DE60226244T2 - Il-4 rezeptor sequenzvarianten, die mit typ i diabetes assoziiert sind - Google Patents

Il-4 rezeptor sequenzvarianten, die mit typ i diabetes assoziiert sind Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete der Immunologie und der Molekularbiologie. Insbesondere betrifft sie Verfahren und Reagenzien zum Nachweisen der Nukleotidsequenz-Variabilität im IL4-Rezeptor-Locus, der mit Diabetes Typ 1 assoziiert ist.
  • BESCHREIBUNG DES DAZU GEHÖRIGEN FACHGEBIETES
  • Die Immunreaktion auf ein Antigen wird durch eine selektive Differenzierung der CD4+-T-Helfer-Vorläuferzellen (Th0) zu T-Helfer-Effektorzellen vom Typ 1 (Th1) oder T-Helfer-Effektorzellen vom Typ 2 (Th2) mit funktionell verschiedenen Mustern der Cytokin-(auch als Lymphokin beschrieben)-Sekretion vermittelt. TH1-Zellen sezernieren bei Aktivierung Interleukin 2 (IL-2), IL-12, Tumornekrosefaktor (TNF), Lymphotoxin (LT) und Interferon Gamma (IFN-g) und sind hauptsächlich verantwortlich für die zellvermittelte Immunität, wie die Hypersensitivität vom verzögerten Typ. Th2-Zellen sezernieren bei Aktivierung IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 und IL-13 und sind hauptsächlich verantwortlich für extrazelluläre Verteidigungsmechanismen. Die Rolle von Th1- und Th2-Zellen ist zusammenfassend beschrieben in Peltz, 1991, Immunological Reviews 123; 23–35, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • IL-4 und IL-13 spielen eine zentrale Rolle bei IgE-abhängigen Entzündungsreaktionen. IL-4 induziert die IgE-Antikörper-Produktion durch B-Zellen und liefert zudem eine regulatorische Funktion bei der Differenzierung von Th0- zu Th1- oder Th2-Effektorzellen sowohl durch Förderung der Differenzierung zu Th2-Zellen als auch Hemmung der Differenzierung zu Th1-Zellen. IL-13 induziert auch die IgE-Antikörperproduktion durch B-Zellen.
  • IL-4 und IL-13 arbeiten über den IL-4-Rezeptor (IL-4R), der sich auf B- und T-Zellen befindet, und über IL13R, der sich auf B-Zellen befindet. Der Human- IL4-Rezeptor (IL4R) ist ein Heterodimer, das die IL4Rα-Kette und γc-Kette umfasst. Die α-Kette des IL4-Rezeptors dient auch als α-Kette für den IL13-Rezeptor. IL4 bindet an IL4R und IL13R über die IL4Rα-Kette und kann B- und T-Zellen aktivieren, wohingegen IL13 nur an IL13R über die IL13Rα1-Kette bindet und nur T-Zellen aktiviert.
  • Reimsneider et al., (Pediatric Research, 2000, Bd. 47(2), S. 246–249) und Karremitsu et al., (Arthritis and Rheumatism, 1999, Bd. 42(6), S. 1298–1299) untersuchen verschiedene Gen-Polymorphismen im Interleukin-4-Rezeptorgen und schließen, dass dieses Gen nicht mit Diabetes Typ 1 verbunden oder assoziiert ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen neu entdeckten Zusammenhang zwischen Sequenzvarianten in dem in der Tabelle 2 gezeigten IL-4-Rezeptor (IL4R) und Diabetes Typ 1. Die Identifikation von der oder den vorhandenen Sequenzvariante(n) bietet Information, die bei der Charakterisierung von Individuen gemäß ihrem Risiko für Diabetes Typ 1 hilft.
  • Mehrere Einzelnukleotid-Polymorphismen in dem IL4R-Gen wurden identifiziert und sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben. Es sind zwar mehrere Millionen Sequenzvarianten aus den SNPs in der Tabelle 2 möglich, jedoch wurden nicht alle möglichen Varianten beobachtet.
  • Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird der Genotyp von IL4R bestimmt, so dass man Information erhält, die sich zur Bestimmung der Gefahr eines Individuums für bestimmte TH1 vermittelte Krankheiten, insbesondere Diabetes Typ 1, eignet. Individuen, bei denen mindestens ein Allel statistisch mit Diabetes Typ 1 assoziiert ist, besitzen einen Faktor, der zur Gefährdung durch Diabetes Typ 1 beiträgt. Die statistische Assoziation von IL4R-Allelen (Sequenzvarianten) ist in den Beispielen gezeigt.
  • Da IL4R nur eine Komponente des komplexen Systems von Genen ist, die an einer Immunreaktion beteiligt sind, wird erwartet, dass die Wirkung des IL4R-Locus klein ist. Andere Faktoren, wie der HLA-Genotyp eines Individuums, können dominierende Wirkungen aufweisen, die in einigen Fällen die Wirkung des IL4R-Genotyps überdecken können. Bestimmte HLA-Genotypen haben beispielsweise bekanntlich eine größere Wirkung auf die Wahrscheinlichkeit für Diabetes Typ 1 (siehe Noble et al., 1996, Am. J. Hum. Genet. 59: 1134–1148, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist). Der IL4R-Genotyp ist wahrscheinlich informativer als Indikator der Prädisposition hinsichtlich Diabetes Typ 1 unter Individuen, deren HLA-Genotypen weder eine gesteigerte noch eine gesenkte Gefährdung verleihen. Da sich die Allelfrequenzen an anderen Loci, die für Immunsystem-verwandte Krankheiten relevant sind, zwischen Populationen unterscheiden, und somit die Populationen verschiedene Risiken für Immunsystem-verwandte Krankheiten aufweisen, wird erwartet, dass die Wirkung des IL4R-Genotyps in einigen Populationen verschieden hoch ist. Der Beitrag des IL4R-Genotyps kann selbst relativ klein sein, jedoch liefert die Genotypbestimmung am IL4R-Locus Information, die sich trotzdem für eine Charakterisierung der Prädisposition eines Individuums für Diabetes Typ 1 eignet. Die IL4R-Genotyp-Information eignet sich besonders in Kombination mit der Genotypinformation anderer Loci.
  • Die vorliegende Erfindung liefert bevorzugte Verfahren, Reagenzien und Kits zur IL4R-Genotypbestimmung. Der Genotyp kann mit einem beliebigen Verfahren bestimmt werden, das sich zur Identifikation von Nukleotidvariation eignet, die aus einer einzigen polymorphen Nukleotidstelle besteht. Das jeweils verwendete Verfahren ist kein entscheidender Aspekt der Erfindung. Nachstehend ist eine Reihe geeigneter Verfahren beschrieben.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Genotypbestimmung mit Oligonukleotid-Sonden, die für variante Sequenzen spezifisch sind. Ein Bereich des IL4R-Gens, das den Sonden-Hybridisierungsbereich umfasst, wird vorzugsweise vor oder gleichzeitig mit der Sondenhybridisierung amplifiziert. Tests auf Sondenbasis zum Nachweisen von Sequenzvarianten sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die Genotypbestimmung erfolgt alternativ mit allelspezifischen Amplifikations- oder Extensionsreaktionen, wobei allelspezifische Primer verwendet werden, die nur die Primerextension unterstützen, wenn die angezielte variante Sequenz zugegen ist. Ein allelspezifischer Primer hybridisiert in der Regel an das IL4R-Gen, so dass das 3'-terminale Nukleotid mit einer polymorphen Position ausgerichtet wird. Allelspezifische Amplifikationsreaktionen und allelspezifische Extensionsreaktionen sind im Stand der Technik bekannt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
  • 1 zeigt ein Schema des molekularen Haplotypbestimmungs-Verfahrens.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER TABELLEN
  • Tabelle 1 zeigt die Nukleotidsequenz des codierenden Bereichs eines IL4R (SEQ ID NR: 2);
  • Tabelle 2 zeigt die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten IL4R-SNPs;
  • Tabelle 3 zeigt Sonden, die zur Identifikation von IL4R-Polymorphismen verwendet werden (SEQ ID NR: 3 bis 19);
  • Tabelle 4 zeigt mit dem Computer errechnete Haplotyp-Häufigkeiten, verglichen zwischen Philippinischen Kontrollen und Diabetikern (SEQ ID NR: 20 bis 24);
  • Tabelle 5 zeigt Genotypen betroffener und nichtbetroffener Individuen;
  • Tabelle 6 zeigt die erfassten Einzelnukleotidpolymorphismen;
  • Tabelle 7 zeigt Amplikon-Primer und Längen (SEQ ID NR: 25 bis 36);
  • Tabelle 8 zeigt Hybridisierungssonden und Titer (SEQ ID NR: 37 bis 53);
  • Tabelle 9 zeigt die Allelhäufigkeit des Wildtyp-Allels bei HBDI-Gründern;
  • Tabelle 10 zeigt D'- und Δ-Werte für Paare von IL4R SNPs;
  • Tabelle 11A zeigt Ergebnisse für die Einzellocus-TDT-Analyse;
  • Tabelle 11B zeigt Ergebnisse für die Einzellocus-TDT-Analyse;
  • Tabelle 12 zeigt allelspezifische PCR-Primer (SEQ ID NR: 54 bis 62);
  • Tabelle 13 zeigt die IBD-Verteilungen für IL4R-Haplotypen;
  • Tabelle 14A zeigt Haplotyp-Transmissionen;
  • Tabelle 14B zeigt Haplotyp-Transmissionen;
  • Tabelle 14C zeigt Haplotyp-Transmissionen;
  • Tabelle 15A zeigt SNP durch SNP-Alleltransmissionen;
  • Tabelle 15B zeigt SNP durch SNP-Alleltransmissionen;
  • Tabelle 16A zeigt eine TDT-Analyse;
  • Tabelle 16B zeigt eine TDT-Analyse;
  • Tabelle 16C zeigt eine TDT-Analyse;
  • Tabelle 17A zeigt eine TDT-Analyse;
  • Tabelle 17B zeigt eine TDT-Analyse;
  • Tabelle 18 zeigt Allelhäufigkeiten bei Philippino-Kontrollen und Diabetikern;
  • Tabelle 19 zeigt geschätzte Haplotyphäufigkeiten und
  • Tabelle 20 zeigt die beobachteten Haplotyphäufigkeiten.
  • EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Zur Unterstützung des Verständnisses der Erfindung werden einige Begriffe definiert.
  • Der Begriff "IL4R-Gen" betrifft eine genomische Nukleinsäuresequenz, die das Interleukin 4-Rezeptorprotein codiert. Die Nukleotidsequenz eines Gens, wie hier verwendet, umfasst codierende Bereiche, die als Exons bezeichnet werden, dazwischen liegende nicht codierende Bereiche, die als Introns bezeichnet werden und stromaufwärts und stromabwärts gelegene Bereiche. Stromaufwärts und stromabwärts gelegene Bereich, können Bereiche des Gens umfassen, die transkribiert werden, aber keinen Teil eines Introns oder Exons ausmachen, oder Bereiche des Gens, die beispielsweise Bindungsstellen für Faktoren umfassen, die die Gentranskription modulieren. Die Gensequenz einer Human-mRNA für IL4R wird unter der Genbank-Zugriffsnummer X52425 (SEQ ID NR: 1) bereitgestellt. Der codierende Bereich ist als SEQ ID NR: 2 bereitgestellt.
  • Der Begriff "Allel", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Sequenzvariante des Gens. Allele werden in Bezug auf ein oder mehrere polymorphe Positionen identifiziert, wobei der Rest der Gensequenz unspezifiziert bleibt. Ein IL4R kann beispielsweise durch das Nukleotid definiert werden, das an einem einzelnen SNP vorhanden ist, oder durch die Nukleotide, die an mehreren SNPs zugegen sind. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird ein IL4R durch die Genotypen von 6, 7 oder 8 IL4R SNPs definiert. Beispiele für solche IL4 SNPs sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben.
  • Der Einfachheit halber wird das Allel mit einer höheren oder der höchsten Häufigkeit in der Population als Wildtyp-Allel bezeichnet; weniger häufige Allel(e) werden als Mutanten-Allel(e) bezeichnet. Diese Bezeichnung eines Allels als Mutante soll lediglich das Allel von dem Wildtyp-Allel unterscheiden und bedeutet keine Änderung oder Verlust der Funktion.
  • Der Begriff "prädisponierendes Allel" bezeichnet ein Allel, das positiv mit einer Autoimmunkrankheit wie Diabetes Typ 1 assoziiert ist. Die Anwesenheit eines prädisponierenden Allels in einem Individuum kann anzeigen, dass das Individuum einer erhöhten Gefährdung für die Krankheit relativ zu einem Individuum ohne das Allel unterliegt.
  • Der Begriff "Schutzallel" betrifft ein Allel, das negativ mit einer Autoimmunkrankheit wie Diabetes Typ 1 einhergeht. Die Anwesenheit eines Schutzallels in einem Individuum kann anzeigen, dass das Individuum einer verminderten Gefahr für die Krankheit in Bezug auf ein Individuum ohne das Allel unterliegt.
  • Die Begriffe "polymorph" und "Polymorphismus" wie hier verwendet, betreffen den Zustand, in dem zwei oder mehrere Varianten einer spezifischen genomischen Sequenz oder der codierten Aminosäuresequenz in einer Population aufgefunden werden können. Die Begriffe betreffen entweder die Nukleinsäuresequenz oder die codierte Aminosäuresequenz; die Verwendung geht aus dem Zusammenhang hervor. Der polymorphe Bereich oder die polymorphe Stelle betrifft einen Bereich der Nukleinsäure, wo der Nukleotid-Unterschied, der die Varianten unterscheidet, auftritt, oder für Aminosäuresequenzen, einen Bereich der Aminosäure, wo der Aminosäureunterschied, der die Proteinvarianten unterscheidet, auftritt. Wie hier verwendet betrifft "Einzelnukleotidpolymorphismus" oder SNP eine polymorphe Stelle, die aus einer einzelnen Nukleotidposition besteht.
  • Der Begriff "Genotyp" betrifft eine Beschreibung der Allele eines oder mehrerer Gene, die sich in einem Individuum oder einer Probe befinden. Wie hier verwendet wird nicht zwischen dem Genotyp eines Individuums und dem Genotyp einer Probe unterschieden, die aus dem Individuum stammt. In der Regel wird ein Genotyp zwar aus Proben diploider Zellen bestimmt, jedoch lässt sich der Genotyp auch aus einer Probe haploider Zellen, wie einer Spermazelle, bestimmen.
  • Der Haplotyp betrifft eine Beschreibung der Varianten eines Gens oder von Genen, die sich auf einem einzelnen Chromosom befindet, d. h. dem Haplotyp eines einzelnen Chromosoms.
  • Der Begriff "Zielbereich" betrifft einen Bereich einer Nukleinsäure, der analysiert werden soll und der gewöhnlich einen polymorphen Bereich umfasst.
  • Einzelne Aminosäuren in einer Sequenz sind hier als AN oder NA bezeichnet, wobei A die Aminosäure in der Sequenz ist und N die Position in der Sequenz ist. In dem Fall, dass die Position N polymorph ist, ist es geeignet, die häufigere Variante als A1N und die weniger häufige als NA2 zu bezeichnen. Alternativ wird die polymorphe Stelle N als A1NA2 dargestellt, wobei A1 die Aminosäure in der häufigeren Variante ist, und A2 die Aminosäure in der weniger häufigen Variante ist. Es werden entweder Einbuchstaben- oder Dreibuchstaben-Codes zur Bezeichnung der Aminosäuren verwendet (Lehninger, BioChemistry, 2. Auflage, 1975, Worth Publishers, Inc. New York, NY: S. 73–75, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist). I50V ist beispielsweise ein Einzel-Aminosäure-Polymorphismus an der Aminosäureposition 50, wobei Isoleucin in der häufigeren Proteinvariante in der Population vorkommt, und Valin in der weniger häufigen Variante vorkommt. Die Aminosäurepositionen sind auf der Basis der Sequenz des reifen IL4R-Proteins nummeriert, wie nachstehend beschrieben.
  • Die Darstellung von Nukleotiden und Einzelnukleotidaustauschen in DNA-Sequenzen sind analog. A398G veranschaulicht einen Einzelnukleotid-Polymorphismus an Nukleotidposition 398, wobei Adenin im häufigeren (Wildtyp-)Allel in der Population zugegen ist, und Guanin im weniger häufigen (Mutanten-)Allel zugegen ist. Die Nukleotidpositionen sind auf der Basis der IL4R-cDNA-Sequenz nummeriert, die als SEQ ID NR: 2, siehe unten, bereitgestellt ist. Es ist klar, dass der komplementäre Strang jedes Allels in einer doppelsträngigen Form die komplementäre Base an der polymorphen Position enthält.
  • Herkömmliche Techniken der Molekularbiologie und Nukleinsäurechemie, die im Bereich des Fachkönnens liegen, sind vollständig in der Literatur beschrieben. Siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames und S. J. Higgins, Hrsg. 1984); die Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); und die Reihe Current Protocols in Human Genetics (Dracopoli et al. Hrsg., 1984 mit vierteljährlichen Aktualisierungen, John Wiley & Sons, Inc.); die jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen sind. Sämtliche hier erwähnten Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, siehe oben und unten, sind jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen.
  • VERFAHREN DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung einer Gefährdung eines Individuums durch eine Autoimmunkrankheit oder Beschwerde oder eine beliebige Th-1-vermittelte Krankheit bereit. Solche Krankheiten oder Beschwerden umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Diabetes mellitus Typ 1 (insulinabhängiger Diabetes mellitus oder IDDM), entzündliche Darmkrankheiten, systemischer Lupus erythemadodes, Psoriasis, Sclerodermie, Basedow'sche Krankheit, systemische Sklerose, Myasthenia gravis, Gullian-Barre Syndrome und Hashimoto-Thyroiditis. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden die Verfahren verwendet, um die Gefährdung eines Individuums durch IDDM zu bestimmen. Das Individuum ist vorzugsweise ein Mensch.
  • IL4R-mRNA-Sequenz
  • Die Nukleotidsequenz des codierenden Bereichs einer IL4R mRNA ist erhältlich von GenBank unter der Zugriffsnummer X52424, Nukleotide 176–2653, und bereitgestellt als SEQ ID NR: 2, die in der nachstehenden Tabelle 1 in 5'→3'-Orientierung gezeigt ist. Obschon in der Tabelle 1 nur ein Strang der Nukleinsäure gezeigt ist, erkennt der Fachmann, dass SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 Bereiche doppelsträngiger genomischer Nukleinsäure identifizieren, und dass die Sequenzen beider Stränge vollständig durch die bereitgestellte Sequenzinformation spezifiziert werden.
