DE60319280T2

DE60319280T2 - Prozess zur farbreduktion von ausfluss von zellstoff und papier

Info

Publication number: DE60319280T2
Application number: DE2003619280
Authority: DE
Inventors: Rita Inst. Genomi KUMAR; Anil Inst. Genomi KUMAR; Deepa K. Inst. Genomi TIKU
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2003-12-09
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2023-12-10
Also published as: DE60319280D1; CN100343384C; ZA200507592B; BR0318197A; US20040018608A1; EP1613739A1; US20050158840A1; WO2004083410A1; EP1613739B1; US6896806B2; BRPI0318197B1; AU2003285608A1; CN1771322A; ATE386796T1

Description

Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Bakterienstamm mit der Zugangsnr. MTCC 5099, ein Verfahren zur Herstellung eines Inokulums des Bakterienstamms, und ein Verfahren für die Reduktion von Farbe eines Zellstofffabrikausflusses unter Verwendung des vorstehend genannten Inokulums, das die Schritte des Inokulierens bzw. Einimpfens geeigneter Aliquots des Zellstoff- und Papierfabrikausflusses mit dem erhaltenen Zellbrei, des Inkubierens des Gemisches bei ungefähr 37°C bei ungefähr 100 UpM für eine Zeitspanne im Bereich zwischen 24–48 Stunden, des Bewertens der Farbe und der Gesamtligninmengen, um die Farbentfernungseffizienz des vorstehend genannten Bakteriums zu bestimmen, umfasst.
Hintergrund und Referenzen des Standes der Technik zur vorliegenden Erfindung
Das Problem der Farbentfernung aus Zellstoff- und Papierfabrikabfall war ein Gegenstand von umfassender Betrachtung und Untersuchung in den letzten Jahrzehnten. Geschätzte zwei Billionen (engl.: „trillion") Gallonen Abwasser werden jährlich von der Zellstoff- und Papierindustrie in den größten Papier herstellenden Ländern abgesondert, und das Meiste dieses Ausflusses ist stark gefärbt (Joyce et al. 1983).
Die bräunliche Farbe des Abwassers ist hauptsächlich organisch in ihrer Natur, und ist primär auf die Lignindegradationsprodukte zurückzuführen, die während verschiedener Verarbeitungs- und Bleichvorgänge entstehen (Srivastava et al., 1984; Dilek et al., 2000). Die anderen farbverleihenden Mittel sind Holzextrakte, Tannine, Harze und synthetische Farbstoffe.
Es wurde nie angenommen, dass die Farbe ein Hauptproblem darstellen könnte, da sie als ein nicht herkömmlicher Schadstoff klassifiziert wird. Als Gründe für die Farbreglementierungen, die an einigen Orten vorherrschen, gelten der Schutz der Fischerei oder ästhetische Betrachtungen. Zweitens inhibiert das Einleiten von gefärbten Zellstoffausflüssen in die Vorfluter die fotosynthetische Aktivität von aquatischer Biota durch Reduzieren der Einstrahlung von Sonnenlicht, neben der Tatsache, dass es direkte toxische Wirkungen auf die Biota aufweist.
Die Farbverbindungen chelatieren auch Metallionen und können die Kontamination durch Schwermetalle beeinflussen. Kürzlich wurden auch die farbverursachenden organischen Verbindungen in das Auftreten von blaugrünen Algenblüten einbezogen (Paerl, 1982; Kuenzler et al., 1982; Witherspoon & Pierce, 1982). Es ist deshalb zwingend, dass die Farbe, die in den Zellstoff- und Papierfabrikausflüssen anwesend ist, entfernt wird, bevor sie in Vorfluter eingeleitet wird.
Es gibt zwei allgemeine Strategien für das Entfernen von Farbe aus dem Ausfluss einer Zellstoff- und Papierfabrik:

1) herkömmliches Ende der Leitungsbehandlung
2) Modifikation des Zellstoff- und Papierherstellungsverfahrens, sodass weniger Farbe gebildet wird

Die Folgenden sind herkömmlich verwendete Technologien zur Entfernung von Farbe:

– Sekundärbehandlung: die Ausflüsse werden mit dem herkömmlichen aktivierten Schlammverfahren behandelt. Jedoch können herkömmliche biologische Behandlungssysteme keine Farbe entfernen (Yosefian et al., 2000).
– Enzymvorbehandlung
– Harztrennung und Ionenaustausch
– Aluminiumoxid
– Adsorption an Holz
– Membranverfahren
– Bestrahlung
– elektrolytische Verfahren
– Aktivkohle
– Bodenbehandlung
– Ozon

Bis heute wurde keine einzelne Farbentfernungstechnologie als die wirksamste bzw. effizienteste identifiziert. Nachdem all die vorstehend zitierten Technologien kostenintensiv sind, hätten sie einen nachteiligen ökonomischen Einfluss auf die betroffene Fabrik. Darüber hinaus tragen die chemischen Behandlungsverfahren zu der ständig steigenden Konzentration von Chemikalien in der Umwelt bei (Kapdam et al., 2000).
Grundsätzlich ist Entfärbung unter Verwendung eines oder einer Kombination der folgenden Verfahren erreichbar:

– Adsorption
– Filtration
– Präzipitation
– chemische Degradation
– Fotodegradation und
– Biodegradation

