DE60310434T2

DE60310434T2 - Interferon nachahmende peptide und rekombinante proteine

Info

Publication number: DE60310434T2
Application number: DE60310434T
Authority: DE
Inventors: Vladimir Petrovich Moscow region Zav'yalov; Dmitriy Alexandrovich Dolgikh; Mikhail Petrovich Moscow Kirpichnikov; Rita Valerievna Cherikova; Ziedulla Hikmatullaevich Abdullaev; Timo Kalevi Korpela
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-10-07
Filing date: 2003-10-07
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2023-10-08
Also published as: JP2006502198A; AU2003274173A1; ATE347899T1; EP1551441A1; JP4295221B2; FI20021774A; US20060165654A1; DE60310434D1; EP1551441B1; FI20021774A0; WO2004030686A1

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die menschliche oder die Tiermedizin und spezifischer die Verbesserung der Therapie von antiviralen und antiproliferativen Arzneistoffen, wenn immer die effektiven Bestandteile Interferone enthalten können. Diese Erfindung stellt neue Peptide und rekombinante Proteine bereit, die antivirale und antiproliferative Aktivitäten der Interferone nachahmen, aber nicht ihre schädlichen Nebenwirkungen haben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf einer tiefgründigen Computer-Modellierungs-Auswertung der Interferonstrukturen aus verschiedenen Quellen und der Identifizierung von zwei bioaktiven Stellen der Interferone, von denen eine der Teil eines anderen ist. Solche Daten, kombiniert mit biologischen Studien mit synthetischen Peptiden, führte uns zu dem überraschenden Befund, dass die kleinen künstlichen Peptide, die spezifisch miteinander kombiniert sind, fast die vollständige biologische Aktivität dem Ausgangs-Interferon verdanken können. Der hauptsächliche Vorteil eines solchen künstlichen Mini-Interferons ist der Befund, dass viele der schädlichen Nebenwirkungen von Interferonen vermieden werden können.
Interferone sind die ersten Cytokine, die durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurden (Taniguchi T. et al., 1980, Nature 285, S. 547-549). Die starke antivirale Aktivität der Interferone zusammen mit ihren möglichen Antitumor-(antiproliferativen) Wirkungen lieferte den Antrieb für die großtechnische Produktion von Interferonen zu dem Zweck der klinischen Auswertung bei einer Vielfalt von viralen und malignen Erkrankungen (Pestka S. et al., 1987, Annual Review Biochem. 56, S. 727-777; Meager A., 1998, In: Cytokines, Hrsg. Mire-Sluis A. und Thorpe R., Academic Press, S. 361-389; Sen G.C., 2001, Annual Rev. Microbiol. 55, S. 255-281; Bon A.L. und Tough D. F., 2002, Curr. Opin. Immun. 14, S. 432-436).
Interferone werden in zwei Typen eingeteilt. Die Typ I-Interferone beinhalten das Fibroblasten oder Interferon-β, eine Anzahl von Subtypen von Leukocyten oder Interferon-α, Trophoblast oder Interferon-τ und Interferon-ω. Das Typ II-Interferon wird durch Immuninterferon oder Interferon-γ repräsentiert (De Maeyer E. und De Maeyer-Guignard J., 1998, In: Cytokines, Hrsg. Mire-Sluis A. und Thorpe R., Academic Press, S. 392-400). Die Typ I-Interferone sind bei einem pH-Wert von 2 stabil und realisieren ihre antiviralen Eigenschaften durch Wechselwirkung mit einem allgemeinen Zellrezeptor, IFNAR. Dieser Rezeptor besteht aus zwei Transmembran-Proteinen: IFNAR1 und IFNAR2. Die Interferone-α binden zuerst an IFNAR2 und dann an IFNAR1. IFNAR2 ist die hauptsächliche Liganden-bindende Untereinheit des Rezeptors mit K_d ≈ 2 – 10 × 10^–9 M für menschliches Interferon-α₂. Die Affinität von IFNAR1 an menschliches Interferon-α₂ ist wesentlich geringer (K_d > 100 × 10^–9 M), aber seine Mitwirkung an der Bindungsreaktion steigert die Affinität des Rezeptors an den Liganden ungefähr zehn mal und ist notwendig für die Induktion des intrazellulären Signals. Die Assoziierung von IFNAR1 und IFNAR2 in den Rezeptorkomplex aktiviert die IFNAR-assoziierten cytoplasmatischen Tyrosinkinasen (JAK1 und TYK2), die sich gegenseitig und die intrazellulären Teile der Rezeptoruntereinheiten phosphorylieren. Es führt wiederum zur Phosphorylierung und Aktivierung von latenten cytoplasmatischen Transkriptionsfaktoren (STAT1 und STAT2). Zusammen mit der dritten Komponente (p48) bilden die Faktoren einen Komplex, der die Transkription der Interferon-stimulierten Gene, ISG, aktiviert (Zav'yalov V. und Zav'yalova G., 1997, Acta Pathol. Microbiol. Immun. Scand. 105, S. 161-186).
Die dreidimensionale Struktur des menschlichen Interferon-α₂ wurde durch die Verfahren der Röntgenstrukturanalyse (Radhakrishnan R. et al., 1996, Structure 4, S. 1453-1463) und der NMR-Spektroskopie (Klaus W. et al., 1997, J. Mol. Biol. 274, S. 661-675) erhalten. Das menschliche Interferon-α₂ gehört zu den α-helicalen Cytokinen (Zav'yalov V. et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1041, S. 178-185). Seine kugelförmige Struktur beinhaltet fünf α-Helices. Studien zur Kartierung aufeinanderfolgender Epitope durch monoclonale Antikörper, synthetische Peptide, natürliche und de novo-Mutanten (Zav'yalov V. et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1041, S. 178-185; Fish E.N., 1992, J. Interferon Res. 12, S. 257-266; Senda T. et al., 1995, J. Mol. Biol. 253, S. 187-207; Piehler J. und Schreiber G., 1999, J. Mol. Biol. 294, S. 223-237; s. auch die Übersichtsartikel: Zav'yalov V. und Zav'yalova G., 1997, Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. 105, S. 161-186; Mitsui Y. et al., 1993, Pharmac. Ther. 58, S. 93-132; Uze G. et al., 1995, J. Interferon Cytokine Res. 15, S. 3-26) zeigten, dass die Sequenzen, die der N-terminalen Hälfte der Schleife AB (Reste 25-35), der N-terminalen Hälfte der Helix D und dem C-terminalen Teil der Schleife DE (Reste 121-134) entsprechen, den hauptsächlichen Beitrag zur Bildung der IFNAR2-Bindungsstelle sowie zu antiviralen und antiproliferativen Aktivitäten des menschlichen Interferon-α₂ machen. Diese Sequenzen sind in dem 3D-Modell des menschlichen Interferon-α₂ nahe zusammen (Piehler J. und Schreiber G., 1999, J. Mol. Biol. 294, S. 223-237). Die Reste Leu30 und Arg33 in dem N-terminalen Teil dieser Stelle sind für die antivirale Aktivität des menschlichen Interferon-α₂ absolut notwendig (insbesondere verringert die Substitution von Arg33 für Lys oder Ala die Aktivität um 500- bzw. 2500-mal. Ihre Rolle bei der antiviralen Aktivität korreliert mit ihrem Beitrag an der Wechselwirkung mit IFNAR2. Der C-terminale Teil der Bindungsstelle ist nicht so wichtig für die Wechselwirkung mit IFNAR2 und für die antivirale Aktivität. Zu der gleichen Zeit unterdrücken synthetische Peptide, die den Sequenzen 124-138 (Danilkovich A. et al., 1992, Immunol. Lett. 31, S. 15-20; Danilkovich A. et al., 1995, FEBS Lett. 369, S. 161-164) und 130-137 (LKEKKYSP, Zav'yalov V. et al., WO9852594) entsprechen, die Proliferation der menschlichen lymphoblastoiden T-Zelllinie MT-4 bei Konzentrationen von 10^–9 – 10^–8 M, aber besitzen keine wesentliche antivirale Aktivität.