  • Tabelle 1 SEQ ID NR: 2
    Figure 00110001
  • IL4R SNPs
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der Genotyp von einer oder mehreren SNPs in dem IL4R-Gen bestimmt. Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten SNPs in dem IL4R-Locus umfassen SNPs in Exons, Introns oder stromaufwärts oder stromabwärts gelegenen Regionen und sind in der nachstehenden Tabelle 2 bereitgestellt und eingehend in den Beispielen erörtert.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann der Genotyp von einem IL4R-SNP verwendet werden, um eine Gefährdung eines Individuums für eine Autoimmunkrankheit zu bestimmen. In anderen Ausführungsformen werden die Genotypen einer Reihe von IL4R SNPs verwendet. Daher können die Genotypen von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 oder 26 der SNPs in der Tabelle 2 verwendet werden. um die Gefährdung eines Individuums für eine Autoimmunkrankheit zu bestimmen. Tabelle 2 IL4R SNPs
    dbSNP ID rs# Exon Variation WT Allel Var Allel Acc X52425.1 (cDNA) AC004575.1 (genomisch) Formaler SNPName
    P P 3 C(–3223)7 T(–1914)C I50V G A A A G G NA NA 398 128387 127078 94272 G128387A A127078G A398G
    4 N142N C T 676 92548 C676T
    4 C92516T C T Na 92516 C92516T
    4 A92417T A T Na 92417 A92417T
    2234896 7 P249P C G 997 80189 C997G
    2234897 9 F288F T C 1114 76868 T1114C
    1895011 9 E375A A C 1374 76608 A1374C
    9 E375E G A 1375 76607 G1375A
    2234898 9 L389L G T 1417 76565 G1417T
    1805012 9 C406R T C 1466 76516 T1466C
    2234899 9 C406C C T 1468 76514 C1468T
    2234900 9 L408L T C 1474 76508 T1474C
    1805013 9 S411L C T 1482 76500 C1482T
    1805015 9 S478P T C 1682 76300 T1682C
    1801275 9 Q551R A G 1902 76080 A1902G
    9 V5541 G A 1910 76072 G1910A
    9 P650S C T 2198 75784 C2198T
    1805016 9 S727A T G 2429 75553 T2429G
    9 G759G C T 2567 75455 C2567T
    1805014 9 S761P T C 2531 75451 T2531C
    9 P774P T C 2572 75410 T2572C
    1049631 9 3'UTR G A 3044 74938 G3044A
    8832 9 3'UTR A G 3289 74693 A3289G
    8674 9 3'UTR C T 3391 74581 C3391T
  • Genotypbestimmungs-Verfahren
  • In den erfindungsgemäßen Verfahren werden die in einer Probe vorhandenen Allele identifiziert durch Identifizieren des Nukleotids, das an einer oder mehreren polymorphen Stellen zugegen ist. Jeder Typ Gewebe, der IL4R-Nukleinsäure enthält, kann zur Bestimmung des IL4R-Genotyps eines Individuums herangezogen werden. Eine Anzahl von Verfahren ist im Stand der Technik zur Identifikation des Nukleotids an einem Einzelnukleotidpolymorphismus bekannt. Das jeweils zur Identifikation des Genotyps verwendete Verfahren ist kein entscheidender Aspekt der Erfindung. Bestimmte Verfahren sind aufgrund von Überlegungen hinsichtlich Leistung, Kosten und Zweckmäßigkeit zwar wünschenswerter als andere, jedoch ist es klar, dass jedes Verfahren, das das vorhandene Nukleotid identifizieren kann, die Information bereitstellen kann, die zur Identifikation des Genotyps notwendig ist. Bevorzugte Genotypbestimmungs-Verfahren umfassen DNA-Sequenzierung, allelspezifische Amplifikation, oder Nachweis der amplifizierten Nukleinsäure auf Sondenbasis.
  • IL4R-Allele können durch im Stand der Technik bekannte DNA-Sequenzierungsverfahren, wie durch das Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463–5467, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist) identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine Subsequenz des Gens, das die polymorphe Stelle umfasst, amplifiziert und entweder in ein geeignetes Plasmid kloniert und dann sequenziert oder direkt sequenziert. Die Sequenzierung auf PCR-Basis ist beschrieben in US-Patent 5 075 216 ; Brow, in PCR Protocols, 1990 (Innis et al., Hrsg. Academic Press, San Diego), Kapitel 24 und Gyllensten, in PCR Technology, 1989 (Erlich Hrsg. Stockton Press, New York), Kapitel 5, die jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen sind. Die Sequenzierung erfolgt gewöhnlich durch eines der Automatik-DNA-Sequenziergeräte, die kommerziell erhältlich sind, beispielsweise von PE Biosystems (Foster City, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ), Genomyx Corp. (Foster City, CA), LI-COR Biotech (Lincoln, NE), GeneSys Technologies (Sauk City, WI) und Visable Genetics, Inc. (Toronto, Canada).
  • IL4R-Alleles können mit Genotypbestimmungs-Verfahren auf Amplifikationsbasis identifiziert werden. Es wurde eine Reihe von Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren beschrieben, die in Tests verwendet werden können, die Einzelbasenaustausche in einer Ziel-Nukleinsäure nachweisen können. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Polymerasekettenreaktion (PCR), die jetzt im Stand der Technik bekannt ist und in den US-Patenten Nr. 4 683 195 ; 4 683 202 ; und 4 965 188 beschrieben ist; welche jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen sind. Beispiele für zahlreiche veröffentlichte Artikel, die Verfahren und Anwendungen für PCR beschreiben, finden sich in PCR Applications, 1999, (Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego), PCR Strategies, 1995, (Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego); PCR Protocols, 1990, (Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego); und PCR Technology, 1989, (Erlich, Hrsg., Stockton Press, New York); welche jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen sind. Kommerzielle Anbieter, wie PE Biosystems (Foster City, CA) verkaufen PCR Reagenzien und veröffentlichen PCR-Protokolle.
  • Andere geeignete Amplifikationsverfahren umfassen die Ligasekettenreaktion (Wu und Wallace 1988, Genomics 4: 560–569); den Strangverdrängungstest (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392–396, Walker et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 1691–1696, und US-Patent Nr. 5 455 166 ); und mehrere Amplifikationssysteme auf Transkriptionsbasis, einschließlich der in den US-Patenten Nr. 5 437 990 ; 5 409 818 ; und 5 399 491 beschriebenen Verfahren; das Transkriptionsamplifikationssystem (TAS) (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177); und die selbständige Sequenzreplikation (3SR) (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878 und WO 92/08800 ); welche jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen sind. Verfahren, die die Sonde auf nachweisbare Mengen amplifizieren, können alternativ verwendet werden, wie die Qβ-Replikaseamplifikation (Kramer und Lizardi, 1989, Nature 339: 401–402, und Lomeli et al., 1989, Clin. Chem. 35: 1826–1831, welche jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen sind). Ein Überblick über bekannte Amplifikationsverfahren ist in Abramsom und Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41–47 gegeben, welches durch Bezugnahme hier aufgenommen ist.
  • Genotypbestimmung kann ebenfalls durch Nachweis von IL4R mRNA erfolgen. Die Amplifikation von RNA kann erfolgen, indem zuerst die Ziel-RNA revers transkribiert wird, wobei beispielsweise eine virale reverse Transkriptase verwendet wird, und dann die resultierende cDNA amplifiziert wird, oder mit einer kombinierten Hochtemperatur-reverse-Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), wie in den US-Patenten Nr. 5 310 652 ; 5 322 770 ; 5 561 058 ; 5 641 864 ; und 5 693 517 ; welche jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen sind (siehe ebenfalls Myers und Sigua, 1995, in PCR Strategies, siehe oben, Kapitel 5).
  • IL4R Allele können mit allelspezifischen Amplifikations- oder Primerextensionsverfahren identifiziert werden, die auf der inhibitorischen Wirkung eines terminalen Primermismatchs auf die Fähigkeit einer DNA-Polymerase zur Verlängerung des Primers beruhen. Zum Erfassen einer Allelsequenz mit einem Verfahren auf allelspezifischer Amplifikations- oder Extensions-Basis, wird ein Primer gewählt, der zum IL4R Gen komplementär ist, so dass das 3'-terminale Nukleotid an der polymorphen Position hybridisiert. In Anwesenheit des zu identifizierenden Allels stimmt der Primer mit der Zielsequenz am 3'-Terminus überein, und der Primer wird verlängert. In Anwesenheit von nur dem anderen Allel, hat der Primer einen 3'-Mismatch gegenüber der Zielsequenz, und die Primerextension wird entweder eliminiert oder signifikant reduziert. Die Verfahren auf allelspezifischer Amplifikations- oder Extensionsbasis sind beispielsweise beschrieben in den US-Patenten Nr. 5 137 806 ; 5 595 890 ; 5 639 611 ; und US-Patent Nr. 4 851 331 , welche hier jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Mit Hilfe der allelspezifischen Genotypbestimmung auf Amplifikationsbasis erfordert die Identifikation der Allele nur die Erfassung der Anwesenheit oder Abwesenheit amplifizierter Zielsequenzen. Verfahren zur Erfassung amplifizierter Zielsequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Es werden beispielsweise Gelelektrophorese (siehe Sambrook et al., 1989, siehe oben) und die oben beschriebenen Sondenhybridisierungstests weithin zur Erfassung der Anwesenheit von Nukleinsäuren verwendet.
  • Verfahren auf allelspezifischer Amplifikationsbasis zur Genotypbestimmung können die Identifikation von Haplotypen erleichtern, wie in den Beispielen beschrieben. Hauptsächlich wird die allelspezifische Amplifikation verwendet, um einen Bereich, der mehrere polymorphe Stellen umfasst, nur aus einem der beiden Allele in einer heterozygoten Probe zu amplifizieren. Die SNP-Varianten, die in der amplifizierten Sequenz zugegen sind, werden dann identifiziert, wie durch Sondenhybridisierung oder Sequenzierung.