Rohella et al., 2001 verwendeten Polyelektrolyte (kommerziell erhältlich) zum Entfernen von Farbe aus Zellstofffabrikausflüssen. Jedoch hat sich die Kosten-Nutzen-Analyse dieser Behandlung bislang nicht gerechnet, und deshalb ist diese Art der Technologie nicht praktikabel. Weil jedoch die Polyelektrolyte auf der Ionenladung des Ausflusses beruhen, wird die Fähigkeit zur Reduktion von Farbe stark variabel sein, zieht man die enormen Schwankungen in Betracht, die in der Zusammensetzung des Abwassers auftreten.
Der Großteil der Techniken zur Entfernung von Farbe arbeiten entweder dadurch, dass sie die Farbe in dem Schlamm konzentrieren oder dadurch, dass das gefärbte Molekül teilweise oder vollständig zusammenbricht (Willmott et al., 1998). Jedoch ist die Farb- und chemische Zusammensetzung der Zellstofffabrikausflüsse für gewöhnlich Gegenstand sowohl des täglichen Verfahrens als auch saisonaler Schwankungen. Eine einzelne, universell einsetzbare Lösung am Ende der Leitung ist deshalb bis heute noch nicht aufgetaucht.
Allgemeine physikalisch-chemische Verfahren zur Entfernung von Farbe, wie chemische Präzipitation, schnelle Sandfiltration, Membranverfahren und Adsorption wurden entwickelt (Springer, 1985). Obwohl die Adsorption und Membranverfahren wirksam sind, sind sie teuer (Manjunath und Mehrotra, 1981).
Die Anwendung von elektrochemischen Verfahren ist eine andere Weise, um die Abwasser aus der Zellulosepapierherstellung zu behandeln (Christoskova und Lazarov, 1988). Dieses Verfahren garantiert eine hohe Behandlungswirksamkeit, aber seine Wirksamkeit hängt von der Art der Elektroden, der Konstruktion des Elektrokoagulators und den Bedingungen, unter denen das Verfahren stattfindet, ab.
Die chemische Präzipitation, unter Verwendung von Alaun, Eisenchlorid und Kalk, wurde ebenfalls intensiv untersucht (Lathia und Joyce, 1987; Dugal et al., 1975; Joyce et al. 1979; Srivastava et al., 1984; Beulker und Jekel, 1993; Stephenson & Duff, 1996). Trotz der kurzen Rückhaltezeiten und der niedrigen Kapitalkosten, wurde über einige Nachteile berichtet, wie hohe Chemikalienkosten für die Präzipitation ebenso wie die pH-Wert Einstellung, voluminöse Schlammbildung aufgrund von großen Dosierungen, Problemen, die mit dem Entwässern und dem Ablagern des gebildeten Schlamms und der hohen Restkationenmenge assoziiert sind, so dass ihre Farbe in dem Überstand verbleibt (Stephenson und Duff, 1996; Srivastava et al. 1984).
Theoretisch ergibt die biologische Behandlung die ideale Lösung für die Farbentfernung, weil weniger Schlamm im Vergleich zu chemischen Behandlungen gebildet wird. Damit gehen niedrigere tägliche laufende Kosten einher. Unter den biologischen Systemen wurden die Weißfäulepilze (engl.: „white-rot fungi") bislang intensiv hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Lignin zu degradieren, untersucht, das einen wichtigen und Hauptbestandteil der Zellstoff- und Papierfabrikausflüsse darstellt (Feijoo et al., 1995). Bestimmte Gruppen haben gezeigt, dass die Pellets von Weißfäulepilzen, unter spezifischen Inkubationsbedingungen, stark Farbe und AOX aus dem Kraftbleichbad des Pflanzenausflusses adsorbiert (Jaspers et al., 1996).
Raghu Kumar et al., 1996, zeigten, dass Meerespilze auch für die Farbentfernung aus gebleichten Pflanzenausflüssen verwendet werden können. Von einem der Stämme wurde berichtet, dass er 74% Entfärbung bei alkalischem pH-Wert über einen Zeitraum von 14 Tagen ergibt. Einige andere Forscher haben ebenfalls über die teilweise Entfärbung durch Weißfäulepilze berichtet (Eaton et al., 1980; Livernoche et al., 1983; Pronty, 1990; Gokcay und Dilek, 1994). Gokcay und Dilek (1994) haben darauf hingewiesen, dass aufgrund des Bedarfs des Pilzes an hohen Glucosekonzentrationen diese Behandlung ökonomisch nicht durchführbar ist. Sie haben ebenfalls berichtet, dass die Pilze nicht wirksam waren, wenn gebleichte Ausflüsse anwesend waren.
Dilek et al., 1999 haben über die Entfernung von Zellstofffabrikausflüssen unter Verwendung einer gemischten Kulturalge berichtet. Eine Kombination einer aeroben-anaeroben Behandlung wurde von Vidal et al. verwendet. Weißfäulepilze, die verschiedene extrazelluläre oxidative Enzyme, einschließlich Ligninperoxidase, Manganperoxidase und Laccasen absondern, wurden verwendet, um gebleichte Kraftausflüsse aus Zellstofffabriken zu entfärben. Bis zu 64% der Farbe wurde durch das Anwenden einer aeroben-anaeroben Behandlung, gefolgt von einer Enzymbehandlung entfernt.
Bis heute gibt es nahezu keine Berichte hinsichtlich der Verwendung von reinen Bakterienkulturen für die Entfärbung von Zellstofffabrikausflüssen. Die Neuheit der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung von reinen Bakterienkulturen, isoliert aus ihrem natürlichen Habitat, für das Entfernen von Farbe aus den Zellstoff- und Papierabwässern in einer industriell und ökonomisch durchführbaren Weise.
Ziele der vorliegenden Erfindung:
Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die aerobe Behandlung von Zellstofffabrikabwasser für die Farbreduktion bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Bakterienstamm für die Farbreduktion von Papier- und Zellstofffabrikausflüssen bereitzustellen.
Noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Inokulum des Stamms für die Farbreduktion von Papier- und Zellstoffausflüssen zu entwickeln.
Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Bakterienstamm mit der Zugangsnr. MTCC 5099, ein Verfahren zur Herstellung eines Inokulums dieses Stamms, und ein Verfahren für die Reduktion von Farbe aus Zellstofffabrikausfluss unter Verwendung des vorstehend genannten Inokulums, das die Schritte des Inokulierens geeigneter Aliquots des Zellstoff- und Papierfabrikausflusses mit dem erhaltenen Zellbrei, des Inkubierens des Gemisches bei ungefähr 37°C bei ungefähr 100 UpM für eine Zeitspanne im Bereich zwischen 24–48 Stunden, des Bewertens der Farbe und der Gesamtligninmengen, um die Farbentfernungseffizienz des vorstehend genannten Bakteriums zu bestimmen, umfasst.
Detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Bakterienstamm mit der Zugangsnr. MTCC 5099, ein Verfahren zur Herstellung eine Inokulums des Stamms, und ein Verfahren für die Reduktion von Farbe aus Zellstofffabrikausfluss unter Verwendung des vorstehend genannten Inokulums, welches die Schritte des Inokulierens geeigneter Aliquots des Zellstoff- und Papierfabrikausflusses mit dem erhaltenen Zellbrei, wie in Anspruch 2 beansprucht, für Farbreduktionsstudien zusammen mit einem Kontrollbehälter, der eine Ausflussprobe ohne hinzugefügtes Inokulum enthält, des Inkubierens der in Schritt (a) hergestellten Behälter, bei 37°C/100 UpM für 48 Stunden, des Entnehmens von Proben von den vorstehenden Behältern in 50 ml Aliquots und des Bearbeitens derselben, um die Farbe und die Gesamtligninlevel bzw. Gesamtligninmengen festzustellen, des Analysierens der Farbentfernungseffizienz des vorstehend genannten Bakteriums umfasst.
Eine noch andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Bakterienstamm mit der Zugangsnr. MTCC 5099.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Stamm, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Stamm Gram negativ ist.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Stamm, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Stamm kurz stäbchenförmig ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Inokulums des Bakterienstamms mit der Zugangsnr. MTCC 5099 bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Kultivieren des Bakterienstamms mit der Zugangsnr. MTCC 5099 und Nährstoffagarmedien, welche 0,1% w/v jeweils von Lignin, Tannin und Vanillin enthalten, um reine Kulturen zu erhalten,
(b) Einimpfen des Bakteriums in Nährbrühe, welche 0,01% Tween 80 enthält, um eine Starterkultur bzw. Ausgangskultur zu erhalten,
(c) Kultivieren des vorstehend genannten Bakteriums, um die benötigte Biomasse zu erhalten, durch das Einimpfen eines geeigneten Aliquots der Nährbrühe mit der Starterkultur und Inkubieren des vorstehend genannten Mediums bei 37°C/100 UpM für 16 bis 18 Stunden.
(d) Zentrifugieren der resultierenden Kultur, nachdem eine optische Dichte von 1,5 bis 2,0 erreicht wurde, um ein Pellet zu erhalten. Waschen des gesammelten Pellets durch ein Auflösen in PO₄ ^3–-Puffer, 0,05 M, pH-Wert 6,8, erneutes Zentrifugieren des Pellets, und
(e) Sammeln des in Schritt (d) erhaltenen Pellets, Auflösen in 10 ml eines PO₄ ^3–-Puffers, 0,05 M, pH-Wert 6,8, um einen Zellbrei für Studien zur Behandelbarkeit zu erhalten.

