DE60318224T2 - Epothilonderivate - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die Erfindung bezieht sich auf Antitumormittel. Besonders bezieht sich die Erfindung auf Analoga von Epothilon B, trans-12,13-Cyclopropylepothilon B als Antitumormittel.
  • Zusammenfassung
  • Die Erfindung ist gerichtet auf Analoga von Epothilon B trans-12,13-Cyclopropylepothilon B, die stark cytotoxisch wirksam sind gegen eine Varietät an Zelllinien unter Einschluss von Tumorzellen, die gegen Taxol® resistent sind. Zu Beispielen für Ausführungsformen der Erfindung gehört die in der 1 illustrierte Verbindung 12. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist auf die Verwendung solcher Verbindungen als cytotoxische Mittel gerichtet.
  • Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung der folgenden Formel I
    Figure 00010001
    oder ein Salz einer Verbindung der Formel I, worin eine Salz bildende Gruppe vorhanden ist.
  • Wird die Pluralform für Verbindungen, Salze und dergleichen verwendet, dann soll davon auch eine einzelne Verbindung, ein einzelnes Salz oder dergleichen darunter verstanden werden, nämlich eine als ein undefinierter Artikel oder als eine numerische Bedeutung ein oder eins.
  • Salze sind primär die pharmazeutisch akzeptablen Salze von Verbindungen der Formel I.
  • Solche Salze werden gebildet beispielsweise als Säureadditionssalze, vorzugsweise mit organischen oder anorganischen Säuren, aus Verbindungen der Formel I mit einem basischen Stickstoffatom, besonders die pharmazeutisch akzeptablen Salze. Zu geeigneten anorganischen Säuren gehören beispielsweise Halogenwasserstoffsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Geeignete organische Säuren sind beispielsweise Carbonsäure, Phosphonsäure, Sulfonsäure oder Sulfaminsäure, beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Octansäure, Decansäure, Dodecansäure, Glycolsäure, Milchsäure, 2-Hydroxybuttersäure, Gluconsäure, Glucosemonocarbonsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Suberinsäure, Azelainsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Glucarsäure, Galactarsäure, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Asparaginsäure, N-Methylglycin, Acetylaminoessigsäure, N-Acetylasparagin oder N-Acetylcystein, Pyruvasäure (Brenztraubensäure), Acetoessigsäure, Phosphoserin, 2- oder 3-Glycerophophorsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Methylmaleinsäure, Cyclohexancarbonsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, 1- oder 3-Hydroxynaphthyl-2-carbonsäure, 3,4,5-Trimethoxybenzoesäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, 4-Aminosalicylsäure, Phthalsäure, Phenylessigsäure, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Ethan-1,2-disulfonsäure, Benzolsulfonsäure, 2-Naphthalinsulfon säure, 1,5-Naphthalindisulfonsäure, N-Cyclohexylsulfaminsäure, N-Methyl-, N-Ethyl- oder N-Propylsulfaminsäure oder andere organische Protonensäuren, wie Ascorbinsäure.
  • Salze von Verbindungen der Formel I mit einer Salz bildenden Gruppe können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Säureadditionssalze von Verbindungen der Formel I lassen sich daher erhalten beispielsweise durch Behandlung mit einer Säure oder einem geeigneten Anionenaustauschreagenz.
  • Salze können gewöhnlich in freie Verbindungen umgewandelt werden, beispielsweise durch Behandlung mit geeigneten basischen Mitteln, beispielsweise mit Alkalimetallcarbonaten, Alkalimetallhydrogencarbonaten oder Alkalimetallhydroxiden, typisch mit Kaliumcarbonat oder Natriumhydroxid.
  • Zu Zwecken einer Isolierung oder Reinigung können auch pharmazeutisch nicht akzeptable Salze verwendet werden, wie beispielsweise Picrate oder Perchlorate. Nur die pharmazeutisch akzeptablen Salze oder die freien Verbindungen (falls sich die Gelegenheit ergibt in der Form pharmazeutischer Zubereitungen) werden für therapeutische Zwecke verwendet, so dass diese bevorzugt sind.
  • Im Hinblick auf die enge Verwandtschaft zwischen den neuen Verbindungen in freier Form und in der Form ihrer Salze, einschließlich der Salze, die als Zwischenprodukte verwendet werden können, beispielsweise zur Reinigung oder Identifizierung der neuen Verbindungen, ist hierin oben und im Folgenden irgendeine Bezugnahme auf die freien Verbindungen so zu verstehen, dass sie sich auch auf die entsprechenden Salze bezieht, falls geeignet und zweckdienlich.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Synthese irgendwelcher Verbindungen, wie sie oben beschrieben sind, oder von Zwischenprodukten hiervon, wie sie in der Beschreibung beschrieben sind, besonders ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln I, II, III, IV oder V, das gekennzeichnet ist
    durch in einer ersten Stufe eine Kondensation durch eine Veresterungsreaktion optional in Gegenwart eines Katalysators, einer Verbindung der Formel VI
    Figure 00020001
    worin X für CH2 steht und R für
    Figure 00020002
    steht und PG eine Schutzgruppe für eine Hydroxyfunktion ist,
    und in einer zweiten Stufe die Abspaltung der Schutzgruppe unter Erhalt eines Lactons der Formel I.
  • Die Bezeichnung Schutzgruppen für eine Hydroxygruppe, wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf Säure-labile Schutzgruppen für eine Hydroxygruppe, wobei solche Gruppen an sich bekannt sind. Es ist ein Charakteristikum von Schutzgruppen, dass sie sich mühelos, nämlich ohne unerwünschte Sekundärreaktionen, entfernen lassen, typisch durch Solvolyse, Reduktion, Photolyse oder auch eine Enzymaktivität, beispielsweise unter Bedingungen, die zu physiologischen Bedingungen analog sind, und dass sie nicht in den Endprodukten vorhanden sind. Der Fachmann weiß oder kann ohne weiteres erkennen, welche Schutzgruppen im Zusammenhang mit den oben und im Folgenden erwähnten Reaktionen geeignet sind.
  • Der Schutz von Hydroxygruppen durch Schutzgruppen, nämlich die Schutzgruppen selbst, und die Reaktionen zur Abspaltung solcher Gruppen, werden beispielsweise in Standardwerken beschrieben, wie von J. F. W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, London und New York 1973, von T. W. Greene in Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York 1981, in The Peptides, Band 3 (Herausgeber E. Gross und J. Meienhofer), Academic Press, London und New York 1981, in Methoden der organischen Chemie (Methods of organic chemistry), Houben Weyl, 4. Auflage, Band 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974, von H.-D. Jakubke und H. Jescheit in Aminosäuren, Peptide, Proteine (Amino acids, peptides, proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, und Basel, 1982, und von Jochen Lehmann in Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate (Chemistry of carbohydrates: monosaccharides and derivatives), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.
  • Bevorzugte Schutzgruppen sind Silylether, die Säure-labil sind, wie tert-Butyldimethylsilylether (TBS), Triethylsilylether (TES), Triisopropylsilylether (TIPS), Diethylisopropylsilylether (DEIPS), Isopropyldimethylsilylether (IPDMS) oder Thexyldimethylsilylether (TDS).
  • Kurze Beschreibung der Figuren, die Folgendes zeigt:
  • 1 die Strukturen selektierter natürlicher und synthetischer Epothilone. Graue Boxen bedeuten Verbindungen, die für dieses Studium synthetisiert worden sind.
  • 4 eine retrosynthetische Analyse von Analoga von trans-Cyclopropylepothilon B 12.
  • 5 die Konstruktion eines Aldehyds 32.
  • 6 die Konstruktion von Vinyliodiden 20e.
  • 7 die Synthese von Epothilonanaloga 12.
  • 8 eine Tabelle mit den Cytotoxizitätsdaten von Epothilonen 1, 2 und 12 und Paclitaxel gegen humane Ovarialkarzinomzellen 1A9 und β-Tubulin-mutante Zelllinien, die mit Paclitaxel oder Epothilon A ausgewählt sind.
  • 9 eine Tabelle mit Daten der Stärke der Tubulinpolymerisation und der Cytotoxizität von Epothilonen 1 bis 2 und 12 gegen humane epidermoide Krebszelllinien.
  • 10 eine Tabelle mit den Bindungsaffinitäten von Epothilonanaloga an die Taxoidbindestelle von Mikrotubuli.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist gerichtet auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutische Dosis einer Verbindung innerhalb irgendeiner der oben angegebenen Formeln I, II, III, IV oder V zur Behandlung einer proliferativen Krankheit bei einem Säuger, wobei der Säuger vorzugsweise ein Mensch ist.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Hierin wird die Konstruktion einer Reihe von Epoxidepothilonen und Cyclopropanepothilonen mit unterschiedlichen Ketten durch chemische Synthese und unter einer biologischen Evaluierung beschrieben. Der Aufbau der vorliegend fokussierten Epothilonbibliothek beruht auf der heutigen Kenntnis der Struktur-Aktivität-Beziehungen (SAR), speziell der Fakten, dass (1) Epothilon B (2) als stärker erachtet ist als Epothilon A (1), (2) ein Thiomethylersatz für die Methylgruppe am Thiazolrest die Stärke verbessert (K. C. Nicolaou et al., Angew. Chem. 1998, 100, Seiten 2120 bis 2153, Angew. Chem. Int. 1998, 37, Seiten 2014 bis 2045, K. C. Nicolaou et al., Tetrahedron 2002, 58, Seiten 6413 bis 6432, K. C. Nicolaou et al., Angew. Chem. 1998, 110, Seiten 89 bis 42 und Angew. Chem. Int 1998, 37, Seiten 84 bis 87), (3) ein Heterocyclusersatz, wie Pyridin (K. C. Nicolaou et al., Chem. Biol. 2000, 7, Seiten 593 bis 599) für den Thiazolring erforderlich ist für die saubere Position des Stickstoffs für eine biologische Aktivität, und (4) ein Cyclopropanring den Epoxidrest ersetzen kann, ohne einen Verlust an Aktivität (K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, Seiten 9313 bis 9323, K. C. Nicolaou et al., ChemBioChem 2001, 2, Seiten 69 bis 75, und J. A. Johnson et al., Org. Lett. 2000, 2, Seiten 1537 bis 1540). Aus diesen Betrachtungen ist Epothilon 12 (1) als ein primärer Kandidat für eine chemische Synthese und eine biologische Evaluation angesehen. Die biologische Evaluation dieser Verbindungen hat zur Identifikation der Thiomethylthiazolseitenkette als eine wünschenswerte pharmakophore Gruppe geführt, welche die biologische Aktivität der Epothilone bezüglich der Cytotoxizität und der Eigenschaften einer Tubulinpolymerisation verbessern. Die verbesserte Aktivität wird durch drei distinkte biologische Assays bestätigt, durch welche die Einflüsse der geprüften Verbindungen sowohl in Zellen als auch in vitro bestimmt werden.
  • Auslegung und chemische Synthese von Epothilonanaloga
  • Als ein initialer Beutezug ist beschlossen worden, die Verbesserung der Stärke, die dem Epothilongerüst verliehen ist durch die Methylthiogruppe im Vergleich zum Methylsubstituenten in der Serie von Epothilon B zu bestätigen. Hierzu wird das Methylthiothiazolepothilon B (3) durch eine Kupplung nach Stille von Stannan 16 (K. C. Nicolaou et al., Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, Seiten 665 bis 697) mit Vinyliodid 15 (K. C. Nicolaou et al., Chem. Eur. J. 2000, 6, Seiten 2783 bis 2800) synthetisiert (80%), wie dies in 3 gezeigt ist. Die dabei beobachtete hohe Stärke des Analogs 3 gegen eine Reihe an Tumorzelllinien (siehe Tabelle 1) ermutigte zur Durchführung des Aufbaus und der Synthese für eine ganze Familie an Methylthioanaloga und auch eine Reihe an neuen Pyridin-enthaltenden Epothilonen.