  • Ein alternatives sondenloses Verfahren, das hier als kinetisches PCR-Verfahren bezeichnet wird, wobei die Erzeugung der amplifizierten Nukleinsäure durch Überwachen des Anstiegs der Gesamtmenge an Doppelstrang-DNA im Reaktionsgemisch erfasst wird, ist in Higuchi et al., 1992, Bio/Technology 10: 413–417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11: 1026–1030; Higuchi und Watson, in PCR Applications, siehe oben, Kapitel 16; US-Patente Nr. 5 994 056 und 6 171 785 und in den europäischen Patentveröffentlichungen Nr. 487 218 und 512 334 , die hier jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschrieben. Der Nachweis von doppelsträngiger Ziel-DNA beruht auf der gesteigerten Fluoreszenz, die DNA-bindende Farbstoffe, wie Ethidiumbromid, aufweisen, wenn sie an doppelsträngige DNA binden. Der Anstieg der doppelsträngigen DNA, der aus der Synthese von Zielsequenzen resultiert, führt zu einem Anstieg der Menge Farbstoff, die an doppelsträngiger DNA gebunden ist, und einem gleichzeitig nachweisbaren Anstieg der Fluoreszenz. Zur Genotypbestimmung mit den kinetischen PCR-Verfahren werden die Amplifikationsreaktionen mit einem Paar von Primern durchgeführt, die für eines der Allele spezifisch sind, so dass jede Amplifikation die Anwesenheit eines bestimmten Allels anzeigen kann. Durch Ausführen von zwei Amplifikationen, eine mit Primern, die für das Wildtyp-Allel spezifisch sind, und eine mittels Primer, die für das mutierte Allel spezifisch sind, kann der Genotyp der Probe in Bezug auf diesen SNP erfasst werden. Entsprechend kann durch Ausführen von vier Amplifikationen, jeweils mit einem der möglichen Paare, die mit allelspezifischen Primern für stromaufwärts gelegene und stromabwärts gelegene Primer möglich sind, der Genotyp der Probe in Bezug auf zwei SNPs bestimmt werden. Dies ergibt die Haplotypinformation für ein Paar SNPs.
  • Allele können mittels Verfahren auf Sondenbasis identifiziert werden, die auf der unterschiedlichen Stabilität der Hybridisierungs-Doppelstränge beruhen, die sich zwischen der Sonde und den IL4R-Allelen bilden, und die sich hinsichtlich des Komplementaritätsgrades unterscheiden. Unter hinreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen werden stabile Doppelstränge nur zwischen der Sonde und der Zielallelsequenz gebildet. Die Anwesenheit stabiler Hybridisierungs-Doppelstränge kann durch eine beliebige Anzahl von bekannten Verfahren festgestellt werden. Im Allgemeinen ist die Amplifikation der Nukleinsäure vor der Hybridisierung bevorzugt, so dass der Nachweis erleichtert wird. Dies ist jedoch nicht notwendig, wenn hinreichend Nukleinsäure ohne Amplifikation erhalten werden kann.
  • Eine zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren auf Sondenbasis geeignete Sonde, die einen hybridisierenden Bereich entweder im Wesentlichen komplementär oder genau komplementär zu einem Zielbereich von SEQ ID NR: 2 oder dem Komplement von SEQ ID NR: 2 enthält, wobei der Zielbereich die polymorphe Stelle umfasst, und zu einer der beiden Allelsequenzen an der polymorphen Stelle genau komplementär ist, kann ausgewählt werden, wobei die hier bereitgestellte und im Stand der Technik bekannte Anleitung verwendet wird. Entsprechend können geeignete Hybridisierungsbedingungen, die von der genauen Größe und Sequenz der Sonde abhängen, empirisch gewählt werden, wobei die hier bereitgestellte und im Stand der Technik bekannte Anleitung verwendet wird. Die Verwendung von Oligonukleotid-Sonden zur Erfassung von Einzelbasenpaarunterschieden in der Sequenz ist beispielsweise in Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278–282 und in den US-Patenten Nr. 5 468 613 und 5 604 099 beschrieben, die jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen sind.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Verfahren auf Sondenbasis zur Bestimmung des IL4R-Genotyps werden multiple Nukleinsäuresequenzen aus dem IL4R-Gen, die die polymorphen Stellen umfassen, amplifiziert und an einen Satz von Sonden unter hinreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Die vorhandenen IL4R-Allele werden aus dem Bindungsmuster der Sonden an die amplifizierten Zielsequenzen hergeleitet. In dieser Ausführungsform erfolgt die Amplifikation zur Bereitstellung von hinreichend Nukleinsäure zur Analyse durch Sondenhybridisierung. Somit sind die Primer so ausgelegt, dass die Bereiche des IL4R-Gens, das die polymorphen Stellen umfasst, ungeachtet, des in der Probe vorhandenen Allels amplifiziert werden. Eine allelunabhängige Amplifikation wird mittels Primer erzielt, die an konservierte Bereiche des IL4R-Gens hybridisieren. Die IL4R-Gensequenz ist hochkonserviert und geeignete allelunabhängige Primer können routinemäßig aus SEQ ID NR: 1 ausgewählt werden. Der Fachmann erkennt, dass eine experimentelle Optimierung eines Amplifikationssystems gewöhnlich hilfreich ist.
  • Geeignete Testformate zum Erfassen von Hybriden, die sich zwischen Sonden und Ziel-Nukleinsäuresequenzen in einer Probe bilden, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen das immobilisierte Ziel-(Dot-Blot)-Format und das immobilisierte Sonden-(Umkehr-Dot-Blot oder Line-Blot)-Testformate. Dot-Blot- und Umkehr-Dot-Blot-Testformate sind in den US-Patenten Nr. 5 310 893 ; 5 451 512 ; 5 468 613 und 5 604 099 ; beschrieben, die jeweils durch Bezugnahme hier aufgenommen sind.
  • In einem Dot-Blotformat wird die amplifizierte Ziel-DNA auf einem festen Träger, wie einer Nylonmembran, immobilisiert. Der Membran-Zielkomplex wird mit einer markierten Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen markiert, unhybridisierte Sonde wird durch Waschen unter geeignet stringenten Bedingungen entfernt, und die Membran wird auf die Anwesenheit von gebundener Sonde untersucht. Ein bevorzugter Dot-Blot-Nachweistest ist in den Beispielen beschrieben.
  • Im Umkehr-Dot-Blot-(oder Line-Blot)-Format werden die Sonden auf einem festen Träger, wie einer Nylonmembran oder einer Mikrotiterplatte, immobilisiert. Die Ziel-DNA wird markiert, gewöhnlich während der Amplifikation durch den Einbau markierter Primer. Eine oder beide Primer können markiert werden. Der Membran-Sonden-Komplex wird mit der markierten amplifizierten Ziel-DNA unter geeigneten Hybridisierungs-Bedingungen inkubiert, unhybridisierte Ziel-DNA wird durch Waschen unter geeignet stringenten Bedingungen entfernt, und die Membran wird auf die Anwesenheit von gebundener Ziel-DNA überwacht. Ein bevorzugter Umkehr-Line-Blot-Nachweistest ist in den Beispielen beschrieben.
  • Die Genotypbestimmung auf Sonden-Basis kann mit einem "TaqMan" oder "5'-Nuklease-Test" durchgeführt werden, wie in den US-Patenten Nr. 5 210 015 ; 5 487 972 und 5 804 375 und Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276–7280 beschrieben, die hier jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind. In dem TaqMan-Test werden markierte Nachweissonden, die in dem amplifizierten Bereich hybridisieren, während des Amplifikations-Reaktionsgemischs zugegeben. Die Sonden sind modifiziert, so dass sie es verhindern, dass die Sonden als Primer für die DNA-Synthese wirken. Die Amplifikation erfolgt mit einer DNA-Polymerase, die die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität besitzen, beispielsweise Tth-DNA-Polymerase. Während jedes Syntheseschritts der Amplifikation wird jede Sonde, die an die Ziel-Nukleinsäure stromabwärts des verlängerte Primers hybridisiert, durch die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase abgebaut. Somit ergibt die Synthese eines neuen Zielstrangs auch den Abbau einer Sonde, und die Anreicherung eines Abbauproduktes stellt ein Maß für die Synthese der Zielsequenzen bereit.
  • Jedes Verfahren, das sich zum Nachweisen des Abbauproduktes eignet, kann in dem TaqMan-Test verwendet werden. In einem bevorzugten Verfahren werden die Nachweissonden mit zwei Fluoreszenz-Farbstoffen markiert, von denen einer die Fluoreszenz des anderen Farbstoffs quenchen kann. Die Farbstoffe werden an diese Sonde gebunden, vorzugsweise ist eine am 5'-Terminus gebunden, und die andere ist an einer internen Stelle gebunden, so dass ein Quenchen erfolgt, wenn die Sonde in einem unhybridisierten Zustand ist, und so dass eine Spaltung der Sonde durch die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase zwischen den beiden Farbstoffen erfolgt. Die Amplifikation führt zur Spaltung der Sonde zwischen den Farbstoffen mit einer gleichzeitigen Eliminierung des Quenching und einem Anstieg der Fluoreszenz, die sich von dem anfangs gequenchten Farbstoff beobachten lässt. Die Anreicherung des Abbauproduktes wird durch Messen des Anstiegs der Reaktionsfluoreszenz überwacht. Die US-Patente Nr. 5 491 063 und 5 571 673 , die hier jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschrieben alternative Verfahren zum Nachweisen des Abbaus der Sonde, die zeitgleich mit der Amplifikation erfolgt.
