DE60313366T2

DE60313366T2 - Nukleinsäuresonden und Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäuresequenz mit zwei oder mehr cis-Nukleinsäurebereichen

Info

Publication number: DE60313366T2
Application number: DE60313366T
Authority: DE
Inventors: Ian Crosby; Bunce Caerwys MICHAEL
Original assignee: Dynal Biotech Ltd
Current assignee: Life Technologies Ltd
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-19
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2023-11-20
Also published as: EP1585835A2; DE60313366D1; ATE360100T1; GB2395557A; WO2004048611A3; AU2003302440A8; EP1585835B1; GB0227274D0; AU2003302440A1; US20100317004A1; WO2004048611A2; US20060269916A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Sonden, Nachweis- und Diagnoseverfahren und ein Gerät zur Verwendung in solchen Verfahren. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Nukleinsäure, speziell Oligonukleotid, Sonden und Verfahren und ein Gerät für den Nachweis des Vorhandenseins oder nicht Vorhandenseins von nicht angrenzenden, cis-ständigen Nukleinsäuresequenzen und darin vorhandenen Polymorphismen.
Zwei oder mehrere Polymorphismen der Nukleinsäure auf einem einzelnen Molekül oder einem Einzelstrang gelten als cis-ständig und diese treten natürlich in Nukleinsäuresequenzen auf, vor allem in Allelen, die zum Humanen Leukozyten Antigen (HLA) gehören. Wie von Bodmer et al (Tissue Antigens (1999); 53; 407–446) ausführlich beschrieben, ist der HLA-Locus der am höchsten polymorphe im menschlichen Genom. Derzeit sind mehr als 240 HLA-A Allele, 478 HLA-B Allele, 116 HLA-C Allele, 99 HLA-DPB1 Allele, 52 DQB1 Allele und 305 DRB1 Allele bekannt, wobei kontinuierlich neue Allele gefunden werden. Alle HLA-A, -B, und -C Allele weisen ähnliche Sequenzen auf, die aus Blöcken von Polymorphismen oder Sequenzmotiven bestehen. Die unterschiedlichen Allele sind im Allgemeinen aus Rekombinationen dieser Sequenzmotive gebildet. Das selbe gilt für Loci der Klasse II wie DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 und DPB1.
Es gibt viele Verfahren zur Genotypisierung von HLA. Ein herkömmliches Verfahren besteht in der Amplifikation von Ziel-DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gefolgt von dem Nachweisen von polymorphen DNA-Sequenzen unter Verwendung von sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden (SSO) (Saiki RK et al, Nature. 1986 Nov 13–19; 324 (6093): 163–6). Die SSO-Sonden, die mit Ziel-DNA hybridisiert sind, können zum Beispiel durch kolorimetrische, radioaktive oder fluoreszierende Verfahren nachgewiesen werden. Beim Genotypisieren von HLA ist die anfängliche Amplifikation normalerweise generisch, kann aber ein Mosaik von Amplifikationen umfassen, die, wenn sie zusammen verwendet werden, alle möglichen Allele eines gegebenen Locus amplifizieren. SSO Techniken wurden erstmals von Saiki et al (Saiki RK et al, Nature. 1986 Nov 13–19; 324 (6093): 163–6) auf die Genotypisierung von HLA (HLA-DQA1) angewandt. Danach wurden SSO Reverse Blot-Techniken (Erlich H et al, Eur J Immunogenet. 1991 Feb–Apr; 18 (1–2): 33–55) entwickelt. Reverse Verfahren hängen von der Einführung einer chemischen Markierung, wie Botin, gewöhnlich über markierte Amplikations-Primer, in die anfängliche generische PCR-Amplifikation ab. Bei dem Reversen Dot Blot Verfahren, werden die SSO-Sonden an eine feste Trägermembran gebunden, wobei das Detektionsende der Sonde frei bleibt, um mit der Ziel-DNA interagieren zu können. Auf eine einzelne Membran können viele verschiedene Sonden gebunden werden, die theoretisch alle der Polymorphismen enthalten würden, die für das Genotypisieren eines einzelnen Polymorphismus an jedem beliebigen gegebenen Locus benötigt werden. Wenn markierte Ziel-DNA auf die reverse Dot-Blot Membran angewandt wird, hybridisiert die DNA nur mit denjenigen Sonden, die eine passender DNA Sequenz aufweisen. Hybridisierte, mit Biotin markierte Produkte werden durch das Hinzufügen eines Reportermoleküls, das einen Farbwechsel im Substrat induziert. Ob eine Sonde gezielt mit einer Ziel-DNA-Sequenz hybridisiert, hängt von der Menge der Fehlpaarungen zwischen Ziel und Sonde ab, der Position der Fehlpaarung in Bezug auf die Sonde und die Sondenlänge ab und ist auch zu einem großen Teil abhängig von den für die Hybridisierung herrschenden Bedingungen (wie Temperatur und Salzkonzentration).
HLA Allele werden von einem Patchwork von polymorphen DNA-Motiven, die mit anderen Allelen geteilt werden, gebildet. Es ist auf Grund dieser geteilten Motive und der Tatsache, dass die meisten Lebewesen diploid sind, was bedeutet, dass wir alle zwei Ausgaben jedes Locus haben, d. h. zwei HLA-A Allele, zwei HLA-B Allele, etc. nicht möglich, mit herkömmlichen SSO Techniken zwischen bestimmten Sets von Allelen zu unterscheiden. Als Folge der gemeinsamen Motive ist eine einzelne Sonde wahrscheinlich in der Lage, eine Anzahl von verschiedenen Allelen, welche die Spezifität der Sonde beeinträchtigen, nachzuweisen, und zwar indem eine große Anzahl von Allelen anstatt einer kleinen Anzahl von Allelen nachgewiesen wird oder anstatt dass sie sogar nur für ein Allel spezifisch ist.
Zusätzlich ist es mit herkömmlichen SSO Techniken, die eine Mischung von Sonden verwenden (eine für jeden räumlich getrennten Ziel-Polymorphismus) nicht möglich zu bestimmen, ob die Motive auf den selben Allelen vorhanden sind oder nicht, da jede der Sonden mit verschiedenen Allelen hybridisieren wird, wenn beide der Zwei in der DNA vorhandenen Allele einen oder beide der Ziel-Polymorphismen enthalten.
