei Subregionen der variablen Domäne der schweren wie auch der leichten Kette von nativen Immunglobulin-Molekülen zusammen für die Antigen-Erkennung und -Bindung verantwortlich sind. Es ist wohlbekannt, daß Fv, das kleinste Antikörper-Fragment, das eine komplette Antigen-Erkennungs- und -Bindungsstelle aufweist, als Dimer vorliegt, bestehend aus einer variablen Domäne der schweren Kette und einer variablen Domäne der leichten Kette, die nichtkovalent verknüpft sind. Genau in dieser Konfiguration wirken die drei Subregionen, hier "komplementarität-determinierende Regionen" oder "CDRs" genannt, einer jeden variablen Domäne zusammen und definieren eine Antigenbindungs stelle auf der Oberfläche des VH-VL-Dimers. Die sechs CDRs zusammen verleihen dem Antikörper Antigenbindungsspezifität. Eine einzelne variable Domäne (oder eine halbe Fv- Sequenz bestehend aus nur drei CDRs mit Spezifität für ein Antigen) besitzt die Fähigkeit zur Antigen-Erkennung und -Bindung, wenngleich auch mit einer geringeren Affinität als eine komplette Bindungsstelle (Painter u.a. (1972), Biochem. 11:1327-1337).
Jede dieser komplementarität-determinierenden Regionen umfaßt eine der hypervariablen Regionen oder Schleifen und ausgewählte Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen, angeordnet in den Rahmenregionen (FRs), die diese spezielle hypervariable Region einrahmen. Diese FRs dienen dazu, die CDRs in ihrer jeweils richtigen Ausrichtung zur Antigenbindung zu halten. Man hat festgestellt, daß biosynthetische Domänen, die die Struktur der beiden Ketten einer Immunoglobulin-Bindungsstelle kopieren, durch einen Polypeptid-Verbindungsbereich verknüpft werden können bei gleichzeitiger weitgehender Annäherung an die, Aufrechterhaltung und häufig Verbesserung der Bindungseigenschaften.
Das zwei Domänen umfassende, einkettige Komposit-Polypeptid der BABS hat eine Struktur, die dem Muster von im Gespann hintereinandergeschalteten VH- und VL- Domänen nachgebildet ist, bei der jedoch das Carboxyl-Ende einer Domäne über eine Verbindungs-Aminosäuresequenz mit dem Amino-Ende der anderen Domäne verknüpft ist. Die Verbindungssequenz umfaßt vorzugsweise mindestens ca. 15 Aminosäuren oder erstreckt sich über eine Distanz von mindestens 40 Angström in wäßriger Lösung und beinhaltet Reste, die zusammen ein hydrophiles, relativ unstrukturiertes Segment darstellen. Jede Domäne umfaßt einen Satz Aminosäuresequenzen analog zu Immunglobulin- CDRs, die in geeigneter Konformation durch einen Satz Sequenzen gehalten werden, die zu den Rahmenregionen (FRs) eines Fv-Segments eines natürlichen Antikörpers analog sind. Die CDR- und FR-Polypeptid-Segmente werden ausgehend von einer Sequenzanalyse des Fv-Bereichs von vorher vorhandenen Antikörpern oder der für sie codierenden DNA konzipiert.
Diese chimärischen Einzelketten-Bindungsstellen werden entweder an ihrem Amino-Terminus oder an ihrem Carboxyl-Terminus (oder an beiden Enden) an eine Aminosäuresequenz gekoppelt, die für die Ankopplung an eine Oberfläche ausgelegt ist. Die synthetische Bindungsstelle kann beispielsweise eine Vorläufer-("Leader"-)Sequenz und/oder Nachläufer-("Trailer"-)Sequenz beinhalten, die ein Polypeptid definiert bzw. definieren, das eine funktionelle Gruppe bereitstellt, die dafür ausgelegt ist, sich kovalent mit einer aktivierten Gruppe an der Membranoberfläche zu verbinden. Bevorzugte Polypeptid-Sequenzen sind u.a. Sequenzen, die positiv- oder negativgeladene Aminosäuren oder sulfhydryl-haltige Aminosäuren, wie z.B. Methionin, enthalten. Dieser fusionierte, unabhängig funktionelle Proteinabschnitt ist von fusionierten Leader-Sequenzen zu unterscheiden, die nur zur Förderung der Expression in Prokaryonten-Wirtszellen oder Hefen eingesetzt werden. Die multifunktionalen Proteine sind auch von den "Konjugaten" zu unterscheiden, die in Vorveröffentlichungen offenbart wurden und die Antikörper umfassen, die, nach Expression, chemisch mit einer zweiten Hälfte verknüpft werden.
Die Verknüpfung zwischen der unabhängig funktionellen Antigenbindungsregion und der Membranoberflächen-Bindungsregion des bifunktionalen Proteins erfolgt durch einen Abstandshalter ("Spacer") der eine kurze Aminosäuresequenz umfaßt und dessen Zweck darin besteht, die funktionellen Regionen zu trennen, damit die Bindungsregion ihre aktive tertiäre Konformation einnehmen kann. Der Abstandshalter kann aus einer Aminosäuresequenz bestehen, die am Ende eines funktionellen Proteins vorkommt und die als solche für dessen Funktion nicht erforderlich ist, und/oder aus spezifischen Sequenzen, die auf der DNA-Stufe in das Protein eingebaut wurden.
Der Abstandshalter kann im allgemeinen zwischen 5 und 25 Resten umfassen. Seine optimale Länge läßt sich anhand von konstruktierten Gebilden mit unterschiedlichen Spacer-Längen, die z.B. um jeweils 5 Aminosäuren umfassende Einheiten voneinander abweichen, ermitteln. Die spezifischen Aminosäuren in dem Abstandshalter können variieren. Cysteine sollten vermieden werden, um eine inkorrekte Faltung des bifunktionalen Proteins zu verhindern. Hydrophile Aminosäuren werden bevorzugt. Der Abstandshalter kann so konzipiert werden, daß er eine bestimmte Struktur, z.B. eine helixförnige Struktur, einnimmt, wobei er jedoch vorzugsweise Aminosäuren umfaßt, die eine Domänenbildung nicht fördern.
Die Fähigkeit, die BABS zu konstruieren, hängt von der Fähigkeit ab, die Sequenz der Aminosäuren in der variablen Region interessierender monoklonaler Antikörper oder der für diese codierenden DNA zu bestimmen. Die Hydbridomatechnologie erlaubt die Herstellung von Zellinien, die einen Antikörper gegen im wesentlichen jede gewünschte eine Immunreaktion auslösende Substanz produzieren. Die für die leichte und schwere Kette des Immunglobulins codierende RNA kann dann aus dem Zytoplasma des Hybridoms gewonnen werden. Der 5'-Ende-Abschnitt der mRNA kann zur Darstellung der cDNA für die nachfolgende Sequenzbestimmung verwendet werden, oder die Aminosäuresequenz der hypervariablen Regionen und angrenzenden Rahmenregionen kann durch die Ermittlung der Aminosäuresequenz der V-Region-Fragmente der schweren (H-) und leichten (L-) Ketten bestimmt werden. Eine solche Sequenzanalyse ist heute eine Routineangelegenheit. Dieses Wissen zusammen mit Beobachtungen und Ableitungen aus der verallgemeinerten Struktur von Immunglobulin-Fv-Regionen erlaubt die Konstruktion synthetischer Gene, die für FR- und CDR-Sequenzen codieren, die mit Wahrscheinlichkeit das Antigen binden werden. Diese synthetischen Gene werden dann anhand von bekannten Verfahren oder anhand des im folgenden beschriebenen Verfahrens hergestellt, in einen geeigneten Wirt eingebaut und exprimiert, und das exprimierte Protein wird schließlich gereinigt/isoliert. Je nach Wirtszelle können Renaturierungsverfahren erforderlich sein, um die richtige Konformation zu erhalten. Die verschiedenen Proteine werden sodann auf ihre Bindungsfähigkeit hin getestet, und eines mit angemessener Affinität wird für den Einbau in ein Reagenz von dem obenbeschriebenen Typ ausgewählt. Bei Bedarf können in der DNA punktuelle Substitutionen mit dem Ziel der Optimierung der Bindung anhand des herkömmlichen Verfahrens der Kassetten-Mutagenese ("cassette mutagenesis") oder anhand anderer Verfahren zur Manipulation von Proteinen wie im folgenden offenbart durchgeführt werden.
Die Herstellung der Effektor-Polypeptid-Region des bifunktionalen Proteins hängt ferner von der Kenntnis der Aminosäuresequenz (oder entsprechenden DNA- oder RNA- Sequenz) des interessierenden Proteins ab. Angaben zu diesen Sequenzen finden sich in der Literatur und sind über EDV-mäßig angelegte Datenbanken abrufbar.
Die DNA-Sequenzen der Bindungsregion und der zweiten Protein-Domäne werden mittels herkömmlicher Verknüpfungstechniken fusioniert oder aus synthetisierten Oligonucleotiden zusammengesetzt und dann anhand ebenso herkömmlicher Techniken exprimiert.
Die Verfahren zur Manipulation, Verstärkung und Rekombination von DNAs, die für interessierende Aminosäuresequenzen codieren, sind Stand der Technik und im allgemeinen gut bekannt und werden daher hier nicht im einzelnen beschrieben. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Genen, die für interessierende Antikörper codieren, sind gut verständlich und werden in dem Patent und in anderer Literatur beschrieben. Diese Verfahren implizieren im allgemeinen das Auswählen von genetischem Material, das für Aminosäuren codiert, die die interessierenden Proteine, einschließlich der interessierenden CDRs und FRs, entsprechend dem genetischen Code definieren.
Entsprechend läßt sich der Aufbau von DNAs, die für Proteine codieren, wie hierin offenbart, anhand von bekannten Techniken durchführen, die die Verwendung von verschiedenen Restriktions-Enzymen, die sequenzspezifische Schnitte in der DNA durchführen, um stumpfe Enden oder kohäsive Enden hervorzubringen, von DNA-Ligasen, von Techniken, die das enzymatische Verknüpfen von DNA mit "sticky ends" (d.h. mit Schnittenden mit einem überstehenden Teil) mit DNA mit stumpfen Enden ermöglichen, oder den Aufbau von synthetischen DNAs durch Zusammenfügen von kurzen oder mittellangen Oligonucleotiden, von cDNA-Synthese-Techniken sowie von synthetischen Proben zur Isolierung von Immunglobulin oder anderen bioaktiven Proteingenen implizieren. Verschiedene Promotor-Sequenzen und andere Regulator-DNA-Sequenzen, die eingesetzt werden, um die Expression zu erzielen, sowie verschiedene Arten von Wirtszellen sind ebenso bekannt und verfügbar. Herkömmliche Transfektions-Techniken sowie ebenso herkömmliche Techniken der Klonierung und Subklonierung von DNA sind in der Anwendung dieser Erfindung nützlich und sind dem Fachmann bekannt. Verschiedene Arten von Vektoren können verwendet werden, wie z.B. Plasmide und Viren einschließlich tierischer Viren und Bakteriophagen. Die Vektoren können verschiedene Marker-Gene nutzen, die einer erfolgreich transfizierten ("Transfektion") Zelle eine erkennbare phenotypische Eigenschaft verleihen, die genutzt werden können zur Identifizierung der Familie von Klonen aus einer Reihe von Klon-Familien, die die rekombinante DNA des Vektors erfolgreich einverleibt hat.
Ein Verfahren zur Gewinnung von DNA, die für die hier offenbarten Proteine codiert, ist das Verknüpfen von synthetischen Oligonucleotiden, die in einem herkömmlichen, automatisierten Polynucleotid-Synthesizer hergestellt wurden, mit anschließender Ligation mit geeigneten Ligasen. So können beispielsweise überlappende komplementäre DNA-Fragmente mit 15 Basen halbmanuell anhand der Phosphoramidit- Chemie synthetisch hergestellt werden, mit Endsegmenten, die unphosphoryliert bleiben, um eine Polymerisation während der Ligation zu verhindern. Ein Ende der synthetischen DNA bleibt als "sticky end" zurück, entsprechend dem Wirkungsort einer bestimmten Restriktions-Endonuclease, und das andere Ende bleibt als Ende zurück, das dem Wirkungsort einer anderen Restriktions-Endonuclease entspricht. Alternativ hierzu kann dieser Ansatz vollautomatisiert werden. Die für das Protein codierende DNA läßt sich durch Synthetisierung längerer einsträngiger Fragmente (z.B. 50 - 100 Nucleotide lang) zum Beispiel in einem Biosearch-Syntheziser herstellen, die Fragmente können anschließend verknüpft werden.
Ein besonders nützliches Verfahren zur Herstellung der BABS ist die Herstellung einer synthetischen DNA, die für ein Polypeptid codiert, das z.B. Rahmenbereiche (FRs) vom Menschen umfaßt und das zwischen "Dummy"-CDRs - oder Aminosäuren, die keine Funktion haben außer der, geeignet plazierte einzigartige Restriktionsenzym-Spaltstellen zu definieren - geschaltet ist. Diese synthetische DNA wird sodann durch DNA-Austausch geändert, indem durch restriktionsenzymatische Spaltung ("restriction") und Ligation synthetische Oligonucleotide, die für CDRs codieren, die die gewünschte Bindungsspezifität definieren, an der richtigen Stelle zwischen den FRs eingefügt werden. Dieser Ansatz erlaubt es, die Bindungsspezifität der BABS zu ändern, und erleichtert außerdem die empirische Verfeinerung der Bindungseigenschaften der BABS.
Diese Technik hängt von der Fähigkeit ab, eine in ihrer Struktur einem 'variable Domäne'-Gen entsprechende DNA an bestimmten, an Nucleotid-Sequenzen, die für CDRs codieren, angrenzenden Stellen zu spalten. Diese Restriktionsenzym-Spaltstellen lassen ("restriction sites") sich manchmal in dem nativen Gen finden. Alternativ können nicht- native Restriktionsenzym-Spaltstellen in die Nucleotid-Sequenz eingebaut werden, was ein synthetisches Gen hervorbringt, das zwar eine andere Nucleotid-Sequenz aufweist, das jedoch für dieselben Aminosäuren der variablen Domäne codiert, und dies wegen der Entartung des genetischen Codes. Die Fragmente, die aus der Endonuclease-Aufschließung resultieren und die Sequenzen umfassen, die für FRs codieren, werden dann mit nicht-nativen Sequenzen, die für CDRs codieren, verknüpft, um ein synthetisches 'variable Domäne'-Gen mit geänderter Antigen-Bindungsspezifität hervorzubringen. Die zusätzlichen Nucleotid-Sequenzen, die für ein bioaktives Molekül oder eine andere Effektor- Sequenz codieren, können dann mit den Gen-Sequenzen gekoppelt werden, um ein bifunktionales Protein hervorzubringen.
Die Expression dieser synthetischen DNAs läßt sich sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Systemem auf dem Wege der Transfektion mit einem geeigneten Vektor erzielen. In E. coli und anderen mikrobiellen Wirtszellen können die synthetischen Gene als Fusionsprotein exprimiert werden, das anschließend abgespalten wird. Die Expression in Eukaryonten läßt sich durch die Transfektion von DNA-Sequenzen erzielen, die für Aminosäuren der CDR- und FR-Regionen sowie für Aminosäuren codieren, die eine zweite Funktion in einer Myelom- oder sonstigen Art von Zellinie definieren. Durch diese Strategie lassen sich intakte Hybrid-Antikörpermoleküle mit Hybrid-Fv-Regionen und verschiedene bioaktive Proteine mit einer biosynthetischen Bindungsregion herstellen. Im Falle von Fusions-Protein, exprimiert in Bakterien, kann eine nachfolgende proteolytische Abspaltung ("cleavage") der expressionsfördernden Vorläufer-("Leader"-) Sequenz vorgenommen werden, um freies bi- oder multifunktionales Protein zu gewinnen, das renaturiert werden kann, um eine intakte biosynthetische Hybrid-Antikörperbindungs stelle zu erhalten.

5.3.3 Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen isotropen feinporigen Membranen

Das obenerörterte Verfahren zur Derivatisierung von hydrophoben Polymer- Schnittstellen ist insbesondere zur Oberflächenmodifizierung von feinporigen Membranen anwendbar. Auf der Suche nach neuen Wegen zur Herstellung von Membranen haben die Erfinder eine einzigartige Vierkomponenten-Formmassen-("Dope"-)Zusammensetzung entdeckt, die in Kombination mit anderen Aspekten des Gesamtherstellungsverfahrens Membranen mit im wesentlichen isotropen feinporigen Strukturen liefert, die entweder als Platten-Membranen ("flat sheet membranes") oder, was vielleicht noch bedeutsamer ist, als Hohlfaser-Membranen ausgebildet sind.