Die Sequenz LKEKKYSP (130-137) des menschlichen Interferon-α₂ wurde in den N-terminalen Teil des de novo-Proteins Albebetin eingesetzt (Fedorov A. et al., 1992, J. Mol. Biol. 225, S. 927-931). Als Ergebnis wurde das de novo-Protein Albeferon mit vor-entworfener Struktur und Funktion (Dolgikh D.A. et al., 1993, Biophsysics 38, S. 59-66) hergestellt. Die Studie seiner Struktur und Aktivität zeigte, dass Albeferon eine kompaktere und stabilere Struktur als Albebetin besitzt (Aphsizheva I. et al., 1998, FEBS Lett. 425/1, S. 101-104), die Proliferation von Maus-Thymocyten bei geringeren Konzentrationen als menschliches Interferon-α₂ stimulierte (Dolgikh D. et al., 1996, Protein Engineering 9, S. 195-201) und effizient die Proliferation der menschlichen T-lymphoblastoiden Zelllinie MT-4 bei Konzentrationen von 10^–9 – 10^–8 M unterdrückte; das ist mit der antiproliferativen Aktivität von menschlichem Interferon-α₂ vergleichbar (Zav'yalov V. et al., WO9852594).
Während eine allgemeine Hoffnung unter den Wissenschaftlern bestand, künstliche Proteine und Peptide mit ähnlichen biologischen Funktionen wie Interferone herzustellen, hat es niemand geregelt, dies erfolgreich zu tun. Ein solcher Versuch wird beschrieben in der Publikation von Zusammenfassungen von Chertkova, R.V., et al. in „Biopolimeri I Klitina", Bd. 18, S. 161-163, wo die Fusion des Fragments LKDRHDF (30-36) aus menschlichem Interferon-α₂ (HulFN-α2) mit dem C-Terminus des de novo-Proteins Albeferon und auch die Insertion in den N-Terminus von Albeferon genau nach dem Fragment LKEKKYSP (130-137) ohne eine Linkersequenz zwischen den Peptiden beschrieben ist. Die Ergebnisse der Studie, dargestellt in den 1a und b in dem zitierten Dokument, zeigen tatsächlich eine geringe (wenn überhaupt) antivirale Aktivität für die Proteine, weil die Kontrollproteine HulFN-α2 und HulFN-γ eine wesentlich geringere Aktivität als IL-2 und IL-4 hatten. Darüber hinaus zeigt IL-4 eine ziemlich unterschiedliche Aktivität bei VERO- und L-41-Zellen, während alle anderen in der Figur dargestellten Proteine praktisch die gleiche Aktivität in beiden Zellkulturen besitzen. Dies zeigt zumindest Instabilität und Unzuverlässigkeit der Ergebnisse an. Außerdem beinhaltet das zitierte Dokument einen ernsthaften inneren Widerspruch: die englische Zusammenfassung sagt aus, dass „both proteins prevented the destruction of the L-41 and VERO cell monolayers generated by cytopathical action of a virus with the efficiency of native HulFN-alpha2 and did not possess cytotoxicological properties" [„beide Proteine die Zerstörung der L-41- und VERO-Einzelzellschicht, die durch cytopathische Wirkung eines Virus verursacht wurde, mit der Effizienz von natürlichem HulFN-alpha2 verhinderten und keine zelltoxikologischen Eigenschaften besaßen"], während sowohl die russische als auch die ukrainische Zusammenfassung nur die Aussage beinhalteten, dass „both proteins possessed anti-viral activity and did not possess cytotoxicological properties" [„beide Proteine antivirale Aktivität besaßen und keine zelltoxikologischen Eigenschaften besaßen"]. Daher ist es nicht möglich, eine Schlussfolgerung auf der Grundlage der Ergebnisse in dem zitierten Literaturhinweis zu machen. In ihm wurden die Aktivitäten der Peptide auch nicht in einem reinen Zustand untersucht (wie in der vorliegenden Erfindung), sondern nur als unreine Fusionen mit künstlichen Proteinen, wobei die Fusionsproteine durch rekombinante Verfahren hergestellt wurden. Wenn sich solch ein Fusionsprotein faltet, kann es falsche nichtaktive Konformationen annehmen, abhängig vom Wirtsstamm und den Bedingungen der Expression und Aufreinigung des Produkts. Der entscheidende Unterschied und die hauptsächliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung über Chertkova, R.V. et al. in dem Journal „Biopolimeri I Klitina", Bd. 18, S. 161-163 ist die künstliche Verbindung zwischen den Interferonfragmenten, die ihnen erlaubt, die korrekte Konformation anzunehmen und infolgedessen die antiviralen Aktivitäten der Ausgangspeptide und sogar der ohne einen Spacer miteinander verbundenen Peptide signifikant zu verbessern.
Der zusätzliche Unterschied der vorliegenden Erfindung über Chertkova, R.V. et al., in den „Biopolimeri I Klitina", Bd. 18, S. 161-163 ist die Demonstration der antiviralen Aktivität bei den chemisch synthetisierten Peptiden LKEKKYSP, LKDRHDF und LKEKKYSF-Ser-Ser-LKDRHDF, die genau beschreibbare Strukturen bilden. Wenn diese Peptide unpassend mit Proteinen verbunden werden, können sie ihre biologischen Aktivitäten verlieren, angezeigt durch die Ergebnisse in der Veröffentlichung von Chertkova et al.