In noch einer anderen Ausführungsform wird das Inokulum zur Verwendung in Farbreduktionsexperimenten durch das Einimpfen des vorstehend genannten Bakteriums in eine Nährbrühe, welche 0,01% Tween 80 enthält, zum Erhalten einer Starterkultur erhalten.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die vorstehend genannte Starterkultur zum Erhalten des benötigten Inokulums durch das Einimpfen eines geeigneten Aliquots von Nährbrühe mit der Starterkultur und das Inkubieren des vorstehenden Mediums bei 37°C/100 UpM für 16 bis 18 Stunden verwendet.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die resultierende Kultur bei geeigneten UpM, vorzugsweise 600 UpM, für eine Dauer von 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das resultierende Pellet durch Auflösen in PO₄ ^3–-Puffer 0,05 M, pH-Wert 6,8 und durch erneutes Zentrifugieren des Pellets gewaschen.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das resultierende Pellet in 10 ml von PO₄ ^3–-Puffer, 0,05 M, pH-Wert 6,8 aufgelöst, um ein Inokulum für Farbreduktionsstudien zu erhalten.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein aerobisches bzw. anaerobes Verfahren für die Reduktion von Farbe eines Zellstofffabrikausflusses unter Verwendung des Inokulums des Bakteriumstamms mit der Zugangsnr. MTCC 5099 bereit, welches umfasst:

(a) Einimpfen von geeigneten Aliquots des Zellstoff- und Papierfabrikausflusses mit dem, wie in Anspruch 3 beanspruchten, erhaltenen Zellbrei für Farbreduktionsstudien zusammen mit einem Kontrollbehälter, welcher Ausflussprobe ohne den Zusatz eines Inokulums enthält;
(b) Inkubieren der Behälter, wie in Schritt (a) hergestellt, bei 37°C/100 UpM für 48 Stunden;
(c) Entnehmen von Proben von den vorstehenden Behältern in 50 ml Aliquots und Bearbeiten derselben, um die Farbe und die Gesamtligninlevel festzustellen;
(d) Analysieren der Farbentfernungseffizienz des vorstehend genannten Bakteriums durch Vergleichen der Farblevel des mit dem wie in Anspruch 2 beanpruchten Bakterium behandelten Ausflusses mit dem Farblevel der Kontrollprobe nach 24- und 48-Stundenintervallen;
(e) Überprüfen der Lebensfähigkeit der vorstehend genannten Kultur in dem Ausfluss durch Kultivieren desselben in einem Nährstoffagarmedium und Berechnen der Kolonie bildenden Einheit (CFU)/ml.