5.3.3.1 Formmassen-("Dope"-)Zusammensetzung

Diese neuartige Formmassen-Zusammensetzung beinhaltet eine primäre Polymer-Komponente, eine sekundäre Polymer-Komponente und zwei Lösungsmittel, von denen das erste ein wirksames Lösungsmittel für beide Polymere (d.h. ein Lösungsmittel, in dem beide Polymere sofort löslich sind) und das zweite ein wirksames Lösungsmittel für die sekundäre Polymer-Komponente jedoch ein unwirksames Lösungsmittel für die primäre Polymer-Komponente (d.h. ein Lösungsmittel, in dem das primäre Polymer schwach oder kaum löslich oder vorzugsweise im wesentlichen unlöslich) ist. Von den genannten Lösungsmittelkomponenten ist es die letztere, die dem resultierenden Formmassen-Gemisch ein gewisses Maß an Inkompatibilität oder Instabilität verleiht, und durch wohlüberlegte Berichtigung der relativen Anteile der verschiedenen Komponenten lassen sich die die Formmassen-Zusammensetzung charakterisierenden kritischen Parameter, wie z.B. die untere kritische Lösungstemperatur und die obere kritische Lösungstemperatur (LCST bzw. UCST) optimal auf die gewünschten Verarbeitungsschritte abstimmen.
Ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung ist die Auswahl des in der Formmasse zu verwendenden Polymer-Paares. Eine relativ gute Kompatibilität ist erforderlich, um die Manipulation der Phasengrenze als eine Funktion des Anteils des Nicht-Lösungsmittels (z.B. Glycerin) in dem gewünschten Umfang zu ermöglichen. Kompatibilität läßt sich ganz allgemein wie folgt definieren: wenn zwei Polymere gemeinsam in einem gemeinsamen Lösungsmittel (oder Lösungsmittelgemisch) unbegrenzt bei 5 bis 50 % Gesamtfeststoffanteil gelöst werden können, um eine durchsichtige, klare Lösung bei einer kontrollierbaren Temperatur zu erhalten, dann spricht man von einer kompatiblen Lösung.
Wie in dem Falle des Polymer-Paares PES/PEO (resp. primäre/sekundäre Polymer-Komponente) dient ein Lösungsmittel wie z.B. Glycerin zugleich als Lösungsmittel für das eine Polymer als auch als Nicht-Lösungsmittel für das andere Polymer. Das Polymer, für das diese Flüssigkeit ein wirksames Nicht-Lösungsmittel ist, bildet den Hauptbestandteil oder die primäre Komponente der gewünschten fertigen Membran (in diesem Falle: PES). Das Polymer, das in beiden Lösungsmitteln löslich ist, sollte auch hydrophile Eigenschaften besitzen, wie z.B. wasserlösliche Polymere, ohne jedoch auf diese Gruppe beschränkt zu sein. Man sollte jedoch daran denken, daß sich bei Verwendung eines wasserlöslichen Polymers Formen mit einem höheren Molekulargewicht statistisch gesehen infolge einer Verhakung der Ketten häufiger in der fertigen Membran einstellen als solche mit geringerem Molekulargewicht, wenn ein wäßriges Quenchbad bei der Herstellung eingesetzt wird. Diese Verhakung kann an sich wünschenswert sein, da dies der ansonsten hydrophoben Membranoberfläche einen gewissen Grad an Hydrophilie und Benetzbarkeit verleiht.
Ein in bezug auf das Molekulargewicht breites Spektrum an hydrophilen Polymeren (z.B. PEO) ist für diese Erfindung brauchbar, wobei die Bandbreite des Molekulargewichts von einigen zehn Tausend (z.B. PEG) bis zu mehreren Millionen reicht. Das bevorzugte Molekulargewicht für PEO liegt bei mindestens 100.000.
Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von PES, Polysulfon (PS) und anderen Polymeren mit hoher Einfrier- (oder Glas-)/Schmelztemperatur als Hauptbestandteil in diesen Blends ist der, daß daraus Membranen hervorgehen, die wiederholt einer Autoklavbehandlung unterzogen werden können, ohne daß die Membran-Eigenschaften dadurch nachteilig verändert werden. Eine Autoklavbehandlung kann in der Tat die Zerreißfestigkeit von PES/PEO-Fasern erhöhen, was wahrscheinlich darin begründet liegt, daß eine Polymer-Relaxation eintreten kann, durch die der bei aus Lösungen gegossenen Membranen beobachtete langsame, über Tage, Wochen oder sogar Monate sich hinziehende Verfestigungs- oder Verdichtungsprozeß unterbunden wird. Ein solcher Verdichtungsprozeß führt häufig zu einer - über die Zeit betrachtet - reduzierten Wasserdurchlässigkeit. PES/PEO-Fasern sind letztlich ausreichend hydrophil (auf Grund der Gegenwart von einem gewissen Umfang an PEO an den Membranoberflächen), daß zyklische Naß/Trocken-Durchläufe ohne Benetzungshilfsmittel und ohne Leistungsänderung durchgeführt werden können.
Beispiele für andere geeignete Polymer-Paare, die sich bei dieser Erfindung einsetzen lassen, sind u.a.: Polysulfon (PS)/PEO; PES/Polyvinyl-pyrrolidon (PVP) (insbesondere die PVP-Formen mit hohem Molekulargewicht, z.B. von ca. 360.000); PS/PVP (Molekulargewicht rund 360.000); Polyvinylidenfluorid (PVDF)/PEO; PES/Epichlorhydrin-Copolymere von PEO; PES/Polyvinylalkohol (PVA); Polyphenylenoxid (PPO)/hydrophilierte Formen von Polystyrol (einschließlich Copolymeren und sulfonyliertes Polystyrol); Poly(acrylnitril) (PAN) und Copolymere/hydrophile Acrylpolymere (einschließlich Polyacrylamid), oder PVP; PES/hydrophilierte Formen von PES (einschließlich sulfoniertes PES); und PS/hydrophilierte Formen von PS.
Geeignete Lösungsmittel/Nicht-Lösungsmittel-Paare sind zahlreich, entsprechen jedoch vorzugsweise der vorgenannten Kompatibilitätsdefinition und Polymerpaar- Auswahl. Allgemein gesprochen stellt die Klasse der heterozyklischen oder aminhaltigen Lösungsmittel (Dimethylformamid, N-Methyl-pyrrolidon, Dimethylacetamid und Piperidin eingeschlossen) und polaren aprotische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid und dergleichen eine ausgezeichnete und bevorzugte Auswahl an ersten Lösungsmitteln für beide Polymere dar, und dies auf Grund ihrer relativ hohen Siedepunkte, ihres polaren Charakters und ihrer Wassermischbarkeit. Alternativen zu Glycerin als zweites Lösungsmittel mit Lösungsvermögen für die sekundäre Polymer-Komponente und Nicht- Lösungsvermögen für die Haupt-Polymerkomponente sind u.a.: 2-Methoxyethanol, Formamid, Ethylenglycol, verschiedene Alkohole und dergleichen.
Im Hinblick auf leichte Verfahrenstechnik wird die Verwendung wäßriger Quench-/Waschbäder bevorzugt, jedoch braucht dieses Verfahren nicht so beschränkt zu werden. Ebenso gilt, daß die zulässigen Bereiche für die LCST- und UCST-Phasengrenzen nur durch die erreichbaren Temperaturbereiche ausgehend von der verfügbaren Geräteausstattung und geeigneten Quenchmitteln beschränkt sind. Im Falle eines auf einem wäßrigen Quench-/Waschbad basierenden Verfahrens lauten die bevorzugten Bereiche hinsichtlich der Phasengrenzen: LCST ca. 80ºC und UCST ca. 50ºC.
In einer bevorzugten Ausführungsart dieser Erfindung wird Polyethersulfon (PES), ein hydrophobes Polymer, als primäre Polymer-Komponente der Formmassen-Zusammensetzung ausgewählt. Poly(ethylenoxid) (PEO), N-Methylpyrrolidon (NMP) und Glycerin stellen die sekundäre Polymer-Komponente bzw. die zweiten Lösungsmittel dar. Das Trübungspunkt-Phasendiagramm für eine Reihe von Formmassen ("Dopes") bestehend aus 20 Gew.-% PES und einem Gemisch aus 7,5 Gew.-% PEO in NMP mit schwankendem Glycerin-Gehalt, als ein prozentualer Gewichtsanteil am Gesamtgewicht, ist in Abbildung 10 dargestellt. Wie gezeigt, kann der Temperaturbereich, in dem eine einphasige homogene Zusammensetzung erreicht wird, für ein bekanntes PES/PEO- Verhältnis in Abhängigkeit von der vorliegenden Menge an Nicht-Lösungsmittel variieren. Der Einphasen-Temperaturbereich kann dementsprechend bis 100ºC reichen oder aber auch nur einige Grade umfassen. In den meisten Fällen liegt der bevorzugte Bereich bei ca. 30º-40ºC. Im Falle der Vierkomponenten-Formmasse wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine Temperatur-Phasenumkehrung nicht nur bei Temperaturen unterhalb der oberen kritischen Lösungstemperatur (UCST), sondern auch bei hohen Temperaturen, oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST), eintritt (siehe Abbildung 10).

5.3.3.2 Platten-Membranen

Es wurde auch festgestellt, daß Membranen mit im wesentlichen isotropen porigen Strukturen (d.h. Strukturen, in denen die Porendurchmesser alle in einer Größenordnung liegen) hergestellt und konserviert werden können, indem man die homogene Formmasse einer plötzlichen Temperaturänderung unterwirft, vorzugsweise bei oder über der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST), und die ausgefällte Struktur im wesentlichen gleichzeitig "ausfriert" durch Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels für wenigstens die primäre Polymer-Komponente. Dieses Verfahren läßt sich im Falle von Platten-Membranen ("flat sheet membranes") auf sehr bequeme Weise durchführen, indem man einen Flüssigkeitsfilm ("liquid sheet") aus der Formmassen-Zusammensetzung in ein Nicht-Lösungsmittel-Quenchbad (z.B. Wasser), das auf einer Temperatur oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur gehalten wird, eintaucht. Das Abkühlen des Gemischs bei einer Temperatur oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur bringt offenere Membran- Strukturen hervor mit größeren isotropen Poren im um-Bereich. Demgegenüber erhält man anisotrope feinporige Membranen oder großporige Membranen mit Quenchbädern, deren Temperatur auf einem Wert unterhalb der unteren bzw. oberen kritischen Lösungstemperatur (LCST bzw. UCST) gehalten wird. Die Membran-Porengrößen, abgesehen davon, daß sie im wesentlichen isotrop sind, lassen sich somit durch Auswahl der Temperatur des Quenchbades potentiell steuern. Desweiteren sind die durch ein Quenchen oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) hergestellten Membranen im wesentlichen hautlos und weisen eine sehr hohe Porendichte in der Membran-Außenseite auf.
Mit dieser Erfindung ist es effektiv gelungen, einen thermischen Phasenumkehrprozeß, eingeleitet bei einer hohen Temperatur durch eine fast sofort erfolgende Temperaturänderung der gesamten Formmasse, welche durch Eintauchen der Lösung in ein Quenchbad erreicht wird, nutzbar zu machen. Da man es nicht einfach bei der Theorie belassen will, geht die Vermutung dahin, daß das resultierende mikrophasengetrennte Binärpolymersystem eine im wesentlichen isotrope Feinstruktur aufweist als Ergebnis der gleichförmigen schnellen Wärmeübertragung. Die Feinstruktur wird dann "eingefroren" und in der gesamten Membran aufrechterhalten durch einen zweiten Prozeß, der gleichzeitig mit der thermischen Phasenumkehrung erfolgt und die Diffusion des Nicht-Lösungsmittel- Quenchmittels impliziert. Diese Kombination aus einer Hochtemperatur-Phasenumkehrung und Nicht-Lösungsmittel-Quenchprozessen bringt Membranen hervor, die im wesentlichen isotrop sind und die relativ dick und selbsttragend ausgeführt werden können. Unter "im wesentlichen isotrop" sind perfekt isotrope Porengrößenverteilungen sowie eine Porengrößenverteilung in einer Größenordnung zu verstehen, wie sie sich anhand von Porenvermessung, Latexkugel-Durchgang oder anhand einer Untersuchung mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) ermitteln läßt. Verfahren zur Bestimmung der Partikelgröße durch Porenvermessung sind in dem "Operator's Handbook for Coulter Porometer" ("Bedienungsleitfaden für das Coulter-Porimeter"), Ausgabe A, Juni 1986, Bestell-Nr. 9903175 (herausgegeben von Coulter Electronics Limited, Northwell Dr., Juton, Beds., England) dokumentiert.
Wenngleich sich mit den derzeitigen Techniken zur Herstellung feinporiger Hohlfaser-Membranen mit Oberflächenporen mit Durchmessern zwischen Zehntelwerten eines Mikrometers (um) und einigen Mikrometern (um) realisieren lassen, halten diese herkömmlichen, dem derzeitigen Stand der Technik entsprechenden Membranen typischerweise Partikel zurück, die mehr als eine Größenordnung kleiner als die Oberflächenporengröße sind. Die kommerziell erhältliche für nominell 0,2 um bemessene Hohlfaser von AG Technology (Needham, MA), beispielsweise, weist, wie man festgestellt hat, Latex-Kügelchen von nur 0,03 um Größe im wesentlichen vollständig zurück; diese Größe liegt um mehr als eine Größenordnung unterhalb der Oberflächenporengröße von ca. 1 um, wie die Untersuchung mit dem Rasterelektronenmikroskop (REM) ergab. Außerdem zeigt die REM-Untersuchung, daß die Durchmesser der Poren unterhalb der Hohlraum-(Lumen-) Oberfläche über eine Strecke von wenigen um sehr schnell auf weniger als 0,1 um abnehmen. REM-Untersuchungen einer solchen Membran nach einem 0,03-um-Latex- Test zeigen einen Einschluß von Latex-Partikeln innerhalb des feinporigen Bereichs in der Matrix unterhalb der Hohlraum-Oberfläche. Eine typische feinporige Hohlfaser der vorliegenden Erfindung zeigte bei einer REM-Untersuchung Oberflächenporen in einer Größenordnung von 1 um. Tests mit Latex-Kügelchen - als einem Mittel zur Isotropie-Bestimmung - ergeben, daß Latex-Partikel in einer Größe von 0,25 um ungehindert die Membran-Wand passierten. Darüber hinaus bestätigte die REM-Untersuchung der Hohlfaserwand, daß die Porengrößenverteilung über die gesamte Membranwand im wesentlichen isotrop war, wobei die kleinsten Poren in der Faserwand typischerweise nicht kleiner als ca. 0,3 um waren.
Eine überraschende Feststellung war, daß sich eine Membran mit umgekehrter Porengrößenverteilung (d.h. große Poren in der Nähe der Membran/Lösungsmittel-Trennfläche und kleinere Poren innerhalb der Membran-Matrix) durch ein modifiziertes Quenchbad herstellen läßt, das eine ausreichende Menge eines starken Lösungsmittels enthält, um die Poren in dem mit dem Bad in Kontakt befindlichen Membranabschnitt anschwellen zu lassen. Nach Erreichen der gewünschten Porengrößen wird das starke Lösungsmittel verdünnt und eventuell durch eine Nicht-Lösungsmittel/Waschmittel-Zusammensetzung ersetzt. Die resultierenden Membranen lassen sich auf diese Weise mit Hilfe der obenbeschriebenen Vierkomponenten-Formmasse relativ dick und selbsttragend herstellen. Diese Membranen sind für eine Vielzahl von Mikrofiltrations-Anwendungen insbesondere zur Abtrennung von Blutzellen von Vollblut von Nutzen.
Durch Anwendung des in der vorliegenden Erfindung offenbarten Herstellungsverfahrens lassen sich im wesentlichen isotrope selbsttragende Membran-Strukturen mit hohem Feststoffgehalt herstellen. Es wird vermutet, daß die Einleitung des Phasenumkehrprozesses bei höheren Temperaturen zu einem weniger viskosen System führt, in dem eine größere Anzahl von Polymerkomponenten-Molekülen vor der Verfestigung oder Ausfällung der Membran zu ihren jeweiligen Bereichen wandern. Ein solcher Wanderungsprozeß (Migrations-Prozeß) könnte für die größerporigen Strukturen verantwortlich sein, die bei Membranen festgestellt wurden, die mit Quenchbädern gewonnen wurden, deren Temperatur oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) lag.