Eine theoretische Möglichkeit für die Lösung solcher Probleme, eine Sonde auszuführen, die mit zwei oder mehreren Ziel-Polymorphismen hybridisieren wird, nicht jedoch mit ihren dazwischen liegenden Nukleinsäuresequenzen. Dennoch wird in Fällen, in denen die Ziel-DNA-Motive von einander beabstandet liegen, die Ausgestaltung einer einzelnen Sonde mit paarenden Standardnukleotiden komplementär zu den räumlich getrennten Ziel-DNA-Motiven und der dazwischen liegenden Sequenz Auswirkungen auf die Hybridisierungstemperatur der Sonde haben und diese so erhöhen, dass sie über den normalen Parametern für die Ausgestaltung, die bei herkömmlichen SSO Techniken gelten, liegt, bei denen eine Temperatur für die Hybridisierung von Sonde mit Ziel-DNA normalerweise im Bereich von 35°C–65°C liegt.
Die US Patentanmeldung 20010019825 offenbart ein Verfahren für das Amplifizieren von DNA für den Nachweis von Zielnukleinsäuresequenzen mit diagnostischen Primern einschließlich Primer-Bereichen und Sonden-Bereichen, die komplementär zu jeweils Ziel- und Referenzbereichen auf einem Nukleinsäurestrang einer Probe sind. Optional ist ein Bereich auf dem diagnostischen Primer vorgesehen, der von einer Spacer Region aus Nukleinsäure getrennt wird.
Die US Patentanmeldung 20020042077 offenbart teilweise nicht hybridisierende Oligonukleotide, die zwei oder mehr hybridisierende Segmente enthalten, mit beliebigen zwei hybridisierenden Segmenten, die von einem nicht hybridisierenden Spacer-Segment getrennt werden. Die in dieser Anmeldung verwendete Technik besteht in der Ausführung von Sonden mit multiplen hybridisierenden Bereichen, allerdings nicht im Speziellen um cis-ständige Polymorphismen nachzuweisen um so gegeben Spezifität der Sonden für ein Allel oder eine Gruppe von Allelen, die sich zwei oder mehrere Polymorphismen teilen, zu vergrößern.
Ein weiteres Hauptproblem, dass mit Sonden, die zwei hybridisierende Segmente und einem nicht hybridisierenden Spacer-Segment in Verbindung gebracht wird, besteht darin, dass der nicht hybridisierende Spacer, der entweder aus Nukleinsäure oder eine Verbindung mit Eigenschaften, die jenen einer Nukleinsäure ähneln, zusammengesetzt ist, eine Sonde herstellt, deren Hybridisierungsbedingungen weniger streng sind. Diese weniger zwingenden Bedingungen dienen dazu, die Hybridisierung in Anwesenheit von fehlgepaarten Nukleotiden/Nukleosiden oder ähnlichen Verbindungen innerhalb des Spacer Segments zu ermöglichen, was zu Problemen mit falsch positiven Ergebnissen und Ergebnissen, die nur schwer interpretiert werden können, führt.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die im Stand der Technik auftretenden Probleme zu mindern oder zu lösen.
In Übereinstimmung mit einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäurensonde wie im beigefügten Anspruch 1 vorgesehen.
Die Erfindung bezieht sich auf Sonden, die nicht angrenzende, cis-ständige Nukleinsäuresequenzen, die für bestimmte Allele typisch sind, einschließlich jener, die sich auf das Humane Leukozyten Antigen (HLA) und andere Gene mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex, MHC), der im Gebiet der Transplantationen und Erkrankungen des Menschen von Interesse ist, nachweisen können. Die erfindungsgemäße Sonde ist jedoch nicht darauf beschränkt, Gene innerhalb des MHC bestimmen zu können, sondern kann auf jedes beliebige Allel-System angewandt werden, in dem die Allele zwei oder mehrere cisständige Bereiche aufweisen, die nachgewiesen werden sollen. Zum Beispiel kann die erfindungsgemäße Sonde so ausgeführt sein, dass sie auf andere polymorphe Gene gerichtet ist, einschließlich, aber nicht beschränkend, der folgenden: Thiopurinmethyltransferase (TPMT), Hämatochromatose-Gen (HFE), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Lymphotoxin (LT), Mannose bindendes Lektin (MBL), ABO-System und andere Blutgruppensysteme wie Sekretor Status, Duffy-System und Rhesus-System, Faktor V Leiden, Thrombozytenmembran-Glykoproteine (GPIIIa/IIb/Ib/IX), Humane Thrombozytenantigene (Human Platelet Antigen, HPA), CC-Chemokin Rezeptor 5 (CCR5), Gene für Interleukin und Interleukinrezeptoren, Gene für Chemokin und Chemokin-Rezeptoren, Gene für cystische Fibrose, KIR-Gene, Cluster of Differentiation Antigen (CD), wie CD1, NOTCH-Gene, TOLL Gene, Hitzeschockproteine, Xanthinoxidase (XO), Mangan Superoxid-Dismutase (SOD), Paraoxonase, N-Acetyltransferase (NAT-1 und NAT-2), Cytochrom P450 CYP2D6 (Debrisoquin Hydroxylase), Multidrug Resistance Gen 1 (MDR1) und Zelladhäsionsmoleküle wie MICH; MICV, VCAM, CAM und PECAM.
Die Zielnukleinsäuresequenz kann eines oder mehrere Allele eines Gens umfassen. Zum Beispiel kann die Zielsequenz eines oder mehrere Allele von HLA umfassen. Beispiele von anderen Allelen die mit der erfindungsgemäßen Sonde bestimmt werden können schließen die folgenden ein, sind aber nicht darauf beschränkt: TPMT*3a, TNF Allele, die als allelische Typen -238G/-238A-308G/-308A-376G/-376A (siehe Knight et al Nature Genet. 22: 145–150, 1999) bezeichnet werden, HFE C282Y (Feder et al Proc. Nat. Acad. Sci.95: 1472–1477, 1998).
Die Spacer Region hybridisiert vorzugsweise nicht zu einem wesentlichen Grad mit Nukleinsäuresequenzen im Zielmolekül oder mit anderen Nukleinsäuresequenzen in der sondierten Probe. Das bedeutet gewissermaßen, dass die Hybridisierungsbedingungen, unter denen die Sonde mit der Zielnukleinsäuresequenz hybridisiert, im Wesentlichen von dem Nukleotidgehalt (oder Nukleosidgehalt) der nicht angrenzenden Bereichen der Sonde bestimmt werden.
Die Sonde der Erfindung hat einen signifikanten Vorteil gegenüber überbrückten Sonden gemäß dem Stand der Technik, der darin liegt, dass die Länge der Spacer Region ausgewählt wird, um Paarbildung der nicht angrenzenden Bereichen mit cisständigen nicht angrenzenden Motiven in einem/mehreren Zielallel(en) zu ermöglichen und so die Sonde für zwei oder mehrere Bereichen spezifisch zu machen, wenn diese auf dem selben Allel vorhanden sind.