In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Lebensfähigkeit der vorstehend genannten Kultur durch das Ausplattieren von Verdünnungen einer dem Experiment entnommenen Probe, um zählbare Kolonien zu erhalten und durch Berechnen der CFU/ml derselben nach 24- und 48-Stundenintervallen überprüft.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wird ein Verfahren wie in Anspruch 1 bis 9 beansprucht, in dem ein aerobes biologisches Entfärbungsverfahren durch das Verwenden eines bakteriellen Isolats, das vom aktivierten Schlamm einer Zellstoff- und Papierfabrik Ausflussbehandlungsanlage (ETP) erhalten wird, definiert ist, welcher bis zu 55% Reduktion von Farbleveln bzw. Farbspiegeln des vorgegebenen Ausflusses ergibt.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt der Stamm eine Farbreduktion von 55% in 24 Std.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt der Stamm eine Farbreduktion von 60% in 48 Std.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verhältnis eines Äquivalents zu Biomasse ungefähr 1:1.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Stamm nach der Farbreduktion lebensfähig.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung ein biologisches Verfahren für die Reduktion von Farbe eines Zellstoff- und Papierfabrikausflusses bereit. Ebenfalls offenbart ist ein Bakterienstamm, der aus einer spezifischen Quelle isoliert wurde, der die Fähigkeit besitzt, Farbe aus dem Zellstoff- und Papierausfluss zu reduzieren. Das vorstehend genannte Bakterienisolat ist in der Lage, die Farbe des Ausflusses zu reduzieren.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein biologisches Verfahren für die Reduktion von Farbe eines Zellstoff- und Papierfabrikausflusses unter Verwendung eines aeroben Bakterienstamms, der aus einer spezifischen Quelle aus der Zellstoff- und Papierfabrik isoliert wurde.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Reduktion eines Zellstoffausflusses unter Verwendung eines aeroben Behandlungsverfahrens bereit. Ein aerober Bakterienstamm wurde aus einer spezifischen Quelle aus der Zellstoff- und Papierfabrik isoliert und für die Entfärbung des Zellstofffabrikausflusses verwendet.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Bakterienisolat gegenwärtig bei IGIB als CBTCC/hinterlegt, und seine Identifizierung findet gegenwärtig statt.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erleichtert dieses Bakterienisolat die Reduktion von Farbe aus Zellstoff- und Papierausfluss.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Bakterium, das in dieser Erfindung beschrieben ist, aus aktiviertem Schlamm einer Anlage zur Behandlung von Ausfluss einer Zellstoff- und Papierfabrik isoliert, 5,0 Gramm des homogenisierten aktivierten Schlammes, der von der Anlage zur Behandlung von Ausfluss der Zellstoff- und Papierfabrik entnommen wurde, wird in dem Anreicherungsmedium inokuliert. Das Anreicherungsmedium besteht aus 100 ml Schlamminfusion, 25 ml steriler Nährbrühe und 0,1% (w/v) von jeweils Lignin (Alkalilignin-Aldrich, USA), Vanillin und Tannin (Sigma). Der pH-Wert wird bei 6,8 ± 0,2 eingestellt.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Schlammextrakt durch Kochen eines Gemisches enthaltend 300 ml Schlamm in 1200 ml dreifach destilliertem Wasser für ungefähr 30 Minuten hergestellt. Die Infusion wurde abgekühlt, zentrifugiert und grob filtriert. Das erhaltene Endfiltrat wird bei 121°C, 15 psi für 20 Minuten autoklaviert und zur Herstellung des Anreicherungsmediums verwendet. Das mit dem aktivierten Schlamm inokulierte Anreicherungsmedium wird bei 37°C für 24–48 Stunden inkubiert, um eine angereicherte Kultur zu erhalten.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die angereicherte Kultur in einer Reihe auf 10^–12 unter Verwendung von 0,05 M NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ Puffer, pH-Wert 7,0 angereichert. Es werden Stocklösungen von Lignin, Vanillin und Tannin hergestellt. Es wird eine Nährbrühe mit 2% Agar hergestellt, und 0,2% (v/v) von jeweils Lignin, Vanillin und Tannin wird zu ihren Stocklösungen gegeben. Das in Reihe verdünnte Inokulum wird anschließend ausplattiert und bei 37°C für 24–48 Stunden inkubiert. Eine einzelne isolierte Kolonie wird gepickt und auf einer frischen Platte desselben Mediums ausgestrichen. Der obige Schritt wird zweimal wiederholt, bis reine Kolonien erhalten werden.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das vorstehend genannte Bakterium mit der Hilfe einer sterilen Nichromschlinge in 15–20 ml sterile Nährbrühe (NB) enthaltend (pro Liter) 5,0 g peptischer Verdau aus Tiergewebe, 5,0 g Natriumchlorid, 1,5 g Rinderextrakt, 1,5 g Hefeextrakt und 0,2 ml Tween-80 inokuliert. Die Kultur wird bei 37°C für ungefähr 16–18 Stunden in einem Inkubationsschüttler inkubiert. Für ein vorsichtiges Schütteln wird der Inkubationsschüttler bei einer geeigneten UpM, vorzugsweise 100 UpM gehalten. Nachdem ausreichendes Wachstum erhalten wurde, wird die Brühe bei 4°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. 250 ml der sterilen NB wird mit 250 μl der vorstehend hergestellten Ausgangskultur inokuliert.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Behälter für die Inkubation bei 37°C/100 UpM für 16–18 Stunden gehalten, bis eine optische Dichte (650 nm) von 1,5–2,0 erreicht wurde. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei einer geeigneten UpM, vorzugsweise 6000 UpM für 20 Minuten geerntet. Das resultierende Pellet wird durch Lösen in einer minimalen Menge an Phosphatpuffer 0,05 M, pH-Wert 6,8 gewaschen und erneut unter Verwendung derselben UpM- und Zeitbedingungen zentrifugiert. Während der Zentrifugation wird die Temperatur bei 4°C gehalten. Das so erhaltene Pellet wird in einem minimalen Volumen an Phosphatpuffer, 0,05 M, pH-Wert 6,8, vorzugsweise 10 ml resuspendiert und gevortext, um eine homogene Suspension herzustellen, die für das Reduzieren von Farbe aus dem Zellstoff- und Papierausfluss verwendet werden soll.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird für die Durchführung der Farbreduktionsexperimente 250 ml der Probe in schraubverschlossene konische Schüttelbehälter aufgenommen. Das Inokulum wird zu der Ausflussprobe zugegeben, nachdem überprüft wurde, dass der pH-Wert des Ausflusses vorzugsweise um 7,0 liegt. Ein Kontrollbehälter, der kein zugegebenes Inokulum enthält, wird zum Vergleich ebenfalls aufrecht erhalten. Die Behälter werden bei 37°C/100 UpM für einen Zeitraum von 48 Stunden inkubiert.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden für das Analysieren der Farbreduktionseffizienz ebenso wie der Gesamtligninlevel des vorstehend genannten Bakteriums ungefähr 50 ml der Proben entnommen. Die Proben werden für die Analyse durch ihr Zentrifugieren bei einer geeigneten UpM, vorzugsweise 8000 UpM für 30 Minuten bei 4°C hergestellt. Der Überstand wird anschließend durch 0,45 μ Filter (Millipore) passagiert. Zum Messen der Farblevel wird der pH-Wert der Proben auf 7,6 eingestellt, und die optische Dichte wird bei 465 nm, wie in dem NCASI Farbbewertungsverfahren beschrieben, gemessen. Der Gesamtligninassay wird ebenfalls durch das modifizierte Pearl Benson Verfahren durchgeführt.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung würde für die Bewertung der Lebensfähigkeit der Kultur während des gesamten Experiments die Probe in Reihe verdünnt und auf Nähragarmedium ausplattiert und bei 37°C über Nacht in einer invertierten Position inkubiert. Die Kolonien wurden gezählt, und die Kolonie bildenden Einheiten (engl.: Colony Forming Units)/ml (CFU/ml) wurden berechnet.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung weiterhin ein Verfahren für die Herstellung eines Inokukums des vorstehend genannten Bakteriums und seine Verwendung für die Reduktion von Farbe aus Zellstoff- und Papierfabrikausfluss bereit, das umfasst:

a) Isolieren eines Bakteriums aus aktiviertem Schlamm, der von der Anlage zur Behandlung von Ausfluss einer Zellstoff- und Papierfabrik gesammelt wurde;
b) Kultivieren des vorstehend genannten Bakteriums auf Nähragarmedien enthaltend 0,1% w/v von jeweils Lignin, Tannin und Vanillin, um reine Kulturen zu erhalten;
c) Einimpfen des vorstehend genannten Bakteriums in Nährbrühe enthaltend 0,01% Tween 80, um eine Ausgangskultur zu erhalten;
d) Kultivieren des vorstehend genannten Bakteriums um die benötigte Biomasse zu erhalten durch Einimpfen eines geeigneten Aliquots der Nährbrühe mit der Ausgangskultur und Inkubieren des vorstehend genannten Mediums bei 37°C/100 UpM für 16–18 Stunden;
e) Zentrifugieren der resultierenden Kultur, nachdem eine optische Dichte von 1,5–2,0 erhalten wurde, um ein Pellet zu erhalten, Waschen des gesammelten Pellets durch Lösen in PO₄ ^3–-Puffer, 0,05 M, pH-Wert 6,8, sowie erneutes Zentrifugieren des Pellets;
f) Sammeln des in Schritt (e) erhaltenen Pellets, Lösen in 10 ml PO₄ ^3–-Puffer, 0,05 M, pH-Wert 6,8, um einen Zellbrei für Behandlungsstudien zu erhalten;
g) Einimpfen geeigneter Aliquots des Zellstoff- und Papierfabrikausflusses mit dem in Schritt (f) erhaltenen Zellbrei für Farbreduktionsstudien zusammen mit einem Kontrollbehälter enthaltend eine Ausflussprobe ohne hinzugefügtem Inokukum;
h) Inkubieren des in Schritt (g) erzeugten Behältersatzes bei 37°C/100 UpM für 48 Stunden;
i) Entnehmen von Proben aus den vorstehend genannten Behältern in 50 ml Aliquots und ihr Verarbeiten für die Bewertung der Farb- und Gesamtligninlevel;
j) Analysieren der Farbentfernungseffizienz des vorstehend genannten Bakteriums durch Vergleichen der Farblevel der Kontrollprobe nach 24- und 48-Stundenintervallen;
k) Überprüfen der Lebensfähigkeit des vorstehend genannten Bakteriums in dem Ausfluss durch ein Koloniezählverfahren und Berechnen der CFU/ml nach 24 und 48 Stunden.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Bakterium aus aktiviertem Schlamm isoliert, der von der Anlage zur Behandlung von Ausfluss aus einer Zellstoff- und Papierfabrik gesammelt wurde.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das vorstehend genannte Bakterium in Nährbrühe enthaltend 0,01% Tween 80 inkubiert, um eine Ausgangskultur zu erhalten.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kultur des Bakteriums durch Einimpfen bzw. Beimpfen der Nährbrühe mit der Ausgangskultur hergestellt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Inkubation der Bakterienstämme durch vorsichtige Bewegung bei 100 UpM durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Wachstum der inkubierten Bakterienstämme bei einer Temperatur von 37°C für einen Zeitraum von 16–18 Stunden durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Bakterium bei einer geeigneten UpM, vorzugsweise 6000 UpM für einen Zeitraum von ungefähr 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert, nachdem eine optische Dichte von ungefähr 1,5–2,0 erreicht wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das resultierende Pellet durch Lösen in einer minimalen Menge an Phosphatpuffer, 0,05 M, pH-Wert 6,8 und erneutem Zentrifugieren unter Verwendung derselben UpM- und Zeitbedingungen gewaschen. Während der Zentrifugation wird die Temperatur bei 4°C gehalten.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das so erhaltene Pellet in einem minimalen Volumen an Phosphatpuffer, 0,05 M, pH-Wert 6,8, vorzugsweise 10 ml, suspendiert und gevortext, um eine homogene Suspension zu erhalten.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der vorstehend erhaltene Zellbrei verwendet, um die Ausflussproben für die Reduktion von Farbe zu beimpfen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren für die Reduktion von Farbleveln aus einem Zellstoff- und Papierfabrikausfluss.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Behälter, die das vorstehend genannte Inokulum enthalten, bei 37°C bei 120 UpM für 48 Stunden inkubiert.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Reduktion in den Farb- und Gesamtligninleveln über einen Zeitraum von 48 Stunden beobachtet.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kultur auf Platten enthaltend Nähragarmedium für die Lebensfähigkeit des Bakteriums in dem vorstehend genannten Ausfluss angezogen.