5.3.3.3 Verbesserte Koextrusions-Spinndüsen-Baugruppe und Herstellung von Hohlfasern

Zur Herstellung von Hohlfaser-Membranen mit im wesentlichen isotropen feinporigen Strukturen sind anspruchsvollere Herstellungsverfahren als das Eintauchen eines Flüssigkeitsfilms der Formmassen-Zusammensetzung in ein Quenchbad (d.h. bei der Herstellung von Platten-Membranen) erforderlich. Zu diesem Zweck wird eine verbesserte Spinndüsen-Baugruppe eingesetzt, deren schematischer Aufbau in Abbildung 11 dargestellt ist.
Die in dieser Abbildung gezeigte "Koextrusions"-Spinndüsen-Baugruppe ist Teil eines allgemeinen Fertigungssystems, das unter anderem folgendes umfaßt: Gefäße zum Mischen, Verrühren und Bevorraten der Formmasse; Rohrleitungen, Schlauchleitungen oder Speiseleitungen zum Einleiten und Zuführen von Reagenzien, Lösungsmitteln, Formmassen oder Fluids; Pumpen; Rührwerke; Bäder; und Heizeinrichtungen zur Temperaturregelung dieser Ausstattungsteile einschließlich der Spinndüse. Ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung ist, daß nicht mehr als drei Fluid-Eintrittsöffnungen notwendig sind, um die gewünschte Strömungsverteilung in der Vorrichtung zu erzielen. Das heißt, für jeden der drei Strömungswege ist nur eine Einlaßöffnung vorgesehen. Die durch jede Öffnung strömende Menge einer jeden Flüssigkeit läßt sich unabhängig regeln, was der Gesamtprozeßsteuerung ein größeres Maß an Flexibilität und Einfachheit verleiht. Die Strömungsmenge der einzelnen Fluids kann überdies die strukturellen Eigenschaften der resultierenden Faser beeinflussen.
Die in Abbildung 11 gezeigte Koextrusions-Spinndüse verkörpert die zentralen Merkmale dieser Erfindung und bietet zugleich ein hohes Maß an Vielseitigkeit in ihrer Anwendung (in Einklang mit der obigen Lehre). Wie oben bereits angedeutet, gibt es drei Fluid-Strömungswege, die von vier oder fünf modularen Teilen gebildet werden. Diese Teile sind im folgenden in der Reihenfolge, in der sie in Abbildung 11 bezeichnet sind, aufgeführt.
1. Der obere Abschnitt bildet den Vorratsbehälter für die Formmasse im oberen Teil der Spinndüse, mit einer Einleitungsöffnung für besagte Formmasse.
2. Dieser Abschnitt besteht aus einem Ring mit einer Vielzahl von Speichen, die radial zur Mitte angeordnet sind, wo sie als Träger für den Hohlbohrungs-Einspritzdorn fungieren -- das Bohrungs- oder Innenringfluid zur Herstellung einer Hohlfaser strömt durch eine dieser Speichen zum Hohlbohrungs-Einspritzdorn.
3. In diesem Abschnitt ist die Einleitungsöffnung für das Außenringfluid untergebracht; dieser Abschnitt bildet zusammen mit Abschnitt 5 den Außenringraum.
4. Als Zusatzeinrichtung ist eine Spiralvorrichtung zur Überwindung etwaiger Strömungsverteilungsprobleme vorgesehen, die bei hochviskosen Lösungen, die über eine einzige Öffnung dem Außenringraum zugeleitet werden, auftreten können.
5. Die Frontplatte der Spinndüse beinhaltet die (nach unten zum Quenchbad weisende) Fläche, an der die Doppelring-Konfiguration dieser Erfindung klar erkennbar ist.
Zahlreiche alternative Ausführungsarten dieser Erfindung sind möglich. Ein Beispiel ist in Abbildung 12 gezeigt, wo der zentrale Aspekt von zwei konzentrisch um einen Hohldorn herum angeordneten Ringen beibehalten wurde. In diesem Fall liegt der Schwerpunkt der Auslegung auf leichter Herstellung der Vorrichtung im Hinblick auf die Möglichkeit der äußerst effizienten Massenproduktion von Identischen Spinndüsen. Darüber hinaus bietet diese Auslegung, bei der das Bohrungseinspritz- oder Innenringfluid senkrecht durch die Vorrichtung eingeleitet wird, die Möglichkeit der Verwendung von austauschbaren Dornen. Dieses Merkmal erlaubt zusätzliche Kosteneinsparungen, da schadhafte Dorne modular erneuert werden können. Ebenso können Fasern unterschiedlicher Größen einfach und schnell durch Auswechseln des Dorns und/oder Modifizieren des Frontplattenabschnitts hergestellt werden.
Anhand dieser Vorrichtung kann ein Innenring- oder Bohrungseinspritzfluid, das ein Gas, ein Dampf oder eine Flüssigkeit sein kann, veranlaßt werden, aus dem Hohldorn der zentralen Bohrung auszutreten. Beispiele für ein bevorzugtes Innenringfluid sind u.a. ein Inertgas, Wasser, Wasserdampf, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, eine wäßrige Lösung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, eine wäßrige Lösung eines wasserlöslichen Polymers oder Gemische daraus. Um diese zentrale Bohrung sind zwei konzentrische Ringräume angeordnet. Aus dem Innenring wird die Spinnlösung extrudiert. Die Formmasse tritt als hohler Schlauch aus, der durch die Gegenwart des Innenringfluid-Stroms daran gehindert wird, zusammenzufallen. Während dieser Prozeß abläuft, kann unter Einbeziehung des zweiten, äußeren Ringraums, der den ersten umkreist, ein Außenringfluid unter Druck über die Außenseite der Faser geleitet werden. Dieses Außenringfluid ist vorzugsweise ein Lösungsmittelsystem, das der verwendeten Innenringlösung ähnlich oder mit dieser identisch ist. Beispiele bevorzugter Außenringfluids sind, ohne sich jedoch hierauf zu beschränken, Wasser, alkoholisches Lösungsmittel, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, eine wäßrige Lösung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, eine wäßrige Lösung eines wasserlöslichen Polymers oder Gemische daraus. Besonders bevorzugt wird, daß beide Fluids auf einer Temperatur oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) der Formmasse gehalten werden und daß beide in der Lage sind, im wesentlichen als Quenchmittel für das phasengetrennte Polymersystem zu dienen. Auf diese Weise können die innere und die äußere Oberfläche der Hohlfaser derselben Umgebung ausgesetzt werden, was zu einer isotroperen Verteilung der Porengrößen führt verglichen mit dem, was normalerweise bei einem Prozeß eintreten würde, der nicht den Vorzug des äußeren Schleiers eines Außenringfluids genießt.
Bei Verwendung einer solchen Konfiguration in dem Verfahren zur Herstellung der Hohlfaser-Membranen der vorliegenden Erfindung werden die Schwankungen in der Porengröße im wesentlichen ausgeschaltet, die als Folge der zwischen den Austrittsöffnungen der Spinndüse und dem normalen stationären Quench-/Waschbad vorliegenden Umgebungsluft auftreten, die ein anderes Medium als das Innenringfluid darstellt und die gewöhnlich eine andere Temperatur aufweist. Somit stellt der Abstand zwischen der Strangpresse (Extruder) und dem stationären Bad nicht länger ein wichtiger Faktor dar, womit eine viel größere Flexibilität bei der Anordnung der Ausrüstungsteile für dieses Verfahren erreicht wird.
Vielleicht noch wichtiger ist, daß, weil die Phasentrennung, das Strangpressen und das Quenchen bei Verwendung der Innen- und Außenringfluid-Konfiguration in einer sehr kurzen Zeitspanne vollzogen werden kann, der Prozeß der Hohlfaserherstellung im einzelnen bei näherem Hinsehen der Schrittfolge ähnelt, die bei dem einfachen Verfahren der Herstellung von Platten ("flat sheets") abläuft. Diese Erfindung erlaubt es somit, zur Herstellung von Hohlfasern mit Feinstrukturen und Eigenschaften, die denen der Platten ähnlich sind, mit im wesentlichen den gleichen Formmassen-Zusammensetzungen, Quenchmedien und Temperatureinstellungen wie bei der Herstellung von Platten zu arbeiten. Bei Anwendung der Methoden dieser Erfindung steht es einem Arbeiter, der bestrebt ist, bessere Hohlfaser-Membranen zu entwickeln, frei, mit Platten zu experimentieren und - wegen deren leichter Herstellung - Platten herzustellen, und dies in der Zuversicht, daß sich die Ergebnisse leicht auf Hohlfaser-Strukturen übertragen lassen. Die sich daraus ergebenden Vorteile in puncto Zeit, Materialkosten, Arbeitskräfteeinsatz und Investitionskosten können erheblich sein.
Ein weiterer Vorzug dieser Erfindung ist, daß teure oder relativ toxische Außenringfluids effektiv genutzt werden können, da nur geringe Flüssigkeitsmengen eingesetzt werden müssen. Auch hier ergeben sich wieder Kosteneinsparungen, und dies nicht nur in bei der Materialbeschaffung, sondern auch bei der anschließenden Abfallentsorgung.
Der Einsatz der Spinndüsen-Baugruppe der vorliegenden Erfindung bietet auch in fertigungstechnischer Hinsicht eine bedeutende Verbesserung, indem die Möglichkeit geboten wird, den wünschenswerten Effekt eines hohen Lösungsmittelgehalts des Außenringfluids zu erzielen, sofern gewünscht, mit anschließender schneller Entfernung des Lösungsmittels bei Eintritt in ein wäßriges Quenchbad. Somit lassen sich anhand der Verfahren dieser Erfindung bislang unerreichbare Membranstrukturen realisieren und strukturelle Merkmale beherrschen.
Dies hat zur Folge, daß die Rolle, die der Luftspalt bei der Steuerung der Lösungsmittel-Verdunstungszeit spielt, weitgehend entfällt. Der Abstand zwischen der Austrittsseite der Spinndüse und dem Quenchbad wird somit relativ unwichtig. Der Abstand spielt nur dann eine wichtige Rolle in dem Prozeß, wenn die Kinetik der Membranbildung ausreichend langsam ist oder wenn die Zusammensetzung des Außenringfluids der Struktur der Membran selbst schadet.
Desweiteren gilt, daß wenngleich auch das Innenring- und das Außenringfluid beide sowohl zur Einleitung der thermischen Phasentrennung als auch zum Abkühlen (Quenchen) der resultierenden feinporigen Struktur dienen können, das stationäre Wasch-/Quenchbad dennoch dazu dient, die Membranstruktur teilweise abzukühlen und zu konservieren. Wie bereits erwähnt, wird neben anderen verunreinigenden Substanzen auch das starke Lösungsmittel während des Waschvorgangs von der Membran abgewaschen. Vorzugsweise sollte auch die Badtemperatur oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur der Formmasse gehalten werden.
Phasengrenzen können natürlich zur Festlegung von Prozeßtemperaturen dienen. Typischerweise wird eine Temperatur von 10ºC über der unteren kritischen Lösungstemperatur zur Herstellung relativ isotroper feinporiger Membranen mit Poren im Bereich von 1 mm Durchmesser verwendet. Die Formmassen können in dem Einphasen-Bereich des Phasendiagramms gehalten werden (z.B. bei 60ºC), bevor sie die Spinndüse im Strangpressvorgang erreichen; die Formmasse kann aber auch, was gleichermaßen von Nutzen ist, zur Phasentrennung innerhalb der Formmassen-Leitungen oder im Formmassen- Vorratsbehälter veranlaßt werden. Die aufwärts gerichtete Strömung der Spinndüse, bei der die thermische Phasenumkehrung eintritt, scheint nicht von großer Bedeutung zu sein, eine Feststellung, die im Gegensatz zu der allgemeinen Lehre auf dem Gebiet der Membran-Technik steht, die besagt, daß Formmassen bis zu ihrem Austritt aus der Spinndüse stets in dem Einphasen-Bereich gehalten werden sollten. Nach dem herkömmlichen Stand der Erkenntnisse sollte eine Phasentrennung in jedem Teil der Spinndüsen-Vorrichtung vermieden werden, da sie normalerweise zu nichtreproduzierbaren und schlechteren Membraneigenschaften führt (z.B. Fehler, geschlossene Zellmatrixstruktur und ähnliches). Wichtig ist jedoch, so hat man festgestellt, daß die Formmasse vor oder kurz nach dem Kontakt mit dem Quenchmittel eine Temperatur erreicht, die der unteren kritischen Lösungstemperatur entspricht oder diese überschreitet. Entsprechend werden im Falle der Herstellung von Platten Polymer-Formmassen vorzugsweise im Einphasen-Bereich stranggepreßt und in Wasser mit einer Temperatur von ca. 80ºC bis 90ºC abgeschreckt (gequencht). Im Falle von Hohlfasern werden sowohl das Spinn-(Quench-)bad als auch die Spinndüse vorzugsweise auf einer Temperatur von ca. 80ºC bis 90ºC gehalten.
Die Hohlfasern werden nach Austritt aus dem Spinnbad vorzugsweise gleich "on- line" in einer Reihe von Galette-Bädern ("Godet baths") gewaschen. Ein Galette-Bad besteht aus einem Paar teilweise in eine Waschwanne eingetauchten Trommeln. Die Fasern werden mehrmals um diese umlaufenden Trommeln gewickelt, wodurch die Verweildauer der Fasern in dem Bad verlängert wird. Auch die Galette- und Waschbad- Temperaturen sind wichtige Faktoren in bezug auf die Durchlässigkeit und Feinstruktur der Membran. Eine übliche Waschtemperatur nach Übernahme der Faser von der Spinn- Strecke liegt beispielsweise bei 60ºC (bei einer Dauer von ca. einem Tag). Erfolgt das Waschen jedoch statt dessen bei Raumtemperatur, dann können die Fasern eine reduzierte Wasserdurchlässigkeit im Vergleich zu bei 60ºC gewaschenen Fasern aufweisen. Diese Fasern mit reduziertem Lp zeigen, wenn sie anschließend bei 60ºC oder einer höheren Temperatur gewaschen werden, eine gleichwertige Durchlässigkeit wie solche Fasern auf, die unmittelbar nach ihrer Herstellung in der Spinn-Strecke bei 60ºC gewaschen werden.
Beim Strangpressen von bevorzugten PES/PEO-Formmassen läßt sich eine Reihe von Bohrungseinspritz-(Innenring)-Fluids mit guter Wirkung einsetzen. Hierzu zählen: Wasser, Wasser/Lösungsmittel-(z.B. NMP-)Gemische, reine Lösungsmittel (z.B. NMP), wasserlösliche Polymer-Lösungen (z.B. PVA), Gas (z.N. Stickstoff), angefeuchtetes Gas, verschiedene Nicht-Lösungsmittel und Flüssigkeiten, die mit Komponenten der Formmasse nicht mischbar sind, je nachdem, was man letztlich erreichen will. Bei der Herstellung von relativ isotropen feinporigen Membranen mit Oberflächenporen in dem Bereich von 1 um ist das bevorzugte Bohrungseinspritzfluid ein Wasser/NMP-Gemisch.
Ebenso können die Außenringfluid-Zusammensetzung und die Strömungsgeschwindigkeit jeweils über einen sehr großen Bereich variiert werden, um die Art der Oberflächenporen oder den Symmetriegrad in der Unterstruktur zu steuern. Auch hier kann, um im wesentlichen isotrope Strukturen zu erzielen, dasselbe Fluid als Innenring- und als Außenringfluid eingesetzt werden.
Wichtig ist, und daran sollte man immer denken, daß der Fachmann auf dem Gebiet der Membran-Technik die Verfahren und die Vorrichtung, die in dieser Unterlage beschrieben werden, in ihrem ganzen Umfang nutzen kann, um die Spinnbedingungen auf vielfältige Weise so abzustimmen und zusammenzustellen (z.B. durch Verwendung eines Nicht-Lösungsmittels als Innenringfluid und eines starken Lösungsmittels als Außenringfluid, durch Arbeiten mit verschiedenen Temperaturen, usw.), daß ein breites Spektrum an Hohlfasern mit Porengrößen im Bereich von u-Werten bis zweistelligen Angström-Werten hervorgeht.

5.3.4 Ladungsmodifizierte PES-Membranoberflächen

Handelsübliche 2,5-cm-Polysulfon-Membranplatten (Tuffryn-Membranfilter, HT- 200, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) werden mit kaltem Wasser dreimal gewaschen, um die in Isopropanol extrahierbaren Stoffe zu entfernen. Die Membranen werden sodann über Nacht gewaschen, um in Acetonitril extrahierbare Stoffe zu entfernen. Die Membranen werden anschließend mit 10% EGDGE in 0,6 N NaOH 4 Stunden lang aktiviert, um schwebende kovalent gebundene Epoxid-Gruppen zu bilden. Nach dem Abwaschen des überschüssigen EGDGE mit kaltem demineralisiertem Wasser werden einige Membranen in 2 % HEC in 0,6 N NaOH, einige in 2 % Carboxymethyl-Zellulose (CMC) (Cellulose Gum-CMC, Typ 7LF, Hercules Inc., Wilmington, Del.) in 0,6 N NaOH und einige in 2 % Poly(ethylenimin) (PEI) (Molekulargewicht 70.000, Aldrich Chemicals, Milwaukee, Wisconsin) gewaschen. Eine extrahierte Kontroll-Tuffryn-Membran wird ebenso in demineralisiertes Wasser gegeben. Sodann werden alle Membranen für 16 Stunden in ein auf 60ºC erwärmtes Wasserbad gegeben, um die kovalente Pfropfung ("grafting") einzuleiten. Im Anschluß daran werden die Membranen mit 60ºC heißem demineralisiertem Wasser gewaschen, um die unreagierten wasserlöslichen Polymere zu entfernen. Danach werden die Membranen anhand des in Beispiel 6.4.2 in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 07/258.406 von Azad und Goffe mit dem Titel "Process for the Covalent Surface Modification of Hydrophobic Polymers and Articles Made Therefrom" ("Verfahren zur kovalenten Oberflächen-Modifizierung von hydrophoben Polymeren und daraus hergestellten Artikeln"), die durch Bezugnahme in der vorliegenden Unterlage Bestandteil derselben ist, angegebenen Standardprotokolls, jedoch mit den nachgenannten Abweichungen, auf ihre Fähigkeit zur Bindung und Elution von Human-IgG getestet. Das Human-IgG wird in der phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Tween 80, die zuvor im Verhältnis 1:10 verdünnt wurde, gelöst. Die Waschvorgänge werden unter Verwendung derselben verdünnten Pufferlösung durchgeführt. Das Elutions-Protokoll entspricht dem Protokoll, das in besagtem Beispiel 6.4.2 der obengenannten US-Patentanmeldung angegeben ist. Die Ergebnisse der Elution sind in Tabelle I zusammengefaßt. TABELLE I Aus mit HEC CMC und PEI vorbehandelten handelsüblichen Tuffryn-Polysulfon-Membranen und aus Kontroll-Membranen eluiertes Human-IgG Probe mg eluiertes IgG/ml a Membranvolumen HEC-beschichtet CMC-beschichtet PEI-beschichtet Kontroll-Membran, unbeschichtet
Die Ergebnisse entsprechen jeweils dem Mittelwert von zwei Proben.
Die Ergebnisse lassen vermuten, daß Membranen mit ladungsmodifizierter Oberfläche (Positionen 2 und 3 in Tabelle I) besser in der Lage sind, Human-IgG zu binden, als Membranen mit einer einfachen hydrophilen (HEC-) Oberfläche.

5.3.5 Herstellung von Moduln, die modifizierte Hohlfaser-Membranen enthalten

PES/PEO-Hohlfaser-Membranen (Los-Nr. 2300-6) werden wie in Beispiel 6.8 beschrieben hergestellt. Ca. 100 Stück 457,20 mm (18 inch) große Faser-Membranen werden in ein 2-I-Becherglas gegeben. Die Membranen werden wie normal mit 95ºC heißem Wasser über 16 Stunden und anschließend mit 5 N NaOH bei 95ºC über 16 Stunden gewaschen, um die endständigen funktionellen Gruppen an der Oberfläche zu maximieren. Proben der mit NaOH behandelten Faser werden zu Analysezwecken aufbewahrt. Die verbleibenden Fasern werden sodann mit EGDGE aktiviert und mit HEC einmal (1 x HEC) wie oben beschrieben gepfropft. Nach dem Waschen mit heißem Wasser werden die Fasern in zwei Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe wird in kaltem Wasser gewaschen, während die zweite Gruppe in Acetonitril gewaschen wird. Die zweite Gruppe Fasern wird anschließend in kaltes Wasser gegeben. Nun werden beide Faser-Gruppen einem zweiten Pfropfvorgang mit HEC unterzogen, anschließend in heißem Wasser zur Entfernung von unreagiertem HEC gewaschen, und schließlich in kaltem Wasser und Acetonitril wie oben beschrieben gewaschen. Dieses Verfahren wird wiederholt, um eine dreimal HEC-gepfropfte (3 x HEC) PES-Faser zu erhalten. Die Proben werden erneut in Wasser und Acetonitril gewaschen. Es werden auf jeder Aufbereitungsstufe Proben zur Bestimmung der Hydroxylgruppen-Konzentration und nichtspezifischen Bindung sowie zur Ermittlung der Durchlässigkeit und Protein-A-Kopplung/Human-IgG-Bindung und -Elution zurückbehalten. Die ermittelten Werte für die Hydroxylgruppen-Konzentration und die nichtspezifische Bindung von Rinder-Serumalbumin sind in Tabelle II zusammengefaßt. TABELLE II Hydroxylgruppen-Konzentration insgesamt (-OH-Konz.) und nichtspezifische Bindung (NSB) von PES/PEO-Hohlfasern (2300-6) nach verschiedenen Oberflächenbehandlungen Probe -OH-Konz. Nach NaOH-Behandlung HEC-beschichtet einmal beschichtet zweimal beschichtet dreimal beschichtet Kontroll-Membran hydrophil, 'Durapore' (0,22 um) nur mit Wasser gewaschen gering* mit Acetonitril gewaschen
* Die nichtspezifische Bindung (NSB) war sehr gering, ein quantitativer Wert war schwerlich zuzuordnen. Die -OH-Konzentrationen sind angegeben in umol -OH pro ml Membran-Volumen, und die NSB-Werte verstehen sich in ug monomerisches Rinder- Serumalbumin (BSA) pro ml Membran-Volumen.
Die Fasern (2300-6) haben eine Ausgangs-Durchlässigkeit vor Aufbringung der HEC-Beschichtung im Bereich von 900 x 10&supmin;&sup4; cm³/Ns (900 x 10&supmin;&sup9; cm³/Dyn s). Nach dreimaligem Pfropfen ("grafting") mit HEC liegen die Durchlässigkeitswerte noch in dem Bereich von 290 bis 300 x 10&supmin;&sup4; cm³/Ns (290 bis 300 x 10&supmin;&sup9; cm³/Dyn s). Dieses Ergebnis zeigt erneut die Leistungsfähigkeit der vorliegenden Erfindung, bei der das kovalente Pfropfen generell auf die Oberflächenschichten beschränkt bleibt, während die Poren der Membran unverstopft bleiben.
Die Fasern, die dreimal mit HEC beschichtet wurden, jeweils mit zwischengeschalteten Waschgängen in Acetonitril, werden nun in einem Becherglas FMP-aktiviert und anschließend luftgetrocknet. Ein leeres Polysulfon-Modul wird mit 0,5 ml der Hohlfaser- Membranen gepackt. Sodann wird rekombinantes Protein A mit dem Inhalt des Moduls gekoppelt. Das Modul wird anschließend auf seine Fähigkeit zur Bindung von Human-IgG aus der IgG-haltigen phosphatgepufferten Kochsalzlösung getestet. Nach dem Beladen mit Human-IgG und Abwaschen von ungebundenem IgG eluiert das Modul 4,0 mg IgG, was einer Membran-Kapazität von 8,0 mg IgG/ml Membran-Volumen entspricht.