  • Die 4 zeigt in retrosynthetischem Format den Weg, der für die Konstruktion von Analoga von Cyclopropylepothilon B befolgt wird. Auf Basis der diesseitigen früher berichteten Strategie erfordert die adoptierte Frequenz eine Cyclopropanierungsreaktion nach Charette (K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, Seiten 9313 bis 9323; A. B. Charette et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, Seiten 11943 bis 11952), um früh in der Synthese der 12,13-Cyclopropylstelle eine Aldolreaktion entsprechend dem diesseitigen optimierten Verfahren (K. C. Nicolaou et al., Chem. Eur. J. 2000, 6, Seiten 2783 bis 2800) zu optimieren und die C6-C7-Bindung mit dessen zwei Stereozentren zu konstruieren, eine Kupplung nach Nozaki-Hiyama-Kishi (K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, Seiten 9313 bis 9323, K. Takai et al., Tetrahedron Lett. 1983, 24, Seiten 5281 bis 5284, H. Jin et al., J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, Seiten 5644 bis 5646) zur Einführung einer Seitenkette, und eine Makrolactonisierung nach Yamaguchi (J. Inanaga et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1979, 52, Seiten 1989 bis 1993, J. Mulzer et al., Synthesis 1992, Seiten 215 bis 228, und K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 1997, 199, Seiten 7974 bis 7991), um die makrocyclische Struktur zu komplettieren. Die Schlüsselbaublöcke 18 oder 69 und 19, und 20 sind somit als die Ausgangspunkte für diese Konstruktionen definiert worden. Eine Konstruktion der entsprechenden Analoga von Epothilon A soll in der gleichen Art und Weise durchgeführt werden, wie dies diesseits früher berichtet worden ist (K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 124, Seiten 9313 bis 9323).
  • Die 5 und 14 zeigen die Synthese des erforderlichen Aldehyds 32 oder 82 aus dem leicht verfügbaren Geraniol (18 oder 69). Hierdurch wird durch eine Cyclopropanierung von 18 nach Charette (Et2Zn-CH2I2 in Gegenwart eines chiralen Liganden 21) (A. B. Charette et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, Seiten 11943 bis 11952) ein Cyclopropylalkohol 22 in einer Ausbeute von 87% und 93% ee oder Cyclopropylalkohol 71 in einer Ausbeute von 80% und 95% ee erhalten. Ein Schutz der Hydroxygruppe in 22 oder 71 (NaH-BnBr) (zu den Abkürzungen der Reagenzien und Schutzgruppen wird auf die Legenden in den Reaktionsschemata verwiesen) und eine anschließende Ozonolyse (O3, NaBH4) der verbleibenden Doppelbindung führt zu einer Verbindung 23 oder 72 in einer Gesamtausbeute von 89% oder von 83%. Anschließend erfolgt eine Umwandlung eines Alkohols 23 oder 72 zum entsprechenden Iodid (Ausbeuten von 24,95% bzw. 73,91%) nach einer Mesylierung und anschließenden Umsetzung mit NaI. Anschließend erfolgt eine Alkylierung von (–)-Propionaldehyd-SAMP-Hydrazon (25) (K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, Seiten 7974 bis 7991, D. Enders, Asymmetric Synth. 1984, 3, Seiten 275 bis 339, D. Enders, M. Klatt, Synthesis 1996, Seiten 1403 bis 1418) mit einem Iodid 24 oder 73 unter dem Einfluss von LDA unter Erhalt einer Verbindung 26 oder 75 (Ausbeuten von 84% bzw. 87%), deren Spaltung (MeI, HClaq) zu einem Aldehyd 17 in einer Ausbeute von 86% oder 76 in einer Ausbeute von 91 % führt. Das Verhältnis der erhaltenen C-8 Epimeren wird durch eine 1H NMR Analyse der von einem Aldehyd 17 abgeleiteten MTPA Ester auf etwa 97:3 bestimmt (M. Tsuda, T. Endo, J. Kobayashi, J. Org. Chem. 2000, 65, Seiten 1349 bis 1352 und die darin zitierten Literaturhinweise). Die Aldolkondensation zwischen einem Keton 19 und einem Aldehyd 17 unter den vorher definierten Bedingungen [LDA (2,4 Äquiv.), mit einem Keton 19 (2,3 Äquiv.), bei –78 bis –40°C und 30 min, und dann mit einem Aldehyd 17 oder 76 bei –78°C und 5 min] (K. C. Nicolaou et al., Chem. Eur. J. 2000, 6, Seiten 2783 bis 2800) führt zu einem Aldolprodukt 27 oder 78, das in einer an Diastereomeren reinen Form isoliert wird (81%). Ein anschließender Schutz des sekundären Alkohols in 27 oder 78 als ein TBS Ether (TBSOTf, 2,6-Lutidin) gefolgt durch eine selektive Spaltung der primären TBS Gruppe (HF·py) ergibt dann einen Alkohol 28 in einer Gesamtausbeute von 88% oder einen Alkohol 79 in einer Gesamtausbeute von 86%. Sodann wird die Verbindung stufenweise zur Carbonsäure (DMP, dann NaClO2) oxidiert, die anschließend geschützt wird als der TMSE Ester 29 oder 80 (TMSE-OH, EDC, 4-DMAP), der in einer Gesamtausbeute von 75% oder 73% erhalten wird. Durch eine Hydrogenolyse des Benzylethers in 29 oder 80, gefolgt von einer Oxidation mit DMP ergibt sich ein Aldehyd 30 oder 82 (in Ausbeuten von 84% oder 87%), dessen Homologisierung (NaHMDS-MeOCH2PPh3Cl, dann PPTS) zum gewünschten höheren Aldehyd 32 oder 83 über einen Vinylether 31 (E:Z Verhältnis etwa 1:1) glatt unter einer Gesamtausbeute von 82% abläuft.
  • Die Seitenketten (20e, Schema 4) werden aus den entsprechenden Arylhalogeniden (33 (J. W. Ellingboe et al., J. Med. Chem. 1994, 37, Seiten 542 bis 550) synthetisiert, wie dies im Schema 4 gezeigt ist. Ein Schutz des 4-Hydroxymethyl-2-pyridylbromids 33 als ein Tritylether (TrCl, 4-DMAP, 100%) gefolgt von einer Sonogashira-Kupplung (A. Arcadi et al., Tetrahedron 1994, 50, Seiten 437 bis 452) des erhaltenen Arylbromids 34 mit Propin [Pd(PPh3)2Cl2-CuI, 96%] ergibt die Acetylenverbindung 35 als Vorläufer für Vinyliodid 20c (n-BuLi, dann (n-Bu3Sn)2, CuCN, MeOH, dann I2, 80%). Ein Austausch der Tritylgruppe gegen einer MOM Gruppe innerhalb von 35 [HCl(g), CHCl3, dann NaH, MOM-Cl, Gesamtausbeute 34%] (J.-F. Betzer et al., Tetrahedron Lett. 1997, 38, Seiten 2279 bis 2282) erlaubt einen Zugang zum Vinyliodid 20d (67%), indem das erhaltene Zwischenprodukt 36 den gleichen Bedingungen ausgesetzt wird, wie sie oben für die Umwandlung von 35 zu 20c beschrieben sind. Eine ähnliche Chemie wird auch angewandt zur Konstruktion des Vinyliodids 20e aus 37, wie dies in Schema 4 gezeigt ist.
  • Zwei kritische Bindungsbildungen und zwei begleitende Schutzgruppenabspaltungen führen zu einer Abtrennung der Schlüsselblöcke 32 (hergestellt in dieser Studie aus den Epothilon B Analoga), 40 (hergestellt wie oben für die Epothilon A Analoga beschrieben) (K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, Seiten 9313 bis 9323) und 20a bis 20g (für die Seitenketten) aus den das Ziel bildenden Epothilonanaloga. Die erste Operation ist eine Nozaki-Hiyama-Kishi-Kupplung (K. Takai et al., Tetrahedron Lett. 1983, 24, Seiten 5281 bis 5284, und H. Jin et al., J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, Seiten 5644 bis 5646) der Aldehyde 32 und 40 mit Vinyliodiden 20e. Diese Reaktion zur Bildung einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung verläuft im vorliegenden Fall bewundernswert (CrCl2, NiCl2, 4-t-BuPy, DMSO) und ergibt nach einer durch TRAF induzierten Bildung einer Carbonsäure die Kupplungsprodukte (41e) in den in den Schemata 5 angegebenen Ausbeuten (als etwa 1:1 Gemische von C-15 Diastereomeren). Jedes Gemisch an Hydroxysäurediastereomeren (41e) wird dann einer Yamaguchi-Makrocyclisierung unterzogen (2,4,6-Trichlorbenzoylchlorid, 4-DMAP) (J. Inanaga et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1979, 52, Seiten 1989 bis 1993, und J. Mulzer et al., Synthesis 1992, Seiten 215 bis 228), wodurch das gewünschte 15(S) Lacton in den angegebenen (nicht optimierten) Ausbeuten zusammen mit seinem 15(R) Epimer erhalten wird. Die Auftrennung der beiden Epimeren an dieser Stelle wird erleichtert durch ihre ziemlich drastisch unterschiedlichen Rf Werte auf Silicagel. Eine abschließende Schutzgruppenabspaltung von geschützten Derivaten entweder mit 20% TFA in CH2Cl2 (43e) ergibt das Epothilon 12 in den angegebenen (nicht optimierten) Ausbeuten (Schemata 5). Chromatographisch und spektroskopisch reine Verbindungen werden dann biologischen Evaluationen unterzogen, wie sie im Folgenden beschrieben sind.
  • Chemische Biologie
  • Die biologischen Aktivitäten der synthetisierten Epothilone werden evaluiert durch Cytotoxizitätsassays, durch in vitro Tubulinpolymerisationsassays und durch Tubulinbindeassays. Zuerst wird die Cytotoxizität evaluiert in einem Satz an Ovarialkarzinomzelllinien unter Einschluss einer Parentalzelllinie (IA9) und von drei Arzneimittel-resistenten Zelllinien, nämlich den Paclitaxel-resistenten Stämmen (P. Giannakakou et al, J. Biol. Chem. 1997, 272, Seiten 17118 bis 17125), IA9/PTX10 und IA9/PTX22 und des Epothilon-resistenten Stamms (P. Giannakakou et al., Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97, Seiten 2904 bis 2909) 1A9/A8. Diese resistenten Zelllinien beherbergen distinkte erhaltene β-Tubulinmutationen, die eine Wirkstoff-Tubulin-Wechselwirkung beeinflussen und zu einer geschädigten Taxanpolymerisation und Epothilon-getriebenen Tubulinpolymerisation führen. Die Ergebnisse dieser biologischen Untersuchungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst (P. Shekan et al., J. Natl. Cancer Inst. 1990, 82, Seiten 1107 bis 1112). Weitere Cytotoxizitätsassays und in vitro Tubulinpolymerisationsassays werden durchgeführt unter Verwendung eines Satzes humaner Epidermoidkrebszelllinien unter Einschluss einer Parentalzelllinie (KB-31) und einer infolge einer Pgp Überexpression Paclitaxel-resistenten Zelllinie (KB-8511). Die bei diesen Studien erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst (K. C. Nicolaou et al., Chem. Biol. 2000, 7, Seiten 593 bis 599 und T. Meyer et al., Int. J. Cancer 1989, 43, Seiten 851 bis 856).