1. Wie in der vorläufigen Patentanmeldung beschrieben ist, waren die Bakterienkonsortien in der Lage, die Farbe des Ausflusses über einen Zeitraum von fünf Tagen zu reduzieren. Jedoch wurden spätere Studien durchgeführt, um die Rückhaltezeit (um das Verfahren schneller zu machen) zu verringern ebenso um das Ausmaß der Farbreduktion des Ausflusses zu verstärken. Ungefähr 58% Reduktion in den Farbleveln innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden durch ein einzelnes Bakterienisolat wurde beobachtet, was definitiv besser ist als die frühere 51% Reduktion in dem 3- bis 5-Tageszeitraum im Fall der Konsortien. Deshalb wurden in der vollständigen Beschreibung der Patentanmeldung die Ergebnisse, die unter Verwendung des einzelnen Bakterienisolats erhalten wurden, zusammengestellt; die deutlich besser waren als jene, die mit den Bakterienkonsortien erhalten wurden.
2. Die Kultur wurde bereits für die Hinterlegung zu IMTECH in der internatonalen Hinterlegungsstelle geschickt, und die Nummer sollte am 17. März 2003 zugewiesen werden.
3. Wir möchten nur das eine bakterielle Isolat beanspruchen, das wiederholt die besten Ergebnisse gezeigt hat, wie in den Tabellen 5 und 8 der vollständigen Beschreibung angegeben ist.

Der Stamm der vorliegenden Anmeldung wird bei MTCC, Chandigarh INDIEN hinterlegt, und die Zugangsnr. lautet MTCC 5099. Der Stamm ist als Bakterienstamm Bakterium B4 in der Beschreibung an verschiedenen Stellen erwähnt.
Die Erfindung der vorliegenden Anmeldung wird weiter in Form von Beispielen ausgeführt. Jedoch substantiieren diese Beispiele lediglich die Erfindung, und sie sollen nicht derart ausgelegt werden, dass sie den Schutzbereich der Erfindung beschränken.
Beispiel 1
Bakterien wurden aus Abwasser isoliert, das sowohl von dem Einlass als auch von dem Auslass einer Anlage zur Behandlung von Ausfluss stammten. Der pH-Wert des Ausflusses wurde überprüft, und es wurde festgestellt, dass er bei 7,6 ± 0,2 lag. Filtriertes und autoklaviertes Abwasser wurde als Medium zum Isolieren von autochthonomen Bakterien in verschiedenen Prozentsätzen viz., 100%, 80%, 50%, 30% und 10% unter Verwendung von Mineralsalzmedium (MSM) verwendet.

Die Zusammensetzung des verwendeten MSM war wie folgt:

K₂HPO₄	5 mM
KH₂PO₄	5 mM
MgSO₄·7H₂O	1 mM
EDTA	0,3 mM
ZnSO₄·7H₂O	0,01 mM
MnSO₄·7H₂O	0,02 mM
CuSO₄·7H₂O	0,004 mM
FeSO₄·7H₂O	0,1 mM
NaMoO₄·2H₂O	0,004 mM
(NH₄)₂SO₄·7H₂O	5 mM
pH-Wert	7,0 ± 0,2