5.3.5.1 Immunoaffinitäts-Reinigung von Faktor VIII (FVIII)

Zweihundertundsechzig 558,80-mm-(22-inch-)PES/PEO Hohlfaser-Membranen (Los-Nr. 2400-5), hergestellt nach dem in Beispiel 7.6 der gleichzeitig anhängigen US- Patentanmeldung Nr. 07/258.406 beschriebenen Verfahren und mit einer Wasserdurchlässigkeit von 500 x 10&supmin;&sup4; cm³/Ns (500 x 10&supmin;&sup9; cm³/Dyn s) werden 16 Stunden lang in 2 Liter 95ºC heißem Wasser getränkt. Anschließend werden die Fasern in einem Autoklaven mit Dampf bei 121ºC für 15 Minuten behandelt. Sodann werden sie 16 Stunden lang in Acetonitril bei Raumtemperatur getränkt, danach mit kaltem Wasser gewaschen und im Anschluß daran einer 4-stündigen Behandlung mit 0,6 N NaOH mit 10 % EGDGE-Gehalt unterzogen. Nach dem Abwaschen des überschüssigen EGDGE mit kaltem demineralisiertem Wasser werden die Fasern in 0,6 N NaOH mit 2 % HEC bei 75ºC für 3 Stunden getränkt und anschließend mit heißem demineralisiertem Wasser mit 55ºC gewaschen (um das unreagierte HEC und das überschüssige NaOH zu entfernen). Nun werden die Fasern einer Behandlung mit FMP unterzogen und luftgetrocknet. Die Wasserdurchlässigkeit der FMP-aktivierten Fasern beträgt 138,10&supmin;&sup4; cm³/Ns (138 x 10&supmin;&sup9; cm³/Dyn s) bei einem durchschnittlichen mittleren Porendurchmesser von 0,30 mm, gemessen mit einem Coulter-Porimeter. Die Fasern haben außerdem eine Hydroxyl-Konzentration von 32,4 mmol/ml Membran. Nun wird ein Hohlfaser-Membranmodul mit einem Innenvolumen von 1,5 ml hergestellt, indem mehrere Fasern, die wie oben beschrieben vorbehandelt worden sind, in ein Polysulfon-Modul gepackt werden. Das endgültige Hohlfaser- Membranvolumen beträgt 0,5 ml.
Eine NaHCO&sub3; Pufferlösung (pH 8,1, 15 ml) mit einem Gehalt von 0,3 mg Anti- FVIII-Antikörper/ml wird durch Verdünnen von Anti-FVIII-Antikörpern (bezogen als Aszites- Flüssigkeit ESWF 7 von American Diagnostic, New York, NY, und gereinigt mittels einer Protein-A-Säule) mit einem Bicarbonat-Puffer (dargestellt entsprechend Beispiel 6.4.1 der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 07/258.406), anschließendes Aufkonzentrieren der resultierenden Lösung durch Ultrafiltration und Verdünnen des konzentrierten Antikörpers auf die geeignete Konzentration hergestellt. Die Antikörper-Lösung wird nun bei Raumtemperatur mittels einer Schlauchpumpe im Kreislauf durch das Hohlfaser- Membranmodul gepumpt. Der lose gebundene Antikörper wird durch Waschen des Moduls mit Natriumbicarbonat-Puffer entfernt. Unreagierte FMP-Gruppen werden anhand des in Beispiel 6.4.1 der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 07/258.406 für Protein A beschriebenen Verfahrens, von der Verwendung der Pumpe zur Umwälzung von Lösungsmitteln und Reagenzien abgesehen, entfernt. Das kovalent-gebundene Antikörper enthaltende Modul wird dann auf seine Fähigkeit zur Aufnahme von FVIII wie nachfolgend beschrieben getestet.
FVIII-Konzentrat (1,3 Einheiten/mg Protein, Hyland Laboratories, Inc., California) wird mit 0,015 M Citrat-Puffer (pH-Wert 7,0) mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl auf 0,76 Einheiten/ml verdünnt. Die verdünnte Pufferlösung wird einmal durch das Hohlfaser- Membranmodul mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min geschickt. Insgesamt 22,9 ml (17,3 Einheiten) Puffer werden durch das Modul geleitet. Das Filtrat wird zur Analyse des Proteingehalts aufbewahrt. Das System wird sodann mit einem Puffer, der 0,015 M Natriumcitrat und 0,15 M NaCl (pH-Wert 7,0) enthält, gewaschen, bis die Absorption der Waschlösung bei 280 nm vernachlässigbar ist, was darauf hinweist, daß sich von dem Modul kein lose gebundenes Protein mehr löst (ca. 30 ml). Der gebundene FVIII wird dann mit einer gepufferten Lösung, die 1 M Kl, 1 M Lysin, 20 mM Imidazol und 5 mM CaCl&sub2; enthält (pH-Wert 6,5), eluiert. Das Filtrat und das Eluat werden dann gesondert auf ihre FVIII:C-Aktivität hin mittels eines Stratchrom FVIII:C Anti-hemophilic Factor Chromogenic Assay (Diagnostica Stago, 6 ter, rue Denis Papin, 92600 Asnieres, Frankreich) analysiert. Die Filtrat-Analyse ergab einen Gehalt von 3,3 Einheiten, was bedeutet, daß 81 % des aufgebrachten FVIII von dem Modul festgehalten werden. Die Eluat-Fraktion (3,8 ml) enthielt insgesamt 8,0 Einheiten FVIII:C-Aktivität, was einer Rückgewinnung von insgesamt 46 % FVIII:C-Aktivität entspricht. Der Rest des ursprünglich aufgebrachten FVIII wird in der Puffer-Waschlösung vermutet. Die spezifischen FVIII:C-Aktivitäten des Ausgangsmaterials (1,3 Einheiten/mg Protein) und des eluierten FVIII (150 Einheiten/mg Protein) werden ausgehend von der FVIII-Aktivität und Proteinkonzentration, wie mit dem Lowry-Protein-Assay gemessen, bestimmt; der ermittelte Reinigungsfaktor war 115. Das obige Verfahren ist noch nicht optimal und könnte zweifellos, z.B. durch Senkung der Strömungsgeschwindkeit, Umwälzung der gepufferten Proteinlösung oder Änderung der Puffer-Bestandteile, verbessert werden.
Es ist klar, daß die Erfindung, die Gegenstand der vorliegenden Patentbeschreibung und Patentansprüche ist, nicht auf die Immunoaffinitäts-Reinigung von FVIII als Ligat beschränkt ist. Die Isolierung und Reinigung von anderen Ligaten, insbesondere von solchen von biologischer Bedeutung, anhand von Verfahren, die den obenbeschriebenen Verfahren ähnlich sind, fällt ebenso in den Bereich dieser Erfindung. Beispiele für Ligate, die mittels Immunoaffinität und biospezifischer Erkennung gereinigt werden können, sind u.a. Gewebeplasminogen-Aktivator, Human-Koagulationsfaktor IX, Hormone, Interleukine, sonstige Proteine vom Menschen oder Säugetier, usw., wie in Abschnitt 5 bereits beschrieben.

5.3.6 Modifizierung von handelsüblichen Platten- und Hohlfaser-Membranen

Handelsübliche Polysulfon-Platten- und -Hohlfaser-Membranen werden wie folgt modifiziert, um die allgemeine Anwendbarkeit dieser Erfindung zu demonstrieren.
Die 0,2-um-Polysulfon-Hohlfaser-Membran (Modell CFP-2-E-4, AG Technology Corp., Needham, Mass.) wird aus dem Mikrofilter-Modul herausgenommen und zwei Wochen lang mit Isopropanol gewaschen, um alle mit Isopropanol extrahierbaren Stoffe zu entfernen. Die handelsübliche 0,45-um-Polysulfon-Platten-Membran (HT-450 Tuffryn, 25 mm Durchmesser, Produkt-Nr. 66221, Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan) wird zunächst mit Wasser gewaschen, um alle mit Wasser extrahierbaren Stoffe zu entfernen, und wird anschließend über Nacht mit Isopropanol gewaschen, um mit Isopropanol extrahierbare Stoffe zu entfernen. Ein Teil dieser Membranen wird außerdem 16 Stunden lang über Nacht [mit Acetonitril] gewaschen, um alle mit Acetonitril extrahierbaren Stoffe zu entfernen.
Sodann wird von den unterschiedlich behandelten Membranen jeweils ein Teil einer 16-stündigen Behandlung mit 10% EGDGE in 0,6 N NaOH unterzogen und dann mit HEC gepfropft ("grafting"), wie bereits beschrieben. Danach werden die Proben mit heißem Wasser gewaschen und zum Zwecke einer Bestimmung der Hydroxyl-Gruppen- Konzentration und nichtspezifischen Rinder-Serumalbumin-Bindung (BSA-NSB) aufbewahrt. In der Tabelle XV der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung von Azad und Goffe sind die Ergebnisse der Analyse der -OH-Gruppen-Konzentration und der nichtspezifischen Rinder-Serumalbumin-Bindung (BSA-NSB) dieser Membranen auf verschiedenen Stufen der Oberflächenbehandlung zusammengefaßt. All diese Messungen werden in einer Versuchsmatrix mit der handelsüblichen Kontroll-Membran durchgeführt.

5.4 Technische Angaben zum Membranverfahren und zur Apparatur

Die Vorrichtung kann in der Größe konfiguriert werden, die erforderlich ist, um die Verfahrensschritte ausführen zu können. Vier Verfahrensschritte werden bevorzugt: (1) BELADEN, (2) WASCHEN, (3) ELUIEREN und (4) REGENERIEREN. Die Prinzipien der Übertragung auf die Prozeßebene werden im folgenden beschrieben. Dieser Beschreibung schließt sich eine ausführliche Beschreibung der Verfahrensschritte in Verbindung mit den in den Abbildungen 1 und 2 gezeigten schematischen Darstellungen an.
Die Übertragung des Membranverfahrens auf eine höhere Anwendungsebene geht aus von den Stoffaustausch- und Druckabfall-Beschränkungen. Das Verhältnis der Variablen, die für Stoffaustausch-Beschränkungen verwendet werden, ist durch Gleichung 1 definiert. Dieser Ausdruck wird verwendet zur Festlegung des Systemumfangs oder der Modulgröße ausgehend von: 1) der Kenntnis des pro Tag zu verarbeitenden Fluid- Volumens, Q; 2) der Morphologie der porigen Membranstruktur; 3) dem Diffusionskoeffizienten des Ziel-Moleküls; und 4) dem Wert der Péclet-Zahl für günstiges Auffangen. Aus Gleichung 1 wird
Gleichung 2
V&sub0; = QL*tD/Pe
In dieser Bemessungsgleichung kann Pe als 0,01 spezifiziert werden, ist tD als LD²/D gegeben, und ist QL das Durchflußvolumen beim BELADEN basierend auf Q. Diese Berechnungsformel liefert als Ergebnis einen Wert für das Membran-Hohlraumvolumen, V&sub0;, wobei:
Gleichung 3
Vm = Vo/Porositätsfraktion
Vm entspricht dem von der Membran eingenommenen Volumen. Ausgehend von einer Membran mit definierter Wanddicke, definiertem Durchmesser (Weite) und definierter Länge ist die erforderliche frontseitige Oberfläche der Membran definiert.
Druckabfall-Beschränkungen ergeben sich aus der Notwendigkeit, für eine gleichförmige Durchtränkung der Membran in Abwärtsrichtung entlang der Länge des Kanals zu sorgen. Um dies zu erreichen, wird das Verhältnis von transmembranen/translumenalen Druckabfall auf einen Wert kleiner 0,10 beschränkt. Diese Beschränkung kann außerdem Änderungen der Maße des Strömungskanals und/oder der Membranoberfläche nach sich ziehen.
Mit dem obenskizzierten Bemessungsprozeß lassen sich drei Ausstattungsgrößen der Modulvorrichtung definieren. Dies schließt Prozesse größeren Umfangs, die sich über jedes beliebige in einer geforderten Zeitspanne zu verarbeitende Volumen erstrecken können, nicht aus.
Die Membranmodulgröße kann definiert werden als 1,5 ml, 30 ml oder 150 ml, bezogen auf das ungefähre Innenvolumen des Moduls selbst. Hohlfaser-Membrane nehmen typischerweise 1/3 des Gesamtmodulvolumens ein. Eine dieser Erfindung entsprechende 1,5-ml-Modulvorrichtung für Laborzwecke kann 5 Liter Zustrom pro Tag verarbeiten, was einer Ausbeute an monoklonalem Antikörper-Produkt im Bereich von 200 mg entspricht. Eine der vorliegenden Erfindung entsprechende Membranmodulvorrichtung von 30 ml Größe für Pilotzwecke kann 100 Liter Zustrom täglich aufbereiten. Die dieser Erfindung entsprechende 150-ml-Membranvorrichtung für die Prozeßebene wird 500 Liter täglich gemäß dieser Erfindung aufbereiten. Eine ähnliche Membranverfahrens-Vorrichtung entsprechend dieser Erfindung wird 500 Liter täglich entsprechend dieser Erfindung aufbereiten. Es lassen sich ähnliche Membranverfahrens-Vorrichtungen konstruieren, die 2.000 bis 10.000 Liter täglich aufbereiten. Das Innenvolumen des Moduls kann, entsprechend dem Anwendungsbereich dieser Erfindung, zwischen 1 ml oder weniger und 10 l oder mehr betragen, wobei es vorzugsweise zwischen 1,5 ml und ca. 1 000 ml liegt.
Die Membranverfahrens-Vorrichtungen, gleich welcher Größe, sind so ausgelegt daß ihr Raumbedarf unter dem einer Vorrichtung liegt, die nach der Säulentechnik arbeitet und zur Verarbeitung eines vergleichbaren Zustromvolumens in der Lage wäre. Die Prozeßsteuerung sowie die Datenerfassung sind vorzugsweise automatisiert. Die Bediener-Schnittstelle umfaßt einen Einschaltknopf ("Power On"), Druckschalter für Start/Stop und eine Computer-Schnittstelle, die Zugriff auf die Systemsteuerung zur Änderung von Betriebsbedingungen gewährt. Der Computer und/oder mikroprozessorgestützte Controller steuert Elektromagnet- (pneumatische) Ventile sowie Druckpumpen an, um die gewünschten Durchflußmengen zu erreichen.
Die Ereignisse sind getaktete Regel-Intervalle oder Entscheidungen basierend auf einer beliebigen Kombination aus Absorptions-UV-Wert(en), Druck (Drücken), Leitfähigkeit, Füllstand (Füllstände) oder Temperatur. Die Entscheidung kann ausgehend entweder von größen- oder zeitbezogener Ableitung erfolgen und kann dazu verwendet werden, Schritte zu beginnen oder zu beenden oder Ventile anzusteuern.
Die Filtrat- und Umlaufströmungsmengen werden vorzugsweise von Schlauchpumpen gesteuert. Die Pumpendrehzahlen werden vorzugsweise über eine Bediener-Schnittstelle eingestellt, sie können jedoch auch druckabhängig geregelt werden.
Die Systeme können unter sterilen Bedingungen betrieben werden, wobei Einweg- Rohrleitungen und Quetschventile im Falle der kleineren Membranverfahrens-Vorrichtung und die Steam-In-Place-Technik (Bedampfung) im Falle der Membranverfahrens-Vorrichtung für die Prozeßebene zur Anwendung kommen. Die für die Prozeßebene ausgelegte Anlage wird während allen Betriebsphasen mit innerem Überdruck gefahren. Dies wird durch Abstimmung des Drucks im Luftraum der Behälter erreicht. Das System wird unter positivem Druck betrieben, um die erforderliche Zulaufhöhe für die Filtrat-Pumpe sicherzustellen.
Behältnisse mit Kühlmänteln und Umwälzschleife sind vorzugsweise mit Temperaturfühlern ausgestattet.
Behälter-Füllstände werden vorzugsweise mit Kapazitätsme ßfühlern überwacht.
Die mit den Fluid-Strömen in Kontakt kommenden Werkstoffe sind vorzugsweise nichtreaktiv, korrosionsbeständig und biokompatibel, wie z.B. Polypropylen, Silikon, Polysulfon, Polycarbonat, Teflon, Norphen, C-Flex (thermoplastisches Elastomer) sowie elektrolytisch polierter 316L-Edelstahl. Schlauchleitungen werden mittels "barbs to luers" (? Haken und Widerhaken ?) und Fittings angeschlossen und finden in dem kleineren System Verwendung. Die Schlauchpumpen in beiden Systemen, dem kleinen System für Laborzwecke sowie dem großen System, verwenden Schlauchleitungen. Die Leitungen in dem großen System sind vorzugsweise aus rostfreiem Stahl.
Im Falle der 1,5-ml- und 30-ml-Membran-Affinitätsabsorptionssysteme (Abbildung 1) wird die Vorrichtung vorzugsweise in der nachgenannten Schrittfolge betrieben (wobei "V" für ein Ventil und "P" für eine Pumpe stehen):

SCHRITT 1: BELADEN

Zweck dieses Schritts ist, die Membranstruktur mit dem Zielprotein zu beladen. Bei diesem Schritt kommt das Gegenstromfiltrationsprinzip zur Anwendung. Die Filtrat-Pumpe regelt die Durchflußgeschwindigkeit und und den Volumendurchsatz.

A. Umlaufstrom

- Die bevorzugte Durchflußgeschwindigkeit liegt im Falle des 1,5- ml-Moduls bei 50 bis 100 ml/min, im Falle des 30-ml-Moduls hingegen bei 250 bis 2.000 ml/min.
P1 sorgt für die Strömung zu den Affinitäts-Moduln
V4 ist offen
V8 lenkt die Strömung zu V9
V9 lenkt die Strömung zu dem Umlauf-Behälter

B. Filtrat-Strom

- Die bevorzugte Durchflußgeschwindigkeit liegt im Falle des 1,5- ml-Moduls bei 2 bis 20 ml/min, im Falle des 30-ml-Moduls bei 40 bis 400 ml/min.
P2 regelt den Durchfluß durch die Membran in dem Affinitäts-Modul
V5 lenkt die Strömung zu V6
V6 lenkt die Strömung zu P2
V7 lenkt die Strömung zum Filtrat-Ablaß

SCHRITT 2: WASCHEN

Dieser Schritt dient dem Zweck, unerwünschte und ungebundene Proteine aus dem Affinitäts-Modul und der Membran zu entfernen.
P1 stoppt und V4 schließt

A. Abspülen des Mantels

P2 pumpt Puffer zur Mantelseite des Moduls
V1 lenkt Strömung zu V6
V6 lenkt Strömung zu P2
V7 lenkt Strömung zu Affinitäts-Moduln
V5 lenkt Strömung zum Mantel-Ablaß

B. Auswaschen des Hohlraums (Lumen)

V4 ist offen, V5 stoppt Strömung zum Auslaß
P2 pumpt Puffer zur Mantelseite des Moduls
V1 lenkt Strömung zu V6
V6 lenkt Strömung zu P2
V7 lenkt Strömung zu Affinitäts-Moduln
V4 lenkt Srömung zu V8
V8 lenkt Strömung zum Hohlraum-Ablaß

SCHRITT 3: ELUIEREN

Der Zweck dieses Schritts besteht darin, für eine gleichmäßige Elution des Ziel- Moleküls aus der Membranstruktur zu sorgen. Der Teilschritt 'Eluieren von Produkt' dieses Verfahrensschrittes erfolgt vorzugsweise unter Anwendung des Rückspülverfahrens ("Backflushing").

A. Abspülen des Mantels

- Wie oben (in 2A), V2 liefert Puffer

B. Eluieren des Produkts

- Wie bei 'Abspülen des Mantels' (in 2B), mit folgenden Ausnahmen:
V8 lenkt die Strömung zu V9
V9 lenkt die Strömung in den Produkt-Behälter

SCHRITT 4: REGENERIEREN

Dieser Schritt dient dazu, die Membran wieder in einen Zustand zurückzuversetzen, der sich für ein Beladen eignet.

A. Abspülen des Mantels

- wie bei WASCHEN, V3 liefert Puffer

B. Auswaschen des Hohlraums

- wie bei WASCHEN, V3 liefert Puffer
Im Falle einer Großanlage (Abb. 2) wird die Vorrichtung vorzugsweise in der nachgenannten Schrittfolge betrieben ("V" steht wieder für ein Ventil und "P" wieder für eine Pumpe):

SCHRITT 1: BELADEN

Zweck dieses Schritts ist, die Membranstruktur mit dem Zielprotein zu beladen. Bei diesem Schritt kommt das Gegenstromfiltrationsprinzip zur Anwendung. Die Filtrat-Pumpe ist umschaltbar und regelt die Durchflußgeschwindigkeit und den Volumendurchsatz. V1, V2, V3 und V4 sind geöffnet. Alle anderen Ventile sind geschlossen.