  • Im Allgemeinen besteht eine gute Übereinstimmung zwischen der in vitro Tubulinpolymerisationsstärke und dem Cytotoxizitätsprofil der getesteten Verbindungen gegen die humanen Ovarialkarzinomzellen 1A9 und die humanen Epidermoidkarzinomzellen KB-31. In Übereinstimmung mit den ursprünglichen Beobachtungen mit den natürlich vorkommenden Epothilonen A und B scheint keines der hierin getesteten Analoga von Epothilon A oder Epothilon B ein gutes Substrat für die Arzneimitteleffluxpumpe P-Glycoprotein (Pgp) zu sein. Dies ist evident durch das Fehlen einer Kreuzresistenz eines jeden dieser Analoga infolge der Pgp exprimierenden Zelllinie KB-8511, im Gegensatz zu Paclitaxel – einem bekannten Pgp Substrat –, das 214mal weniger aktiv ist gegen KB-8511 Zellen (siehe 9 und 17). Zu bemerken ist auch, dass alle Analoga von Epothilon wirksamer gegen die β-Tubulinmutanten zu sein scheinen als gegen Epothilon A (1) und Epothilon B (2) (siehe 8 und 16, RR Werte). Dies ist stärker ausgeprägt bei der Verbindung 12, für welche die relativen Resistenzwerte (RR) im Bereich von 1,6 bis 9,3 liegen, gegen PTX10 Zellen (β270) und A8 Zellen (β274) im Vergleich zu den RR Werten von 9,4 bis 24,9 für Epo A (1) und für Epo B (2) (8). Weiter hat sich beim derzeitigen Studium und in Übereinstimmung mit früheren Berichten (K. C. Nicolaou et al., ChemBioChem 2001, 2, Seiten 69 bis 75, P. Giannakakou et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, Seiten 17118 bis 17125, und P. Giannakakou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97, Seiten 2904 bis 2909) gezeigt, dass die Paclitaxel-selektierte Mutante PTX22 (β324) nahezu ihre gesamte Sensitivität gegen die Epothilone und gegen alle Analoga von Epothilon behalten, die bei diesem Bericht getestet worden sind (RR Werte æ 3,3).
  • Es besteht eine allgemeine Übereinstimmung in der relativen Stärke der substituierten Analoga von Epothilon B gegen die humanen Ovarialkrebszellen 1A9 und die humanen Epidermoidalkrebszellen KB-31. Kollektiv sind die Ergebnisse dieser Cytotoxizitätsassays eine interessante Information zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung innerhalb der Familie der Epothilone. Zuerst ist zu bemerken, dass die Verbindungen 4 und 6, bei denen der C12-C13-Epoxidteil durch einen Cyclopropanring ersetzt ist, die stärksten Verbindungen unter allen hierin gezeigten Analoga von Epothilon B sind. Dies bestätigt, dass der C12-C13-Epoxidteil für eine biologische Aktivität nicht notwendig ist, was bereits früher bemerkt worden ist (K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9313 bis 9323, K. C. Nicolaou et al., ChemBioChem. 2001, 2, 69 bis 75 und J. A. Johnson et al., Org. Lett. 2000, 2, 1537 bis 1540). Die Verbindung 4 ist 6mal wirksamer als das Parentalepothilon B (2) gegenüber humanen Ovarialkarzinomzellen 1A9 (8), was weiter bestätigt, dass der Ersatz der Methylgruppe an der Thiazolseitenkette durch eine Thiomethylgruppe zu einer erhöhten Aktivität führt. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit früheren Daten über eine ähnliche Substitution im Epothilon B ohne einen Ersatz des C12 bis C13-Epoxids der Verbindung (3) (K. C. Nicolaou et al., Tetrahedron 2002, 58, 6413 bis 6432). Die letztgenannte Verbindung (3) ist etwa 2mal wirksamer als das Parentalepothilon B, während die Verbindung 4 6mal stärker ist als das Epothilon B. Dieses Ergebnis macht die Verbindung 4 zum stärksten Analogon von Epothilon B gegen die Zelllinie 1A9, die bis dato synthetisiert worden ist, und legt nahe, dass ein Ersatz des Epoxidteils durch einen Cyclopropanteil zusammen mit dem Ersatz des Methylsubstituenten am Thiazolteil durch eine Thiomethylgruppe synergistisch wirkt und somit zur beobachteten Verbesserung der biologischen Wirksamkeit führt. Interessanterweise führt ein Ersatz der Methylgruppe des Thiazolrings mit größeren Resten (Verbindung 12) zu einer niedrigeren biologischen Aktivität im Vergleich zu Epothilon B (8 und 9).
  • Zusätzlich zu den obigen biologischen Assays ist auch die relative Stärke jedes Epothilonanalogons durch den Fluoreszenztaxoidaustauschassay gemessen worden (J. M. Andreu, I. Barasoain, Biochemistry 2001, 40, 11975 bis 11984). Zweck dieser Experimente war ein Vergleich der Gleichgewichtskonstanten, mit denen Mikrotubuli an ihrer Taxanstelle die untersuchten Epothilonanaloga bindet. Die Inhibition der Bindung des gut charakterisierten Fluoreszenztaxoids Flutax-2 (A. A. Souto et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engt. 1995, 34, 2710 bis 2712, J. F. Diaz et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 26265 bis 26276 und M. Abal et al., Cell. Motil. Cytoskeleton 2001, 49, 1 bis 15) an Mikrotubuli durch jedes der Analoga von Epothilon wird bei 37°C gemessen (10). Die dabei erhaltenen Dissoziationskonstanten im Gleichgewicht, die in der Tabelle gezeigt sind, belegen, dass Epothilon A (1) die niedrigste Bindungsaffinität unter den getesteten Epothilonanaloga hat (Kd = 34 Å 4). Der bei diesem Assay gemessene stärkste Ligand ist die Verbindung 3 mit einem Kd Wert von 0,64 Å 0,24 nmol, gefolgt von der Verbindung 12 mit einem ähnlichen Kd Wert n von 1,8 nmol, wobei die Bindungsaffinitäten der getesteten Analoga ihre jeweiligen Aktivitäten sowohl in den Zellwachstumsinhibitionsassays als auch den in vitro Tubulinpolymerisationsassay spiegeln.
  • Aus allen drei hierin verwendeten biologischen Assays kann kollektiv eine Anzahl an Schlussfolgerungen in den Struktur-Aktivitäts-Beziehungen innerhalb der Familie der Epothilone gezogen werden. Als erstes ist zu bemerken, dass die Addition der C12-Methylgruppe keine Verbesserung der Aktivität in der trans-Cyclopropylreihe ergibt (Verbindungen 5 vs. 6, 7 vs. 8, 9 vs. 10), was im Gegensatz steht zum Ergebnis in der cis-Epoxidreihe, worin das Epothilon B (2) wenigstens 10mal wirksamer ist als das Epothilon A (1). Dies könnte eine Folge der unterschiedlichen Orientierung der C12-Methylgruppe bei den cis- und trans-Verbindungen oder der Gesamtdifferenzen in Konformation zwischen den cis- und trans-Verbindungen sein, obgleich die diesbezüglichen Details noch aufzuklären sind. Als zweites ist zu bemerken, dass die Einführung der 2-Thiomethylthiazolseitenkette die Aktivität im Vergleich zur natürlichen 2-Methylthiazolseitenkette verbessert (Verbindungen 2 vs. 3, 5 vs. 11 und 6 vs. 12). Dieser Effekt ist bereits für die Analoga von Epothilon C und Epothilon D beobachtet worden (K. C. Nicolaou et al., Angew. Chem. 1997, 109, 2181 bis 2187, und Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 2097 bis 2103, wozu auch hingewiesen wird auf S. C. Sinha et al., ChemBioChem 2001, 2, 656 bis 665). Drittens ist zu bemerken, dass der Ersatz einer Methylgruppe durch eine Thiomethylgruppe in der Pyridinseitenkettenreihe (Verbindungen 8 vs. 13) zu einer Reduktion der Stärke führt, was im Gegensatz zu den für die obigen Thiazolseitenketten erhaltenen Ergebnissen steht. Dieser Schluss beruht auf Zelltoxizitätsdaten und in vitro Tubulinpolymerisationsdaten, während beim Fluoreszenztaxoidaustauschassay der Ersatz der Methyl gruppe durch eine Thiomethylgruppe in der Pyridinseitenkette bezüglich der Bindungsaffinität different ist. Diese Diskrepanz kann einfach unterschiedlich in der Zellaufnahme und der Permeabilität der getesteten Verbindungen oder den Unterschieden in der Sensitivität der beiden Tubulinassays reflektieren. Trotz dieser Diskrepanz machen diese Daten aber klar, dass die Einführung einer Thiomethylgruppe an der Thiazolseitenkette eine günstigere Modifikation ist als die Einführung einer Thiomethylgruppe an der Pyridinseitenkette, was zurückgeführt werden kann auf unterschiedliche sterische Erfordernisse durch die beiden Seitenkettengerüste. In Übereinstimmung mit früher mit cis-Pyridinepothilonanaloga erhaltenen Daten (K. C. Nicolaou et al., Chem. Biol. 2000, 7, 593 bis 599) ist eine Verlagerung der Thiomethylgruppe der Pyridinseitenkette von der Position 5 (Verbindung 13) zur Position 6 (Verbindung 14) mit einem signifikanten Aktivitätsverlust verbunden. Viertens ist zu bemerken, dass gemischte Ergebnisse mit Verbindungen 7 vs. 9 und 8 vs. 10 erhalten werden, bei denen die 5-Methylpyridinseitenkette (Verbindungen 7 und 8) ersetzt ist durch die 5-Hydroxymethylpyridinseitenkette (Verbindungen 9 und 10). Diese Substitution scheint in den Cytotoxizitätsassays indifferent zu sein gegen die humanen Ovarialkarzinomzellen 1A9 (Tabelle 1), wo sehr ähnliche IC50 Werte für jedes Verbindungspaar erhalten werden, beispielsweise Werte von 0,6 und 0,7 nmol für die Verbindungen 7 und 9, und ein Wert von 1,7 nmol für die Verbindungen 8 und 10. Andererseits ist in den humanen Epidermoidkarzinomzellen KB-31 die Verbindung 10 2mal wirksamer als die ihr Gegenstück bildende Verbindung 8 mit IC50 Werten von 0,44 vs. 0,9 nmol. Aus den gegebenen kleinen Unterschieden in der Wachstumsrate der beiden humanen Krebszelllinien, die für die unterschiedlichen Ergebnisse verantwortlich sein könnten, konnte geschlossen werden, dass die Einführung der 5-Hydroxymethylpyridinseitenkette wahrscheinlich zu keinerlei Verbesserung der Aktivität führt, was wenigstens für die trans-12,13-Cyclopropylanaloga der Familie der Epothilone gelten sollte.
  • Aufgrund dieser Eigenschaften eignen sich die Verbindungen für die Behandlung proliferativer Krankheiten, besonders Tumorkrankheiten, unter Einschluss von Metastasen, beispielsweise solider Tumoren, wie Lungentumoren, Brusttumoren, Colorektaltumoren, Prostatatumoren, Melanomen, Brusttumoren, Pankreastumoren, Halstumoren, Blasentumoren, Neuroblasmen oder Halstumoren, aber auch zur Behandlung proliferativer Krankheiten von Blutzellen, wie Leukämie, und zur Behandlung anderer Krankheiten, die auf eine Behandlung mit Mikrotubulidepolymerisationsinhibitoren antworten, wie Psoriasis.
