DE60313769T2 - 3-(pyridinyl-amino)-1h-indol-2-carbonsäure-verbindungen als inhibitoren der interleukin-4 genexpression - Google Patents

3-(pyridinyl-amino)-1h-indol-2-carbonsäure-verbindungen als inhibitoren der interleukin-4 genexpression Download PDF

Info

Publication number
DE60313769T2
DE60313769T2 DE60313769T DE60313769T DE60313769T2 DE 60313769 T2 DE60313769 T2 DE 60313769T2 DE 60313769 T DE60313769 T DE 60313769T DE 60313769 T DE60313769 T DE 60313769T DE 60313769 T2 DE60313769 T2 DE 60313769T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
alkyl
indole
carboxylic acid
cells
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60313769T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60313769D1 (de
Inventor
Gregory H. Phillipsburg MERRIMAN
Philip M. Warren WEINTRAUB
Jeffrey S. Bridgewater SABOL
Ramalinga Belle Mead DHARANIPRAGADA
Nicholas J. Hillsborough HRIB
John G. Bethlehem JURCAK
Alexandre Jersey City GROSS
Brian Lebanon WHITELEY
Kwon Yon Raritan MUSICK
Joseph T. Neshanic Station KLEIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0217920.8A external-priority patent/GB0217920D0/en
Application filed by Aventis Pharmaceuticals Inc filed Critical Aventis Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE60313769D1 publication Critical patent/DE60313769D1/de
Publication of DE60313769T2 publication Critical patent/DE60313769T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/42—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Description

  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Serie von Indol-Derivaten. Spezifischer, die vorliegende Erfindung betrifft eine Serie von substituierten 3-Aminoindolcarbonsäure-Derivaten. Die Ausgangsverbindungen sind in der Lage, T-Helferzellen (Th) zu modulieren, somit die Transkription der Interleukin-4 (IL-4) Boten, die IL-4-Freisetzung oder die IL-4 Produktion kontrollieren und dadurch eine große Vielseitigkeit an therapeutischem Nutzen aufweisen.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Es ist allgemein bekannt, dass Lymphozyten, die in dem Knochenmark produziert werden, eine Klasse von Zellen sind, die das Immunsystem kontrollieren. Es ist ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt, dass eine Klasse von Lymphozyten, bekannt als T-Zellen, die im Thymus erzogen werden, weiter unterteilt werden in T-Helferzellen, welche die Reaktionen von anderen weißen Blutzellen, wie zum Beispiel Makrophagen oder B-Zellen, durch Sezernieren einer Vielfalt von lokalen Mediatoren, Lymphokinen, Interleukinen und/oder Cytokinen verstärken oder aktivieren. Innerhalb dieser Klasse von T-Zellen gibt es zwei T-Zell-Untergruppen, normalerweise als Th1- und Th2-Zellen bezeichnet, die sich durch die Ausstattung an Cytokingenen unterscheiden, die von jedem Zelltyp exprimiert werden und jede Zelle scheint in unterschiedlichen Typen der Immunantworten eingebunden zu sein.
  • Wenn sie nicht kontrolliert werden, sind Th1-Zellen mit der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen verwickelt, wie Typ-1 Diabetes, rheumatoide Arthritis und Multiple Sklerose (MS). Ebenfalls ist es bekannt, dass Th2-Zellen wichtig sind für die Ausrottung von Helminthen und anderen extrazellulären Parasiten und in allergi schen und atopischen Reaktionen involviert sind. Cytokine, die durch die Th2-Zellen produziert werden, können eine Hyperreaktivität der Atemwege sowie eine Produktion von IgE induzieren. Die Th2-Zellen exprimieren die Cytokine IL-4, IL-5 und IL-13 und können Mastzellen und Eosinophile aktivieren. Th2-Zellen stimulieren B-Zellen zu proliferieren und Antikörper effektiv zu sezernieren (humorale Immunität).
  • IL-4 ist ein pleiotropes Typ-I Cytokin, was durch Th2-Zellen, Basophile und Mastzellen als Reaktion auf Rezeptor-vermittelte Aktivierungsereignisse produziert wird. IL-4 wird auch durch eine spezialisierte Untergruppe von T-Zellen produziert, von denen einige NK 1,1 exprimieren und spezifische für CD-1 zu sein scheinen (NK T-Zellen), Yoshimoto, T., et al., Science (1995) 270: 1845–1847. Von T-Zellen ist berichtet worden, dass sie IL-4 produzieren und, dass Mäuse, denen diese Zellen fehlen, es nicht fertig bringen, eine IL-4-abhängige Atemwegssensibilität nach Immunisierung mit Ovalbumin in Alaun zu entwickeln. Für Eosinophile ist ebenfalls berichtet worden, dass sie in der Lage sind, IL-4 zu produzieren.
  • IL-4 spielt eine zentrale Rolle in der Regulation der Differenzierung von antigen-stimulierten naiven T-Zellen. IL-4 veranlasst solche Zellen, sich zu Zellen zu entwickeln, die zu der Produktion von IL-4 und einer Reihe von anderen Cytokinen einschließlich IL-5, IL-10 und IL-13 in der Lage sind (d. h. Th2-artige Zellen). IL-4 unterdrückt wirksam das Auftreten von IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Zellen, z. B. TH1-Zellen. Eine zweite Funktion mit größerer physiologischer Bedeutung von IL-4 ist die Kontrolle der Spezifität des Wechsels der Immunglobulinklassen. IL-4 bestimmt, dass menschliche B-Zellen zu der Expression von IgE und IgG4 wechseln und die B-Zellen der Mäuse zu IgE und IgG1. In IL-4- und IL-4-Rezeptor Knockout-Mäusen sowie in Mäusen, denen ein prinzipielles Substrat von dem IL-4-Rezeptor, Stat-6, fehlt, ist die IgE-Produktion mit einem Faktor von 100-fach oder mehr verringert. IL-4-Rezeptor Knockout-Mäuse und Stat-6 Knockout-Mäuse wiesen ebenfalls einen Mangel in der Entwicklung von IL-4 produzierenden T-Zellen in Mäusen auf, die mit dem helminthischen Parasiten Nippostrongylus brasiliensis infiziert waren. Diese physiologischen Funktionen von IL-4 geben ihm eine überragende Rolle in der Regulation von allergischen Bedingungen; es spielt auch eine größere Rolle in der Entwicklung von schützenden Immunantworten auf Helminthen und andere extrazelluläre Parasiten. In experimentellen und klinischen Situationen scheint IL-4 in der Lage zu sein, die Wirkungen der gewebezerstörenden Autoimmunität zu verbessern.
  • Demzufolge ist es eine Aufgabe von dieser Erfindung eine Serie von Verbindungen bereitzustellen, die in der Behandlung von einer großen Vielzahl von Krankheitsstadien nützlich sind, die durch ein Ungleichgewicht der Th1-/Th2-Zellen verursacht werden. Solche Krankheitsstadien beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Allergie, Asthma, Rhinitis, Dermatitis, B-Zell-Lymphome, Tumore und Erkrankungen, die mit bakteriellen Infektionen, Rhinovirus- oder Respiratorischer Syncitium-Virus-(RSV) Infektionen verbunden sind.
  • Es ist auch eine Aufgabe von dieser Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, die in der Lage sind, T-Helferzellen (Th-Zellen) Th1/Th2 zu modulieren, und dadurch die Anzahl der Th2-Zellen in Bezug auf die Th1-Zellen zu vermindern.
  • Es ist weiterhin eine Aufgabe von dieser Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, die in der Lage sind, die Transkription von Interleukin-4 (IL-4) Boten, die IL-4-Freisetzung oder die IL-4 Produktion zu inhibieren.
  • Schließlich ist es eine Aufgabe von dieser Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, welches Indol-Derivate sind, die alle hierin vorangehend beschriebenen Aufgaben befriedigen.
  • Andere Aufgaben und der weitere Bereich von der Anwendbarkeit von der vorliegenden Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung, die folgt, offensichtlich.
  • WO 00/46199 offenbart 3-substituierte Amino-1H-indol-2-carbonsäure-Derivate als entzündungshemmende Wirkstoffe, die für die Behandlung von Asthma, Psoriasis und hypersensibler Reaktionen der Haut nützlich sind. EP-B-0 186 367 offenbart 2-Carboxamidotetrazol-substituierte Indol-Derivate als nützliche entzündungshemmende Wirkstoffe für die Behandlung von z. B. Dermatitis, Asthma und Rhinitis.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Demzufolge wird gemäß der Praxis dieser Erfindung eine Verbindung der Formel (I) bereitgestellt:
    Figure 00040001
    wobei
    X und Y gleich oder unterschiedlich sind und unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Amino, Hydroxy, C1-6-Alkoxy, C1-6-Perfluoralkoxy und Phenyl, wobei Phenyl wahlweise substituiert ist mit ein oder zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Halogen, Hydroxy oder C1-6-Perfluoralkyl oder C1-6-Perfluoralkoxy;
    Z für N-R steht, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C1-6-Alkyl und C1-6-Alkylcarbonyl;
    R1 für Wasserstoff steht;
    Figure 00050001
    steht;
    R2 für C1-6-Alkyl steht;
    oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
  • In einem weiteren Aspekt von dieser Erfindung sind verschiedenartige Prozesse, die zur Herstellung einer Vielzahl von Verbindungen dieser Erfindung verwendet wurden, ebenfalls offenbart und beansprucht.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Säulendiagramm, dass die Wirkungen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) auf die Cytokine der bronchoalveolären Waschflüssigkeit (BALF) und die Lungenentzündung in Mäusen zeigt.
  • 2 ist ein Säulendiagramm, dass die Inhibierung der Allergen-induzierten Lungenentzündung in der Ratte durch 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) darstellt.
  • 3A ist ein Diagramm, dass die Wirkung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) auf die Antigen-induzierten frühen und späten Bronchialantworten darstellt.
  • 3B ist ein Säulendiagramm, dass die Wirkung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) (3 mg/kg) auf die Atemwegsreaktionen nach der Belastung darstellt.
  • 4 ist eine Auflistung von der Sequenz, SEQ ID NO:1, einem 6,7 kb Fragment, das die Nukleotide –6635 bis +66 des Promotors des menschlichen IL-4 Gens umfasst.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Bezeichnungen, wie hierin verwendet, besitzen folgende Bedeutung:
    Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck „C1-6-Alkyl" Methyl- und Ethylgruppen und geradkettige oder verzweigte Propyl-, Butyl-, Pentyl- und Hexyl-Gruppen ein. Besondere Alkylgruppen sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, tert-Butyl und Amyl. Hergeleitete Ausdrücke wie zum Beispiel "C1-6-Alkoxy", "C1-6-Alkoxy-C1-6-alkyl", "Hydroxy-C1-6-alkyl", "C1-6-Alkylcarbonyl", "C1-6-Alkoxycarbonyl-C1-6-alkyl", "C1-6-Alkoxycarbonyl", "Amino-C1-6-alkyl", "C1-6-Alkylcarbamoyl-C1-6-alkyl", "C1-6-Dialkylcarbamoyl-C1-6-alkyl", "Mono- oder Di-C1-6-Alkylamino-C1-6-alkyl", "Amino-C1-6-alkylcarbonyl" "Diphenyl-C1-6-alkyl", "Phenyl-C1-6-alkyl", "Phenylcarboyl-C1-6-alkyl" und "Phenoxy-C1-6-alkyl" sind entsprechend auszulegen.
  • Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck „C2-6-Alkenyl" Ethenyl und geradkettige oder verzweigte Propenyl-, Butenyl-, Pentenyl- und Hexenyl-Gruppen ein. Ähnlich schließt der Ausdruck „C2-6-Alkinyl" Ethinyl und Propinyl und geradkettige oder verzweigte Butinyl-, Pentinyl- und Hexinyl-Gruppen ein.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „C1-6-Perfluoralkyl", dass alle Wasserstoffatome in der Alkylgruppe durch Fluoratome ersetzt sind. Veranschaulichende Beispiele schließen Trifluormethyl und Pentafluorethyl und geradkettige oder verzweigte Heptafluorpropyl-, Nonafluorbutyl-, Undecafluorpentyl- und Tridecafluorhexyl-Gruppen ein. Der abgeleitete Ausdruck "C1-6-Perfluoralkoxy" ist entsprechend auszulegen.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "C3-8-Cycloalkyl" Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl und Cyclooctyl.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "C3-8-Cycloalkyl-C1-6-alkyl", dass das wie hierin definierte C3-8-Cycloalkyl ferner an C1-6-Alkyl, wie hierin definiert, angehängt ist. Repräsentative Beispiele schließen Cyclopropylmethyl, 1-Cyclobutylethyl, 2-Cyclopentylpropyl, Cyclohexylmethyl, 2-Cycloheptylethyl und 2-Cyclooctylbutyl und dergleichen ein.
  • Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck "C1-6-Acyl" dieselbe Bedeutung besitzen wie "C1-6-Alkanoyl", was strukturell auch als „R-CO-" Gruppe repräsentiert werden kann, wobei R ein wie hierin definiertes C2-6-Alkyl bedeutet. Zusätzlich soll "C1-6-Alkylcarbonyl" dasselbe bedeuten wie C2-6-Acyl. Spezifisch soll "C1-6-Acyl" Formyl, Acetyl oder Ethanoyl, Propanoyl, n-Butanoyl usw. bedeuten. Abgeleitete Ausdrücke wie zum Beispiel "C2-6-Acyloxymethyl" und "C2-6-Acyloxyalkyl" sind entsprechend auszulegen.
  • „CsA" bedeutet Cyclosporin A.
  • „Halogen" oder „Halo" bedeutet Chlor, Fluor, Brom und Iod.
  • „IL" bedeutet Interleukin.
  • „Luc" bedeutet Luciferase.
  • Wie hierin verwendet, ist für die verschiedenen Formen von dem Begriff „Modulation" beabsichtigt, Stimulation (z. B. Verstärkung oder Hochregulation einer bestimmten Reaktion oder Aktivität) und Inhibierung (z. B. Abnahme oder Herunterregulation einer Reaktion oder Aktivität) einzuschließen.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet „Patient" ein warmblütiges Tier, wie zum Beispiel Ratten, Mäuse, Hunde, Katzen, Meerschweinchen und Primaten wie Menschen.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „pharmazeutisch unbedenklicher Träger" ein nicht-toxisches Lösemittel, Dispersionsmittel, Hilfsstoff, Adjuvant oder ein anderes Material, das mit der Verbindung der vorliegenden Erfindung gemischt wird, um die Bildung von einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu ermöglichen, d. h. einer Dosierungsform, die geeignet ist, an den Patienten verabreicht zu werden. Ein Beispiel für solch einen Träger ist ein pharmazeutisch unbedenkliches Öl, das typischerweise für die parenterale Verabreichung verwendet wird.
  • Die Bezeichnung „pharmazeutisch unbedenkliches Salz" bedeutet, wie hierin verwendet, dass die Salze von den Verbindungen der vorliegenden Erfindung in der Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden können. Andere Salze können jedoch verwendbar sein in der Herstellung von den Verbindungen gemäß der Erfindung oder von ihren pharmazeutisch unbedenklichen Salzen. Geeignete pharmazeutisch unbedenkliche Salze von den Verbindungen der Erfindung schließen saure Additionssalze ein, die zum Beispiel durch Mischen einer Lösung von der Verbindung gemäß der Erfindung mit einer Lösung von einer pharmazeutisch unbedenklichen Säure wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Methansulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Essigsäure, Salicylsäure, Zimtsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, Hydroxybenzoesäure, Phenylessigsäure, Benzoesäure, Oxalsäure, Citronensäure, Weinsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Carbonsäure oder Phos phorsäure gebildet werden können. Die sauren Metallsalze wie zum Beispiel Natriummonohydrogen-Orthophosphat und Kaliumhydrogensulfat können auch gebildet werden. Ebenfalls sind die derart geformten Salze entweder als Mono- oder Di-Säuresalze vorhanden und können entweder hydratisiert oder grundsätzlich unhydratisiert existieren. Weiterhin können, wo die Verbindungen der Erfindung einen sauren Rest tragen, geeignete pharmazeutisch unbedenkliche Salze davon Alkalimetallsalze, z. B. Natrium- oder Kalium-Salze, Alkalierdmetall-Salze, z. B. Calcium- oder Magnesium-Salze und Salze, die mit geeigneten organischen Liganden gebildet werden, z. B. quaternäre Ammoniumsalze, einschließen.
  • Der Ausdruck „Stereoisomere" ist eine allgemeine Bezeichnung für alle Isomere von den individuellen Molekülen, die sich nur in der Orientierung ihrer Atome im Raum unterscheiden. Typischerweise schließt er Spiegelbildisomere ein, die gewöhnlich aufgrund von mindestens einem asymmetrischen Zentrum gebildet werden (Enantiomere). Wo die Verbindungen gemäß der Erfindung zwei oder mehr asymmetrische Zentren besitzen, können sie zusätzlich als Diastereoisomere existieren, auch bestimmte einzelne Moleküle können als geometrische Isomere (cis/trans-) existieren. Es ist zu verstehen, dass alle solchen Isomere und Mischungen in irgendeinem Verhältnis davon innerhalb des Anwendungsbereiches der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
  • „Substituiert" bedeutet substituiert durch 1 bis 2 Substituenten, die unabhängig aus der Gruppe bestehend aus C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Hydroxy, -CO2H, einem Ester, einem Amid, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Perfluoralkoxy, -NH2, Cl, Br, I, F, -NH-niederes Alkyl und -N(niederes Alkyl)2 ausgewählt wurden.
  • „Therapeutisch wirksame Menge" bedeutet eine Menge von der Verbindung, welche in der Behandlung der genannten Krankheit oder der Erkrankung wirksam ist.
  • Wie in den Beispielen und Präparationen, die folgen, verwendet, sollen die dort verwendeten Bezeichnungen die angegebene Bedeutung besitzen. "kg" bedeutet Kilogramm, "g" bedeutet Gramm, "mg" bedeutet Milligramm, "μg" bedeutet Mikrogramm, "pg" bedeutet Pikogramm, "mol" bedeutet Mol, "mmol" bedeutet Millimol, "nmol" bedeutet Nanomol, "L" bedeutet Liter, "mL" oder "ml" bedeutet Milliliter, "μL" bedeutet Mikroliter, "°C" bedeutet Grad Celsius, "Rf" bedeutet Retentionsfaktor, "mp" oder "m.p." bedeuten Schmelzpunkt, "dec" bedeutet Zerfall, "bp" oder "b.p." bedeutet Siedepunkt, "mm Hg" bedeutet Druck in Millimeter Quecksilber, "cm" bedeutet Zentimeter, "nm" bedeutet Nanometer, "[α]20 D" bedeutet spezifische Rotation der D-Linie von Natrium bei 20°C, erhalten in einer 1-Dezimeter Zelle, "c" bedeutet Konzentration in g/mL, "THF" bedeutet Tetrahydrofuran, "DMF" bedeutet Dimethylformamid, "NMP" bedeutet 1-Methyl-2-pyrrolidinon, "Salzlake" bedeutet eine gesättigte wässrige Natriumchlorid-Lösung, "M" bedeutet Molar, "mM" bedeutet Millimolar, "μM" bedeutet Mikromolar, "nM" bedeutet Nanomolar, "TLC" bedeutet Dünnschicht-Chromatographie, "HPLC" bedeutet Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie, "HRMS" bedeutet Hochauflösungs-Massenspektrum, "lb" bedeutet Pfund, "gal" bedeutet Gallone, "L.O.D." bedeutet Verlust bei Trocknen, "μCi" bedeutet Mikrocurie, "i.p." bedeutet intraperitoneal, "i.v." bedeutet intravenös.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Serie von Verbindungen bereitgestellt, die als Prodrugs (d. h. R2 bedeutet etwas anderes als Wasserstoff in der Verbindung von Formel (I) und den folgenden Definitionen) wirksam sind. Die Prodrugs dieser Erfindung sind im Allgemeinen Ester von der aktiven Verbindung. Diese Prodrugs bieten einen Zugang zu verbesserter Arzneimittelwirksamkeit. Im Allgemeinen werden die Prodrugs dieser Erfindung zu dem aktiven Ausgangs-Arzneimittel (d. h. R2 = Wasserstoff in Formel (I)) in vivo durch enzymatische Hydrolyse umgewandelt (z. B. wandelt eine Esterase einen Ester in eine Carbonsäure um, eine Amidase wandelt ein Amid in eine Carbonsäure um, usw.). Im Allgemeinen bieten Prodrugs eine Anzahl von Vorteilen gegenüber den Ausgangs-Arzneimitteln. Zum Beispiel können, ohne irgendwelche Einschränkungen, einige der Vorteile von den Prodrugs dieser Erfindung wie folgt spezifiziert werden:
    • 1. Gesteigerte physiko-chemische Eigenschaften, wie zum Beispiel verbesserte Löslichkeit usw.
    • 2. Verbesserte Absorption und Verteilung unter physiologischen Bedingungen,
    • 3. Seitenspezifität,
    • 4. Stabilität,
    • 5. Verlängerte Freisetzung,
    • 6. Geringe Toxizität, wenn verglichen mit dem aktiven Ausgangsmolekül,
    • 7. Annehmbarkeit durch Patienten und
    • 8. Verbesserte Formulierungseigenschaften.
  • Die Verbindungen von dieser Erfindung sind im Allgemeinen Carbonsäure- und Esterderivate von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure. Die freie Säure, 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure, zeigt im Allgemeinen geringe Löslichkeit und niedrige orale Bioverfügbarkeit. Die Ester der Prodrugs, die davon erhalten wurden, weisen auf der anderen Seite eine erhöhte Löslichkeit sowie verbesserte Bioverfügbarkeit auf, insbesondere wenn sie oral verabreicht werden. Die Verbindungen dieser Erfindung werden durch die folgende Formel (I) repräsentiert:
    Figure 00120001
    wobei
    X und Y identisch oder unterschiedlich sind und unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
    Halogen, Amino, Hydroxy, C1-6-Alkoxy, C1-6-Perfluoralkoxy und Phenyl, wobei Phenyl wahlweise substituiert ist mit ein oder zwei Substituenten, die jeweils unabhängig ausgewählt sind aus C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Halogen, Hydroxy oder C1-6-Perfluoralkyl oder C1-6-Perfluoralkoxy;
    Z für N-R steht, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C1-6-Alkyl und C1-6-Alkylcarbonyl;
    R1 für Wasserstoff steht;
    R3 für
    Figure 00120002
    steht; und
    R2 für C1-6-Alkyl oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon steht.
  • Spezifische Verbindungen, die zu dieser Ausführungsform gehören, schließen 5,6-Dimethoxy-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-ethylester ein.
  • Wie oben erwähnt, sind einige von den durch die oben erwähnte generische Formel (I) eingeschlossenen Verbin dungen in der Literatur bekannt. Insbesondere die freie Carbonsäure und die Alkylester von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure von Formel (IA):
    Figure 00130001
    sind in der Literatur bekannt. Siehe US-Patentschriften Nr. 5,177,088 und 5,328,920 .
  • Im Allgemeinen können die Verbindungen dieser Erfindung leicht durch irgendeines der dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisiert werden. Speziell können die bekannten Verbindungen, die in dem Verfahren von dieser Erfindung verwendet werden, gemäß den in den US-Patentschriften Nr. 5,177,088 ; 5,189,054 ; 5,328,920 ; 5,491,153 ; und 5,675,018 bekannt gemachten Prozeduren hergestellt werden.
  • Spezifischer, die hierin offenbarten Verbindungen können gemäß den folgenden Prozeduren der Schemata A–H synthetisiert werden, wobei die X-, Y-, Z-, R1-, R2- und R3-Substituenten definiert sind wie für Formel (I) oben, sofern nichts anderes angegeben ist.
  • Im Allgemeinen kann für die Indol-Derivate, die in dem Verfahren von dieser Erfindung verwendet werden, das startende 3-Aminoindol durch Folgen der Prozeduren in den Schemata A–D hergestellt werden.
  • Schema A
    Figure 00140001
  • In Schema A, Schritt A1, wird das substituierte 2-Fluorbenzonitril 1 mit dem α-Aminocarbonsäureester 2 umgesetzt, um das 3-Aminoindol-Derivat 3 zu bilden. Die Reaktion wird im Allgemeinen pur durchgeführt oder in der Gegenwart von einem geeigneten organischen Lösemittel unter basischen Reaktionsbedingungen. Geeignete Basen beinhalten alkalische Hydroxide wie beispielsweise Natrium- oder Kaliumhydroxid, alkalische Carbonate wie Natrium- oder Kaliumcarbonat, Ammoniak oder Ammoniumhydroxid und dergleichen. Die Reaktion wird im Allgemeinen bei Umgebungs- oder erhöhten Temperaturen in dem Bereich von etwa 80°C bis 150°C unter einer inerten Atmosphäre wie Stickstoff oder Argon durchgeführt.
  • Schema B
    Figure 00140002
  • Schema B zeigt einen weiteren Zugang zur Synthese der 3-Aminoindol-Derivate 3, was 5 Schritte einschließt, beginnend mit der substituierten 2-Aminobenzoesäure 4. In diesem Verfahren wird zuerst in den Schritten B1 und B2 die Carboxylgruppe zu der Nitrilgruppe umgewandelt.
  • Jegliche der Prozeduren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, solche Umwandlungen zu fördern, kann eingesetzt werden. Somit wird zum Beispiel in Schritt B1 von Schema B die substituierte 2-Aminobenzoesäure 4 mit aktivierenden Resten wie N-Hydroxysuccinimid in der Gegenwart von einem geeigneten dehydrierenden Reagenz in einem geeigneten organischen Lösemittel behandelt. Das aktivierte Carbonsäure-Derivat wird dann mit einem Amin wie zum Beispiel tert-Butylamin umgesetzt, um das Benzamid-Derivat 5 zu bilden. Geeignete dehydratisierende Reagenzien schließen Dicyclocarbodiimid, Cyanurchlorid und dergleichen ein. Die Reaktion kann bei Umgebungs- oder Subumgebungs-Temperaturen, zum Beispiel bei –20°C bis 25°C durchgeführt werden.
  • In Schritt B2, Schema B, wird das in Schritt B1 gebildete Benzamid 5 weiter umgesetzt, um das Benzonitril-Derivat 6 zu bilden. Im Allgemeinen kann dies durch Umsetzen des Benzamids 5 mit einem geeigneten Carbonsäureanhydrid, wie zum Beispiel Trifluoressigsäureanhydrid bewirkt werden, um das Benzonitril-Derivat 6 zu bilden. Die Reaktion kann in diesem Schritt in einem geeigneten organischen Lösemittel wie Dichlormethan bei Umgebungs- bis Subumgebungs-Temperatur, bevorzugt bei ungefähr 0°C durchgeführt werden.
  • In Schritt B3, Schema B, wird das Benzonitril-Derivat 6 weiter mit einem erwünschten α-Halocarbonsäureester 7 in der Gegenwart von einer geeigneten Base in einem organischen Lösemittel wie beispielsweise DMF umgesetzt. Geeignete Basen schließen Alkalihydride wie Natriumhydrid oder Alkylalkali-Verbindungen wie Butyllithium und dergleichen ein. Die Reaktion wird im Allgemeinen in einer inerten Atmosphäre, wie Stickstoff oder Argon, und bei Subumgebungs-Temperaturen, wie zum Beispiel 0°C durchgeführt, es können jedoch auch Umgebungs- bis oberhalb der Umgebungstemperatur liegende Reaktions-Temperaturen verwendet werden.
  • In Schritt B4, Schema B wird das Additionsprodukt 8 aus Schritt B3 in der Gegenwart einer Base unter inerten Reaktionsbedingungen typischerweise bei Subumgebungs-Temperaturen wie 0°C cyclisiert. Jede Base, die wirksam ist, die Cyclisierungsreaktion durchzuführen, kann eingesetzt werden und solche Beispiele schließen Alkalihydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, Alkalicarbonate wie Natrium- oder Kaliumcarbonat, alkalische Alkoxide wie Kalium-tert-butoxid, Ammoniak oder Ammoniumhydroxid und dergleichen ein. Insbesondere ist Kalium-tert-butoxid bevorzugt.
  • Schließlich wird in Schritt B5, Schema B, die startende Indolverbindung 3 durch Abspalten der Trifluoracetyl-Gruppe an der Aminogruppe von der Indolverbindung 8 hergestellt. Diese Spaltung kann durch die Verwendung von irgendeiner der auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bewirkt werden. Zum Beispiel kann die Spaltung durch Behandeln des Produktes 8 aus B4 mit einer Base wie Kaliumcarbonat bei Umgebungstemperatur oder Reaktionstemperaturen oberhalb der Umgebung bewirkt werden; eine Temperatur in dem Bereich von 50 bis 80°C ist besonders bevorzugt. Schema C
    Figure 00160001
  • Schema C veranschaulicht eine Synthese von einem bestimmten Typ des substituierten 3-Aminoindol-Derivates 3A, in welchem der Substituent an dem Indolring Phenyl ist. Verschiedene andere Mono- oder Diaryl-substituierte 3-Aminoindol-Derivate können durch Folgen der Schritte von Schema C synthetisiert werden. In Schritt C1, Schema C, wird die Aminogruppe von dem 2-Amino-4-chlorbenzonitril 9A mit einer Acetylgruppe durch die Behandlung mit Essigsäureanhydrid geschützt. Verschiedene andere schützende Gruppen können in einer ähnlichen Art und Weise eingesetzt werden. In Schritt C2, Schema C, wird die geschützte Aminoverbindung 6A unter Verwendung eines Phenylierungsreagenzes wie Phenylborsäure in der Gegenwart von einem Übergangsmetall-Katalysator wie Palladiumacetat phenyliert. In Schritt C3, Schema C, wird die phenylierte Verbindung 6B mit einem α-Halocarbonsäureester unter Verwendung der Prozeduren ähnlich zu jenen, die für die Schritte B3 und B4 von Schema B beschrieben wurden, umgesetzt. Interessanterweise kann in diesem Schritt sowohl Addition als auch Cyclisierung in einem einzigen Schritt durchgeführt werden, um das Indol-Derivat 8B zu bilden. Diese Kombination von Reaktionen können typischerweise in der Gegenwart von einer geeigneten Base wie Kalium-tert-butoxid ausgeführt werden. Die Reaktion wird typischerweise in einem organischen Lösemitteln wie NMP, THF oder Mischungen davon bei Temperaturen in dem Bereich von etwa 0°C bis 40°C durchgeführt. Schließlich wird in Schritt C4, Schema C, das Acetylindol-Derivat 8B durch Folgen der Prozeduren von Schritt B5, Schema B, entschützt.