Zu 100 ml Aliquots der Nährbrühe (NB) wurde 1 ml von jeweils Einlass wie Auslass des Abwassers zugegeben und bei 37°C/24–48 Std. zur Anreicherung gehalten.
Ausfluss-MSM Platten wurden unter Verwendung von 2% Agar als verfestigendes Mittel hergestellt. Die Platten wurden zur Verfestigung und bis zur weiteren Verwendung invertiert aufbewahrt. Das Ausplattieren in einer Verdünnungsreihe wurde durch Verdünnen der angereicherten Inokula in Reihe bis zu einer Verdünnung von 10^–12 durchgeführt. Die Verdünnungsreihe wurde durchgeführt, indem 9 ml Aliquots von Na₂HPO₄ – NaH₂PO₄ Puffer (pH-Wert 6,8, 0,05 M) entnommen und mit 1 ml angereichertem Inokulum in einem ersten Gefäß beimpft und gevortext wurden. Es wurden 1 ml aus diesem Gefäß entnommen und in dem nächsten Gefäß damit verdünnt, bis eine 10^–12 Verdünnung erreicht wurde. Diese Gefäße wurden anschließend für das Ausplattieren auf den Ausfluss-MSM Platten verwendet.
100 μl der vorstehend genannten Verdünnungen wurde auf den verschiedenen Ausfluss-MSM ausplattiert und mit der Hilfe eines sterilen Glasschabers ausgebracht. Alle Platten wurden doppelt hergestellt und für 24–48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Kolonien, die auf diesen Platten auftraten, wurden entsprechend den morphologischen Unterschieden markiert und für die weitere Reinigung ausgewählt.
Kolonien, die eine unterschiedliche morphologische Erscheinung zeigten, wurden mit sterilen Impfnadeln gepickt und auf Platten ausplattiert, welche die entsprechenden Wachstumsmedien enthielten. Nach zwei oder drei wiederholenden Subkultivierungen wurden gereinigte Isolate erhalten, die hinsichtlich Reinheit getestet wurden und in geneigten Stapeln (engl.: „slants and stabs") in ihren jeweiligen Medien aufbewahrt wurden.
Eine Impföse voll der Kulturen wurden entnommen und in sterilen Aliquots in Nährbrühe beimpft, gevortext und zur Inkubation bei 37°C/120 UpM für 16–18 Std. gehalten. Die optischen Dichten der Ausgangskulturen wurden bei 650 nm überprüft.
Fünfunddreißig morphologisch unterschiedliche Bakterien wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit die Farbe von Zellstofffabrikabwasser zu reduzieren, gescreent. 100 ml sterile NB wurde mit 100 μl der jeweiligen Ausgangskulturen beimpft und bei 37°C/120 UpM für 16–18 Stunden inkubiert. Die anfangs- und endoptischen Dichten bei 650 nm wurden notiert. Die Kulturen wurden bei einer OD₆₅₀ von 1,5–2,0 durch Zentrifugieren bei 6000 UpM für 20 Minuten bei 4°C geerntet. Das erhaltene Pellet wurde zweimal mit sterilem Phosphatpuffer (pH-Wert 6,8, 0,05 M) und in einem kleinen Volumen desselben Puffers resuspendiert. Diese Suspension wurde anschließend für Behandlungsassays in einem Verhältnis von 1:1 verwendet, d. h. 100 ml der Ausflussprobe wurden mit Pellet behandelt, das aus 100 ml Kulturmedium erhalten wurde.
Das Farbentfernungsexperiment wurde in Batchkultur in konischen Schüttelbehältern bei 37°C bei 120 UpM für einen Zeitraum von fünf Tagen durchgeführt. Die Farbintensitäten wurden bei 450 nm unter Verwendung des NCASI optischen Dichteverfahrens am Tag Null, Tag Drei und Tag Fünf gemessen. 13 Bakterien ergaben eine Reduktion von 50% und mehr am Tag Fünf (Tabelle 1).
Beispiel II
Die dreizehn individuellen Bakterien, die mehr als 50% Farbreduktion zeigten, wurden ausgewählt, und neun verschiedene Bakterienkonsortien wurden unter Verwendung zufälligen Kombinationen gebildet.
Individuelle Kulturen, welche den gebildeten Konsortien entsprachen, wurden unabhängig in Nährbrühe durch Einimpfen von 100 μl aktiv wachsenden Kulturen in jeden Behälter angezogen. Die Kulturen wurden bei 37°C/16–18 Std. bei 120 UpM inkubiert, bis eine optische Dichte von 1,5–2,0 erreicht wurde. Die Kulturen wurden anschließend gemäß der Zusammensetzung des Konsortiums in einem Pool zusammengenommen. Die optische Dichte bei 650 nm der vereinigten Kultur wurde bestimmt. Die Zellen der resultierenden Konsortien wurden durch Zentrifugieren bei 6000 UpM für 20 Minuten bei 4°C geerntet und zweimal mit Na₂HPO₄ – NaH₂PO₄ Puffer (pH-Wert 6,8, 0,05 M) gewaschen. Die Pellets wurden anschließend in 10 ml Phosphatpuffer erneut gelöst und für Farbreduktionsexperimente verwendet.
Es wurden Ausflussproben, neutralisiert auf pH-Wert 7,0 + 0,2, in 100 ml Aliquots in Schüttelbehälter abgenommen und mit den vorstehend hergestellten Pellets in einem Verhältnis von 1:1 beimpft. Alle Flaschen wurden bei 37°C/120 UpM für 3 Tage inkubiert. Es wurden auch Kontrollen aufrecht erhalten, die kein zugegebenes Inokulum, mit Ausnahme der ursprünglichen Flora, enthielten.
Die Proben wurden hinsichtlich Farbleveln unter Verwendung des NCASI spektrophotometrischen Assays analysiert, und die prozentuale Reduktion wurde berechnet. Nur zwei Konsortien zeigten eine Farbreduktion, die größer war als 50% (Tabelle 2).
Beispiel III
Die optimale Inokulumgröße zum Reduzieren von Farbleveln wurde durch Beimpfen der Konsortien in drei verschiedenen Verhältnissen, viz., 1:1, 1:0,5 und 1:0,75 (Ausfluss: Kultur) überprüft.
100 ml Ausflussproben wurden in Schüttelbehälter abgenommen und mit den vorbereiteten Konsortien, die aus 100 ml, 50 ml und 75 ml NB Aliquots hergestellt wurden, beimpft. All die Bedingungen der Inkubationstemperatur, Zeit und des Schüttelns wurden genauso wie im Beispiel 2 aufrecht erhalten, und die Farblevel wurden nach der Behandlung für drei Tage gemessen.
Die Konsortien zeigten die höchste Farbreduktion mit einem 1:1 Ausfluss:Biomasseverhältnis (Tabelle 3).
Beispiel IV
Um die Farbentfernungseffizienz zu verbessern, wurde eine frische Bakterienisolierung aus dem aktivierten Schlamm durchgeführt, der aus ETP einer Zellstoff- und Papierfabrik erhalten wurde. 5,0 Gramm homogenisierter aktivierter Schlamm, der aus der ETP einer Zellstoff- und Papierfabrik entnommen wurde, wurde in Medium angereichert, das aus 100 ml Schlamminfusion, 25 ml steriler Nährbühe und 0,1% (w/v) von jeweils Lignin (Alkalilignin-Aldrich, USA), Vanillin und Tannin (Sigma) bestand. Der pH-Wert wurde auf 6,8 ± 0,2 eingestellt.
Einzelne Bakterien wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, den Papierfabrikausfluss zu entfärben, gescreent. Der Behandlungsassay wurde in 100 ml Aliquots durchgeführt, und einzelne Bakterienpellets wurden hinsichtlich ihrer Farbentfernungseffizienzen gescreent. Es wurde beobachtet, dass das Isolat Nummer 4 das beste von allen war, was 68% Farbentfernung in 48 Stunden ergab, gefolgt von den Isolaten Nummer 35 (63%) und 19 (60%) (Tabelle 4).
Beispiel V
Die Isolate 4, 19 und 35 wurden anschließend einzeln in zwei verschiedenen Medien – Nährbrühe (NB) (Vollmedium) und Mineralsalzmedium (Minimalmedium) mit anorganischen Bestandteilen und Glucose (1%) als Kohlenstoffquelle – kultiviert, um die Wirkung der Wachstumsmedien auf die Leistung der Kulturen bei dem Entfernen von Farbe aus Zellstofffabrik-Abwassern zu vergleichen.
Die vorstehenden Isolate wurden ebenfalls getrennt kultiviert, um sie zusammen in der Form eines Konsortiums zusammenzustellen und um sie hinsichtlich der Wirkung von Kulturmedien auf die Wirksamkeit des Konsortiums, die Farbe zu reduzieren, zu testen.
Nährbrühe (NB) wurde hergestellt durch Lösen (pro Liter) von 5,0 g Peptidverdau aus Tiergewebe, 5,0 g Natriumchlorid, 1,5 g Rinderextrakt, 1,5 g Hefeextrakt und 0,2 ml Tween-80. Mineralsalzmedium (MSM) wurde wie in Beispiel I beschrieben, hergestellt. Glucose (1% v/v), die aus ihrer sterilen Stocklösung entnommen wurde, wurde ebenfalls zu MSM zugegeben, um als eine Kohlenstoffergänzung für die Bakterien zu wirken.
Die Farbentfernungsassays wurden in Batchkulturen in 100 ml Aliquots mit einer Inkubationstemperatur von 37°C und 120 UpM unter Schütteln durchgeführt. Die Proben für die Farbanalysen wurden nach 0-, 24- und 48-Stundenintervallen entnommen und hinsichtlich der Farblevel analysiert. Sowohl in NB als auch in MSM angezogene Kulturen zeigten nahezu ähnliche Ergebnisse (Tabelle 5).
Beispiel VI
Die Isolate 4, 19 und 35, die mehr als 60% Reduktion der Farbe des Ausflusses der Zellstofffabrik zeigten, wurden in einem Konsortium vereinigt und zusammen mit anderen zusammengestellten Konsortien hinsichtlich ihrer Farbreduktionsfähigkeiten gescreent, die zufällig zusammengestellte Kulturen enthielten, wobei das Konsortium CC17 das Beste unter allen war, was bis zu 55% Farbreduktion innerhalb von 48 Stunden zeigte.
Beispiel VII
Das Konsortium CC17, das in Beispiel VI zusammengestellt wurde, wurde für die Farbentfernung von Century Einlassausfluss in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Glucose und Sucrose Viz. 0,5, 0,75, 1,0% w/v verwendet.
Es wurde gefunden, dass 1% Glucose die beste Ergänzung im Vergleich zu anderen war, die bis zu 75% Reduktion der Farbe innerhalb von 48 Stunden lieferte. Jedoch waren alle anderen nicht signifikant davon verschieden (Tabelle 7).
Beispiel VIII
Obwohl es so aussah, als gäbe die Zugabe von Glucose in dem Abwasser eine bessere Farbreduktion, ist ihre praktische Anwendbarkeit jedoch fraglich. Deshalb entschieden die Erfinder, die Biomassebeladung in dem Ausfluss zu erhöhen, um den Effekt zu bewerten. Die Bakterien Nr. 4, 19 und 35 wurden, wie vorher beschrieben, einzeln bis zu einer OD 650 von 1,5–2,0, anstelle von 1,0, angezogen, um das Konsortium zusammenzustellen, und MTCC 5099 wurde ebenfalls einzeln bis zu einer optischen Dichte von 1,5–2,0 angezogen, um irgendeine Verstärkung in der Farbentfernungseffizienz festzustellen. Alle anderen experimentellen Bedingungen blieben gleich. Das Bakterium Nummer 4 zeigte bis zu 55% Farbreduktion innerhalb von 24 Stunden (Tabelle 8).
Die Gesamtligninlevel der vorstehenden Bakterien wurden ebenfalls unter Verwendung des modifizierten Pearl Benson Verfahrens geschätzt.
Das Bakterium Nummer 4 zeigte die beste Antwort im Vergleich zu den anderen individuellen Bakterien ebenso wie gegenüber dem Konsortium mit der erhöhten Biomassebeladung. Die Ergebnisse wurden dreifach wiederholt.
Beispiel IX
Die Überwachung der Biomasselevel und die Lebensfähigkeit von Isolat 4 während des Experiments wurde durch Kolonie bildende Einheiten (CFU/ml) durchgeführt.