Umlaufstrom

- bevorzugte Durchflußgeschwindigkeit für ein 150-ml-Membranmodul: 5 bis 10 l/min
P1 sorgt für die Strömung zu den Affinitäts-Moduln

Filtrat-Strom

- 0,2 bis 2 l/min, typischerweise
P2 regelt den Durchfluß durch die Membran in dem Affinitäts-Modul
V4 lenkt die Strömung zum Filtrat-Ablaß
PR1 sorgt für positiven einseitigen Druck auf das System und für die erforderliche Zulaufhöhe für P2

SCHRITT 2: WASCHEN

Dieser Schritt dient dem Zweck, unerwünschte und ungebundene Proteine aus dem Affinitäts-Modul und der Membran zu entfernen.
P1 stoppt und V1, V2, V3 und V4 schließen

A. Abspülen des Mantels

P2 pumpt Puffer zur Mantelseite des Moduls
V5, V6 und V7 sind geöffnet
V5 lenkt Strömung zu V6
V7 lenkt Strömung zu P2
V6 lenkt Strömung zum Ablaß

B. Auswaschen des Hohlraums (Lumen)

V5 ist geschlossen, V3 ist geöffnet
P2 pumpt Puffer zur Mantelseite des Moduls
V3 lenkt Strömung zu V6
V6 lenkt Strömung zum Ablaß

SCHRITT 3: ELUIEREN

Der Zweck dieses Schritts besteht darin, für eine gleichmäßige Elution des Ziel- Moleküls aus der Membranstruktur zu sorgen. Der Teilschritt 'Eluieren von Produkt' dieses Verfahrensschrittes erfolgt unserer Meinung nach vorzugsweise unter Anwendung des Rückspülverfahrens ("Backflushing").

A. Abspülen des Mantels

- Wie oben (in 2A), V8 liefert Puffer

B. Eluieren des Produkts

- Wie bei 'Abspülen des Mantels' (in 2B), mit folgenden Ausnahmen:
V3 ist geschlossen, V10 ist geöffnet
V10 lenkt die Strömung zum Produkt-Behälter

SCHRITT 4: REGENERIEREN

Dieser Schritt dient dazu, für eine gleichmäßige Regenerierung der Membran- Hohlfasern zu sorgen. Nach der Regenerierung der Membran-Hohlfasern kann der Zyklus wiederholt werden.

A. Abspülen des Mantels

- wie oben (in 2A), V9 liefert Puffer

B. Auswaschen des Hohlraums

- wie bei WASCHEN (2B), jedoch liefert wieder V9 den Puffer
Die obigen Beispiele veranschaulichen im einzelnen die bevorzugte Verkörperung der Membran-Vorrichtung. Diese Vorrichtung arbeitet nach dem Prinzip der Gegenstromfiltration in dem Verfahrensschritt BELADEN und nach dem Prinzip der Membran-Rückspülung in den Verfahrensschritten WASCHEN, ELUIEREN und REGENERIEREN. Es fällt auch in den Bereich dieser Erfindung, daß auf die Gegenstromfiltration verzichtet werden kann, in welchem Falle die Filtration vom Ende aus erfolgt, wobei das gesamte Volumen des Einsatzstroms die Membran passiert. Es liegt ebenso im Bereich dieser Erfindung, auf das Rückspülen in den Schritten WASCHEN, ELUIEREN und REGENERIEREN zu verzichten und die Lösungen statt dessen komplett in derselben Richtung wie in dem Verfahrensschritt BELADEN durch die Vorrichtung zu pumpen.
Weitere bevorzugte betriebstechnische Daten, die speziell für die große Anlage oder Anlage für die Prozeßebene gelten, sind im folgenden angegeben. Die Affinitäts-Vorrichtung für die Prozeßebene sollte selbstablaufend/selbsttrocknend und frei von Sprüngen oder Rissen sein. Diese technischen Daten lassen sich sowohl auf das 1,5-ml- als auch das 30-ml-Membranverfahren und die entsprechenden Vorrichtungen maßstäblich übertragen.
Die bevorzugten Leistungsdaten für die Großanlage sind in Tabelle III zusammengefaßt. TABELLE III IgG-Einlaßkonzentration IgG-Auslaßkonzentration IgG-Bindungsfähigkeit IgG-Bindungsfähigkeit insgesamt IgG-Reinheit IgG-Spezifität Protein-A-Bindungsfähigkeit Zyklen/Modul < 1 mg Serumprotein/ml MV
Die bevorzugten Strömungsgeschwindigkeiten, Drücke und Temperaturen sind in Tabelle IV angegeben: TABELLE IV Drücke Basisfall Statischer Betriebsdruck Transmembran Temperaturen Produkt- & Umlauffluid-Behälter Puffer Einlaß Schleifen-Gradient Strömungsgeschwindigkeiten Filtrat Umlauffluid Durchtränkte Fraktion Puffer
Die in der Großanlage vorzugsweise verwendeten Volumen sind in der Tabelle V angegeben. TABELLE V Basisfall Beladen Waschen Eluieren Regenerieren Adsorption/8-Std.-Schicht Puffer/8-Std.-Schicht Adsorption/Los Adsorption/Woche
Das Modul für die für die Prozeßebene ausgelegte Affinitäts-Vorrichtung hat vorzugsweise die folgenden technischen Daten:
Volumen 150 ml
Anzahl pro System 4
Werkstoff Polysulfon
Druck 2,04 bar (30 psig)
Temperaturgrenze 126ºC
Anschlüsse 1-1/2 Triclamp
Die bevorzugten technischen Daten der Fasern für den Einsatz in der Affinitäts- Vorrichtung sind wie folgt:
Wirksame Länge 13 +/- 0,5 cm
Gesamtlänge 15 +/- 0,5 cm
Innendurchmesser 1000 +/- 5,0 um
Außendurchmesser 1600 +/- 5 um
Porosität 0,8 +/- 0,05 - 0,35
Porengröße 0,6 um + 1,0 - 0,3
Membranvolumen/Faser 0,159 +/- 0,012 ml
Fasern/Modul 285+/- 15
Gesamt-Membranvolumen/Modul 45 +/- 5 ml
Oberfläche/Modul 1163 +/- 155 cm²
Dynamischer Druckabfall 0,14 - 0,48 bar (2 - 7 psig)
Der Einsatz der Affinitäts-Vorrichtung bei der Durchführung eines Affinitäts-Reinigungsverfahrens ist in dem nachfolgenden Beispiel veranschaulicht.

6.0 Beispiele

6.1 Reinigung von Fibronectin aus Blutplasma anhand des Membran-Affinitäts-Verfahrens

Die Reinigung/Isolierung von Fibronectin (FN) aus Blutplasma wurde gemäß dem von Miekka u.a. (Thromb. Res. 27, 1-14,1982) beschriebenen allgemeinen Verfahren unter Einsatz von HPC-beschichteten PES/PEO-Platten-("flat sheet"-)Membranen, die immobilisierte aus Schweinehaut gewonnene Gelatine (Sigma Typ I) enthielten, durchgeführt. Membranplatten wurden in eine Kunstoff-Filterhalterung (2,5 cm Durchmesser) eingefügt, die in der in Abbildung 6 gezeigten Versuchsvorrichtung plaziert wurde. Die Konvektion von Blutplasma und Pufferlösungen durch die Membran-Vorrichtung wurde von einer Schlauchpumpe gesteuert. Die Absorption der ausfließenden Medien bei 280 nm wurde mit Hilfe eines UV-Detektors überwacht, der einem Fraktionssammler vorgeschaltet war. Der transmembrane Druck wurde mit Hilfe eines Online-Druckmeßwertwandlers gemessen. In einem typischen affinitätsmembran-gestützten FN-Reinigungsvorgang (Abbildung 7) wurden 4,6 ml Blutplasma auf eine 0,34-ml-Membran-Vorrichtung gegeben. Nach dem Waschen der Membran mit Ausgleichspuffer und 1 M NaCl wurde das FN durch Senkung des pH-Wertes auf 5,5 eluiert. Alle Schritte wurden mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min durchgeführt, was einer Membran-Verweilzeit von ungefähr 15 Sekunden entspricht. Eine Analyse der Filtratfraktionen auf FN mittels eines handelsüblichen turbidimetrischen Tests (Boehringer Mannheim) ergab, daß im wesentlichen das gesamte FN aus dem Einsatzplasma entfernt worden war. Die Ausbeute an isoliertem gereinigten FN betrug 0,34 mg, oder 26 % der Anfangsmenge von FN.
Proben von gereinigtem FN und von FN-erschöpftem Plasma wurden mit SDS- PAGE untersucht an Gelen mit einem Gradienten von 8 % - 25 % (Pharmacia), sichtbar gemacht durch Silberfärbung (Abbildung 8). Das in dem Ausgangsplasma (B) und in dem FN-Standard (E) erkennbare FN-Band um 230.000 Dalton fehlt nahezu völlig in dem FN- erschöpften Plasma (C). Das Eluat mit dem niedrige pH-Wert (D) ist beinahe reines FN, mit Spuren von Serumalbumin. Der Reinheitsgrad in Prozent des eluierten Produkts wurde durch Vergleich der Konzentration von FN, bestimmt duch Trübungsmessung, und der Protein-Konzentration, bestimmt durch A280 (basierend auf einem Wert von 12,8 für die Absorption einer 1-prozentigen FN-Lösung) ermittelt. Der für affinitätsmembran-gereinigtes FN ermittelte Wert beträgt 93 %.
Die Auswirkung der Plasma-Aufbringungsrate auf die FN-Aufnahmeleistung wurde mit Hilfe der obenbeschriebenen Versuchseinrichtung untersucht. Plasma (8,8 ml; 25,9 Membranvolumina) wurde durch die Membranvorrichtung mit Strömungsgeschwindigkeiten von 0,3, 1,0, 3,0 und 6,0 ml/min gepumpt (was einer jeweiligen Verweilzeit von 51, 15, 5,1 bzw. 2,6 Sekunden entspricht). Bei allen untersuchten Strömungsgeschwindigkeiten wurde festgestellt, daß mindestens 6,0 ml (18 Membranvolumina) von FN-erschöpftem Plasma vor dem Erscheinen von bemerkenswerten Mengen an ungebundenem FN aufgefangen werden konnten.

6.2 Immunoaffinitäts-Reinigung von Faktor VIII (F.VIII)

Ein 1,5-ml-Hohlfaser-Affinitätsmodul, das kovalent gekoppelte monoklonale Antikörper gegen F.VIII-Konzentrat, verdünnt auf 0,76 Einheiten/ml in 0,015 M Citrat, enthielt [wurde mit] 0,15 M Citrat, 0,15 M NaCl pH-Wert 7,0 mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min [beschickt]. Nach Aufbringung von 22,9 ml (17,3 Einheiten) wurde die Vorrichtung mit 0,015 M Citrat, 0,15 M NaCl pH-Wert 7,0 gewaschen, bis die Absorption der Waschflüssigkeit bei 280 nm vernachlässigbar war (30 ml). Der gebundene F.VIII wurde anschließend mit einer gepufferten Lösung, die 1 M KI, 1 M Lysin, 20 mM Imidazol, 5 mM CaCl&sub2; pH-Wert 6,5 enthielt, eluiert. Die aufgefangenen Filtrate und Eluate wurden auf ihre F.VIII:C-Aktivität hin analysiert. Die Analyse der Filtrate ergab einen Gehalt von 3,3 Einheiten, was darauf hinwies, daß die Vorrichtung 80 % des aufgebrachten F.VIII aufgefangen hatte. Die Eluat-Fraktion enthielt 8,0 Einheiten. Die Gesamtrückgewinnung an F.VIII:C-Aktivität betrug 46 %. Spezifische F.VIII:C-Aktivitäten des Einsatzmaterials und des eluierten F.VIII wurden ausgehend von der F.VIII-Aktivität und der Proteinkonzentration, wie anhand der Lowry-Analyse ermittelt, bestimmt. Ein Vergleich dieser Werte ergab einen Reinigungsfaktor von 115. Diese Daten sind in der nachfolgenden Tabelle VI zusammengefaßt: TABELLE VI Fraktion F.VIII-Aktivität Einh./ml Protein mg/ml Spezif. Aktiv. mg/ml Reinigungsfaktor Einsatzmaterial Eluat
Handelsübliches F.VIII-Konzentrat wurde von Hyland Laboratories, Inc. bezogen. Monoklonaler Antikörper gegen F.VIII-Komplex stammte von American Diagnostica. Dieser monoklonale Antikörper war in Aszites-Flüssigkeit gebildet und mittels Protein-A- Sepharose-Gel gereinigt worden; seine Bezeichnung ist American Diagnostic ESVWF1, was darauf hinweist, daß der monoklonale Antikörper den Von-Wildebrandtsche Anteil des Faktor-VIII-Komplexes erkennt.

6.3 Immunoaffinitäts-Reinigung von F.VIII aus Blutplasma

Ein 1,5-ml-Affinitätsmodul, das wie die in obigem Beispiel beschriebene Vorrichtung monoklonalen Antikörper gegen F.VIII enthielt, wurde mit unaufbereitetem Blutplasma mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min beladen. Nach der Einspeisung von 50,6 ml Plasma (50,6 Einheiten F.VIII:C-Aktivität) wurde die Vorrichtung wie oben beschrieben gewaschen und eluiert. Die aufgefangenen Filtrate und Eluate wurden auf ihre F.VIII:C-Aktivität hin analysiert, wie oben beschrieben. Im Falle der Filtrate wurde ein Gehalt von 8,1 Einheiten (16 % der aufgebrachten Aktivität) festgestellt, was zeigte, daß 84% des aufgebrachten F.VIII aufgefangen worden waren. Die Eluat-Fraktion enthielt 16,9 Einheiten (33 % der aufgebrachten Aktivität). Die Gesamtrückgewinnung an F.VIII: C-Aktivität betrug 49 %. Spezifische F.VIII:C-Aktivitäten der Eluat-Fraktion und des Ausgangsplasmas wurden ausgehend von den Ergebnissen der F.VIII:C-Analyse und der Proteinkonzentrationen, ermittelt anhand der Lowry-Analyse, bestimmt. Ein Vergleich der anfänglichen spezifischen Aktivität und der letztlichen spezifischen Aktivität ergibt einen Reinigungsfaktor von 56. Diese Ergebnisse sind im folgenden zusammengefaßt: TABELLE VI Fraktion F.VIII-Aktivität Einh./ml Protein mg/ml Spezif. Aktiv. Einh./mg Reinigungsfaktor Einsatzplasma Eluat

6.4 Protein-A-Membran-vermitteltes Auffangen von Human-IgG

Die Fähigkeit von Affinitätsmembranen zum effizienten Auffangen von Ziel-Proteinen bei Beschickungsgeschwindigkeiten, die Verweilzeiten von wenigen Sekunden entsprechen, wurde unter Verwendung von Protein A als Affinitäts-Ligand und IgG vom Menschen als Zielprotein untersucht und bewertet. Hierzu wurden Platten-Affinitäts- Membranen, die mit immobilisiertem Protein A belegt waren, in eine Kunststoff-Filterhalterung (2,5 cm Durchmesser) eingesetzt und in dem in Abbildung 6 gezeigten Versuchsaufbau angeordnet. Das von dem System eingeschlossene Gesamtmembranmatrix-Volumen betrug 0,2 ml; die statische IgG-Gesamtkapazität des Systems betrug 0,76 mg (3,8 mg/ml Membranmatrix-Volumen).
Der Beladungs-/Elutions-Zyklus setzte sich aus folgenden Schritten zusammen: (i) Durchpumpen von 11,6 ml einer Lösung aus 0,05 mg/ml Human-IgG (Sigma) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 8,0 durch das System mit einer vorabgewählten Strömungsgeschwindigkeit (entsprechend einer Beladung mit IgG von 2,9 mg/ml Membranmatrix-Volumen - 76 % der statischen Kapazität); (ii) Waschen des Systems mit PBS, bis die Absorption der Waschflüssigkeit bei 280 nm vernachlässigbar war; und (iii) Elution des aufgefangenen IgG mit 0,1 M Citrat-Puffer, pH-Wert 3,0. Der Auffangwirkungsgrad während des IgG-Beladungsschritts wurde in dem Strömungsgeschwindigkeitsbereich von 0,25 ml/min bis 5,0 ml/min beurteilt. Alle anderen Schritte wurden mit 5,0 ml/min durchgeführt. Der IgG-Auffangwirkungsgrad bei jeder Beladungsgeschwindigkeit wurde durch Ermittlung des IgG-Gehalts in den Citrat-Eluat-Fraktionen mittels der Lowry-Protein-Analyse bewertet. Die nachstehende Tabelle VII zeigt, daß bei einer IgG-Beladung von 76 % der statischen Kapazität des Systems und bei Strömungsgeschwindigkeiten von 5,0 ml/min (was einer Fluid-Verweilzeit von 1,8 s entspricht) mindestens 75 % des aufgebrachten IgG gebunden worden waren. TABELLE VII Protein-A-Membran-vermitteltes IgG-Auffangen und -Eluieren Auswirkung der IgG-Beladungsgeschwindigkeit Beladungsrate Matrix Eluiertes IgG Durchlauf-Nr. Fluid-Verweilzeit (s) (mg/ml % Matrix) (% aufgebrachte Menge) Matrix-Volumen: 0,2 ml IgG-Konzentration Zustrom: 0,05 mg/ml Pro Zyklus aufgebrachtes IgG: 2,9 mg/ml Matrix Gesamt-IgG-Kapazität (statisch): 3,8 mg/ml Matrix

6.5 Protein-A-vermitteltes Auffangen eines monoklonalen Antikörpers aus Zellkultur-Überstand

Die Fähigkeit von Affinitäts-Membranen zur effizienten Isolierung von Zielproteinen aus komplexen Gemischen bei hohen Beschickungsgeschwindigkeiten wurde durch Verwendung von Protein A als Affinitäts-Ligand und eines monoklonalen Antikörpers als Zielprotein untersucht und bewertet. In diesem Fall wurde das Protein A in einem 1,5 ml- Hohlfaser-Modul immobilisiert, das anschließend mit dem in Abschnitt 5 beschriebenen automatisierten Affinitäts-System für Laborzwecke gekoppelt wurde. Als Einsatzlösung wurde ein serumfreier Zellkultur-Überstand gewählt, der 0,055 mg/ml des gewünschten monoklonalen Antikörpers nebst verunreinigenden Proteinen enthielt, die entweder von den Zellen produziert worden waren oder bereits zu Anfang in dem Medium vorgelegen hatten. Die Beladung erfolgte im Gegenstromprinzip mit einer Einsatzlösungs-Strömungs geschwindigkeit von 50 ml/min und mit Filtrat-Strömungsgeschwindigkeiten zwischen 2,6 und 16 ml/min (9,2 bis 1,5 s). Die Menge des pro Zyklus eingespeisten Zellkultur-Überstands entsprach entweder 2,9 +/- 0,1 mg monoklonaler Antikörper pro ml Matrixvolumen (ca. 30 % der statischen Kapazität des Systems für den monoklonalen Ziel-Antikörper) oder 9,0 +/- 0,4 mg/ml Matrixvolumen (ca. 30 % der statischen Kapazität). Zur Ermittlung der Auswirkungen von Filtrationsgeschwindigkeit und monoklonale Antikörper-Beladung auf den Auffangwirkungsgrad wurden die während eines jeden Zyklus erzeugten Filtrate gesammelt und mit Hilfe der Hochleistungs-Säulenchromatographie (HPLC) wie von Hammen u.a. skizziert (BioChromatography 3, 54-59, 1988) auf ihren Gehalt an monoklonalem Antikörper untersucht. Durch die vergleichende Gegenüberstellung der Konzentration an monoklonalem Antikörper im Filtrat und der Konzentration an monoklonalem Antikörper in der Einsatzlösung wurde der Auffangwirkungsgrad in Prozent ermittelt. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt und zeigen, daß bei System- Beladungen von 100 % der statischen Kapazität des Systems und bei einer Fluid-Verweilzeit von nur 1,5 s über 80 % des aufgebrachten Ziel-Proteins aufgefangen worden waren. TABELLE VIII Protein-A-Membran-vermitteltes Auffangen eines monoklonalen Antikörpers aus Zellkultur-Überstand Aufgebrachte Menge (mg/ml Matrix) Strömungsgesschwindigkeit (ml/min) Zeit (s) Auffang-Wirkungsgrad (%)