  • Schema D
    Figure 00180001
  • Schema D veranschaulicht eine weitere Variante von der Synthese von den 3-Aminoindol-Derivaten, die in der Synthese der Verbindungen von dieser Erfindung verwendbar sind. Die Schritte D3 bis D5, Schema D, sind ähnlich zu denjenigen, die oben in den Schemata B und C beschrieben wurden. Somit können Syntheseprozeduren, wie die oben beschriebenen, in den Schritten D3 bis D5 verwendet werden. In einigen Fällen braucht die Aminogruppe jedoch nicht geschützt zu werden und kann direkt mit dem gewünschten α-Halocarbonsäureester umgesetzt werden, um das 3-Aminoindol-Derivat 3 zu bilden, wobei den Schritten D1 und D2 in Schema D gefolgt wird. Demzufolge kann in Schritt D1, Schema D, die Reaktion durch Behandeln des substituierten 2-Aminobenzonitrils 9 mit α-Halocarbonsäureester in der Gegenwart von einer geeigneten Base wie Kalium- oder Natriumcarbonat durchgeführt werden, um das Produkt 10 zu bilden, welches anschließend zu der Indolverbindung 3 in der Gegenwart einer Base wie Kalium-tert-butoxid cyclisiert wird.
  • Schema E
    Figure 00190001
  • Schema E veranschaulicht die Herstellung von verschiedenen Indolverbindungen von dieser Erfindung. In Schritt E1, Schema E, wird das 3-Aminoindol-Derivat 3, welches gemäß einem von den Schemata A bis D wie hierin beschrieben hergestellt wurde, mit einer geeigneten Halo-substituierten R3-Verbindung in der Gegenwart von einem geeigneten organischen Lösemittel, wie in der US-Patentschrift Nr. 5,328,920 beschrieben, umgesetzt. Die Reaktion wird typischerweise bei Umgebungs- bis oberhalb der Umgebungstemperatur liegenden Temperaturbedingungen durchgeführt, typischerweise in dem Temperaturbereich von 20°C bis 150°C. Schema E ist insbesondere geeignet für die Herstellung von Verbindungen von dem Verfahren dieser Erfindung, wobei R2 C1-6-Alkyl oder C1-6-Perfluoralkyl ist; C1-4-Alkyl sind bevorzugt, Ethyl oder t-Butyl sind mehr bevorzugt.
  • Schema F
    Figure 00190002
  • Schema F zeigt verschiedene andere synthetische Zugänge zu der Herstellung von den Verbindungen dieser Erfindung. Zusammengefasst stellt Schema F zwei Methoden für die Herstellung von verschiedenen Verbindungen dieser Erfindung durch Umesterungsreaktionen dar. Jede von den anderen bekannten Umesterungsreaktionen kann für die Herstellung von diesen Verbindungen verwendet werden. Schließlich veranschaulicht Schema F, in Schritt F8, auch die Herstellung von N-substituierten Indolen.
  • In Schritt F1, Schema F, werden die Carbonsäureester, bevorzugt die Alkylester der Indolderivate 11 unter Verwendung einer geeigneten Base wie Kaliumhydroxid hydrolysiert, um das korrespondierende Salz 12 zu bilden. Typischerweise ist die Hydrolyse in einem wässrigen Medium, alkoholischen Medium oder einer Mischung davon ausgeführt. Die Reaktion wird im Allgemeinen bei Umgebungstemperatur oder oberhalb davon durchgeführt, typischerweise in dem Temperaturbereich von etwa 25°C bis 80°C.
  • In Schritt F2, Schema F, wird das Kaliumsalz 12, das so in Schritt F1, Schema F, hergestellt wurde, mit einer geeigneten Halogenverbindung umgesetzt, um die gewünschte umgeesterte Indolverbindung 11A herzustellen, die in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet wurde. Die Reaktion wird typischerweise in einem polaren oder in einem nicht-polaren nichtwässrigen Lösemittel durchgeführt. Geeignete Lösemittel beinhalten ätherische Lösemittel wie zum Beispiel Tetrahydrofuran oder polare Lösemittel wie Dimethylformamid (DMF). Die Reaktion kann bei Umgebungstemperatur oder oberhalb davon durchgeführt werden, typischerweise ist eine Temperatur in dem Bereich von 30°C bis 100°C bevorzugt. Die Reaktion kann auch in der Gegenwart von einem Katalysator wie Kaliumiodid durchgeführt werden.
  • Die Schritte F3 und F4 von Schema F stellen eine alter native Methode für die Herstellung von der umgeesterten Indolverbindung 11A von dieser Erfindung dar. In Schritt F3, Schema F, wird das Esterderivat von einer Indolverbindung 11 unter sauren Reaktionsbedingungen unter Reaktionstemperaturen von Umgebungs-, Subumgebungs-Temperaturen oder oberhalb der Umgebungstemperatur hydrolysiert, um die freie Säure des Carbonsäure-Derivates 13 zu bilden. Geeignete saure Katalysatoren schließen Mineralsäuren wie Salzsäure oder Schwefelsäure, organische Sulfonsäuren wie Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure oder para-Toluolsulfonsäure und Carbonsäuren wie Essigsäuren oder Trifluoressigsäure und dergleichen ein. Feste saure Katalysatoren wie zum Beispiel H-ZSM-5 können auch eingesetzt werden. Typische Reaktionstemperaturen sind in dem Bereich von etwa 0°C bis 50°C.
  • In Schritt F4, Schema F, wird das Carbonsäurederivat 13, hergestellt in Schritt F3, Schema F, verestert, um die gewünschte Indolverbindung 11A dieser Erfindung zu erhalten. Die Bedingungen für die Veresterungsreaktion werden abhängig von dem Ester, der gebildet wird, verändert. Solche Variationen in den Reaktionsbedingungen werden bereitwillig durch den Fachmann gewürdigt.
  • Zum Beispiel wird die Veresterungsreaktion unter essentiell neutralen Bedingungen in der Gegenwart eines Carbonsäure-aktivierenden Reagenzes durchgeführt, wobei das resultierende Produkt einen hydrolytisch zugänglichen Rest enthält. Wahlweise kann die Veresterung jedoch in der Gegenwart von einer gehinderten Base wie Diethylisopropylamin durchgeführt werden. Geeignete Reagenzien zur Aktivierung der Veresterung schließen Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) oder Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorphosphat (PYBOP) ein. Die Reaktion wird typischerweise in einem polaren Lösemittel wie 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP) oder DMF durchgeführt. Die Reaktion wird im Allgemeinen bei Subumgebungs- bis Umgebungstemperatur durchgeführt, d. h. in dem Temperaturbereich von etwa –20°C bis 25°C.
  • Alternativ kann in Schritt F4, Schema F, die Veresterungsreaktion auch unter milden basischen Bedingungen in der Gegenwart von einem geeigneten Katalysator durchgeführt werden. Eine geeignete Base schließt Cäsiumcarbonat oder Kaliumcarbonat ein. Fakultative Katalysatoren schließen Kaliumiodid ein. Die Reaktion wird typischerweise in einem Temperaturbereich von etwa 40°C bis 80°C durchgeführt.
  • In noch einem alternativen Zugang, veranschaulichen in Schema F, die Schritte F5 und F7 eine weitere Methode für die Herstellung der Indolverbindung 11A dieser Erfindung. In Schritt F5, Schema F, wird das Carbonsäurederivat zuerst verestert, um das Pentafluorphenylester-Derivat 14 zu bilden. Die Reaktion wird typischerweise in der Gegenwart von einer organischen Base wie Pyridin und Pentafluorphenyltrifluoracetat als dem veresternden Reagenz durchgeführt. Die Reaktion wird typischerweise bei Umgebungstemperaturen wie zum Beispiel 20°C bis 30°C durchgeführt.
  • In Schritt F7, Schema F, wird der Pentafluorphenylester mit dem gewünschten veresternden Reagenz umgesetzt, um die gewünschte Indolverbindung 11A in der Gegenwart von einer Base wie Natriumhydroxid zu bilden. Typische Lösemittel, die für diese Reaktion geeignet sind, schließen NMP oder DMF ein. Die Reaktion wird im Allgemeinen bei Subumgebungstemperaturen durchgeführt, typischerweise in dem Bereich von etwa –20°C bis 0°C.
  • In Schritt F8, Schema F, wird die Indolverbindung 11A an dem 1-Stickstoff mit einer R-Restgruppe wie hierin definiert substituiert, um die gewünschte Indolverbindung 15 zu bilden. Jede der bekannten N-Substitutionsreaktionen kann für diesen Zweck eingesetzt werden.
  • Spezifisch, die N-Alkylierung kann durch Umsetzen der unsubstituierten Indolverbindung mit einem geeigneten Alkylierungsreagenz wie Iodalkan oder Alkylsulfat durchgeführt werden. Spezifische Beispiele solcher Alkylierungsreagenzien schließen Iodmethan, Iodethan, Dimethylsulfat, Diethylsulfat, Methyltriflat und dergleichen ein. Die Reaktion wird typischerweise in der Gegenwart von einer Base wie Kalium-tert-butoxid bei etwa 0°C in einem geeigneten polaren Lösemittel wie DMF durchgeführt.
  • Schema G
    Figure 00230001
  • Schema G veranschaulicht ein weiteres bevorzugtes Verfahren für die Herstellung von einer Vielzahl von Indolverbindungen von dieser Erfindung. In Schritt G1, Schema G, wird das gewünschte substituierte 2-Aminobenzonitril mit einem α-Halogencarbonsäureester, wie beispielsweise Ethylbromacetat, in der Gegenwart von einer geeigneten Base wie Natriumbicarbonat und in der Gegenwart von einem Katalysator wie Natriumiodid in einem geeigneten organischen Lösemittel wie Ethanol umgesetzt. Die Reaktion wird im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von etwa 60°C bis 120°C durchgeführt.
  • Höher siedende Lösemittel können eingesetzt werden, wenn höhere Reaktionstemperaturen wünschenswert sind. Im Allgemeinen beschleunigen höhere Temperaturen die Reaktionsgeschwindigkeiten, womit kürzere Reaktionszeiten benötigt werden.
  • In Schritt G2, Schema G, wird die N-substituierte Benzonitrilverbindung 10 einer Zyklisierungsreaktion in der Gegenwart von einer geeigneten Base wie Kalium-tert-butoxid in Lösemitteln wie THF unter einer inerten Atmosphäre, wie zum Beispiel Stickstoff, unterworfen. Typischerweise wird die Reaktionstemperatur bei oder unterhalb der Umgebungstemperaturen gehalten, d. h. bei etwa 25°C durch Kühlen der Reaktionsmischung mit einem geeigneten Kühlungsmittel wie Eis. Das resultierende substituierte Indolderivat 3 wird isoliert.
  • In Schritt G3, Schema G, wird das substituierte Indolderivat 3 einer N-Substitutionsreaktion unterworfen, wie in Schema E beschrieben. Dies kann typischerweise durch Umsetzen des Indolderivats 3 mit einer geeigneten Halogenverbindung wie 4-Chlorpyridin bewirkt werden, um die korrespondierende Pyridinylamino-Verbindung 11 zu bilden. Diese Substitutionsreaktion wird typischerweise in einem geeigneten organischen Lösemittel wie NMP durchgeführt. Die Reaktion wird typischerweise bei erhöhten Temperaturen durchgeführt, im Allgemeinen in dem Bereich von etwa 80°C bis 120°C.
  • In Schritt G4, Schema G, wird die N-substituierte Verbindung 11 hydrolysiert, um das Kaliumsalz der Indolverbindung 12 zu bilden. Dieser Schritt ist ähnlich zu dem, der oben in Schritt F1 von Schema F beschrieben wurde. Die Hydrolyse wird bevorzugt unter Verwendung von Kaliumhydroxid in Ethanol als Lösemittel durchgeführt.
  • In Schritt G5, Schema G, wird das Kaliumsalz 11 mit einer geeigneten Säure wie Salzsäure behandelt, um die freie Carbonsäure 13 bei Umgebungsreaktionstemperaturen herzustellen.
  • Schema H
    Figure 00250001
  • Schema H zeigt zwei Prozeduren für die Herstellung von den Benzo(b)thiophen-Verbindungen 16 und 17 (Vergleichsverbindungen). Die substituierte Ausgangssubstanz 3-Aminobenzo(b)thiophen 15 kann durch verschiedenartige Methoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel beschreibt, wie oben erwähnt, die US-Patentschrift Nr. 5,328,920 ein paar solcher Prozeduren.
  • In Schritt H1, Schema H, wird das substituierte 3-Aminobenzo(b)thiophen 15 mit einer geeigneten Base wie Lithiumdiisopropylamid umgesetzt, um ein in situ-Anion der Verbindung 15 zu generieren. Diese Reaktion wird typischerweise bei Reaktionstemperaturen unterhalb der Umgebungstemperatur allgemein bei ungefähr –120°C bis 0°C durchgeführt. Die Reaktion wird auch in einer inerten Atmosphäre wie Stickstoff und in einem nicht-polaren Lösemittel wie etherhaltigen Lösemitteln einschließlich Diethylether, THF, Alkanlösemitteln einschließlich Heptan, Hexan usw. und aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Ethylbenzol oder Kombinationen davon durchgeführt. Das Anion von Verbindung 15, was so in diesem Schritt gebildet wurde, wird dann mit jedem gewünschten Ester von Carbonsäuren einschließlich Dialkylcarbonaten wie Diethylcarbonat umgesetzt. Dies führt zu Verbindung 16.
  • Alternativ wird in Schritt H2, Schema H, die Verbindung 15 mit einer geeigneten Base wie beispielsweise Alkyllithium umgesetzt, um das Anion zu erzeugen, welches dann mit Kohlendioxid umgesetzt wird, um die freie Carbonsäureverbindung 17 zu bilden. Das Anion von Verbindung 15 wird typischerweise bei Reaktionsbedingungen unterhalb der Umgebungstemperatur wie oben beschrieben gebildet und dann mit Trockeneis, d. h. der festen Form von Kohlendioxid, umgesetzt.
  • Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein oder mehr Verbindungen gemäß dieser Erfindung in Zusammenhang mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger umfassen. Bevorzugt sind diese Zusammensetzungen in Einheitsdosisformen wie Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Granulaten, sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen, Dosieraerosole oder flüssigen Sprays, Tropfen, Ampullen, Auto-Injektionsvorrichtungen oder Zäpfchen für die orale, parenterale, intranasale, sublinguale oder rektale Verabreichung oder für die Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation. Alternativ können die Zusammensetzungen in einer Form präsentiert werden für die Verabreichung einmal in der Woche oder einmal im Monat, zum Beispiel kann ein unlösliches Salz von der aktiven Verbindung wie beispielsweise das Decanoat-Salz, angepasst werden, um eine Depotpräparation für die intramuskuläre Injektion bereitzustellen. Ein erodierbares Polymer, das die aktiven Inhaltsstoffe enthält, kann in Betracht kommen. Für die Herstellung fester Zusammenstellungen wie Tabletten, wird der prinzipielle aktive Inhaltsstoff mit einem pharmazeutischen Träger gemischt, z. B. konventionellen Tabletteninhaltsstoffen wie Maisstärke, Laktose, Saccharose, Sorbitol, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat oder Gummi, und anderen pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, z. B. Wasser, um eine feste Vorformulierung der Zusammensetzung zu bilden, die eine homogene Mischung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes davon enthält. Wenn sich auf diese Vorformulierungs-Zusammensetzungen als homogen bezogen wird, so bedeutet das, dass der aktive Inhaltsstoff gleichmäßig durch die ganze Zusammensetzung verteilt ist, sodass die Zusammensetzung leicht in gleich wirksame Einheitsdosisformen wie Tabletten, Pillen und Kapseln unterteilt werden kann. Diese feste Vorformulierungs-Zusammensetzung wird dann in Einheitsdosisformen von dem oben beschriebenen Typ unterteilt, die von 0,1 bis etwa 500 mg von dem aktiven Inhaltsstoff der vorliegenden Erfindung enthalten. Mit einem Geschmacksstoff versehene Einheitsdosisformen enthalten von 1 bis 100 mg, zum Beispiel 1, 2, 5, 10, 25, 50 oder 100 mg, von dem aktiven Inhaltsstoff. Die Tabletten oder Pillen von der neuartigen Zusammensetzung können überzogen sein oder anderweitig kompoundiert, um eine Dosierungsform bereitzustellen, die den Vorteil der verlängerten Wirkung hervorbringt. Zum Beispiel kann die Tablette oder Pille eine innere Dosis- und eine äußere Dosiskomponente umfassen, wobei die letztere in der Form einer Umhüllung über der vorherigen vorliegt. Die zwei Komponenten können durch eine magensaftresistente Schicht getrennt sein, welche dazu dient, dem Zerfall im Magen zu widerstehen und gestattet es der inneren Komponente intakt in das Duodenum zu gelangen oder in der Freisetzung verzögert zu sein. Eine Vielzahl von Materialien können für solche magensaftresistenten Schichten und Überzüge verwendet werden, solche Materialien schließen eine Anzahl von Polymersäuren und Mischungen von Polymersäuren mit Materialien wie Schellack, Cetylalkohol und Celluloseacetat ein.
  • Die flüssigen Formen, in welche die neuartigen Zusam mensetzungen der vorliegenden Erfindung für die orale Verabreichung oder der Verabreichung durch Injektion eingebaut sein können, schließen wässrige Lösungen, geeignete mit Geschmacksstoffen versetzte Sirupe, wässrige oder ölige Suspensionen und mit Geschmacksstoffen versetzte Emulsionen mit essbaren Ölen wie Baumwollsamenöl, Sesamöl, Kokosnussöl oder Erdnussöl, sowie Elixiere und ähnliche pharmazeutische Hilfsstoffe ein. Geeignete dispergierende oder suspendierende Reagenzien für wässrige Suspensionen schließen synthetische und natürliche Gummi wie Traganth-Gummi, Acacia, Alginat, Dextran, Natrium-Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon oder Gelatine ein.
  • Die bevorzugte Verabreichung von der pharmazeutischen Zusammensetzung dieser Erfindung ist durch eine intranasale Route. Jede der bekannten Methoden zur Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen durch eine intranasale Route kann verwendet werden, um die Zusammensetzung dieser Erfindung zu verabreichen.
  • In der Behandlung von verschiedenen Krankheitsstadien wie hierin beschrieben, ist ein geeignetes Dosislevel etwa 0,01 bis 250 mg/kg pro Tag, vorzugsweise etwa 0,05 bis 100 mg/kg pro Tag und insbesondere etwa 0,05 bis 20 mg/kg pro Tag. Die Verbindungen können mit einem Regimen von 1 bis 4 mal pro Tag verabreicht werden.
  • Biologische Beispiele:
  • Die folgenden Testprotokolle werden verwendet, um die biologischen Eigenschaften von den Verbindungen abzusichern.
  • Die erste Methode beinhaltet das Hinzufügen der Verbindung zu einer Zelle, die einen Vektor enthält, der mindestens 100 zusammenhängende Nukleotide von einem menschlichen Interleukin-4-Promotor umfasst, der funktionsmäßig mit einem Gen verbunden ist, das ein nachweisbares Protein kodiert, unter Bedingungen, welche die Expression des nachweisbaren Proteins zulassen, und das Nachweisen des nachweisbaren Proteins.
  • Geeignete nachweisbare Proteine schließen Proteine ein, die durch Standardlabortechniken wie Anfärbemethoden gemessen werden können, zum Beispiel β-Galaktosidase, Immunoassays wie solche, die FLAG-markierte Proteine, lumineszente Proteine, wie Luciferase oder GFP einschließen.
  • Die relative Menge des nachweisbaren Proteins kann direkt bestimmt werden wie durch Verwendung von Standardlabortechniken, die geeignet sind für das nachweisbare Protein, zum Beispiel durch Immunchemie oder Lumineszenz. Alternativ kann die relative Menge von dem nachweisbaren Protein indirekt bestimmt werden durch Messen der mRNA- oder cDNA-Mengen, die dem nachweisbaren Protein entsprechen.
  • Es wird bevorzugt, dass die Zelle, die in der vorliegenden Methode verwendet wird, nicht das nachweisbare Protein endogen exprimiert. In einer alternativen Ausführungsform können jedoch die Testbedingungen derart verändert werden, dass das endogene Protein nicht exprimiert wird, wenn die Verbindung zu der Zelle hinzugefügt wird.
  • Es wird bevorzugt, dass Zellen, die in der vorliegenden Methode verwendet werden, in der Lage sind, unter Zellkulturbedingungen kultiviert zu werden. Handelsübliche Quellen für geeignete Zellen sind gut bekannt und schließen American Type Culture Collection (ATCC) und andere Händler ein. Beispiele für geeignete Zellen schließen Standardkulturzellen wie Ovarzellen des Goldhamsters (CHO), Lymphozyten, T-Zellen, naive T-Zellen, Th1-Zellen, Th2-Zellen, Makrophagen oder andere Zellen ein, die von dem Immunsystem erhalten wurden. Im allgemeinen sind menschliche Zellen bevorzugt. Primäre Zellen können auch in dem vorliegenden Verfahren ver wendet werden.
  • Die Verwendung von Säugetierzellen wird bevorzugt in dem Aufbau von Tests zur Identifizierung von Verbindungen, die in der Lage sind, ein oder mehrere Th2-Cytokine zu modulieren. Die Verwendung von Primatenzellen wird eher bevorzugt in solchen Tests und die Verwendung von menschlichen Zellen wird insbesondere in solchen Tests bevorzugt.
  • Zellen können von jedem Gewebe des Körpers abstammen, aber es wird im Allgemeinen bevorzugt, dass die Zellen aus dem Immunsystem stammen, wie Lymphozyten, T-Zellen, naive T-Zellen, Th1-Zellen, Th2-Zellen, Makrophagen oder andere Zellen, die aus dem Immunsystem stammen.
  • Das nachweisbare Protein kann ein direkt messbares oder nachweisbares Protein sein, wie oben beschrieben, zum Beispiel β-Galaktosidase, FLAG-markierte Proteine, Luciferase oder GFP. Wahlweise kann das nachweisbare Protein indirekt messbar sein, wie beispielsweise ein Protein, das einen Signalweg initiiert, wobei diese Initiierung nachweisbar ist. Ein Beispiel für das letztere ist ein Transkriptionsfaktor, dessen Expression die nachweisbare Hoch- oder Herunterregulation der Transkription von einem zweiten Gen erlaubt. Ein indirekt messbares nachweisbares Protein kann eine Änderung in dem Phänotyp beinhalten, zum Beispiel Apoptose.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Level des nachweisbaren Proteins mit dem Level des nachweisbaren Proteins in der Abwesenheit der Verbindung verglichen.
  • In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung wird der Level des nachweisbaren Proteins mit dem Level des nachweisbaren Proteins in der Gegenwart der Verbindung verglichen. Referenzverbindungen können bekannte Modulatoren von einem Th2-Cytokin sein wie beispielsweise Cyclosporin-A, FK-506 und Rapamycin usw., oder können vorher unbekannte Modulatoren von einem Th2-Cytokin sein.
  • Die Th2-Cytokine in der vorliegenden Erfindung sind IL-4, IL-5 und IL-13.
  • In den nachfolgenden biologischen Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
    • Al(OH)3
    Aluminiumhydroxid
    Anti-DNP
    Anti-Dinitrophenyl-Antikörper
    Anti-OVA
    Anti-Ovalbumin-Antikörper
    BALF
    Bronchoalveoläre Waschflüssigkeit
    CsA
    Cyclosporin-A
    DMSO
    Dimethylsulfoxid
    DNP-KLH
    Dinitrophenyl-Keyhole Limpet Hämocyanin
    ED50
    Mittlere wirksame Dosis
    ELISA
    Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest
    GFP
    Grün fluoreszierendes Protein
    IC50
    Inhibitorische Konzentration, 50%
    IFN-γ
    Interferon-gamma
    IgE
    Immunglobulin E
    IgG1
    Immunglobulin G1
    IgG2a
    Immunglobulin G2a
    IL-4
    Interleukin-4
    IL-5
    Interleukin-5
    IL-I3
    Interleukin-13
    i.n.
    Intranasal
    i.p.
    Intraperitoneal
    i.v.
    Intravenös
    LD50
    Mittlere tödliche Dosis
    NY-1
    Eine NY-Th1 genannte Th1-Zelllinie
    NY-2
    Eine NY-Th2 genannte Th2-Zelllinie
    PC400
    Post-Carbacholkonzentration, die SRL 400% über den Ausgangswert erhöht
    p.o.
    Durch den Mund (per os)
    PHA
    Phytohaemagglutinin
    RL
    Widerstand in der Lunge (pulmonal)
    SD
    Standardabweichung
    SE
    Standardfehler
    SEM
    Mittlerer Standardfehler
    STAT-6
    Signalvermittler und Transkriptionsaktivator-6
    SRL
    Spezifischer Widerstand in der Lunge
    s.c.
    Subkutan
    Th
    T-Helferzellen
    Th1
    T-Helferzellen-1
    Th2
    T-Helferzellen-2
  • IL-4 Luciferasetest in Jurkat Zellen
  • Ein IL-4 Luciferasetest kann verwendet werden, um nach Verbindungen zu suchen, welche die Höhe der IL-4 Transkription modulieren. Einige Luciferasetests sind entwickelt worden, um Verbindungen zu überprüfen, die in der transkriptionellen Modulation von dem Gen wirksam sind und somit den Level des Proteins beeinflussen, das durch das Gen, welches durch die Zelle exprimiert wird, kodiert wird. Zum Beispiel wird eine transkriptionelle Testmethode verwendet, um zu zeigen, dass ein 11 Basenpaar langes DNA-Sequenzmotif an dem menschlichen IL-4 Gen beteiligt ist, das für die T-Zell-aktivierenden Signale verantwortlich ist, siehe Abe, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1992), 89, 2864–2868. Es ist auch durch Überprüfen einer Expressionsbibliothek von Jurkat T-Zellen und der Isolierung einer cDNA, die NF-IL-6 kodiert, gezeigt worden, dass der Nukleäre Faktor-IL-6 (NF-IL-6) an der transkriptionellen Aktivierung von dem menschlichen IL-4 Promotor in T-Zellen beteiligt ist, siehe Davydov, I. V., et al., J. Immunol., (1995), 155(11), 5273–5279.
  • Der Beitrag zu der T-Zell-spezifischen Expression durch andere Promotorstellen ist in einem transienten Expressionstest mit IL-13 Promotor-Konstrukten, die mit einem Luciferasegen verbunden sind, überprüft worden, die sich anfänglich auf die Core-binding-factor-(CBF) Stelle richteten, die nach der in vivo T-Zellaktivierung prägend ist, siehe Taylor, D. S., et al., J. Biol. Chem. (1996), 271(14), 14020–14027. Es ist kürzlich berichtet worden, dass der menschliche IL-4 Promotor in multiplen Allelformen existiert, die unterschiedliche Transkriptionsaktivitäten in IL-4-positiven Zellen aufweisen, siehe Song, Z. et al., J. Immunol., (1996), 156(2), 424–429. Erst ganz kürzlich offenbarten die US-Patenschriften Nr. 5,863,733 und 5,976,793 Verfahren zur transkriptionellen Modulation der Genexpression und der Entdeckung von Chemikalien, die als Genexpressionsmodulatoren wirken können.
  • Isolation des menschlichen IL-4 Promotors:
  • Ein 6,7 kb Fragment, das die Nukleotide –6635 bis +66 von dem IL-4 Promotor (4, SEQ ID NO:1) umfasst, wurde von einer menschlichen genomischen P-1 Bibliothek, Klon F0178, erhalten von BIOS Laboratories (New Hauen, CT), unter Verwendung einer IL-4 spezifischen, 5'-Ende ausgerichteten Sonde isoliert (Arai et al., J. of Immunol., (1989), 142, 274–282). Das Promotorkonstrukt wurde durch Ligieren von zwei EcoRI-Restriktionsfragmenten von 5,5, beziehungsweise 1,2 KB erzeugt. Eine HindIII-Restriktionsstelle wurde an dem 3'-Ende von dem 1,2 KB EcoRI-Fragment angefügt und in eine ähnliche Stelle auf der multiplen Klonierungsregion von pGL3Neo kloniert. Ähnlich wurde eine XhoI-Restriktionsstelle an dem 5'-Ende von dem 5,5 KB EcoRI-Fragment angefügt und in die XhoI-Stelle von pGL3Neo kloniert. Das IL-4 Promotorkonstrukt wurde durch Sequenzieren nachgeprüft.
  • Jurkat-Zellen werden in RPMI 1640, Gibco/BRL, Katalog Nr: 11875-093; 10% FBS Gibco/BRL, Katalog Nr:16000-096; 1% Antibiotika/Antimykotika, Gibco/BRL, Katalog Nr:15240-096) wachsen gelassen und mit der oben angeführten DNA transfiziert, wobei dem Protokoll beschrieben bei Staynov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1995), 92, 3606–3610, gefolgt wird und gegen 800 μg/ml G418 (Geneticin, Gibco/BRL, Katalog Nr:10131-035) selektiert. Die monoklonalen Linien 1F7, F8 und C5 werden von der stabil transfizierten polyklonalen Population durch die limitierende Verdünnungsmethode erhalten und für den Test verwendet. Die monoklonalen Zelllinien werden in dem oben beschriebenen Medium in der Gegenwart von 400 μg/ml G418 kultiviert.