Die Spacer Region kann zum Beispiel abasische Phosphoramidit-Ribose-Moleküle, Nukleinsäuremoleküle, die zumindest im Wesentlichen keine Basenpaarung mit der Zielsequenz in dem Bereich zwischen den cis-ständigen Bereichen eingehen, umfassen oder sie kann jedes beliebige andere Nukleotidanalogon umfassen, das nicht oder nur schwach mit der dazwischen liegenden Ziel-DNA-Sequenz hybridisiert und das die paarweise Komplementarität zwischen den zwei oder mehreren hybridisierenden Bereichen aufrecht erhält.
Vorzugsweise umfasst die Spacer Region eine Sequenz von Molekülen, von denen ein jedes die selbe oder eine ähnliche Größe wie eine Nukleinsäurebase aufweist.
Somit umfasst der Spacer vorzugsweise ein oder mehrere Molekül(e), die räumlich korrekt angeordnet sind und die die selben oder ähnlichen räumlichen Dimensionen wie eine Nukleinsäurebase, wie zum Beispiel Purin oder Pyrimidin aufweisen. Diese Basen sind dem Fachmann bekannt und schließen die folgenden ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Adenosinderivate, Guanosinderivate, Cytosinderivate, Thymidinderivate, Locked-Nukleinsäuren (LNA), Peptidnukleinsäuren (PNA), Amino-Nukleinsäuren (ANA), 2-Amino-2'-Desoxyadenosin(2-amino-2'-dA), 2',3'-Didesoxyadenosin(2',3'-ddA), 3'-Desoxyadenosin, Cordycepin(3'-dA), 7-deaza-2'-Desoxyadenosin(7-deaza-2'-dA), 8-Brom-2'-Desoxyadenosin(8-Br-2'-dA), N6-Methyl-2'-Desoxyadenosin(N6-Methyl-2'-dA, 2',3'-Didesoxycytidin(2',3'-ddC), 5-Methyl-2'-Desoxycytidin(5-Me-2'-dC), 5-Brom-2'-Desoxycytidin(5-Br-2'-dC), 5-Jod-2'-Desoxycytidin(5-I-2'-dC), 7-deaza-2'-Desoxyguanosin(7-deaza-2'-dG), 8-Brom-2'-Desoxyguanosin(8-Br-2'-dG), 4-Thio-2'-Desoxythymidin(4-thio-dT), 5-C3-Carboxy-2'-Desoxythymidin(5-C3-carboxy-dT), 5-C6-Amino-2'-Desoxythymidin(5-C6-amino-dT), inverses 2'-Desoxythymidin(inverses-dT), 2'-Desoxyuridin(2'-dU), 2,6-Diaminopurin-2'-Desoxyribosid, 2-Aminopurine-2'-Desoxyribosid, 6-Thio-2'-Desoxyguanosin, 7-deaza-2'-Desoxyadenosin, 7-deaza-2'-Desoxyguanosin, 7-Deaza-2'-Desoxyxanthosin, 8-Brom-2'-Desoxyadenosin, 8-Brom-2'-Desoxyguanosin, 8-Oxo-2'-Desoxyadenosin, 8-Oxo-2'-Desoxyguanosin, Ethen-2'-Desoxyadenosin, N6-Methyl-2'-Desoxyadenosin, 06-Methyl-2'-Desoxyguanosin, 06-PHenyl-2'desoxyinosin, 2'-Desoxypseudouridin, 2'-Desoxyuridin, 2-Thiothymidin, 4-Thio-2'-Desoxyuridin, 4-Thiothymidin, 4-Triazolyl-2'-Desoxyuridin, 4-Triazolylthymidin, 5'-Aminothymidin, 5'-Jodthymidin, 5'-O-Methylthymidin, 5,6-Dihydro-2'-Desoxyuridin, 5,6-Dihydrothymidin, 5-Brom-2'-Desoxycytidin, 5-Brom-2'-Desoxyuridin, 5-Fluor-2'-Desoxyuridin, 5-Hydroxy-2'-Desoxyuridin, 5-Hydroxymethyl-2'-Desoxyuridin, 5-Jod-2'-Desoxycytidin, 5-Jod-2'-Desoxyuridin, 5-Methyl-2'-Desoxycytidin, 5-Propynyl-2'-Desoxycytid in, 5-Propynyl-2'-Desoxyuridin, Carboxy-Thymidin, N4-Ethyl-2'-Desoxycytidin, 04-Methylthymidin, TMP-F-2'-Desoxyuridin, 1-Methyladenin, 2-Methyladenin, N.sup. 6-Methyladenin, N.sup. 6-Isopentyladenin, 2-Methylthio-N. sup. 6-Isopentyladenin, N,N-Dimethyladenin, 8-Bromadenin, 2-Thiocytosin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, 5-Ethylcytosin, 4-Acetylcytosin, 1-Methylguanin, 2-Methylguanin, 7-Methylguanin, 2,2-Dimethylguanin, 8-Bromguanin, 8-Chlorguanin, 8-Aminoguanin, 8-Methylguanin, 8-Thioguanin, 5-Fluorouracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Joduracil, 5-Ethyluracil, 5-Propyluracil, 5-Methoxyuracil, 5- Hydroxymethyluracil, 5-(Carboxyhydroxymethyl)-Uracil, 5-(Methyl-Aminomethyl)-Uracil, 5-(Carboxymethylaminomethyl)-Uracil, 2-Thiouracil, 5-Methyl-2-Thiouracil, 5-(2-Bromvinyl)-Uracil, Uracil-5-Oxyessigsäure, Uracil-5-Oxyessigsäure-Methylester, Pseudouracil, 1-Methylpseudouracil, Queuosin, Inosin, 1-Methylinosin, Hypoxanthin, Xanthin, 2-Aminopurin, 6-Hydroxyaminopurin, 6-Thiopurin und 2,6-Diaminopurin, 3-Thioether-2',3'-Didesoxynukleosid-5-Triphosphate, 3-Thioamid-2',3'-Didesoxynucleosid-5'-Triphosphate, 3'-Alkyl-2',3'-Didesoxynukleosid-5'-triphosphate, 3'-Urea-2',3'-Didesoxynukleosid-5'-Triphosphate, und 3'-Thiourea-modifizierte 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-Triphosphate und fehlgepaarte Purine oder Pyrimidine.