6.6 Protein-A-Membran-vermittelte Reinigung von monoklonalem Antikörper aus Zellkultur-Überstand

Die Reinigung/Isolierung eines Ziel-Proteins aus einem komplexen Gemisch auf eine schnelle, multizyklische Art und Weise wurde anhand eines 1,5-ml-Hohlfaser-Moduls demonstriert, das immobiliertes Protein enthielt und das an das in Abschnitt 5.1. beschriebene für Laborzwecke vorgesehene automatisierte Affinitäts-System angeschlossen war. Bei dem Ziel-Protein handelte es sich um monoklonalen Antikörper von der Maus, der in Zellkultur-Überstand in einer Konzentration von 0,039 mg/ml vorlag. Jeder Bindungs-/Elutions-Zyklus umfaßte die nachgenannten Einzelschritte:

BELADEN

Umlauf-Strom - 50 ml/min
Filtrat-Strom - 12 ml/min
Beschickungsmenge je Zyklus - 100 ml; 7,8 mg monoklo naler Antikörper/ml Matrix

WASCHEN HOHLRAUM

Puffer - PBS pH-Wert 8,0
Durchflußgeschwindigkeit - 20 ml/min
Volumen - 40 ml

ELUIEREN MANTEL

Puffer - 0,1 m Citrat pH-Wert 3,0
Durchflußgeschwindigkeit - 10 ml/min
Volumen - 10 ml

ELUIEREN HOHLRAUM

Puffer - 0,1 m Citrat pH-Wert 3,0
Durchflußgeschwindigkeit - 4,0 ml/min
Volumen - 24 ml

REGENERIEREN HOHLRAUM

Puffer - PBS pH-Wert 8,0 + 0,? % Tween 80
Durchflußgeschwindigkeit - 10 ml/min
Volumen - 10 ml

REGENERIEREN MANTEL

Puffer - PBS pH-Wert 8,0 + 0,1 % Tween 80
Durchflußgeschwindigkeit - 10 ml/min
Volumen - 20 ml
Die Zeit je Einzelzyklus betrug 27 Minuten. Es wurden insgesamt 20 Zyklen durchgeführt, in denen 2000 ml Zellkultur-Überstand aufbereitet wurden (Abbildung 9). Die Menge an rückgewonnenem monoklonalem Antikörper wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm und Berechnung der Produktkonzentration unter Ansatz von &epsi;&sub2;&sub8;&sub0; = 1,1 ermittelt. Von den ursprünglich in dem Zellkultur-Überstand vorliegenden 78 mg monoklonaler Antikörper wurden 64 mg in einem Volumen von 300 ml rückgewonnen, was auf eine Produktrückgewinnung von 82 % und einen Konzentrationsfaktor von 5,4 hinweist. Eine SDS-PAGE-Analyse der auf diese Weise erzeugten Proben ergab, daß alle verunreinigenden Proteine aus dem gereinigten Produkt entfernt worden waren und daß alle Filtrate in bezug auf den monoklonalen Ziel-Antikörper im wesentlichen erschöpft waren.

6.7 Verfahren der Formmassen-Darstellung und Polymer-Trocknung

Das Verfahren der Formmassen-Darstellung impliziert das Abwiegen und Vorbehandeln der zwei in der Blend verwendeten Polymere. PES, auch unter der Bezeichnung Vitrex (von ICI America, grade 5200P, erhältlich in 15-kg-Packungen) bekannt, wird in einem Wärmeschrank bei 150ºC 3 Stunden lang getrocknet und wird über einige weitere Stunden auf 60ºC abkühlen gelassen. Die Gesamterwärmungszeit in dem Wärmeschank beläuft sich auf nicht weniger als rund 24 Stunden. PEO (Polyox 301, Molekulargewicht 4.000.000 Dalton, von Union Carbide Corp., erhältlich in 63,42 kg-(140 lb-)Tonnen) wird in einem Unterdruck-Wärmeschank bei Raumtemperatur ca. 24 Stunden lang vorbehandelt. Es ist darauf zu achten, daß die vorbehandelten Polymere nicht längere Zeit der freien Luft ausgesetzt werden, bevor sie in den Mixer gegeben werden.
NMP (d.h. N-Pyrol, Kat.-Nr. 1-3-72755/000 & 5-72, von GAF Chemicals Corp., lieferbar in 242,55-I-(55-gal-)Tonnen) und Glycerin (von Baxter Scientific Product Group, Mallincrodt, Kat.-Nr. 5092-4, Analytical Reagent) werden jeweils im Anlieferungszustand verwendet, wobei jedoch zur Minimierung der Aufnahme von Luftfeuchtigkeit als Vorsichtsmaßnahme beide unverzüglich nach der Entnahme aus ihren Behältnissen in den Mixer zu geben sind. Ihre Behältnisse sollten fest verschlossen sein, wenn sie nicht in Gebrauch sind.

Mischverfahren

NMP (2812 g) und Glycerin (1128 g) werden in einem 3,8-l-(1-gal-)Behälter vorgemischt, bevor sie in einen Ross-Mixer (Modell PVM2) mit Raumtemperatur gegeben werden. Der Ross-Mixer ist zu Spülzwecken mit einer Stickstoff-Zapfstelle ausgestattet. Die inerte Atmosphäre wird bei allen Flüssigkeiten aufrechterhalten, bis das PEO zuge setzt worden ist. Beim Einfüllen des NMP/Glycerin-Vorgemischs werden zwei der Rührwerke eingeschaltet: das Grundrührwerk läuft mit 135 1/min, das Dispergierwerk mit 3.500 1/min. PEO (360 g) wird während des Mischens bei Raumtemperatur allmählich über ca. 1 Minute zugesetzt. Danach wird eine 500-g-Portion NMP zugesetzt, so daß sich derGesamtanteil von NMP in der Formmasse auf 3312 g beläuft. Nun wird das Dispergierwerk ausgeschaltet und die Mokon-Wärmetauschereinheit auf 120ºC eingestellt. Nach dreistündigem Mischen wird das PES (1200 g) allmählich über einen Zeitraum von 2 bis 3 Minuten zugesetzt und wird die Temperatur aufgezeichnet, wobei das Grundmischwerk mit 135 1/min weiterläuft. Nach weiteren 18 Stunden wird ein allmählicher Temperaturrückgang durch Einstellen der Mokon-Wärmetauschereinheit auf 60ºC eingeleitet. Innerhalb von 1,5 Stunden nach dieser Temperaturänderung erreicht die Formmasse gewöhnlich eine Temperatur von ca. 75 +5ºC; nun wird allmählich ein Unterdruck aufgebaut, um das Gemisch zu entgasen. Nach ungefähr 15 Minuten liegt voller Unterdruck an, der für weitere 5 Minuten aufrechterhalten wird. Der Mixer wird dann ausgeschaltet, während die Entgasung fortgeführt wird. Der Unterdruck wird für weitere 1 bis 2 Minuten aufrechterhalten, bevor Stickstoff zur Wiederherstellung des atmosphärischen Drucks in dem Mischbehälter bei 60ºC eingeleitet wird.
Dieses Darstellungsverfahren führt typischerweise zu einer Formmassen-Viskosität von ca. 100 (+/- 20) Pa.s (100.000 (+ 20.000) cps) bei 60ºC. Jedoch lassen sich gelegentlich Abweichungen von der Norm feststellen, die keine negativen Auswirkungen auf die Membraneigenschaften nach sich zu ziehen scheinen. Eine solche Formmasse weist Phasengrenzen bei ca. 78ºC (untere kritische Lösungstemperatur, LCST) und ca. 57ºC (obere kritische Lösungstemperatur, UCST) auf, wie in Abbildung 10 gezeigt.

6.8 Hohlfaser-Spinnen von relativ isotropen feinporigen Membranen zur primären Verwendung in Affinitätsanwendungen

Eine Formmasse (Spinnmasse) wird wie oben beschrieben hergestellt, ihre Viskosität bei 60ºC beträgt laut Untersuchungsergebnis 123 Pa.s (123.000 cps). Diese Spinnmasse wird durch die in Abbildung 11 schematisch dargestellte Koextrusions-Spinndüse extrudiert. Die Spinndüsen-Temperatur wird während der gesamten Dauer dieses Versuchs auf 80ºC gehalten. Zu den anderen festen Parametern gehören vorzugsweise:
. Spinnpumpen-Drehzahl - ca. 70 1/min
. Spinn-/Quenchbad-Temperatur - ca. 90ºC
. Spinn-/Quenchbad-Zusammensetzung - Demineralisiertes Wasser
. Innenringfluid-Zusammensetzung - ca. 70 % NMP : 30 % demineralisiertes Wasser (V/V)
. Außenringfluid-Zusammensetzung - ca. 70 % NMP : 30 % demineralisiertes Wasser (V/V)
. Außenringfluid-Durchflußgeschwindigkeit - ca. 30,2 (+/- 1,2) ml/min
. Temperatur erstes und zweites Galette-Bad - ca. 42,5 (+/- 2,5) ºC
Andere veränderliche Parameter bei diesem Experiment sind: Luftspalt oder Spinndüsenhöhe über Spinn-/Quenchbad (was eine Änderung der Faser-Aufspulgeschwindigkeit oder der Geschwindigkeit der Faserproduktion in lineare Fuß pro Minute nach sich zieht) und Außenringfluid-Durchflußgeschwindigkeit. Letztere ändert sich von null auf 66 ml/min bei Spinndüsenhöhen von 76,20 bis 117,80 mm (3-7 inches). Es ist festzuhalten, daß die Spinnstrecke nur zwei Galette-Bäder umfaßt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der Abbildung 13 sowie in der Datentabelle angegeben, die als Bestandteil dieser Abbildung für Fasern der Bezeichnung 2500-1 bis 11 eingefügt ist. Eine sehr deutliche Abhängigkeit der Wasserdurchlässigkeit für demineralisiertes Wasser der Membran (Lp) von der Außenring-Durchflußgeschwindigkeit ist erkennbar. Die Faser 2500-1 ist bei einer Außenring-Durchflußgeschwindigkeit von null identisch mit einer Faser, die mit einer herkömmlichen 'Rohr-in-Mundloch'-Spinndüse ("tube-in-orifice spinnerette") hergestellt wird.
Diese Abhängigkeit von Lp von der Außenring-Durchflußgeschwindigkeit ist reproduzierbar bei Verwendung einer Portion der in Abbildung 13 verwendeten Formmasse (siehe Tabelle IX für Fasern mit der Bezeichnung 2600-1 bis 9). TABELLE IX Wasserdurchlässigkeit von Hohlfasern als eine Funktion der Außenring-Durchflußgeschwindigkeit Faserprobe Außenring-Strömung (ml/min) Luftspalt (in inches; 1 in = 2,54 cm) Innendurchmesser (mm) Außendurchmesser (mm)
Die Faserprobe 2600-6 wird mit einem Elektronenmikroskop untersucht, und es werden Poren im 1-3 pm auf beiden Oberflächen festgestellt. Die allgemeine Porengrößenverteilung in der Matrix der annähernd 300-Am-Faserwand schwankt im Bereich von 1 bis 2 Größenordnungen, wobei jedoch die große Mehrheit der Poren innerhalb einer Größenordnung liegt. Die Ergebnisse zeigen, daß diese Membran ein Beispiel ist für eine im wesentlichen hautlose relativ isotrope feinporige Membran. Im Gegensatz dazu zeigt die Faser 2600-5 (die ohne das Außenringfluid hergestellt worden ist) eine bei weitem anisotropere feinporige Membranstruktur.
Die Faser 2600-6 und andere Fasern aus diesem Los werden anschließend einer Behandlung im Autoklaven unterzogen, hydrophiliert durch Pfropfen ("Grafting") einer Komposit-Beschichtung auf ihre gesamte Innen- und Außenoberfläche, und erfolgreich in Affinitäts- und Biotrennversuchen eingesetzt. Die 1,5-ml-Hohlfaser-Moduln mit 0,5 ml Membranvolumen werden kovalent funktionalisiert, um Protein-A-Ligand zu koppeln. Die ermittelte IgG-Kapazität für solche Moduln liegt bei 7 und 8 mg/ml (für Modul Nr. 13 bzw. Nr. 14), während die nichtspezifische Bindung von fetalen Serumproteinen vom Kalb eine Kapazität von 1 mg/ml hat. Die nichtspezifisch-gebundenen Proteine lassen sich auf Grund der Hydrophilie leicht von den Membranoberflächen abwaschen. Mit dieser Faser lassen sich auf Grund der Wanddicke von 300 Mikron hohe Beladungskapazitäten erreichen, während die hohe Wasserdurchlässigkeit für demineralisiertes Wasser sowohl nach der Hydrophilierung als auch nach der chemischen Aktivierung aufrechterhalten bleibt. So haben die Moduln Nr. 13 und 14, beispielsweise, Lp-Werte von 314 x 10&supmin;&sup4; bzw. 191 x 10&supmin;&sup4; cm³/Ns (314 x 10&supmin;&sup9; bzw. 191 x 10&supmin;&sup9; cm³/Dyn s). Nach dem Beladen mit dem Liganden Protein A beträgt der Lp-Wert für das Modul Nr. 14 149 x 10&supmin;&sup4; cm³/Ns (149 x 10&supmin;&sup9; cm³/Dyn s).
Ein breites Spektrum an Mikrofiltrations- und Ultrafiltrations-Anwendungen lassen sich mit diesen Membranen (mit oder ohne weitere Oberflächenmodifizierung oder Hydrophilierung) realisieren, wo die relativ schwach protein-bindenden Oberflächen die Möglichkeit der Verschmutzung und Verstopfung der Matrix minimieren. Besonders interessant ist die Verwendung der relativ isotropen feinporigen Fasern (z.B. Faser 2600-6) zur Zelltrennung. Diese Abtrennung von Zellen aus der begleitenden Flüssigkeit läßt sich mit sehr hohen Durchflußgeschwindigkeiten erreichen, ohne die Wasserdurchlässigkeit völlig auszuschalten, wie es typischerweise bei handelsüblichen Hohlfasern festzustellen ist. Beispiele solcher Zelltrenn-Anwendungen sind, um nur einige wenige zu nennen, u.a. Reinigung von Zell-Bouillon und aufbereiteten Medien (mit der Möglichkeit der Kombinierung der Schritte Affinitäts-Bindung und -Reinigung, um die Anzahl der Systemarbeitsgänge bei der Proteinreinigung zu reduzieren) sowie Trennung von Blutzellen für medizinische Anwendungen.
Der in diesem Beispiel (d.h. in Abbildung 13) gezeigte Außenringfluid-Durchflußgeschwindigkeitsbereich, bei Viskositätsunterschieden der verwendeten Spinnmassen/Außenringfluid-Kombinationen von mehr als fünf Größenordnungen, ist mit der in dem US-Patent Nr. 4.493.629 offenbarten modular aufgebauten Spinndüse nicht möglich.

6.9 Auswirkungen der Waschdauer und -temperatur

Es werden Hohlfasern mit einem Außenringfluid aus einer Spinnmasse hergestellt, die eine Viskosität von 108 Pa.s (108.000 cps) bei 60ºC aufweist. Die in diesem Versuch verwendeten Spinn-Parameter sind in Tabelle X im einzelnen angegeben. Nach dem Waschen in Wasser mit ca. 60ºC über Nacht wurde eine durchschnittliche Wasserdurchlässigkeit für demineralisiertes Wasser (ausgehend von drei Testmoduln) von 348 x 10&supmin;&sup4; cm³/Ns (348 x 10&supmin;&sup9; cm³/Dyn s) für die Faserprobe 3000-1 ermittelt.
Ebenso wird eine andere Spinnmasse mit einer Viskosität von 118 Pa.s (118.000 cps) bei 60ºC dargestellt, und es werden die Hohlfasern 3100-1 bis -5 unter im wesentlichen denselben Bedingungen wie die obengenannte Faser 3000-1 hergestellt. All diese Faserproben werden unter identischen Spinnbedingungen hergestellt, um große Mengen von Fasern mit denselben Lp-Werten bereitzustellen. Einige dieser Membranen (Sammellos 3100-2 bis -5) werden in einer Reihe von Waschversuchen eingesetzt, bei denen sowohl die Waschdauer als auch die Waschtemperatur variiert werden. Die Daten sind in Tabelle XI zusammengefaßt und zeigen als Tendenz einen Anstieg von Lp mit steigender Waschdauer, insbesondere bei 20ºC, und mit steigender Temperatur. Diese Zahlen lassen vermuten, daß eine geeignete Waschtemperatur und Waschdauer für ein wirksames Waschen nach dem Spinnen ca. 60ºC über Nacht sein könnten. TABELLE X PROZESSPARAMETER FÜR HOHLFASER-MEMBRAN 3000-1 Temperatur in ºC Spinnmassenbehälter Spinnmassenleitung Bohrungsfluidleitung Spinndüse Spinnbad Galette-Bäder Innenringfluid Außenringfluid Durchflußvolumen in cm³/min Aufwickelgeschwindigkeit (mm/min)a: Messung Durchschnitt Standardabweichung Ebenso, Faser-Produktionsgeschwindigkeit TABELLE XI ERGEBNISSE BEI ÄNDERUNG DER WASCHZEITEN UND WASCHTEMPERATUREN DER FASERN NACH DEREN ÜBERNAHME VON DER SPINNSTRECKE Waschtemperatur in ºC Waschdauer in Std. Durchschnittswerte von 2 bis 7 Testmoduln