  • Die IL-4 6,7-Luc monoklonalen Zelllinien, die bei 100.000 Zellen/ml ausgesät wurden, werden in 150 cm belüfteten T-Flaschen für zwei Tage wachsen lassen. Die Zellen werden geerntet, in frischem Medium resuspendiert und bei einer Dichte von 50.000 Zellen/Vertiefung in einem Volumen von 120 μl ausplattiert und für 16 Stunden wachsen lassen. Die Testverbindungen werden zu der Kultur in Replikaten von 3 oder 4 in einem 15-μL Volumen hinzugefügt (in DMSO, Endkonzentration von 0,5%). Typischerweise werden die Dosis-Wirkungs-Kurven durch Verwendung von drei (10, 1 und 0,1 μM) oder fünf Konzentrationen (10, 1, 0,1, 0,01 und 0,001 μM) erzeugt. Die Kulturen werden dann mit 50 ng/ml Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA, Sigma, Katalog-Nr. P-8139) und 1,0 μM Calciumionophor (A23187, Sigma, Katalog-Nr. C-7522) in 25 μL Medium für 8 Stunden stimuliert. Der Stimulationsprozess wird durch die Zugabe von 50 μL 1 × Lysispuffer (25 mM Tris Phosphat, pH 7,8, 2,0 mM DTT, 2,0 mM EDTA, 100 ml/L Glycerol, 1,0% Triton X-100 (v/v)) beendet. Die Zellen werden in der Gegenwart von Lysispuffer für 5 Minuten inkubiert und hoch und runter pipettiert, 5x, um die vollständige Lyse sicherzustellen. Ein 100-μl Aliquot von dem Zelllysat wird in weiße Luminometerplatten (Dynatech) transferiert und auf Luciferaseaktivität mit einem Dynatech Luminometer untersucht. Das Substrat, Luciferase-Reagenz (470 μM Luciferin, 530 μM ATP, 270 μM Coenzyme A und 33,3 mM DTT) wird in 2 × Luciferase-Testpuffer (20 mM Tricin, 1,07 mM (MgCO3)4Mg(OH)2·5H2O, 2,67 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,8) aufgelöst.
  • Alle experimentellen Platten enthielten nicht-induzierte und induzierte Kontrollvertiefungen. Zusätzlich wird CsA (Cyclosporin A, Sigma Katalog-Nr.: C-3662) bei Konzentrationen von 1, 0,3, 0,1, 0,03 & 0,01 μM auf den Platten als eine positive Kontrolle einbezogen.
  • ANALYSE DER ERGEBNISSE: Eine fünf- bis sechs-fache Induktion (bestimmt durch das Verhältnis von stimuliert zu nicht-stimuliert) wird in den 6,7 IL-4 Luc-Zellen beobachtet. Die durch den Test erzeugten Ergebnisse werden in Prozent Aktivität ausgedrückt.
    Figure 00350001
  • Der primäre Test maß die Wirkungen von der Fähigkeit einer Verbindung, die Menge von einem Reportergen, Luciferase, zu modulieren, das an einen menschlichen IL-4 Promotor gekoppelt in eine menschliche Jurkat-Zelllinie transfiziert wurde. Durch die Verwendung von diesem Test wurden 250 positive Verbindungen gefunden, die in der Lage waren, die Mengen an IL-4 zu modulieren.
  • Zusätzliche Tests können verwendet werden, um ferner die Fähigkeit der Verbindung zu charakterisieren, andere Th2-Cytokine, zum Beispiel IL-13, zu modulieren oder alternativ die Fähigkeit zu charakterisieren, Th1-Cytokine, zum Beispiel IFN-γ zu modulieren.
  • In Tabelle 1 werden die Wirkungen von der Verbindung der vorliegenden Erfindung auf die Genexpression von Jurkat-Zellen, die mit IL-4, IL-13 und IFN-γ transfiziert sind dargestellt. Tabelle 1 (Vergleichend) Inhibierung der IL-4 und IL-13 Genexpression in einer Jurkat-Zelllinie durch die Verbindung der vorliegenden Erfindung
    Verbindung 6,7-IL-4-Luc (% Kontrolle) 2,1-IL-13-Luc (% Kontrolle) 2,7-IFN-γ-Luc (% Kontrolle)
    3-(4-Pyridinyl-amino-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) 62 ± 29 50 ± 12 100 ± 15
    CsA (IC50 μM) 0,06 ± 0,01 0,06 ± 0,001 0,06 ± 0,001
  • IFN-γ Luc Test:
  • Das Fragment des menschlichen IFN-γ Promotorfragmentes, das die Nukleotide –3218 bis +128 umfasst, wurde in pGL3NEO (SstI/HindIII) kloniert, um IFN-γ Luc zu ergeben. Die Jurkat-Zellen (gewachsen in RPMI 1640, 10% FBS, 1% Antibiotika/Antimykotika) wurden mit der obigen DNA transfiziert (Protokoll beschrieben bei Staynov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1995), 92, 3606–3610) und gegen 800 μg/ml G418 (Geneticin) selektiert. Die monoklonalen Linien wurden von den stabil transfizierten polyklonalen Populationen erhalten und für den Test verwendet. Die monoklonalen Zelllinien werden in dem oben beschriebenen Medium in der Gegenwart von 400 μg/ml G418 kultiviert.
  • Jurkat-Zellen, die 2,3IFN-γ Luc enthalten (monoklonale Linien) wurden bei einer Dichte von 50.000 Zellen in 120 μl pro Vertiefung ausplattiert und für 16 Stunden wachsen lassen. Die Kulturen wurden dann mit 10 ng/ml Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) und 1,0 μM Calciumionophor A23187 in 10 μl Medium für 8 Stunden stimuliert. Der Stimulationsprozess wurde durch die Zugabe von 50 μl 1 × Lysispuffer (25 mM Tris-Phosphat, pH 7,8, 2,0 mM DTT, 2 mM EDTA, 100 ml/L Glycerol, 1,0% Triton X-100 (v/v)) beendet. Die Zellen wurden in der Gegenwart von Lysispuffer für 5 Minuten inkubiert und hoch und runter pipettiert, 5x, um die vollständige Lyse sicherzustellen. Ein 100-μl Aliquot von dem Zelllysat wurde in weiße Luminometerplatten (Dynatech) transferiert und auf Luciferaseaktivität mit einem Dynatech Luminometer untersucht. Das Substrat, Luciferase-Reagenz (7,1 mg Luciferin, 14,6 mg ATP, 10,4 mg Coenzyme A und 250 mg DTT) wurde in 2x Luciferase-Testpuffer (14,33 g Tricin, 2,07 g (MgCO3)4Mg(OH)2·5H2O, 2,63 g MgSO4, 0,15 g EDTA, in 2 L Wasser und der pH-Wert wurde auf pH 7,8 eingestellt) aufgelöst.
  • Um diesen Test für das Überprüfen auf Agonisten oder Antagonisten von einer chemischen Bibliothek zu verwenden, wurden gewünschte Dosen von einer Verbindung direkt zusammen mit der PMA/A23187-Mischung hinzugefügt.
  • Eine mehr als zwanzigfache Induktion (bestimmt durch das Verhältnis von stimuliert zu nicht-stimuliert) wurde in den IFN-γ Luc-Zellen beobachtet. Die Ergebnisse von dem HTPS werden als Prozent der Kontrolle bei gegebenen Konzentrationen (nämlich 0,1 μM, 1 μM, 10 μM) dargestellt.
    • LITERATURVERZEICHNIS: Staynov, D. Z., Cousins, D. J., und Lee, T. K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1995), 92, 3606–3610.
  • IL-13 Luc Test
  • Das menschliche IL-13 Promotorfragment, das die Nukleotide –2154 bis +53 umfasst (wie bei Dulganov et al., Blond, (1996), 87, 3316–3326 beschrieben) wurde in pGL3NEO (KpNI/HindIII) kloniert, um 2,1IL-13 Luc zu ergeben. Jurkat cells wurden in RPMI 1640, 10% FBS, 1% Antibiotikum/Antimykotikum) wachsen lassen, mit der obigen DNA transfiziert (Protokoll beschrieben durch Staynov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1995), 92, 3606–3610) und gegen 800 μg/ml G418 (Geneticin) selektiert. Monoklonale Linien wurden durch die stabil transfizierte polyklonale Population erhalten und für den Test verwendet. Die monoklonalen Zelllinien wurden in dem oben beschriebenen Medium in der Gegenwart von 400 μg/ml G418 kultiviert.
  • Jurkat-Zellen, die 2,1IL-13 Luc enthalten (monoklonale Linien) wurden bei einer Dichte von 50.000 Zellen in 120 μl pro Vertiefung ausplattiert und für 16 Stunden wachsen lassen. Die Kulturen wurden dann mit 10 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) und 1,0 μM Calciumionophor A23187 in 10 μL Medium für 8 Stunden stimuliert. Der Stimulationsprozess wurde durch die Zugabe von 50 μl 1 × Lysispuffer (25 mM Tris-Phosphat, pH 7,8, 2,0 mM Dithiothreitol (DTT), 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 100 ml/L Glycerol, 1,0% Triton X-100 (v/v)) beendet. Die Zellen wurden in der Gegenwart von Lysispuffer für 5 Minuten inkubiert und hoch und runter pipettiert, 5 ×, um die vollständige Lyse sicherzustellen. Ein 100-μl Aliquot von dem Zelllysat wurde in weiße Luminometerplatten (Dynatech) transferiert und auf Luciferaseaktivität mit einem Dynatech Luminometer untersucht. Das Substrat, Luciferase-Reagenz (7,1 mg Luciferin, 14,6 mg ATP, 10,4 mg Coenzyme A und 250 mg DTT) wurde in 2 × Luciferase-Testpuffer (14,33 g Tricin, 2,07 g (MgCO3)4Mg(OH)2·5H2O, 2,63 g MgSO4, 0,15 g EDTA, in 2 L Wasser und der pH-Wert wurde auf pH 7,8 eingestellt) aufgelöst.
  • Um diesen Test für das Überprüfen auf Agonisten oder Antagonisten von einer chemischen Bibliothek zu verwenden, wurden gewünschte Dosen von einer Verbindung direkt zusammen mit der PMA/A23187-Mischung hinzugefügt.
  • Eine mehr als fünfzehnfache Induktion (bestimmt durch das Verhältnis von stimuliert zu nicht-stimuliert) wurde in den IL-13 Luc-Zellen beobachtet. Die Ergebnisse von dem Hochdurchsatz-Screening (HTPS) werden als Prozent der Kontrolle bei gegebenen Konzentrationen (nämlich 0,1 μM, 1 μM, 10 μM) dargestellt.
    • LITERATURVERZEICHNIS: Staynov, D. Z., Cousins, D. J., und Lee, T. K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1995), 92, 3606–3610.
  • Die zweite Methode bezieht das Hinzufügen der Verbindung zu einer primären menschlichen Zelle ein, die nachweisbare Cytokine, insbesondere IL-4 Protein unter Bedingungen sezerniert, welche die Expression von dem nachweisbaren Protein zulassen und das Nachweisen des nachweisbaren Proteins.
  • Erzeugung und Verwendung von menschlichen primären Th1- und Th2-Zellen:
  • Die hierin beschriebenen Methoden erlauben die Polarisation von primären humanen peripheren Blutzellen zu Th1- und Th2-Zellen und der Erzeugung von ausreichend großen Mengen von Th1- und Th2-Zellen, z. B. Milliarden von Zellen, um das Drug-Screening zu ermöglichen. In Kürze, CD4+CD45RA+ T-Zellen, isoliert von peripheren mononuklearen Spenderblutzellen von gesunden Spendern, wurden in der Gegenwart von Anti-CD3/CD28-Antikörpern und verschiedenen Wachstumsfaktoren herangezogen, um entweder einen Th1-artigen oder Th2-artigen Phänotyp zu erhalten, wie durch die bekannten Cytokinprofile von diesen beiden Zelltypen bestimmt. Primäre menschliche Th1-Zellen sezernierten INF-γ und IL-2 Cytokine, während primäre menschliche Th2-Zellen IL-4, IL-5, IL-13 und basale Mengen an INF-γ sezernierten, die durch den enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA) messbar sind.
  • Erzeugung und Erhaltung von Th1- und Th2-Zelllinien aus menschlichem Blut:
  • Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden aus menschlichem Blut über Ficoll-Hypacque (Pharmacia) präpariert. Die Zellen werden zweimal in Hank's physiologischer Salzlösung (HBSS) gewaschen und gezählt.
  • Naive T-Zellen (CD4+/CD45RA) werden durch die negative Selektionsmethode unter Verwendung der folgenden Antiköper und von Dynabeads präpariert. Anti-CD8-, Anti- HLA-DR- (wobei HLA menschliches Leukozyten-Antigen bedeutet), Anti-CD14-, Anti-CD16-, Anti-CD19- und Anti-CD45RO-Antikörper (alle von R & D Systems, 1–2 μg/ml) wurden zu den Zellen hinzugefügt und die Zellen wurden für 30 Minuten auf Eis gehalten. Danach werden die Zellen zweimal in HBSS gewaschen und Ziege-anti-Maus Ig-Beads (Bead:Antigen-Verhältnis 5:1) werden hinzugefügt. Die Zellen und die Beads werden bei 4°C für 20 Minuten rotiert (dem Protokoll folgend, das von Dynal geliefert wurde). Der Überstand wird entfernt und frische Ziege-Anti-Maus Beads werden zu dem Überstand hinzugefügt, der langsam bei 4°C für 20 Minuten rotiert wird. Die Zellen werden gezählt und phänotypisch mittels Durchflusszytometrie-Analyse gekennzeichnet. Typischerweise beträgt die Reinheit der CD4+/CD45RA+ nach der negativen Selektion 96%. Die Kontamination mit CD8+-, CD14+-, CD16+-, CD19+- und CD45RO+-Zellen war unterhalb feststellbarer Mengen (< 0,1%).
  • Erzeugung von Th1-/Th2-Zellen:
  • Vierundzwanzig-Well-Platten werden mit 300 μL Anti-CD3 Antikörper (10 μg/ml, in PBS 1–2 Std. bei 37°C oder über Nacht bei 4°C) beschichtet und zweimal mit PBS gewaschen. Es werden CD4+/CD45RA+-Zellen bei einer Dichte von 106/ml in RPMI präpariert und zu RPMI-Medium, dass 10% Hyclone-Serum/Glutamin und 1–2 μg/ml Anti-CD28 Antikörper enthält, hinzugefügt. Die Zellen werden in zwei Aliquote unterteilt. Für Th1-Zellen: Anti IL-4 Antikörper (1–2 μg/ml) und IFN-γ (1 mg/ml, oder 5000 Einheiten/ml) werden zu den Vertiefungen hinzugefügt. Für Th2-Zellen: IL-4 (100–200 ng/ml), Anti-IFN-γ neutralisierender Antikörper (1–2 μg/ml) und Anti-IL-12 neutralisierender Antikörper (1–2 μg/ml) werden zu den Vertiefungen hinzugefügt. Die Zellen werden für 2–3 Tage bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden in frische Vertiefungen überführt und mit 200 Einheiten/ml IL-2 für 2 Wochen und Füttern an jedem zweiten Tag mit IL-2-haltigen Medium und Splitten der Kulturen im Verhältnis 1:2 oder 1:3, wie es benötigt wird, wachsen lassen. Der Grad der Polarisation wird bestimmt durch intrazelluläres Anfärben der Zellen mit Anti-IFN-γ und Anti-IL-4 Antikörpern von Pharmingen und unter Verwendung der Durchflusszytometrie von Becton Dickinson (BD), gemäß den Beschreibungen der Hersteller. Die Zellen werden mit PHA und Alloantigenen bei Tag 14 und 28, wie nachfolgend beschrieben, stimuliert. Acht Tage nach der zweiten Allostimulation können die Zellen für das Verbindungs-Screening verwendet oder für weitere Verwendung eingefroren werden. Zum Testen der Verbindungen werden große Mengen von Th1- und Th2-Zellen, die von einem Donor (NY-Th1 und NY-Th2) expandiert und als Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Zellen werden aufgetaut und kultiviert, wie und wann sie benötigt werden. Die aufgetauten Zellen werden mit Alloantigen/PHA-Kombination stimuliert. Die Zellen werden zum Screening der Verbindungen nach 8–10 Tagen in Kultur verwendet.
  • Restimulation durch allogene Zellen:
  • Menschliche PBMCs, die als Alloantigene verwendet werden sollen, werden aus frisch entnommenen Blut durch Ficoll-Trennung isoliert. Die Zellen werden in Medium, das 50 μg/ml Mitomycin-C enthält, resuspendiert und für 40 Minuten bei 37°C inkubiert und danach extensiv gewaschen, um alles von dem Mitomycin-C zu entfernen. Die Zellen werden gezählt und auf eine Endkonzentration von 2 × 106/ml mit Medium verdünnt, das 10 μg/ml PHA und 200 Einheiten/ml IL-2 enthält. Th1- oder Th2-Zellen (3 × 105 Zellen/ml) werden mit den obigen PBMC in einem 1:1-Verhältnis in 24-Well Platten gemischt und bei 37°C inkubiert. Die so gebildeten Zellen können für das Testen der Verbindungen typischerweise nach 8 bis 10 Tagen verwendet werden.
  • Testen der Verbindungen:
  • Sechsundneunzig-Well Falcon Gewebekulturplatten (Fisher Scientific) werden mit 100 μl pro Vertiefung (Well) von 10 μg/ml Anti-CD3 Antikörper (PharMingen) in Phosphatgepufferter Salzlösung beschichtet und bei 4°C einen Tag vor dem Experiment gelagert.
  • An dem Testtag werden die Anti-CD3 Antikörper-beschichteten Platten einmal mit PBS gewaschen, um allen löslichen Anti-CD3 Antikörper zu entfernen. Die T-Zellen werden zentrifugiert und mit RPMI 1640 Zellkulturmedium (Gibco) ohne IL-2 gewaschen, gezählt und bei einer Endkonzentration von 1 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Stammlösungen der Verbindungen von dieser Erfindung (Konzentration 10 mM) werden auf eine Endkonzentration von 10 μM in 0,1% DMSO (Dimethylsulfoxid) verdünnt und unter Verwendung 3-facher Verdünnungen über 7 Reihen für IC50-Bestimmungen titriert. Alle Verbindungen und Kontrollen werden in Triplikaten getestet. Die Kontrollvertiefungen bestehen aus 0,25% Ethanol, 0,1% DMSO, Anti-CD3- und Anti-CD28-stimulierten Zellen (dienen als positive Kontrolle) oder unstimulierten Zellen (als negative Kontrollen) in Triplikaten. Cyclosporin A (CsA) in Ethanol (bei 1 μM Konzentration), titriert über 7 Reihen, ist als eine Plattenkontrolle innerhalb der ersten Platte von jedem Test eingeschlossen. 1 μg/ml von Anti-CD28 Antikörper (R & D Systems) wird als ein Co-Stimulus zu allen Vertiefungen hinzugefügt und 100 Mikroliter mit 1 × 105 Zellen werden in jede Vertiefung pipettiert.
  • Die Zellen werden bei 37°C unter einer 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Nach 48 Stunden werden die Überstände zum Testen mit ELISA entfernt. Prozent der Kontrolle wird gemessen durch Subtrahieren des Hintergrundes von der mittleren OD der Triplikate und wird verglichen mit der mittleren OD von Kontrollen minus dem Hintergrund, d. h. (x OD Verbindung – Hintergrund)/(x OD Kontrollen – Hintergrund) X 100 IL-5 (PharMingen), IL-4 (R & D Systems), IL-13 (R & D Systems) und IFN-γ (R & D Systems) werden durch ELISA-Kits gemessen und die Ergebnisse als % Kontrolle angegeben. Nach 48 Stunden wird mit den verbliebenen Zellen ein „Lebensfähigkeits-Test" unter Verwendung eines nicht-radioaktiven MTS-Testkits, erworben von Promega, durchgeführt. Da lebensfähige Zellen fortfahren zu proliferieren, sind die Ergebnisse als „Proliferation" in den Tabellen angegeben. (Toxische Verbindungen inhibierten die Proliferation von Th-Zellen).
  • In Tabelle 2 sind die Wirkungen von einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure, auf menschliche primäre Th2-Zellen dargestellt. Th2-Zellen werden mit Anti-CD3 und Anti-CD28 Antikörpern, wie in dem Methodenabschnitt beschrieben, in der Abwesenheit oder der Anwesenheit von den Verbindungen dieser Erfindung aktiviert. Die Überstände werden für Cytokinmessungen durch Standard-ELISA 48 Stunden nach der Stimulation gesammelt. Die Zellzahlen werden mittels des MTS-Testkits (Promega) durch Inkubieren der verbliebenen Zellen für weitere 20 Stunden bestimmt. Die Standardabweichungen der Triplikatkulturen sind angegeben. Tabelle 2 (Vergleichend) Wirkungen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) auf die Cytokin-Expression und die Proliferation von menschlichen Th2-Zellen
    Proliferation (% Kontrolle) IL-5 (% Kontrolle) IL-4 (% Kontrolle) IFN-γ (% Kontrolle) IL-13 (% Kontrolle)
    μM Mittelwert SD Mittelwert SD Mittelwert SD Mittelwert SD Mittelwert SD
    10 71,55 0,07 53,90 3,96 30,80 4,95 75,00 10,32 68,40 4,10
    3 72,05 0,64 70,40 0,00 36,40 0,00 83,50 7,07 73,40 0,71
    1 77,25 1,06 70,70 2,12 42,55 2,90 89,25 5,30 75,15 1,77
    0,3 80,60 3,68 70,80 7,21 45,00 0,00 92,10 2,26 80,60 0,00
    0,1 86,70 1,84 78,60 5,37 59,75 1,77 91,75 0,21 82,30 0,85
    0,03 85,05 6,86 85,20 0,00 65,30 0,00 91,60 2,97 86,40 0,00
    0,01 89,50 8,34 102,45 3,46 102,15 3,61 96,90 1,70 91,05 1,91
  • In Tabelle 3 werden die kombinierten Daten von 10 verschiedenen Experimenten dargestellt. Die Th2-Zellen werden wie oben beschrieben aktiviert. Die Standardabweichungen waren geringer als 15% und wurden daher nicht eingeschlossen. Als Kontrolle wurde CsA, ein nichtselektiver Cytokin-Inhibitor verwendet. Die Verbindung dieser Erfindung 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure inhibierte selektiv IL-4, aber nicht IFN-γ und die Zellproliferation. Tabelle 3 (Vergleichend) Zusammenfassung der Wirkungen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) auf die menschlichen Th2-Zellen
    Menschliche primäre Th2-Zellen behandelt mit: IL-4 IC50 (μm) IL-13 IC50 (μm) IL-5 IC50 (μm) IFN-γ IC50 (μm Prol. IC50 (μm IFN-γ/IL-4 Verhältnis
    3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsqäure (n = 10) 0,24 ≈10 ≅10 >10 >10 >41
    Cyclosporin A (CsA) (n = 25) 0,006 0,008 0,008 0,008 1,0
  • In Tabelle 4 ist die Wirkung von einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure, auf menschliche primäre NYTh1-Zellen dargestellt. NYTh1-Zellen werden mit Anti-CD3 und Anti-CD28, wie in den Tabellen 1 und 2 beschrieben, aktiviert. Die Daten aus 8 unterschiedlichen Experimenten, von denen alle 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure verwendeten, werden kombiniert. Die Standardabweichungen waren geringer als 15% und wurden daher nicht eingeschlossen. CsA, ein nicht-spezifisches immunsuppressives Arzneimittel, wurde als Kontrolle verwendet. Diese Experimente demonstrieren, dass eine Verbindung dieser Erfindung keine Wirkung auf Th1-Zellen aufwies. Tabelle 4 (Vergleichend) Zusammenfassung der Wirkungen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) auf die menschlichen Th1-Zellen
    Menschliche primäre Th1-Zellen behandelt mit IFN-γ IC50 (μM) Proliferation IC50 (μM) IFN-γ/IL-4 Verhältnis
    3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (n = 8) >10 >10 –
    Cyclosporin A 0,006 0,005 1,0
  • In Tabelle 5 ist die Wirkung von einigen nahen Analogen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure auf menschliche primäre Th2-Zellen dargestellt. Th2-Zellen werden mit Anti-CD3 und Anti-CD28 Antikörpern, wie in dem Methodenabschnitt beschrieben, in der Abwesenheit oder der Anwesenheit von einigen Verbindungen dieser Erfindung aktiviert und die Ergebnisse sind als IC50 in μM angegeben. Die Standardabweichungen waren geringer als 15% und wurden daher nicht eingeschlossen. Wie ersichtlich ist, inhibieren verschiedene Verbindungen der vorliegenden Erfindung selektiv die Expression von IL-4 und weisen ein ähnliches Selektivitätsprofil auf wie das von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure. Tabelle 5 (Vergleichend) Zusammenfassung der Aktivität und des Selektions profils von den Verbindungen der vorliegenden Erfindung
    IL-4 IC50 Prolif. IC50 IL-5 IC50 IFN-γ IC50 IL-13 IC50
    Verbindung # μM μM μM μM μM
    Beispiel 11 >10 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 24A 2,0 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 28 (Maleatsalz) 0,24 >10 >10 >10 ~10
    Beispiel 76 4,0 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 77 3,6 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 78 0,3 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 79 5,0 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 80 6,0 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 81 6,0 >10 7,0 9,5 >10
    Beispiel 82 0,15 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 83 1,0 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 84 1,0 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 85 0,9 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 86 1,0 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 87 0,6 >10 2,0 >10 >10
    Beispiel 88 2,5 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 89 2,5 4,0 8 >10 >10
    Beispiel 90 1,0 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 91 1,0 >10 >10 >10 >10
    Beispiel 92 0,45 >10 >10 >10 >10
  • In Tabelle 6 ist die Wirkung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure auf das Fließgleichgewicht des IL-4 mRNA-Spiegels dargestellt. Menschliche Th2-Zellen werden mit Anti-CD3 und Anti-CD28 Antikörpern (wie in den Methoden beschrieben) in der Gegenwart einer Lösung von 10 μM 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure oder 100 nM Cyclosporin A (CsA) für 18 Stunden aktiviert. Die RNA der geernteten Zellen wurde isoliert und durch Taqman auf IL-4 Boten untersucht. Die GAPDH-Boten wurde als interner Standard zur Normalisierung verwendet. Die Prozentwerte der Aktivität wurden berechnet durch Behandeln der Werte für die nicht mit Arzneimittel behandelten, die Anti-CD3- und die Anti-CD28-stimulierten Th2-Zellen als 100%. Tabelle 6 fasst die Daten von zwei unabhängigen Experimenten zusammen.
  • In dem zweiten Experiment werden auch die IL-4 Proteinspiegel durch Standard-ELISA in den Kulturüberständen, wie früher beschrieben, bestimmt. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure die IL-4 mRNA in primären menschlichen T-Zellen hemmt. Tabelle 6 (Vergleichend) Test auf IL-4 Transkription in menschlichen Th2-Zellen
    Behandlung von menschlichen primären Th2-Zellen für 18 Std. RNA Exp #1 RNA Exp #2 IL-4 PROTEIN Exp #2
    % Aktivität % Aktivität pg/ml
    Unstimuliert 6 24 3,2 +/– 0,0
    Stimuliert: CD3/CD28 100 100 625,0 +/– 23
    Stimuliert: CD3/CD28 + 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) 44 45 286,2 +/– 19
    Stimuliert: CD3/CD28+ Cyclosporin A 12 ND ND
    • ND – nicht bestimmt.
  • Ein dritter Test, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, schloss einen in vitro Toxizitäts-Test ein. Dieser Test wird zur weiteren Charakterisierung der Verbindungen verwendet, um die toxischen Aktivitäten der Verbindungen auf Kontakt-inhibierte, nicht-teilende 3T3-Fibroblasten festzustellen. Andere Toxizitäts-Tests können verwendet werden.
  • Jede Verbindung, die 3T3-Fibroblastenzellen abtötete, wurde von weiteren Studien ausgeschlossen.
  • Kontakt-inhibierte Swiss 3T3-Fibroblasten wurden von ATCC bezogen. Die Zellen werden in 1640 RPMI gehalten, das mit 10% fötalem Rinderserum (Gibco) ergänzt ist.
  • An dem Testtag werden die Zellen von den Flaschen durch Trypsinierung abgelöst, in Medium gewaschen und gezählt. 100 Mikroliter von 2,5 × 104 Zellen pro Vertiefung werden auf Falcon 96-Well Gewebekulturplatten ausplattiert und die Zellen bei 37°C in der Gegenwart von 5% CO2 für 2 Tage oder bis sie konfluent sind inkubiert.
  • An Tag 2 von dem Test werden 75 Mikroliter Medium zu jeder Vertiefung hinzugefügt und 25 μL der Testverbindungen werden bei Konzentrationen, die von 10 bis 0,01 μM reichen, hinzugefügt. Alle Verdünnungen der Verbindungen werden in Triplikaten getestet. Die Kontrollen schließen 10 μM Methotrexat (Sigma), 10 μM Actinomycin D (Sigma) und 10 μM Cyclosporin A (Sigma) ein. Die Zellen werden für 2 Tage in den Inkubator zurückgestellt.
  • Nach 2 Tagen Inkubation werden die 3T3-Zellen auf Lebensfähigkeit unter Verwendung eines MTS-Testkits (Promega) untersucht. Medien werden zu leeren Vertiefungen zur Berechnung des Hintergrundes hinzugefügt. Nach 2 Stunden Inkubation in den Reagenzien des Kits wird die optische Dichte bei 490 nm für jede Verbindung und Kontrolle mittels eines Plattenlesegerätes bestimmt.
  • Die Ergebnisse werden als Prozent Cytotoxizität wiedergegeben, d. h. (OD-Mittelwert der Verbindungsvertiefungen – OD Hintergrund)/(OD-Mittelwert der Kontrollen – OD Hintergrund).
  • Arzneimittel, die klinisch verwendet werden, können als Kontrolle in diesem Test verwendet werden und schließen Arzneimittel ein, von denen erwartet wird, dass sie keine Wirkung auf 3T3-Zellen aufweisen, zum Beispiel, Steroide, Cyclosporin A, Methotrexat usw. oder Arzneimittel, die bekannte toxische Wirkungen aufweisen, zum Beispiel Actinomycin D.