Es wurde gefunden, dass bei null Stunden, der CFU/ml Level ungefähr 10⁹ CFU/ml betrug, der so bis 24 Stunden verblieb und tatsächlich einen Annstieg auf 10¹⁰ CFU/ml zeigte, was zeigt, dass die Zellen vollständig lebensfähig waren, selbst am Ende des Experiments. Die Proben wurden auf festem Nährmedium ausgestrichen, um die morphologischen Eigenschaften der Originalkultur mit der Kultur in dem Ausfluss abzugleichen, und es wurde gefunden, dass sie gleich waren. Tabelle – 1 Farbreduktion von Century Zellstoff- und Papierfabrikeinlass zu ETP

Pr. Nr.	Isolat Nr.	% Farbreduktion (5. Tag)	Pr. Nr.	Isolat Nr.	% Farbreduktion (5. Tag)
1	176	51*	19	208	46
2	177	56*	20	209	55*
3	178	35	21	210	40
4	180	52*	22	211	38
5	183	53*	23	218	40
6	185	55*	24	222	40
7	186	57*	25	223	40
8	188	50*	26	225	60*
9	190	36	27	236	42
10	191	38	28	243	22
11	193	38	29	245	50*
12	195	50*	30	248	32
13	200	49	31	252	40
14	201	50*	32	262	30
15	202	50*	33	270	22
16	205	40	34	271	21
17	206	46	35	239	27
18	207	46

*Bakterien, die mehr als 50% Farbreduktion zeigen
Anmerkung: Alle Werte sind Mittelwerte aus drei Experimenten

Pr. Nr.	Konsortium	Farbentfernung (%)
Pr. Nr.	Konsortium	Tag 0	3. Tag
1	L1	36	57
2	L2	48	51
3	C2	39	63
4	C3	41	60
5	C5	51*	58
6	C6	30	63
7	C7	60*	60
8	C8	35	57
9	C9	48	58
10	Kontrolle	Null	Null

* Konsortien, die mehr als 50% Reduktion am Tag 0 zeigen
Alle Werte sind der Mittelwert von dreifachen Analysen mit einer S.D. von ±0,2

Pr. Nr.	Konsortien Nummer	% Farbreduktion nach 3 Tagen
Pr. Nr.	Konsortien Nummer	1:1	1:0,75	1:0,5
1	L1	56	51	45
2	L2	52	48	39
3	C2	65	53	38
4	C3	61	50	46
5	C5	59	49	40
6	C6	60	51	37
7	C7	60	50	35
8	C8	55	43	29
9	C9	55	44	25
10	Kontrolle	Null	Null	Null

Alle Werte sind der Mittelwert von dreifachen Analysen mit einer S.D. von ±0,2

Kultur Nr.	% Farbreduktion
4	68
18	55
25	58
32	55
33	51
34	51
35	63
36	51
22	48
20	56
19	60
Kontrolle	Null

Alle Werte sind der Mittelwert von dreifachen Analysen mit einer S.D. von ±0,2

Isolat Nr.	24 Std.		48 Std.
Isolat Nr.	NB-angezogen	MSM-angezogen	NB-angeogen	MSM-angezogen
4	58	56	68	67
19	49	48	61	60
35	49	46	58	59
CC17	48	46	49	51

Alle Werte sind ein Durchschnitt von dreifachen Analysen mit einer S.D. von ±0,2

Pr. Nr.	Konsortium Nr.	% Farbreduktion
Pr. Nr.	Konsortium Nr.	24 Std.	48 Std.	72 Std.	96 Std.
1.	CC1	17	22	53	53
2.	CC2	11	24	39	41
3.	CC3	11	26	48	50
4.	CC4	11	29	42	43
5.	CC5	11	24	32	41
6.	CC6	10	19	22	29
7.	CC7	9	5	12	33
8.	CC8	6	13	15	27
9.	CC9	10	23	27	44
10.	CC10	1	1	9	8
11.	CC11	0	11	16	8
12.	CC12	3	10	15	40
13.	CC13	18	52	52	65
14.	CC14	7	8	8	13
15.	CC15	15	30	30	66
16.	CC16	5	14	14	18
17.	CC17	47	55	62	70