  • Eine Verbindung der Formel I kann allein oder in Kombination mit ein oder mehr anderen Therapeutika verabreicht werden, möglich als Kombinationstherapie in der Form fixer Kombinationen oder durch Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung mit ein oder mehr anderen Therapeutika, die gestaffelt oder voneinander unabhängig gegeben werden, oder durch eine kombinierte Verabreichung fixer Kombinationen mit ein oder mehr anderen Therapeutika. Eine Verbindung der Formel I kann neben oder zusätzlich auch verabreicht werden für eine Tumortherapie in Kombination mit einer Chemotherapie, Radiotherapie, Immuntherapie, chirurgischen Intervention oder einer Kombination hiervon. Eine Langzeittherapie ist genauso gut möglich wie eine adjuvante Therapie im Kontext mit sonstigen Behandlungsstrategien, wie dies oben beschrieben worden ist. Andere mögliche Behandlungen sind eine Therapie zur Aufrechterhaltung des Status des Patienten nach einer Tumorregression oder sogar eine chemopräventive Therapie, beispielsweise bei Risikopatienten.
  • Therapeutika für eine mögliche Kombination sind besonders ein oder mehr antiproliferative, zytostatische oder zytotoxische Verbindungen, beispielsweise ein oder mehr Chemotherapeutika, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die umfasst die klassischen Chemotherapeutika, Inhibitoren für eine Polyaminbiosynthese, Inhibitoren für Proteinkinase, besonders für Serin/Threonin Proteinkinase, wie Proteinkinase C, oder für Tyrosinproteinkinase, wie eine epidermalen Wachstumsfaktorrezeptorproteintyrosinkinase, eines Cytokins, eines negativen Wachstumsregulators, wie TGF-β oder IFN-β, eines Aromataseinhibitors und eines klassischen Zytostatikums.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind nicht nur für die – prophylaktische und vorzugsweise therapeutische – Behandlung von Menschen, sondern eignen sich auch für die Behandlung anderer warmblütiger Tiere, beispielsweise wirtschaftlich brauchbarer Tiere, beispielsweise von Nagern, wie Mäusen, Hasen oder Ratten, oder auch Meerschweinchen. Sie können auch verwendet werden als Bezugsstandard in den oben beschriebenen Testsystemen, um so einen Vergleich mit anderen Verbindungen zu ermöglichen.
  • Eine Verbindung der Formel I kann auch für diagnostische Zwecke angewandt werden, beispielsweise bei Tumoren, die von Wirten warmblütiger Tiere, besonders Menschen, erhalten und in Mäuse implantiert worden sind, um diese bezüglich Abnahmen im Wachstum nach einer Behandlung mit einer solchen Verbindung zu testen, und hierdurch ihre Sensitivität auf die jeweilige Verbindung zu untersuchen und somit die Detektion und Bestimmung möglicher therapeutischer Verfahren für neoplastische Krankheiten im ursprünglichen Wirt zu verbessern.
  • Stereoisomere Gemische, beispielsweise Gemische von Diastereoisomeren, können in ihre entsprechenden Isomere in an sich bekannter Weise mittels geeigneter Auftrennverfahren aufgetrennt werden. Die Auftrennung solcher diastereoisomerer Gemische in ihre einzelnen Diastereoisomeren kann beispielsweise erfolgen durch fraktionierte Kristallisation, Chromatographie, Lösemittelverteilung und ähnliche Verfahren. Die Auftrennung kann vorgenommen werden entweder an der Stufe einer der zu verwendenden Ausgangsverbindungen oder bei einer Verbindung der Formel I selbst. Enantiomere können durch die Bildung diastereoisomerer Salze aufgetrennt werden, beispielsweise durch eine Salzbildung mit einer Enantiomer-reinen chiralen Säure oder durch Chromatographie, beispielsweise durch HPLC, unter Verwendung chromatographischer Substrate mit chiralen Liganden. Normalerweise wird eine Enantiomertrennung an der Stufe eines Zwischenprodukts vorgenommen.
  • Pharmazeutische Präparate, Verfahren und Anwendungen
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Präparate, die eine Verbindung der Formel I als Wirkstoff enthalten und die besonders zur Behandlung der oben erwähnten Krankheiten verwendet werden können. Präparate für eine enterale Verabreichung, wie eine nasale, buccale, rektale oder besonders orale Verabreichung, und für eine parenterale Verabreichung, wie eine intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung, an warmblütige Tiere, besonders an Menschen, sind speziell bevorzugt. Diese Präparate können den Wirkstoff allein oder vorzugsweise zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Die Dosis des Wirkstoffs ist unter anderem abhängig von der zu behandelnden Krankheit und der jeweils zu behandelnden Spezies einschließlich dem jeweiligen Alter, Gewicht und individuellen Zustand, den individuellen pharmakokinetischen Daten und der Verabreichungsart.
  • Die präzise Dosis der Verbindungen der Formel I, die zur Inhibition proliferativer Krankheiten angewandt werden sollen, vorzugsweise von Tumoren, ist von mehreren Faktoren abhängig unter Einschluss des Wirts, der Natur und der Schwere des zu behandelnden Zustands, der Art der Verabreichung und der verwendeten besonderen Verbindung. Im Allgemeinen lässt sich jedoch eine zufriedenstellende Inhibition von Tumoren erreichen, wenn eine Verbindung der Formel I parenteral, beispielsweise intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, subkutan, intratumoral oder rektal oder auch enteral, beispielsweise oral, vorzugsweise intravenös oder oral, bevorzugter intravenös, als Einzeldosis von 1 bis 300 mg/kg Körpergewicht pro Zyklus (Zyklus = 3 bis 6 Wochen) oder für die meisten größeren Primaten als eine Einzeldosis von 50 bis 5000 mg pro Behandlungszyklus, verabreicht wird. Eine bevorzugte intravenöse Einzeldosis pro Behandlungszyklus von 3 bis 6 Wochen ist 1 bis 75 mg/kg Körpergewicht oder, für die meisten größeren Primaten, eine tägliche Dosis von 50 bis 1500 mg. Eine typische intravenöse Dosis beträgt 45 mg/kg einer einmaligen Verabreichung alle drei Wochen.
  • Gewöhnlich wird initial eine kleine Dosis verabreicht und die Dosis dann allmählich so lange erhöht, bis eine optimale Dosis für den zu behandelnden Wirt bestimmt ist. Die Obergrenze der Dosierung wird vorgegeben durch Nebeneffekte und kann durch Ausprobieren für den zu behandelnden Wirt bestimmt werden.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei einem Verfahren für die prophylaktische oder speziell die therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, ein Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen, besonders in der Form von Zusammensetzungen für die Behandlung von Tumoren, und ein Verfahren für die Behandlung der oben erwähnten Krankheiten, primär neoplastischer Krankheiten und speziell der oben erwähnten Krankheiten.
  • Weiter bezieht sich die Erfindung auf Verfahren und auf die Verwendung von Verbindungen der Formel I zur Herstellung pharmazeutischer Präparate, die Verbindungen der Formel I als Wirkkomponente (aktiven Bestandteil) enthalten.
  • Bevorzugt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die sich für eine Verabreichung an einen Warmblüter, besonders an einen Menschen oder an einen kommerziell brauchbaren Säuger eignet, der an einer Krankheit leidet, die responsiv ist auf die Inhibition einer Mikrotubulidepolymerisation, beispielsweise Psoriasis oder speziell eine neoplastische Krankheit, umfassend eine entsprechend wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes hiervon, wenn Salz-bildende Gruppen vorhanden sind, zusammen mit wenigstens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung für die prophylaktische oder speziell die therapeutische Behandlung neoplastischer oder sonstiger proliferativer Krankheiten bei einem warmblütigen Tier, speziell bei einem Menschen oder bei einem kommerziell brauchbaren Säuger, der einer solchen Behandlung bedarf und der speziell an einer solchen Krankheit leidet, umfassend eine neue Verbindung der Formel I oder ein akzeptables Säureadditionssalz, als Wirkstoff in einer Menge, die prophylaktisch oder speziell therapeutisch wirksam ist gegen die genannten Krankheiten, ist ähnlich bevorzugt.
  • Die pharmazeutischen Präparate enthalten etwa 0,000001% bis 95% Wirkstoff, wobei Einzeldosierungsformen einer Verabreichung vorzugsweise etwa 0,00001% bis 90% und multiple Dosisformen einer Verabreichung vorzugsweise etwa 0,0001% bis 0,5% Wirkstoff im Fall von Präparationen für eine parenterale Verabreichung, oder 1% bis 20% Wirkstoff im Fall von Präparationen für eine enterale Verabreichung enthalten. Einheitsdosierungsformen sind beispielsweise beschichtete oder unbeschichtete Tabletten, Ampullen, Phiolen, Suppositorien oder Kapseln. Weitere Dosierungsformen sind beispielsweise Salben, Cremes, Pasten, Schäume, Tinkturen, Lippenstifte, Tropfen, Sprays, Dispersionen und dergleichen. Beispiele sind Kapseln mit einem Wirkstoffgehalt von etwa 0,0002 g bis etwa 1,0 g.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparationen werden in an sich bekannter Weise hergestellt, beispielsweise mittels herkömmlicher Verfahren zur Vermischung, Granulation, Beschichtung, Auflösung oder Lyophilisation.
  • Die für eine parenterale Verabreichung brauchbaren Formulierungen sind primär wässrige Lösungen (oder beispielsweise physiologische Kochsalzlösungen, die erhältlich sind durch Verdünnung von Lösungen in Polyethylenglycol, wie Polyethylenglycol (PEG) 300 oder PEG 400) als Wirkstoff in einer wasserlöslichen Form, beispielsweise einem in Wasser löslichen Salz, oder injizierbare Suspensionen, die die Viskosität erhöhende Mittel enthalten, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran, und die geeignetenfalls auch Stabilisatoren enthalten. Der Wirkstoff kann erforderlichenfalls zusammen mit Exzipientien auch in der Form eines Lyophilisats vorliegen und kann vor einer parenteralen Verabreichung durch Zusatz geeigneter Lösemittel in Lösung gebracht werden.
  • Lösungen, wie sie beispielsweise für eine parenterale Verabreichung verwendet werden, können auch als Infusionslösungen angewandt werden.
  • Die Erfindung bezieht sich ähnlich auch auf ein Verfahren oder eine Methode für die Behandlung der oben erwähnten pathologischen Zustände, speziell einer Krankheit, die auf eine Inhibition einer Mikrotubulidepolymerisation antwortet, speziell auf eine entsprechende neoplastische Krankheit. Eine Verbindung der Formel I kann als solche oder in der Form pharmazeutischer Zusammensetzungen prophylaktisch oder therapeutisch, vorzugsweise in einer Menge, die gegen diese Krankheiten effektiv ist, an einen Warmblüter verabreicht werden, beispielsweise einen Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf, wobei die Verbindungen speziell in der Form pharmazeutischer Zusammensetzungen verwendet werden. Im Fall eines Individuums mit einem Körpergewicht von etwa 70 kg beträgt die zu verabreichende Dosis etwa 0,1 mg bis etwa 1 g, vorzugsweise etwa 0,5 mg bis etwa 200 mg, einer erfindungsgemäßen Verbindung. Eine Verabreichung erfolgt vorzugsweise beispielsweise alle ein bis vier Wochen, beispielsweise wöchentlich, alle zwei Wochen, alle drei Wochen oder alle vier Wochen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes hiervon, speziell einer Verbindung der Formel I, die als eine bevorzugte Verbindung bezeichnet ist, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes hiervon als solche(s) oder in Form einer pharmazeutischen Formulierung, die wenigstens einen pharmazeutisch ver wendbaren Träger enthält, für die therapeutische und auch prophylaktische Behandlung von ein oder mehr der obigen Krankheiten.