  • In Tabelle 7 sind die Wirkungen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure und bestimmten bekannten Standard-Verbindungen auf die Lebensfähigkeit von ruhenden 3T3-Zellen dargestellt. Wie erwartet war Actinomycin D die einzige Verbindung, welche die Lebensfähigkeit von sich nicht-teilenden Zellen beeinflusste. Es ist zu beachten, dass die Startkonzentration von CsA 1 μM war. 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure wies keine toxischen Wirkungen auf diese Zellen auf. (Verschiedene andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls negativ in diesem Test). Tabelle 7 (Vergleichend) Fehlen der in vitro Zytotoxizität von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28)
    Verbindungen μM Medium % Kontrolle Beispiel 28 % Kontrolle Actinomycin D % Kontrolle Methotrexat % Kontrolle Dexamethason % Kontrolle Cyclosporin A % Kontrolle
    10 100 99,1 16,8 92,4 60,5 99,8
    3 100 109,7 29,7 93,8 60,7 103,0
    0,1 100 110,7 28,2 98,9 64,2 104,0
    0,03 100 111,1 33,9 100,0 67,8 105,0
    0,01 100 111,8 67,2 102,8 71,6 105,5
    0,003 100 1116,3 74,9 105,2 77,9 114,4
    0,001 100 124,0 79,0 113,2 100,0 121,0
  • IN VIVO EXPERIMENTE
  • Immunologische in vivo Tests oder Krankheitsmodelle können auch verwendet werden, um die Fähigkeit einer Verbindung zu charakterisieren, die Spiegel von Th2-Cytokinen zu modulieren. Solche Tests sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und zahlreiche Protokolle sind veröffentlicht worden. Das Folgende sind Beispiele von in vivo Tests, die verwendet werden können, um ferner die Fähigkeit einer Verbindung zu charakterisieren, die Spiegel von Th2-Cytokinen zu modulieren und somit die Wirksamkeit der IL-4 Inhibierung zu demonstrieren.
  • Sofern nichts anderes angegeben ist, wurde in allen von den folgenden in vivo Experimenten ein Maleatsalz von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) verwendet.
  • In vivo Ovalbumin-(OVA) Mausmodell:
  • Diese Modell ist ausgelegt, die Fähigkeit von einem Testgegenstand zu bestimmen, eine Antigen-induzierte pulmonale Ansammlung von Entzündungszellen in sensibilisierten Balb/c-Mäusen von Charles River Laboratories zu modulieren. Den Mäusen wird eine Zeitspanne von zwei Wochen von dem Ankunftsdatum bis zur Sensibilisierung zugestanden.
  • Sensibilisierungen und Belastung
  • An den Tagen 0, 7, 14 wird jedes Tier intraperitoneal (i.p.) mit einer 0,2 ml Ovalbumin-Hydragel-Lösung injiziert. Jedes Tier erhält 10 μg Ovalbumin in 0,2 ml Hydragel, einem Aluminiumhydroxid adsorptiven Gel, das 2% Aluminiumoxid enthält. An Tag 21 werden die Tiere mit den Testverbindungen 30–60 Minuten vor der Aerosol-Belastung mit 5% Ovalbumin dosiert. An Tag 22 werden BALF-Proben von einer Gruppe von Tieren gesammelt und für die Cytokin-Analyse verwendet. An Tag 24 werden BALF-Proben von einer zweiten Gruppe von Tieren erhalten und für die differentielle Zellzählung verwendet.
  • Methoden und experimenteller Aufbau
  • Test-System: Weibliche Balb/cJ-Mäuse (Jackson Laboratories), ungefähr 6–9 Wochen alt, wobei jede ungefähr 20 bis 25 Gramm wiegt, werden in 10 Tiere pro Gruppe unterteilt.
  • Akklimatisierung/Quarantäne: Nach der Ankunft der Mäuse, werden die Tiere auf ihre allgemeine Gesundheit hin durch ein Mitglied der tierärztlichen Belegschaft oder einen geeigneten Beauftragten beurteilt. Vor den Experimenten werden die Tiere für ein Minimum von 7 Tagen gehalten, um sie an die Laborumgebung zu akklimatisieren und sie hinsichtlich der Entwicklung von ansteckenden Erkrankungen zu beobachten. Irgendwelche Tiere, die als unannehmbar für die Verwendung in dieser Studie erachtet wurden, wurden durch Tiere mit ähnlichem Alter und Gewicht von demselben Anbieter ersetzt.
  • Tierhaltung: Alle Tiere (Gruppe oder Einzeltier) wurden in Übereinstimmung mit den USDA-Richtlinien beherbergt. Die Tierraumumgebung wird kontrolliert mit den festgesetzten Bedingungen: Temperatur 18 bis 26°C, relative Luftfeuchtigkeit 30% bis 70%, 12 Stunden künstlicher Hell-Dunkelzyklus. Die Temperaturen und die relative Luftfeuchtigkeit wurden täglich überwacht.
  • Alle Tiere haben Zugang zu Harlan Teklad Rodent Diet®, ad libitum, oder irgendeinem anderen annehmbaren Laborfutter, werden täglich kontrolliert und je nach Notwendigkeit hinzugefügt oder ersetzt. Die Futteranlagen sind so angelegt, dass sie Verschmutzung, Zuführungsverstopfung und Verstreuen vermindern. Wasser wird den Tieren ad libitum bereitgestellt.
  • Sensibilisierungs-Regime: Die Mäuse werden durch eine intraperitoneale Injektion von 10 μg Ovalbumin (OVA), gemischt in einer 4 mg Aluminiumhydroxid Al(OH)3 Gelsuspension in 0,2 ml steriler Salzlösung an den Tagen 0, 7 und 14 sensibilisiert. Diese Suspension wird eine Stunde vor der intraperitonealen Injektion in jede Maus hergestellt. Die Tiere sind für die OVA-Belastung an Tag 21 bereit.
  • Antigen-Belastung: Die Tiere werden an Tag 21 aerosolisiertem OVA (5% w/v in steriler Salzlösung) für 20 Minuten ausgesetzt. Das Aerosol wird durch einen PARI-Master Vernebler erzeugt, wobei der Auslass mit einer kleinen Plexiglas®-Kammer verbunden ist, welche die Tiere enthält. Die Bronchoalveolar-Waschung wird an Tag 22 durchgeführt.
  • Methode der Studiendurchführung: An Tag 24, 72 Stunden nach der OVA-Aerosol Belastung, wird eine separate Gruppe von Tieren mit Urethan (0,15–0,2 g/kg) anästhesiert und die Luftröhre freigelegt und kannuliert. Die Lungen werden gewaschen mit 2 × 0,5 ml Hank's physiologischer Salzlösung, ohne Ca2+ und Mg2+ (HBSS; Gibco, Grand Island, NY), die 0,1% EDTA enthält. Die Waschflüssigkeit wird nach 30 Sekunden durch behutsame Aspiration zurückgeholt und für jedes Tier vereinigt. Die Proben werden bei 2.000 min–1 für 15 Minuten bei 5°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden die individuellen Überstände bei –80°C gefroren gelagert. Das resultierende Pellet wird in 0,5 ml HBSS, die 0,1% EDTA enthält, resuspendiert. Die Gesamtzellen und Eosinophile wurden unter Verwendung von einem Technicon HI, beziehungsweise Cytoslide bestimmt.
  • Verabreichung von dem Test/Kontroll-Gegenstand: Der Testgegenstand und die Trägersubstanz-Dosierungspräparationen wurden einmal jeder anästhesierten Maus intranasal unter Verwendung einer 200-μl Pipette 30–60 Minuten vor der OVA-Belastung verabreicht. Jedes Tier erhält 50 μl (25 μl/Nasenloch) bei jedem Zeitpunkt. Methode der Euthanasie: Urethan-Überdosis bis zur Beendigung des Lebens.
  • Statistische Analyse: Die Gesamtzell- und Eosinophilenzahl von verschiedenen Behandlungsgruppen wird verglichen unter Verwendung von ANOVA, gefolgt von einem Multiple Comparison Test.
  • Die Ergebnisse der Mausexperimente sind in Tabelle 8 dargestellt. Die Verbindungen wurden 30 Minuten vor der Ovalbumin-Aerosol-Belastung an OVA-sensibilisierte Mäuse verabreicht. BALF wurde 24 Stunden nach der Aerosol-Belastung geerntet; N = 6/Gruppe. 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure inhibierte signifikant sowohl IL-4 als auch IL-13-Spiegel in den BALF in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Tabelle 8 (Vergleichend) In vivo Allergen-induzierte Lungenentzündung in der Maus, Wirkung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) auf Cytokine der bronchoalveolären Waschflüssigkeit (BALF)
    Verbindung Dosis (mg/kg) (intranasal) IL-4 pg/ml (± SEM) IL-13 pg/ml (+ SEM)
    Trägersubstanz - - 1220,4 + 207,7 120,2 ± 19,8
    Cyclosporin A 30 144,4 + 35,7 15,9 ± 2,4
    Beispiel 28 30 123,9 ± 48,7 15,1 ± 7,1
    Beispiel 28 10 414,3 + 115,5 59,9 ± 12,7
    Beispiel 28 3 835,1 + 40,4 ND
    • pg = Pikogramm; ND – nicht bestimmt
  • 1 fasst die Ergebnisse von einem repräsentativen Experiment (von drei) zusammen, in dem zusätzlich zu den BALF-Cytokinen auch die Lungeneosinophilie bestimmt ist. Mäuse (12 Tiere pro Gruppe) werden mit 0,2 ml einer Al(OH)3-Hydrogelsuspension (2% Al(OH)3), die 50 μg/ml Ovalbumin enthält, an den Tagen 0, 7 und 14 sensibilisiert. An Tag 21 werden die Mäuse mit verschiedenen Dosierungshöhen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28), 3, 10 & 30 mg/kg, 30 Minuten vor einer 20-minütigen Belastung mit 5% Ovalbumin (OVA) dosiert. Das Glucocorticosteroid Budesonid (10 mg/kg) ist als eine Kontrolle eingeschlossen.
  • Alle Verbindungen werden in 0,5% Methylcellulose/0,2% Tween-80, intranasal (50 μl) verabreicht. Nach der OVA-Belastung für 24 Stunden waren die Mäuse der Bronchoalveolarwaschung ausgesetzt und die IL-4- und IL-13- Spiegel in den BALF wurden durch ELISA bestimmt. Eine weitere Mäusegruppe wurde der Bronchoalveolarwaschung ausgesetzt (72 Stunden nach der Behandlung), um die Anzahl der Eosinophile zu bestimmen (*p < 0,05, **p < 0,01). Wie in 1 gezeigt, inhibierte 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) signifikant die Allergen-induzierten IL-4- und IL-13-Spiegel in den BALF, mit ED50-Werten von ungefähr 10 mg/kg für jedes Cytokin. Obwohl 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure ein relativ schlechter Inhibitor von IL-13 in vitro ist, inhibierte 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure in vivo IL-13 fast so gut wie IL-4.
  • Tabelle 9 fasst die Wirkungen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) und verschiedenen anderen Verbindungen von dieser Erfindung auf das OVA-induzierte IL-4 und die Eosiniphilie in BALF zusammen. Die Verbindungen (30 mg/kg) werden einmalig intranasal 30 Minuten vor der OVA-Belastung gegeben, wenn nichts anderes erwähnt ist. Die BAL-Flüssigkeiten werden 24 Stunden nach der OVA-Belastung gesammelt und die Cytokinspiegel durch Standard-ELISA gemessen. Von einem parallelen Ansatz an Tieren wird BALF nach 48 Stunden gesammelt und die Anzahl der Eosinophilen wird bestimmt. Verschiedene Salze von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure, einschließlich dem Maleatsalz, dem Methansulfonsäuresalz (EF, Experiment # 146) und dem Kaliumsalz, (ZD, Experiment # 146) werden, wie in Tabelle 9 zusammengefasst, getestet. Tabelle 9 (Vergleichend) In vivo Allergen-induzierte Lungenentzündung in der Maus: Zusammenfassung der in vivo-Wirkungen von verschiedenen Salzen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28)
    Exp# Verbindung # Route Dosis (mg/kg) IL-4 Ktrl. bei 24 Std. Eos % Ktrl. bei 72 Std.
    109 Beispiel 24A (Maleatsalz) i.n. 30 3 8
    130 Beispiel 24A (Maleatsalz) i.p. 12 50
    140 Beispiel 28 (Maleatsalz) i.n. 12 50 Nicht gemacht
    146 Beispiel 28 (Maleatsal) i.n. 10 57 53
    146 Beispiel 28 (Maleatsalz) i.n. 30 34 28
    146 Beispiel 28-EF i.n. 30 27 42
    146 Beispiel 28-ZD i.n. 30 49,6 37,4
    115 Beispiel 28 (Maleatsalz) i.p. 30 43 Nicht gemacht
    109 Beispiel 90 i.n. 30 37 71
    • i.n. = intranasal; i.p. = intraperitoneal; und p.o. = per os (durch den Mund)
  • Tabelle 10 fasst die Wirkungen von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure auf OVA-induziertes IgE in Mäusen zusammen. Weibliche Mäuse (5–8 Wochen alt, Balb/c, Charles River) wurden in dieser Studie verwendet. Ovalbumin (Sigma) wurde an Aluminum Hydroxide Adsorptive Gel, Inter, adsorbiert und 10 μg/0,2 ml/Maus intraperitoneal an den Experimenttagen 0 und 7 injiziert. Dexamethason (Sigma) und 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) waren in 10% HPCD (Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Aldrich) gelöst. Dexamethason (10 mg/kg), 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) (3 und 10 mg/kg) und 10% HPCD (0,2 ml/Maus) werden einmal pro Tag von Tag 6 bis Tag 14 intraperitoneal in Mäuse injiziert. Diese werden an Tag 15 geblutet. Serum-Ovalbumin-spezifische IgE-Spiegel werden bestimmt durch einen Standard-ELISA unter Verwendung eines Ziege-Anti-Maus IgE Antikörpers, der mit alkalischer Phosphatase markiert ist. Die Anti-OVA Titer wurden durch Herstellen serieller Verdünnungen von Testseren und Vergleichen mit der Trägersubstanz-Kontrolle bestimmt. Tabelle 10 (Vergleichend) Inhibierung der Allergen-spezifischen IgE-Antikörper durch 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) in Mäusen
    Behandlung Anti-OVA IgE SE
    Trägersubstanz 150,8 52,9
    Dexamethason 27,4 9,4
    Beispiel 28 (3 mg/kg) 41,8 8,5
    Example 28 (10 mg/kg) 45,6 15,7
  • Die Wirkung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure auf OVA-induzierte Lungenentzündung wurde auch in Ratten studiert. Das Rattenmodell war sehr ähnlich zu den vorher beschriebenen Mausmodellen. In Kürze, das von Haczku et al. beschriebene Lungenentzündungsmodell wurde mit geringen Veränderungen verwendet (Haczku A., et al., Immunology, (1996), 88, 247–251). Männliche Brown-Norway Ratten, die 160–200 Gramm wiegen, werden mit einer intraperitonealen Injektion von 1 ml einer Suspension, die Ovalbumin (1 mg) und Al(OH)3 (100 mg) enthält, an den Tagen 1, 2 und 3 sensibilisiert. Drei Wochen später werden die Ratten mit dem Trägerstoff oder den Arzneimitteln über intraperitoneale Injektionen behandelt. Eine Stunde später werden die Ratten mit der Ovalbumin-Inhalation (1%ige Lösung, 10 mg/ml in steriler Salzlösung) für 20 Minuten in einer 10-Liter Plexiglas-Kammer, die mit einem DeVilbiss (Ultra-NEB®99) Vernebler bei einem Trägerluftstrom von 1 Liter/Min. verbunden war, belastet.
  • Die Ergebnisse der Dosis-Wirkungs-Studien von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure auf den Eosinophilen-Einstrom in die bronchoalveolare Flüssigkeit von Ovalbumin-sensibilisierten und belasteten Brown-Norway Ratten sind als Säulendiagramme in 2 dargestellt. Einzeldosen von Cyclosporin A (CsA) und Dexamethason (Dex) wurden auch als Referenzstandards eingeschlossen. 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure, verabreicht mit intraperitonealer Injektion, inhibierte den Einstrom von Eosinophilen in einer dosisabhängigen Art und Weise mit ED50 von 10,07 mg/kg.
  • Ein in vivo-Modell der humoralen Immunität in Mäusen.
  • Der Zweck von diesem Test war zu bestimmen, ob IL-4 Inhibitoren eine Wirkung auf die normale Antikörperreaktion aufwiesen, für die bekannt ist, dass sie von den T-Helferzellen abhängig ist, welche die Antikörperproduktion von B-Zellen regulieren. Dieses Modell demonstriert die Wirkung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure auf seine allgemeinen immunsuppressiven Aktivitäten in Mäusen.
  • Es wurden weibliche Balb/c-Mäuse, von denen jede ungefähr 20 bis 25 Gramm wiegt, mit einem Alter von 5 bis 8 Wochen verwendet. Jedes Experiment verwendete 30 Mäuse.
  • Immunisierung der Mäuse:
  • Das Antigen zur Immunisierung ist 2,4-Dinitrophenyl (DNP) oder 2,4,6-Trinitrophenyl (TNP), welches an Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) konjugiert ist. Das Antigen (100 μg/Maus) ist an ein Adjuvant (kolloidales Aluminiumhydroxid) adsorbiert und wird i.p. dem Tier in einem Gesamtvolumen von 0,2–0,3 ml verabreicht. Die hierin beschriebene Methode für die Produktion von Immunreaktionen ist ähnlich zu den Methoden, die durch andere Forscher verwendet wurden (siehe zum Beispiel Wilder, J. A., et al., J. Immunol. (1996), 156, 146–152 und Leenaars et al., Immunology, (1997), 90, 337–343).
  • Protokoll und Verbindungs-Behandlung:
  • Die Tiere werden willkürlich in 5 Gruppen zu je 6 Mäusen aufgeteilt. Gruppe 1 ist eine Positivkontrollgruppe, die Gruppen 2, 3 und 4 sind Testverbindungsgruppen und Gruppe 5 ist eine Trägersubstanz-Kontroll gruppe. Die Verbindungen können durch i.n.-, i.p.-, p.o.-, s.c.-, i.m.- oder i.v.-Verabreichung gegeben werden. Im Allgemeinen werden die Verbindungen dieser Erfindung täglich an die Mäuse verabreicht, beginnend einen oder zwei Tage vor der Immunisierung bis 7 Tage nach der Immunisierung (9–10 mal). An Tag 8 nach der Immunisierung werden die Mäuse durch Herzpunktion unter Anästhesie (Isofluran) geblutet und die Serumproben bei –20°C gelagert, bis sie für die Antikörperanalyse benötigt werden. Die anästhesierten Tiere werden mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital am Ende von dem Experiment euthanasiert. Die statistische Analyse von den Daten wird unter Verwendung von ANOVA durchgeführt.
  • Die Ergebnisse, die in Tabelle 11 dargestellt sind, demonstrieren eine Selektivität für Th2-Cytokine von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure in vivo. Mäuse werden mit einem Hapten-Trägerkonjugat, DNP-KLH, immunisiert und die Anti-DNP Antikörperspiegel werden in einer Isotyp-spezifischen Weise wie oben beschrieben bestimmt. Die Behandlung mit 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure verursachte eine ausgeprägte Verminderung der IgG1 Anti-DNP Antikörperspiegel (teilweise Th2, IL-4-abhängig), aber besaß keine signifikante Wirkung auf IgG2a Antikörperspiegel (Th1, IFN-γ-abhängig). CsA, das bei 10 mg/kg als Kontrolle in dieser Studie verwendet wurde, inhibierte vollständig sowohl IgG2a als auch IgG1 Antikörper. Tabelle 11 (Vergleichend) Unterschiedliche Wirkung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) auf verschiedene Isotypen von Anti-Hapten Antikörpern
    Tier # IgG2a Anti-DNP Antikörper Titer IgG1 Anti-DNP Antikörper Titer
    Trägersubstanz Beispiel 28 Trägersubstanz Beispiel 28
    1 31,40 30,59 123,14 72,42
    2 30,64 38,60 149,30 185,22
    3 38,46 14,09 205,93 19,83
    4 24,21 17,45 236,97 40,19
    5 27,64 30,21 158,70 83,11
    6 – 27,98 132,12 37,83
    Mittelwert 30,47 +/– 26,49 +/– 167,69 +/– 73,10 +/–
    +/– SE 2,37 3,72 18,19 24,38
    Inhibierung – 13% – 56,5%
  • Asthmamodell des Schafs:
  • Das folgende in vivo Modell demonstriert, dass eine Verbindung, die in der Lage ist, ein Th2-Cytokin, spezifisch IL-4, zu modulieren, auch in der Lage ist, die pulmonale Funktion zu verbessern und den pulmonalen Widerstand in vivo zu vermindern. Die folgenden pulmonalen Funktionsstudien werden an Schafen durchgeführt, die allergisch auf Ascaris suum sind, wie kürzlich von Abraham beschrieben (Abraham, W. M., "Sheep Models of Allergic Bronchoconstriction" in "Allergy and Allergic Diseases," Kay, A.B., Hrsg. Blackwell Science – Oxford, (1997), 1045–1055). Für die in dieser Studie verwendeten Schafe sind kürzlich frühe und späte Atemwegsreaktionen und Atemwegs-Überempfindlichkeit gegen Carbachol nach Inhalationsbelastung mit Ascaris suum-Extrakt demonstriert worden. In Kürze, transpulmonaler Druck, pulmonaler Widerstand (RL), spezifischer Lungenwiderstand (SRL), Atemwegs-Hyperreaktivität und Atemwegsempfindlichkeit werden bestimmt.
  • METHODEN
  • Tier-Vorbereitung: Alle Tiere zeigten sowohl frühe als auch späte Atemwegsreaktionen auf die Inhalationsbelastung mit Ascaris suum Antigen. Venöse Blutproben (~5 ml) werden von einer peripheren Beinvene oder der Jugularvene für pharmakokinetische Daten erhalten.
  • Messung der Atemwegsfunktion: Die unsedierten Schafe werden in einem Wagen in der liegenden Position mit ihren Köpfen immobilisiert. Nach topischer Anästhesie von den Nasenwegen mit 2% Lidocainlösung, wird ein Ballonkatheter durch ein Nasenloch in die untere Speiseröhre vorgeschoben. Die Tiere werden mit einem gecufften Endotrachealtubus durch das andere Nasenloch unter Verwendung eines flexiblen, faseroptischen Bronchoskops als Orientierungshilfe intubiert. (Der Cuff des Endotrachealtubus wird nur aufgepumpt für die Messung der Atemwegsfunktion und während der Aerosolbelastung, um unangemessene Beschwerden zu verhindern. Diese Prozedur besitzt keine Wirkung auf die Atemwegsfunktion). Der Pleuraldruck wird mit dem Ösophagus-Ballonkatheter (gefüllt mit einem ml Luft) bewertet, der 5–10 cm von dem gastroösophagealen Übergang positioniert ist. In dieser Position bewegt sich der endexspiratorische Pleuraldruck zwischen –2 und –5 cm H2O. Sobald der Ballon platziert ist, wird er gesichert, sodass er für die Dauer des Experimentes in der Position verbleibt. Der laterale Druck in den Tracheen wird mit einem Seitenloch-Katheter (innerer Durchmesser 2,5 mm) gemessen, der distal zu der Spitze von dem Endotrachealtubus vorgeschoben und positioniert wird. Der transpulmonale Druck, die Differenz zwischen dem trachealen und dem pleuralen Druck, wird mit einem Differenzdruck-Messkathetersystem gemessen. Für die Messung des pulmonalen Widerstandes (RL), wird das proximale Ende des Endotrachealtubus an einen Pneumotachographen (Fleisch, Dyna Sciences, Blue Bell, PA) angeschlossen. Die Signale der Strömung und der transpulmonale Druck werden mit einem Oszilloskop-Aufzeichnungsgerät aufgenommen, das mit einem Computer zur Online-Berechnung von RL aus dem transpulmonalen Druck, dem respiratorischen Volumen (erhalten durch digitale Integration) und der Strömung verbunden ist. Die Analyse von 5–10 Atemzügen wird für die Bestimmung von RL verwendet. Unmittelbar nach der Messung von RL wird das Thorax-Gasvolumen (Vtg) in einem konstantvolumigen Ganzkörperplethysmograph gemessen, um den spezifischen Lungenwiderstand (SRL = RL – Vtg) in L × cm H2O/LPS zu erhalten.
  • Aerosol Zuführungssystem: Die Aerosole aus Ascaris suum Extrakt (20:1 verdünnt mit Phosphat-gepufferter Salzlösung; 82.000 PNU/ml) werden erzeugt unter Verwendung medizinischen Einmalverneblers (Raindrop®, Puritan Bennett), der ein Aerosol mit einem mittleren aerodynamischen Massendurchmesser von 3,2 μm (geometrische Standardabweichung 1,9) erzeugt, wie durch einen 7-stufigen Andersen Kaskaden-Impaktor bestimmt. Der Auslass von dem Vernebler ist in ein T-Stück aus Plastik gerichtet, wobei ein Ende davon mit dem Einatmungs-Anschluss von einem Harvard Respirator verbunden ist. Um die Aerosolzuführung besser zu kontrollieren, wird ein Dosimeter, das aus einem Magnetventil und einer Bezugsquelle für komprimierte Luft (20 psi) besteht, am Beginn des Inspirationszyklus des Harvard Respirationssystems für 1 Sekunde aktiviert. Das Aerosol wird mit einem Atemzugvolumen von 500 ml und mit einer Geschwindigkeit von 20 Atemzügen pro Minute für 20 Minuten geliefert. Jedes Schaf wird mit einer äquivalenten Dosis Antigen (400 Atemzüge) in dem Kontroll- und Arzneimitteltest belastet. Die Carbacholaerosole werden auch mit dem oben beschriebenen Verneblersystem erzeugt.
  • Dosis-Wirkungs-Kurven für inhaliertes Carbachol: Für die Dosis-Wirkungs-Kurven von Carbachol werden die Messungen von SRL unmittelbar nach der Inhalation von Puffer und nach jeder Verabreichung von 10 Atemzügen mit ansteigenden Konzentrationen an Carbachollösung (0,25%, 0,5%, 1,0%, 2,0% und 4,0% w/v) wiederholt. Um die Atemwegsempfindlichkeit festzustellen, wird die kumulative Carbacholdosis in den Atemzugseinheiten (BU), die den SRL 400% über den Wert nach dem Puffer steigern (d. h. PC400) aus der Dosis-Wirkungs-Kurve berechnet. Eine Atemzugseinheit ist definiert als ein Atemzug von einer 1%igen w/v Carbachollösung.
  • EXPERIMENTELLES PROTOKOLL
  • Die Ausgangs-Dosis-Wirkungs-Kurven für Carbacholaerosol werden 1–3 Tage vor der Antigen-Belastung erhalten. Bei Gelegenheiten, die mindestens 2 Wochen auseinanderliegen, werden die Ausgangswerte des spezifischen Lungenwiderstandes (SRL) erhalten und dann den Schafen Salzlösung (Kontrolle) oder Arzneimittel (bei Dosen von 3 mg pro Testverbindung, 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28), in NaOH/Salzlösung) 30 Minuten vor der Antigenbelastung verabreicht. Für diese Studien wird die Verbindung, 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28), als Aerosol verabreicht. Dann werden die Schafe mit Ascaris suum Antigen belastet. Messungen von SRL werden unmittelbar nach der Belastung erlangt, stündlich von 1 – 6 Stunden nach der Belastung und halbstündlich von 6 1/2–8 Stunden nach der Belastung. Messungen von SRL werden 24 Stunden nach der Antigenbelastung erlangt, gefolgt von der Carbachol Dosis-Wirkungs-Kurve für 24 Stunden nach Belastung. Für die anfänglichen Studien werden die Arzneimitteltests mit den Stammkontrolldaten des Tieres verglichen.
  • Für die Evaluierung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) werden die Ausgangswerte von SRL erlangt und dann den Schafen entweder Trägersubstanz oder Arzneimittel (3 mg/kg) als ein Aerosol in PEG400-Trägersubstanz verabreicht. SRL wird wieder gemessen und 30 Minuten nach der Dosierung werden die Tiere durch Aerosol mit Ascaris suum Antigen belastet. Messungen von SRL werden unmittelbar nach der Belastung erlangt, stündlich von 1 bis 6 Stunden nach der Belastung und halbstündlich von 6,5 bis 8 Stunden nach der Belastung.
  • Die in 3 dargestellten Ergebnisse repräsentieren den Mittelwert ± SEM von 2 Schafen pro Gruppe. 3A stellt die Wirkung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) auf die Antigen-induzierten frühen und späten bronchialen Reaktionen dar. 3-(4- Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) (3 mg/kg) wird 30 Minuten vor der Antigenbelastung als Aerosol gegeben. Es beeinflusste nicht die akute Zunahme in dem spezifischen Lungenwiderstand (SRL), aber blockierte die späte Reaktion verglichen mit der Kontrolle.
  • 3B stellt die Wirkung von 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) (3 mg/kg) auf die Atemwegsreaktionen nach der Belastung dar, in dem Kontrolltest ging PC400 (die Menge an Carbachol, die eine Zunahme von SRL um 400% verursacht) nach der Antigenbelastung zurück (d. h. die Schafe wurden hyperempfindlich). Die Behandlung mit 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (Beispiel 28) verhinderte diese Wirkung. Alle Werte sind Mittelwerte ± SE für 2 Schafe. Die Reaktionen werden mit den Stammkontrollwerten (Kontrolle) und den Trägersubstanz-Kontrollen verglichen.
  • Beispiele (Allgemein)
  • Allgemeine, für die Charakterisierung verwendete analytische Techniken: Es wurde eine Vielzahl von analytischen Techniken verwendet, um die Verbindungen, die in dem Verfahren von dieser Erfindung verwendet wurden, zu charakterisieren.
  • Die Formulierung „konzentriert unter Vakuum oder rotationsverdampft" bezeichnet die Rotationsverdampfung unter Verwendung einer Büchi-Apparatur bei 20–60°C und 15–30 Torr, bei Verwendung einer KNF-Neuberger Membranpumpe. Raumtemperatur wird als „rt" abgekürzt.
  • Präparative Umkehrphase-HPLC wurde an einer Rainin SD1 Einheit unter Verwendung einer Dynamax-C18-Säule (60 A sphärische 13 μm Partikel) durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril/Puffer-Mischungen, wobei der Puffer zusammengesetzt war aus destilliertem Wasser, Acetonitril und Trifluoroacetat (TFA) in dem in den experimentellen Prozeduren aufgelisteten Verhältnis.