Pr. Nr.	Probe	% Farbreduktion
Pr. Nr.	Probe	24 Stunden	48 Stunden	72 Stunden
1.	Ausfluss + Konsortien	49	63	72
2.	Ausfluss + Konsortien + 0,5% Glucose	60	68	73
3.	Ausfluss + Konsortien + 0,75% Glucose	62	69	71
4.	Ausfluss + Konsortien + 1,0% Glucose	68	75	79
5.	Ausfluss + Konsortien + 0,5% Sucrose	60	65	73
6.	Ausfluss + Konsortien + 0,75% Sucrose	64	73	75
7.	Ausfluss + Konsortien + 1,0% Sucrose	63	74	75

Alle Werte sind ein Durchschnitt von doppelten Analysen mit einer S.D. von ±0,2

Probe	% Farbreduktion		% Reduktion des Gesamtlignins
Probe	24 Stunden	48 Stunden	24 Stunden	48 Stunden
Ausfluss + CCC17	50	58	16	19
Ausfluss + MTCC 5099	55	60	18	25
Ausfluss + Bakterium 19	48	49	19	29
Ausfluss + Bakterium 35	43	48	26	31

Alle Werte sind ein Durchschnitt von dreifachen Analysen mit einer S.D. von ±0,5

CFU/ml (0 Stunden)	CFU/ml (24 Stunden)	CFU/ml (48 Stunden)
9,7 × 10⁹	8,0 × 10⁹	6,1 × 10¹⁰

Vorteile

1. Das isolierte Bakterium ist in der Lage, die Farbe von Zellstofffabrikausfluss in einer reproduzierbaren Weise zu reduzieren.
2. Das isolierte Bakterium bleibt lebensfähig, selbst nach dem Abschluss des Experiments, was seine Wiederverwertbarkeit in dem nächsten Experiment nahe legt.
3. Das natürlich isolierte Bakterium ist nicht pathogen und kann auf einfachen Nährmedien ohne irgendwelche ökonomischen Herausforderungen kultiviert werden.
4. Diese Art der Bakterienreduktion von Farbe aus Zellstofffabrikausflüssen ist neu.

Claims

Bakterienstamm mit der Zugangsnr. MTCC 5099.
Stamm wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Stamm kurz stäbchenförmig ist.
Verfahren zur Herstellung eines Inokulums des Bakterienstamms mit der Zugangsnr. MTCC 5099, wobei das Verfahren umfaßt: a) Kultivieren des Bakterienstamms mit der Zugangsnr. MTCC 5099 auf Nährstoffagarmedien, welche 0,1% w/v jeweils von Lignin, Tannin und Vanillin enthalten, um reine Kulturen zu erhalten, b) Einimpfen des Bakteriums in Nährbrühe, welche 0,01% Tween 80 enthält, um eine Starterkultur zu erhalten, c) Kultivieren des vorstehend genannten Bakteriums, um die benötigte Biomasse zu erhalten, durch das Einimpfen eines geeigneten Aliquots der Nährbrühe mit der Starterkultur und Inkubieren des vorstehend genannten Mediums bei 37°C/100 UpM für 16 bis 18 Stunden, d) Zentrifugieren der resultierenden Kultur, nachdem eine optische Dichte von 1,5 bis 2,0 erreicht wurde, um ein Pellet zu erhalten, Waschen des gesammelten Pellets durch ein Auflösen in PO₄ ^3–-Puffer, 0,05 M, pH-Wert 6,8, Zentrifugieren des Pellets, und e) Sammeln des in Schritt (d) erhaltenen Pellets, Auflösen in 10 ml eines PO₄ ^–3-Puffers, 0,05 M, pH-Wert 6,8, um einen Zellbrei für Studien zur Behandelbarkeit zu erhalten.
Verfahren wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das Inokulum zur Verwendung in Farbreduktionsexperimenten durch das Einimpfen des vorstehend genannten Bakteriums in eine Nährbrühe, welche 0,01% Tween 80 enthält, zum Erhalten einer Starterkultur erhalten wird.
Verfahren wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die vorstehend genannte Starterkultur zum Erhalten des benötigten Inokulums durch das Einimpfen eines geeigneten Aliquots von Nährbrühe mit der Starterkultur und das Inkubieren des vorstehenden Mediums bei 37°C/100 UpM für 16 bis 18 Stunden verwendet wird.
Verfahren wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die resultierende Kultur bei geeigneten UpM, vorzugsweise 6000 UpM, für eine Dauer von 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert wird.
Verfahren wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das resultierende Pellet durch Auflösen in PO₄ ^3–-Puffer 0,05 M, pH-Wert 6,8 gewaschen wird und durch Zentrifugieren des Pellets.
Verfahren wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das resultierende Pellet in 10 ml von PO₄ ^3–-Puffer, 0,05 M, pH-Wert 6,8, aufgelöst wird, um ein Inokulum für Farbreduktionsstudien zu erhalten.
Aerobisches Verfahren für die Reduktion von Farbe eines Zellstoff-Fabrikausflusses unter Verwendung des Inokulums des Bakteriumstamms mit der Zugangsnr. MTCC 5099, welches umfaßt: a) Einimpfen von geeigneten Aliquots des Zellstoff- und Papierfabrikausflusses mit dem wie in Anspruch 3 beanspruchten erhaltenen Zellbrei für Farbreduktionsstudien zusammen mit einem Kontrollbehälter, welche Ausflußprobe ohne den Zusatz eines Inokulums enthalten; b) Inkubieren der Behälter, wie in Schritt (a) hergestellt, bei 37°C/100 UpM für 48 Stunden; c) Entnehmen von Proben von den vorstehenden Behältern in 50 ml Aliquots und Bearbeiten derselben, um die Farbe und die Gesamtligninlevel festzustellen, d) Analysieren der Farbentfernungseffizienz des vorstehend genannten Bakteriums durch Vergleichen der Farblevel des mit dem wie in Anspruch 2 beanspruchten Bakterium behandelten Ausflusses mit dem Farblevel der Kontrollprobe nach 24- und 48-Stundenintervallen, e) Überprüfen der Lebensfähigkeit der vorstehend genannten Kultur in dem Ausfluß durch Kultivieren desselben in einem Nährstoffagarmedium und Berechnen der Kolonie bildenden Einheit (CFU)/ml.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei die Lebensfähigkeit der vorstehend genannten Kultur durch das Ausplattieren von Verdünnungen der dem Experiment entnommenen Probe, um zählbare Kolonien zu erhalten und die CFU/ml derselben nach 24- und 48-Stundenintervallen zu berechnen, überprüft wird.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei das aerobe biologische Entfärbungsverfahren durch das Verwenden des Bakteriumsstamms mit der Zugangsnr. MTCC 5099, welcher vom aktivierten Schlamm einer Zellstoff- und Papierfabrik Ausflußbehandlungsanlage (ETP) erhalten wird, definiert ist, welcher bis zu 55% Reduktion von Farbleveln des vorgegebenen Ausflusses ergibt.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei der Stamm eine Farbreduktion von 55% in 24 Stunden zeigt.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei der Stamm eine Farbreduktion von 60% in 48 Stunden zeigt.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei der Stamm nach der Farbreduktion lebensfähig ist.