Nach der vorliegenden Erfindung war das Peptid LKEKKYSP-X-X-LKDRHDF (das eine künstliche Verbindung zwischen den Peptiden einbezieht; wobei X einen kurzen Seitenkettenaminosäurerest meint) vorzuziehen und es reproduzierte praktisch vollständig die antiviralen Eigenschaften von HulFN-α₂. Wir studierten verschiedene Peptidstrukturen und wir fanden überraschenderweise, dass diese zwei Fragmente von HulFN-α2, die sehr weit voneinander in der Sequenz entfernt liegen, miteinander synergetisch wirken. Jedoch können sie nicht die korrekte Struktur, bezogen auf ihre gegenseitige Position in der 3-D-Struktur des Interferons, ohne eine künstliche Verbindung zwischen den Fragmenten annehmen (zum Beispiel zwei Ser-Reste oder zwei andere Reste mit einer kurzen Seitenkette, die die S-S-Bindung Cys29-Cys138 in den HulFNs-α-Molekülen nachahmen, s. 1 der vorliegenden Erfindung). Überraschenderweise fanden wir, dass nur die mit einer solchen Verbindung im Peptid oder in einem Fusionsprotein chemisch verbundenen Fragmente die mit dem HulFN-α₂ vergleichbare antivirale Aktivität haben (s. 7 der Erfindung). Die antivirale Aktivität von Albeferon I, bei dem die Fragmente getrennt in die N- und C-Termini eingesetzt wurden, war um zwei Ordnungen geringer als die von Albeferon II. Die antivirale Aktivität von Albeferon, bei dem nur das Fragment LKEKKYSP (130-137) in den N-Terminus eingesetzt wurde, war um fünf Ordnungen geringer als die von Albeferon II.
Während der letzten Jahre wird eine zunehmende Aufmerksamkeit der Rolle der Typ I-Interferone bei der Immunitätsregulation geschenkt (Bogdan C., 2000, Curr. Opin. Immunol. 12, S. 419-424; Akbar A. et al., 2000, Immunol. Today 21, S. 337-342; Sinigaglia F. et al., 1999, Immunol. Rev. 170, S. 65-72). Insbesondere stimulieren diese Interferone die Aktivität und die Differenzierung der Antigen-aktivierten Th1-Lymphozyten. Sie fördern die Reifung der meisten effizienten Antigen-repräsentierenden Zellen, d.h. der aus Monocytenhervorgehende Dendritenzellen und aktivierten B-Lymphocyten (Ruuth K. et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 284, S. 583-586).
Ein Hauptanliegen, das aus klinischen Studien von Interferonen entstand, ist, dass Typ I-Interferone alle eine wesentliche Anzahl von unerwünschten, klinisch beobachtbaren Nebenwirkungen erzeugen. 19% der Patienten, die an Autoimmunkrankheiten, die autoimmune Hepatitis, Polymyositis, Thyroiditis, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes beinhalten, leiden (Ronnblom L. et al., 1991, Ann. Intern. Med. 115, S. 178-183; Ioannou Y. und Isenberg D., 2000, Arthritis Rheum. 43, S. 1431-1442; Ronnblom L. und Alm G., 2001, J. Exp. Med. 194, S. F59-F63), bekommen gefährliche Symptome. Zusätzlich entwickelt ein variabler Anteil (1-40%) der Patienten, die mit menschlichem Interferon-α oder menschlichem Interferon-β, besonders mit rekombinantem menschlichem Interferon-α₂ und rekombinantem menschlichen Interferon-β Ser 17 behandelt werden, neutralisierende Antikörper gegen die verwendeten Interferonarten (Rinehart J. et al., 1986, Cancer Res. 46, S. 5364-5367; Antonelli G. et al., 1991, J. Infect. Dis. 163, S. 882-885), die in einigen Fällen mit klinischer „Resistenz" gegen Interferon assoziiert wurden (Steis R. et al., 1988, N. Engl. J. Med. 318, S. 1409-1413; Oberg, K. et al., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81, S. 531-535; Freund M. et al., 1989, Br. J. Haematol. 72, S. 350-356; Fossa S. et al., 1992, Int. J. Cancer 50, S. 868-870). Außerdem erzeugen Interferone alle Fieber, Schüttelfrost, Unwohlsein, Myalgie, Kopfschmerzen, Müdigkeit und Gewichtsverlust, und bei bestimmten Fällen waren diese schwer genug, um die Behandlung unterbrechen zu müssen. Diese klinischen Beobachtungen machen die Herstellung von Typ I-Interferonmimetika sehr wichtig, die spezifisch antivirale und antiproliferative Aktivitäten der Proteine aufweisen, frei von Stellen, die verantwortlich für die Antikörperreaktion sind, frei von der Induktion der voranstehend zitierten Autoimmunkrankheiten und frei von anderen unerwünschten Nebenwirkungen sind.
Die vorliegende Erfindung erfüllt die voranstehend beschriebenen Anforderungen für die Entwicklung neuer Peptide und Proteine mit spezifischen biologischen Aktivitäten von Interferonen ohne ihre Nebenwirkungen während der Behandlung von verschiedenen Krankheiten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Peptid- und rekombinante Proteinmimetika bereit, die spezifisch die antiviralen und antiproliferativen Aktivitäten von Interferonen aufweisen, wobei unerwünschte Nebenwirkungen der Interferone während der Behandlung einer Vielfalt von Krankheiten vermieden werden.
Die grundlegende Ausführungsform der vorliegenden Erfindung war, durch einen Spacer zwei primäre Proteinsequenzen, die entfernt zueinander in der natürlichen Struktur des Interferons liegen, zusammen zu verbinden. Eine dieser zwei Sequenzen, welche die antivirale Stelle der Interferone ausmacht, entspricht der antiproliferativen Stelle.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 Tertiärstrukturen des funktionellen Epitops des menschlichen Interferon-α₂, das verantwortlich für seine Bindung mit IFNAR2 und die antivirale Aktivität ist (A), und die vorher angenommene biologisch aktive Konformation des Peptids LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF, das das Epitop des menschlichen Interferon-α₂ nachahmt (B und C). Die Tertiärstrukturen werden als raumfüllende (A, B) oder Stab-(C) Modelle auf der Grundlage der Atomkoordinaten der Aminosäurereste des menschlichen Interferon-α₂ in Lösung gezeigt (Klaus W. et al., 1997, J. Mol. Biol. 274, S. 661-675). Nach der Mutangenese-Studie (Piehler J. und Schreiber G., 1999, J. Mol. Biol. 294, S. 223-237) spielen die Reste R33, 130 und 126 eine entscheidende Rolle bei der Wechselwirkung mit IFNAR2 und der antiviralen Aktivität; die Reste F27, K31, D32, H34, D35, R125 und K133 sind auch wichtig für diese Aktivitäten. Im Gegensatz dazu leisten die Reste S25, S28, K121, L128, K131, E132 und E134 einen minimalen Beitrag zu den Aktivitäten. Die Modelle wurden unter Verwendung des Programms Chem-X (Chemical Design Ltd., GB) erhalten.