  • 1H-NMR wurden auf einem Varian Gemini 300, Unity 300, Unity 400 oder Unity 500 Spektrometer aufgezeichnet mit chemischen Verschiebungen (δ), die in ppm relativ zu Tetramethylsilan (0,00 ppm) oder Chloroform (7,26 ppm) als Referenz angegeben sind. Die Signals wurden bezeichnet als s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett), p (Pentuplett), m (Multiplett), br (breit).
  • Chromatographische (Flash-)Reinigungen an Kieselgel wurden unter Verwendung von vorgepackten Isco- oder Biotage-Kartuschen (32–63 μm, 60 A) gemacht.
  • Massenspektren (MS) wurden an einem Finnigan MAT Model TSQ 700 Mass Spectrometer System durch chemische Ionisation bei 120 eV unter Verwendung von Methan (CI, 120 eV) erhalten. Das protonierte Molekülion, bezeichnet als (M+ + 1), ist in Klammer angegeben.
  • Flüssigchromatographie mit Massenspektralanalyse (LC/MS): HPLC: Säule: 50 × 4,6 mm, Hypersil BDS C18 3μ. Mobile Phase: A = Wasser mit 0,05% Trifluoressigsäure, B = Acetonitril mit 0,05% Trifluoressigsäure, Flussgeschwindigkeit = 1,0 ml/min, Gradient = 5%B bis 100%B in 3 Min, Halt 100% für 2 Min. Massenspektrometrie: Lct API LC/Orthogonal-Flugzeit Massenspektrometer und Masslynx Datensystem von Micromass. Ionisierungsart = Elektrospray (ESI), Quellentemperatur = 120°C, Desolvationstemperatur = 250°C, Düsenspannung = 25 Volt, Erfassung Massebereich m/z von 145 bis 1.000. Werte wurden für das protonierte Molekülion (M+ + 1) bestimmt.
  • Vergleichsbeispiel 1
    Figure 00650001
    Schema A, Schritt A1: 3-Amino-6-trifluormethyl-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Unter Stickstoff wird eine Mischung aus 2-Fluor-4-(trifluormethyl)benzonitril (1,0 g, 5,29 mmol), Ethylglycinathydrochlorid (886 mg, 6,3 mmol), Kaliumcarbonat (1,46 g, 6,3 mmol) und 1-Methyl-2-pyrrolidinon (20 ml) bei 115–120°C erhitzt und gerührt. Nach sechs Stunden wird Kalium-tert-butoxid (700 mg, 6,2 mmol) hinzugefügt und bei Umgebungstemperatur für 2 Std. gerührt. Es wird durch Eingießen in Eis/Wasser abgeschreckt, die wässrige Mischung mit Ether extrahiert, der Extrakt mit Wasser gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Der Extrakt wird filtriert und unter Vakuum konzentriert, um das rohe Produkt zu ergeben. Das rohe Produkt wird an Kieselgel (10 g, Sepack-Kartusche) mit Dichlormethan als Elutionsmittel chromatographiert, um 332 mg (23%) von der Titelverbindung zu liefern. Identisch an TLC (Kieselgel, Dichlormethan) zu der Verbindung, die in US-Patentschrift Nr. 5,189,054 offenbart ist. Vergleichsbeispiel 2
    Figure 00650002
    Schema A, Schritt A1: 3-Amino-6-fluor-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Unter Stickstoff wird eine Mischung aus 2,4-Difluorbenzonitril (1,14 g, 8,2 mmol), Ethylglycinat-Hydrochlorid (1,5 mg, 10,7 mmol), Kaliumcarbonat (3,4 g, 24,6 mmol) und 1-Methyl-2-pyrrolidinon (20 ml) gerührt und erhitzt. Nach 2 Stunden wird die Reaktion auf 40°C abkühlen lassen und Kalium-tert-butoxid (300 mg, 2,7 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion für 1 Stunde rühren und dann zusätzliches Kalium-tert-butoxid (500 mg, 4,4 mmol) hinzufügen. Über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen lassen und die Reaktionsmischung auf Eis gießen. Es wird Wasser zum Auflösen der Feststoffe in der Reaktionsflasche hinzugegeben und zu der gelöschten Reaktion hinzugefügt. Den präzipitierten braunen Feststoff abfiltrieren und das Filtrat mit Ethylacetat extrahieren. Den Extrakt mit Wasser (2x), Salzlake waschen und über Magnesiumsulfat trocknen. Filtrieren und unter Vakuum trocknen, um einen Rückstand zu erhalten, der mit Dichlormethan trituriert wird, um einen Feststoff zu liefern. Den Feststoff sammeln, das Filtrat konzentrieren und den Feststoff an Kieselgel (10 g, Sepack-Kartusche) mit Dichlormethan als Elutionsmittel chromatographieren. Die entsprechenden Fraktionen sammeln und konzentrieren, um einen Feststoff zu erhalten. Mit dem vorher gesammelten Feststoff vereinen, um 136,7 mg (7,5%) von der Titelverbindung zu ergeben. MS 223 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 3
    Figure 00660001
    Schema B: 3-Amino-5-chlor-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Schritt B1: 2-Amino-N-tert-butyl-5-chlorbenzamid
  • Eine Lösung aus 2-Amino-5-chlorbenzoesäure (1,21 g, 10 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (1,38 g, 12 mmol) in Dichlormethan (12 ml) wird gerührt und auf 0°C gekühlt. Eine 1 M Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan (12 ml, 12 mmol) wird tropfenweise hinzugefügt und für 1 Stunde bei 0°C gerührt. Mittels einer Spritze wird tert-Butylamin (1,74 g, 23,79 mmol) hinzugefügt und bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wird gefiltert und das Filtrat mit wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen. Die organische Phase wird mit MgSO4 getrocknet und über Kieselgel chromatographiert, um durch Elution mit 4% Ethylacetat/Dichlormethan 1,74 g von der Titelverbindung zu liefern. MS 227 (M+H), m.p. 126–127°C.
  • Schritt B2: N-(4-Chlor-2-cyanophenyl)-2,2,2-trifluoracetamid
  • Eine Lösung von 2-Amino-N-tert-butyl-5-chlorbenzamid (5,07 g, 22,36 mmol) in Dichlormethan (200 ml) wird gerührt und auf 0°C gekühlt und dann tropfenweise Trifluoressigsäureanhydrid hinzugefügt. Es wird über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt und dann unter reduziertem Druck konzentriert. Zwischen Chloroform und wässrigem Natriumbicarbonat verteilen und die organische Schicht sammeln. Den Extrakt mit MgSO4 trocknen, filtrieren und das Lösemittel verdampfen. Den Rückstand mit Heptan triturieren und den weißen Feststoff sammeln, um 4,80 g (82%) von der Titelverbindung zu erhalten. MS 249 (M+H), m.p. 105–107°C.
  • Schritt B3: ((4-Chlor-2-cyanophenyl)-(2,2,2-trifluorethanoyl)amino)essigsäureethylester
  • Unter Stickstoff eine Lösung von N-(4-Chlor-2-cyanophenyl)-2,2,2-trifluoracetamid (4,80 g, 19,31 mmol) in Dimethylformamid (50 ml) rühren, auf 0°C kühlen und NaH (0,7 g, 29,1 mmol) hinzufügen. Die Reaktion für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur rühren und Ethylbromacetat (4,3 ml, 38,77 mmol) mit Hilfe einer Spritze hinzufügen. Bei 50°C über Nacht rühren und dann die Reaktion in wässriges Ammoniumchlorid-Ethylacetat gießen. Die organische Schicht mit Salzlake (2x) waschen, über MgSO4 trocknen, filtrieren und verdampfen, um ein Öl zu erhalten. Das Öl chromatographieren und mit 20% Ethylacetat/Heptan und dann 30% Ethylacetat/Heptan eluieren. Die entsprechenden Fraktionen konzentrieren und 6,0 g von einem Feststoff erhalten. MS 335 (M+H), m.p. 71–73°C.
  • Schritt B4: 3-Amino-5-chlor-1-(2,2,2-trifluorethanoyl)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Unter Stickstoff wird eine Mischung aus [(4-Chlor-2-cyanophenyl)-(2,2,2-trifluorethanoyl)amino]essigsäureethylester (93,34 g, 10 mmol) in Tetrahydrofuran (20 ml) gerührt, auf 0°C gekühlt und dann tropfenweise eine 1 M Lösung von Kalium-tert-butoxid in Tetrahydrofuran (12 ml, 12 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion bei Umgebungstemperatur für 2 Stunden rühren und dann zwischen wässrigem Ammoniumchlorid/Ethylacetat verteilen. Die organische Schicht abtrennen, über MgSO4 trocknen, filtrieren und zu einem Feststoff konzentrieren. Den Rückstand mit Heptan triturieren, den Feststoff filtrieren und an der Luft trocknen, um 2,86 g (86%) von der Titelverbindung zu erhalten. MS 335 (M+H), m.p. 249–251°C.
  • Schritt B5: 3-Amino-5-chlor-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Eine Mischung aus 3-Amino-5-chlor-1-(2,2,2-trifluorethanoyl)-1H-indol-2-carbonsäureethylester (3,34 g, 10 mmol), Ethanol (50 ml) und Kaliumcarbonat (1,50 g, 10,85 mmol) wird bei 70°C erhitzt und gerührt. Nach 1,75 Stunden wird Wasser (20 ml) hinzugefügt und nach einer weiteren Stunde wird zusätzliches Kaliumcarbonat (0,58 g, 4,20 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird auf Umgebungstemperatur abgekühlt und zwischen Wasser/Ethylacetat verteilt. Die organische Schicht abtrennen, über MgSO4 trocknen, filtrieren und konzentrieren, um 1,70 g der Titelverbindung als Feststoff zu liefern. MS 239 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 4
    Figure 00690001
    Schema B: 3-Amino-5-fluor-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Schritt B1: 2-Amino-N-tert-butyl-5-fluorbenzamid
  • Eine Lösung aus 2-Amino-5-fluorbenzoesäure (7,75 g, 50 mmol), N-Hydroxysuccinimid (6,9 g, 60 mmol) und Dimethylaminopyridin (1,0 g) in Dichlormethan (200 ml) wird gerührt und auf 0°C gekühlt. Eine 1 M Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan (60 ml, 60 mmol) wird tropfenweise hinzugefügt und für 1 Stunde bei 0°C gerührt. Mittels einer Spritze wird tert-Butylamin (20 ml, 190,3 mmol) hinzugefügt und bei 0°C für 3 Stunden und dann bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Auf eine Unterlage aus Kieselgel gießen und mit 5% Ethylacetat/Dichlormethan eluieren. Die ähnlichen Fraktionen vereinigen und konzentrieren, um einen unverarbeiteten Feststoff zu erhalten. Den Rückstand mit Heptan triturieren und filtrieren, um 7,7 g (73%) von der Titelverbindung zu erhalten. MS 211 (M+H), m.p. 77–78°C.
  • Schritte B2–B5: 3-Amino-5-fluor-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Der Prozedur von Beispiel 3 (Schritte B2–B5) folgen, um 3-Amino-5-fluor-1H-indol-2-carbonsäureethylester zu erlangen. MS 223 (M+H), TLC (Kieselgel, 4% Ethylacetat/Dichlormethan) Rf = 0,50.
  • Vergleichsbeispiel 5
    Figure 00700001
    Schema B, Schritte B3–B5: 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 3 (Schritte B3–B5) gefolgt, aber mit N-(2-Cyanophenyl)-2,2,2-trifluoracetamid (Synthese beschrieben in J. Fluorine Chem. 1981, 18, (2), 185–95) und tert-Butylbromacetat gestartet, um die Titelverbindung zu erlangen: MS 310 (M+H), TLC (Kieselgel, Dichlormethan/Methanol, 7:1), Rf = 0,38.
  • Vergleichsbeispiel 6
    Figure 00700002
    Schema B, Schritte B1–B5: 3-Amino-5-methoxy-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 3 gefolgt, aber mit 2-Amino-5-methoxy-benzoesäure gestartet und in Schritt B3 wird tert-Butylbromacetat anstatt Ethylbromacetat verwendet, um die Titelverbindung zu erlangen: MS 263 (M+H), m.p. 146–147°C.
  • Vergleichsbeispiel 7
    Figure 00710001
    Schema B, Schritte B3–B5: 3-Amino-4-fluor-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 5 gefolgt, aber mit 3-Fluor-N-(2-cyanophenyl)-2,2,2-trifluoracetamid (Synthese beschrieben in J. Fluorine Chem. 1981, 18, (2), 185–95) und tert-Butylbromacetat gestartet, um die Titelverbindung zu erlangen: MS 251 (M+H), TLC (Kieselgel, Dichlormethan/Methanol, 7:1), Rf = 0,38.
  • Vergleichsbeispiel 8
    Figure 00710002
    Schema C: 3-Amino-6-phenyl-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Schritt C1: N-(5-Chlor-2-cyanophenyl)acetamid
  • Eine Mischung von 2-Amino-4-chlorbenzonitril (20,0 g, 131 mmol) und acetischem Anhydrid (80 mL) wird für 40 Minuten auf dem Dampfbad erhitzt. Es wird Wasser (300 ml) hinzugefügt und für 1 Stunde gerührt. Der resultierende Feststoff wird filtriert, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum bei 40°C getrocknet, um 22,9 g Produkt zu erlangen. Eine Probe von 12,8 g wird von Ethanol-Ethylacetat rekristallisiert und 9,83 g von der Titelverbindung erhalten. MS 195 (M+H), TLC (Kieselgel, Ethylacetat/Heptan 1:1) Rf = 0,38.
  • Schritt C2: N-(2-Cyanophenyl-5-phenyl)acetamid
  • Eine Mischung aus N-(5-Chlor-2-cyanophenyl)acetamid (0,389 g, 2,0 mmol), Phenylborsäure (0,366 g, 3,0 mmol), Palladium(II)acetat (8,8 mg), 2-(Dicyclohexylphosphino)biphenyl (28,0 mg), Kaliumfluorid (0,348 g, 5,99 mmol) und Tetrahydrofuran (5 ml) wird bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wird in eine wässrige Lösung von Kaliumcarbonat (30 ml) gegossen und mit Ethylacetat (2 × 25 ml) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und mit Wasser und Salzlake gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum getrocknet, um einen gelbbraunen Feststoff zu erlangen. Der Feststoff wird mit Ether trituriert und 0,365 g (77%) von der Titelverbindung als ein cremefarbenes Pulver gesammelt. MS 237 (M+H), m.p. 168–170°C.
  • Schritt C3: 3-Amino-1-(ethanoyl)-6-phenyl-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Eine Lösung von N-(2-Cyanophenyl-5-phenyl)acetamid (15,0 g, 63,5 mmol) in 1-Methyl-2-pyrrolidinon (150 ml) wird auf 4°C gekühlt und tropfenweise eine 1 M Lösung von Kalium-tert-butoxid in Tetrahydrofuran (77,0 ml, 77,0 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wird bei 0°C für 30 Minuten gealtert und dann Ethylbromacetat (12,0 g, 72,1 mmol) hinzugefügt. Es wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und die Reaktion in Wasser (600 ml) abgeschreckt. Die wässrige Mischung wird mit Ether (3 × 300 ml) extrahiert, die Extrakte vereinigt, die Ex trakte werden mit Wasser und Salzlake gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Die Extrakte werden filtriert und unter Vakuum konzentriert, um 20,6 g von einem dunklen Öl zu erlangen. Es wird über eine Waters Prep-Pak Kieselgel-Kartusche (500 g) chromatographiert und mit einem Stufengradienten von 5%, 10%, beziehungsweise 20% Ethylacetat/Dichlormethan eluiert. Die Fraktionen, die das Startmaterial enthalten, werden konzentriert und ein gelber Festsstoff erhalten. Der Feststoff wird mit Ether trituriert und filtriert, um 2,61 g eines weißen Feststoffes zu liefern.
  • Die Filtrate von oben werden mit den Fraktionen von der Chromatographie, die das Produkt erhalten, vereinigt und konzentriert, um 16,2 g von einem dunklen Öl zu liefern. Das Öl wird über eine Waters Prep-Pak Kieselgel-Kartusche chromatographiert und mit einem Stufengradienten von 2%, 5%, beziehungsweise 10% Ethylacetat/Dichlormethan eluiert. Ähnliche Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um 7,33 g von der Titelverbindung zu ergeben. MS 323 (M+H), TLC (Kieselgel, 20% Ethylacetat/Dichlormethan) Rf = 0,67.
  • Schritt C4: 3-Amino-6-phenyl-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Eine Mischung aus 3-Amino-1-(ethanoyl)-6-phenyl-1H-indol-2-carbonsäureethylester (7,3 g, 22,6 mmol) 20% wässrigem Kaliumcarbonat (100 ml) und Ethanol (100 ml) wird für 1,75 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktion wird bei Umgebungstemperatur über Nacht stehen gelassen und mit Wasser (500 ml) verdünnt. Es wird auf 0°C abgekühlt und ein violetter Feststoff gesammelt. Der Feststoff wird mit Wasser gewaschen und bei 40°C unter Vakuum getrocknet und 5,7 g eines violetten Feststoffes erhalten. Der Feststoff wird mit Dichlormethan (40 ml) trituriert, filtriert und mit Dichlormethan und Ethylacetat gewaschen und dann bei 40°C unter Vakuum getrocknet, um 2,5 g der Titelverbindung als einen Feststoff zu ergeben. ESI/MS 281 (M+H), HPLC: Rf = 183 min., m.p. 181–183°C. Beispiel 9
    Figure 00740001
    Schema D: 3-Amino-5,6-dimethoxy-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Schritt D1: (2-Cyano-4,5-dimethoxyphenylamino)essigsäureethylester
  • Unter N2 wird 2-Amino-4,5-dimethoxybenzonitril (2,0 g, 12,25 mmol) in Ethanol (50 ml) suspendiert und Natriumbicarbonat (3,09 g, 36,78 mmol) in einer Portion hinzugefügt. Mit Hilfe einer Spritze wird langsam Ethylbromacetat (2,72 ml, 24,5 mmol) hinzugefügt und dann Natriumiodid (10 mg). Die Reaktion wird bei 65°C erhitzt und dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Der resultierende Feststoff wird filtriert und mit Ethylacetat gewaschen, um die organischen Anteile zu lösen. Das Filtrat wird konzentriert, um 0,66 g (23%) von der Titelverbindung zu ergeben; MS 265 (M+H).
  • Schritt D2: 3-Amino-5,6-dimethoxy-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Unter N2 wird eine Mischung aus (2-Cyano-4,5-dimethoxyphenylamino)essigsäureethylester (0,124 g, 0,47 mmol) in Tetrahydrofuran (6 ml) gerührt und dann tropfenweise eine 1 M Lösung von Kalium-tert-butoxid in Tetrahydrofuran (0,66 ml, 0,66 mmol) hinzugefügt. Es wird für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt und dann in Eis/Wasser gegossen. Es wird mit Ethylacetat extra hiert, der Extrakt über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum zu einem Feststoff konzentriert. Diese wird an einer Sep-Pak Kieselgel-Kartusche (2 g) chromatographiert und mit Dichlormethan und dann mit 2:1 Heptan/Ethylacetat eluiert. Ähnliche Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um 61,9 mg (49%) von der Titelverbindung als einen Feststoff zu ergeben. MS 265 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 10
    Figure 00750001
    Schema D: 3-Amino-6-chlor-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Schritt D4: 3-Amino-1-(ethanoyl)-6-chlor-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Eine Mischung aus N-(5-Chlor-2-cyanophenyl)acetamid (siehe Beispiel 8, 1,0 g, 5,14 mmol) und THF (10 ml) wird gerührt, auf 0°C gekühlt und Kalium-tert-butoxid (6,2 ml einer 1 M Lösung in THF) hinzugefügt und bei 0°C für 30 Minuten gerührt. Dann wird Bromethylacetat (0,6 ml) in einer Portion hinzugefügt. Es wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Die Reaktion wird mit Wasser (40 ml) abgeschreckt und mit Ethylacetat gerührt. Die Schichten werden getrennt und die wässrige mit Ethylacetat nochmals extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt und mit Wasser und Salzlauge gewaschen. Es wird über MgSO4 getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert, um einen braunen Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wird mit Ether trituriert und ein beiger Feststoff gesammelt. Der Feststoff wird an Kieselgel mit 2% Ethylacetat/Dichlormethan chromatographiert, gefolgt von 10% Ethylacetat/Dichlormethan, um 0,65 g (45%) von der Titelverbindung als einen beigen Feststoff zu erhalten. MS 281 (M+H), HPLC: Rt = 3,20 min., TLC (Kieselgel, 10% Ethylacetat/Dichlormethan) Rf = 0,53.
  • Schritt D5: 3-Amino-6-chlor-1-H-Indol-2-carbonsäureethylester
  • Es wird eine 1 N ethanolische Kaliumhydroxidlösung (100 ml) zu 3-Amino-1-(ethanoyl)-6-chlor-1H-indol-2-carbonsäureethylester (3,5 g, 12,5 mmol) hinzugefügt und die Reaktion für 20 Minuten stehen lassen. Die resultierende Aufschlämmung wird unter schnellem Rühren in Wasser bei 5°C gegossen. Es wird bei 0°C für 10 Minuten altern lassen, der Feststoff gesammelt, mit Wasser gewaschen, bei 40°C unter Vakuum getrocknet und 2,42 g (81%) von der Titelverbindung erhalten: MS 239 (M+H).
  • Beispiele 11–21
  • Schema E, Schritt E1: Tabelle 12 veranschaulicht 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureester der vorliegenden Erfindung, die ähnlich zu der in der US-Patentschrift Nr. 5,328,920 offenbarten Methode synthetisiert werden können. Dementsprechend produziert die Reaktion von dem entsprechenden 3-Amino-indol-2-carboxylat mit 4-Chlorpyridinhydrochlorid in 1-Methyl-2-pyrrolidinon die gewünschten Verbindungen. Änderungen der Reaktionszeiten und Temperaturen von der mit Verweisen versehenen Prozedur sind in der Tabelle vermerkt. Tabelle 13 listet die entsprechenden physikalischen Eigenschaften auf.
    Figure 00770001
    Tabelle 12 Reaktionsbedingungen [(C.) = Vergleichend)]
    Beispiel X Y Z R R2 Temp. °C Zeit Std.
    11 (C.) H H NH H C2H5 165c 6
    12 (C.) 6-CF3 H NH H C2H5 80 18
    13 (C.) 6-Cl H NH H C2H5 100 5
    14 (C.) 5-Cl H NH H C2H5 100 4,5
    15 (C.) 6-F H NH H C2H5 80 d
    16 (C.) 5-F H NH H C2H5 100 2
    17 (C.) 4-F H NH H C(CH3)3 75 16
    18 (C.) 6-Phenyl H NH H C2H5 100 d
    19 (C.) H H NH H C(CH3)3 100 2
    20 5-OCH3 6-OCH3 NH H C2H5 80 6
    21 (C.) 5-OCH3 H NH H C(CH3)3 80 3,5
    • d = über Nacht, etwa 16–20 Std.
    Tabelle 13 Physikalische Eigenschaften
    Beispiel MS (M+H) Retentionszeit Minuten (HPLC) mp°C
    11 282 248–250
    12 350
    13 316 1,90 258–261(dec)
    14 316
    15 300
    16 300
    17 328 1,58 210–212
    18 358 241–243
    19 310
    20 342 1,20
    21 340 1,13 217–219
    Vergleichsbeispiel 22
    Figure 00780001
    Schema E, Schritt E1: 3-(2-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Eine Mischung aus 3-Aminoindol-2-carboxylat (250 mg, 1,2 mmol) und 2-Bromopyridin (1,0 ml, 10 mmol) wird bei 150°C für 1 Stunde erhitzt. Die Reaktion wird gekühlt und zwischen wässrigem Ammoniumchlorid und Ethylacetat partitioniert. Die organische Schicht wird abgetrennt und konzentriert, um eine unverarbeitete Mischung zu liefern. Die Mischung wird mittels Flash-Chromatographie an Kieselgel chromatographiert, um durch Elution mit 25% Ethylacetat/Dichlormethan 50 mg von der Titelverbindung zu liefern. MS 282 (M+H). Vergleichsbeispiel 23
    Figure 00780002
    Schema E, Schritt E1: 3-(Pyrimidin-2-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Eine Mischung aus Ethyl-3-aminoindol-2-carboxylat (204 mg, 1,0 mmol) und 2-Chlorpyrimidin (1,2 g, 10,5 mmol) wird bei 100°C für 16 Stunde erhitzt. Die Reaktion wird gekühlt und wässriges Ammoniumchlorid und Ethylacetat hinzugefügt. Der Überschuss von 2-Chlorpyrimidin wird abfiltriert, die organischen Schichten getrennt, mit MgSO4 getrocknet, filtriert und konzentriert, um eine unaufbereitete Mischung zu liefern. Die Mischung wird mittels Flash-Chromatographie an Kieselgel chromatographiert, um durch Elution mit 25% Ethylacetat/Dichlormethan 50 mg von der Titelverbindung zu liefern. MS 283 (M+H), TLC (Kieselgel, 25% Ethylacetat/Dichlormethan) Rf = 0,44. Vergleichsbeispiel 24
    Figure 00790001
    Schema F, Schritt F8: 5-Fluor-1-methyl-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Eine Mischung aus 5-Fluor-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester (0,195 mg, 0,65 mmol) in Dimethylformamid (3,0 ml) wird bei 0°C gerührt und dann eine 1 M Lösung von Kalium-tert-butoxid in Tetrahydrofuran (0,8 ml, 0,8 mmol) hinzugefügt. Es wird für 0,5 bis 1 Stunde bei 0°C gerührt und dann Iodmethan (0,05 ml, 0,78 mmol) hinzugefügt. Nach 1 Stunde wird gesättigte wässrige Ammoniumchloridlösung (5 ml) und Ethylacetat (10 ml) hinzugefügt. Die Schichten werden getrennt und mit Ethylacetat nochmals extrahiert. Die organischen Schichten werden vereinigt und mit Wasser (3x), Salzlake gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Der Extrakt wird konzentriert, um 60 mg (30%) von der Titelverbindung als einen braunen Feststoff zu erhalten: ESI/MS 314 (M+H), HPLC: Rt = 1,50 min. Vergleichsbeispiel 24A
    Figure 00800001
    Schema F, Schritt F8: 1-Methyl-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Die Prozedur von Beispiel 24 wird im Wesentlichen in diesem Beispiel wiederholt, außer dass das verwendete Startmaterial 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester ist. Diese Verbindung ist auch in der US-Patentschrift Nr. 5,328,920 beschrieben. Das Maleatsalz von dieser Verbindung weist einen m.p. von 169–170°C (dec) auf. Vergleichsbeispiel 25
    Figure 00800002
    Schema F, Schritt F8: 4-Fluor-1-methyl-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 24 gefolgt, aber mit 4-Fluor-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester gestartet und Tetrahydrofuran für Dimethylformamid substituiert, um die Titelverbindung zu erhalten. ESI/MS 342 (M+H), HPLC: Rt = 1,41 min. Vergleichsbeispiel 26
    Figure 00810001
    Schema F, Schritt F8: 5-Chlor-1-methyl-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 24 gefolgt, mit 5-Chlor-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester gestartet und die Titelverbindung erhalten. ESI/MS 330 (M+H), HPLC: Rt = 1,58 min. Vergleichsbeispiel 27
    Figure 00810002
    Schema F, Schritt F8: 6-Chlor-1-methyl-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 24 gefolgt, mit 6-Chlor-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester gestartet und die Titelverbindung erhalten. ESI/MS 330 (M+H), HPLC: Rt = 1,64 min, m.p. 154–155°C.
  • Vergleichsbeispiel 28
    Figure 00820001
    Schema G: 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure
  • Schritt G1: (2-Cyanophenylamino)essigsäureethylester
  • Ein 30-Gallonen-Reaktor wird mit einer Mischung aus 10,0 kg (84,6 mol) Anthranilonitril, 21,2 kg (127,0 mol, 1,5 Äquivalente) Ethylbromacetat, 12,0 kg (143,0 mol, 1,7 Äquivalente) NaHCO3 10,0 g (katalytisch) Natriumiodid und 33,0 L Ethanol beschickt. Die Reaktionsmischung wird erhitzt und bei 78–80°C unter Stickstoff gehalten. Der Fortschritt der Reaktion wird durch HPLC (Säule – 150 × 3,9 mm Waters Symmetry C18, 5 Mikrometer; Mobile Phase – 60% Acetonitril/40% 0,1% TFA in Wasser; Flussgeschwindigkeit – 1,0 ml/min; Wellenlänge – 225 nm; RT: Anthranilonitril – 1,8 Min. (2-Cyanophenylamino)essigsäureethylester – 2,7 Min.) überwacht. Typischerweise wird eine 70–72%ige Umsetzung in etwa 40–44 Stunden erreicht. Die Mischung wird auf 60°C abkühlen lassen und warm filtriert, um die anorganischen Feststoffe zu entfernen. Der Filterkuchen wird mit 10,0 L warmem (70°C) Ethanol gewaschen. Das Filtrat wird gekühlt und bei –20°C für 4 Stunden gehalten. Der Feststoff, der sich gebildet hat, wird abfiltriert und mit 6,0 L kaltem (–20°C) Ethanol gewaschen und luftgetrocknet, um 11,02 kg, 64,0% Ausbeute von der Titelverbindung zu ergeben: HPLC-Analyse 100% rein.
  • Schritt G2: 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Ein 30-Gallonen Reaktor wird mit insgesamt 30,0 L Tetrahydrofuran unter Stickstoff beschickt. Es werden insgesamt 4,0 kg (32,72 mol, 1,045 Äquivalente) Kalium-tert-butoxid hinzugefügt. Es wird eine exotherme Reaktion auf 25°C von 20°C beobachtet. Die Mischung wird auf 20°C gekühlt. Es werden insgesamt 6,40 kg (31,3 mol) (2-Cyanophenylamino)essigsäureethylester in 30,0 L Tetrahydrofuran gelöst und über 5 Stunden bei 20–25°C hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird bei 20–23°C für 18 Stunden gerührt. Der Fortschritt der Reaktion wird durch HPLC (Säule – 150 × 3,9 mm Waters Symmetry C18, 5 Mikrometer; Mobile Phase – 60% Acetonitril/40% 0,1% TFA in Wasser; Flussgeschwindigkeit – 1,0 ml/Min.; Wellenlänge – 225 nm; RT: 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäureethylester – 1,5 Min.; (2-Cyanophenylamino)essigsäureethylester – 2,7 Min.) überwacht. Typischerweise wird eine 97%ige Umsetzung erreicht. Die Mischung wird bei 30°C/50 Torr zu einem Feststoffrückstand konzentriert. Es werden insgesamt 60,0 L Wasser zu dem Rückstand hinzugefügt und die Mischung für 2 Stunden bei 23°C gerührt. Der Feststoff wird abfiltriert und mit 60,0 L Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Ferner wird der Feststoff in einem zwangsbelüfteten Ofen bei 55°C für 24 Stunden getrocknet, um 4,45 kg, 69,5% Ausbeute, von der Titelverbindung zu ergeben. HPLC-Analyse 79,2% rein.