6.10 Modifizierung von Hohlfaser-Membranen

Es werden PES/PEO-Hohlfaser-Membranen wie zuvor beschrieben hergestellt. Ungefähr 100 457,20-mm-(18 inch-)Faser-Membranen werden in ein 2-l-Becherglas gegeben. Die Membranen werden zunächst mit 95ºC-heißem Wasser 16 Stunden lang gewaschen und anschließend mit 5 N NaOH bei 95ºC 16 Stunden lang gewaschen, um die Anzahl der verfügbaren funktionellen Endgruppen zu erhöhen. Dann läßt man die Faser mit einer 0,1-N-NaOH-Lösung mit 10 Gew.-% EGDGE bei Raumtemperatur 4 Stunden lang reagieren. Die Fasern werden herausgenommen und vorzugsweise mit frischem kaltem Wasser gewaschen, um unreagiertes EGDGE und überschüssige Base zu entfernen. Dann werden die Proben in eine 0,6-N-NaOH-Lösung mit 2 Gew.-% Hydroxyethylcellulose (HEC; Natrosol 250 JR, Aqualon Company, Wilmington, Delaware, USA) eingetaucht und für 16 Stunden auf 60ºC erwärmt. Im Anschluß daran werden die Fasern mit 60ºC-warmem Wasser abgespült, um ungebundene Komponenten zu entfernen. Dieses Material wird 1X-HEC-Material genannt. Durch Wiederholen der Behandlungen mit EGDGE und HEC können weitere HEC-Schichten auf die Fasern aufgebracht werden, um, wie gewünscht, 2X-HEC-, 3X-HEC-, 4X-HEC-Materialien usw. zu erhalten.
Das 3X-HEC-Material wird zur weiteren Modifizierung ausgewählt (wenngleich auch ein anderes HEC-beschichtetes Material ausgewählt werden kann). Die Fasern werden in ein Becherglas gegeben und mit einem Überschuß an Acetonitril-Lösung aus 2 Gew.-% 2-Fluor-1-methylpyridinium-p-toluensulfonat (FMP, Aldrich, Chemical company, Milwaukee, Wisconsin, USA) und 1 Gew.-% Triethylamin bei Raumtemperatur für ca. 15 Minuten behandelt. Anschließend werden die Fasern mit frischem Acetonitril gewaschen und luftgetrocknet.
Ein hohles Polysulfon-Modul mit einem Innenvolumen von 1,5 ml wird anschließend mit den FMP-aktivierten Fasern gepackt, so daß ein Faser-Membranvolumen von letztlich 0,5 ml vorliegt. Rekombinantes Protein A wird mit dem Inhalt des Moduls gekoppelt, indem eine gepufferte Lösung dieses Proteins mittels einer Schlauchpumpe im Kreislauf durch das Modul gepumpt wird. Etwaiges lose gebundenes Protein wird mit Natriumbicarbonat-Puffer abgewaschen, und etwaige unreagierte FMP-aktivierte Gruppen werden aufgebraucht, indem die Fasern mit 30 mM Natriumbicarbonat-Puffer mit 1 Gew.- % Mercaptoethanol behandelt werden. Das Modul wird anschließend mit einer phosphatgepufferten Lösung aus Human-IgG befüllt. Sämtliches losegebundene Material wird sodann durch Abwaschen abgelöst; 4,0 mg IgG, so das Ergebnis, werden von dem Modul eluiert, woraus sich eine Membrankapazität von 8,0 mg IgG/ml Membranvolumen ergibt.
Ebenso wird eine wäßrige Lösung von Anti-Faktor-VIII (Anti-FVIII, American Diagnostics, New York, New York, USA) in Natriumbicarbonat-Puffer 16 Stunden lang bei Raumtemperatur im Kreislauf durch ein Modul, das, wie das Modul zuvor, mit FMP-aktivierten Fasern gepackt ist, gepumpt. Unreagierte FMP-aktivierte Gruppen werden auf gleiche Weise ausgeschaltet. Anschließend werden insgesamt 22,9 ml einer FVIII-Lösung (0,76 Einheiten/ml) in 0,015 M Citrat-Puffer (pH-Wert = 7,0) mit 0,15 M NaCl mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min durch das Modul geleitet. Sodann wird das Modul mit einem Puffer aus 0,015 M Citrat und 0,15 M NaCl gewaschen, bis die Absorption der Waschflüssigkeit bei 280 nm vernachlässigbar ist, was darauf hinweist, daß kein Protein in der Lösung vorliegt. Das FVIII wird nun mit einer geeigneten Lösung (z.B. einer wäßrigen Lösung aus 1 M Kaliumiodid 1 M Lysin, 20 nM Imidazol und 5 mM Kalziumchlorid, pH- Wert 6,5) eluiert. Die Analyse des Eluats mit Hilfe eines Stratchrom FVIII:C Anti-Hemophilic Factor chromogenic Assay (Diagnostica Stage, 6 ter, rue Denis Papin, 92600 Asnières, France) ergibt einen Gehalt von 8,0 Einheiten FVIII:C-Aktivität, was auf eine Rückgewinnung von 46 % bezogen auf die ursprünglich aufgebrachte FVIII-Menge hinweist. Außerdem wird durch dieses noch nicht optimierte Verfahren, das von der spezifischen Aktivität der FVIII-Ausgangslösung ausgeht, ein Reinigungsfaktor von 115 erreicht.

6.11 Kopplung von monoklonalem Anti-Faktor-IX-Antikörper an ein 1,5-ml-Modul und Immunoreinigung von Faktor IX

Ein 1,5-ml-Hohlfaser-Affinitätsmembranmodul mit FMP-aktivierten Hohlfasern wurde mit ungefähr 2,0 mg monoklonalem Anti-Faktor-IX-Antikörper gekoppelt. Ein halbgereinigtes Präparat von Faktor IX (FIX), gewonnen aus aufbereitetem Plasma, wurde zum Zwecke einer Affinitäts-Reinigung in einem Hepes-gepufferten 30 Millimolare Mg&spplus;&spplus; enthaltenden Lösungsmittel vorbehandelt, um auf einen berechneten Wert von 10 Einheiten von Faktor IX je Milliliter zu kommen. Eine Beladungsprobe von 30 ml wurde auf das Anti-Faktor-IX-Modul mit einer Filtrat-Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min aufgebracht. Das Beladungsvolumen wurde so berechnet, daß es ungefähr das 1,5fache der Menge an Faktor IX enthielt, die maximal an das Modul gekoppelt werden könnte.
Faktor IX wurde durch Aufbringen einer Hepes-gepufferten wäßrigen Lösung ohne Mg&spplus;&spplus; in einem Gesamtvolumen von 12 ml eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden auf ihren Gesamtgehalt an Protein durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm unter Ansatz eines Extinktionskoeffizienten für reinen Faktor IX von 1,3 für 1 mg pro ml in wäßriger Lösung analysiert. Die Versuchsergebnisse ergaben eine Rückgewinnung von durchschnittlich 0,36 mg Gesamt-Protein aus dem 1,5-ml-Modul, gemessen anhand des Extinktionskoeffizienten für Faktor IX. (Siehe Tabelle XII für Ergebnisse). TABELLE XII Versuch Nr. Fraktion Rückgewinnungsmenge (in mg) Menge an verfügbarem Faktor IX ELUAT

6.12 Synthese eines multifunktionalen Proteins

In diesem Beispiel wurde ein bifunktionales Protein hergestellt durch Verschmelzen (Fusion) einer Nucleinsäuresequenz, die für eine biosynthetische Digoxin-Bindungsstelle codiert, die die Antigen-Determinante des monoklonalen IgG2α,λ-Anikörpers 26-10 nachahmt, mit einer Sequenz, die für das FB-Fragment von Protein A codiert. Das FB- Fragment, das als die zweite aktive Region fungiert, lag in diesem Gebilde als Anführer("Leader"-)Sequenz vor. Die nativen Aminosäuren, die die letzten 11 Aminosäuren des an eine Asp-Pro-Schwachsäure-Spaltstelle gebundenen FB-Fragments umfaßten, dienten als Abstandshalter ("Spacer"). Der FB-Bindungsbereich des FB-Fragments setzt sich aus den unmittelbar vorangehenden 43 Aminosäuren zusammen, die eine helixförmige Konfiguration einnehmen. Der N-terminale Abschnitt dieses Bereichs kann kovalent an Gruppen an der Membranoberfläche angelagert werden, die zuvor durch Einfügen von höheren sich trennenden Gruppen ("leaving groups") unter Verwendung eines jeden beliebigen der in dieser Beschreibung genannten Reaktionsmittel aktiviert worden sind.

6.12.1 Modell-Bindungsstelle

Die Digoxin-Bindungsstelle des monoklonalen IgG2α,λ-Antikörpers ist von Mudgett-Hunter und Kollegen analysiert worden (unveröffentlicht). Die V-Region-Sequenzen des monoklonalen Antikörpers 26-10 wurden ausgehend von der Aminosäuresequenz- und DNA-Sequenzbestimmung von mRNA-Transkripten der schweren (H-) und leichten (L-) Kette des 26-10 (D. Panka, J.N. & M.N.M., unveröffentlichte Daten) ermittelt. Der Antikörper 26-10 zeigt eine hohe Digoxin-Bindungsaffinität [Ko = 5,4 x 10&sup9; M&supmin;¹] und weist ein gut definiertes Spezifitätsprofil auf, was eine Basis für einen Vergleich mit den biosynthetischen Bindungsstellen, die seine Struktur nachahmen, bietet.

6.12.2 Aufbau der biosynthetischen Antikörper-Bindungsstelle (BABS)

Kristallografisch ermittelte Atomkoordinaten für Fab-Fragmente von MOPC-603 wurden von der Brookhaven-Datenbank bezogen. Eine Prüfung der verfügbaren dreidimensionalen Strukturen von Fv-Regionen innerhalb deren Stamm-Fab-Fragmente zeigte, daß der euklidische Abstand zwischen dem C-Terminus der VH-Domäne und dem N-Terminus der VL-Domäne ca. 35 Angström beträgt. In Anbetracht der Tatsache, daß die Länge einer Peptid-Einheit ca. 3,8 Angström beträgt, wurde zur Überbrückung dieser Lücke ein 15-Rest-Verbindungsglied ("Linker") ausgewählt. Dieses Verbindungsglied sollte geringe Neigung für eine Zweitstruktur zeigen und die Domänen-Faltung nicht behindern. Dementsprechend wurde die 15-Rest-Sequenz (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)&sub3; ausgewählt, um den Carboxyl-Terminus der VH-Domäne mit dem Amino-Terminus der VL-Domäne zu verbinden.
Verknüpfungsstudien mit einkettigen Bindungsbereichen mit weniger oder mehr als 15 Resten zeigen die Bedeutung des Abstands, der zwischen VH und VL gegeben sein muß, auf; z.B. zeigt ein (Gly&sub4;-Ser)&sub1;-Linker keine Bindungsaktivität, und zeigen solche [Bindungsbereiche] mit (Gly&sub4;-Ser)&sub5;-Linkern eine geringe Aktivität im Vergleich zu solchen mit (Gly&sub4;-Ser)&sub3;-Linkern.

6.13 Gensynthese

Der Aufbau der 744-Basen-Sequenz für das synthetische Bindungsstellen-Gen wurde von der Fv-Proteinsequenz des Antikörpers 26-10 abgeleitet unter Zuhilfenahme eines handelsüblichen Computerprogramms, das kombinierte Rückwärtsübersetzungs- ("Reverse Translation") und Restriktions[enzym-Spalt]stellensuchläufe durchführt ("RV.exe" von Compugene, Inc.). Die bekannten Aminosäuresequenzen für VH-und VL- 26-10-Polypeptide wurden eingegeben, und alle potentiellen für diese Peptide codierenden DNA-Sequenzen sowie alle potentiellen Restriktionsenzym-Spaltstellen ("restriction sites") wurden von dem Programm analysiert. Außerdem wählte das Programm von E. coli bevorzugte Codons aus.
Die Auslegung von VH und VL erlaubt ein sehr flexibles Vorgehen, da die Aminosäuresequenzen auf der Stufe der DNA festgelegt werden, und Manipulationen an der DNA lassen sich auf leichte Weise durchführen.
Wird beispielsweise ein Stammrahmengen ("master framework gene") gewünscht, das den Austausch der komplementarität-determinierenden Region (CDR) erleichtert, so kann mit Hilfe eines Computerprogrammes wie Compugene eine synthetische DNA konstruiert werden, die die nachgenannte Genstruktur aufweist:
R&sub1;-FR&sub1;-X&sub1;-FR&sub2;-X&sub2;-FR&sub3;-X&sub3;-FR&sub4;-R&sub2;
worin R&sub1; und R&sub2; "restricted ends" sind, die in einen Vektor ligiert werden müssen, und X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; DNA-Sequenzen sind, deren Funktion darin besteht, geeignete Spaltstellen für Restriktionsendonucleasen ("restriction sites") für den CDR-Einbau anzubieten. Die Verwendung von an die FR-Grenzen angrenzenden einmaligen Hexanucleotidsequenzen [d.h. Spaltstellen für Restriktionsendonucleasen mit einer Länge von 6 Basen - "restriction sites"] gestattet das leichte Einfügen (Insertion) von synthetischen Nukleotidsequenzen, die für CDRs eines gewünschten monoklonalen [Antikörpers] codieren. Hexanucleotidsequenzen werden bevorzugt, jedoch können, wenn Hexanucleotidsequenzen nicht möglich sind, auch Tetra- oder Pentanucleotidsequenzen verwendet werden. Diese Sequenzen erlangen innerhalb des Gens, sofern sie nicht schon einmalig sind, dadurch Einmaligkeit, daß jedes sonstige Vorkommen innerhalb des Gens ohne Änderung notwendiger Aminosäuresequenzen eliminiert wird. Bevorzugte Spaltstellen ("cleavage sites") sind solche, bei denen nach einmaligem Durchtrennen Fragmente mit "sticky ends" [d.h. mit Schnittenden mit einem überstehenden Teil; von engl. to stick = kleben] genau außerhalb der Grenze der komplementaritäts-determinierenden Region (CDR) innerhalb des Rahmens (FR) entstehen. Jedoch sind solche idealen Stellen nur gelegentlich möglich, da die FR-CDR-Grenze nicht eine absolute ist und weil die Aminosäuresequenz des Rahmens möglicherweise eine Restriktions[endonuclease]-Spaltstelle nicht zuläßt. In diesen Fällen werden flankierende Stellen ("flanking sites") in dem Rahmen ausgewählt, die von der vorausgesagten Grenze weiter entfernt sind.
In dem vorliegenden Beispiel wurde das Gen, das für VH codiert, aus 46 chemisch synthetisierten Oligonucleotiden zusammengesetzt, die unter Einsatz eines DNA-Synthesizers von Biosearch, Modell 8600 (San Rafael, CA) dargestellt worden sind. Alle synthetisierten Polynucleotide waren 15 Basen lang, mit Ausnahme von terminalen Fragmenten (13 bis 19 Basen), die kohäsive Cloning-Enden enthielten. Zwischen 8 und 15 überlappende Oligonucleotide wurden enzymatisch zu einer Doppelstrang-DNA vereinigt (Ligation), an zur Klonierung geeigneten Restriktions[endonuclease]-Spaltstellen durchtrennt (NarI, XbaI, SalI, SacII, SacI), durch PAGE auf 8 % Gelen gereinigt und in pUC, das zuvor modifiziert worden war, um den Polylinker mit zusätzlichen Cloning-Stellen auszustatten, geklont. Die geklonten Segmente wurden durch Ligation mit dem pUC-Cloning- Vektor schrittweise zu dem kompletten die VH-Region kopierenden Gen zusammengefügt.
Das Gen, das die VL-Domäne des Antikörpers 26-10 kopiert, wurde aus 12 langen synthetischen Polynucleotiden, die zwischen 33 und 88 Basenpaaren umfaßten und ebenso in automatisierten DNA-Synthesizern (Modell 6500, Biosearch, San Rafael, CA; Modell 380A, Applied Biosysthems, Foster City, CA) hergestellt worden waren, aufgebaut. Fünf einzelne Doppelstrang-Segmente wurden aus langen synthetischen Oligonucleotid- Paaren hergestellt, die sich über Restriktions[endonuclease]-Spaltstellen mit einer Länge von sechs Basenpaaren in dem Gen erstreckten (AarII, BsrEII, PpnI, HindIII, BgIII und PstI). In einem Fall wurden vier lange überlappende Stränge kombiniert und geklont. Genfragmente, deren Verknüpfung über Spaltstellen für Restriktionsendonucleasen erfolgte, die in dem pUC-Polylinker nicht vorgesehen waren, wie z.B. AatII und BstEII, wurden durch EcoRI- und BamHI-Enden 'flankiert', um das Klonieren zu erleichtern.
Der Linker zwischen VH und VL, der für (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)&sub3; codierte, wurde aus zwei langen synthetischen Oligonucleotiden geklont, die 54 bzw. 62 Basen lang waren und sich über SacI- und AatII-Stellen erstreckten, wobei letzterer ein EcoRI-Cloning-Ende folgte. Das komplette einkettige Bindungsstellen-Gen wurde aus den VH-, VL- und Linker- Genen aufgebaut; das resultierende Gebilde entsprach Aspartyl-prolyl-VH-< Linker> -VL, flankiert von EcoRI- und PstI-Restriktions[endonuclease]-Spaltstellen.
Die DNA-Sequenz, die für das FB-Fragment von Protein A codiert, wurde in die EcoRI-Stelle geklont, die das stromaufwärts befindliche Ende des BABS-Gens flankiert. Der trp-Promotor-Operator, beginnend an seiner SspI-Stelle, wurde aus 12 überlappenden 15-Basen-Oligomeren aufgebaut, und das MLE-Anführer-("Leader"-)Gen wurde aus 24 überlappenden 15-Basen-Oligomeren zusammengesetzt. Diese wurden geklont und nach der Strategie der Flankierung von Kombinations-/Verknüpfungsstellen mit Cloning-Stellen in den pUC eingebaut. Das endgültige Expressions-Plasmid wurde in den pBR322-Vektor eingebaut. Die Sequenzierung von Zwischen-DNA-Fragmenten und zusammengesetzten Genen erfolgte nach der Dideoxy-Methode. Das in Abbildung 15 dargestellte fertige fusionierte Gen wurde anschließend in E. coli exprimiert.