2 Struktur der in der PCR verwendeten Oligonucleotide, um die Gene der de novo-Proteine Albeferon-I und Albeferon-II zu konstruieren. Die Restriktionsstellen und die Sequenzen, die den Peptidfragmenten LKEKKYSP und LKDRHDF entsprechen, werden gezeigt; überlappende Sequenzen der Primer IIdp-1 und IIdp-2 werden durch doppeltes Unterstreichen gezeigt; die Sequenz, die eine Spaltungsstelle der Protease „Faktor Xa" codiert, wird durch graue Farbe gezeigt.
3 Manipulieren der Gene der de novo-Proteine Albeferon-I (ABBI-I) und Albeferon-II (ABBI-II) und die Expressionsplasmidvektoren pET-32 LIC, die diese Gene tragen. (A) – Schema der PCR, um das Gen von Albeferon-I (ABBI-I) unter Verwendung des Albeferon (ABBI)-Gens als Matrize herzustellen; (B) – Schema der PCR, um das Gen von Albeferon-II (ABBI-II) unter Verwendung des Albebetin (ABB)- Gens als Matrize herzustellen; a, b, c, d – wechselseitige Positionen der regelmäßigen Sekundärstruktur-Elemente und die Sequenzen des menschlichen Interferon-α₂ für Albeferon (ABBI), Albeferon-I (ABBI-I), Albebetin (ABB) bzw. Albeferon-II (ABBI-II); (C) — Clonierungsschema der Gene von Albeferon-I (ABBI-I) und Albeferon-II (ABBI-II) in den Plasmidvektor pET-32 LIC.
4 Zuvor angenommene Tertiärstrukturen der de novo-Proteine Albeferon (A), Albeferon-I (B) und Albeferon-II (C), die die Peptidsequenzen des menschlichen Interferon-α₂ beinhalten. Die Sequenzen der N- und C-terminalen Teile der Moleküle und des menschlichen Interferon-α₂ werden gezeigt. Die Strukturen der Sequenzen des menschlichen Interferon-α₂ werden auf herkömmliche Weise.
5 CD-Spektren der Proteine Albeferon (ABBI), Albeferon-I (ABBI-I) und Albeferon-II (ABBI-II) im fernen UV-Bereich. Die Messungen wurden in 20 mM NH₄HCO₃-Puffer, pH 7.9 bei 20°C ausgeführt. Die Konzentrationen der Proteine waren 0.98 (Albeferon), 0.96 (Albeferon-I) und 1.04 (Albeferon-II) mg/ml, die Zellenweglänge war 1 mm.
6 Regelmäßige Sekundärstrukturen der de novo-Proteine Albebetin, Albeferon, Albeferon-I und Albeferon-II.
7 Antivirale Eigenschaften von de novo-Proteinen und Interferonen in L-41-(menschliche mononukleäre Leukose) und VERO-(Niere des Grünen Affen) Zellkulturen. Die Aktivität der Präparationen wurde als eine minimale Konzentration bestimmt, die zu einer 50% Verzögerung der cytopathischen Wirkung des Virus bei Maus-Encephalomyocarditis führte. Die Durchschnittswerte von drei unabhängigen Experimenten ± die Standardabweichungen werden gezeigt.
8 Antivirale Eigenschaften von de novo-Proteinen in den L-41-(menschliche mononukleäre Leukose) und VERO-(Niere des Grünen Affen) Zellkulturen. Die Aktivitäten der Proteine Albeferon (ABBI), Albeferon-I (ABBI-I), Albeferon-II (ABBI-II) und des rekombinanten menschlichen Interferon-α₂ (IFN) wurden als minimale Konzentrationen bestimmt, die zu einer 50% Verzögerung in der zytopathischen Wirkung des Virus bei Maus-Encephalomyocarditis führten. Die Durchschnittswerte von drei unabhängigen Experimenten ± die Standardabweichungen werden gezeigt.
9 Cytotoxische Eigenschaften der de novo-Proteine Albebetin, Albeferon, Albeferon-I und Albeferon-II. Cytotoxische Dosen wurden als minimale Konzentrationen bestimmt, die zu einer 50% Zerstörung einer Zelleinzelschicht bei Abwesenheit des EMC-Virus führten.
10 Antivirale Eigenschaften des synthetischen linearen Peptids LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF, das das Epitop des menschlichen Interferon-α₂ nachahmt, im Vergleich mit dem rekombinanten menschlichen Interferon-α₂ und den Peptiden LKEKKYSP und LKDRHDF der de novo-Proteine in den L-41-(menschliche mononukleäre Leukose) und VERO-(Niere des Grünen Affen) Zellkulturen. Die Aktivitäten der Peptide und des rekombinanten menschlichen Interferon-α₂ wurden als minimale Konzentrationen bestimmt, die zu einer 50% Verzögerung in der cytopathischen Wirkung des Virus bei Maus-Encephalomyocarditis führten. Die Durchschnittswerte von drei unabhängigen Experimenten ± die Standardabweichungen werden gezeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die starke antivirale Aktivität der Typ I-Interferone zusammen mit ihren möglichen Antitumor-(antiproliferativen) Wirkungen lieferte den Antrieb für die großtechnische Produktion von Interferonen zum Zweck der klinischen Beurteilung einer Vielfalt von viralen und malignen Krankheiten. Andererseits ist eine Hauptanliegen, die aus klinischen Studien entstand, dass Typ I-Interferone alle eine wesentliche Anzahl von unerwünschten, klinisch beobachtbaren Nebenwirkungen erzeugen. Es ist höchst gefährlich, dass 19% der Patienten von Autoimmunkrankheiten leiden, die autoimmune Hepatitis, Polymyositis, Thyroiditis, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes beinhalten. Zusätzlich entwickelt ein variabler Anteil (1-40%) der Patienten, die mit menschlichem Interferon-α oder menschlichem Interferon-β, besonders rekombinantem menschlichem Interferon-α₂ und rekombinantem menschlichem Interferon-β Ser17, behandelt werden, neutralisierende Antikörper gegen die verwendeten Interferon-Arten, die in einigen Fällen mit klinischer „Resistenz" gegen Interferon assoziiert wurden. Außerdem erzeugen Typ I-Interferone alle Fieber, Schüttelfrost, Unwohlsein, Myalgie, Kopfschmerzen, Müdigkeit und Gewichtsverlust, und bei bestimmten Fällen waren diese schwer genug, um die Behandlung unterbrechen zu müssen. Diese klinischen Beobachtungen machen die Herstellung der Typ I-Interferonmimetika sehr wichtig, die spezifischen die antiviralen und antiproliferativen Aktivitäten der Proteine aufweisen, aber frei sind von den meisten Stellen, die für unerwünschte Nebenwirkungen verantwortlich sind.