  • Weiter bezieht sich die Erfindung vor allem auf die Verwendung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes hiervon, speziell einer Verbindung der Formel I, die als eine bevorzugte Verbindung bezeichnet wird, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes hiervon, zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung für die therapeutische und auch die prophylaktische Behandlung von ein oder mehr der obigen Krankheiten.
  • Experimenteller Teil
  • Allgemeines
  • Alle Reaktionen werden unter Argonatmosphäre mit trockenen Lösemitteln unter wasserfreien Bedingungen durchgeführt, sofern nichts anderes gesagt ist. Wasserfreie Lösemittel werden erhalten, indem sie durch im Handel erhältliche aktivierte Aluminiumoxidsäulen geschickt werden. Alle Reagenzien werden mit höchster kommerzieller Qualität gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet. Die Reaktionen werden allgemein durch Dünnschichtchromatographie überwacht, die durchgeführt wird mit 0,25 mm Silicagelplatten von E. Merck (60F-254). Silicagel (60, Teilchengröße 0,040 bis 0,063 mm) von E. Merck wird auch zur Befüllung von Säulen für eine Blitzchromatographie verwendet. Abtrennungen durch präparative Dünnschichtchromatographie (PTLC) werden auf 0,25 mm, 0,50 mm oder 1 mm Silicagelplatten von E. Merck (60F-254) durchgeführt. Die Schmelzpunkte (Smp.) sind unkorrigiert und auf einer Kapillarschmelzpunktapparatur von Thomas-Hoover Unimelt aufgezeichnet. Die optischen Drehwerte sind auf einem Polarimeter 241 von Perkin-Elmer aufgezeichnet. Die NMR Spektren sind auf Instrumenten DRX-600, DRX-500, AMX-400 oder AC-250 von Bruker aufgezeichnet und unter Verwendung restlicher nicht deuterierter Lösemittel als eine innere Referenz kalibriert. Alle Markierungen von Kohlenstoffatomen, beispielsweise von C15, beziehen sich auf die Nummerierung von Epothilon A (1) (siehe 1). Die IR Spektren sind auf einem FT-IR-Spektrometer 1600 von Perkin-Elmer aufgezeichnet. Die Hochauflösungsmassenspektren sind auf einem Massenspektrometer PerSeptive Biosystems Voyager® IonSpec (MALDI-FTMS) oder auf einem Massenspektrometer API 100 von Perkin-Elmer (ESI) aufgezeichnet.
  • Synthese von Epothilon 3
  • Stille Kupplung von Vinyliodid 15 mit Stannan 16
  • Eine Lösung des Pd2(dba)3(CHCl3) (3,9 mg, 3,8 μmol), AsPH3 (4,6 mg, 15 μmol) und CuI (7,2 mg, 38 μmol) in DMF (entgast, 0,5 ml) wird bei 25°C zu einer Lösung von Iodid 15 (10 mg, 19 μmol) (K. C. Nicolaou et al., Chem. Eur. J. 2000, 6, 2783 bis 2800) und Stannan 16 (11 mg, 38 μmol) (K. C. Nicolaou et al., Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 665 bis 697) in DMF (entgast, 0,5 ml) gegeben, und die erhaltene Lösung wird 2 h gerührt. Das nach Zusatz von Wasser (10 ml) erhaltene Gemisch wird mit EtOAc (3 (10 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wird mit Wasser (30 ml) und Kochsalzlösung (30 ml) gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Der nach Verdampfung der flüssigen Bestandteile erhaltene Rückstand wird durch eine Blitzsäulenchromatographie (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 2:1 (1:1) gereinigt, wodurch Epothilon 3 als ein weißer Feststoff erhalten wird (7,2 mg, 72%). Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,29 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 1:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 53 (c 0,51, CH2Cl2), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 3472 (br), 2967, 2920, 1731, 1684, 1461, 1420, 1378, 1249, 1143, 1032, 973, 879, 732 und 667 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 562,2267 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C27H41NO6S2Na zufolge bei 562,2267.
  • Konstruktion des Aldehyds 32
  • Alkohol 23
  • Eine Lösung des Cyclopropylalkohols 22 (4,08 g, 24 mmol) (AB. Charette et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943 bis 11952) in DMF (40 ml) wird portionsweise unter Rührung bei 0°C mit Natriumhydrid (1,45 g, 36 mmol, 60% in Mineralöl) versetzt. Nach einer Rührung für 0,5 h bei 25°C wird das Gemisch auf 0°C abgekühlt, während 2 min mit Benzylbromid (4,3 ml, 36 mmol) versetzt und weitere 12 h bei 25°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit NH4Cl (gesättigt, 50 ml) abgeschreckt und mit EtOAc (3 (50 ml) extrahiert, und der vereinigte Extrakt wird mit Kochsalzlösung (2 (100 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und eingedampft. Der Rückstand wird in CH2Cl2:MeOH 4:1 (60 ml) gelöst, und die Lösung wird 21 min bei –78°C ozonisiert (100 l/h, etwa 5 g O3/h). (Beachte: längere Reaktionszeiten müssen zur Verhinderung einer Oxidation des Benzylethers zum entsprechenden Benzoat vermieden werden.) Der Überschuss an Ozon wird durch Spülung mit N2 während 1 min entfernt, worauf zuerst in kleinen Anteilen NaBH4 (2,75 g, 73 mmol) (Achtung! Exotherme Reaktion!) und dann Methanol (20 ml) zugegeben werden. Das Gemisch wird während 1 h auf 25°C erwärmt, und die Reaktion wird hierauf durch Zugabe von NH4Cl (gesättigt, 20 ml) abgeschreckt. Das Gemisch wird mit CH2Cl2 (2 (50 ml) extrahiert, worauf der vereinigte Extrakt mit Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und eingedampft wird. Der Rückstand wird durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 5:2) gereinigt, wodurch 23 als ein gelbes Öl (5,07 g, 89%) erhalten wird. Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,20 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 3:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 7,5 (c 1,76, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 3390 (br), 2933, 2859, 1452, 1070, 739 und 698 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 257,1519 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C15H22O2Na zufolge bei 257,1512.
  • Iodid 24
  • Ein Lösung des Cyclopropylalkohols 23 (10,08 g, 43,0 mmol) in trockenem CH2Cl2 (100 ml) wird bei 0°C tropfenweise zuerst mit Methansulfonylchlorid (4,2 ml, 54 mmol) und dann mit Triethylamin (9,0 ml, 65 mmol) versetzt. Hierdurch beginnt sich unmittelbar ein weißer Niederschlag zu bilden. Das Gemisch wird 1 h bei 25°C gerührt und dann mit NH4Cl (gesättigt, 50 ml) und Wasser (50 ml) versetzt, worauf die Phasen getrennt werden. Die wässrige Phase wird mit EtOAc (100 ml) extrahiert, und die vereinigte organische Phase wird mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und eingedampft. Der Rückstand wird in trockenem Aceton (200 ml) gelöst und die Lösung mit Natriumiodid (19,3 g, 129 mmol) versetzt. Die anfänglich nahezu klare Lösung wird 40 min unter Rückfluss gehalten, wobei sich während dieser Zeit ein weißer Niederschlag bildet. Nach Zusatz von Wasser (100 ml) wird das Gemisch mit Ether (500 + 250 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird getrocknet und eingedampft, und der Rückstand wird durch Blitzchromatographie gereinigt (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 5:1), wodurch 24 als ein farblo ses Öl (14,16 g, 95%) erhalten wird. Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,66 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 5:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 16 (c 2,05, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 2916, 2848, 1453, 1217, 1098, 1073, 735 und 697 cm–1, der ESI-MS Wert m/z beträgt 367 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C15H21IONa zufolge bei 367.
  • Hydrazon 26
  • Eine Lösung von LDA wird hergestellt durch Zusatz von n-BuLi (13,1 ml, 21,0 mmol, 1,6 mol in Hexanen) zu Diisopropylamin (2,94 ml, 21,0 mmol) in THF (10 ml) bei –78°C, worauf die Lösung auf 0°C erwärmt und 10 min gerührt wird. Sodann wird diese LDA Lösung mit Propionaldehyd-SAMP-Hydrazon 25 (3,32 g, 19,5 mmol) versetzt (K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 1997, 199, 7974-7991, D. Enders, Asymmetric Synth. 1984, 3, 275 bis 339 und D. Enders et al., Synthesis 1996, 1403 bis 1418), und das Gemisch wird 6 h bei 0°C gerührt, wobei sich während dieser Zeit ein weißer Niederschlag bildet. Das Gemisch wird auf –78°C gekühlt (MeOH/N2(I) Bad), worauf während 0,5 h eine Lösung von Iodid 24 (5,16 g, 15,0 mmol) in THF (20 ml) zugegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird während 14 h auf –10°C erwärmt und dann mit NH4Cl (gesättigt, 10 ml) abgeschreckt. Das Gemisch wird mit EtOAc (100 ml + 2 (50 ml) extrahiert, und der vereinigte Extrakt wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, und der Rückstand wird durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 6:1 (4:1)) gereinigt, wodurch Hydrazon 26 als ein gelbes Öl (4,88 g, 84%) erhalten wird. Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,38 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 5:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 61 (c 1,45, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 2926, 1454, 1097, 736 und 697 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 387,3008 (MH+), und liegt einer Berechnung für C24H39N2O2 zufolge bei 387,3006.
  • Aldehyd 17
  • Eine Lösung des Hydrazons 26 (3,82 g, 9,9 mmol) in Iodmethan (10 ml) wird während 3 h auf 60°C (Rückflusskondensator) erhitzt und dann auf 25°C abgekühlt. Der Überschuss an Iodmethan wird verdampft, und die Spuren hiervon werden unter einem Ölpumpenvakuum entfernt. Der zurückbleibende gelbe Sirup wird kräftig mit 3 N HCl (190 ml) und Pentan (190 ml) während 3 h bei 25°C gerührt, worauf die Phasen getrennt werden und die wässrige Phase mit Pentan (100 ml) extrahiert wird. Die vereinigte organische Phase wird getrocknet (Na2SO4, NaHCO3) und eingedampft, wodurch der Aldehyd 17 als ein gelbes Öl (2,38 g, 88%) erhalten wird. Der [α]D Wert beträgt 22 + 2 (c 1,3, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 2931, 2856, 1724, 1454, 1095, 1074, 736 und 698 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 297,1830 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C18H26O2Na zufolge bei 297,1825.
  • Infolge der konfigurationalen Labilität am C8 (Epothilonnummerierung) soll der Aldehyd unmittelbar bei der nächsten Stufe verwendet werden. Der dr Wert am C8 wird wie folgt ermittelt: Eine Probe von 17 wird während 10 min mit überschüssigem NaBH4 in Methanol behandelt. Die Reaktion wird mit NH4Cl (gesättigt) abgeschreckt, worauf das Gemisch mit EtOAc extrahiert wird und der Extrakt getrocknet (Na2SO4) und eingedampft wird. Der Rückstand wird 3 h mit (R)-(–)-MTPACl (2 bis 3 Äquiv.), überschüssigem Triethylamin und 4-DMAP in CH2Cl2 behandelt. Eine anschließende Reinigung durch präparative TLC ergibt eine Probe des (S)-MTPA Esters, die bei der 1H NMR Analyse einen dr Wert von 97:3 zeigt, wobei die korrekte absolute Stereochemie am C8 das überwiegende Isomer ist (M. Tsuda et al., J. Org. Chem. 2000, 65, 1349 bis 1352). Analoge Ergebnisse werden unter Verwendung von (S)-(+)-MTPACl erhalten.