6.14 Protein-Expression

Die starke Expression dieser bifunktionalen Proteine in E. coli führt zu deren Ansammlung in refraktilen oder Inklusions-Körpern in dem Zell-Zytoplasma. Diese Proteine können durch Durchschlagen der Zellen mittels Beschallung oder einer Französischen Presse ("French Press") gewonnen werden. In diesem Beispiel wurden die Proteine durch Beschallung gewonnen. Nach der Beschallung wurden Inklusions-Körper durch Zentrifugieren gesammelt und anschließend in 6 M Guanidin-hydrochlorid (GuHCl), 0,2 M Tris und 0,1 M 2-Mercaptoethanol (BME), pH-Wert 8,2, gelöst. Das Protein wurde in dem Lösungsmittel über Nacht bei Raumtemperatur denaturiert und reduziert. Die Reinigung des Fusions-Proteins von den Inklusions-Körpern erfolgte durch Ausschluß-Chromatographie. Hierzu wurden eine Sepharose-4B-Säule (1,5 x 80 cm) und ein Lösungsmittel aus 6 M GuHCl und 0,01 M NaOH, pH-Wert 4,75, eingesetzt. Die Protein-Lösung wurde bei Raumtemperatur in 0,5 bis 1,0 ml Dosen in die Säule gegeben. Fraktionen wurden aufgefangen und mit kalten Ethanol ausgefällt. Diese wurden über SDS-Gele geleitet, und die Fraktionen, die reich an dem rekombinanten Protein waren (ca. 34.000 D), wurden gesammelt. Dies stellt einen einfachen ersten Schritt zur Reinigung von Inklusions-Körper- Präparaten dar, ohne [daß diese] eine bedeutende proteolytische Verschlechterung erfahren.
Zum Rückfalten wurde das Protein gegen 100 ml derselben GuHCl-Tris-BME- Lösung dialysiert, und das Dialysat wurde über zwei Tage um ein 11faches verdünnt auf 0,55 M GuHCl, 0,01 M Tris und 0,01 M BME. Die Dialyse-Beutel wurden dann auf 0,01 M NaCl transferiert, und das Protein wurde vor einer Analyse der Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Digoxin mittels eines Radioimmunoassay (RIA) eingehend dialysiert. Das Rückfaltungs-Verfahren läßt sich vereinfachen durch schnelles Verdünnen mit Wasser, um die GuHCl-Konzentration auf 1,1 M zu reduzieren, und anschließendes Dialysieren gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,15 M NaCl, 0,05 M Kaliumphosphat, pH-Wert 7, mit 0,03 % NaN&sub3;), so daß es innerhalb von 12 Stunden komplett frei von GuHCl ist. Produkte beider Darstellungsverfahrensarten zeigten Bindu ngsaktivität.
Dieses Protein mit einer FB-Anführer-("Leader")-Sequenz und einer fusionierten BABS ist bifunktional; die BABS-Domäne bindet Digoxin, und das FB bindet die Fc- Regionen von Immunglobulinen. Zum Zwecke der Darstellung dieser dualen und simultanen Aktivität wurden verschiedene Radioimmunoassays durchgeführt.
Die Eigenschaften der Bindungsstelle wurden nach einem modifizierten Verfahren eines von Mudgett-Hunter u.a. entwickelten Analyseverfahrens (J. Immunol. (1982) 129: 1165:1172; Molec. Immunol. (1985) 22: 477-488) untersucht, so daß die Untersuchung an Mikrotiter-Platten als eine Fest-Phasen-Sandwich-Analyse durchgeführt werden konnte. Bindungsdaten wurden unter Verwendung von Anti-Maus-Fab-Antiseren (gAmFab) als der primäre Antikörper, der die Senken der Platte anfänglich überzieht, gesammelt. Hierbei handelt es sich um polyklonale Antiseren, die Epitope erkennen, die größtenteils in Rahmen-Bereichen zu sitzen scheinen. Nach dem Abwaschen von ungebundenem Protein werden die Senken ¹²&sup5;I-markierten (radioiodierten) Digoxin-Konjugaten, entweder als ¹²&sup5;I-dig-BSA oder als ¹²&sup5;I-dig-lysin, ausgesetzt.
Die Daten sind in dem Schaubild in Abbildung 16A eingetragen, das die Ergebnisse eines Verdünnungskurven-Experiments zusammenfaßt, wobei der elterliche 26-10- Antikörper zu Kontrollzwecken eingefügt worden ist. Die Stellen wurden ¹²&sup5;I-dig-BSA wie oben beschrieben ausgesetzt, und zwar anhand einer Reihe von Verdünnungen, die aus vorrätigen Einsatzlösungen hergestellt worden waren, einschließlich sowohl der langsam rückgefalteten (2) und der schnell verdünnten/schnell rückgefalteten (3) einkettigen Proteine. Die Parallelität zwischen allen drei Verdünnungskurven zeigt, daß gAmFab- Bindungsbereiche in dem BABS-Molekül im wesentlichen denen auf dem Fv des authentischen 26-10-Antikörpers entsprechen, d.h. die Oberflächenepitope scheinen bei beiden Proteinen dieselben zu sein.
Versuchsdaten zur Digoxin-Bindung lieferten Bindungskonstanten in dem Bereich von 10&sup8; bis 10&sup9; M&supmin;¹. Der elterliche 26-10-Antikörper hat eine Affinität von 5,4 x 10&sup9; M&supmin;¹. Inhibierungs-Analysen zeigen außerdem die Bindung von ¹²&sup5;I-dig-lysin und lassen sich durch unmarkiertes Digoxin, Digoxigenin, Digitoxin, Digitoxigenin, Gitoxin, Acetylstrophanthidin und Ouabin hemmen, und zwar auf eine Weise, die weitgehend mit dem elterlichen 26-10-Fab parallel geht. Dies zeigt, daß die Spezifizität des biosynthetischen Proteins im wesentlichen mit dem des ursprünglich monoklonalen identisch ist.
In einem zweiten Test wird Digoxin-BSA verwendet, um Microtiter-Platten zu beschichten. Renaturierte FB-BABS wird den beschichteten Platten hinzugefügt, so daß nur solche Moleküle, die eine geeignete Bindungsstelle haben, sich an der Platte anlagern können. ¹²&sup5;I-markiertes Kaninchen-IgG (radioaktiver Ligand) wird mit gebundener FB- BABS auf den Platten gemischt. Die gekoppelte Radioaktivität spiegelt die Wechselwirkung zwischen IgG und dem FB-Bereich der BABS wider, und die Spezifität dieser Bindung zeigt sich durch ihre Hemmung mit steigenden Mengen von FB, Protein A, Kaninchen-IgG, -IgG2a und -IgG1, wie in Abbildung 16B dargestellt.
Die nachgenannten Arten wurden zur Demonstration der authentischen Bindung getestet: monoklonaler unmarkierter Kaninchen-IgG- und -IgG2a-Antikörper (der sich konkurrierend an die FB-Domäne des BABS anlagert); und Protein A und FB (die sich konkurrierend an den Radioliganden anlagern). Diese Arten hemmen festgestelltermaßen vollständig die Bindung des Radioliganden, wie erwartet. Ein monoklonaler Antikörper der Unterklasse IgG1 bindet sich schlecht an FB, wie erwartet; nur ca. 34 % des Radioliganden werden von einer Anlagerung abgehalten. Diese Daten zeigen, daß die BABS- Domäne und die FB-Domäne eine voneinander unabhängige Aktivität besitzen.

Claims

1. - Eine Vorrichtung zur Durchführung eines Affinitätstrennverfahrens, bestehend aus:

(a) einer porigen Hohlfasermembran gekoppelt mit einem Liganden;

(b) Einrichtung zur Einfassung besagter poriger Hohlfasermembran;

(c) Einrichtung zum Einleiten eines ersten Fluids und Herbeiführen eines engen Kontakts zwischen demselben und einer Seite besagter poriger Hohlfasermembran: und

(d) Einrichtung zum Ableiten von solchen Fluids in ein Behältnis, die sich auf der Seite von besagter poriger Hohlfasermembran befinden, die der Seite gegenüber liegt, auf der besagtes erstes Fluid über die unter (c) genannte Einrichtung eingeleitet wurde:

dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil des über Einrichtung (d) austretenden Fluids aus besagtem über Einrichtung (c) eingeleiteten Fluid stammt, und desweiteren dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran durch und durch und in allen Richtungen eine im wesentlichen isotrope mikroporige Struktur aufweist, wobei die Poren groß genug sind, um die Konvektionsströmung von Makromoleküle enthaltenden Lösungen durch die Membran zu gestatten.

2. - Die Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran eine mittlere Porengröße von mindestens 0,20 um aufweist.

3. - Die Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran eine Dicke von mindestens 200 um aufweist.

4. - Die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran eine hydrophobe Membran ist, die eine derivatisierte Oberfläche besitzt.

5. - Die Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Oberfläche der Membran durch eine Linker-Hälfte derivatisiert wird, die sich an besagter Oberflache sowie an einen Liganden mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen anlagert, um eine Produktmembran mit derivatisierten Oberflacheneigenschaften hervorzubringen.

6. - Die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran besteht aus a) einem hydrophoben Polymer mit funktionalisierbaren Kettenenden, die an der Polymeroberfläche liegen; b) einem Makromolekül und/oder einem Liganden, das/der in der Lage ist, die Oberflächeneigenschaften besagten hydrophoben Polymers zu verändern; c) einer Linker-Hälfte, die das Ende einer Kette des besagten hydrophoben Polymers mit besagtem Makromolekül und/oder mit besagtem Liganden verknüpft.

7. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes hydrophobe Polymer ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polysulfonen, Polyethersulfonen, Polyamiden, Polyarylenoxid, Polyurethanen, Polyetheretherketonen, Polycarbonaten, Polyestern, Polyvinylhalogeniden und Polyvinylidenpolyhalogeniden bzw. daraus gewonnenen Derivaten, Blends, Gemischen oder Copolymeren.

8. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Linker-Hälfte ein Molekül ist, das eine Basisgruppe und mindestens zwei funktionelle Gruppen umfaßt, die aus der Gruppe bestehend aus Epoxid-, Carbonyl-, Carboxyl-, Amin-, Halogenid-, Säurechlorid-, Säureanhydrid-, Sufonyl-, Sulfonylchlorid-, Carboxylsäure-, Hydroxylgruppen und stabilen Verbindungen derselben ausgewählt wird.

9. - Die Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Basisgruppe des Moleküls der Linker-Hälfte ein Kohlerwasserstoffmolekül ist.

10. - Die Vorrichtung nach einem der Anspruche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Linker-Hälfte eine funktionelle Gruppe beinhaltet, die aus der Gruppe bestehend aus Silikon, Aluminium, Zinn, Bor, Phosphor, Schwefel und Stickstoff ausgewählt wird.

11. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Linker-Hälfte ein Molekulargewicht von weniger als ca. 2000 hat.

12. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Makromolekül hydrophil ist.

13. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Makromolekul hydrophob ist.

14. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Makromolekül amphoter ist.

15. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Makromolekül eine funktionelle Gruppe aufweist, die in der Lage ist, eine Ladung zu tragen.

16. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Makromolekül eine nichtionische funktionelle Gruppe aufweist.

17. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Makromolekül eine biosynthetische Antikörperbindungsstelle ist.

18. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus natürlichem Polymer, synthetischem Polymer, daraus gewonnenen Derivaten, Blends, Gemischen und Copolymeren, oberflächenaktivem Stoff (Surfactant), Kohlenhydrat, Lectin, Pelypeptid, Polysaccharid, Liposom, Protein, Glycoprotein, Oligonucleolid, synthetischem Farbstoff, natürlichem Farbstoff, Polynucleotid, daraus gewonnenen Derivaten und Gemischen, monoklonalem Antikörper, polyklonalem Antikörper, Antigen, Rezeptor, Enzymsubstrat, Enzym, Tragerprotein, Koagulationsfaktor, Cofaktor, Inhibitor, Hormon, Immunglobulin, Histon, Plasmid, daraus gewonnenen Derivaten und Gemischen, sowie Polysilan, Polysiloxan, Polysulfonat, Polycarboxylat, Hydroxyalkylcellulose, Dextran, Diethylaminoethyldextran, Carboxymethylcellulose, Polyethylenimin, Polycarboxymethylethylanimin, Polyvinylalkohöl und daraus gewonnenen Derivaten, Blends, Gemischen und Copolymeren.

19. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Makromolekül ein durchschnittliches Molekulargewicht von ca. 0,2 bis ca. 5000 Kilodalton hat.

20. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Membranpolymer desweiteren mehrere Lagen von Makromolekülen beinhaltet, wobei diese Lagen durch kovalente Bindungen zusammengehalten werden.

21. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Ligand über eine kovalente Bindung mit besagtem (besagten) Makromolekul(en) verknüpft ist.

22. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Ligand eine ionisierbare funktionelle Gruppe umfaßt.

23. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Ligand ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus langkettigem aliphatischem Kohlenwasserstoffsilan, verzweigtkettigem aliphatischem Kohlenwasserstoffsilan, aromatischem Kohlenwasserstoffsilan sowie Gemischen daraus, oberflächenaktivem Stoff, Surfactant), Kohlenhydrat, Lectin, Polypeptid, Monosaccharid, Polysaccharid, Liposom, Protein, Glycoprotein, Oligonucleotid, synthetischem Farbstoff, natürlichem Farbstoff, Polynucleotid, daraus gewonnenen Derivaten und Gemischen, monoklonalem Antikörper, polyklonalem Antikörper, Antigen, Rezeptor, Enzymsubstrat, Enzym, Trägerprotein, Glycoprotein, Koagulationsfaktor, Cofaktor, Inhibitor, Hormon, Immunglobulin, Histon, Plasmid, daraus gewonnenen Derivaten und Gemischen, sowie naturlichem Protein A, rekombinantem Protein A, Avidin, Biotin, Heparin, Lectin, tierischem Zelloberflächenrezeptor, pflanzlichem Zelloberflächenrezeptor, bakteriellem Zelloberflächenrezeptor und einsträngiger Nukleinsäure.

24. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein biosynthetisches Bindeprotein ist.

25. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Ligand eine Bindungsstelle ist, die ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus Immunglobulin G, Immunglobulin M, Immunglobulin A, Immunglobulin E, Gewebeplasminogen-Aktivator menschlichem Interleucinprotein, Blutkoagulationsfaktor, menschlichem gonadotropem Chorion (HCG), Thyreotropinhormon (TTH), carcinoembryonalem Antigen, a-Fetoprotein, transformierendein Wachstumsfaktor und Interferon binden kann.

26. - Die Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran besteht aus (a) Polyethersulfon als erster hydrophober Polymerbestandteil mit funktionalisierbaren Phenolkettenenden; (b) Hydroxyalkylcellulose mit funktionellen Hydroxyl- Gruppen; und (c) einer Linker-Hälfte, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglycoldiglycidylether, 1,4-Butandioldiglycidylether, Epichlorohydrin und Chlorethansäure, wobei diese Linker-Hälfte in der Lage ist, das Ende einer Phenolkette besagten Polyethersulfons mit mindestens einer Hydroxylgruppe besagter Hydroxyalkylcellulose kovalent zu verknüpfen.

27. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran mit einem Liganden derivatisiert wird, der ein einkettiges multifunktionales biosythetisches Protein umfaßt, das von einem einzigen Gen, gewonnen durch rekombinante DNA-Techniken, ausgedrückt wird, das folgendes umfaßt:

- eine biosynthetische Antikörperbindungsstelle die eine vorbestimmte Antigen-Determinante an sich binden kann sind die mindestens einen Proteinabschnitt aufweist, wobei die Aminosäuresequenz in besagtem Abschnitt mindestens mit einem Teil der Sequenz eines variablen Abschnitts eines Immunglobulin-Moleküls, das die Fähigkeit besitzt, besagte vorbestimmte Antigendeterminante nebst darangeknüpftem Peptid an sich zu binden, homolog ist;

- ein Polypeptid-Effektorprotein mit mindestens einer funktionellen Gruppe, die zur selektiven kovalenten Bindung an besagte Membran in der Lage ist,

28. - Die Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Bindungsstelle mindestens zwei Abschnitte aufweist, die über Peptid-Brücken mit einer Polypeptidbindungssequenz verknüpft sind.

29. - Die Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß besagte zwei Abschnitte einem VH und einem VL eines natürlichen Immunglobulins ähnlich sehen.

30. - Die Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz jeder der besagten Abschnitte einen Satz von komplementärbestimmenden Bereichen ("CDRs - complementarily determining regions"), eingebettet in einen Satz von einrahmenden Bereichen ("FRs - framing regions"), umfaßt, von denen jeder mit mindestens einem Teil der CDRs bzw. FRs aus besagtem variablen Abschnitt eines Immunglobulin-Moleküls, das die Fähigkeit besitzt, besagte vorbestimmte Antigendeterminante zu binden, homolog ist

31. - Die Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Polypeptidbindungssequenz Aminosäuren beinhaltet, die zusammen eine unstrukturierte Polypeptid-Konfiguration bilden, die sich auf einer Strecke von mindestens 40 A in wäßriger Lösung erstreckt.

32. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran eine porige flache dünne Membran ist, die durch und durch und in alle Richtungen isotrop ist.

33. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von Strängen besagter Hohlfasermembran vorliegen.

34. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie desweiteren eine zweite Einrichtung zum Ableiten besagten ersten Fluids in ein zweites Behältnis aufweist.

35. - Die Vorrichtung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie desweiteren eine zweite Einrichtung zur Einleitung eines zweiten Fluids in besagte einfassende Einrichtung auf die der Einleitungsseite des ersten Fluids gegenüberliegenden Seite besagter Membran aufweist.

36. - Die Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Einleitungseinrichtung eine umkehrbare Pumpe ist, die in der Lage ist, ein Fluid abzusaugen oder den Abfluß des Fluids aus besagter einfassender Einrichtung zu regeln.

37. - Die Vorrichtung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß besagte unter (d) genannte Ablaßeinrichtung geschlossen ist.

38. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der statische Betriebsdruck besagter Vorrichtung bis zu ca. 1,02 bar (15 psig) reicht.

39. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Transmembrandruck besagter Vorrichtung bis zu ca. 0.68 bar (10 psig) reicht.

40. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur besagten ersten und zweiten Fluids zwischen ca. 2ºC und ca. 37ºC liegt.

41. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen von besagter Einrichtung zur Einfassung der Membran eingeschlossenen Raum mit einem Fassungsvermögen von ca. 1. ml bis zu ca. 10 l aufweist.

42. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Einrichtung zur Einfassung besagter Membran korrosionsbeständig ist.

43. - Die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Einleitungseinrichtung eine Pumpe ist.

44. - Ein Verfahren zur Reinigung/Trennung eines Ligats in einem Membransystem mittels Affinität, gekennzeichnet durch die nachgenannten Verfahrensschritte:

(a) Einleiten einer ligathaltigen Einsatzflüssigkeit auf eine porige Hohlfasermembran, die mit einem Liganden für besagtes Ligat gekoppelt ist, wobei besagte Einsatzflüssigkeit unter einem Druck steht, der ausreicht, um einen Teil der besagten Einsatzflüssigkeit zu veranlassen, tangential über eine Außenseite besagter Membran zu strömen und um den Rest des Fluids zu veranlassen, in besagte porige Membran einzuströmen und durch diese hindurchzuströmen, wobei sich das in besagter Einsatzflüssigkeit enthaltene Ligat an besagten Liganden anlagert und dadurch aus besagter Einsatzflüssigkeit isoliert wird;

(b) Abwaschen besagter Membran mit einer Pulferlösung;

(c) Einleiten einer Elutionslösung auf eine Seite besagter Membran unter einem Druck, der ausreichend hoch ist, um besagte Elutionslösung zu veranlassen, in besagte Membran einzuströmen und durch diese hindurchzuströmen und die Disassoziierung sämtlicher in Schritt (a) gebildeter Ligat-Ligand- Verbindungen zu bewirken, wobei jedes an besagten Liganden gebundene Ligat mittels besagter Elutionslösung eluiert wird; und

(d) Isolieren besagten Ligats in reiner Form aus besagter Elutionslösung; dadurch gekennzeichnet, daß besagte Membran durch und durch und in alle Richtungen eine im wesentlichen isotrope feinporige Struktur autweist, wobei die Poren groß genug sind, um die Konvektionsströmung von Makromoleküle enthaltenden Lösungen durch die Membran zu ermöglichen.

45. - Das Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Elutionslösung auf der der Einleitungsseite der Einsatzflüssigkeit gegenüberliegenden Seite besagter Membran eingeleitet wird, wobei die Einspeisung unter ausreichend hohem Druck erfolgt, um besagte Lösung zu veranlassen, in die Membran einzuströmen und durch diese hindurchzuströmen.

46. - Das Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Pufferlösung auf der der Einleitungsseite der Einsatzflüssigkeit gegenüberliegenden Seite besagter Membran eingeleitet wird, wobei die Einspeisung unter ausreichend hohem Druck enfolgt, um besagte Lösung zu veranlassen, in die Membran einzuströmen und durch diese hindurchzuströmen.

47. - Das Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Ligat aus der Gruppe bestehend aus IgG, Faktor VIII, Fibronectin und Faktor IX und besagter Ligand aus der Gruppe bestehend aus Protein A, einem monokonalem Antikörper zu Faktor VIII, Gelatine vom Schwein und einem monoklonalem Antikörper zu Faktor IX ausgewählt wird.