  • Schritt G3: 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Ein 30-Gallonen Reaktor wird mit 4,0 kg (19,56 mol) 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäureethylester, 4,10 kg (27,33 mol, 1,4 Äquivalente) 4-Chlorpyridinhydrochlorid und 8,0 L 1-Methyl-2-pyrrolidinon beschickt und unter Stickstoff auf 100°C erhitzt. Der Fortschritt der Reaktion wird durch HPLC (Säule – 150 × 3,9 mm Waters Symmetry C18, 5 Mikrometer; Mobile Phase – 60% Acetonitril/40% 0,1% TFA in Wasser; Flussgeschwindigkeit – 1,0 ml/min; Wellenlänge – 225 nm; RT: 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäureethylester – 1,5 Min. 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester – 6,0 Min.; 4-Chlorpyridin – 1,1 Min.) überwacht. Typischerweise wird eine 99%ige Umsetzung innerhalb 1 Stunde erreicht. Die Mischung wird auf 20°C abkühlen lassen und insgesamt 55 L Wasser hinzugefügt. Die Mischung wird mit insgesamt 20,0 L Ethylacetat extrahiert und die Schichten getrennt. Der pH-Wert der wässrigen Phase wird auf pH = 9,3 unter Verwendung von 25% Natriumhydroxidlösung eingestellt. Der Feststoff, der sich bildet, wird abfiltriert und mit 45,0 L Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Ferner wird der Feststoff in einem zwangsbelüfteten Ofen bei 50°C für 24 Stunden luftgetrocknet, um 4,20 kg, 77% Ausbeute, von der Titelverbindung zu ergeben. HPLC-Analyse 95,8% rein.
  • Schritt G4: 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-Kaliumsalz
  • Ein 30-Gallonen Reaktor wird mit einer Mischung aus 7,50 kg (26,66 mol) 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäureethylester, 37,5 L Ethanol und 37,5 L 4 M KOH beschickt und bei 75°C über 30 Minuten erhitzt. Der Fortschritt der Reaktion wird durch HPLC (Säule – 150 × 3,9 mm Waters Symmetry C18, 5 Mikrometer; Mobile Phase – 20% Acetonitril/80% 0,1% TFA in Wasser; Flussgeschwindigkeit – 1,0 ml/Min.; Wellenlänge – 225 nm; RT: 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-Kaliumsalz – 3,3 Min.; 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäureethylester – 6,0 Min.) überwacht. Typischerweise wird eine 100%ige Umsetzung innerhalb von 3 Stunden erreicht. Die Mischung wird auf 25°C über 2 Stunden abgekühlt und bei 50–60°C/50 Torr zu einem Rückstand konzentriert. Es werden insgesamt 37,5 L Wasser hinzugefügt und die Mischung auf 85°C erhitzt und dort für 30 Minuten gehalten. Die Mischung wird auf 10°C über 2 Stunden abgekühlt und dann weiter auf 5°C gekühlt und dort für 2 Stunden gehalten. Der Feststoff, der sich bildet, wird abfiltriert, mit insgesamt 10 L 4 M KOH-Lösung gewaschen und luftgetrocknet. Ferner wird der Feststoff in einem zwangsbelüfteten Ofen bei 35°C für 72 Stunden getrocknet, um 10,9 kg, 140% Ausbeute, von der Titelverbindung zu ergeben. HPLC-Analyse 70,7% rein.
  • Schritt G5: 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure
  • Ein mit Glas ausgekleideter 30-Gallonen Reaktor wird mit einer Mischung aus insgesamt 10,9 kg (37,4 mol, 140% Ausbeute für Esterhydrolyse) 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-Kaliumsalz und 75,0 L Wasser beschickt. Die gerührte Mischung wird mit 75,0 L (3 × 25,0 L) Ethylacetat extrahiert. Der pH-Wert der wässrigen Phase wird durch Zugabe von 7,0 L 6 N HCl bei 20–22°C auf pH = 6,0 eingestellt und die Reinheit des Produktes durch HPLC (Säule – 150 × 3,9 mm Waters Symmetry C18, 5 Mikrometer; Mobile Phase – 20% Acetonitril/80% 0,1% TFA in Wasser; Flussgeschwindigkeit – 1,0 ml/Min.; Wellenlänge – 225 nm; RT: 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure – 3,3 Min.) überwacht. Die Mischung wird für 45 Minuten gerührt und dann der pH-Wert gemessen, dass der pH = 6,0 ist. Der Feststoff, der sich bildet, wird abfiltriert, mit insgesamt 50 L Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Ferner wird der Feststoff in einem zwangsbelüfteten Ofen bei 35°C für 24 Stunden getrocknet, um 6,15 kg, 65,5% Ausbeute, von 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure zu ergeben. Die HPLC-Analyse zeigte, dass die Verbindung 93,8% rein ist. Ein 30-Gallonen Reaktor wird mit insgesamt 6,15 kg (24,28 mol) von dem Produkt, 11,3 kg (97,35 mol, 4,0 Äquivalente) Maleinsäure, 62,0 L Methanol und 6,2 L Wasser beschickt und unter Stickstoff auf 70°C erhitzt und dort für 45 Minuten gehalten. Die Mischung wird auf 30°C über 1,5 Stunden abgekühlt und bei 60°C/50 Torr zu einem feuchten Feststoff konzentriert. Es werden insgesamt 20,0 L IPA hinzugefügt und die Mischung bei 60°C/50 Torr zu einem Feststoff konzentriert. Dieser Prozess wird wiederholt. Es werden insgesamt 50,0 L IPA zu dem Rückstand hinzugefügt und die Mischung auf 70°C erhitzt und dort für 60 Minuten gehalten, dann wird auf 20°C über 16 Stunden abgekühlt. Die Mischung wird auf 2°C gekühlt und dort für 1 Stunde gehalten. Die Reinheit des Produktes wird durch HPLC (Säule – 150 × 3,9 mm Waters Symmetry C18, 5 Mikrometer; Mobile Phase – 20% Acetonitril/80% 0,1% TFA in Wasser; Flussgeschwindigkeit – 1,0 ml/min; Wellenlänge – 225 nm; RT: 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure – 3,3 Min.; Maleinsäure – 1,2 Min.) überwacht. Der Feststoff wird abfiltriert, mit 10,0 L kaltem (5°C) IPA gewaschen und bei 35°C in einem zwangsbelüfteten Ofen getrocknet, um 5,4 kg, 60,6% Ausbeute, von 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-Maleatsalz zu ergeben. HPLC-Analyse 99,0% rein.
  • Ein 30-Gallonen Reaktor wird mit insgesamt 7,9 kg (5,4 kg + 2,5 kg aus zwei Läufen) 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-Maleatsalz und 50,0 L 4 M KOH beschickt und auf 70°C erhitzt und dort gehalten. Es werden insgesamt 12,0 L Ethanol bis die Mischung bei 70°C homogen wird, hinzugefügt. Die Mischung wird auf 20°C über 2 Stunden abgekühlt. Die Mischung wird weiter auf 4°C abgekühlt und dort für 1 Stunde gehalten. Die Reinheit des Produktes wird durch HPLC (Säule – 150 × 3,9 mm Waters Symmetry C18, 5 Mikrometer; Mobile Phase – 20% Acetonitril/80% 0,1% TFA in Wasser; Flussgeschwindigkeit – 1,0 ml/Min.; Wellenlänge – 225 nm; RT: 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-Kaliumsalz – 3,3 Min.) überwacht. Der Feststoff wird abfiltriert und mit 10,0 L 4 M KOH (22,5%ige Lösung) gewaschen und unter Stickstoff getrocknet, um 9,4 kg, 151% Ausbeute, von 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-Kaliumsalz zu ergeben. HPLC-Analyse 97,4% rein.
  • Ein 30-Gallonen Reaktor wird mit insgesamt 18,1 kg (9,4 kg + 8,7 kg aus zwei Läufen) 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-Kaliumsalz und 100,0 L Wasser beschickt. Der pH-Wert der Mischung wird durch Hinzufügen von 13,0 L 6 N HCl bei 23–27°C auf pH = 5,95 eingestellt.
  • Die Mischung wird für 1,5 Stunden bei 22–25°C gerührt. Der Feststoff, der sich bildet, wird abfiltriert und mit 60,0 L Wasser gewaschen. Die Reinheit des Produktes wird durch HPLC (Säule – 150 × 3,9 mm Waters Symmetry C18, 5 Mikrometer; Mobile Phase – 20% Acetonitril/80% 0,1% TFA in Wasser; Flussgeschwindigkeit – 1,0 ml/Min.; Wellenlänge – 225 nm; RT: 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure – 3,3 Min.) überwacht. Der Feststoff wird bei 60°C/50 Torr getrocknet, um 10,2 kg, 41,1% Ausbeute, von der Titelverbindung zu ergeben: HPLC-Analyse 98,4% rein.
    Analyse: Berechnet für C14H11N3O2·1,21 H2O:%C 61,15%; %H 4,91%; %N 15,28%. Gefunden, %C 60,83%; %H 5,05%; %N 15,37%. Vergleichsbeispiel 29
    Figure 00870001
    Salzbildung: 1-Methyl-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-Maleat
  • Eine Mischung aus 1-Methyl-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester (Präparation beschrieben in Beispiel 24A, siehe auch US-Patentschrift 5,328,920 ; 0,5 g, 1,69 mmol) Lithiumhydroxid-Hydrat (0,106 g, 2,53 mmol) und Wasser – Ethanol, 1:4 wird unter N2 bei 50°C für 4 Stunden gerührt. Es wird ein Anteil von dem Ethanol entfernt und die Reaktionsmischung bei ungefähr 5°C über Nacht gelagert. Der resultierende Feststoff wird filtriert, mit Wasser gewaschen und bei 40°C unter Hochvakuum getrocknet, um 0,41 g von einem weißen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wird in Methanol suspendiert und Maleinsäure (0,346 g) hinzugefügt und für 0,5 Stunden stehen gelassen. Das Filtrat wird filtriert und konzentriert, um einen gelbbraunen Feststoff zu erlangen. Der Feststoff wird von Methanol/Ethylacetat rekristallisiert und 0,19 g (29%) der Titelverbindung erhalten. MS 224 (-CO2, M+H), m.p. 192–194°C (dec).
    Analyse: Berechnet für C15H13N3O2·C4H4O4: 59,53 %C; 4,47 %H; 10,96 %N; Gefunden: 59,47 %C; 4,47 %H; 10,86 %N. Vergleichsbeispiel 30
    Figure 00880001
    Schema F, Schritt F3: 4-Fluor-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-Trifluoracetat-Salz
  • Eine Lösung von 4-Fluor-3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester (Beispiel 17, 0,15 g, 0,458 mmol) in 35% Trifluoressigsäure/Dichlormethan wird bei Umgebungstemperatur für 3 Stunden gerührt. Die Reaktion wird unter Vakuum konzentriert, um einen grauen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wird bei 40°C unter Vakuum getrocknet und dann mit heißem Ethylacetat trituriert. Es wird auf Umgebungstemperatur abkühlen lassen und ein hellgraues Pulver gesammelt. Das Pulver wird bei 45°C unter Vakuum für 2 Stunden getrocknet und 0,15 g (88%) von der Titelverbindung erhalten. MS 272 (M+H), m.p. 231–234°C (dec.). Vergleichsbeispiel 31
    Figure 00890001
    Schema F, Schritt F3: 4-Fluor-1-methyl-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure Trifluoracetat-Salz
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 30 gefolgt, wobei mit 4-Fluor-1-methyl-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester (Beispiel 25) gestartet wird, um die Titelverbindung als cremefarbenes Pulver zu erhalten. MS 286 (M+H), m.p. 197–199°C.
  • Vergleichsbeispiel 32
    Figure 00890002
    Schema F, Schritt F3: 5-Methoxy-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-Trifluoracetat-Salz
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 30 gefolgt, wobei mit 5-Methoxy-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester (Beispiel 21) gestartet wird, um die Titelverbindung als weißes Pulver zu erhalten. ESI/MS 284 (M+N), m.p. 211–213°C. Vergleichsbeispiel 33
    Figure 00900001
    Schema F, Schritt F8: 1-Ethoxycarbonylmethyl-3-(pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Eine Mischung von Ethyl-3-(4-pyridinylamino)indol-2-carboxylat (siehe US-Patentschrift Nr. 5,328,920 ; 0,20 g, 0,711 mmol) in Dimethylformamid (5 ml) wird unter Stickstoff gerührt und auf 0°C gekühlt. Eine 1 M Lösung von Kalium-tert-butoxid in Tetrahydrofuran (0,75 ml, 0,75 mmol) wird in einer Portion hinzugefügt, für 10 Minuten gerührt und dann Ethylbromacetat (0,12 g, 0,72 mmol) in einer Portion hinzugefügt. Es wird bei 0°C für 50 Minuten gerührt und die Reaktion in Wasser (30 ml) abgeschreckt. Die wässrige Mischung wird mit Ethylacetat (2 × 20 ml) extrahiert, die Extrakte vereinigt, mit Wasser (25 ml), Salzlake (25 ml) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Es wird unter Vakuum konzentriert, der Rückstand an einer Redisep Kieselgel-Kartusche (10 g) chromatographiert, wobei mit 5% Methanol/Dichlormethan bis 20% Methanol/Dichlormethan eluiert wird. Nicht-homogene Fraktionen werden vereinigt, konzentriert und wieder wie oben chromatographiert. Alle homogenen Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um 0,13 g (50%) von der Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu ergeben. MS 368 (M+H). Vergleichsbeispiel 34
    Figure 00910001
    Schema F, Schritt F8: 6-Chlor-1-diethylcarbamoylmethyl-3-(pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Eine Mischung von 6-Chlor-3-(4-pyridinylamino)indol-2-carboxylat (0,50 g, 1,58 mmol) in Dimethylformamid (5 ml) wird unter Stickstoff gerührt und auf 0°C gekühlt. Eine 1 M Lösung von Kalium-tert-butoxid in Tetrahydrofuran (1,7 ml, 1,7 mmol) wird eine Zeitspanne von 2 Minuten hinzugefügt und für 10 Minuten gerührt. 2-Chlor-N,N-diethylacetamid (0,22 ml, 1,6 mmol) wird in einer Portion hinzugefügt und bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktion wird in Wasser (35 ml) abgeschreckt und die wässrige Mischung mit Ethylacetat (2 × 20 ml) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, mit Wasser (25 ml), Salzlake (25 ml) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Es wird unter Vakuum konzentriert und der Rückstand an einer Redisep Kieselgel-Kartusche (10 g) chromatographiert, wobei mit 5% Methanol/Dichlormethan bis 20% Methanol/Dichlormethan eluiert wird. Alle homogenen Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um einen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wird von Ethylacetat rekristallisiert und 0,1 g der Titelverbindung als ein weißer Feststoff erhalten. MS 429 (M+H), m.p. 212–214°C. Vergleichsbeispiel 35
    Figure 00920001
    Schema F, Schritt F5: 3-(Pyrimidin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurepentafluorphenylester
  • Eine Suspension aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (0,2 g, 0,78 mmol) in Dimethylformamid wird unter N2 gerührt, Pyridin (0,13 ml, 1,6 mmol) hinzugefügt und dann tropfenweise Pentafluorphenyltrifluoracetat (0,31 g, 1,13 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wird über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt und dann in Wasser abgeschreckt. Die wässrige Mischung wird mit Ethylacetat extrahiert, mit 5% wässrigem Kaliumcarbonat und Salzlake gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Es wird unter Vakuum konzentriert, um einen unbearbeiteten Feststoff zu liefern, der mit Ether trituriert wird, um 0,13 g (41%) der Titelverbindung zu erhalten. MS 420 (M+H). Vergleichsbeispiel 36
    Figure 00920002
    Schema F, Schritt F7: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-diethylaminoethylester
  • Eine Suspension von NaH (29 mg, 0,72 mmol einer 60%igen Öldispersion) in 1-Methyl-2-pyrrolidinon (15 ml) wird unter Stickstoff bei 0°C gerührt und langsam N,N-Diethylethanolamin (0,095 ml, 0,72 mmol) hinzugefügt. Es wird für 10 Minuten gerührt und dann tropfenweise 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurepentafluorphenylester (100 mg, 0,24 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wird auf Umgebungstemperatur kommen lassen und über Nacht gerührt. Es wird in Wasser abgeschreckt und mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser und Salzlake gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter Vakuum konzentriert, um das unbearbeitete Produkt zu erlangen. Es wird an Kieselgel (10 g, Sepack-Kartusche) chromatographiert und 1:1 Methanol/Ethylacetat als Elutionsmittel verwendet. Ähnliche Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum konzentriert, um 26,3 mg (31%) von der Titelverbindung zu erhalten. MS 353 (M+H). Vergleichsbeispiel 37
    Figure 00930001
    Schema F, Schritt F7: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäuredimethylaminoethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 36 gefolgt, wobei mit N,N-Dimethylethanolamin gestartet, um die Titelverbindung als einen Feststoff zu erhalten. MS 325 (M+H). Vergleichsbeispiel 38
    Figure 00940001
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-piperidin-1-ylethylester
  • Eine Suspension aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (0,25 g, 1 mmol), Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorphosphat (0,52 g, 1 mmol), Diethylisopropylamin (0,175 ml, 1 mmol) und 1-Methyl-2-pyrrolidinon (4,0 ml) wird unter N2 bei 0°C gerührt. Es wird 1-Piperidinethanol (0,50 ml, 3,8 mmol) in einer Portion hinzugefügt und bei Umgebungstemperatur für 18,5 Stunden gerührt. Die Reaktion wird in 5% wässriges Kaliumcarbonat gegossen und mit Ethylacetat (2 × 20 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wird mit Wasser (20 ml) und Salzlake (20 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum zu einem dunklen Rückstand konzentriert. Es wird über Kieselgel (Redisep-Kartusche, 30 g) chromatographiert und mit einem Stufengradienten von 10% Methanol/Dichlormethan (150 ml) bis 20% Methanol/Dichlormethan eluiert. Ähnliche Fraktionen werden unter Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird unter Hochvakuum bei Umgebungstemperatur getrocknet und 0,14 g von der Titelverbindung als ein gelbbrauner Schaum erhalten. MS 365 (M+H), TLC (Kieselgel, 0,5/9,5/90 Ammoniumhydroxid/Methanol/Dichlormethan) Rf = 0,25. Vergleichsbeispiel 39
    Figure 00950001
    Schema H, Schritt H1: 3-(4-Pyridinylamino)benzo(b)thiophen-2-carbonsäureethylester
  • Eine Lösung aus wasserfreiem Tetrahydrofuran (25 ml) und 3-(4-Pyridyl)amino)benzo(b)thiophen HCl (siehe US-Patentschrift Nr. 5,328,920 ; 298 mg, 1,09 mmol) wird auf –78°C gekühlt und eine 2 molare Lösung von Lithiumdiisopropylamid in Heptan/Tetrahydrofuran/Ethylbenzol (1,9 ml, 3,8 mmol) hinzugefügt. Nach 2 Stunden wird Diethylcarbonat (1,2 ml, 9,89 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wird für weitere 3 Stunden gerührt während die Temperatur auf –40°C steigt. Das Kältebad wird entfernt und nach 30 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von Wasser (10 ml) abgeschreckt. Die Reaktion wird mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt, mit Salzlake gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert. Der Rückstand wird an einer ISCO RediSep 10-Gramm Kieselgel-Kartusche mit Ethylacetat-50% Heptan und Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um Ethyl-3-[(4-pyridyl)amino]benzo[b]thiophenyl-2-carboxylat als einen gelbbraunen Feststoff (289 mg, 86%) zu ergeben. ESI/MS 299 (M+H); 1H-NMR δ 1,41–1,43 (m, 3H), 4,11–4,43 (m, 2H), 6,81 (2H), 7,23–7,52 (m, 1H), 7,60 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,84 (d, J = 9 Hz, 1H), 8,36 (br d, 2H), 8,43 (s, 1H, NH); 13C-NMR δ 14,29, 61,44, 112,61, 113,92, 123,36, 124,11, 125,15, 127,86, 132,53, 139,49, 141,75, 149,68, 150,36, 164,53.
  • Vergleichsbeispiel 40
    Figure 00960001
    Schema H, Schritt H1: 6-Fluor-3-(4-pyridinylamino)benzo(b)thiophen-2-carbonsäureethylester
  • Eine Lösung aus wasserfreiem Tetrahydrofuran (20 ml) und 6-Fluor-3-[(4-pyridyl)amino]benzo(b)thiophen (siehe US-Patentschrift Nr. 5,177,088 ; 181 mg, 0,741 mmol) wird auf –78°C gekühlt und eine 2 molare Lösung von Lithiumdiisopropylamid in Heptan/Tetrahydrofuran/Ethylbenzol (0,74 ml, 1,5 mmol) hinzugefügt. Nach 2 Stunden wird Diethylcarbonat (0,8 ml, 6,59 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wird für 1 weitere Stunde gerührt, sie sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen lassen und über Nacht fortgesetzt zu rühren. Die Reaktion wird durch Zugabe von Wasser (10 ml) abgeschreckt. Es werden alle Lösemittel an einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen. Das Ethylacetat wird mit Wasser und Salzlake gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert. Der Rückstand wird an einer ISCO RediSep 10-Gramm Kieselgel-Kartusche mit Ethylacetat-50% Heptan und Ethylacetat-0,5% NH4OH als Elutionsmittel gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um 6-Fluor-3-[(4-pyridyl)amino]benzo[b]thiophenyl-2-carboxylat zu ergeben. ESI/MS 317 (M+H); 1H-NMR 6 1,40–1,43 (m, 3H); 4,35–4,42 (m, 2H); 6,80 (br d, 2H); 7,04–7,10 (m, 1H); 7,48–7,57 (m, 2H); 8,37 (br s, 2H); 8,43 (s, 1H, NH); 13C-NMR δ 14,3; 61,5; 109,2 (JCF = 25 Hz); 112,7 (JCF = 4 Hz); 113,4; 113,7 (JCF = 25 Hz); 126,7 (JCF = 9 Hz); 129,0; 140,9 (JCF = 11 Hz); 141,4; 149,5; 150,5; 162,4 (JCF = 260 Hz); 164,1; 19F-NMR (282 MHz) δ –110,8. Vergleichsbeispiel 41
    Figure 00970001
    Schema H, Schritt H1: 3-[(4-Pyridyl)amino-N-methyl]benzo[b]thiophenyl-2-carbonsäureethylester
  • Eine Lösung aus wasserfreiem Tetrahydrofuran (4 ml) und 3-[(4-Pyridyl)amino-N-methyl]benzo(b)thiophen HCl (siehe US-Patentschrift Nr. 5,328,920 ; 50 mg, 0,18 mmol) wird unter Stickstoff auf –76°C gekühlt und eine 2 molare Lösung von Lithiumdiisopropylamid in Heptan/Tetrahydrofuran/Ethylbenzol (0,28 ml, 0,54 mmol) hinzugefügt. Nach 20 Minuten wird das Trockeneis/Aceton-Bad gegen ein Eis/Wasser-Bad ausgetauscht. Nach 1 Stunde mit Diethylcarbonat (0,27 ml, 2,23 mmol) hinzugefügt und die Reaktion für 4 Stunden bei dieser Temperatur gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur. Die Reaktion wird durch Zugabe von Wasser (3 ml) abgeschreckt. Die Reaktion wird mit Ether extrahiert und der Extrakt mit Salzlake gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert. Der Rückstand wird an einer ISCO RediSep 4-Gramm Kieselgel-Kartusche mit Ethylacetat-3% Methanol-NH4OH als Elutionsmittel gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um 3-[(4-pyridyl)amino-N-methyl]benzo[b]thiophenyl-2-carbonsäureethylester als einen gelbbraunen Feststoff (30 mg, 53%) zu ergeben. ESI/MS 313 (M+H); 1H-NMR δ 1,26 (t, 3H, J = 9 Hz), 3,38 (s, 3H, Me), 4,30 (q, 2H, J = 6 Hz), 6,42 (br s, 2H), 7,57 (m, 3H), 7,90 (d, 1H, J = 9 Hz), 8,21 (br s, 2H); 13C-NMR δ 14,1, 38,2, 61,6, 107,7, 123,3, 123,4, 125,2, 127,9, 135,8, 139,3, 142,6, 149,9, 153,5, 161,2.
  • Vergleichsbeispiel 42
    Figure 00980001
    Schema H, Schritt H2: 3-(4-Pyridinylamino)-6-trifluor-methylbenzo(b)thiophen-2-carbonsäure-methansulfonat-Salz
  • Eine Lösung aus wasserfreiem Tetrahydrofuran (60 ml) und 3-[(4-Pyridinylamino)-6-trifluormethyl-benzo[b]thiophen (siehe US-Patentschrift Nr. 5,328,920 ; 0,47 g, 1,6 mmol) wird unter Stickstoff auf –78°C gekühlt und eine 2,5 molare Lösung von n-Butyllithium in Hexan (1,3 ml, 3,25 mmol) mittels einer Spritze hinzugefügt. Die Reaktion wird für 2 Stunden gerührt und in ein Becherglas gegossen, das 140 g Trockeneis und 10 ml wasserfreies Tetrahydrofuran enthält. Die Reaktion wird für 1 Stunde gerührt, Wasser (50 ml) hinzugefügt und mit 10% wässrigem Natriumhydroxid auf pH 13–14 basisch gemacht. Die basische Lösung wird mit Ether (2 × 10 ml) extrahiert und der wässrige Anteil mit 3% wässriger HCl angesäuert. Bei etwa pH 7 präzipitiert ein weißer Feststoff aus der Lösung. Der Feststoff wird gesammelt und über Nacht unter Vakuum getrocknet, um 0,35 g (65%) der freien Base der Titelverbindung zu liefern. Ein Anteil von der freien Base wird mit Methansulfonsäure umgesetzt und 59,0 mg der Titelverbindung erhalten. ESI/MS 339 (M+H), HPLC: Rt = 1,38 min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/min Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min, Halten bis 3,5 Min.) Vergleichsbeispiel 43
    Figure 00990001
    Schema H, Schritt H2: 3-(4-Pyridinylamino)benzo[b]thiophen-2-carbonsäure-hydrochlorid-Salz
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 42 gefolgt, wobei mit 3-(4-Pyridinylamino)-6-benzo[b]thiophen (siehe US-Patentschrift Nr. 5,328,920 zur Synthese) gestartet wird. Das Hydrochlorid-Salz wird in Methanol und etherhaltiger HCl gebildet, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben. ESI/MS 271 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 44
    Figure 00990002
    Schema H, Schritt H1: 3-(4-Pyridinylamino)-6-trifluormethyl-benzo[b]thiophen-2-carbonsäureethylester-hydrochlorid-Salz
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 40 gefolgt, wobei mit 3-(4-Pyridinylamino)-6-trifluormethylbenzo[b]thiophen (siehe US-Patentschrift Nr. 5,328,920 zur Synthese) gestartet wird. Das Hydrochlorid-Salz wird in etherhaltiger HCl gebildet, um die Titelverbindung als einen cremefarbigen Feststoff zu ergeben. MS 367 (M+H), TLC (Kieselgel, Ethylacetat/Methanol/Ammoniumhydroxid) Rf = 0,80. Vergleichsbeispiel 45
    Figure 01000001
    Schema H, Schritt H1: 3-(Propyl-4-pyridinylamino)benzo[b]thiophen-2-carbonsäureethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 40 gefolgt, wobei mit 3-(Propyl-4-pyridinylamino)benzo[b]thiophen (siehe US-Patentschrift Nr. 5,328,920 zur Synthese) gestartet wird. Die Titelverbindung wird als ein gelbbrauner Feststoff erhalten. ESI/MS 341 (M+H), HPLC: Rt = 1,53 min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/Min. Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min Halten bis 3,5 Min.) Vergleichsbeispiel 46
    Figure 01000002
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-(S)-1-methoxycarbonylethylester
  • Eine Suspension aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (3,0 g, 12 mmol), Methyl-(S)-(–)-lactat (2,3 ml, 24 mmol), 4-Methylmorpholin (2,6 ml, 24 mmol) und DMF (50,0 ml) wird bei 0°C gerührt. Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP, 5,32 g, 12 mmol) wird in einer Portion hinzugefügt und bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Es wird Salzlake (50 ml) hinzugefügt und mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Es wird unter Vakuum zu einem Öl konzentriert. Es wird über Kieselgel (5 g) chromatographiert und mit Dichlormethan, EtOAc und MeOH eluiert. Ähnliche Fraktionen werden unter Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird mit HCl in Ether (10 ml) behandelt, zusätzlicher Ether (50 ml) hinzugefügt und unter Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird mit 5% wässrigem NAHCO3 behandelt und mit EtOAc extrahiert. Der Extrakt wird über Na2SO4 getrocknet, filtriert und zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird in der Gegenwart von Ether mit einem Glasstab bearbeitet, um einen klebrigen Feststoff zu erhalten. Es wird CH3CN hinzugefügt und dann Ether und die Titelverbindung als ein gelber Feststoff, 140 mg, erhalten. MS 340 (M+H), Rt = 2,73 Min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/Min. Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min Halten bis 3,5 Min.) Vergleichsbeispiel 47
    Figure 01010001
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-methoxyethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 46 gefolgt, aber die Reaktion auf –10 bis 15°C gekühlt, 2-Methoxyethanol für Methyl-(S)-(–)-lactat substituiert und durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei mit 15% MeOH/Dichlormethan eluiert wird, um die Titelverbindung zu erhalten. MS 312 (M+H), TLC (Kieselgel, 15% MeOH/Dichlormethan) Rf = 0,53.