  • Aldolprodukt 27
  • Eine Lösung des IDA wird hergestellt durch Zusatz von n-BuLi (7,5 ml, 12 mmol, 1,6 mol in Hexanen) zu Diisopropylamin (1,68 ml, 12 mmol) in THF (12 ml) bei –78°C, worauf die Lösung kurz auf 0°C erwärmt und schließlich wieder auf –78°C abgekühlt wird. Sodann wird während 2 min tropfenweise eine Lösung des Ketons 19 (4,63 g, 11,5 mmol) (K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 1997, 199, 7974 bis 7991) in THF (12 ml) zugegeben, worauf das Gemisch zuerst 1 h bei –78°C und dann während 0,5 h bei –40°C gerührt wird. Nach erneuter Abkühlung auf –78°C wird über eine Kanüle während 1 min eine Lösung des Aldehyds 17 (1,37 g, 5,0 mmol) in THF (25 ml), das auf –78°C vorgekühlt ist, zugesetzt, wobei darauf zu achten ist, dass während des Transfers für eine minimale Erwärmung gesorgt ist. Das Gemisch wird 5 min gerührt, und die Reaktion wird dann durch rasche Injektion einer Lösung von AcOH (1,4 ml) in THF (4,2 ml) abgeschreckt. Nach 5 min bei –78°C wird das Gemisch auf 25°C erwärmt und zwischen NH4Cl (gesättigt, 50 ml) und Ether (50 ml) verteilt. Die wässrige Phase wird mit Ether (2 (50 ml) extrahiert, der vereinigte Extrakt wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, und der Rückstand wird durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Hexane:Ether 20:1 (6:1) gereinigt, wodurch das Keton 19 (1,71 g, 4,25 mmol) und dann das Aldolprodukt 27 in einer an Diastereomeren reinen Form (2,73 g, 81%) erhalten wird. Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,34 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 5:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 40 (c 1,0, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 3502 (br), 2954, 2928, 2856, 1681, 1472, 1255, 1098, 836 und 776 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 699,4796 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C39H72O5Si2Na zufolge bei 699,4816.
  • Alkohol 28
  • Eine Lösung des Aldolprodukts 27 (2,71 g, 4,0 mmol) und 2,6-Lutidin (1,40 ml, 12 mmol) in CH2Cl2 (25 ml) wird auf –20°C gekühlt und dann tropfenweise mit TBSOTf (1,84 ml, 8,0 mmol) versetzt. Das Gemisch wird 1 h bei –20°C gerührt, und die Reaktion wird dann durch Zusatz von NH4Cl (gesättigt, 25 ml) abgeschreckt. Das Gemisch wird auf 25°C erwärmt, worauf die Phasen getrennt werden und die wässrige Phase mit CH2Cl2 (25 ml) und Ether (25 ml) extrahiert wird. Die vereinigte organische Phase wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, und der Rückstand wird durch einen Siliciumdioxidpfropfen filtriert, wobei eine Elution mit Hexan:Ether 10:1 vorgenommen wird. Das Filtrat wird eingedampft, und der erhaltene rohe Silylether (3,14 g, 4,0 mmol, 99%) wird in THF (40 ml) gelöst. Diese Lösung wird mit einer kalten (0°C) Lösung eines HF·Pyridinkomplexes (6,4 ml) und Pyridin (18 ml) in THF (32 ml) bei 0°C versetzt, wobei diese Lösung hergestellt wird durch langsame Zugabe des HF·Pyridinkomplexes zu einer Lösung von Pyridin in THF bei 0°C. Dabei ist zu beachten, dass das HF·Pyridin hoch korrosiv ist. Die Zugabe von HF-Pyridin zur THF Lösung des Pyridins ist hoch exotherm und muss unter Rührung und Kühlung in einem Eisbad vorgenommen werden, um ein Spritzen zu vermeiden, worauf die erhaltene Lösung 4 h bei 25°C gerührt wird. Das Gemisch wird mit EtOAc (100 ml) verdünnt, in ein Eisbad gegeben und durch vorsichtige Zugabe von NaHCO3 (gesättigt, 100 ml) und möglichst viel an festem NaHCO3 abgeschreckt, um eine vollständige Neutralisation sicherzustellen (Achtung! Schäumung!). Das Gemisch wird mit EtOAc (3 (100 ml) extrahiert, und der vereinigte Extrakt wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, worauf der Rückstand durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 5:1) gereinigt wird und die Verbindung 28 als ein farbloses Öl (2,40 g, 89%) erhalten wird. Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,39 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 5:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 26 (c 1,1, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 3458 (br), 2929, 2856, 1693, 1472, 1462, 1255, 1093, 986, 836 und 775 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 699,4807 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C39H72O5Si2Na zufolge bei 699,4816.
  • Ester 29
  • Der Alkohol 28 (2,40 g, 3,5 mmol), Periodinan nach Dess-Martin (3,75 g, 8,8 mmol), NaHCO3 (0,74 g, 8,8 mmol) und Wasser (76 μl, 4,2 mmol) werden in CH2Cl2 (80 ml) vermischt, und die erhaltene Suspension wird 1 h gerührt. Das Gemisch wird mit Ether (200 ml), Wasser (100 ml) und NaHCO3 (gesättigt, 100 ml) verdünnt und dann filtriert. Die Phasen werden getrennt, die wässrige Phase wird mit Ether (2 (100 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, und der Rückstand wird durch einen Siliciumdioxidpfropfen filtriert, wobei eine Elution mit Hexanen:EtOAC 6:1 erfolgt. Das Filtrat wird eingedampft, und der erhaltene rohe Aldehyd (2,15 g, 3,2 mmol, 90%) wird in einem Gemisch von THF (80 ml), t-BuOH (145 ml) und 2-Methyl-2-buten (25 ml) gelöst. Diese Lösung wird mit einer Lösung von NaH2PO4 (0,95 g, 6,7 mmol) und mit NaClO2 (1,14 g, 10 mmol) in Wasser (31 ml) versetzt, und das erhaltene Gemisch wird kräftig während 1 h gerührt. Die flüchtigen Bestandteile werden durch Verdampfung entfernt, und der Rückstand wird zwischen EtOAc (100 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) verteilt. Die Phasen werden getrennt, und die wässrige Phase wird mit EtOAc (3 (100 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, worauf der Rückstand in DMF (5 ml) gelöst und zur Entfernung von Spuren an t-BuOH erneut eingedampft wird. Die so erhaltene rohe Säure (2,4 g, etwa 3,2 mmol, > 100%) wird erneut in DMF (10 ml) gelöst, worauf diese Lösung mit 2-(Trimethylsilyl)ethanol (1,83 ml, 12,7 mmol), EDC (0,92 g, 4,8 mmol) und 4-DMAP (40 mg, 0,33 mmol) versetzt wird. Die erhaltene Suspension wird 14 h gerührt, worauf eine klare Lösung erhalten wird. Diese Lösung wird mit Wasser (10 ml) versetzt, und das Gemisch wird mit Ether (3 (50 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird mit einem Gemisch von Wasser und Kochsalzlösung (100 + 100 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und eingedampft. Der Rückstand wird durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 10:1) gereinigt, wodurch der Ester 29 als ein viskoses fahlgelbes Öl (2,08 g, 74%) erhalten wird. Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,57 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 10:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 33 (c 1,2, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 2954, 2930, 2856, 1735, 1695, 1472, 1385, 1252, 1090, 988, 836 und 776 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 813,5315 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C44H82O6Si3Na zufolge bei 813,5311.
  • Aldehyd 30
  • Eine Lösung des Benzylethers 29 (2,08 g, 2,63 mmol) in EtOH:EtOAc 1:1 (50 ml) wird zu 20%igem Pd(OH)2 auf Kohle (2,1 g, 60% Feuchtigkeit) gegeben, und das Gemisch wird 1 h hydriert. Sodann wird der Katalysator durch Celite filtriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand zur Entfernung von Spuren an EtOH mit Benzol gemeinsam verdampft. Der erhaltene rohe Alkohol (1,89 g, etwa 2,6 mmol, > 100%), wird in CH2Cl2 (60 ml) gelöst, und diese Lösung wird mit Periodinan nach Dess-Martin (2,76 g, 6,5 mmol), NaHCO3 (0,55 g, 6,5 mmol) und Wasser (56 μl, 3,1 mmol) versetzt, worauf die erhaltene Suspension 1 h gerührt wird. Das Gemisch wird mit Ether (150 ml), Wasser (75 ml) und NaHCO3 (gesättigt, 75 ml) verdünnt und dann filtriert. Die Phasen werden getrennt, und die wässrige Phase wird mit Ether (2 (75 ml) extrahiert. Der Extrakt wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, und der Rückstand wird durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 15:1) gereinigt, wodurch der Aldehyd 30 als ein viskoses Öl (1,55 g, 84%) erhalten wird. Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,24 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 15:1), der [α]D, Wert beträgt 22 bis 47 (c 1,3, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 2954, 2856, 1734, 1703, 1251, 1173, 1084, 988, 837 und 776 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 721,4671 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C37H74O6Si3Na zufolge bei 721,4685.
  • Enolether 31
  • Eine Suspension von MeOCH2PPh3Cl (3,09 g, 9,0 mmol) in THF (20 ml) wird bei 0°C tropfenweise mit NaHMDS (8,5 ml, 8,5 mmol, 1 mol in THF) versetzt, wodurch sich eine rote Farbe entwickelt. Das Gemisch wird 0,5 h bei 0°C gerührt und dann auf –40°C gekühlt. Sodann wird eine Lösung des Aldehyds 30 (2,12 g, 3,0 mmol) in THF (7 ml) zugesetzt, und das Gemisch während 2 h auf –10°C erwärmt. Die Reaktion wird mit NH4Cl (gesättigt, 15 ml) abgeschreckt, die Phasen werden getrennt, und die wässrige Phase wird mit EtOAc (2 (75 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, und der Rückstand wird durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 30:1) gereinigt, wodurch der Enolether 31 als ein farbloses viskoses Öl erhalten wird (1,85 g, 84%, Olefin cis:trans etwa 1:1 durch 1H NMR). Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,23 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 30:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 36 (c 1,2, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 2954, 2930, 2856, 1735, 1695, 1251, 1171, 1105, 988, 836 und 776 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 749,4996 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C39H78O6Si3Na zufolge bei 749,4998.
  • Aldehyd 32
  • Eine Lösung des Enolethers 31 (847 mg, 1,16 mmol) in einem 9:1 Gemisch von Dioxan und Wasser (12 ml) wird mit Pyridinium-para-toluolsulfonat (2,34 g, 9,31 mmol) versetzt, und das Gemisch wird so lange bei 70°C gerührt, bis eine TLC die Beendigung der Reaktion (6 bis 10 h) zeigt. Sodann wird die Reaktion mit NaHCO3 (gesättigt, 15 ml) abgeschreckt und das Gemisch mit EtOAc (3 (50 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, und der Rückstand wird durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 15:1) gereinigt, wodurch der Aldehyd 32 als ein farbloses viskoses Öl erhalten wird (681 mg, 82%). Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,29 (Silici umdioxid, Hexane:EtOAc 15:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 34 (c 1,0, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 2954, 2856, 1731, 1695, 1251, 1086, 988, 836 und 776 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 735,4823 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C38H76O6Si3Na zufolge bei 735,4842.
  • Konstruktion von Vinyliodiden 20e
  • Sonogashira-Kupplung von Arylbromiden (38) mit Propin (allgemeines Verfahren).