Die Spacer Region kann mit einer oder mehreren spezifischen Nukleinsäuren unterbrochen werden, die ausgewählt werden, um sich mit komplementären Basen auf den Zielnukleinsäuresequenz zu paaren und es so zu ermöglichen, dass die Sonde Mutationen oder einzelne Sequenzen in dem Bereich der Zielnukleinsäuresequenz, die der Spacer Region der Sonde entspricht bei Hybridisierung unterscheiden kann. Solch eine Sonde kann auch höhere Spezifität bieten, vor allem wenn es sich bei dem Nukleotid auf der Zielsequenz, welcher der wenigstens einen komplementären Base entspricht, um einen Polymorphismus handelt.
Die hybridisierenden Bereichen der Sonde umfassen Bereiche der Nukleinsäure, die in der Lage sind mit den jeweiligen cis-ständigen Bereichen der Nukleinsäure auf der Zielsequenz zu hybridisieren. Diese Nukleinsäurebereiche der Sonde umfassen passenderweise häufig Nukleotide, können aber alternativ oder zusätzlich auch modifizierte Basen (DNA-Analoga) umfassen, die in manchen Fällen wirksamer an die Zielsequenz binden als herkömmliche Nukleotide. Geeignete DNA-Analoge schließen zum Beispiel Amino-Nukleinsäure (ANA), Peptidnukleinsäure (PNA) und Locked-Nukleinsäure (LNA) ein. Die hybridisierenden Nukleinsäurebereiche der Sonde können auch Nukleoside umfassen. Die Nukleotide, Nukleoside und/oder deren Analoga, welche die hybridisierenden Bereichen der Sonde bilden, werden vorzugsweise nach der Eigenschaft ausgewählt, dass sie spezifisch in einem angemessenen Ausmaß mit der Zielsequenz hybridisieren.
Im Falle, dass es eine Anzahl von polymorphen Sequenzen, von denen eine oder mehrere die Zielsequenz darstellen, in der Probe, die sondiert werden soll vorhanden sind, hat die erfindungsgemäße Sonde hat gegenüber Sonden nach dem Stand der Technik einen besonderen Vorteil. Eine hypothetische Darstellung dieses Vorteils wird in 1 gezeigt. Unter Bezugnahme auf 1 könnten SSO-Sonden 1–4 (nach dem Stand der Technik) so ausgestaltet sein, dass sie unter Verwendung von Polymorphismen an den Positionen 14 und 37 zwischen den Allelen D*9901-*9904 unterscheiden. Wenn eine Locus-spezifische Amplifikation durchgeführt und mit den vier Sonden getestet und mit einer Locus-spezifischen, PCR-amplifizierten DNA-Probe hybridisiert wurde, so ist ein mögliches Ergebnis, dass alle Sonden positiv sein können. Ist dies der Fall, wäre es nicht möglich zu bestimmen, welches in der Probe vorhandene Allelpaar als D*9901 + D + 9904 das selbe ist wie D*9902 + D*9903. Wenn allerdings die zwei Polymorphismen an den Positionen 14 und 37 durch eine einzelne (erfindungsgemäße) Sonde verbunden werden (an cis), ist die Sonde spezifisch für die zwei nicht angrenzenden Sequenzmotive. In 1 ist die (erfindungsgemäße) Sonde 5 spezifisch für das D*9903 Allel.
Es ist erforderlich, dass die Phosphoramiditbrücke in Sonde 5 (Phosphoramidite in der Brücke sind mit p bezeichnet) paarweise Bindungen zwischen der Sonde und der Ziel-DNA-Sequenz beibehält. Phosphoramidite sind nicht in der Lage Basenpaare mit Strängen aus Ziel-DNA zu bilden und haben somit keinen Einfluss auf die Hybridisierungstemperatur. Wenn eine Sonde (nach dem Stand der Technik) mit paarenden Standardnukleotiden ausgestaltet wäre, würde die Hybridisierungstemperatur der Sonde auf einen Wert oberhalb der normalen Parameter für die Ausgestaltung, die in einem SSO Typisierungssystem gelten, steigen und die Spezifität der Sonde würde beeinträchtigt.
Weiterhin unter Bezugnahme auf 1, zeigt Sonde 6 eine weitere Ausführungsform der Erfindung, wonach ein Polymorphismus auf dem D*9903 Allel verwendet wird, um die Spezifität der Sonde durch die Verwendung eines herkömmlichen, gepaarten Nukleotid mit der korrekten räumlichen Ausrichtung in der Spacer Region der Sonde zu verbessern. Sonde 7 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, in der der Spacer (mit einer Ausnahme entsprechend der zuvor genannten Polymorphismen) fehlgepaarte Nukleotide umfasst.
Von bestimmten Sonden nach dem Stand der Technik ist es bekannt, dass sie inaktive Spacer enthalten (wie in zum Beispiel in US-A-2002/0042077 beschrieben). Allerdings werden die Spacer in diesen Sonden nach dem Stand der Technik nicht mit Hinblick auf die Zielsequenz ausgewählt (was die Länge betrifft), die wirksam sein soll für die Aufrechterhaltung der korrekten räumlichen Ausrichtung und somit für die paarweise Bindung bei Hybridisierung der nicht benachbarten Bereiche der Sonde mit cis-ständigen Bereichen auf einer Zielsequenz. 2 zeigt, dass solche Sonden nach dem Stand der Technik, die Spacer bestehend aus nichtkomplementären Sequenzen enthalten, z. B. nicht korrekte Länge der Spacer, auf Grund der nicht passenden Bindung kein adäquates oder korrektes Signal zur Paarbildung liefern können. In diesem Beispiel hat der Spacer in Sonde 8 keine korrekte Länge, die es nicht ermöglicht, dass die Hybridisierungsbereiche der Sonde korrekt paarweise an die Zielnukleinsäurebereiche binden. Im ersten Fall hybridisiert der linke Arm der Sonde mit den Zielbereich, ermöglicht aber keine korrekte Hybridisierung des rechten Arms. Im zweiten Fall ist die Situation, was die Bindung von Sonde 8 betrifft, genau umgekehrt. Die teilweise Hybridisierung der Sonde mit falsche Bereiche der DNA führt sowohl zu falsch positiven als auch falsch negativen Ergebnissen. Diese Beispiele iterieren die Probleme in Verbindung mit Sonden nach dem Stand der Technik.