In der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass die schädlichen Nebenwirkungen der Interferone durch Konstruieren von künstlichen Peptiden oder rekombinanten Proteinen, die bioaktive Peptide tragen, vermieden werden kann. Solche Peptide wurden vorläufig durch sorgfältige Computer-Medellierungs-Analysen identifiziert. Die Peptide wurden synthetisiert und zufällig auf verschiedene Weisen kombiniert, was zu biologisch sehr aktiven, künstlichen Interferonmimetika führte. Insbesondere wurde überraschenderweise beobachtet, dass das künstliche Peptid LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF, eingesetzt in die N-Termini des de novo-Proteins Albebetin, antivirale Aktivität zeigte und fast so aktiv wie das menschliche Interferon-α₂ war. Das Protein offenbarte Cytotoxizität nur bei Konzentrationen, die die minimale aktive Konzentration um 6 Größenordnungen überschritten.
In den früheren Studien wurde gefunden, dass das synthetische Peptid LKEKKYSP (α-Peptoferon) die Proliferation der menschlichen lymphoblastoiden T-Zelllinie MT-4 bei Konzentrationen von 10^–9 – 10^–8 M unterdrückte; was mit der antiproliferativen Aktivität des rekombinanten menschlichen Interferon-α₂ vergleichbar ist (Zav'yalov V. et al., WO 9852594).
Die Sequenz LKEKKYSP (130437) des menschlichen Interferon-α₂ wurde in den N-terminalen Teil des de novo-Proteins Albebetin eingesetzt (Fedorov A. et al., 1992, J. Mol. Biol. 225, S. 927-931). Als Ergebnis wurde das de novo-Protein Albeferon mit der vor-entworfenen Struktur und Funktion hergestellt (Dolgikh D.A. et al., 1993, Biophysics 38, S. 59-66). Die Untersuchung seiner Struktur und Aktivität zeigte, dass Albeferon eine kompaktere und stabilere Struktur als Albebetin besaß (Aphsizheva I. et al., 1998, FEBS Lett. 425/1, S. 101-104), und effizient die Proliferation der menschlichen lymphoblastoiden T-Zelllinie MT-4 bei Konzentrationen von 10^–9 – 10^–8 M unterdrückte, was mit der antiproliferativen Aktivität des rekombinanten menschlichen Interferon-α₂ vergleichbar ist (Zav'yalov V. et al., WO9852594).
Es ist gut bekannt, dass alle Typ I-Interferone um den allgemeinen Rezeptor IFNAR konkurrieren und die allgemeinen Typ I-Interferonaktivitäten induzieren können. Daher ist es vernünftig, anzunehmen, dass bei dem Prozess der natürlichen Selektion die Änderungen in der Aminosäuresequenz der bindenden/antiviralen/antiproliferativen Stelle/n der Typ I-Interferone ausgewählt wurden, um nicht die biologischen Aktivitäten der Stelle aufzuheben. Folglich können alle natürlichen und rekombinanten Interferone vom Typ I sowie die Peptide, die ihrer/ihren bindenden/antiviralen/antiproliferativen Stelle(n) entsprechen, und rekombinante Proteine mit den Aminosäuresequenzen, die dieser/n Stelle/n entsprechen, spezifisch die antiviralen und antiproliferativen Aktivitäten aufweisen.
Zum Testen der Peptid- und rekombinanten Proteinmimetika, die spezifisch die bindende(n)/antivirale(n)/antiproliferative(n) Stelle(n) der Typ I-Interferone repräsentieren, verwendeten wir die klassischen antiviralen Testsysteme mit den L-41-Zellen von menschlicher mononukleärer Leukose und VERO-Zellen der Niere der Grünen Meerkatze sowie die klassischen antilymphoproliferativen Testsysteme mit menschlichen peripheren polymorphkernigen Zellen und der menschlichen T-lymphoblastoiden Zelllinie MT-4. Die Zellkulturbedingungen und die Bedingungen der humoralen Zellen im Blutkreislauf sind eng aufeinander bezogen. Tatsächlich werden die Bedingungen bei Zellkulturen, die allgemein zum Testen von möglichen Arzneistoffen verwendet werden, ähnlich wie beim Blutkreislauf strikt beibehalten, wie hinsichtlich Temperatur, pH-Wert, Puffer, Mineralien, Partialdrücken von CO₂ und O₂ usw. Andererseits kommen in diesem besonderen Fall die Zielzellen der Peptid- und rekombinanten Proteinmimetika, die spezifisch die bindende(n)/antivirale(n)/antiproliferative(n) Stelle(n) der Typ I-Interferone repräsentieren, die als Arzneistoffe verwendet werden, spezifisch in dem Blutkreislauf unter sehr gleichen Bedingungen zu den Zellkulturen vor. Demnach ist es sehr gut vorhersagbar, dass die Peptide oder rekombinanten Proteine der vorliegenden Erfindung als medizinische Arzneistoffe zu früher verwendeten Zwecken für Interferone als aktive Bestandteile bei Arzneistoffformulierungen verwendet werden können.
Die erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, dass zwei vollständig getrennte Peptidsequenzen, sehr entfernt voneinander in der Polypeptidkette, synergistisch arbeiten können, wenn sie miteinander geeignet durch einen Linker von mindestens 1 Aminosäurerest kombiniert werden. Obwohl die Linkersequenz vorzugsweise 2 Aminosäurereste hat, können auch längere Linker mit möglicherweise großen Seitenketten verwendet werden, wobei die Reste die freien Rotationen um den Linker begrenzen. Ebenso gut können andere Moleküle wie Kohlenhydrate als Linker verwendet werden, um die Peptide zusammenzubringen. In bestimmten Fällen ist es vorzuziehen, dass das aktive Peptid mit einem Protein fusioniert wird, um seine Stabilität, Löslichkeit, sein Targeting oder andere Eigenschaften zu steigern. Der entscheidende Unterschied der vorliegenden Erfindung über Chertkova, R.V. et al. in dem Journal „Biopolimeri I Klitina", Bd. 18, S. 161-163, ist spezifisch die künstliche Verbindung zwischen den zwei Peptidfragmenten des Interferons, die erlauben, dass das fusionierte Peptid die korrekte Konformation annimmt und folglich die antivirale Aktivität der Interferone maximal reproduziert. Nach der vorliegenden Erfindung können zwei Interferonfragmente durch eine künstliche Verbindung verbunden werden, normalerweise durch eine Peptidverbindung, um signifikant bioaktivere Peptide zu erhalten, als durch Chertkova R.V. et al. Beschrieben ist. Der zusätzliche Unterschied der vorliegenden Erfindung über Chertkova, R.V., et al. in den „Biopolimeri I Klitina", Bd. 18, S. 161-163 ist hierin die Demonstration der antiviralen Aktivität der chemisch synthetisierten Peptide LKEKKYSP, LKDRHDF und LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF, die genau beschreibbare Strukturen, frei von möglichen Beeinträchtigungen durch die Trägerproteine, bilden.
Die Peptide einer Länge von mindestens 10 Aminosäurereste können, entweder als solche oder mit geeigneten Peptiden oder Proteinen fusioniert, zur Behandlung von Krankheiten wie maligner B-Zell- und chronischer myeloischer Leukämien, Non-Hodgkin-lymphom geringen Grades und kutanen T-Zell-Lymphomen, Karzinoiden, Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und des Halses, primären, klarzelligem Nierenkarzinom, multiplen und malignen Melanomen, Kaposi-Sarkom und viralen infektiösen Krankheiten wie chronischer aktiver Hepatitis B und C, Krankheiten, bei denen bekannt ist, dass Interferone zum Einsatz kommen.
Während die vorliegende Erfindung konkrete Strukturen von bioaktiven Peptiden mit für Anwendungen als Arzneistoffe brauchbaren Eigenschaften beschreibt, ist es zu verstehen, dass solche Peptide oder Peptide mit Trägermolekülen zusätzlich durch chemische oder physikalische Mittel modifiziert werden können. Solche Modifikationen können normalerweise den Zweck von verlängerter Freisetzung, erhöhter Bioverfügbarkeit oder Binden an eine spezifische Zielzelle oder Membran haben.
Die Erfindung wird weiter nachstehend durch nicht begrenzende Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1.
Molecular Modeling. Molekülmodelle der funktionellen Epitopstruktur des menschlichen Interferon-α₂ und der vorausgesetzten biologisch aktiven Konformation des nachahmenden Peptids LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF wurden unter Verwendung des Programms Chem-X (Chemical Design Ltd., GB) und der Atomkoordinaten der entsprechenden Aminosäurereste in dem menschlichen Interferon-α₂-Molekül in Lösung (Klaus W. et al., 1997, J. Mol. Biol. 274, S. 661-675) erhalten (1).
Synthese der Peptide. Die Peptide LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF, LKEKKYSP und LKDRHDF wurden unter Verwendung der Pentafluorphenylether der N-ausgetauschten Aminosäuren durch die Festphasenmethode-(430-A Synthesegerät, Applied Biosystems, USA) synthetisiert. Die Rohprodukte wurden durch HPLC auf einem Chromatographen (Gilson, Frankreich) unter Verwendung einer Zorbax-ODS-Säule (4 × 150 mm, 5 μm, DuPont USA) unter Verwendung des linearen Gradienten von Wasser-Acetonitril (95%) in 0.2% Trichloressigsäure (10-25%, 20 min) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgereinigt. Gemäß den optischen Daten bei 220 nm wurde gefunden, dass der Gehalt der Hauptsubstanz bei 99% liegt. Das Molekulargewicht der Peptide wurde durch massenspektrometrische Analyse unter Verwendung eines Vision 2000-Spektrometers („Thermo Bioanalysis", GB) geschätzt. Die Peptidstruktur wurde durch die Aminosäureanalyse an einem D500-Aminosäureanalysator (Durrum, USA) bestätigt.
Rekombinante DNA-Konstruktionen zur Expression der A/beferon-I- und A/beferon-II-Proteingene. Das Gen des de novo-Proteins Albebetin wurde früher hergestellt (Fedorov A. et al., 1992, J. Mol. Biol. 225, S. 927-931). Dann wurde das funktionelle de novo-Protein Albeferon (Dolgikh D.A. et al., 1993, Biophysics 38, S. 59-66) durch Einbringen eines Fragments (130-LKEKKYSP-137) aus menschlichem Interferon-α₂ in den N-Terminus von Albebetin durch die Polymerasekettenreaktion erhalten. Die Gene dieser Proteine wurden in den Plasmidexpressionsvektor pMal-c (New England BioLabs, USA) in die Restriktionsstellen BamHI und HindIII (Albebetin) und EcoRI und HindIII (Albeferon) eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit manipulierten wir zwei neue biologisch aktive de novo-Proteine auf der Grundlage von Albebetin und Albeferon unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit synthetisierten Oligonucleotidprimern, die den aktiven Peptidfragmenten (2) entsprechen. Das neue Protein Albeferon-I wurde durch Einbringen eines aktiven Fragments (30-LKDRHDF-36) aus menschlichem Interferon-α₂ in den C-Terminus von Albeferon erhalten. Das Schema der Polymerasekettenreaktion wird in 3A gezeigt. Der Plasmidvektor pMal-c, der das Albeferon-Gen trägt, wurde als Matrize verwendet; der direkte Primer Idp beinhaltete die Restriktionsstelle BamHI, der reverse Primer Irp beinhaltete HindIII und die codierende Sequenz des aktiven Fragments. Um ein Gen des anderen Proteins Albeferon-II zu konstruieren, das beide Fragmente (die durch zwei Serinreste verbunden sind) in dem N-terminalen Teil von Albeferon beinhaltet, wurden zwei direkte überlappende Primer (IIdp-1 und IIdp-2) (2) synthetisiert. Der Primer IIdp-1 beinhaltete die Restriktionsstellen BamI und die Sequenzen, die die Spaltungsstelle der Protease „Faktor Xa" und das Fragment LKEKKYSP-S-S codieren; der Primer IIdp-2 beinhaltete einen Teil der Sequenz von IIdp-1 und die Sequenz, die dem zweiten Fragments LKDRHDF entspricht. Der sequenzierende Primer M13/pUC (New England Biolabs, CIIIA) wurde als reverser Primer verwendet, und der Plasmidvektor pMal-c, der das Albebetin-Gen trägt, wurde als Matrize in der Pomymerasekettenreaktion verwendet (3B). Die Produkte der Polymerasekettenreaktion wurden mit den Endonucleasen BamHI und HindIII behandelt und in den Plasmidvektor pMal-c durch diese Restriktionsstellen cloniert.
Der pMal-c-Vektor erlaubt die effiziente Expression von Zielproteinen als Fusionsproteine mit dem Maltose bindenden Protein gefolgt von ihren Verdau durch den Proteasefaktor Xa. Jedoch war die Endausbeute der de novo-Ziel-Proteine in diesem System wegen einer kleinen Fraktion von de novo-Proteinen (~9 kDa) in den Fusionsproteinen (~54 kDa) nicht ausreichend. Daher entschieden wir, ein anderes Fusionssystem auf Grundlage des Plasmidvektors pET-32 LIC (Novagen, USA) zu verwenden. Dieses System beinhaltet ein relativ kleines Thioredoxin-Protein aus Escherichia coli und gibt eine höhere Ausbeute der Ziele und ein günstiges Schema ihrer Isolierung und Aufreinigung. Früher wurde dieser Vektor für die effiziente Biosynthese von Albebetin, das ein Fragment des Differenzierungsfaktors HLDF trägt, verwendet (Chertkova R.V. et al., 2002, Bioorgan. Chemistry, Moskau, 28, im Druck). Der Vektor enthält das Thioredoxinproteingen unter Kontrolle eines starken Promotors des Bakteriophagen T7 und beinhaltet den 6His-Marker für die effiziente Isolierung und Aufreinigung des Hybridproteins unter Verwendung der Affinitätschromatographie über immobilisiertes Metall an Nickelnitrilotriacetat-Agarose. Das Expressionsniveau der Fusionsproteine in dieser Konstruktion ist ausreichend hoch und erreicht bis zu 30-40% eines gesamten Zellproteins (Chertkova R.V. et al., 2002, Bioorgan. Chemistry, Moskau, 28, im Druck).
Um die de novo-Proteingene in das Plasmid pET-32 LIC zu clonieren, wurde die Restriktionsstelle BgIII in beide Gene durch die Polymerasekettenreaktion eingebracht. Der direkte Primer dp-pET, der BgIII beinhaltet, wurde synthetisiert; der sequenzierende Primer M13/pUC wurde als ein reverser Primer verwendet, und das Plasmid pMal-c mit dem jeweiligen Gen wurde als eine Matrize verwendet. Die Produkte der Polymerasekettenreaktion wurden mit den Endonucleasen BgIII und HindIII behandelt und in pET-32 LIC unter Verwendung der voranstehenden Stellen (3C) cloniert. Die erhaltenen Plasmidkonstrukte wurden durch Sequenzierung bestätigt und für die Transformation von E. coli verwendet. Demnach wurden zwei neue Proteine Albeferon-I und Albeferon-II mit dem Peptidfragment LKDRHDF (30-36) aus einer Consensus-Sequenz des menschlichen Interferon-α₂ erhalten. Ihre vermuteten Tertiärstrukturen werden in den 4B und 4C gezeigt.
Die Expression der rekombinanten Gene. Die de novo-Proteine Albebetin, Albeferon, Albeferon-I und Albeferon-II wurden als Fusionsproteine mit Thioredoxin in dem E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS exprimiert, wie früher für ein Albebetin, das ein Fragment des Differenzierungsfaktors HLDF beinhaltet, beschrieben wurde (Chertkova R.V. et al., 2002, Bioorgan. Chemistry, Moskau, 28, im Druck). Die maximale Ausbeute der Fusionsproteine (bis zu 30-40% von einem gesamten Zellprotein gemäß der SDS-PAGE) wurde nach einem 8-9 h-Wachstum in TB-Brühe unter Verwendung einer 0.6-1.0 mM Konzentration des Induktors β-D-Thiogalactopyranosid und 37°C erreicht.
Isolierung und Aufreinigung der Proteine. Die als Fusionsproteine mit Thioredoxin exprimierten de novo-Proteine wurden unter Verwendung der Ionenaustausch-Chromatographie und dann Affinitätschromatographie auf Nickelnitrilotriacetat-Agaraose aufgereinigt. Die erhaltenen Fusionsproteine wurden mit der hoch spezifischen Protease „Faktor Xa" verdaut und die Reaktionsmischung wurde auf einer Säule mit Nickelnitrilotriacetat-Agarose angewendet (Chertkova R.V. et al., 2002, Bioorgan. Chemistry, Moskau, 28, im Druck). Die letzte Aufreinigung auf der Anionen-Austauschsäule mit Mono Q HR (Pharmacia Biotech) führte zu > 90 Reinheit gemäß SDS-PAGE. Die Molekulargewichte der erhaltenen Proteine, die durch Massenspektrometerie bestimmt wurden, entsprachen jenen, die theoretisch berechnet wurden, und waren gleich 9.3 und 9.8 kDa für Albeferon-I bzw. Albeferon- II. Die Homogenität der erhaltenen Präparationen wurde durch SDS-PAGE-Analyse und auch durch die N-terminale Aminosäuresequenzierung bestätigt. Neun N-terminale Aminosäurereste Met-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Tyr-Ser-Pro wurden für beide Proteine bestätigt. Die ausgearbeitete Prozedur der Isolierung und Aufreinigung von de novo-Proteinen ergab bis zu 12 mg/l der Zellsuspenison.
CD-Spektren der de novo-Proteine. Die Circulardichroismus-Spektren von Albeferon, Albeferon-I und Albeferon-II im weiten UV-Bereich werden in 5 gezeigt. Aus diesen Daten kann jemand schlussfolgern, dass die Proteine ähnliche Spektren besitzen, typisch für Proteine mit beträchtlich regelmäßiger Sekundärstruktur. Die Analyse der Spektren durch das Verfahren von Provencher und Glocker (Provencher S. und Glocker J., 1981, Biochemistry 20, S. 33) zeigte, dass Albeferon-I und Albeferon-II 30 bzw. 23% α- und 29 bzw. 38% β-Struktur enthalten, und Albeferon 27% α- und 35% β-Struktur hat (Aphsizheva I. et al., 1998, FEBS Lett. 425/1, S. 101-104) (6). Die erhaltenen Daten sind in guter Übereinstimmung mit den experimentellen Daten (29% α- und 40% β-Struktur) und theoretischer Berechnung (30% α- und 36% β-Struktur) für das ursprüngliche Protein Albebetin (Dolgikh D. et al., 1996, Protein Engineenring 9, S. 195-201). Demnach beeinflusst das Einbringen eines zweiten menschlichen Interferon-α-Fragments in das Albeferon nicht wesentlich seine Sekundärsturktur.
Antivirale und Cytotoxizitätseigenschaften der erhaltenen Proteine. Das Testen der antiviralen Aktivität der Proteine wurde in vitro durch Überwachen der Fähigkeit der Präparation, die cytopathische Wirkung des Testvirus zu unterdrücken, ausgeführt (Ershov F., 1996, Interferon system: norm and pathology, Moskau, Medicine). Zwei Zelllinien wurden in den Experimenten verwendet: L-41-Zellen von menschlicher mononukleärer Leukose und VERO-Zellen der Niere der Grünen Meerkatze. Das Virus der Maus-Encephalomyocarditis, das einen kurzen Zyklus der Reproduktion und eine hohe Empfindlichkeit auf die Wirkung von Interferonen besitzt, wurde als Test-Virus gewählt. Das rekombinante menschliche Interferon-α₂ und das rekombinante menschliche Interferon-γ wurden als Positivkontrolle der antiviralen Aktivität gewählt. Die Ergebnisse des Testens werden in 7 gezeigt. Beide de novo-Proteine besitzen antivirale Aktivität. In dem Fall von Albeferon-II (dem Protein, das die künstliche Sequenz LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF in dem N-terminalen Teil des Moleküls beinhaltet, vergl. 4C) ist die antivirale Aktivität nur um eine Größenordnung kleiner als die des menschlichen Interferon-α₂ und vergleichbar mit der des menschlichen Interferon-γ. Die Aktivität der Präparation des rekombinanten menschlichen Interferon-α₂, Albeferon, Albeferon-I und Albeferon-II in internationalen Einheiten wurde unter Verwendung des menschlichen Lekukocyten-Interferon-α₂ als Interferonstandard berechnet (8). Es sollte beachtet werden, dass das anfängliche Protein Albeferon auch schwache antivirale Eigenschaften besaß.
Cytotoxische Dosen (CTD₅₀) der Proteine wurden als ihre Konzentrationen bestimmt, die 50% Zellzerstörung nach 24 h des Kontakts mit Zellen bei Abwesenheit des Virus verursachen (Chidjov N. et al., 1988, Basics of experimental chemotherapy of viral infections, Riga, Zinatne). Es wurde gezeigt, dass alle getesteten de novo-Proteine cytotoxische Eigenschaften nur bei vergleichbar hohen Konzentrationen offenbarten, die 8 × 10^–5 M überschreiten (9). Insbesondere wurde eine Cytotoxizität von Albeferon-II bei einer Konzentration beobachtet, die um das ~10⁶-fache höher ist als diese, die für die antivirale Wirkung dieses Proteins notwendig ist.
Demnach stellten wir her und erhielten wir zwei de novo-Proteine, von denen eins (Albeferon-II) praktisch vollständig die antiviralen Eigenschaften des menschlichen Interferon-α₂ reproduziert. Das Protein Albeferon-II, das die künstliche Sequenz LKEKKYSP-Scr-Ser-LKDRHDF in seinem N-terminalen Teil beinhaltet, besaß eine um zwei Größenordnungen höhere antivirale Aktivität als Albeferon-I, bei dem die Sequenzen LKEKKYSP und LKDRHDF an den entgegengesetzten Enden des Moleküls sind. Man kann annehmen, dass die entgegengesetzten Positionen der Sequenzen zu einiger sterischer oder/und kinetischer Begrenzung für ihre Vereinigung in einem einzelnen antiviralen Zentrum führen können. Diese Annahme wird durch einen experimentellen Beweis hinsichtlich des Einflusses der Cys29-Cys139-Disulfidbindung auf die biologische Aktivität der Typ I-Interferone bestätigt. Diese Bindung, die den N-terminalen Teil der Schleife AB und den N- terminalen Teil der Helix E in allen Interferonen-α verbindet, ist beim Maus-Interferon-β abwesend. Das mutierte Maus-Interferon-β, bei dem die Disulfidbindung gentechnisch eingebracht wurde, besitzt ~10-mal höhere antivirale Aktivität als das Wildtyp-Protein (Day C. et al., 1992, J. Interferon Res. 12, S. 139-143). Bei Albeferon-II wurde diese Disulfidbindung durch zwei Serinreste, die über eine Peptidbindung verbunden sind, ersetzt. Die Röntgenstrukturanalyse zeigte, dass in dem Kristall des menschlichen Interferon-α₂ die Oδ1- und Oδ2-Seitenkettenatome von Asp32 zwischen den Nζ-Gruppen von Lys31 und Lys133 wie in einem Sandwich sind (Radhakrishnan R. et al., 1996, Structure 4, S. 1453-1463). Diese Wechselwirkungen könnten die biologisch aktive Konformation der künstlichen Sequenz LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF von Albeferon-II stabilisieren, wenn der Komplex mit IFNAR2 gebildet wird.
Die erhaltenen Daten zeigen, dass beide menschlichen Interferon-α₂-Fragmente LKEKKYSP (130-137) und LKDRHDF (30-36) zur Bildung des antiviralen Zentrums beitragen, jedoch wird der Beitrag des Fragments LKDRHDF beherrscht. Diese Schlussfolgerung stimmt vollständig mit den Daten der Mutagenese überein (Piehler J. und Schreiber G., 1999, J. Mol. Biol. 294, S. 223-237).
Beispiel 2.
Antivirale Eigenschaften der synthetischen linearen Peptide. Das Testen der antiviralen Aktivität der synthetischen linearen Peptide wurde in vitro durch Überwachen der Fähigkeit der Präparation, die cytopathische Wirkung des Test-Virus zu unterdrücken, ausgeführt (Ershov F., 1996, Interferon system: norm and pathology, Moskau, medicine). Zwei Zelllinien wurden in den Experimenten verwendet: L-41-Zellen der menschlichen mononukleären Leukose und VERO-Zellen der Niere der Grünen Meerkatze. Das Virus der Maus-Encephalomyocarditis, das kurze Zyklen der Reproduktion und eine hohe Empfindlichkeit gegenüber der Wirkung von Interferonen besitzt, wurde als Test-Virus gewählt. Das menschliche rekombinante menschliche Interferon-α₂ wurde als Positivkontrolle der antiviralen Aktivität gewählt. Die Ergebnisse des Testens werden in 10 gezeigt. Die antivirale Aktivität des Peptids LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF ist nur um eine Größenordnung kleiner als die des menschlichen Interferon-α₂.
Demnach reproduziert das lineare synthetische Peptid LKEKKYSP-Ser-Ser-LKDRHDF praktisch vollständig die antiviralen Eigenschaften des menschlichen Interferon-α₂.

Claims

Fusionspeptidsequenz, zusammengesetzt aus zwei über einen Linker aus zwei Aminosäureresten miteinander verbundenen Interferonpeptiden, wobei die Fusionspeptidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem in der Sequenz der obersten horizontalen Zeile der nachstehenden Tabelle beschriebenen Peptid und Peptiden, die mindestens 10 Aminosäurereste enthalten, welche identisch sind mit der Sequenz der obersten horizontalen Zeile, wobei jeder Aminosäurerest der Sequenz der obersten horizontalen Zeile mit jedem der Aminosäurereste in der darunter gezeigten vertikalen Reihe ersetzt werden kann:
Fusionpeptidsequenz nach Anspruch 1, wobei die Linkersequenz Ser-Ser ist.
Arzneistoffzusammensetzung, umfassend eine oder mehrere der Fusionspeptidsequenzen nach Anspruch 1.
Rekombinantes Protein, umfassend eine oder mehrere der Peptidsequenzen nach Anspruch 1, fusioniert mit einem rekombinanten Trägerprotein.
Rekombinantes Protein nach Anspruch 4, wobei das Trägerprotein Albebetin, Serumalbumin oder Immunglobulin G ist.
Arzneistoffzusammensetzung, umfassend eines oder mehrere der rekombinanten Proteine nach Anspruch 4.