  • Eine kurz deoxygenierte (Einleitung von Ar) Lösung des Arylbromids 38 (3,5 mmol) in DMF (3 ml) und Diisopropylamin (2,5 ml) wird unter Argon mit Pd(PPH3)2Cl2 (25 mg, 36 μmol) und CuI (13 mg, 70 μmol) versetzt, worauf die Inertatmosphäre durch Propin (1 atm, Ballon) ersetzt wird. Das Gemisch wird 3 h bei 25°C gerührt. Während dieser Zeit wird ein Niederschlag gebildet, wobei sich das Reaktionsgemisch in dunkelbraun verändert. Nach Zusatz von Wasser (15 ml) wird das Gemisch mit EtOAc extrahiert, worauf der vereinigte Extrakt getrocknet (Na2SO4) und eingedampft wird. Durch anschließende Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Gemische von Hexan:EtOAc) wird das reine 1-Arylpropin erhalten.
  • Sonogashira Kupplungsprodukt von 38
  • Braunes Öl (97%); der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,21 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 5:1), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 2908, 2227, 1567, 1531, 1461, 1431, 1361, 1108, 1008 und 832 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 164,0527 (MH+), und liegt einer Berechnung für C9H10NS zufolge bei 164,0528.
  • Hydrostannylierungsiodierung (allgemeines Verfahren)
  • Dies ist eine Anpassung des früher berichteten Verfahrens (J.-F. Setzer et al., Tetrahedron Lett. 1997, 38, 2279 bis 2282).
  • Eine Lösung von Hexabutyldizinn (10,1 ml, 20 mmol) in trockenem THF (40 ml) wird bei –78°C mit n-BuLi (12,9 ml, 20 mmol, 1,55 mol in Hexanen) versetzt und die erhaltene klare Lösung wird 30 min bei –40°C gerührt. Sodann wird diese Lösung mit einer Kanüle in eine Suspension von CuCN (0,90 g, 10 mmol) in THF (2 ml) bei –78°C übertragen. Die dabei gebildete klare gelbe Lösung wird 5 min bei –40°C gerührt und dann wiederum auf –78°C abgekühlt. Die nach Zusatz von trockenem Methanol (23 ml, 0,57 mol) erhaltene rote Lösung wird 15 min bei –40°C gerührt, worauf eine Lösung des Arylpropins (5,0 mmol) in THF (5 ml) zugesetzt wird. Die erhaltene orangerote Lösung wird über Nacht bei –10°C gerührt (es fällt eine gewisse Menge an Cu und/oder Cu2+ Salzen aus), wobei dann nach Kühlung auf –20°C ein Zusatz von Methanol (10 ml) erfolgt. Nach 15 min bei –20°C wird Wasser (10 ml) zugesetzt und dieses Gemisch unter Erwärmung auf 25°C weitere 15 min gerührt. Das Gemisch wird mit Ether extrahiert, und die organische Phase wird mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und eingedampft. Das nach einer Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Gemische von Hexanen:EtOAc) als Zwischenprodukt erhaltene Vinylstannan wird in CH2Cl2 (5 ml) gelöst. Sodann wird diese Lösung bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung von Iod (1,05 Äquiv.) in CH2Cl2 (40 ml pro g I2) versetzt. Nach Zugabe der letzten wenigen Tropfen bleibt die Farbe von I2 bestehen, worauf die Reaktion weitere 5 min bei 0°C fortgesetzt wird. Das Lösemittel wird verdampft, und der Rückstand in Ether gelöst. Sodann erfolgt ein Zusatz von KF (1 mol Lö sung in Wasser, 3 Äquiv.) und Na2S2O3 (gesättigt, 10 ml pro mmol Substrat), und das Gemisch wird 15 min bei 25°C gerührt, wonach sich ein weißer Niederschlag gebildet hat. Das Gemisch wird durch Celite filtriert, und die organische Phase wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft. Eine anschließende Reinigung des Rückstands durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Gemische von Hexanen:EtOAc) ergibt das gewünschte Vinyliodid.
  • Vinyliodid 20e
  • Das als Zwischenprodukt erhaltene Vinylstannan wird mühelos Protodestannyliert, so dass eine Blitzchromatographie dieses Zwischenprodukts unter Verwendung von Hexanen:EtOAc:Et3N 50:1:1 als Elutionsmittel durchgeführt werden muss, worauf das so erhaltene Vinylstannan andere Butylzinnverbindungen enthält. Nach dem allgemeinen Verfahren wird das Gemisch mit so viel I2 behandelt, dass die braune Farbe am Ende der Zugabe (etwa 2 Äquiv. an I2) bestehen bleibt. Nach einer Blitzchromatographie (Hexane:EtOAc 50:1) wird das Vinyliodid 20e als ein gelbes Öl (74%) erhalten. Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,41 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 50:1), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 3102, 2923, 1620, 1423, 1300, 1065, 1035, 964, 863, 723 und 562 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 297,9215 (MH+), und liegt einer Berechnung für C7H9INS2 zufolge bei 297,9216.
  • Synthese von Epothilonanaloga 8-144
  • Nozaki-Hiyama-Kishi-Kupplung von Aldehyden (34, 40) mit Vinylstannanen (20a–g) (allgemeines Verfahren)
  • Eine kurz durch Vakuum entgaste Lösung des Aldehyds 32 (107 mg, 0,15 mmol), des entsprechenden Vinyliodids 20 (0,45 mmol) und von 4-tert-Butylpyridin (665 μl, 4,5 mmol) in DMSO (3 ml) wird mit wasserfreiem CrCl2 (184 mg, 1,5 mmol) und wasserfreiem NiCl2 (4 mg, 0,03 mmol) versetzt. Das Gemisch wird 3 h bei 25°C gerührt, worauf eine weitere Menge an Vinyliodid (0,45 mmol) zugegeben und das Ganze weitere 3 h gerührt wird. All dies wird einmal wiederholt, worauf über Nacht weiter gerührt wird. Sodann wird die Reaktion mit Wasser (5 ml) abgeschreckt, mit Pyridin (1 ml) versetzt, um eine Extraktion von Cr Produktkomplexen in die Wasserphase zu vermeiden, und das Gemisch mit EtOAc (3 (25 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird mit Kochsalzlösung (2 (100 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und eingedampft. Eine anschießende Chromatographie (Siliciumdioxid, Gemische von Hexanen:EtOAc) ergibt das Kupplungsprodukt, das in den meisten Fällen nicht von überschüssigem 4-tert-Butylpyridin getrennt werden kann.
  • Produkt von 20e und 32
  • Gelbes Glas (78%, etwa 1:1 Gemisch von C15 Epimeren). Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,40 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 5:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 28 (c 2,0, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 3416 (br), 2929, 2856, 1732, 1694, 1472, 1251, 1037, 988, 836 und 776 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 906,5021 (MH+), und liegt einer Berechnung für C45H85NO6S2Si3Na zufolge bei 906,5018.
  • Schutzgruppenentfernung von TRAF (allgemeines Verfahren)
  • Das Produktgemisch der Nozaki-Hiyama-Kishi-Kupplung wird in THF (1,5 ml) gelöst und bei 0°C mit TRAF (1 mol in THF, 0,30 ml, 0,30 mmol) versetzt. Nach 1 h bei 0°C wird eine weitere Portion an TRAF (0,30 ml, 0,30 mmol) zugegeben, und das Gemisch 1 h bei 25°C gerührt. Sodann wird die Reaktion mit NH4Cl (gesättigt, 5 ml) abgeschreckt und das Gemisch mit EtOAc (4 (20 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird getrocknet (Na2SO4) und eingedampft, und der Rückstand wird durch Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Gemische von Hexanen:EtOAc) gereinigt, wodurch die gewünschte Hydroxysäure als ein etwa 1:1 Gemisch von C15 Epimeren erhalten wird, die an dieser Stufe nicht aufgetrennt werden können.
  • Hydroxysäure 41e
  • Gelber Feststoff (79%, etwa 1:1 Gemisch von C15 Epimeren). Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,37 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 2:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 23 (c 2,3, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 3356 (br), 2929, 2856, 1712, 1472, 1253, 1085, 1038, 988, 836 und 776 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 806,4282 (MNa+), und liegt einer Berechnung für C40H73NO8S2Si2Na zufolge bei 806,4315.
  • Yamaguchi Makrolactonisierung (allgemeines Verfahren)
  • Eine Lösung der Hydroxysäure (95 μmol) in trockenem THF (8 ml) wird bei 0°C mit Triethylamin (79 μl, 0,57 mmol) und 2,4,6-Trichlorbenzoylchlorid (40 μl, 0,23 mmol) versetzt. Nach einer Rührung bei 0°C während 1 h wird die erhaltene Lösung während 2 h zu einer Lösung von 4-DMAP (26 mg, 0,21 mmol) in Toluol (20 ml) bei 75°C unter Verwendung einer Spritzenpumpe gegeben. Nach einer Rührung bei 75°C während einer weiteren Stunde wird das Toluol unter verringertem Druck verdampft und der Rückstand direkt einer Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Gemische von Hexanen:EtOAc) unterzogen, wodurch das Makrolacton und sein (15R)-Epimer erhalten wird, das leicht abtrennbar ist. In allen Fällen wird das gewünschte (15S)-Epimer nach dem weniger polaren (15R)-Epimer eluiert.
  • Makrolacton 43e
  • Dieses Produkt wird als ein rohes Gemisch isoliert, das direkt den globalen Desilylierungsbedingungen (siehe unten) ohne weitere Reinigung unterzogen wird.
  • Globale Desilylierung (allgemeines Verfahren)
  • Das Makrolacton wird in 20% Vol./Vol. TFA in CH2Cl2 gelöst, und die Lösung wird 3 h auf 25°C gehalten, worauf die flüchtigen Bestandteile ohne Erhitzung verdampft werden. Der Rückstand wird in EtOAc gelöst, und die Lösung wird mit NaHCO3 (gesättigt) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und eingedampft. Eine anschließende Blitzchromatographie (Siliciumdioxid, Gemische von Hexanen:EtOAc) ergibt das reine Epothilon.
  • Epothilon 12
  • Viskoses Öl (17% von 41e). Der durch TLC erhaltene Rf Wert beträgt 0,38 (Siliciumdioxid, Hexane:EtOAc 2:1), der [α]D Wert beträgt 22 bis 52 (c 0,50, CHCl3), das IR Spektrum (Film) zeigt vmax Werte von 3490 (br), 2933, 1732, 1686, 1255, 1038 und 756 cm–1, der MALDI-FTMS Wert m/z beträgt 538,2666 (MH+), und liegt einer Berechnung für C28H44NO5S2 zufolge bei 538,2655.
  • Beispiel: Weichkapseln
  • 5000 Weichgelatinekapseln, die als Wirkstoff jeweils 0,05 g einer der Verbindungen der Formel I enthalten, wie sie in den vorherigen Beispielen bezeichnet sind, werden wie folgt hergestellt:
    Zusammensetzung Menge
    Wirkstoff 250 g
    Lauroglycol 2 l
  • Herstellungsverfahren: Der pulverisierte Wirkstoff wird in Lauroglykol® (Propylenglycollaurat, Gattefossé S.A., Saint Priest, Frankreich) suspendiert und auf dem Nasspulverisator auf eine Korngröße von etwa 1 bis 3 μm vermahlen. Portionen, die jeweils 0,419 g des Gemisches enthalten, werden dann mit einer Kapselfüllmaschine in Weichgelatinekapseln abgefüllt.
  • Detaillierte Beschreibung der Figuren
  • Die 1 zeigt die Strukturen ausgewählter natürlicher und entworfener Epothilone. Die grauen Boxen zeigen Verbindungen, die für diese Studie synthetisiert worden sind.
  • Die 4 zeigt die retrosynthetische Analyse des Analogen von trans-Cyclopropylepothilon B (12).