Die erhöhte Spezifität, die der Fähigkeit der erfindungsgemäßen Sonde zwei oder mehrere nicht angrenzende Bereiche der Zielsequenz zu hybridisieren zu verdanken ist, führt dazu, dass eine kleinere Anzahl von Allelen durch diese Sonde nachgewiesen werden kann und ermöglicht damit ist eine verbesserte Auflösung über herkömmliche SSO Sondentechniken oder jede beliebige andere Technik, die Oligonukleotidsonden, die mit polymorphen Ziel-DNA-Sequenzen hybridisieren, wie Screening der cDNA-Bibliothek oder Nachweis von RNA Polymorphismen. Die Erfindung sieht den cis-Nachweis (in Phase) von räumlich unterschiedlichen Zielnukleinsäuresequenzen mit einzelnen diagnostischen, komplementären DNA-Sonden vor. Der Begriff cis bezieht sich auf Sequenzen, die zum Beispiel hintereinander auf einem Allel vorhanden sind. Der Ausdruck „räumlich unterschiedlich" bezieht sich auf getrennte Sequenzen, die an verschiedenen Punkten längs eines Gens oder Genoms situiert sind.
Die Sonde umfasst vorzugsweise erste und zweite Bereiche, die jeweils mit ersten und zweiten nicht angrenzenden Bereichen auf der Zielnukleinsäuresequenz hybridisieren können. Die Bereiche der Sonde, die mit der Zielnukleinsäuresequenz hybridisieren können, können mindestens einen Nukleotid, der komplementär zu mindestens einem Nukleotid auf der Zielnukleinsäuresequenz ist, umfassen. Der bevorzugte Umfang der hybridisierende Bereichen liegt zwischen 1–20 komplementären Nukleotiden.
Die Sonde kann in gesamter Länge von 1 bis 300 Nukleinsäurebasen umfassen. Vorzugsweise umfasst die Sonde von 1 bis 200 Nukleinsäurebasen. Noch bevorzugter umfasst die Sonde von 30 bis 100 bis Nukleinsäurebasen.
Vorzugsweise ist die Sonde in der Lage, mit HLA Allelen zu hybridisieren, kann aber jeden beliebigen polymorphen Locus enthalten, wenn zwei oder mehrere polymorphe Bereichen auf einem oder mehreren Allelen auf den Loci vorhanden sind. Die erfindungsgemäße Sonde kann einer Formel wie folgt entsprechen:
5'-Hybl-(1-)1-300sp-Hyb2,
z. B. 5'amino-cacgttatcctcctgg(13P)tgtccaggttccgca;
5'amino-cgcacgttatcctcctg(14P)tgtccaggttccgca oder
5'amino-cgcacgttatcctcct(15P)tgtccaggttccgca,
5'-Hyb1-(1-150sp)-Hyb2-(1-150sp)-Hyb3,
z. B. 5'amino-cacgttatcctcctgg(13P)tgtccaggttccgca(17P)tttgatacgacgatagcga,
5'-Hybl-[(1-Nsp)-(1-10 Nucleotid)-(1-Nsp)-)-(1-10 Nucleotid)-(1-Nsp)]-Hyb2,
z. B. 5'amino-cacgttatcctcctgg(4 × P)g(2 × P)a(1 × P)ta(2 × P)tgtccaggttccgca,
worin „sp" ein Spacer Molekül, wie zum Beispiel einen fehlgepaarten Nukleotid oder ein Phosphoramidit bezeichnet; P = Phosphoramidit (als Beispiel); Hyb1 = erster hybridisierender Bereich des Nukleotids, der zum Beispiel 1–30 Nukleotidbasen umfasst, Hyb2 = zweiter hybridisierender Bereich des Nukleotids, der zum Beispiel 1- 30 Nukleotidbasen umfasst und Hyb3 = dritter hybridisierender Bereich des Nukleotids, der zum Beispiel 1–30 Nukleotidbasen umfasst.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für das spezifische Nachweisen von zwei oder mehreren cis-ständigen Zielnukleinsäuresequenzen in einer Probe vorgesehen, das umfasst, dass diese Probe mit mindestens einer Nukleinsäuresonde wie hier oben beschrieben in Kontakt gebracht wird und dass bestimmt wird, ob beliebiges hybridisiertes Material vorhanden ist.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für das spezifische Nachweisen von zwei oder mehreren nicht angrenzenden, cis-ständigen, polymorphen Zielnukleinsäuresequenzen in einer Nukleinsäureprobe vorgesehen, dass umfasst, dass diese Probe mit mindestens einer Nukleinsäuresonde wie hier oben beschrieben in Kontakt gebracht wird und dass bestimmt wird, ob ein Sonde/Zielnukleinsäuresequenz-Hybrid gebildet wurde.
Vorzugsweise umfassen die hier oben beschriebenen Verfahren den vorbereitenden Schritt, in dem die Nukleinsäureprobe unter Verwendung einer im Stand der Technik bekannten Technik, wie, zum Beispiel, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Saiki RK et al Science. 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350–4) amplifiziert wird.
Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren, dass die Sonde und die Nukleinsäureprobe unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht werden. Die Bedingungen können jenen entsprechen, die bei SSO Standardtechniken verwendet werden.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Gerät für das Nachweisen einer Zielnukleinsäuresequenz in einer Probe vorgesehen, wobei der Apparat einen Bereich für das Aufbringen der Probe und mindestens eine Sonde, wie hier weiter oben beschrieben, umfasst. Es ist ein bevorzugtes Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass das Gerät für das Nachweisen einer Zielnukleinsäuresequenz in einer Probe in einem biologischen Assay verwendet werden kann. Vorzugsweise wird der biologische Assay verwendet, um eine oder mehrere Sequenzen in einer Probe nachzuweisen. Noch bevorzugter wird der biologische Assay verwendet, um Polymorphismen in Humanen Leukozyten Antigenen (HLA) nachzuweisen.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose vorgesehen, welches umfasst, dass eine Sonde wie hier weiter oben beschrieben, die ausgeführt ist um mit einem Allel oder einer Anzahl von Allelen und/oder Mutationen zu hybridisieren, mit einer Probe von einem Individuum in Kontakt gebracht wird, um den Genotyp des Individuums zu bestimmen. Dieses Diagnoseverfahren kann verwendet werden, um die genaue genetische Natur von Beschwerden oder Erkrankungen eines Individuums festzustellen oder um die Prädisposition eines Individuums für ein bestimmtes Leiden oder eine bestimmte Krankheit zu bestimmen. Des Weiteren kann das Diagnoseverfahren auch verwendet werden, um die genotypischen Daten eines Individuums zu beurteilen. Vorzugsweise wird das Diagnoseverfahren verwendet, um den Status der Allele der Humanen Leukozyten Antigene in einem Individuum festzustellen. Es wird dem Fachmann klar ersichtlich sein, dass das Verfahren auch für die Untersuchung andere polymorpher Gene verwendet werden kann.
Damit das Verfahren der Erfindung klar verständlich wird und leicht in die Tat umgesetzt werden kann, ist im Folgenden ein Protokoll für die Umsetzung der Erfindung beschrieben. Dieses Protokoll wurde, wenn nicht anders angegeben, in den unten aufgeführten Beispielen verwendet.
Die Sonden werden über einen 5'-Amino-Linker, der die Sonde an Carboxylatgruppen auf der Oberfläche der Kügelchen bindet, mit Latexkügelchen gepaart. Kurz gesagt ist für den Vorgang der Paarung die Inkubation/Einarbeitung von Caroxylatkügelchen mit Amino-markierten Oligonukleotiden in Anwesenheit von 2M 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid Hydrochlorid (EDC) und 50 mM N-Hydroxy-Sulfosuccinimid (NHS) nötig. Nicht gepaarte Sonde wird anschließend weggewaschen und die Kügelchen werden in Wasser resuspensiert und auf Nylonmembran (Cuno 0,8 Mikrometer) aufpipettiert wo sie auf die Membran auftrocken können.
Vor dem Hybridisierungsassay wird die DNA-Probe PCR-amplifiziert: Die DNAenthaltenden Proben und Reagenzienmischung werden auf 95°C erhitzt um die doppelsträngige DNA zu trennen und die Zielsequenzen den Primern auszusetzen. Wenn die Mischung abkühlt, hybridisieren die biotinylierten Primer an ihre Ziele. Die thermostabile rekombinante Thermus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase breitet, in Anwesenheit von überschüssigen Desoxynukleosid-Triphosphaten (dNTPs), einschließlich Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxycytidin und Desoxythymidin oder Desoxyuridin (Desoxyuridin für RNA), die hybridisierten Primer entlang der Zielvorlagen aus, um eine biotinylierten DNA-Sequenz, die ein Amplikon genannt wird, herzustellen. Dieser Vorgang wird in mehreren Zyklen wiederholt, wobei jeder Zyklus die Menge an Ziel-DNA effektiv verdoppelt. Für diesen Test wurde eine adäquate Anzahl an Zyklen auf 35 festgelegt, was theoretisch eine mehr als milliardenfache Amplifikation ergibt.
Nach dem Vorgang der PCR-Amplifikation werden die Amplikons chemisch denaturiert (unter Verwendung einer Lösung enthaltend 3% EDTA, 1,6% Natriumhydroxid) um einzelne Stränge zu bilden, die dann in eine Kavität von einem „typing tray" hinzugefügt werden, der die Nylonmembran mit den immobilisierten, sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden enthält. Die mit Biotin markierten Amplikons binden dann (hybridisieren) an die sequenzspezifischen Sonden und werden so auf dem Membranstreifen "gefangen". Die stringenten Bedingungen für Hybridisierung der Amplikons auf den Sonden gewährleisten die Spezifität der Reaktion.
Nach stringentem Waschen des Membranstreifens, um nicht gebundenes Material zu entfernen, wird ein Streptavidin-Horseradish Peroxidase (SA-HRP) Konjugat in die Kavität im typing tray hinzugefügt. Das Streptavidin bindet and die mit Biotin markierten Amplikons, die von der membrangebundenen Sonde erfasst wurden. Nach dem Waschen des ungebundenen Konjugats, wird das gebundene SA-HRP Konjugat zur Reaktion mit Wasserstoffperoxid (H₂O₂) und Tetramethylbenzidin (TMB) gebracht um einen Farbkomplex zu bilden. Die Reaktion wird durch mehrer Waschvorgänge mit Wasser gestoppt. Die Hybridisierungsschritte können per Hand oder automatisch unter Verwendung des Dynal ÅutoRELI 48 Automated Strip Development Apparatus (erhältlich von Dynal Biotech Ltd) ausgeführt werden.
Die entwickelten Strips können dann unter Verwendung eines optischen Flachbettscanners gescannt werden und die Ergebnisse können manuell oder unter Verwendung eines Analyseprogramms wie dem Pattern Matching Program (PMP) von Dynal analysiert werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun rein beispielhaft mit Bezug auf die folgenden Figuren und Beispiele beschrieben, in denen:
1 das Prinzip verbrückter Sonden, wie oben diskutiert darstellt;
2 das Problem in Verbindung mit Sonden die nicht über eine Verbrückungssequenz von korrekter Länge verfügen um paarweise Bindung von hybridisierenden Bereichen auf Recht zu erhalten, wie oben dargelegt.
3 zeigt Sonden gemäß der Erfindung, die mit ausgewählten Zielsequenzen aufgeführt sind; und
4 zeigt die Ergebnisse von erfindungsgemäßen Sonden, die mit Nukleinsäureproben hybridisiert sind;
BEISPIELE

Diese Experimente wurde durchgeführt um die Hybridisierung von Sonden, die für bestimmte Allele (DRB1*0301/5, etc) spezifisch sind zu untersuchen. Unter Bezugnahme auf 3, wurden zahlreiche Testsonden (siehe unten) für eine Kombination aus 164A-165C-172C mit 190G-197A-198A Polymorphismen ausgeführt, die zusammen eindeutig für DRB1*0301/5/6/8/10-13/15/15/18-20 Allele sind, wenn sie auf Ziel-DNA und amplifiziert mit DRB1 Locus-spezifischen Primern verwendet werden. Die Sonden DR3.40–43 sind verbrückt. Phosphoramidite sind mit „p" bezeichnet. Die Sonden wurden so ausgeführt, dass sie positive Reaktionen nur anzeigen, wenn beide Arme der verbrückten Sonden mit einem einzelnen Allel paaren: dies wird „Intersection Specificity" genannt. Diese Sonden sind so ausgeführt, dass sei eine Intersection Specificity zu DRB1*03011/*03012, *03051/03052, *0308/10/11-16/18-20, *1327/41 und DRB3*0108 aufweisen. Kreuzreaktivität des linken Arms könnte (zum Beispiel) mit den Allelen DRB3*0101 erwartet werden, währen Kreuzreaktivität des rechten Arms mit den Allelen DRB1*1301 oder DRB1*1302 erwartet werden könnte. DNA-Proben, die diese potentiell falsch positiven Allele enthalten, wurden zusammen mit wahr positiven DNA-Proben auf DRB1*0301 getestet. Die Sequenz jeder Sonde ist in der folgenden Tabelle dargestellt:

Identität	Sequenz
DR3.40	5'amino-cacgttatcctcctgg(13 × p)tgtccaggttccgca;
DR3.41	5'amino-cacgttatcctcctgg(4 × p)g(2 × p)a(1 × p)ta(2 × p)tgtccaggttccgca
DR3.42	5'amino-cgcacgttatcctcctg(14 × p)tgtccaggttccgca oder
DR3.43	5'amino-cgcacgttatcctcct(15 × p)tgtccaggttccgca;

Sondenspezifität:
Der Sondenbereich, der auf ~ Position 164 (linker Arm) fokussiert, können mit den Allelen DRB1*03011/2 DRB1*0304, DRB1*03051/2 DRB1*0306, DRB1*0308, DRB1*0309, DRB1*0310, DRB1*0311, DRB1*03212, DRB1*0313, DRB1*0314, DRB1*0315, DRB1*0316, DRB1*0318, DRB1*0319, DRB1*0320, DRB1*1327, DRB1*1341, DRB3*01011, DRB3*01012, DRB3*0101202, DRB3*01013, DRB3*01014, DRB3*0102, DRB3*0104, DRB3*0106, DRB3*0107, DRB3*0108, DRB3*0110 paaren.
Der zweite Bereich, der auf -Position 196 fokussiert (rechter Arm) können mit den Allelen DRB1*1608, DRB1*03011, DRB1*03012, DRB1*03021, DRB1*03022, DRB1*0303, DRB1*03051, DRB1*03052, DRB1*0306, DRB1*0307, DRB1*0308, DRB1*0310, DRB1*0311, DRB1*0312, DRB1*0313, DRB1*0314, DRB1*0315, DRB1*0316, DRB1*0318, DRB1*0319, DRB1*0320, DRB1*1109, DRB1*1116, DRB1*1120, DRB1*1140, DRB1*13011, DRB1*13012, DRB1*13021, DRB1*13022, DRB1*1305, DRB1*1306, DRB1*1309, DRB1*1310, DRB1*1315, DRB1*1316, DRB1*1318, DRB1*1320, DRB1*1326, DRB1*1327, DRB1*1328, DRB1*1329, DRB1*1331, DRB1*1332, DRB1*1335, DRB1*1336, DRB1*1339, DRB1*1340, DRB1*1341, DRB1*1342, DRB1*1343, DRB1*1402, DRB1*1403, DRB1*1406, DRB1*1409, DRB1*1412, DRB1*1413, DRB1*1417, DRB1*1418, DRB1*1419, DRB1*1421, DRB1*1424, DRB1*1427, DRB1*1429, DRB1*1430, DRB1*1433, DRB3*0108 paaren.
Intersection Specificity:
Die Kombination beider Hälften der verbrückten Sonden ergab eine Gesamtspezifität für die Sonde von den folgenden Allelen: DRB1*03011/*03012, *03051/03052, 0308/10/11-16/1820, 1327, 1341 und 3*0108.

Die Sonden wurden mit 0,1 Mikrometer Polyscienes Latexpartikeln gepaart und wurden anschließen auf Cuno 0,8 Mikrometer Nylonmembran aufpipettiert und bei Raumtemperatur luftgetrocknet. DNA-Proben wurden mit PCR amplifiziert, unter Verwendung von generischen Primern für DRB1/3/4/5 (CRX28 5'-biotin-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG, AB60 5'-Biotin-CCGAATTCCGCTGCACTGTGAAGCTCTC) und alternativ durch DRB1 (Primer 06 plus DAS6 oder D6 plus DAS1 abhängig vom Genotyp der Zelllinie) oder DRB3-spezifische Primer D9V plus DAS1 oder D9V plus DAS6, wiederum abhängig vom Phänotyp). Die Primer D6, D9V, DAS1 und DAS6 hybridisieren jeweils an ihre Ziele an den Positionen 15–38, 12–31, 257–278 und 257–278. DNA von den folgenden Proben wurde amplifiziert

Position auf Figur 4	Zelllinien Identität	DRB1	DRB3
1	30	*0302	*0101
2	7	*0301	*0202
3	104	*0301	*0101
4	41	*1302	*0301
5	37	*1301	*0101
6	21	*1402	*0101
7	55	*1401	*0202
8	16	*1101	*0202
9	17	*1102	*0202
10	8	0401 1602

Die Hybridisierung wurde unter dem oben beschriebenen Standardprotokoll durchgeführt. Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt und im Folgenden besprochen.
Die Ergebnisse zeigen, dass Sonde DR3.41 spezifisch ist für DRB1*0301 ohne Kreuzreaktivität zu den eng verwandten DRB1*1301 oder DRB3*0101 Allelen. Die beste Spezifität ist mit DRB1 Amplifikation als Amplifikation mit generischen Primern (DRB 1/3/4/5) zu beobachten und führt zu gewisser Kreuzreaktivität mit DRB1*13. Sonde DR3.41 ist ein Beispiel für eine verbrückte Sonde mit zusätzlichen Nukleosid-Paarungen innerhalb der Sondenbrücke.
Sonde DR3.40 ist ein Beispiel für eine Sonde, deren Brücke vollständig aus Phosphoramiditen besteht, Sonde DR3.40 ist Sonde DR3.41 äußerst ähnlich, weist aber nicht die dazwischen liegenden Nukleotide in der Brücke auf. Stattdessen besteht die Brücke vollständig aus Phosphoramiditen. Dieses Beispiel ist auch spezifisch für DRB1*0301 ohne Kreuzreaktivität mit den eng verwandten DRB1*13 Allelen oder DRB3*0101 Allelen, wenn DRB 1-spezifische Amplifikation durchgeführt wird. Wenn generische Amplifikation mit DRB 1/3/4/5 Primern durchgeführt wird, so kann gewisse Kreuzreaktivität mit DRB1*13 Allelen beobachtet werden.

Claims

Eine Nukleinsäuresonde für das Nachweisen einer Zielnukleinsäuresequenz umfassend zwei oder mehrere cis-ständige Bereiche der Nukleinsäure, wobei die Sonde zwei oder mehrere nicht angrenzende Bereiche der Nukleinsäure, die mit entsprechenden cis-ständigen Bereichen der Nukleinsäure auf der Zielsequenz hybridisieren können, wobei die nicht angrenzenden Bereiche von einer oder mehreren Spacer Regionen getrennt werden, die zumindest vorwiegend Materialien umfassen, die nicht mit der Zielsequenz in dem Bereich zwischen den cis-ständigen Bereichen hybridisieren und die eine Länge aufweisen, die mit Bezug auf die Zielsequenz ausgewählt wurde, um in wirksamer Weise die korrekte räumliche Ausrichtung der nicht angrenzenden hybridisierenden Bereiche auf der Sonde zu den cis-ständigen Bereichen auf der Zielsequenz beizubehalten, so dass dazwischen unter Verwendung der Sonde eine paarweise Base zu Base Hybridisierung ausgeführt werden kann, wobei wenigstens eine der einen oder mehreren Spacer Regionen eine oder mehrere Nukleinsäure(n) umfasst (umfassen) die mit der Zielsequenz in dem Bereich zwischen den cis-ständigen Bereichen mit der (den) entsprechenden einen oder mehreren Nukleinsäure(n) hybridisieren können und/oder worin die Spacer Region, welche die zwei oder mehreren nicht angrenzende(n) Nukleinsäuren trennt, eine Sequenz von Molekülen, von denen ein jedes die selbe oder eine ähnliche Größe wie eine Nukleinsäurebase aufweist und worin wenigstens eine der einen oder mehreren Spacer Regionen abasische Phosphoramidit-Ribose-Moleküle umfasst.
Eine Nukleinsäuresonde gemäß Anspruch 1, wobei die Länge der Spacer Region so ausgewählt wird, dass sie im Wesentlichen in ihrer Länge der Länge desjenigen Bereichs der Zielsequenz entspricht, der zwischen den cisständigen Bereichen liegt.
Eine Nukleinsäuresonde gemäß entweder Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei mindestens eine der einen oder mehreren Spacer Region(en) eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die in Bezug auf die Zielsequenz in dem Bereich zwischen den cis-ständigen Bereichen fehlgepaart ist.
Eine Nukleinsäuresonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Sonde das Äquivalent zu 1 bis 300 Nukleotidbasen umfasst.
Eine Nukleinsäuresonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 wobei die Zielnukleinsäuresequenz ein oder mehrere Allel(e) eines Gens umfasst.
Eine Nukleinsäuresonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zielnukleinsäuresequenz das Gen für das Humane Leukozyten Antigen (HLA) umfasst.
Eine Nukleinsäuresonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zielnukleinsäuresequenz das Gen für Hämatochromatose (HFE) umfasst.
Eine Nukleinsäuresonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zielnukleinsäuresequenz das Gen für Thiopurinmethyltransferase (TPMT) umfasst.
Eine Nukleinsäuresonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zielnukleinsäuresequenz das Gen für Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) umfasst.
Eine Nukleinsäuresonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Sonde eine oder mehrere beliebige Sequenzen ausgewählt aus der folgenden Gruppe umfasst: 5'-Hybl-(1-300sp)-Hyb2, z. B. 5'amino-cacgttatcctcctgg(13P)tgtccaggttccgca; 5'amino-cgcacgttatcctcctg(14P)tgtccaggttccgca; or 5'amino-cgcacgttatcctcct(15P)tgtccaggttccgca, 5'-Hybl-(1-150sp)-Hyb2-(1-150sp)-Hyb3, z. B. 5'amino-cacgttatcctcctgg(13P)tgtccaggttccgca(17P)tttgatacgacgatagcga, 5'-Hybl-[(1-Nsp)-(1-10 Nukleotid)-(1-Nsp)-)-(1-10 Nukleotid)-(1-Nsp)]-Hyb2, z. B. 5'amino-cacgttatcctcctgg(4 × P)g(2 × P)a(1 × P)ta(2 × P)tgtccaggttccgca, worin „sp" ein Spacer Molekül, wie zum Beispiel einen fehlgepaarten Nukleotid oder ein Phosphoramidit bezeichnet; P = Phosphoramidit (als Beispiel); Hyb1 = erster hybridisierender Bereich des Nukleotids, der zum Beispiel 1–30 Nukleotidbasen umfasst, Hyb2 = zweiter hybridisierender Bereich des Nukleotids, der zum Beispiel 1–30 Nukleotidbasen umfasst und Hyb3 = dritter hybridisierender Bereich des Nukleotids, der zum Beispiel 1–30 Nukleotidbasen umfasst.
Ein Sondensatz umfassend erste und zweite Nukleinsäuresonden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei sich die erste Sonde von der zweiten Sonde durch mindestens eine Nukleinsäurebase in mindestens einem der nicht angrenzenden Bereiche unterscheidet, so dass die erste Sonde mit einer ersten Zielsequenz hybridisieren kann und die zweite Sonde mit einer zweiten, polymorphen Zielsequenz hybridisieren kann.
Ein Verfahren für das Nachweisen einer Nukleinsäuresequenz in einer Probe welches umfasst, dass diese Probe mit mindestens einer Nukleinsäuresonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 in Kontakt gebracht wird und dass bestimmt wird, ob beliebiges hybridisiertes Material vorliegt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, welches einen vorbereitenden Schritt umfasst, in dem die Nukleinsäuresonde unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 12 oder Anspruch 13, das eine Schritt umfasst, in dem die Sonde und die Nukleinsäurenprobe unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht werden.
Ein Verfahren gemäß einem beliebigen von Anspruch 12 bis 14, das eine Schritt umfasst, in dem die Sonde und die Nukleinsäurenprobe gemäß einem Sequenzspezifischen Oligonukleotid (SSO) Standardprotokoll in Kontakt gebracht werden.
Ein Gerät für das Nachweisen eine Zielnukleinsäuresequenz in einer Probe wobei der Apparat einen Bereich für das Aufbringen der Probe und mindestens eine Sonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst.
Ein Gerät gemäß Anspruch 16, wobei der Apparat in einem biologischen Assay verwendet wird.
Ein Gerät gemäß Anspruch 17, wobei biologische Assay für den Nachweis einer oder mehrerer Sequenzen in einer Probe verwendet wird.
Ein Gerät gemäß einem beliebigen der Ansprüche 16 bis 18, wobei der biologische Assay verwendet wird, um Polymorphismen im Humanen Leukozyten Antigen (HLA) nachzuweisen.
Ein Verfahren für das Nachweisen einer Zielnukleinsäuresequenz in einer Probe, das umfasst, dass diese Probe mit mindestens einer Sonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 in Kontakt gebracht wird und dass bestimmt wird, ob zumindest ein Sonden-/Zielnukleinsäuresequenz-Hybrid gebildet wird.
Ein Diagnoseverfahren, welches umfasst, dass eine Sonde gemäß den Ansprüchen 1 bis 10, die so ausgeführt ist dass sie an ein Allel oder eine Mehrzahl von Allelen und/oder Mutationen hybridisiert, mit einer Probe von einem Individuum in Kontakt gebracht wird, um den Genotyp des Individuums zu bestimmen.
Ein Diagnoseverfahren gemäß Anspruch 21, wobei das Diagnoseverfahren verwendet wird, um den Status der Allele von Humanen Leukozyten Antigenen in einem Individuum festzustellen.