  • Vergleichsbeispiel 48
    Figure 01020001
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-3-ethoxypropylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 47 gefolgt, 2-Ethoxyethanol für 2-Methoxyethanol substituiert und durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei mit 8,5% MeOH/Dichlormethan eluiert wird, um die Titelverbindung zu erhalten. MS 340 (M+H), TLC (Kieselgel, 8,5% MeOH/Dichlormethan) Rf = 0,30.
  • Vergleichsbeispiel 49
    Figure 01020002
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-ethoxycarbonylmethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 46 gefolgt, Ethylglycolat für Methyl (S)-(–)-lactat und NMP für DMF substi tuiert und durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei mit Dichlormethan, EtOAc und 1% MeOH/Dichlormethan eluiert wird, um die Titelverbindung zu erhalten. MS 340 (M+H), Rt = 1,19 Min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/Min. Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min Halten bis 3,5 Min.) TLC Rf = 0,51 (3:1 EtOAc:CH3OH, Kieselgel).
  • Vergleichsbeispiel 50
    Figure 01030001
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureindan-5-ylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 49 gefolgt, wobei 5-Indanol für Ethylglycolat und Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorphosphat (PYBOP) für BOP substituiert wird. Es wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei mit EtOAc eluiert wird, um die Titelverbindung zu erhalten. MS 370 (M+H), Rt = 1,35 Min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/Min. Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min Halten bis 3,5 Min.) TLC Rf = 0,52 (EtOAc, Kieselgel).
  • Vergleichsbeispiel 51
    Figure 01040001
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurediethylcarbamoylmethylester
  • Eine Mischung aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (2,0 g, 8 mmol), KI (10 mg) und Cs2CO3 (2,8 g, 8,6 mmol) in DMF (125 ml) wird bei 50°C für 10 Minuten gerührt. Es wird auf Umgebungstemperatur abkühlen lassen und dann in einem Eisbad gekühlt. Es wird 2-Chlor-N,N-diethylacetamid (1,077 g, 0,9 mmol) hinzugefügt und auf Umgebungstemperatur erwärmen lassen. Salzlake wird zu der Reaktion hinzugefügt und sie mit EtOAc (3X) extrahiert. Der Extrakt wird mit Salzlake und Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter Vakuum konzentriert, um ein halbfestes Produkt zu ergeben. Es wird eine Flash-Chromatographie an Kieselgel durchgeführt, wobei zuerst mit EtOAc und 10% MeOH/EtOAc eluiert wird und 0,317 g der Titelverbindung als ein Feststoff erhalten wird: MS 367 (M+H), HPLC: Rt = 4,75 min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/min Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min Halten bis 3,5 Min.) Vergleichsbeispiel 52
    Figure 01050001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-morpholin-4-yl-2-oxoethylester
  • Zwischenprodukt: 4-(Chloracetyl)morpholin
  • Es wird ein Quest 205 Parallel Synthesizer verwendet und zu einer Mischung aus Morpholin (2,6 g, 30 mmol), Dichlormethan (45 ml) und 2 M K2CO3 wird langsam Chloracetylchlorid (3,73 g, 33 mmol) in Dichlormethan (10 ml) hinzugefügt. Die Reaktion wird über Nacht bewegt und die organische Schicht abfiltriert. Die wässrige Schicht wird mit Dichlormethan (20 ml) extrahiert und zu der vorher gesammelten organischen Schicht hinzugefügt. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO4) und unter Vakuum konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-morpholin-4-yl-2-oxoethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 51 gefolgt, wobei 4-(Chloracetyl)morpholin für 2-Chlor-N,N-diethylacetamid substituiert wird. Das Präzipitat, das sich in dem EtOAc-Extrakt bildet, wird gesammelt und mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung als einen Feststoff zu erhalten. MS 381 (M+H), HPLC: Rt = 2,48 min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/Min. Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min Halten bis 3,5 Min.) Vergleichsbeispiel 53
    Figure 01060001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-oxo-2-pyrrolidin-1-yl-ethylester
  • Zwischenprodukt: 1 Chloracetylpyrrolidin
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 53 gefolgt, wobei Pyrrolidin für Morpholin substituiert und die Titelverbindung erhalten wird.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-oxo-2-pyrrolidin-1-yl-ethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 51 gefolgt, wobei 1-(Chloracetyl)pyrrolidin für 2-Chlor-N,N-diethylacetamid substituiert wird. Das Präzipitat, das sich in dem EtOAc-Extrakt bildet, wird gesammelt und mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung als einen Feststoff zu erhalten. MS 365 (M+H), HPLC: Rt = 2,58 min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/min Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min Halten bis 3,5 Min.) Vergleichsbeispiel 54
    Figure 01070001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure(benzylethylcarbamoyl)methylester
  • Zwischenprodukt: 2-Chloro-N-ethyl-N-(phenylmethyl)acetamid
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 53 gefolgt, wobei N-Benzyl-N-ethylamin für Morpholin substituiert und die Titelverbindung erhalten wird.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure(benzylethylcarbamoyl)methylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 51 gefolgt, wobei 2-Chlor-N-ethyl-N-(phenylmethyl)acetamid für 2-Chlor-N,N-diethylacetamid substituiert wird. Das Präzipitat, das sich in dem EtOAc-Extrakt bildet, wird gesammelt und mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung als einen gelben Feststoff zu erhalten. MS 429 (M+H), HPLC: Rt = 2,72 min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/Min. Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min Halten bis 3,5 Min.) Vergleichsbeispiel 55
    Figure 01080001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-azetidin-1-yl-2-oxoethylester
  • Zwischenprodukt: 1-(Chloracetyl)azetidin
  • Zu einer rührenden Lösung von Chloracetylchlorid und K2CO3 (4,14 g, 30 mmol) in Dichlormethan-Wasser (45-15 ml) wird mittels einer Spritze langsam Azetidin (2,8 g, 30 mmol) hinzugefügt. Nach der Zugabe wird über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Die organische Schicht wird abgetrennt und mit H2O (zweimal) und Salzlake (zweimal) gewaschen und dann unter vermindertem Druck konzentriert, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-azetidin-1-yl-2-oxoethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 51 gefolgt, wobei 1-(Chloracetyl)azetidin für 2-Chlor-N,N-diethylacetamid substituiert wird. Das Präzipitat, das sich in dem EtOAc-Extrakt bildet, wird gesammelt und mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung als einen gelben Feststoff zu erhalten. MS 351 (M+H), HPLC: Rt = 2,52 min. (95/5/0,1 (A) 5/95/0,1 (B) Wasser/CAN/Ameisensäure YMC ODS-A 2 × 50 mm 1 ml/Min. Gradienten-Zusammensetzung: 100% A für 0,1 Min. Linearer Gradient bis 100% B bei 2 min Halten bis 3,5 Min.) Vergleichsbeispiel 56
    Figure 01090001
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-5-methyl-2-oxo-[1,3]dioxol-4-ylmethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 51 gefolgt, wobei 4-(Brommethyl)-5-methyl-1,3-dioxol-2-on (was gemäß den in Saari, W. S., et al., J. Med. Chem., (1984), 27, 713–717 dargelegten Prozeduren hergestellt wurde) für 2-Chlor-N,N-diethylacetamid substituiert wird. Es wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei mit 10% MeOH/EtOAc und dann 15% MeOH/EtOAc eluiert wird, um die Titelverbindung als ein blassgelbes Pulver zu erhalten. MS 366 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 57
    Figure 01090002
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurediethylcarbamoyloxymethylester
  • Zwischenprodukt: Chlormethyldiethylcarbamat
  • Zu einer gerührten Lösung aus Chlormethylchlorformiat (7,09 g, 5,5 mmol) in Heptan (100 ml) wurde bei –20°C eine Lösung von Diethylamin (10,4 g, 14,7 mmol) in Heptan (50 ml) tropfenweise hinzugegeben. Die Innentemperatur wird zwischen –15°C bis –5°C gehalten und nach 1 Stunde die Reaktion mit Wasser abgeschreckt. Die Schichten werden getrennt und die organische Phase wird mit 10% wässriger HCl, Wasser und NaHCO3-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, um 8,3 g von der Titelverbindung zu erhalten.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurediethylcarbamoyloxymethylester
  • Eine Mischung aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (2,0 g, 8,0 mmol), Chlormethyldiethylcarbamat (1,7 g, 10,4 mmol) und K2CO3 in DMF (50 ml) wird bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Es wird EtOAc (400 ml) zu der Reaktionsmischung hinzugefügt, die organische Schicht mit Salzlake (400 ml) gewaschen und zu einem Öl konzentriert. Es wird mittels Flash-Chromatographie über Kieselgel (40 g) gereinigt, wobei mit EtOAc und dann mit 10% MeOH/EtOAc eluiert wird. Ähnliche Fraktionen werden unter Vakuum konzentriert, um ein Öl zu erhalten. Es wird aus Heptan-Ether kristallisiert, um 1,1 g (36%) von der Titelverbindung als ein weißes Pulver zu erhalten: MS 383 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 58
    Figure 01110001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurepiperidin-1-carbonyloxymethylester
  • Zwischenprodukt: 1-Piperidincarbonsäurechlormethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 57 gefolgt, wobei Piperidin für Diethylamin substituiert und die Titelverbindung erhalten wird.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurepiperidin-1-carbonyloxymethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 57, Schritt F4 gefolgt, wobei 1-Piperidincarbonsäurechlormethylester für Chlormethyldiethylcarbamat substituiert wird, um die Titelverbindung als einen Feststoff zu erhalten; MS 395 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 59
    Figure 01110002
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäuremorpholin-4-carbonyloxymethylester
  • Zwischenprodukt: 4-Morpholincarbonsäurechlormethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 57 gefolgt, wobei Morpholin für Diethylamin substituiert und die Titelverbindung erhalten wird.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäuremorpholin-4-carbonyloxymethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 57 gefolgt, wobei 4-Morpholincarbonsäurechlormethylester für Chlormethyldiethylcarbamat substituiert wird, um die Titelverbindung als einen Feststoff zu erhalten. MS 397 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 60
    Figure 01120001
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-ethoxycarbonylamino-2-oxoethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 57 gefolgt, wobei N-Chloracetylurethan für Chlormethyldiethylcarbamat substituiert wird. Es wird mittels Säulenchromatographie gereinigt, wobei mit 10% MeOH/EtOAc und dann 15% MeOH/EtOAc eluiert wird. Es wird aus CH3CN rekristallisiert, um die Titelverbindung als einen Feststoff zu erhalten. MS 383 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 61
    Figure 01130001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurebenzylcarbamoyloxymethylester
  • Zwischenprodukt: (Phenylmethyl)carbaminsäurechlormethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 57 gefolgt, wobei Benzylamin für Diethylamin substituiert und die Titelverbindung erhalten wird.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurebenzylcarbamoyloxymethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 57, Schritt B gefolgt, wobei (Phenylmethyl)carbaminsäurechlormethylester für Chlormethyldiethylcarbamat substituiert wird. Es wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei mit 10% MeOH/EtOAc und dann 20% MeOH/EtOAc eluiert wird, um die Titelverbindung als einen Feststoff zu erhalten: MS 417 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 62
    Figure 01140001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureisopropoxycarbonyloxymethylester
  • Zwischenprodukt: Chlormethylkohlensäure-1-methylester
  • Eine Lösung aus Chlormethylchlorformiat (3,55 g, 27,5 mmol) in Dichlormethan (30 ml) wird gerührt und auf –15°C gekühlt und eine Lösung aus Isopropylalkohol (1,51 g, 2,5 mmol) in Pyridin (2,18 g, 2,5 mmol) wird tropfenweise hinzugefügt, um eine Innentemperatur von zwischen –18°C bis –5°C zu halten. Nach 2 Stunden wird in Wasser abgeschreckt, die Schichten getrennt und die organische Phase mit 10% wässriger HCl, Wasser, NaHCO3-Lösung und Wasser gewaschen. Es wird mit MgSO4 getrocknet, filtriert und konzentriert, um die Titelverbindung als 3,6 g eines farblosen Öls zu erhalten.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureisopropoxycarbonyloxymethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 57 gefolgt, wobei Chlormethylcarbonsäure-1-methylester für Chlormethyldiethylcarbamat substituiert wird und KI (100 mg) zu der Reaktionsmischung hinzugefügt wird. Die Reaktion wird für 3 Stunden fortschreiten lassen und die Titelverbindung als ein Feststoff erhalten. MS 370 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 63
    Figure 01150001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureadamantan-1-yloxycarbonyloxymethylester
  • Zwischenprodukt: Chlormethyl-1-adamantylcarbonat
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 62 gefolgt, wobei 1-Adamantol für Isopropylalkohol substituiert wird, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureadamantan-1-yloxycarbonyloxymethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 62 gefolgt, wobei Chlormethyl-1-adamantylcarbonat für Chlormethylcarbonsäure-1-methylester substituiert wird, aber die Reaktion über Nacht fortschreiten lassen wird. Die Titelverbindung wird als ein Feststoff erhalten. MS 462 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 64
    Figure 01150002
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-1,1,2-trimethylpropoxycarbonyloxymethylester
  • Zwischenprodukt: Carbonsäurechlormethylester-1,1,2-trimethylpropylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 62 gefolgt, wobei 2,3-Dimethyl-2-butanol für Isopropylalkohol substituiert wird, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-1,1,2-trimethylpropoxycarbonyloxymethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 62 gefolgt, wobei Kohlensäurechlormethylester-1,1,2-trimethylpropylester für Chlormethylkohlensäure-1-methylester substituiert wird, aber die Reaktion über Nacht fortschreiten lassen wird. Die Titelverbindung wird als ein Feststoff erhalten. MS 412 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 65
    Figure 01160001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurecyclohexyloxycarbonyloxymethylester
  • Zwischenprodukt: Carbonsäurechlormethylester-1,1,2-trimethyl-propylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 62 gefolgt, wobei Cyclohexanol für Isopropylalkohol substituiert wird, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurecyclohexyloxycarbonyloxymethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 62 gefolgt, wobei Chlormethylcyclohexylcarbonat für Chlormethylcarbonsäure-1-methylester substituiert wird, aber die Reaktion über Nacht fortschreiten lassen wird. Die Titelverbindung wird als ein Feststoff erhalten. MS 410 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 66
    Figure 01170001
    Schema F, Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureacetoxymethylester
  • Eine Mischung aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (1,27 g, 5 mmol) in DMF (25 ml) wird bei 50°C für 10 Minuten gerührt und Cs2CO3 (1,63 g, 5 mmol) hinzugefügt. Nach 10 Minuten wird Brommethylacetat (0,95 g, 6,21 mmol) hinzugefügt und eine Minute danach in wässrige NH4Cl-Lösung abgeschreckt. Es wird mit EtOAc extrahiert und der Extrakt mit wässriger NaHCO3-Lösung gewaschen. Der Extrakt wird getrocknet (MgSO4), filtriert und unter Vakuum konzentriert, um einen Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wird mit EtOAc trituriert und die Titelverbindung als ein Feststoff erhalten. MS 326 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 67
    Figure 01180001
    Schema F, Schritt F2: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2,2-dimethylpropionyloxymethylester
  • Eine Mischung aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure Kaliumsalz (1,0 g, 3,43 mmol), KI (0,16 g) 2,2-Dimethylpropionsäurechlormethylester (0,63 g, 4,16 mmol) in DMF (20 ml) wird bei 50°C für 1,5 Stunden gerührt. Es wird abgekühlt und zwischen H2O-EtOAc partitioniert. Der Extrakt wird mit wässriger NaHCO3-Lösung gewaschen, der Extrakt wird getrocknet (MgSO4), filtriert und unter Vakuum konzentriert, um das unbearbeitete Produkt zu liefern. Das Produkt wird an einer Kieselgelsäule chromatographiert, wobei mit 8% MeOH/EtOAc eluiert wird, um 0,64 g von der Titelverbindung als einen Feststoff zu erhalten: MS 326 (M+H), m.p. 223–224°C, TLC (Kieselgel, 8% MeOH/EtOAc) Rf = 0,30.
  • Vergleichsbeispiel 68
    Figure 01180002
    Schema F, Schritt F2: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäurepentanoyloxymethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 67 gefolgt, außer dass Pentanonsäurechlormethylester für 2,2-Dimethylpropionsäurechlormethylester substituiert wird und die Reaktion über Nacht bei 50°C fortschreiten lassen wird. Es wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei mit 5% MeOH/EtOAc eluiert wird, um die Titelverbindung zu erhalten. MS 368 (M+H).
  • Vergleichsbeispiel 69
    Figure 01190001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-oxopiperidin-1-ylmethylester
  • Zwischenprodukt: N-(Chlormethyl)-2-piperidinon
  • Die Titelverbindung wird gemäß den Prozeduren, die in Moreira, R. et al., Tet. Lett., (1994), 35, 7107–7110 dargelegt sind, hergestellt. Demzufolge wird eine Mischung aus 2-Piperidinon (1,0 g, 10,09 mmol) und Paraformaldehyd (500 mg) unter Rückfluss in wasserfreiem THF (30 ml) und Chlortrimethylsilan (30 ml) über Nacht unter N2 erhitzt. Das Lösemittel wird unter Vakuum konzentriert, um N-(Chlormethyl)-2-piperidon als ein Öl (1,30 g) zu ergeben.
  • Schritt F2: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-oxopiperidin-1-yl-methylester
  • Eine Suspension aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2- carbonsäure-Kaliumsalz (1,6 g, 5,49 mmol) in wasserfreiem THF (30 ml) wird bei 50°C für 20 Minuten in einem Ölbad erhitzt. Eine Lösung von N-(Chlormethyl)-2-piperidon (850 mg, 5,76 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml) wird tropfenweise hinzugefügt. Nach 30 Minuten wird die Reaktion auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Es wird Wasser (100 ml) hinzugefügt und mit Ethylacetat (3 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Schichten werden vereinigt, mit NaHCO3 (sat), Wasser, Salzlake gewaschen und über MgSO4 getrocknet und dann konzentriert. Der Rückstand wird an einer ISCO RediSep 35-Gramm Kieselgel-Kartusche gereinigt, wobei mit 5% Methanol in Ethylacetat und dann mit 20% Methanol in Ethylacetat eluiert wird. Die Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu geben (520 mg, 26%). MS 365 (M+H), TLC (Kieselgel, MeOH/EtOAc 25:75) Rf = 0,18, 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,77 (1H, s), 8,46 (1H, s), 8,08 (2H, d, J = 5,7Hz), 7,50 (3H, m), 7,09 (1H, m), 6,58 (2H, d, J = 6Hz), 5,54 (2H, s), 3,27 (2H, br2), 2,23 (2H, brs), 1,66 (4H, brs). 13C NMR (DMSO-d6) δ 170,00, 160,43, 152,25, 149,44, 135,54, 125,60, 122,96, 121,84, 120,22, 119,87, 118,99, 113,00, 108,59, 70,99, 47,00, 31,99, 22,39, 20,60.
  • Vergleichsbeispiel 70
    Figure 01200001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure(benzoylethoxycarbonylmethylamino)methylester
  • Zwischenprodukt: N-(Chlormethyl)ethylbenzamidoacetat
  • Eine Mischung aus Ethylbenzamidoacetat (1,0 g, 4,83 mmol) und Paraformaldehyd (450 mg) in Chlortrimethylsilan (40 ml) wird über Nacht unter N2 unter Rückfluss erhitzt. Das Lösemittel wird unter Vakuum konzentriert, um N-chlormethylethylbenzamidoacetat als ein Öl (1,2 g, 98%) zu ergeben.
  • Schritt F2: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure(benzoylethoxycarbonylmethylamino)methylester
  • Eine Suspension aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-Kaliumsalz (1,3 g, 4,46 mmol) in wasserfreiem THF (20 ml) wird bei 50°C für 20 Minuten in einem Ölbad erhitzt. Eine Lösung von N-Chlormethyl)ethylbenzamidoacetat (1,2 g, 4,69 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml) wird tropfenweise hinzugefügt. Nach 30 Minuten wird die Reaktion auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Es wird Wasser hinzugefügt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wird mit NaHCO3 (sat), Wasser, Salzlake gewaschen, über MgSO4 getrocknet und dann konzentriert. Der Rückstand wird an einer ISCO RediSep 35-Gramm Kieselgel-Kartusche gereinigt, wobei mit 50% Heptan/Ethylacetat (200 ml), 100% Ethylacetat (300 ml) und dann 1% Methanol/Ethylacetat eluiert wird. Die Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um die Titelverbindung als einen gelben Feststoff zu geben (834 mg): MS 473 (M+H), 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,81 (1H, s), 8,47 (1H, s), 8,10 (2H, d, J = 5,8 Hz), 7,38 (8H, m), 7,08 (1H, m), 6,66 (2H, d, J = 6,0 Hz), 5,49 (2H, s), 4,30 (2H, s), 4,09 (2H, m), 1,99 (3H, m). 13C NMR (DMSO-d6) δ 171,51, 168,86, 160,30, 152,07, 149,58, 135,72, 134,06, 130,51, 128,46, 127,13, 125,76, 122,65, 122,34, 120,50, 119,90, 118,51, 113,06, 108,89, 74,53, 60,79, 59,74, 47,52, 20,75, 14,07, 13,95.
  • Vergleichsbeispiel 71
    Figure 01220001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-oxopyrrolidin-1-yl-methylester
  • Zwischenprodukt: N-(Chlormethyl)-2-pyrrolidinon
  • Eine Mischung aus 2-Pyrrolidinon (1,0 g, 11,75 mmol) und Paraformaldehyd (500 mg) in Chlortrimethylsilan (40 ml) wird unter N2 für 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Lösemittel wird unter Vakuum verdampft, um N-(chlormethyl)-2-pyrrolidon als ein Öl (1,55 g, 99%) zu ergeben.
  • Schritt F2: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-2-oxo-2-pyrrolidin-1-ylethylester
  • Eine Suspension aus 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure Kaliumsalz (2,0 g, 6,86 mmol) in wasserfreiem THF (100 ml) wird bei 50°C für 20 Minuten in einem Ölbad erhitzt. Eine Lösung von N-(Chlormethyl)-2-pyrrolidon (1,10 g, 8,23 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml) wird tropfenweise hinzugefügt. Nach 3 Stunden wird die Reaktion auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Es wird Wasser (100 ml) hinzugefügt und mit Ethylacetat (3 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Schichten werden vereinigt, mit NaHCO3 (sat), Wasser, Salzlake gewaschen, über MgSO4 getrocknet und dann konzentriert. Der Rückstand wird an einer ISCO RediSep 10-Gramm Kieselgel-Kartusche gereinigt, wobei mit Ethylacetat und dann mit 5% Methanol in Ethylacetat eluiert wird. Die Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, um die Titelverbindung als einen gelbfarbenen Feststoff zu geben (205 mg). MS 313 (M+H), TLC (Kieselgel, MeOH/EtOAc 1:1), Rf = 0,33, 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,78 (1H, s), 8,47 (1H, s), 8,09 (2H, d, J = 6,2 Hz), 7,49 (3H, m), 7,09 (1H, m), 6,59 (2H), 5,76 (restliches CH2Cl2), 5,44 (2H, s), 3,37 (2H, m), 2,22 (2H, m), 1,87 (2H, m). Vergleichsbeispiel 72
    Figure 01230001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure[phenyl(toluen-4-sulfonyl)amino]methylester
  • Zwischenprodukt: N-Chlormethyl-N-phenyl-4-methylbenzolsulfonamid
  • Die Titelverbindung wird gemäß den in Iley, J. et al., Bioorg. Med. Chem., (2000), 8, 1629–1636 dargelegten Prozeduren hergestellt. Dementsprechend wird eine Mischung aus N-Phenyl-p-toluensulfonamid (3,0 g, 12,13 mmol) und Paraformaldehyd (600 mg) in Chlortrimethylsilan (50 ml) für 3 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Lösemittel wird unter Vakuum konzentriert, um N-Chloromethyl-N-phenyl-4- methylbenzolsulfonamid als ein Öl (3,2 g) zu ergeben.
  • Schritt F2: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure[phenyl(toluen-4-sulfonyl)amino]methylester
  • 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-Kaliumsatz (2,2 g, 7,5 mmol) in einer Mischung aus wasserfreiem THF und DMF (90:10 ml) wird unter N2 bei 60°C aufgelöst. Es wird auf 0°C abgekühlt und eine Lösung von N-Chlormethyl-N-phenyl-4-methylbenzolsulfonamid (2,6 g, 8,80 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml) tropfenweise hinzugefügt. Nach 20 Minuten wird Wasser (100 ml) hinzugefügt und dann mit Ethylacetat (4 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Schichten werden vereinigt, mit NaHCO3 (sat), Wasser, Salzlake gewaschen, über MgSO4 getrocknet und dann konzentriert. Der Rückstand wird an einer ISCO RediSep 35-Gramm Kieselgel-Kartusche gereinigt, wobei mit Ethylacetat und dann mit 30% Methanol/Ethylacetat eluiert wird. Die Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zu einem Feststoff konzentriert. Der Feststoff wird in Methanol gelöst und mit Ether präzipitiert, um die Titelverbindung als einen gelben Feststoff (390 mg) zu ergeben. ESI/MS 313 (M+H), 1H NMR (CD3OD) δ 8,05 (2H, 2br d, J = 6,5 Hz, J = 6,8 Hz), 7,38 (14H, m), 6,61 (2H, br d, J = 7,0 Hz), 5,93 (2H, s), 2,44 (3H, s). Vergleichsbeispiel 73
    Figure 01240001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure(benzolsulfonylmethylamino)methylester
  • Zwischenprodukt: N-Chlormethyl-N-methyl-4-methylbenzolsulfonamid
  • Eine Mischung aus N-Methylbenzolsulfonamid (2,0 g, 11,68 mmol) und Paraformaldehyd (600 mg) in Chlortrimethylsilan (40 ml) wird für 2,5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Es wird unter Vakuum konzentriert, um N-Chlormethyl-N-methyl-4-methylbenzolsulfonamid als einen weißen Feststoff (2,5 g) zu ergeben.
  • Schritt F2: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure(benzolsulfonylmethylamino)methylester
  • 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure Kaliumsalz (2,2 g, 7,55 mmol) in einer Mischung aus wasserfreiem THF und DMF (150:40 ml) wird unter N2 bei 60°C aufgelöst. Es wird auf 0°C abgekühlt und eine Lösung von N-Chlormethyl-N-methyl-4-methylbenzolsulfonamid (2,0 g, 9,10 mmol) in wasserfreiem THF (10 ml) tropfenweise hinzugefügt. Nach 20 Minuten wird Wasser (100 ml) hinzugefügt und dann mit Dichlormethan (3 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Schichten werden vereinigt, mit NaHCO3 (sat), Wasser, Salzlake gewaschen, über MgSO4 getrocknet und dann konzentriert. Der Rückstand wird an einer ISCO RediSep 35-Gramm Kieselgel-Kartusche gereinigt, wobei mit 50% Heptan/Ethylacetat, Ethylacetat und dann 10% Methanol/Ethylacetat eluiert wird. Die Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird in Methanol gelöst und Ether hinzugefügt, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (800 mg) zu erhalten. MS 437 (M+H), 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,52 (1H, s), 8,29 (1H, s), 8,04 (2H, d, J = 5,5 Hz), 7,76 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,43 (6H, m), 7,03 (1H, m), 6,46 (2H, d, J = 6,0 Hz), 5,60 (2H, s), 2,79 (3H, s).
  • Vergleichsbeispiel 74
    Figure 01260001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure[methyl(toluen-4-sulfonyl)amino]methylester
  • Zwischenprodukt: N-Chlormethyl-N-methyl-4-methylbenzolsulfonamid
  • Eine Mischung aus N-Methyl-4-methylbenzolsulfonamid (2,3 g, 12,4 mmol) und Paraformaldehyd (600 mg) in Chlortrimethylsilan (40 ml) wird für 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Es wird unter Vakuum konzentriert, um N-Chlormethyl-N-methyl-4-methylbenzolsulfonamid als einen weißen Feststoff (2,8 g) zu ergeben.
  • Schritt F2: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure[methyl(toluen-4-sulfonyl)amino]methylester
  • 3-(4-Pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-Kaliumsatz (2,0 g, 6,89 mmol), in einer Mischung aus wasserfreiem THF und DMF (60:10 ml), wird unter N2 bei 60°C aufgelöst. Es wird auf –5°C abgekühlt und Piperidinmethylpolystyrol HL-Harz (NOVA #01-64-0212, 30 mg) hinzugefügt, tropfenweise gefolgt von einer Lösung aus N-Chlormethyl-N-methyl-4-methylbenzolsulfonamid (1,9 g, 8,34 mmol) in wasserfreiem THF (10 ml). Nach 30 Minuten wird Wasser (100 ml) hinzugefügt und dann mit Dichlormethan (3 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Schichten werden vereinigt, mit NaHCO3 (sat), Wasser, Salzlake gewaschen, über MgSO4 getrocknet und dann konzentriert.
  • Der Rückstand wird an einer ISCO RediSep 35-Gramm Kieselgel-Kartusche gereinigt, wobei mit 50% Heptan/Ethylacetat, Ethylacetat und dann 10% Methanol/Ethylacetat eluiert wird. Die Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zu einem Feststoff (1,1 g) konzentriert. Der Feststoff wird mit Methanol/Ether gewaschen und getrocknet, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (720 mg) zu ergeben. TLC (Kieselgel, EtOAc/MeOH, 8:2), Rf = 0,49, 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,47 (1H, s), 8,32 (1H, s), 8,09 (2H, d, J = 5,7 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,48 (1H, d, J = 8,3 Hz), 7,34 (2H, m), 7,14 (3H, m) 6,52 (2H, d, J = 6,0 Hz), 5,61 (2H, s), 2,83 (3H, s), 2,05 (3H, s).
  • Vergleichsbeispiel 75
    Figure 01270001
    Schema F: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butoxycarbonyloxymethylester
  • Zwischenprodukt: tert-Butylchlormethylcarbonat
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 62 gefolgt, wobei tert-Butanol für Isopropylalkohol substituiert wird, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Schritt F4: 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butoxycarbonyloxymethylester
  • Es wird der Prozedur von Beispiel 62 gefolgt, wobei tert-Butylchlormethylcarbonat für Chlormethylcarbonsäure-1-methylester substituiert wird, aber die Reak tion wird über Nacht fortschreiten lassen. Die Titelverbindung wird als ein Feststoff erhalten. MS 384 (M+H), HPLC: Rt = 2,94 min.