  • Die 5 zeigt die Konstruktion des Aldehyds 32. Bezüglich der Reagenzien und Bedingungen wird hingewiesen auf (a) K. C. Nicolaou et al., ChemBioChem 2001, 2, 69 bis 75 und A. B. Charette et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943 bis 11952, (b) NaH (1,5 Äquiv.), BnBr (1,5 Äquiv.), DMF, 0 → 25°C, 12 h, (c) O3, CH2Cl2:MeOH 4:1, –78°C, 21 min, dann NaBH4 (3,0 Äquiv.), –78 → 25°C, 1 h, 89% für 2 Stufen, (d) MsCl (1,3 Äquiv.), Et3N (1,5 Äquiv.), CH2Cl2, 25°C, 1 h, (e) NaI (3,0 Äquiv.), Aceton, Rückfluss, 40 min, 95% für 2 Stufen, (f) LDA (1,4 Äquiv.), 25 (1,3 Äquiv.), THF, 0°C, 6 h, dann 24, –98 → –10°C, 14 h, 84%, (g) MeI, 60°C, 3 h, (h) 3 N HCl:Pentan 1:1, 25°C, 3 h, 88% für 2 Stufen, (i) LDA, (2,4 Äquiv.), 19 (2,3 Äquiv.), THF, –78°C, 1 h, dann –40°C, 0,5 h, dann 17 bei –78°C, 5 min, 81%, (j) TBSOTf (2,0 Äquiv.), 2,6-Lutidin (3,0 Äquiv.), CH2Cl2, –20°C, 1 h, (k) HF·py, Pyridin, THF, 25°C, 4 h, 89% für 2 Stufen, (I) DMP (2,5 Äquiv.), NaHCO3 (2,5 Äquiv.), H2O, CH2Cl2, 25°C, 1 h, (m) NaClO2 (3,1 Äquiv.), NaH2PO4 (2,1 Äquiv.), 2-Methyl-2-buten (74 Äquiv.), t-BuOH, THF, H2O, 25°C, 1 h, (n) 2-(Trimethylsilyl)ethanol (4,0 Äquiv.), EDC (1,5 Äquiv.), 4-DMAP (0,1 Äquiv.), DMF, 25°C, 14 h, 74% für 3 Stufen, (o) 20% Pd(OH)2/C, H2 (1 atm), EtOH:EtOAc 1:1, 25°C, 1 h, (p) DMP (2,5 Äquiv.), NaHCO3 (2,5 Äquiv.), H2O, CH2Cl2, 25°C, 1 h, 84% für 2 Stufen, (q) MeOCH2PPh3Cl (3,0 Äquiv.), NaHMDS (2,8 Äquiv.), THF, –40 → –10°C, 2 h, 84%, (r) PPTS (8,0 Äquiv.), Dioxan:H2O 9:1, 70°C, 6 h, 82%, wobei die genannten Abkürzungen die folgenden Bedeutungen haben:
    • 4-DMAP
    = 4-(Dimethylamino)-pyridin,
    DME
    = 1,2-Dimethoxyethan,
    DMP
    = Periodinan nach Dess-Martin,
    EDC
    = 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid,
    HF·py
    = Hydrogenfluorid-Pyridin-Komplex,
    NaHMDS
    = Natriumhexamethyldisilazid,
    PPTS
    = Pyridinium-para-toluolsulfonat,
    TMS
    = 2-Trimethylsilylethyl.
  • Die 6 zeigt die Konstruktion von Vinyliodiden 20e. Bezüglich der Reagenzien und Bedingungen wird hingewiesen auf (b) Pd(PPh3)2Cl2 (0,01 Äquiv.), CuI (0,02 Äquiv.), HCeCCH3 (1 atm), DMF, i-Pr2NEt, 25°C, 3 h, 35: 96%, (c) n-BuLi (4,0 Äquiv.), (n-Bu3Sn)2 (4,0 Äquiv.), CuCN (2,0 Äquiv.), MICH, THF, –10°C, 12 h, (ii) I2 (1,05 Äquiv.), CH2Cl2, 0°C, 5 min, 20e: 37% von 37, wobei die genannten Abkürzungen die folgenden Bedeutungen haben:
    • TrCl
    = Triphenylmethylchlorid,
    4-DMAP
    = 4-(Dimethylamino)-pyridin,
    MOMCl
    = Chlormethylmethylether.
  • Die 7 zeigt die Synthese von Epothilonanaloga 12. Reagenzien und Bedingungen: (a) CrCl2 (10 Äquiv.), NiCl2 (0,2 Äquiv.), 4-t-Butylpyridin (30 Äquiv.), 20 (3,0 Äquiv.), DMSO, 25°C, über Nacht, (b) TRAF (4,0 Äquiv.), THF, 0°C, 1 h, dann 25°C, 1 h, (c) Et3N (6,0 Äquiv.), 2,4,6-Trichlorbenzoylchlorid (2,4 Äquiv.), 41 oder 42, THF, 0°C, 1 h, dann 4-DMAP (2,2 Äquiv.), Toluol, 75°C, 3 h, (d) 20 Vol./Vol.% TFA in CH2Cl2, 25°C, 3 h (mit Ausnahme von 43d), (e) ermittelt durch 1H NMR, (f) Schutzgruppenabspaltung von 43d: TMSBr (10 Äquiv.), 4 Å MS, CH2Cl2, –30°C, 1 h, dann 20 Vol./Vol.% TFA in CH2Cl2, 25°C, 3 h, wobei die darin genannten Abkürzungen die folgenden Bedeutungen haben:
    • TRAF
    = Tetrabutylammoniumfluorid,
    4-DMAP
    = 4-(Dimethylamino)-pyridin,
    TFA
    = Trifluoressigsäure,
    TMSBr
    = Trimethylsilylbromid,
    MS
    = Molekularsiebe.
  • Die 8 zeigt eine Tabelle über die Cytotoxizität von Epothilonen 1 bis 14 und von Paclitaxel gegen humane Ovarialkarzinomzellen 1A9 und β-Tubulinmutantenzelllinien, die selektiert sind mit Paclitaxel oder Epothilon A. Die antiproliferativen Effekte der getesteten Verbindungen gegen das Parental 1A9 und die durch Paclitaxel und Epothilon selektierten Pharmaka-resistenten Klone (PTX10, PTX22 und A8) werden bestimmt in einem 72 h Wachstumsinhibitionsassay unter Anwendung des SRB-Assays (Sulforhodamin-B), wie dies von P. Skehan et al. in J. Natl. Cancer Inst. 1990, 82, 1107 bis 1112, beschrieben ist. Die IC50 Werte einer jeden Verbindung sind in nmol angegeben und repräsentieren das Mittel aus 3 bis 9 unabhängigen Experimenten aus dem Standardfehler Å des Mittelwertes. Die relative Resistenz (RR) wird als ein IC50 Wert für jede resistente Unterlinie dividiert durch den Wert für die Parentalzelllinie (1A9) berechnet. Dabei haben die folgenden Abkürzungen die jeweils angegebenen Bedeutungen:
    • CP
    = Cyclopropyl,
    py
    = 5-Methylpyridinseitenkette,
    pyOH
    = 5-Hydroxymethylpyridinseitenkette,
    5tmpy
    = 5-Thiomethylpyridinseitenkette,
    6tmpy
    = 6-Thiomethylpyridinseitenkette,
    tmt
    = 2-Thiomethylthiazolseitenkette.
  • Die 9 zeigt eine Tabelle über die Tubulinpolymerisationsstärke und die Cytotoxizität von Epothilonen 1 bis 8 und 10 bis 14 und von Paclitaxel gegen humane epidermoide Krebszelllinien wie folgt:
    • (a) Das Ausmaß einer Polymerisation von Schweinetubulin (TP) durch 4 μmol einer Verbindung wird in Abhängigkeit vom Effekt von 25 μmol Epothilon B, das als 100% definiert ist, wie in K. C. Nicolaou et al., Chem. Biol. 2000, 7, 593 bis 599, beschrieben, bestimmt.
    • (b) Die für eine maximale Inhibition eines Zellwachstums, in nmol angegebene IC50 Werte erforderliche Wirkstoffkonzentration wird nach einer 96 h dauernden Einwirkung des Wirkstoffs durch Quantifizierung der Zellmasse unter Anwendung eines Verfahrens zur Anfärbung von Protein bestimmt, wie dies beschrieben ist von T. Meyer et al., Int. J. Cancer 1989, 43, 851 bis 856. KB-31: Gegenüber dem Epidermoid Taxol® sensitive Zellen, KB-8511: gegenüber dem Epidermoid Taxol® resistente Zellen (infolge einer Pgp Überexpression). Die relative Resistenz (RR) wird berechnet durch Division des IC50 Werts für die resistente Zelllinie durch den IC50 Wert für die sensitive Zelllinie.
    • (c) Die Daten der Referenz 3 (% TP Werte für Taxol®, Epo A und Epo B sind 49, 69 und 90). Dabei haben die folgenden Abkürzungen die jeweils angegebenen Bedeutungen:
      CP
      = Cyclopropyl,
      py
      = 5-Methylpyridinseitenkette,
      pyOH
      = 5-Hydroxymethylpyridinseitenkette,
      5tmpy
      = 5-Thiomethylpyridinseitenkette,
      6tmpy
      = 6-Thiomethylpyridinseitenkette,
      tmt
      = 2-Thiomethylthiazolseitenkette.
  • Die 10 zeigt eine Tabelle über die Bindungsaffinitäten von Analoga von Epothilon an die Taxoidbindestelle von Mikrotubuli.
    • (a) Die Bindung der verschiedenen Liganden an die Taxoidstelle von Mikrotubuli wird gemessen durch die Verschiebung eines fluoreszierenden Taxol® Derivats (Flutax-2) von seiner Bindestelle (2), wie dies von J. F. Diaz et al. in J. Biol. Chem. 2000, 275, 26265 bis 26276, beschrieben ist. Die Verschiebungsisotherme von Flutax-2 eines jeden Liganden wird wenigstens zweimal mit einem Fluoreszenzpolarisationsmikroplattenablesegerät in einem gegenüber dem früheren Bericht modifizierten Verfahren gemessen, wozu auf J. M. Andreu und I. Barasoain in Biochemistry 2001, 40, 11975 bis 11984, hingewiesen wird. Hierzu werden vernetzte stabilisierte Mikrotubuli verwendet, die unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt worden sind. Die Bindungskonstante des Referenzliganden Flutax-2 wird gemessen durch Zentri fugation und Fluoreszenzanisotropie bei jeder Temperatur, wozu hingewiesen wird auf J. F. Diaz et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 26265 bis 26276. Der dabei erhaltene Referenzwert beträgt 2,2 (107 mol–1 bei 37°C).
    • (b) Die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (Kd) sind in nmol angegeben.
    • (c) Die freien Energieveränderungen der Standardbindung (DG0 app) sind in kJ mol–1 angegeben.

Claims (4)

  1. Verbindung der Formel I
    Figure 00260001
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel oder eine Verbindung nach Anspruch 1 oder, falls möglich, ein pharmazeutisch akzeptables Säureadditionssalz oder Basenadditionssalz hiervon.
  3. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer proliferativen Krankheit.
  4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, worin eine Verbindung der Formel VI
    Figure 00260002
    worin X für CH2 steht und R für
    Figure 00260003
    steht und PG eine Schutzgruppe für eine Hydroxyfunktion ist, in einer ersten Stufe durch eine Veresterungsreaktion, optional in Gegenwart eines Katalysators, kondensiert wird und in einer zweiten Stufe die Schutzgruppe abgespalten und so ein Lacton der Formel I gebildet wird.
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