  • Der TaqMan-Test kann mit allelspezifischen Amplifikations-Primerns erfolgen, so dass die Sonde nur zum Erfassen der Anwesenheit des amplifizierten Produkts verwendet wird. Ein solcher Test erfolgt wie für die vorstehend beschriebenen Verfahren auf kinetischer PCR-Basis beschrieben. Alternativ kann der TaqMan-Test mit einer zielspezifischen Sonde verwendet werden.
  • Die vorstehend beschriebenen Testformate nutzen gewöhnlich markierte Oligonukleotide, so dass der Nachweis der Hybrid-Doppelstränge erleichtert wird. Oligonukleotide können markiert werden, indem eine Markierung eingebracht wird, die sich durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Maßnahmen nachweisen lässt. Geeignete Markierungen umfassen 32P, Fluoreszenzfarbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (wie sie gemeinhin in ELISAS verwendet werden), Biotin oder Haptene, und Proteine, für die Antiseren oder monoklonale Antikörper verfügbar sind. Markierte Oligonukleotide der Erfindung können mit den oben für die Synthese von Oligonukleotiden beschriebenen Techniken synthetisiert und markiert werden. Ein Dot-Blot-Test kann beispielsweise mittels Sonden durchgeführt werden, die mit Biotin markiert sind, wie beschrieben in Levenson und Chang 1989, in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Hrsg. Academic Press, San Diego); S. 99–112, das durch Bezugnahme hier aufgenommen ist. Nach der Hybridisierung der immobilisierten Ziel-DNA mit den biotinylierten Sonden unter sequenzspezifischen Bedingungen werden die Sonden, die gebunden bleiben, erfasst, indem zuerst das Biotin an Avidin-Meerrettichperoxidase (A-HRP) oder Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (SA-HRP) gebunden wird, das dann erfasst wird, indem zuerst eine Reaktion durchgeführt wird, in der das HRP eine Farbänderung eines Chromogens katalysiert.
  • Unabhängig von dem Verfahren, mit dem bestimmt wird, welche erfindungsgemäßen Oligonukleotide selektiv an IL4R-Allelsequenzen in einer Probe hybridisieren, beinhaltet das zentrale Merkmal des Typisierungsverfahrens die Identifikation der IL4R-Allele, die in der Probe vorhanden sind, durch Erfassen der vorhandenen varianten Sequenzen. Die Allelsequenz (Ziel) kann DNA oder RNA sein.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits, Behältereinheiten, die geeignete Komponenten zur Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen. Ein geeignetes Kit kann Oligonukleotid-Sonden enthalten, die für die IL4R-Allele spezifisch sind. In einigen Fällen können die Nachweissonden an einer geeigneten Trägermembran fixiert sein. Das Kit kann auch Amplifikationsprimer zum Amplifizieren eines Bereichs des IL4R-Locus enthalten, der die polymorphe Stelle umfasst, da sich diese Primer in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eignen. Alternativ können geeignete Kits einen Satz von Primern enthalten, die einen allelspezifschen Primer für die spezifische Amplifikation der IL4R-Allele umfassen. Andere wahlfreie Komponenten der Kits umfassen zusätzliche Reagenzien, die bei den hier beschriebenen Genotypbestimmungs-Verfahren verwendet werden. Ein Kit kann beispielsweise zudem ein Mittel zur Katalyse der Synthese der Primerextensionsprodukte, Substratnukleosidtriphosphate, Mittel zum Markieren und/oder Nachweisen von Nukleinsäure (beispielsweise ein Avidin-Enzym-Konjugat und Enzymsubstrat und Chromogen, wenn die Markierung Biotin ist), geeignete Puffer für Amplifikations- oder Hybridisierungsreaktionen und Anweisungen zur Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten.
  • Die nachstehend aufgeführten erfindungsgemäßen Beispiele werden lediglich für Veranschaulichungszwecke gegeben und schränken den Schutzbereich der Erfindung nicht ein. Zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung im Schutzbereich der Ansprüche, die den Beispielen folgen, werden dem Fachmann durch Lesen des vorhergehenden Texts und der folgenden Beispiele ersichtlich.
  • Beispiel 1: Genotypbestimmungs-Protokoll: Identifikation der IL4R-Allele auf Sonden-Basis
  • Dieses Beispiel beschreibt ein Genotypbestimmungs-Verfahren, in dem 6 Bereiche des IL4R-Gens, die 8 polymorphe Stellen umfassen, zeitgleich amplifiziert werden und das Nukleotid, das an jedem der 8 Stellen vorhanden ist, durch Sondenhybridisierung identifiziert wird. Der Probennachweis erfolgt durch Verwendung eines Formats mit immobilisierter Sonde (Line-Blot).
  • Amplifikations-Primer
  • Die Amplifikation der 6 Bereiche des IL4R-Gens, das 8 polymorphe Stellen umfasst, erfolgt mit den nachstehend beschriebenen Primerpaaren. Sämtliche Primer sind in der 5'→3'-Orientierung gezeigt.
  • Die folgenden Primer amplifizieren einen 114 Basenpaar-Bereich, der das Codon 398 umfasst.
  • Figure 00250001
  • Die folgenden Primer amplifizieren einen 163 Basenpaar-Bereich, der das Codon 676 umfasst.
  • Figure 00250002
  • Die folgenden Primer amplifizieren einen 228 Basenpaar-Bereich, der die Codon 1374, 1417 und 1466 umfasst.
  • Figure 00250003
  • Die folgenden Primer amplifizieren einen 129 Basenpaar-Bereich, der das Codon 1682 umfasst.
  • Figure 00250004
  • Die folgenden Primer amplifizieren einen 198 Basenpaar-Bereich, der das Codon 1902 umfasst.
  • Figure 00250005
  • Figure 00260001
  • Die folgenden Primer amplifizieren einen 177 Basenpaar-Bereich, der das Codon 2531 umfasst.
  • Figure 00260002
  • Zur Erleichterung des Nachweises in dem nachstehend beschriebenen Sondennachweisformat werden die Primer mit Biotin markiert, das an das 5'-Phosphat gebunden ist. Reagenzien zur Synthese der Oligonukleotide mit einer an das 5'-Phosphat gebundenen Biotinmarkierung sind kommerziell erhältlich von Clonetech (Palo Alto, CA) und Glenn Research (Sterling, VA). Ein bevorzugtes Reagenz ist Biotin-ON von Clonetech.
  • Amplifikation
  • Die PCR-Amplifikation erfolgt in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 25 bis 100 μl, das die folgenden Reagenzien enthält:
    0,2 ng/μl gereinigte genomische DNA aus Mensch
    0,2 mM jedes Primers
    800 mM Gesamt dNTP (jeweils 200 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
    70 mM KCl
    12 mM Tris-HCl, pH 8,3
    3 mM MgCl2,
    0,25 Units/μl AmpliTaq GoldTM DNA-Polymerase
  • Die Amplifikation erfolgt in einem GeneAmp7 PCR System 9600 Thermocycler (Applera, Foster City, CA), mit dem nachstehend gezeigten spezifischen Temperaturcyclingprofil.
    Vorreaktionsinkubation: 94°C für 12,5 min
    33 Zyklen: Denaturieren: 95°C für 45 sec
    Annealing: 61°C für 30 sec
    Verlängern: 72°C für 45 sec
    Endverlängerung: 72°C für 7 min
    Halten: 10°C–15°C
  • Nachweissonden
  • Bevorzugte Sonden, die zur Identifikation der Nukleotide an den 8 SNPs in den amplifizierten IL4R Nukleinsäuren verwendet werden, sind in der Tabelle 3 beschrieben. Die Sonden sind in der 5'→3'-Richtung gezeigt. Zwei Sonden sind zur Erfassung von T1466 gezeigt; es wird ein Gemisch der beiden Sonden verwendet.
  • Sondenhybridisierungsassay, Immobilisiertes Sondenformat
  • Im immobilisierten Sondenformat werden die Sonden vor der Verwendung in der Hybridisierung an einem festen Träger immobilisiert. Der Sonden-Träger-Komplex wird in eine Lösung getaucht, die die denaturierte amplifizierte Nukleinsäure (Biotin-markiert) enthält, so dass eine Hybridisierung erfolgt. Ungebundene Nukleinsäure wird durch Waschen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen entfernt, und Nukleinsäure, die an den immobilisierten Sonden gebunden bleibt, wird mit einer chromogenen Reaktion erfasst. Die Einzelheiten des Tests sind nachstehend beschrieben.
  • Zur Verwendung in dem nachstehend beschriebenen immobilisierten Sondennachweisformat wird eine Einheit an das 5'-Phosphat der Sonde zur Erleichterung der Immobilisierung auf einem festen Träger gebunden. Vorzugsweise wird Rinderserumalbumin (BSA) an dem 5'-Phosphat gebunden, im Wesentlichen wie von Tung et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 464–465 beschrieben, das durch Bezugnahme hier aufgenommen ist. Alternativ wird ein Poly-T-Schwanz an das 5'-Ende gefügt, wie in US-Patent 5 451 512 beschrieben, das durch Bezugnahme hier aufgenommen ist.
  • Die Sonden werden in einem linearen Format auf Nylonmembran-Bögen (beispielsweise BioDyneTM B Nylon Filter, Pall Corp., Glen Cove, NY) aufgetragen, wobei ein Linearer Striper und ein Multispense2000TM Controller (IVEK, N. Springfield, VT) verwendet wird. Probentiter werden so gewählt, dass sie einen Signalausgleich zwischen den allelischen Varianten erzielen; die verwendeten Titer werden in der obigen Tabelle der Sonden bereitgestellt. Jeder Bogen wird in Streifen zwischen 0,35 und 0,5 cm Breite geschnitten. Zur Denaturierung der Amplifikationsprodukte werden 20 μl Amplifikationsprodukt (auf der Basis einer 50 μl Reaktion) zu 20 μl einer Denaturierungslösung (1,6% NaOH) gegeben, und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert, so dass die Denaturierung beendet wird.