  • Vergleichsbeispiel 76
    Figure 01280001
    3-((3-Phenylpropanoyl)methylamino)-1H-6-chlor-indol-2-carbonsäure
  • Eine Lösung aus 3-((3-Phenylpropanoyl)methylamino)-1H-6-chlorindol-2-carbosäureethylester (213 mg, 0,55 mmol) und Lithiumhydroxid (35 mg, 0,83 mmol), gelöst in einem Lösemittelgemisch aus 5 ml THF und 5 ml Wasser, wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Wasser (~10 ml) verdünnt und mit Ethylacetat gewaschen, um jegliche organischen Verunreinigungen zu entfernen. Die wässrige Schicht wird mit 1 N Salzsäure angesäuert, um die Titelverbindung zu präzipitieren. Die Titelverbindung wird durch Filtrieren isoliert und unter Vakuum bei 60°C getrocknet, Ausbeute 197 mg (99% Ausbeute); mp 220–221°C.
  • Vergleichsbeispiel 77
    Figure 01280002
    3-((Benzoyl)methylamino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 11 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 275°C.
  • Vergleichsbeispiel 78
    Figure 01290001
    3-((Benzoyl)amino)-6-chlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 4 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 205–210°C. (dec).
  • Vergleichsbeispiel 79
    Figure 01290002
    3-((Benzoyl)amino)-6-chlor-1H-indol-2-carbonsäure-2-dimethylaminoethylester.
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 5 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind.
  • Vergleichsbeispiel 80
    Figure 01300001
    3-((4-Chlorbenzoyl)methylamino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 28Q von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 279–283°C. Analyse: Berechnet für C17H11Cl3N2O3: C, 51,35; H, 2,79: N, 7,04; Gefunden: C, 51,30; H, 2,81; N, 7,00.
  • Vergleichsbeispiel 81
    Figure 01300002
    3-((Benzoyl)benzylamino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 17 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 266°–267°C.
  • Vergleichsbeispiel 82
    Figure 01310001
    3-((4-Piperidinacyl)amino)-6-chlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind.
  • Vergleichsbeispiel 83
    Figure 01310002
    3-((Benzoyl)methylamino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 10 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 143°–144°C.
  • Vergleichsbeispiel 84
    Figure 01320001
    3-((Benzoyl)methylamino)-5,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 41c von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind.
  • Vergleichsbeispiel 85
    Figure 01320002
    3-((Benzoyl)ethylamino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 15 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 254°–256°C.
  • Vergleichsbeispiel 86
    Figure 01330001
    3-((Benzoyl)methylamino)-6-fluor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 4L von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 142°–143°C. Analyse: Berechnet für C11H13FN2O3: C, 55,00; H, 5,45; N, 11,66; Gefunden: C, 55,09; H, 5,19; N, 11,63.
  • Vergleichsbeispiel 87
    Figure 01330002
    3-((2-Benzylbenzoyl)amino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 21 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 234°–235°C. Analyse: Berechnet für C23H16Cl2N2O3: C, 62,88; H, 3,67: N, 6,38; Gefunden: C, 63,04; H, 4,05; N, 5,97.
  • Vergleichsbeispiel 88
    Figure 01340001
    3-((3-Fluorbenzoyl)methylamino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 28j von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 270°–280°C. Analyse: Berechnet für C17H11Cl2FN2O3: C, 53,57; H, 2,91: N, 7,35; Gefunden: C, 53,54; H, 3,15; N, 7,24.
  • Vergleichsbeispiel 89
    Figure 01340002
    3-((Benzoyl)benzylamino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäureethylester
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 16 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 174°–175°C.
  • Vergleichsbeispiel 90
    Figure 01350001
    3-((Phenylsulfonyl)amino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäureethylester.
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 29 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 245°–247°C.
  • Vergleichsbeispiel 91
    Figure 01350002
    3-((Phenylsulfonyl)amino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäure.
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 30 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 229°–235°C.
  • Vergleichsbeispiel 92
    Figure 01360001
    3-((Phenylsulfonyl)methylamino)-4,6-dichlor-1H-indol-2-carbonsäure
  • Für die Herstellung der Titelverbindung wird den Prozeduren gefolgt, wie sie in Beispiel 32 von der US-Patentschrift Nr. 5,675,018 dargelegt sind; mp 286°–290°C.
  • Vergleichsbeispiele 93–112
    Figure 01360002
    Parallelsynthese von 1H-Indol-2-carbonsäure-3-[(carbonyl)amino]tert-butylestern
  • Ein Reaktionsgefäß wird mit 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester (100 mg), dem entsprechenden Chlorformiat (0,5 mmol) und polymergebundenem Diisopropylethylamin (200 mg) beschickt und auf eine Quest 210 Parallelsynthese-Apparatur platziert und über Nacht gerührt. Es wird Trisamin (im Allgemeinen in Überschussmengen von etwa 2 bis 5 molaren Äquivalenten) hinzugefügt, filtriert und unter Vakuum konzentriert, um die Titelverbindungen zu erhalten.
  • Tabelle 14 listet den Chlorformiat-Reaktanten, das resultierende Produkt und die zugehörigen analytischen Daten für das Produkt auf. Tabelle 14
    Figure 01370001
    Figure 01380001
    Figure 01390001
    • a Retentionszeit in Minuten
    Vergleichsbeispiele 113–119
    Figure 01390002
    Synthese von 3-(Sulfonyl)amino-1H-indol-2-carbonsäure- tert-butylestern
  • Allgemeines Verfahren (Beispiele 113 bis 118)
  • 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester (0,43 mmol) wird in Dichlormethan (1 ml) aufgelöst, N-Methylmorpholin (0,2 ml) und dann das entsprechende Sulfonylchlorid (0,5 mmol), gelöst in Dichlormethan (1 ml), hinzugefügt. Es wird über Nacht gerührt und zwischen 1 N NaOH und Dichlormethan partitioniert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit wässrigem NH4Cl gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert, um die Titelverbindungen zu erhalten.
  • Allgemeines Verfahren (Beispiel 119)
  • 3-Amino-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester (0,43 mmol) wird in Dichlormethan (2 ml) aufgelöst, N-Methylmorpholin (0,2 ml) und dann das entsprechende Sulfonylchlorid (0,5 mmol), gelöst in Dichlormethan (1 ml), hinzugefügt. Es wird auf einer JKEM-Blockapparatur für 4 Stunden bei Umgebungstemperatur geschüttelt. Die Reaktion wird mit gesättigter NH4Cl-Lösung abgeschreckt, die organische Schicht abgetrennt und unter Vakuum verdampft. Der resultierende Feststoff wird in Dichlormethan gelöst, filtriert und das Filtrat unter Vakuum verdampft, um die Titelverbindungen zu, erhalten.
  • Tabelle 15 listet den Sulfonylchlorid-Reaktanten, das resultierende Produkt und die zugehörigen analytischen Daten für das Produkt auf. Tabelle 15
    Figure 01410001
    • a Retentionszeit in Minuten,
    • b Schmelzpunkt = 179–181°C
  • Vergleichsbeispiele 120–124
    Figure 01420001
    Synthese von 3-(substituierten Sulfonyl)amino-1H-indol-2-carbonsäuren
  • Allgemeines Verfahren
  • Ein 3-(substitutierter Sulfonyl)amino-1H-indol-2-carbonsäure-tert-butylester wird in Dichlormethan (2 ml) gelöst, Trifluoressigsäure (1 ml) hinzugefügt und bei Umgebungstemperatur für 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird unter Vakuum konzentriert und der Rückstand zwischen EtOAc und Wasser partitioniert. Die organische Phase wird gesammelt und über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert, um die Titelverbindungen zu erhalten.
  • Wahlweise, für die Beispiele 123 und 124, wird die Reaktion unter Vakuum konzentriert und der Rückstand mit Ether trituriert. Es wird filtriert und das Produkt als ein Trifluoressigsäure-Salz gesammelt.
  • Tabelle 16 listet die 3-(substitutierten Sulfonyl)amino-1H-indol-2-carbonsäuren und die zugehörigen analytischen Daten auf. Tabelle 16
    Figure 01430001
    • a Retentionszeit in Minuten
  • Vergleichsbeispiel 125
    Figure 01430002
    3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäuremethoxymethylamid
  • Zu einer Lösung von 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (1,77 g, 7,0 mmol) in DMF (15 ml), die bei Raumtemperatur gerührt wird, wird ein Kopplungsreagenz, 1,1'-Carbonyldiimidazol (GDI) (1,13 g, 7 mmol), hinzugefügt und das Rühren wird für etwa 30 bis 40 Minuten fortgesetzt. Dann wird N-Methoxy-N-methylaminhydrochlorid (680 mg, 7 mmol) hinzugefügt und die Reaktionsmischung über Nacht rühren lassen. Die Reaktion wird mittels TLC (Kieselgel, Dichlormethan/Methanol 7:3, v/v) überwacht. Das Ausgangsmaterial ist nach dem Rühren über Nacht verbraucht. Es wird wässrige NH4Cl-Lösung, Ethylacetat und Salzlake hinzugefügt. Der sich bildende Feststoff wird abfiltriert und verworfen. Die wässrige Schicht wird mehrere Male mit Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte werden mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol gereinigt, um 300 mg (15%) eines gelben amorphen Feststoffes der Titelverbindung zu erhalten. Die NMR- und LC-MS-Daten sind in Übereinstimmung mit den erwarteten Daten für die Titelverbindung.
  • Vergleichsbeispiel 126
    Figure 01440001
    3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carboxaldehyd
  • Eine Suspension aus 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäuremethoxymethylamid (2,72 g, 7,2 mmol) in THF (35 ml) wird bei 0°C gerührt und eine 1 M Lösung von LAH in THF (14,5 ml, 14,5 mmol) hinzugefügt. Es wird auf Raumtemperatur erwärmen lassen und für 20 Stunden weiter gerührt. Es wird wässrige NH4Cl, gefolgt von Dichlormethan hinzugefügt. Die Aluminiumsalze werden abfiltriert, die organische Phase abgetrennt und unter Vakuum konzentriert, um ein braunes Öl zu erhalten. Das Öl wird einer Flash-Chromatographie unterworfen, um 0,62 g (36%) von der Titelverbindung als eine gelbe Festsubstanz zu ergeben: 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,8 (1H, s), 9,95 (1H, s), 9,1 (1H, s), 8,18 (2H, brs), 7,4 (3H, m), 7,1 (1H, dd), 6,7 (2H, brd).
  • Vergleichsbeispiel 127
    Figure 01450001
    [3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-yl]methanol
  • Eine Suspension aus 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester (1,4 g, 5 mmol) in THF (15 ml) wird bei 0°C gerührt und eine 1 M Lösung von LAH in THF (8 ml, 8 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wird auf Raumtemperatur erwärmen lassen und für zusätzliche 0,5 Stunden gerührt. Es wird wässrige NH4Cl-Lösung, Ethylacetat und Salzlake hinzugefügt. Der Feststoff, der sich in der zweiphasigen Mischung bildet, wird filtriert, um 0,56 g (47%) von der Titelverbindung als einen beigen Feststoff zu erhalten. MS 240 (M+H), HPLC: Rt = 1,04 min.; TLC (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH, 4:1), Rf = 0,6. Vergleichsbeispiel 128
    Figure 01460001
    3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carboxamid
  • Eine Suspension aus 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carbonsäure (1,26 g, 3,0 mmol) in DMF (12 ml) wird bei –20°C gerührt und BOP (1,32 g, 3,0 mmol) und dann Diisopropylethylamin (0,8 ml, 4,5 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wird für 0,25 Stunden gerührt und eine Lösung aus 7 M NH3 in MeOH (0,43 ml, 3,0 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur über Nacht rühren lassen und dann EtOAc hinzugefügt. Die organische Lösung wird mit wässrigem NaHCO3 und Salzlake gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Es wird filtriert und das Filtrat unter Vakuum konzentriert, um einen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wird von EtOAc rekristallisiert, um 0,425 g der Titelverbindung als einen gelben Feststoff zu erhalten. MS 253 (M+H), m.p. 230°C (Zerfall); TLC (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH/Ammoniumhydroxid, 8:2:0,1 v/v), Rf = 0,39.
  • Vergleichsbeispiel 129
    Figure 01460002
    (2-Aminomethyl-1H-indol-3-yl)pyridin-4-ylamin
  • Eine Lösung aus 3-(Pyridin-4-ylamino)-1H-indol-2-carb oxamid (1,26 g, 5 mmol) in THF (10 ml) wird bei 0°C gerührt und eine 1 M Lösung von LAH in THF (25 ml, 25 mmol) tropfenweise hinzugefügt. Die Reaktion wird auf Raumtemperatur erwärmen lassen und dann über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Es wird eine wässrige 10%ige Rochellesalzlösung hinzugefügt und die wässrige Mischung mit EtOAc extrahiert. Der Extrakt wird unter Vakuum konzentriert und 0,5 g eines unbearbeiteten gelben Feststoffes isoliert. Der Feststoff wird durch präparative HPLC gereinigt und 0,2 g der Titelverbindung als ein Feststoff erhalten. MS 239 (M+H).

Claims (10)

  1. Verbindungen der Formel (I):
    Figure 01480001
    wobei X und Y gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander aus der aus Halogen, Amino, Hydroxy, C1-6-Alkoxy, C1-6-Perfluoralkoxy und Phenyl bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei Phenyl gegebenenfalls durch einen oder zwei jeweils unabhängig aus C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Halogen, Hydroxy und C1-6-Perfluoralkoxy ausgewählte Substituenten substituiert ist; Z für N-R steht, wobei R aus der aus Wasserstoff, C1-6-Alkyl und C1-6-Alkylcarbonyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist; R1 für Wasserstoff steht; R3 für
    Figure 01480002
    R2 für C1-6-Alkyl steht und deren pharmazeutisch unbedenkliche Salze.
    Figure 01490001
    mit Trifluoressigsäurepentafluorphenylester umsetzt; (b) die Verbindung der Formel (14) unter Bildung einer Verbindung der Formel (11A) mit R2OH umsetzt; wobei X und Y gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, Halogen, Nitro, Amino, Hydroxy, C1-6-Alkyl, C2-6-Alkenyl, C2-6-Alkinyl, C1-6-Alkoxy, C1-6-Perfluoralkyl, C1-6-Perfluoralkoxy, Phenyl und Benzyl bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei Phenyl bzw. Benzyl gegebenenfalls durch einen oder zwei jeweils unabhängig voneinander aus C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Halogen, Hydroxy oder C1-6-Perfluoralkoxy ausgewählte Substituenten substituiert ist; R2 aus der aus Wasserstoff, C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Perfluoraryl, Indanyl, C1-6-Alkoxy-C1-6-alkyl, C2-6-Acyloxy-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxycarbonyl-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxycarbonyloxy-C1-6-alkyl, C3-8-Cycloalkyl, C3-8-Cycloalkoxycarbonyloxy-C1-6-alkyl, Adamantyloxycarbonyloxy-C1-6-alkyl, C3-8-Cycloalkoxycarbonyl-C1-6-alkyl, Mono- oder Di-C1-6-alkylamino-C1-6-alkyl, C3-8-Azacycloalkyl-C1-6-alkyl, Mono- oder Di-C1-6-alkylcarbamoyl-C1-6-alkyl, C3-8-Azacycloalkylcarbonyloxy-C1-6-alkyl, Benzyl-C1-6-alkylcarbamoyl-C1-6-alkyl, Mono- oder Di-C1-6-alkylcarbamoyloxy-C1-6-alkyl, C3-8-Azacycloalkyl carbonyloxy-C1-6-alkyl, Benzyl-C1-6-alkylcarbamoyloxy-C1-6-alkyl, Benzylcarbamoyloxy-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxycarbonylaminooxo-C1-6-alkyl,
    Figure 01500001
    bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei R8 für Wasserstoff oder C1-6-Alkyl steht, R9 für C1-6-Alkyl oder Phenyl steht, R10 für Wasserstoff, C1-6-Alkyl oder C1-6-Alkoxycarbonyl-C1-6-alkyl steht, R11 für C1-6-Alkyl, Phenyl oder Tolyl steht und A für CH2, NH oder O steht und R3 für
    Figure 01510001
    steht.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der es sich um 5,6-Dimethoxy-3-(4-pyridinylamino)-1H-indol-2-carbonsäureethylester handelt.
  3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 11A:
    Figure 01510002
    bei dem man: (a) eine Verbindung der Formel (13):
    Figure 01510003
    unter Bildung einer Verbindung der Formel (14):
    Figure 01510004
    mit Trifluoressigsäurepentafluorphenylester umsetzt; (b) die Verbindung der Formel (14) unter Bildung einer Verbindung der Formel (11A) mit R2OH umsetzt; wobei X und Y gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, Halogen, Nitro, Amino, Hydroxy, C1-6-Alkyl, C2-6-Alkenyl, C2-6-Alkinyl, C1-6-Alkoxy, C1-6-Perfluoralkyl, C1-6-Perfluoralkoxy, Phenyl und Benzyl bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei Phenyl bzw. Benzyl gegebenenfalls durch einen oder zwei jeweils unabhängig voneinander aus C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Halogen, Hydroxy oder C1-6-Perfluoralkoxy ausgewählte Substituenten substituiert ist; R2 aus der aus Wasserstoff, C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Perfluoraryl, Indanyl, C1-6-Alkoxy-C1-6-alkyl, C2-6-Acyloxy-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxycarbonyl-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxycarbonyloxy-C1-6-alkyl, C3-8-Cycloalkyl, C3-8-Cycloalkoxycarbonyloxy-C1-6-alkyl, Adamantyloxycarbonyloxy-C1-6-alkyl, C3-8-Cycloalkoxycarbonyl-C1-6-alkyl, Mono- oder Di-C1-6-alkylamino-C1-6-alkyl, C3-8-Azacycloalkyl-C1-6-alkyl, Mono- oder Di-C1-6-alkylcarbamoyl-C1-6-alkyl, C3-8-Azacycloalkylcarbonyloxy-C1-6-alkyl, Benzyl-C1-6-alkylcarbamoyl-C1-6-alkyl, Mono- oder Di-C1-6-alkylcarbamoyloxy-C1-6-alkyl, C3-8-Azacycloalkylcarbonyloxy-C1-6-alkyl, Benzyl-C1-6-alkylcarbamoyloxy-C1-6-alkyl, Benzylcarbamoyloxy-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxycarbonylaminooxo-C1-6-alkyl,
    Figure 01530001
    bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei R8 für Wasserstoff oder C1-6-Alkyl steht, R9 für C1-6-Alkyl oder Phenyl steht, R10 für Wasserstoff, C1-6-Alkyl oder C1-6-Alkoxycarbonyl-C1-6-alkyl steht, R11 für C1-6-Alkyl, Phenyl oder Tolyl steht und A für CH2, NH oder O steht und R3 für
    Figure 01530002
    steht.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Schritt (a) in Gegenwart einer organischen Base durchgeführt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei der Base um Pyridin handelt.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Schritt (b) in Gegenwart einer Base in einem geeigneten organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Base um Natriumhydrid und bei dem Lösungsmittel um 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP) oder Dimethylformamid (DMF) handelt.
  8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 11A:
    Figure 01540001
    bei dem man: (a) eine Verbindung der Formel (13):
    Figure 01540002
    unter Bildung einer Verbindung der Formel (11A) mit R2OH umsetzt; wobei X und Y gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, Halogen, Nitro, Amino, Hydroxy, C1-6-Alkyl, C2-6-Alkenyl, C2-6-Alkinyl, C1-6-Alkoxy, C1-6-Perfluoralkyl, C1-6-Perfluoralkoxy, Phenyl und Benzyl bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei Phenyl bzw. Benzyl gegebenenfalls durch einen oder zwei jeweils unabhängig voneinander aus C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Halogen, Hydroxy oder C1-6-Perfluoralkoxy ausgewählte Substituenten substituiert ist; R2 aus der aus Wasserstoff, C1-6-Alkyl, C1-6-Perfluoralkyl, Perfluoraryl, Indanyl, C1-6-Alkoxy-C1-6-alkyl, C2-6-Acyloxy-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxycarbonyl-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxycarbonyloxy-C1-6-alkyl, C3-8-Cycloalkyl, C3-8-Cycloalkoxycarbonyloxy-C1-6-alkyl, Adamantyloxycarbonyloxy-C1-6-alkyl, C3-8-Cycloalkoxycarbonyl-C1-6-alkyl, Mono- oder Di-C1-6-alkylamino-C1-6-alkyl, C3-8-Azacycloalkyl-C1-6-alkyl, Mono- oder Di-C1-6-alkylcarbamoyl-C1-6-alkyl, C3-8-Azacycloalkylcarbonyloxy-C1-6-alkyl, Benzyl-C1-6-alkylcarbamoyl-C1-6-alkyl, Mono- oder Di-C1-6-alkylcarbamoyloxy-C1-6-alkyl, C3-8-Azacycloalkylcarbonyloxy-C1-6-alkyl, Benzyl-C1-6-alkylcarbamoyloxy-C1-6-alkyl, Benzylcarbamoyloxy-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxycarbonylaminooxo-C1-6-alkyl,
    Figure 01560001
    bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei R8 für Wasserstoff oder C1-6-Alkyl steht, R9 für C1-6-Alkyl oder Phenyl steht, R10 für Wasserstoff, C1-6-Alkyl oder C1-6-Alkoxycarbonyl-C1-6-alkyl steht, R11 für C1-6-Alkyl, Phenyl oder Tolyl steht und A für CH2, NH oder O steht und R3 für
    Figure 01560002
    steht.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Umsetzung in Gegenwart eines geeigneten Carbonsäureaktivierungsmittels durchgeführt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Aktivierungsmittel um Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) oder Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorphosphat (PYBOP) handelt.
DE60313769T 2002-04-23 2003-04-23 3-(pyridinyl-amino)-1h-indol-2-carbonsäure-verbindungen als inhibitoren der interleukin-4 genexpression Expired - Lifetime DE60313769T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37530402P 2002-04-23 2002-04-23
US375304P 2002-04-23
GB0217920 2002-08-02
GBGB0217920.8A GB0217920D0 (en) 2002-04-23 2002-08-02 Interleukin-4 Gene Expression inhibitors
PCT/US2003/012661 WO2003091215A1 (en) 2002-04-23 2003-04-23 3-substituted amino-1h-indole-2-carboxylic acid and 3-substituted amino-benzo’ b! thiophene-2-carboxylic acid derivatives as interieukin-4 gene expression inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60313769D1 DE60313769D1 (de) 2007-06-21
DE60313769T2 true DE60313769T2 (de) 2008-03-06

Family

ID=29272010

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60328675T Expired - Lifetime DE60328675D1 (de) 2002-04-23 2003-04-23 3-(substitutierte amino)-1h-indole-2-carbonsäureester und 3-(substitutierte amino)-benzoäbüthiophen-2-carbonsäureester verbindungen als inhibitoren der interleukin-4 genexpression
DE60313769T Expired - Lifetime DE60313769T2 (de) 2002-04-23 2003-04-23 3-(pyridinyl-amino)-1h-indol-2-carbonsäure-verbindungen als inhibitoren der interleukin-4 genexpression

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60328675T Expired - Lifetime DE60328675D1 (de) 2002-04-23 2003-04-23 3-(substitutierte amino)-1h-indole-2-carbonsäureester und 3-(substitutierte amino)-benzoäbüthiophen-2-carbonsäureester verbindungen als inhibitoren der interleukin-4 genexpression

Country Status (8)

Country Link
EP (3) EP1501796B1 (de)
JP (1) JP4497930B2 (de)
AT (2) ATE361910T1 (de)
AU (2) AU2003225131A1 (de)
CA (2) CA2483091A1 (de)
DE (2) DE60328675D1 (de)
ES (1) ES2330628T3 (de)
WO (2) WO2003091215A1 (de)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050215640A1 (en) 2004-03-26 2005-09-29 Baxter Jeffrey H HMB compositions and uses thereof
JP2008519034A (ja) 2004-11-03 2008-06-05 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド イオンチャネル調節剤としてのピリミジン誘導体および使用方法
BRPI0606870A2 (pt) * 2005-02-25 2009-07-21 Ono Pharmaceutical Co composto de indol e uso do mesmo
CN102225060A (zh) * 2005-12-19 2011-10-26 雅培制药有限公司 β-羟基-β-甲基丁酸盐在调节1-型和2-型细胞因子生成失衡中的应用
PE20081354A1 (es) 2006-11-30 2008-11-14 Genentech Inc Compuestos de azaindolilo como inhibidores de mek
WO2008130970A1 (en) * 2007-04-16 2008-10-30 Abbott Laboratories 7-nonsubstituted indole mcl-1 inhibitors
TWI469965B (zh) 2008-12-22 2015-01-21 Ono Pharmaceutical Co 乙炔基吲哚化合物
EP2461704B1 (de) 2010-01-29 2013-10-09 Abbott Laboratories Aseptisch verpackte nahrungsflüssigkeiten mit hmb
US9693577B2 (en) 2010-01-29 2017-07-04 Abbott Laboratories Method of preparing a nutritional powder comprising spray dried HMB
IN2012DN06441A (de) 2010-01-29 2015-10-09 Abbott Lab
TWI526161B (zh) 2010-06-10 2016-03-21 亞培公司 包含鈣ｈｍｂ及可溶性蛋白質之實質上透明營養液
ES2572804T3 (es) 2010-06-21 2016-06-02 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Nuevas formas cristalinas de ácido 4,4'-[4-fluoro-7-({4-[4-(3-fluoro-2-metilfenil)butoxi]fenil}etinil)2-metil-1H-indol-1,3-diil]butanoico
WO2016199172A2 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Council Of Scientific & Industrial Research Novel compounds and uses thereof
CN106632076B (zh) * 2016-09-20 2019-04-30 中国药科大学 4,6-二苯基嘧啶类化合物、其制备方法和医药用途
CN114773302B (zh) * 2022-04-29 2024-04-02 中国药科大学 一种苯并呋喃衍生物及其医药用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4675332A (en) * 1984-12-10 1987-06-23 Warner-Lambert Company Acidic tetrazolyl substituted indole compounds and their use as antiallergy agents
US5189054A (en) * 1990-11-02 1993-02-23 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. 3-amidoindolyl derivatives and pharmaceutical compositions thereof
US5328920A (en) * 1991-04-17 1994-07-12 Hoechst-Roussel Pharmaceuticals Incorporated Substituted (pyridinylamino)-indoles
US5489586A (en) * 1994-03-07 1996-02-06 Warner-Lambert Company Method for treating inflammatory disease in humans
PE32296A1 (es) * 1994-07-28 1996-08-07 Hoffmann La Roche Ester de l-monovalina derivado de 2-(2-amino-1,6-dihidro-6-oxo-purin-9-il) metoxi-1,3-propandiol y sus sales farmaceuticamente aceptables
JPH11513400A (ja) * 1995-10-11 1999-11-16 サンテラボ オキサゾリジン−２−オンから誘導される化合物、それらの製造法およびそれらの治療への応用
GB9902455D0 (en) * 1999-02-05 1999-03-24 Zeneca Ltd Chemical compounds

Also Published As

Publication number Publication date
CA2483162A1 (en) 2003-11-06
AU2003225131A1 (en) 2003-11-10
EP1501796A1 (de) 2005-02-02
EP1501797A1 (de) 2005-02-02
WO2003091215A1 (en) 2003-11-06
CA2483091A1 (en) 2003-11-06
ES2330628T3 (es) 2009-12-14
CA2483162C (en) 2011-08-23
EP1501797B1 (de) 2009-08-05
ATE361910T1 (de) 2007-06-15
EP1501796B1 (de) 2007-05-09
DE60313769D1 (de) 2007-06-21
JP4497930B2 (ja) 2010-07-07
ATE438621T1 (de) 2009-08-15
JP2005529135A (ja) 2005-09-29
WO2003091214A1 (en) 2003-11-06
EP1834947A3 (de) 2008-05-28
EP1834947A2 (de) 2007-09-19
DE60328675D1 (de) 2009-09-17
AU2003239150A1 (en) 2003-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60313769T2 (de) 3-(pyridinyl-amino)-1h-indol-2-carbonsäure-verbindungen als inhibitoren der interleukin-4 genexpression
DE60218037T2 (de) Neue indolderivate mit affinität zum 5-ht6-rezeptor
AU777961B2 (en) Novel benzimidazole derivatives and pharmaceutical compositions comprising these compounds
US6503925B1 (en) 1-phenyl-benzimidazole compounds and their use as GABA-A receptor modulators
DE60212841T2 (de) 4 piperazinylindolderivate mit affinität zum 5-ht6-rezeptor
EP0736525B1 (de) Benzonitrile als 5-HT Agonisten und Antagonisten
EP1831197A2 (de) Substituierte oxindol-derivate, diese enthaltende arzneimittel und deren verwendung
US20080132481A1 (en) Interleukin-4 gene expression inhibitors
KR20020089372A (ko) 알파-2 길항제로서의 퀴놀린 유도체
EP0683166A1 (de) 3-Indolylpiperidine
DE19756036A1 (de) Amid- und Harnstoffderivate
DE602004004378T2 (de) Verbindungen mit einer 5-ht2c rezeptor-wirkung und ihre verwendung
DE69828998T2 (de) Indolderivate verwendbar zur behandlung von u.a. osteoporosis
DE60210058T2 (de) Alkoxycarbonylamino-heteroaryl-carbonsäurederivate als ip-antagonisten
EP2036906A1 (de) Azaindole als Inhibitoren der löslichen Adenylatzyklase
DE102006014320B4 (de) Inhibitoren der löslichen Adenylatzklase
DE102006014319B4 (de) Inhibitoren der löslichen Adenylatzyklase
WO2002050057A1 (en) Novel benzimidazole derivatives for the treatment of gaba-alpha mediated disorders
DE102004015007A1 (de) Substituierte Imidazole
EP1592687A1 (de) Benzofuranderivate und ihre verwendung als antidepressiva und anxiolytika
DD297162A5 (de) Indolderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition