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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Medizin. Insbesondere
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Behandlung von mit
Hypoxie zusammenhängenden
Störungen
bei Säugern
und auf Verbindungen und pharmazeutische Präparate zur Verwendung bei einer
solchen Behandlung.
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Hintergrund der Erfindung
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Herzversagen
ist ein chronisches klinisches Syndrom, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass das Herz nicht in der Lage ist, Blut ausreichend durch
den ganzen Körper
zu pumpen. Im Allgemeinen wird es durch jede Krankheit oder Zustände verursacht,
die einen Verlust des Herzgewebes, insbesondere der linken Herzkammer,
verursachen. Zu den häufigsten Ursachen
gehören
Herzinfarkt, Koronararterienkrankheit, Myokarditis, Chemotherapie,
Alkoholismus und Cardiomyopathie. Andererseits kann ein Herzversagen
auch durch Krankheiten oder Zustände
verursacht sein, die eine übermäßig starke
Herzleistung erfordern. Zu den häufigsten
Ursachen gehören
Bluthochdruck, Herzklappenerkrankungen (am häufigsten Mitralinsuffizienz
und Aortenstenose) und Störungen
der Schilddrüse.
Die langfristige zusätzliche
Belastung des Herzens führt
zu einer kompensatorischen Hypertrophie der Cardiomyocyten. Da sich das
Kapillarnetzwerk nicht ausdehnt, führt die Hypertrophie zu einer
relativen Ischämie,
da der Diffusionsweg für
Sauerstoff zunimmt. Vor kurzem wurde die Wichtigkeit der Rolle von
Ischämie
bei Herzversagen vorgebracht (Van den Heuvel et al., 2000).
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Bisher
hat sich die Behandlung von Patienten, die unter ischämischer
Herzkrankheit und anschließender
Herzschädigung,
die zu Herzversagen führt,
leiden, auf eine frühe
Reperfusion konzentriert. Obwohl eine zusätzliche Zellschutztherapie
theoretisch den Schaden, der durch Myokardischämie verursacht wird, begrenzen
und damit die Morbidität
und Mortalität
reduzieren könnte,
gibt es bisher keine ausreichenden Therapien. Eine zusätzliche
unterstützende
Therapie zum Schutz des Myokards bei akuten ischämischen Bedingungen besteht
heute in der Verabreichung von Betablockern, Calcium-Antagonisten
und Nitraten. Diese Therapien haben jedoch eine geringe Wirksamkeit,
und daher benötigt man
alternative und/oder zusätzliche
Strategien.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1.
Echtzeit-RT-PCR von EPO-R-mRNA. Die Spezifität wurde durch die Verwendung
eines Restriktionsenzyms (NciI) für den partiellen Verdau des 72-bp-EPO-R-Produkts an
den erwarteten Fragmenten (39 bp und 34 bp) überprüft.
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2.
Western-Blot. Spur 1-3: MAPK (pERK1 = 44 kD; pERK2 = 42 kD) in scheinbehandelten
Herzen; Spur 4-6: MAPK in EPO-behandelten Herzen; Spur 7: EPO in
scheinbehandeltem Herzen; Spur 8: EPO-R in scheinbehandeltem Herzen.
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Kurzbeschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung gibt die Verwendung von Erythropoietin (EPO)
oder Derivaten oder funktionellen Analoga davon zur Herstellung
eines Medikaments für
die präventive
und/oder kurative Behandlung von Patienten an, die unter Herzversagen
leiden oder bei denen die Gefahr besteht, dass sie darunter leiden
könnten.
Die Behandlung mit EPO kann bei diesen Zuständen unabhängig von ihrer Ursache und
Natur günstig
sein. In einem Aspekt der Erfindung ist der Patient, der unter Herzversagen
leidet, nicht anämisch.
Obwohl neuere klinische Studien die günstigen Wirkungen von EPO bei
Patienten mit kongestivem Herzversagen (CHF), die auch unter Anämie litten,
bewiesen (Silverberg et al., 2000 und 2001), würde der Fachmann vor der vorliegenden
Erfindung Patienten mit Herzversagen bei Fehlen spezifischer anderer
Indikationen für
die Verwendung von EPO, wie Anämie,
Nierenkrankheit oder Leukämie,
nicht durch Ver- wendung
von EPO behandeln. Ein bestimmter Bruchteil von CHF-Patienten ist
anämisch
(niedriger Hämatokrit/niedriger
Hämoglobinprozentsatz),
und es gibt eine Korrelation zwischen der Schwere des Zustands von
CHF und dem Grad der Anämie.
Wenn Patienten mit Anämie
bei CHF mit rekombinantem EPO behandelt wurden, wurde eine Verbesserung
in Bezug auf die Herzfunktion, die Nierenfunktion und eine Abnahme
der Notwendigkeit von Diuretika und stationärer Behandlung beobachtet (Silverberg
et al, 2000 und 2001). Andere Publikationen (
EP 0 813 877 ; Mancini et al., 2001)
beschreiben ebenfalls die Verwendung von EPO zur Anhebung der Zahl
der roten Blutkörperchen
und/oder zur Verhinderung von Anämie
im Falle von kongestivem Herzversagen. Anscheinend wurde bisher
der verbesserte Zustand von Herzpatienten nach Behandlung mit EPO
der zweckmäßigen Anhebung
des Hämatokrit
zugeschrieben, wenn Patienten eine medizinische Indikation für die Behandlung
mit EPO aufwiesen, so dass die periphere Sauerstoffversorgung durch
einen Mechanismus verbessert wurde, der mit einer Änderung
der Herzfunktion nicht zusammenhängt.
Die vorliegende Erfindung offenbart erstmals die Verwendung von
EPO für
die Behandlung von Herzversagen unabhängig davon, ob der Hämatokritwert
(Zahl der roten Blutkörperchen)
des Patienten niedriger als normal ist oder nicht. Dies macht Herzversagen
an sich zu einer neuen Indikation für die Verwendung von EPO. Die
vorliegende Erfindung gibt daher die Verwendung von EPO für die Behandlung
von Patienten mit Herzversagen an, wobei die Patienten nicht notwendigerweise
neben Herzversagen eine weitere Indikation haben, die ansonsten
aufgrund des heutigen Wissensstands die Behandlung eines solchen
Patienten mit EPO garantiert hätte.
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Gemäß der Erfindung
wurde das EPO oder das Derivat oder funktionelle Analogon davon
in einer Wirtszelle produziert, die wenigstens das E1A-Protein eines
Adenovirus, vorzugsweise in einer von einer PER.C6-Zelle abgeleiteten
Wirtszelle, exprimiert.
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Die
Verwendung von EPO zum Schützen des
Myokards vor akuter ischämischer
Verletzung wurde zwar beschrieben (siehe WO 00/61164, WO 01/82952),
doch kann das verwendete EPO eine gleichzeitige signifikante Erhöhung der
Häma tokritwerte
verursachen, was als unerwünschte
Nebenwirkung für
diese Anwendung angesehen werden kann. Die Verwendung von EPO, das
von PER.C6TM oder einer anderen E1A-exprimierenden
Wirtszelle abgeleitet ist, führt
zu einer Reduktion dieser Nebenwirkung und ist daher günstig (siehe
auch WO 03/038100 wegen des Beweises, dass von PER.C6TM produziertes
EPO funktionsfähig
ist, aber im Vergleich zu einem kommerziell erhältlichen EPO-Präparat (EPREX)
zu einer geringeren Erhöhung
der Hämatokritwerte
führt).
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Die
Erfindung stellt auch pharmazeutisch wirksame Präparate gemäß Anspruch 4 bereit.
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Ausführliche Beschreibung
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Erythropoietin
(EPO), EPO-Derivate und funktionelle Analoga davon werden im Folgenden
gegebenenfalls der Kürze
halber als "EPO" bezeichnet. EPO
ist ein Protein, das für
seine Rolle beim Differenzieren von hämatopoetischen Stammzellen
zu roten Blutkörperchen
wohlbekannt ist, aber es hat auch viele weitere Funktionen. Diese
Anmeldung offenbart ein neues EPO- und EPO-Rezeptor(EPO-R)-System im Herzen,
und dieses Wissen wird in die Praxis umgesetzt, indem man gemäß der vorliegenden
Erfindung Patienten mit Herzversagen EPO verabreicht.
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Herzversagen
oder chronisches Herzversagen oder kongestives Herzversagen ist
definiert als Herzkrankheit, bei der das Herz nicht in der Lage
ist, Blut in einer Menge zu pumpen, die für die metabolisierenden Gewebe
erforderlich ist, oder wenn das Herz dies nur mit einem erhöhten Fülldruck
kann. Die Behandlung von Herzversagen mit EPO gemäß der Erfindung
beinhaltet die Behandlung von Patienten mit Herzinfarkt, Koronararterienkrankheit,
Myokarditis, Chemotherapie, Alkoholismus, Kardiomyopathie, Bluthochdruck,
Herzklappenkrankheiten (am häufigsten
Mitralinsuffizienz und Aortenstenose) und Störungen der Schilddrüse und dergleichen
oder von Patienten, bei denen die Gefahr besteht, davon betroffen
zu sein.
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Ein
Patient gemäß der Erfindung
kann ein Mensch sein, kann aber auch ein Tier mit Herzversagen beinhalten.
Daher kann die Behandlung gemäß der Erfindung
für Menschen
sowie für
andere Tierspezies gelten.
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Wie
der Ausdruck hier verwendet wird, ist ein nichtanämischer
Patient ein Patient, der einen Nämoglobinwert
hat, der als innerhalb des normalen Bereichs liegend angesehen wird,
ein Wert, der einen Arzt nicht dazu veranlassen würde, diesem
Patienten EPO zu verschreiben. Bisher ist die Anwendung von EPO
auf die Prävention
oder Korrektur von Anämie bei
speziellen Patientenpopulationen beschränkt, einschließlich der
(Vor)dialysephase bei chronischer Niereninsuffizienz, zytostatischer
Therapie, Frühgeborenen
und als Präparat
für die
Eigenbluttransfusion oder bei chirurgischen Eingriffen mit erwartetem großem Blutverlust.
Das allgemeine Ziel in solchen Fällen
besteht darin, die Hämoglobinwerte
(Hb) zu erhöhen,
indem man die Zahl der roten Blutkörperchen (Hämatokrit) auf einen spezifischen
Bereich erhöht,
indem man Standarddosisvorschriften an die individuellen Bedürfnisse
anpasst. Je nach der Patientenpopulation liegt der optimale Hb-Wert
im Bereich von einer Untergrenze von 6,5-7,5 mmol/l bis zu einer
Obergrenze von 8,0-8,7 mmol/l.
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Vorzugsweise
wird humanes EPO rekombinant produziert und aus einer geeigneten
rekombinanten Wirtszelle und/oder aus dem Kulturmedium isoliert.
Im Falle der rekombinanten Produktion kann der Wirt zweckmäßigerweise
aus irgendeiner Zelle ausgewählt
werden, die rekombinant Protein produzieren kann, wie bakterielle
Wirtszellen (z.B. E. coli, B, subtilis), Hefe (z.B. S. cerevisiae,
K. lactis), Pilze (z.B. A. niger, Pichia), Säugerzellen (z.B. CHO, BHK) einschließlich menschlicher
Zellen. Gemäß einem Aspekt
der Erfindung wird EPO in einer immortalisierten humanen Zelllinie,
insbesondere PER.C6TM (ECACC Hinterlegungsnummer 96022940), rekombinant
produziert.
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"Derivate von EPO" bezieht sich auf
Modifikationen des Quellen-EPO, bei dem es sich um Urin-EPO oder
um EPO, das rekombinant ausgehend von einer cDNA oder Gensequenz
produziert werden kann, handeln kann, wobei das Expressionsprodukt
eine oder mehrere Modifikationen relativ zum Quellen-EPO aufweist, wobei
sich die Modifikationen in der Primärstruktur befinden können, durch
Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten (wie in NESP), Deletion,
Addition oder Relokation von einem oder mehreren Aminosäureresten
oder Veränderungen
in der post- oder peritranslationalen Modifikation des Proteingerüsts, wie
Hydroxylierungen, Phosphorylierungen oder Glycosylierungen von Aminosäureresten,
Schwefelbrücken
und dergleichen. Derivate umfassen auch natürlich oder nichtnatürlich vorkommende
EPO-Varianten, die an nicht mit EPO verwandte proteinartige Struktureinheiten oder
auch an nichtproteinartige Struktureinheiten gekoppelt sind. Die
vorliegende Erfindung umfasst Derivate von EPO, solange sie mit
dem EPO-Rezeptor wechselwirken und eine Reduktion oder Verhinderung
der unerwünschten
Wirkungen, die von chronischem Herzversagen verursacht werden, bewirken. Als
Maß für das Auftreten
von unerwünschten
Wirkungen kann der Grad der Apoptose und/oder Nekrose im Herzgewebe
bestimmt werden, und/oder die Mengen der Purine im koronaren Effluentkreislauf, oder
nach irgendeiner anderen in der Technik bekannten Methode.
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"Funktionelle Analoga" von EPO bezieht
sich auf Moleküle,
die nicht notwendigerweise von natürlich oder nichtnatürlich vorkommendem
EPO abgeleitet sind und die Wechselwirkung von EPO mit seinem Rezeptor
nachbilden können,
wodurch die unerwünschten
Wirkungen, die durch chronische oder akute Myokardischämie oder
Myokardinfarkt oder allgemein Hypoxie im Herzen verursacht werden,
reduziert und/oder verhindert werden. Solche funktionellen Analoga
können
Peptidomimetika und/oder nichtpeptidische Moleküle, die das mit dem EPO-R wechselwirkende
Idiotop nachbilden, umfassen. Der Fachmann wird sich darüber im Klaren
sein, dass das funktionelle Analogon gemäß der Erfindung nicht notwendigerweise
mit demselben Idiotop oder in derselben Weise zu Wechselwirken braucht,
solange seine Wechselwirkung die Wechselwirkung von EPO mit seinem
Rezeptor nachbildet. Funktionelle Analoga können zweckmäßigerweise durch Screening
von (synthetischen) Peptidbibliotheken, Phagen- oder Ribosomen-Polypeptid-Display-Bibliotheken
oder Kleinmolekülbibliotheken
gesucht und aus diesen ausgewählt
werden. Der Fachmann kann nach funktionellen Analoga suchen oder
solche entwerfen und ihre Funktionalität in hier offenbarten Assays
testen. Neben Assays auf der Basis von Apoptose und/oder Purinbestimmung
können
auch andere Verfahren, wie Verfahren zum Messen der Zellnekrose,
die in der Technik allgemein bekannt sind, verwendet werden, um
die Funktionalität
des Analogons in Bezug auf die Reduktion und/oder Verhinderung der
unerwünschten
Wirkungen der Hypoxie zu testen.
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EPO
kann einem Säuger
in jeder pharmazeutisch annehmbaren Form verabreicht werden. Im Allgemeinen
wird EPO parenteral oder subkutan (sc) verabreicht, aber die Art
der Verabreichung kann von Zeit zu Zeit variieren. Wann immer eine
schnelle Reaktion erhalten werden muss, kann es wünschenswert
sein, EPO in hochdosierter Form mit Mitteln zuzugeben, die das Pharmakon
bekanntermaßen schnell
an das Herz abgeben. Fälle,
in denen dies eindeutig erwünscht
ist, sind zum Beispiel solche, bei denen der Patient unter akuten
Syndromen, wie akuter Myokardischämie, Myokardinfarkt oder akutem Herzversagen,
leidet. Unter diesen Umständen
steigen die Dosen typischerweise über die Dosen, die humanen
Patienten verabreicht werden, welche an Anämie oder an chronischen Koronarsyndromen
leiden (Silverberg et al., 2000 und 2001). Normale Dosen, die an
erwachsene Patienten mit Nierenversagen verabreicht werden, liegen
im Bereich von 4000 bis 7500 IE pro Woche (80 bis 100 kg Körpergewicht).
Diese Mengen werden bei dem kommerziell erhältlichen Epoetin alpha oder
Eprex (von CHO-Zellen produziertes EPO) normalerweise in 3 getrennte Dosen
pro Woche unterteilt. Höhere
Dosen für
die Behandlung von akuten koronaren Störungen können täglich oder noch häufiger gegeben
werden. Die maximal tolerierbare Dosis muss möglicherweise bestimmt werden,
um zu verhindern, dass Hämatokritwerte
und Hämoglobinkonzentrationen
zu scharf ansteigen. Der Fachmann weiß, wie man Hämatokritwerte
und Hämoglobinkonzentrationen
bei Patienten überwacht,
um unerwünschte
Nebenwirkungen, wie extrem hohen Blutdruck, der in späteren Stadien
der Behandlung auftreten kann, zu verhindern. Diese Verabreichungsschemata
stehen im Gegensatz zu den von Silverberg et al. (2000 und 2001)
verwendeten Schemata zur Behandlung von anämischen Patienten, die unter
kongestivem Herzversagen leiden, wobei die Verabreichung von EPO
für Wochen
oder sogar Monate verlängert
wurde. Für
akute Koronarsyndrome könnte
es unnötig
sein, die Behandlung mit den hohen Dosen für mehrere Monate zu verlängern, da
die Schutzwirkung sofort erforderlich ist und unerwünschte Nebenwirkungen
auftreten könnten, wenn
solche hohe Dosen während
längerer
Zeiträume
gegeben werden. Im Falle von chronischen Koronarsyndromen einschließlich unter
anderem Myokardischämie
oder Herzversagen können
niedrigere Dosen während
eines längeren
Zeitraums verabreicht werden. Herzversagen umfasst in chronischen
Fällen eine
reduzierte Pumpleistung des Herzens. Diese angewendeten Dosen sind
vergleichbar mit Dosen, die Patienten mit Nierenversagen gegeben
werden, welche unter fehlendem EPO leiden. Dosen für nichtakute,
mit Hypoxie zusammenhängende
Myokardstörungen
können
im Bereich von 10 bis 10 000 IE pro Verabreichung, vorzugsweise
1000 bis 2500 IE pro Verabreichung (für einen Erwachsenen von 80 bis
100 kg), liegen. In diesem Fall kann auch eine Überwachung notwendig sein,
um unerwünschte
Nebenwirkungen zu verhindern.
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Wie
in WO 00/63403 offenbart ist, kann EPO auch rekombinant von PER.C6TM-Zellen
produziert werden. Vor kurzem wurde beschrieben (siehe Patentanmeldung
WO 03/038100), dass so produziertes EPO zu einer signifikant schwächeren Zunahme des
Hämatokritwerts
nach der Verabreichung führt als ähnliche
Dosen von rekombinantem EPO, das zur Zeit kommerziell erhältlich ist
(EPREX). Dies scheint hauptsächlich
auf die spezifischen posttranslationalen Modifikationen des so produzierten
EPO zurückzuführen zu
sein, die mit der Anwesenheit wenigstens der E1A-Sequenz eines Adenovirus
in exprimierbarem Format in der für die rekombinante Produktion
von EPO verwendeten Wirtszelle zusammenzuhängen scheinen. Eine weniger
ausgeprägte Zunahme
des Hämatokritwerts
bei Verabreichung von EPO ist für
die Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung günstig.
Die vorliegende Erfindung gibt daher die Verwendung von EPO gemäß der Erfindung
an, wobei das EPO rekombinant in einer Wirtszelle produziert wurde,
die wenigstens das E1A-Protein oder ein Derivat oder funktionelles
Analogon davon exprimiert (siehe WO 03/038100). Vorzugsweise ist
die Wirtszelle eine PER.C6TM-Zelle. Ein solches
EPO kann gemäß der Erfindung
für chronisches
Herzversagen verwendet werden.
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Pharmazeutisch
annehmbare Zubereitungen gemäß der Erfindung
umfassen typischerweise EPO gemäß der Erfindung,
gewöhnlich
zusammen mit pharma zeutisch annehmbaren Trägerstoffen, Verdünnungsmitteln,
Lösungsmitteln
und gegebenenfalls Verbindungen, die in einer additiven oder sogar synergistischen
Weise wirken. Verbindungen der letzteren Kategorie umfassen Verbindungen
der Statin-Familie, wie Lovastatin, Simvastatin, Inhibitoren des
angiotensinkonvertierenden Enzyms (ACE-Inhibitoren) und dergleichen.
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Es
ist bemerkenswert, dass die schützende Wirkung
von EPO gemäß der Erfindung
auf Hypoxie-induzierte Myokardschädigung, wie sie durch Purinanalyse
im koronaren Effluenten und/oder anhand des Grads der apoptotischen
Zellen im Myokard bestimmt wird, innerhalb von Minuten nach der
subkutanen Verabreichung beobachtet wird. Es ist schwierig, sich
vorzustellen, dass diese Wirkung der bekannten stimulierenden Wirkung
von EPO auf die Angiogenese oder seiner hämatopoetischen Wirkung, was
das betrifft, zugeschrieben werden soll, da diese Wirkungen typischerweise
nicht im Zeitrahmen von Minuten, sondern eher Tagen oder sogar Wochen
beobachtet werden. Es ist daher verlockend, zu spekulieren, dass
die zellschützende
Wirkung von EPO, die innerhalb von Minuten nach der Verabreichung
beobachtet wird, von einer direkten Wechselwirkung von EPO und Geweben
des Myokards oder Geweben, die in direktem Kontakt damit stehen,
hervorgerufen wird. Die Tatsache, dass sich zeigt, dass EPO-R auf der
Zelloberfläche
der Myocyten exprimiert wird (wie in dieser Erfindung gezeigt wird),
lässt stark
vermuten, dass durch die Wirkung von EPO auf diese Rezeptoren direkte
antiapoptotische und antinekrotische Wirkungen auftreten, während die
direkten angiogenen Wirkungen von EPO höchstwahrscheinlich über den
EPO-R erfolgen, der auf Endothelzellen in den Kapillaren exprimiert
wird. Diese Wirkung kann sowohl in vitro als auch in vivo auftreten.
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Die
Erfindung wird jetzt anhand der folgenden Beispiele erläutert.
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Beispiele
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Beispiel
1. Nachweis von EPO und EPO-R in normalem Human- und Rattenherzgewebe.
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Es
hat sich gezeigt, dass EPO und EPO-R in fetalem Herzgewebe exprimiert
werden (Juul et al., 1998). Trotz der zunehmenden Literatur über die
Expression von EPO und seines Rezeptors und der mutmaßlichen
Rollen, die damit assoziiert sind, ist nur wenig, wenn überhaupt,
von der Verteilung von EPO und EPO-R in erwachsenem Herzgewebe bekannt.
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Die
Expression von EPO und EPO-R wurde durch Echtzeit-RT-PCR, Western
Blotting und Immunhistochemie mit Rattenherzgewebe und durch Western
Blotting und Immunhistochemie mit humanen Herzbiopsien untersucht.
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Rattenherz (Versuchsaufbau nach Langendorff)
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Dazu
wurden Ischämie/Reperfusions(I/R)-Experimente
mit isolierten Rattenherzen, die in einer sogenannten Langendorff-Apparatur
(Van Gilst et al., 1988) aufgehängt
waren, mit und ohne Verabreichung von EPO durchgeführt, wobei
Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
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Männliche
Sprague-Dawley-Ratten, die ungefähr
300 g wogen (n = 12), wurden in 4 Versuchsgruppen eingeteilt. Zwei
Gruppen erhielten eine globale Herzischämie, indem man den Koronarfluss
30 min lang auf 0,6 ml/min reduzierte und anschließend 45
min lang reperfundierte. Zwei andere Gruppen waren ohne Ischämie. Innerhalb
jeder der Gruppen wurde die Hälfte
der Ratten mit EPO (10 E/ml) und die Hälfte mit Kochsalzlösung behandelt.
Die Ratten wurden anästhetisiert,
und 500 E Heparin wurden in die Schwanzvene injiziert. Das Herz
wurde schnell herausgeschnitten, und die Aorta wurde sofort retrograd
mit einer modifizierten Tyrode-Lösung
(Glucose 10, NaCl 128,3, KCl 4,7, NaHCO3 20,2,
CaCl2 1,35, NaH2PO4 0,42, MgCl2 1,05;
alles in mmol/Liter) perfundiert und mit 95% O2 und
5% CO2 äquilibriert.
Der Perfusionsdruck wurde auf 60 mm Hg gehalten. Der Koronarfluss
(CF) wurde mit einem Mikroprozessor gemessen, der den Perfusionsdruck
steuerte, indem er die Perfusionsschlauchpumpe regulierte. Der CF, die
Herzfrequenz (HR) und der linksventrikuläre Spitzendruck wurden ständig überwacht.
Nach 5 Minuten Äquilibrieren
wurden die Herzen 20 Minuten lang mit EPO oder Kochsalzlösung perfundiert,
bevor die I/R-Vorschrift begann.
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Echtzeit-RT-PCR
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Gesamt-RNA
wurde aus der linken Herzkammer der Ratte isoliert und so verarbeitet,
wie es schon früher
beschrieben wurde (Brundel et al., 1999). Kurz gesagt, cDNA wurde
synthetisiert, indem man 1 μg
RNA in Reverse-Transcriptions-Puffer,
200 ng statistischen Hexameren mit 200 E Moloney Murine Leukemia
Virus Reverse Transcriptase, jeweils 1 mmol/l dNTP und 1 E RNase-Inhibitor (Promega)
inkubierte. Die Synthesereaktion wurde 10 Minuten lang bei 20°C, 20 Minuten
lang bei 42°C,
5 Minuten lang bei 99°C
und 5 Minuten lang bei 4°C
durchgeführt.
Alle Produkte wurden auf kontaminierende DNA überprüft. Fragmente von EPO-R wurden
mit einem GeneAmp® 5700 (Perkin-Elmer/ABI)
amplifiziert (Vorwärtsprimer:
CAGGACACCTACCTGGTATTGGA; Rückwärtsprimer:
CAGGCCCAGAGAGGTTCTCA, eurogentec, Belgien), wobei man eine Vorschrift mit
40 Zyklen verwendete, die aus 30 s bei 94°C, 1 min bei 56°C und 30
s bei 72°C
bestanden. Nach dem letzten Zyklus wurde der Verlängerungsschritt bei
72°C auf
5 min ausgedehnt. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von SYBR-Grün I nachgewiesen.
EPO-R wurde unabhängig
von der Behandlung mit EPO in Herzproben von normalem Rattenherzgewebe
und in Gewebe, das in vitro einer Ischämiezeit von 30 min ausgesetzt
worden war, nachgewiesen. Um die Spezifität des Produkts zu bestätigen, wurden
die amplifizierten Fragmente 3 h lang mit dem Restriktionsenzym
NciI behandelt, um die partiell zu verdauen, und durch Gel-Elektrophorese auf
2,5%igen Agarose-Gelen aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die
Restriktionsanalyse bestätigte
ein Spleißen
des erhaltenen Produkts in zwei Fragmente der erwarteten Größe (34 und
39 bp, 1).
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Im
Gegensatz zu EPO-R konnten wir EPO-mRNA in Rattenherz unter Verwendung
des von Neumcke et al. (1999) beschriebenen Echtzeit-RT-PCR-Verfahrens
nicht nachweisen (während Hirngewebe
bei derselben PCR-Reaktion positiv war).
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Western-Blotting
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Western-Blotting
wurde gemäß Standardverfahren
(Brundel et al., 1999) auf mittpapillären Schnitten aus der linken
Kammer des Rattenherzens durchgeführt, die in flüssigem Stickstoff
blitzgefroren worden waren. Kurz gesagt, gefrorene LV-Gewebe (ca. 50
mg) wurden in 1 ml eiskaltem Proteinlysepuffer und Protease-Inhibitoren
homogenisiert. Die Homogenisate wurden dann 20 Minuten lang bei
4°C mit
14 000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde in ein sauberes
Röhrchen übergeführt und
auf Eis gelagert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung
eines Standard-Protein-Assays (Bio-Rad-Protein-Assay, Bio-Rad, Richmond, CA) bestimmt.
Proteinproben (50 μg)
wurden einer SDS-PAGE auf 7,5%igen Acrylamid-Gelen unterzogen und
dann auf PVDF-Membranen übergeführt, wobei
man eine Nassübertragungseinheit
verwendete (3 Stunden lang bei 100 mA). Dann wurden die Membranen
20 Minuten lang mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,04% Tween 20 und
5% fettfreie Trockenmilch enthielt, blockiert und danach 3 Stunden
lang mit dem primären
Antikörper
in Tris-gepufferter Kochsalzlösung,
die 0,04% Tween 20 enthielt, inkubiert; 1:100-Verdünnungen
für den
polyklonalen Kaninchen-Anti-EPO-R-Antikörper (C20, Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA), Anti-EPO-Antikörper (N-162,
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) und 1:1000-Verdünnungen
für den
monoklonalen Maus-Anti-phosphoryliertes-ERK1/ERK2-Antikörper (Nr.
9106S, New England Biolabs, Beverly MA). Die Blots wurden 1 Stunde
lang mit NRP-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert,
bevor man mit Hilfe eines ECL-Kits
(Amersham) entwickelte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass in nach Langendorff
perfundierten Herzen sowohl EPO als auch der EPO-Rezeptor (EPO-R)
auf dem Proteinniveau exprimiert werden (2). Expressionsniveaus
sowohl von EOP als auch von EPO-R scheinen durch die Ischämie-Reperfusion
und durch die Anwendung von EPO nicht beeinflusst zu werden. Im
nächsten
Experiment wurden Rattenherzen in vivo 20 Minuten lang 10 E/ml EPO
ausgesetzt. Unter Verwendung von Western-Blotting fanden wir eine
Erhöhung
bei phosphoryliertem MAPK, insbesondere ERK1 und in geringerem Maße bei ERK2
(2).
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Alles
in allem zeigt der Western-Blot die Anwesenheit von EPO und seines
Rezeptors in Herzgewebe. Wir fanden EPO-R-mRNA in Herzgewebe, konnten
aber keine EPO-mRNA nachweisen, was vermuten lässt, dass EPO nicht lokal produziert
wird. Schließlich
fanden wir heraus, dass EPO die Konzentrationen von phosphoryliertem
MAPK, insbesondere pERK-1, ändert,
was eine funktionelle Rolle von EPO-R im Herzgewebe impliziert.
Dies kann wichtige Implikationen für die Anwendung von EPO bei
Herzversagen haben, da der extrazelluläre signalregulierte Kinasen-Weg
(ERK1/2) als wichtiger Regulator der Herzhypertrophie und des Überlebens
von Myocyten als Reaktion auf hypertrophe Agonisten und Stressreize
erkannt wurde (Bueno und Molkentin, 2002).
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Immunhistochemie
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Um
das EPO- und EPO-R-Expressionsmuster in Rattenherzgewebe zu bewerten,
wurden von der Kontrollrattengruppe vollständige mittventrikuläre Myokardschnitte
erhalten. Gewebeschnitte wurden fixiert und in Paraffin eingebettet.
Histologische Schnitte von ungefähr
3 μm wurden
angefertigt, entwachst und mit abgestuftem Ethanol rehydratisiert. Die
Schnitte wurden mit Anti-EPO-R-Antikörper (C20,
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) und mit Anti-EPO-Antikörper (N-162,
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) inkubiert, wobei man experimentelle
Verfahren verwendete, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunhistochemie
wohlbekannt sind. Ein zweistufiges indirektes Peroxidase-Nachweissystem
wurde eingesetzt, um das Expressionsmuster von EPO und EPO-R sichtbar
zu machen. Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, und
negative Kontrollen, bei denen der primäre Antikörper weggelassen wurde, wurden
gleichzeitig durchgeführt.
Unter Verwendung dieser Immunhistochemie bei nichtischämischem
Rattenherzgewebe wurde eine EPO-Expression
bei mehreren Ratten (n = 4) gefunden, wo die EPO-Expression auf
Arteriolen und Kapillaren beschränkt
zu sein schien. In Cardiomyocyten oder Fibrocyten wurde keine EPO-Expression
gefunden. Die Expression von EPO-R war ebenfalls meistens auf Arteriolen
und Kapillaren beschränkt,
wenn auch die Cardiomyocyten eine schwache Anfärbung in Bezug auf EPO-R zeigten.
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Diese
Ergebnisse betonen weiter eine wichtige Rolle von EPO und EPO-R
bei der Angiogenese.
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Menschliches Herz
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Schnitte
von formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem menschlichem Herzen
werden von Routineautopsiefällen
(Pathologieabteilung, Academisch Ziekenhuis Groningen) erhalten.
Normales Autopsiematerial, das keine Harzpathologie beinhaltet, wird
von wenigstens 10 Individuen erhalten. Dieses Material wird für Western-Blotting
und Immunhistochemie verwendet, wie es oben für Rattenherzgewebe beschrieben
ist.
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Beispiel 2. Wirkung von EPO bei akuten
ischämischen
Ereignissen.
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Es
zeigt sich, dass der EPO-Rezeptor (EPO-R) in neuronalen Geweben
in hohen Konzentrationen exprimiert wird (Digicaylioglu et al. 1995; Juul
et al. 1997). Die durch (temporäre)
Hypoxie aufgrund von Hirnischämie
verursachten Wirkungen können
durch Verabreichen von Erythropoietin (EPO) gemildert werden, wie
in WO 00/35475 offenbart ist. Digicaylioglu und Liptyon (2001) haben
gezeigt, dass eine Vorkonditionierung mit EPO Neuronen in ischämischen
Verletzungsmodellen schützt und
eine Apoptose verhindert. Wie hier offenbart wird, werden EPO und
EPO-R auch in Herzgewebe exprimiert. Herzgewebe, das für Hypoxie
anfällig
ist, kann daher von einer Behandlung mit EPO profitieren (siehe
auch z.B. WO 00/61164, WO 01/82952).
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Apoptose
und die Freisetzung von Purinen aus dem Herzen werden gemessen,
um die Wirkung von EPO unter Umständen, bei denen das Herzgewebe
ischämisch
wird, zu bestimmen. Dazu werden Ischämie/Reperfusions(I/R)-Experimente
an isolierten Rattenherzen, die in einer sogenannten Langendorff-Apparatur aufgehängt sind
(Van Gilst et al., 1988), mit und ohne Verabreichung von EPO durchgeführt, wobei
Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
Das rekombinante EPO wird so erhalten, wie es in WO 00/63403 beschrieben
ist, wobei Reinigungsverfahren verwendet werden, die dem Fachmann
auf dem Gebiet der Proteinproduktion und -isolierung bekannt sind
(siehe auch WO 03/038100). Vier getrennte Versuchsgruppen werden
verwendet, die jeweils 8 Sprague-Dawley(SD)-Ratten umfassen. Jede
Ratte wiegt ungefähr 250
Gramm. Diese Gruppen sind:
- – SD-Ratten ohne I/R, ohne
EPO
- – SD-Ratten
ohne I/R, mit EPO
- – SD-Ratten
mit I/R, ohne EPO
- – SD-Ratten
mit I/R, mit EPO
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Die
Ratten werden anästhetisiert,
und das Herz wird schnell herausgeschnitten. Die Aorta wird sofort
retrograd perfundiert. Der koronare Fluss (CF) wird mit einem Mikroprozessor
gemessen, der den Perfusionsdruck steuert, indem er die Perfusionsschlauchpumpe
reguliert. Der CF, die Herzfrequenz (HR) und der linksventrikuläre Spitzendruck
werden ständig überwacht
und in einer Computerdatenbank gespeichert. Nach 15 min Äquilibrieren
werden die Baseline-Parameter gemessen. Ischämie wird durch 15 min Ligatur
der linken Koronararterie induziert. Dann wird die Reperfusion induziert,
indem man die Ligatur beendet, und die Herzen werden 15 min lang sich
erholen gelassen.
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Es
hat sich gezeigt, dass die Purinfreisetzung aus dem Herzen die Myokardschädigung widerspiegelt
(Van Jaarsveld et al. 1989). Der Koronareffluent, der aus dem Herzen
tropft, wird aufgefangen, um die vom Myokard freigesetzten Purine
zu messen. Baseline-Proben werden nach Stabilisierung des Präparats gesammelt,
und Proben des Koronareffluenten werden nach 15 min Ischämie und nach
15 min Reperfusion genommen, und die Purine werden durch HPLC (high
performance liquid chromatography) gemessen. Der allgemeine Trend
geht dahin, dass die Anfangswerte für Purin, das aus dem Koronareffluenten
von nicht-EPO-behandelten Tieren freigesetzt wird, bei höheren Werten
beginnen, während
die Abnahme von Purin mit der Zeit im Vergleich zu EPO-behandelten
Tieren langsamer zu sein scheint.
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Am
Ende der Experimente werden die Herzen gewogen, und ein mittpapillärer Schnitt
aus der linken Herzkammer wird herausgeschnitten und fixiert. Der
nicht von Infarkt betroffene Teil des Herzens (hintere Wand, IV-Septum)
wird in flüssigem Stickstoff
blitzgefroren. Wie oben beschrieben, werden polyklonale Antikörper gegen
EPO und EPO-R angewendet, um die Expression der beiden Proteine zu
bestimmen.
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Apoptose
wird wie folgt nachgewiesen. Schnitte von in Paraffin eingebetteten
Gewebeblöcken
werden auf beschichtete Objektträger
gelegt, um apoptotische Zellen in situ nachzuweisen. Zellkern-DNA-Fragmente
werden durch eine enzymatische Reaktion sichtbar gemacht, wobei
man den ApopTag-Kit für
den in-situ-Nachweis von Apoptose (Oncor, Gaithersburg, USA) verwendet
und die Anweisungen des Herstellers befolgt. Die Zahl und Verteilung
von angefärbten
Zellen, morphologische Zellkernmerkmale und die Intensität der Anfärbung werden
bewertet.
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Beispiel
3. Wirkung von EPO in Modellsystemen der chronischen Ischämie.
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Bei
Ratten wird ein Myokardinfarkt induziert, und die Rolle von EPO,
das in vivo verabreicht wird bestimmt, indem man den linksventrikulären Druck (LVP),
die Infarktgröße, Apoptose
und mikrovaskuläre
Dichte misst. Dazu werden SD-Ratten
entweder einer Scheinoperation (SH) oder einem Myokardinfarkt (MI)
unterzogen und 4 Wochen lang jeden Tag mit EPO (siehe oben) in einer
Konzentration von 400 Einheiten pro kg sc oder mit Kochsalzlösung behandelt.
Vier getrennte Versuchsgruppen werden verwendet, die jeweils 8 SD-Ratten
umfassen. Jede Ratte wiegt ungefähr
250 Gramm. Diese verwendeten Gruppen sind:
- – SD-Ratten
mit Scheinoperation, ohne EPO
- – SD-Ratten
mit Scheinoperation, mit EPO
- – SD-Ratten
mit Myokardinfarkt, ohne EPO
- – SD-Ratten
mit Myokardinfarkt, mit EPO
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Das
Myokardinfarktmodell wurde an anderer Stelle beschrieben (Pinto
et al. 1993). Kurz gesagt, eine Anästhesie wird induziert, und
eine linksseitige Thoracotomie wird durchgeführt, und eine MI wird erzeugt,
indem man die linke Koronararterie 1-2 mm hinter der Verzweigung
mit der Aorta mit einem 6-0-Seidenfaden
abbindet. Bei den einer Scheinoperation unterzogenen Ratten wird
dieselbe Operation durchgeführt,
ohne die Arterie abzubinden.
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Die
linksventrikuläre
(LV) Funktion wird wie folgt bestimmt. Nach 4 Wochen werden Ratten
anästhetisiert,
und die rechte Karotidenarterie wird mit einem Druckwandlerkatheter
kanüliert.
Nach 3 min Stabilisierungszeit werden der maximale LVP, der linksventrikuläre enddiastolische
Druck (LVEDP) und die Herzfrequenz aufgezeichnet. Danach wird der Katheter
herausgezogen, um den systolischen Blutdruck in der Aortenwurzel
zu messen. Als Indices der globalen Kontraktilität und Relaxation werden die maximalen
Raten der Zunahme und Abnahme des LVP (systolisches dp/dt und diastolisches
dp/dt) bestimmt und weiter in Bezug auf den spitzensystolischen
LVP korrigiert.
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Die
Infarktgröße wird
durch histologische Analyse bestimmt, indem man auf LDH anfärbt, wobei
dem Fachmann bekannte allgemeine Verfahren verwendet werden. Der
gesamte epikardiale und endokardiale Umfang der linken Herzkammer
und die epikardiale und endokardiale Narbenlänge des vom Infarkt betroffenen
Bereichs werden mittels eines computerisierten Planimeters bestimmt.
Die Infarktgröße wird
berechnet, indem man die Summe der Narbenlängen durch die Summe der gesamten
Umfänge
dividiert, wie schon früher
ausführlich
beschrieben wurde (Pinto et al., 1993). Weiterhin wird die Apoptose
gemessen, wie oben beschrieben ist.
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Die
mikrovaskuläre
Dichte wird wie folgt bestimmt (Loot et al., 2002). Der in Paraffin
eingebettete LV-Schnitt wird angefertigt und für die histologische Analyse
zur Berechnung der Infarktgröße mit Hämatoxylin-Eosin
und zur Sichtbarmachung von Mikrogefäßen mit RECA-1-Antikörper angefärbt, wobei
dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet wurden. Die Mikrogefäßdichte
pro mm2 wird in dem verschonten Myokard
(gegenüber
dem Infarkt, gewöhnlich ventrikuläres Septum
oder Hinterwand) gemessen. Von jeder Ratte werden sieben bis zehn
mikroskopische stark vergrößerte Gesichtsfelder
mit quergeschnittenen Myocyten mit der geeigneten Software digital
aufgezeichnet. Die Mikrozirkulation ist definiert als Gefäße jenseits
der Arteriolen dritter Ordnung mit einem Durchmesser von 150 μm oder weniger,
die Gewebe zwischen Arteriolen und Venolen liefern. Die Oberflächen der
Myocyten werden durch Morphometrie gemessen, wobei mit Bildanalysesoftware
(Loot et al., 2002) Myocyten mit einem zentralen Zellkern mit der
größtmöglichen
Oberfläche
ausgewählt
werden.
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Beispiel 4. Bestimmung von EPO- und EPO-R-Konzentrationen
bei chronischer Ischämie
im menschlichen Herzen.
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Die
Expressionsniveaus von EPO und EPO-R werden anhand der Konzentration
der mRNA unter Verwendung einer halbquantitativen Reverse-Transcriptase-Polymerase-Kettenreaktion(RT-PCR)-Technik
bestimmt. Dazu wird Gesamt-RNA unter Verwendung des Säure-Guanidiniumthiocyanat-Lyseverfahrens
(Chomczynski und Sacchi, 1987) isoliert. Die RNA wird aus Gewebe
von Patienten mit ischämischem
Herzversagen erhalten. Das Gewebe wird während der Herzkatheterisierung durch
rechtsventrikuläre
Endomyokard-Biopsie aus der rechten jugularen oder femoralen Vene
entnommen, wobei dem Fachmann bekannte Standardtechniken verwendet
werden. Eine Reverse Transcription von RNA und Amplifikation von
cDNA wird durch RT-PCR durchgeführt.
Die interessierende cDNA und die cDNA des Haushaltsenzyms GAPDH
werden durch Echtzeit-RT-PCR nachgewiesen, wie es oben beschrieben
ist.
-
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-
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