  • Das denaturierte Amplifikationsprodukt (40 ml) wird in die Vertiefung einer Typisierungsplatte gefügt, die 3 ml Hybridisierungspuffer (4 × SSPE, 0,5% SDS) und den Membranstreifen enthielt. Die Hybridisierungen erfolgten weitere 15 min bei 55°C in einem rotierenden Wasserbad. Nach der Hybridisierung wird die Hybridisierungslösung abgesaugt, der Streifen wird in 3 ml warmer Waschpuffer (2 × SSPE, 0,5% SDS) durch vorsichtiges Hin- und Her-Schütteln der Streifen gespült, und der Waschpuffer wird abgesaugt. Nach dem Spülen werden die Streifen in 3 ml Enzymkonjugatlösung (3,3 ml Hybridisierungspuffer und 12 ml Streptavidin-Meerrettichperoxidase (SA-HRP)) im rotierenden Wasserbad für 5 min bei 55°C inkubiert. Dann werden die Streifen wie oben mit Waschpuffer gespült, in Waschpuffer bei 55°C für 12 min (stringenter Waschvorgang) inkubiert und schließlich wieder mit Waschpuffer gespült.
  • Die Zielnukleinsäure, die nun HRP-markiert ist, welches an dem immobilisierten Amplifikationsprodukt gebunden bleibt, wird folgendermaßen sichtbar gemacht. Eine Farbentwicklungslösung wird durch Mischen von 100 ml Citratpuffer (0,1 M Natriumcitrat, pH-Wert 5,0), 5 ml 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin(TMB)-Lösung (2 mg/ml TMB-Pulver von Fluka, Milwaukee, WI, gelöst in 100% EtOH), und 100 μl 3% Wasserstoffperoxid hergestellt. Die Streifen werden zuerst in 0,1 M Natriumcitrat (pH-Wert 5,0) für 5 min gespült, dann in der Farbentwicklungslösung unter vorsichtigem Rühren für 8 bis 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Das TMB, zu Beginn farblos, wird durch das zielgebundene HRP in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid zu einem gefärbten Präzipitat umgewandelt. Die entwickelten Streifen werden in Wasser für mehrere min gespült und sofort photographiert.
  • Beispiel 2: Assoziation mit Diabetes Typ 1
  • Das IL4R-Genotypbestimmung erfolgte an Individuen aus 282 ermittelten Kaukasischen Familien, weil sie zwei Nachkommen enthielten, die von Diabetes Typ 1 betroffen waren. Die IL4R-Genotypen sämtlicher Individuen wurden bestimmt. Die IL4R-Genotypbestimmung erfolgte mit einem Genotypbestimmungs-Verfahren, das im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Neben den 564 Nachkommen (2 Geschwister in jeder der 282 Familien) in den betroffenen Geschwister-Paaren, auf denen die Bestimmung beruhte, existierten noch 26 andere betroffene Kinder. Es gab 270 nicht betroffene Nachkommen unter diesen Familien.
  • Die Proben auf Familienbasis wurden als gereinigte genomische DNA vom Human Biological Data Interchange (HBDI) bereitgestellt, wobei es sich um eine Hinterlegungsstelle für Zelllinien aus Familien handelt, die von Diabetes Typ 1 betroffen sind. Alle in dieser Untersuchung eingesetzten HBDI-Familien sind Kernfamilien mit unbetroffenen Eltern (genetisch unverwandt) und mindestens zwei betroffenen Geschwistern. Diese Proben sind weiter in Noble et al., 1996, Am. J. Hum. Genet. 59: 1134–1148 beschrieben, das durch Bezugnahme hier aufgenommen ist.
  • Es ist bekannt, dass der HLA-Genotyp eine signifikante Wirkung auf die Gefährdung durch Diabetes Typ 1 haben kann, und zwar je nach dem Genotyp entweder erhöht oder verringert. Insbesondere Individuen mit dem HLA DR-Genotyp DR3-DQB1*0201/DR4-DQB1*0302 (bezeichnet als DR3/DR4 unten) scheinen die höchste Gefährdung für Diabetes Typ 1 (siehe Noble et al., 1996, Am. J. Hum. Genet. 59: 1134–1148, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist) zu haben. Diese hoch gefährdeten Individuen haben eine Wahrscheinlichkeit von etwa 1 zu 15, von Diabetes Typ 1 betroffen zu sein. Wegen der starken Wirkung dieses Genotyps auf die Wahrscheinlichkeit von Diabetes Typ 1 kann die Anwesenheit von DR3-DQB1*0201/DR4-DQB1*0302 den Beitrag aus den IL4R-Allelvarianten überdecken.
  • Individuen in diesen Familien wurden ebenfalls an den HLA DRB1 und DQB1-Loci genotypisiert. Von den betroffenen Geschwister-Paaren haben beide Geschwister den DR3/DR4-Genotyp in 90 Familien. Keines der betroffenen Geschwister hat den DR3/4-Genotyp in 144 Familien. Genau ein betroffenes Paar hat den DR3/4 Genotyp in den verbleibenden 48 Familien.
  • Beispiel 3: Assoziation mit Diabetes Typ 1 in philippinischen Proben
  • Individuen
  • Proben aus 183 Individuen von den Philippinen wurden mit dem Umkehr-Line-Blot-Verfahren, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben genotypisiert. Von den 183 Individuen haben 89 Individuen Diabetes Typ 1 und 94 sind passende Kontrollen.
    (Probe 91IDDM nicht typisiert)
  • Ergebnisse
  • Die Genotypen der betroffenen und nicht-betroffenen Individuen sind in der Tabelle 4 (SEQ ID NR: 20 bis 24) gezeigt. Die tatsächlichen Zahlen und Häufigkeiten sind für jeden Genotyp bereitgestellt. Die Daten (Tabelle 5) bestätigen die Anwesenheit einer Assoziation von IL4R SNP-Varianten mit Diabetes Typ 1.
  • Beispiel 4: Verfahren der Genotypbestimmung
  • Acht exemplarische SNPs im Human-IL4R-Gen sind in der Tabelle 6 aufgeführt. Jeder SNP ist durch seine Position in der Referenzsequenz von GenBank mit der Zugriffsnummer X52425.1 (SEQ ID NR: 1) beschrieben. SNP1 befindet sich beispielsweise an Position 398 von X52425.1 (SEQ ID NR: 1), wobei ein "A" Nukleotid vorhanden ist. Das variante Allel an dieser Position hat ein "G" Nukleotid. Die SNPs werden durch die SNP# im nachfolgenden Text bezeichnet.
  • Die Regionen des IL4R-Gens, die die SNPs umfassen, werden amplifiziert und das vorhandene Nukleotid durch Sondenhybridisierung identifiziert. Der Sondennachweis erfolgt mit einem immobilisierten Sonden(Line-Blot)-Format, das noch beschrieben wird.
  • Amplicons und Primer
  • Die Primerpaare, die zur Amplifikation der Bereiche verwendet werden, die die 8 SNPs umfassen, sind in der Tabelle 7 (SEQ ID NR: 25–36) aufgeführt. Die SNPs Nummern 3, 4, und 5 werden auf dem gleichen 228 Basenpaar Fragment coamplifiziert. Die Primer werden an dem 5'-Phosphat durch Konjugation mit Biotin modifiziert. Die Reagenzien zur Synthese der Oligonukleotide mit einer Biotinmarkierung, die an dem 5'-Phosphat gebunden ist, sind von Clontech (Palo Alto, CA) und Glenn Research (Sterling, VA) kommerziell erhältlich. Ein bevorzugtes Reagenz ist Biotin-ON von Clontech.
  • Amplifikationsbedingungen
  • Die sechs Amplikons werden zusammen in einer einzelnen PCR-Reaktion in einem Gesamtreaktionsvolumen von 25 bis 100 ml amplifiziert, das die folgenden Reagenzien enthielt:
    0,2 ng/ml gereinigte genomische DNA aus Mensch
    0,2 nM jedes Primers
    800 mM Gesamt-dNTP (jeweils 200 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
    70 mM KCl
    12 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3
    3 mM MgCl2
    0,25 Units/ml AmpliTaq GoldTM DNA-Polymerase
  • Die Amplifikation erfolgt auf einem GeneAmp 7 PCR System 9600 Thermocycler (PE Biosystems, Foster City, CA), mit dem nachstehend gezeigten spezifischen Temperaturcycling-Profil:
    Vorreaktionsinkubation: 94°C für 12,5 min
    33 Zyklen: Denaturieren: 95°C für 45 sec
    Annealing: 61°C für 30 sec
    Verlängern: 72°C für 45 sec
    Endverlängerung: 72°C für 7 min
    Halten: 10°C–15°C
  • Hybridisierungssonden und Bedingungen
  • Die Sonden werden auf einem festen Träger immobilisiert, bevor sie in der Hybridisierung verwendet werden. Der Sonden-Träger-Komplex wird in eine Lösung getaucht, die denaturierte amplifizierte Nukleinsäure enthält, damit die Hybridisierung stattfindet. Ungebundene Nukleinsäure wird durch Waschen unter sequenzspezifischen Hybridisierungsbedingungen entfernt, und die Nukleinsäure, die an den immobilisierten Sonden gebunden bleibt, wird nachgewiesen. Der Nachweis erfolgt mit dem chromogenen Substrat TMB.
  • Zur Verwendung in dem nachstehend beschriebenen immobilisierten Sondennachweisformat wird eine Einheit an das 5'-Phosphat der Sonde gebunden, so dass die Immobilisierung auf einem festen Träger erleichtert wird. Vorzugsweise wird Rinderserumalbumin (BSA) an das 5'-Phosphat gebunden, und zwar im Wesentlichen wie von Tung et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 464–465, das durch Bezugnahme hier aufgenommen ist, beschrieben. Alternativ wird an das 3'-Ende ein Poly-T-Schwanz gebunden, wie in US-Patent 5 451 512 , das durch Bezugnahme hier aufgenommen ist.
  • Die Sonden werden in einem linearen Format auf Nylonmembranbögen aufgebracht, wobei ein Linearer Striper und ein Multispense2000TM-Controller (IVEK, N. Springfield, VT). verwendet wird. Die allelspezifischen Sonden und ihre Titer sind in der Tabelle 8 gezeigt. Der Nachweis des Wildtypallels von SNP #5 erfolgt mit einem Gemisch aus zwei der aufgeführten Sonden; dieses Gemisch ermöglicht den Nachweis von SNP #5, das von einem weiteren nahen SNP ununterscheidbar ist (nicht relevant für diesen Gereicht). Die aufgeführten Sondentiter werden so gewählt, dass ein Signalausgleich zwischen den allelischen Varianten erzielt wird. Nach der Sondenanwendung wird jeder Nylonbogen der Breite nach zu Streifen mit 0,35 bis 0,55 cm Breite geschnitten.
  • Zum Denaturieren der Amplifikationsprodukte wird 20 ml Amplifikationsprodukt zu 20 ml Denaturierungslösung (1,6% NaOH) gegeben und bei Raumtemperatur inkubiert. Das denaturierte Amplifikationsprodukt (40 ml) wird in die Vertiefung einer Typisierungsplatte mit 3 ml Hybridisierungspuffer (3 × SSPE, 0,5% SDS) und dem Membranstreifen gegeben. Die Hybridisierung erfolgt für weitere 15 min bei 55°C in einem rotierenden Wasserbad. Nach der Hybridisierung wird die Hybridisierungslösung abgesaugt, der Streifen in 3 ml warmer Waschpuffer (1,5 × SSPE, 0,5% SDS) gespült, indem die Streifen vorsichtig hin- und hergeschüttelt werden, und der Waschpuffer wird abgesaugt. Nach dem Spülen werden die Streifen in 3 ml Enzymkonjugatlösung (3,3 ml Hybridisierungspuffer und 12 ml Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (SA-HRP)) in dem rotierenden Wasserbad für 5 min bei 55°C inkubiert. Dann werden die Streifen wie oben mit Waschpuffer bei 55°C für 12 min (stringente Wäsche) gespült, und anschließend wieder mit Waschpuffer gespült.
  • Die Ziel-Nukleinsäuren, die nun HRP-markiert sind, das an dem immobilisierten Amplifikationsprodukt gebunden ist, werden wie folgt sichtbar gemacht. Die Streifen werden in 0,1 M Natriumcitrat (pH-Wert 5,0) für 5 min bei Raumtemperatur gespült, dann in der Farbentwicklungslösung unter vorsichtigem Schütteln für 8 bis 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Farbentwicklungslösung wird durch Mischen von 100 ml Citratpuffer (0,1 M Natriumcitrat, pH-Wert 5,0), 5 ml 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin(TMB)-Lösung (2 mg/ml TMB-Pulver von Fluka (Milwaukee, WI), gelöst in 100% EtOH), und 100 ml 3% Wasserstoffperoxid hergestellt. Das zu Beginn farblose TMB wird durch den zielgebundenen HRP in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid zu einem farblosen Niederschlag umgewandelt. Die entwickelten Streifen werden in Wasser mehrere Minuten lang gespült, und sofort photographiert.
  • Beispiel 5: Assoziation mit Diabetes Typ 1 in HBDI-Individuen
  • Individuen
  • Das IL4R-Genotypbestimmung erfolgte an Individuen aus 282 ermittelten kaukasischen Familien, da sie zwei Nachkommen enthielten, die von Diabetes Typ 1 betroffen waren. Die IL4R-Genotypen aller Individuen wurden bestimmt. Die IL4R-Genotypbestimmung erfolgte mit dem beschriebenen Umkehr-Line-Blot-Verfahren. Neben den 564 Nachkommen (zwei Geschwister in jeweils 282 Familien in den betroffenen Geschwister-Paaren, auf denen die Bestimmung beruhte), existierten 26 andere betroffene Kinder. Es gab 270 nicht betroffene Nachkommen unter diesen Familien.
  • Die Proben auf Familien-Basis wurden als gereinigte genomische DNA von Human Biological Data Interchange (HBDI) bereitgestellt, die eine Hinterlegungsstelle für Zelllinien aus Familien mit Diabetes Typ 1 ist. Alle in dieser Untersuchung eingesetzten HBDI-Familien sind Kernfamilien mit nicht betroffenen Eltern und mindestens zwei betroffenen Geschwistern. Diese Proben werden weiter in Noble et al., 1996, Am. J. Hum. Genet. 59: 1134–1148 beschrieben, das durch Bezugnahme hier aufgenommen ist.
  • Statistische Analyse, Verfahren und Algorithmen
  • Da die 8 SNPs in IL4R physikalisch und genetisch sehr nah miteinander verknüpft sind, ist die Anwesenheit eines bestimmten Allels an einem bestimmten SNP mit der Anwesenheit eines anderen bestimmten Allels an einem nahen SNP korreliert. Diese nicht-zufallsgemäße Assoziation von zwei oder mehreren SNPs-Allelen ist als Verbindungs-Ungleichgewicht (LD) bekannt.
  • Ein Verbindungs-Ungleichgewicht zwischen den 8 IL4R-SNPs wurde mit den Genotypen der 282 Elternpaare bestimmt. Diese 564 Individuen sind außer durch Heirat nicht miteinander verwandt. Eine Zusammenfassung der berechneten Häufigkeit des WT-Allels für jeden SNP in dieser Gruppe von 564 Individuen (den "HBDI-Gründern") ist in der Tabelle 9 angegeben.
  • Die Berechnung von LD kann auf verschiedene Weise erfolgen. Wir verwendeten zwei komplementäre Verfahren zur Bestimmung von LD zwischen allen Paaren von IL4R SNP-Loci. In dem ersten Verfahren berechneten wir die Werte von zwei bestimmten, aber verwandten Metriken für LD, nämlich D und D (Devlin und Risch, 1995), mit dem Maximalen Ähnlichkeits-Bestimmungsalgorithmus von Hill (Hill, 1974). Die Werte für D und D für alle Paare von IL4R SNPs sind in der Tabelle 10 gezeigt, im unteren linken dreieckigen Abschnitt. Beide D und D können Werte aufweisen, die zwischen B1 und +1 liegen. Werte nahe +1 oder B1 legen ein starkes Verbindungs-Ungleichgewicht nahe; Werte nahe Null zeigen die Abwesenheit von LD.
  • Ein zweites Maß für LD nutzte ein Permutationstestverfahren in dem Arlequin-Programm (L. Excoffier, Universität Genf, CH) (Excoffier und Slatkin 1995; Slatkin und Excoffier, 1996). Dieses Verfahren maximiert die Wahrscheinlichkeits-Verhältnis-Statistik (S = –2log(LH*/LH)) durch permutierende Allele und neuerliches Berechnen von S über eine große Zahl von Iterationen, bis S maximiert ist. Diese Iterationen ermöglichen die Bestimmung der Null-Verteilung von S, und somit kann das maximale erhaltene S in einen genauen P-Wert (Signifikanz-Niveau) umgewandelt werden. Diese P-Werte sind im oberen rechten dreieckigen Abschnitt der Tabelle 10 aufgelistet.
  • Die Tabelle 10 der paarweisen LD zeigt, dass es einen signifikanten Beweis für LD zwischen SNPs 1 und 2 gibt, und unter (allen Kombinationen von) SNPs 3, 4, 5, 6, 7 und 8. Die SNPs 3 bis 8 existieren bekanntlich innerhalb von 1200 Basenpaaren voneinander in einem einzelnen Exon (Exon 9) des IL4R-Gens, und der LD zwischen diesen SNPs ist auch der Beweis für sehr kleine genetische Distanzen.
  • Der Transmissions-Ungleichgewichts-Test (TDT) von Spielman (Spielman und Ewens 1996, Spielman und Ewens 1998) wurde anhand der IL4R-Genotyp-Daten für die 282 betroffenen Geschwisterpaare durchgeführt. (d. h. eine Familienstruktur, die aus zwei Eltern und zwei betroffenen Kindern bestand). Der TDT wurde zur Untersuchung auf Assoziation der einzelnen Allele der 8 IL4R SNPs mit Diabetes Typ 1 verwendet. Der TDT bestimmt, ob ein Allel von heterozygoten Eltern auf ihre betroffenen Kinder mit einer Haufigkeit übertragen wird, die sich signifikant von derjenigen unterscheidet, die aufgrund der Wahrscheinlichkeit erwartet wird. Unter der Nullhypothese ohne Assoziation eines Allels mit einer Krankheit überträgt ein heterozygotes Elternteil ein Allel mit gleicher Häufigkeit auf ein betroffenes Kind oder nicht. Die Signifikanz der Abweichung von der Nullhypothese kann mit der McNemar Chi-Quadrat-Test-Statistik (= (T – NT)^2/(T + NT) bestimmt werden, wobei T die beobachtete Anzahl der Transmissionen ist und NT die beobachtete Anzahl der Nicht-Transmissionen ist). Die Signifikanz (P-Wert) der McNemar Chi-Quadrat-Test-Statistik ist gleich der Pearson Chi-Quadrat-Statistik mit einem Freiheitsgrad (Glantz, 1997).
  • Die Ergebnisse der Einzel-SNP-Locus-TDT-Ergebnisse sind in den Tabellen 10A und 10B gezeigt. Das TDT/S-TDT-Programm (Version 1.1) von Spielman wurde zur Durchführung der Zählung von übertragenen und nicht-übertragenen Allelen verwendet (Spielman, McGinnis et al., 1993; Spielman und Ewens 1998). Die Tabelle listet die beobachteten Transmissionen des Wildtyp-Allels an jedem SNP-Locus auf. Da diese biallelische Polymorphismen sind, sind die Transmissionzählungen des varianten Allels gleich den Nicht-Transmissionen des Wildtyp-Allels.
  • Die Zählungen der Transmissionen und Nicht-Transmissionen der Allele in den Probanden, die nur in der Tabelle 11A gezeigt sind, erreichen nicht mal statistische Signifikanz bei a = 0,05. Dies gilt jedoch zum Zählen von Transmissionsereignissen auf alle betroffenen Kindern. Wird jedoch TDT auf diese Weise verwendet (oder für diesen Zweck mit mehr als einem Kind pro Familie), dann ist eine Signifikanzteststatistik nur Beweis für die Verbindung, nicht für Assoziation und Verbindung. Die Tabelle 11B zeigt die TDT-Analyse, wenn 26 zusätzliche betroffene Kinder aufgenommen sind. Die in der nachstehenden Tabelle 11B gezeigten Ergebnisse zeigen, dass es eine signifikante Abweichung von den erwarteten Transmissionshäufigkeiten für die Allele von SNPs 3, 4, 5 und 6 gibt. Die Untersuchung der "% Transmission"-Werte für diese SNPs zeigt, dass das Wildtyp-Allel auf betroffene Kinder bei Häufigkeiten von mehr als den erwarteten 50% übertragen werden.
  • Der Beweis für starke LD unter den 8 IL4R SNPs, deutete an, dass wir die Transmission des geordneten Satzes der Allele aus jedem Elternteil zu jedem betroffenen Kind in der HBDI-Gruppe erfassen konnten. Dieser geordnete Satz von Allelen entspricht physikalisch einem der beiden parentalen Chromosomen und wird als Haplotyp bezeichnet. Durch Ableiten der parentalen Haplotypen und ihrer Transmission oder Nichttransmission an betroffene Kinder erwarten wir, viel mehr statistische Information zu erhalten als aus den Allelen allein.
  • Wir leiteten IL4R-Haplotypen mit einer Kombination von zwei Verfahren ab. Als ersten Schritt verwendeten wir das GeneHunter-Programm (Falling Rain Genomics, Palo Alto, CA) (Kruglyak, Daly et al., 1996), da es sehr rasch die Haplotypen aus Genotyp-Daten aus Stammbäumen errechnet. Wir untersuchten dann jeden HBDI-Familien-Stammbaum einzeln mit dem Programm Cyrillic (Cherwell Scientific Publishing, Palo Alto, CA), so dass unklare oder ungestützte Haplotyp-Zuordnungen aufgelöst wurden. Eindeutige und nicht rekombinante Haplotypen konnten vertrauenswürdig in allen außer 6 der 282 Familien zugeordnet werden. Die Haplotyp-Daten für diese 276 Familien wurden in der nachfolgenden Datennalyse verwendet.
  • Das IL4R-Gen hat die Eigenschaft, dass viele der SNPs innerhalb des am weitesten 3' gelegenen Exons (Exon 9) liegen, dessen codierender Bereich etwa 1,5 kb lang ist. Wir nutzten dies zur Entwicklung eines Verfahrens zur direkten Haplotyp-Bestimmung von bis zu 5 dieser Exon-9-Allele (d. h. SNPs #3-7), ohne dass man die parentalen Genotypen benötigte. Da viele dieser SNPs die Änderungen zu der Aminosäuresequenz des IL4R-Proteins steuern, codieren verschiedene Haplotypen verschiedene Proteine mit wahrscheinlich verschiedenen Funktionen.
  • Haplotypen in einem Individuum, für das keine parentale Genotyp-Information bekannt ist, können nur eindeutig abgeleitet werden, wenn höchstens eine der SNP-Stellen von diesen heterozygot ist. In anderen Fällen muss die Unklarheit experimentell aufgelöst werden.
  • Wir verwenden zwei allelspezifische Primer mit einem gemeinsamen Primer zur Durchführung der PCR-Reaktionen (mittels Stoffel GoldTM Polymerase) zur gesonderten Amplifikation der DNA aus jedem Chromosom, wie in der nachstehenden 1 gezeigt. Die Allele auf jedem Amplikon werden dann durch das gleiche Streifenhybridisierungsverfahren nachgewiesen, und die verknüpften Allele werden direkt angesprochen. Die Wahl der allelspezifischen (farbigen oder schattierte Pfeile) und der allgemeinen (schwarze Pfeile) Primer hängt davon ab, welche SNP Loci heterozygot sind. Die Primer werden am 5'-Phosphat durch Konjugation mit Biotin modifiziert und sind in der Tabelle 12 gezeigt (SEQ ID NR: 54–62).
  • Für jeden Haplotyp-Bestimmungstest, werden zwei PCR-Reaktionen für jede zu untersuchende DNA durchgeführt. Eine Reaktion enthält den allgemeinen Primer und die Wildtyp-allelspezifischen Primer, die andere enthält den allgemeinen Primer und den varianten allelspezifischen Primer. Jede PCR-Reaktion erfolgt in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 50 bis 100 ml, das die folgenden Reagenzien enthielt:
    0,2 ng/ml gereinigte genomische DNA aus Mensch.
    0,2 mM jedes Primers
    800 mM Gesamt dNTP (jeweils 200 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
    10 mM KCl
    10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0
    2,5 mM MgCl2
    0,12 Units/ml Stoffel GoldTM DNA-Polymerase
  • Die Amplifikation erfolgt in einem GeneAmp 7 PCR System 9600 Thermocycler (PE Biosystems, Foster City, CA), mit dem nachstehend gezeigten spezifischen Temperaturzyklenprofil:
    Vorreaktionsinkubation: 94°C für 12,5 min
    33 Zyklen: Denaturieren: 95°C für 45 sec
    Annealing: 64°C für 30 sec
    Verlängern: 72°C für 45 sec
    Endverlängerung: 72°C für 7 min
    Halten: 10°C–15°C
  • Nach der Amplifikation wird jede PCR-Produktreaktion denaturiert und getrennt zur Hybridisierung an die membrangebundenen Sonden wie oben beschrieben verwendet.
  • Haplotyp-Sharing in betroffenen Geschwistern
  • Ein Beweis für die Verknüpfung von IL4R mit Diabetes Typ 1 (im Gegensatz zu Assoziation) kann durch das Haplotyp-Sharing-Verfahren bestimmt werden. Dieses Verfahren bestimmt die Verteilung über alle Familien der Anzahl von Chromosomen, die gemäß Abstammung zwischen den beiden betroffenen Geschwistern in jeder Familie identisch sind (IBD). Wenn beispielsweise in einer Familie der Vater an beide Kinder den gleichen seiner beiden IL4R-Haplotypen überträgt, und die Mutter an beide Kinder den gleichen ihrer beiden IL4R-Haplotypen überträgt, so heißt dies, das die Kinder zwei Chromosomen IBD teilen (oder dass IBD = 2 ist). Übertragen beide Eltern verschiedene Haplotypen an ihre beiden Kinder sind die Kinder sozusagen IBD = 0.
  • Unter der Nullhypothese ohne Verknüpfung des IL4R mit Diabetes Typ 1 ist der Anteil der Familien mit IBD = 0 gleich 25%, IBD = 1 ist gleich 50% und IBD = 2 ist gleich 25%, wie es durch statistische Zuordnung erwartet wird (siehe Tabelle 13). Ein Beweis für einen statistisch signifikanten Unterschied von dieser Erwartung kann mit der Chi-Quadrat-Statistik erfolgen.
  • Die Werte für die Identität gemäß Abstammung (IBD) der parentalen IL4R-Haplotypen in den betroffenen Geschwistern konnte eindeutig in 256 Familien bestimmt werden. Im Rest der Familien waren eine oder zwei Eltern homozygot und/oder die Parentalquelle für die Chromosomen der Kinder konnte nicht bestimmt werden. Die Verteilung von IBD ist in der Tabelle 13 gezeigt.
  • Der HLA-Genotyp kann auf die Gefährdung durch Diabetes Typ 1 eine signifikante Wirkung haben, und zwar je nach dem Genotyp entweder erhöht oder gesenkt. Insbesondere Individuen mit dem HLA DR-Genotyp DR3-DQB1*0201/DR4-DQB1*0302 (bezeichnet als DR3/DR4 unten) scheinen die höchste Gefährdung für Diabetes Typ 1 aufzuweisen (siehe Noble, Valdes et al., 1996, Am. J. Hum. Genet. 59: 1134–1148, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist) zu haben. Diese hoch gefährdeten Individuen sind mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 von 15 von Diabetes Typ 1 betroffen. Aufgrund dieser starken Wirkung dieses Genotyps auf die Wahrscheinlichkeit für Diabetes Typ 1 kann die Anwesenheit des DR3/4-Genotyps die Verteilung der IL4R-Allele oder -Haplotypen überdecken.
  • Die Verteilung von IBD in Familien wurde auf der Basis des DR3/4-Genotyps der Kinder in zwei Gruppen geschichtet. Die erste Gruppe enthält die Familien, in denen eine oder beide Geschwister DR3/4 sind ("einer/beide Geschwister DR3/4", n = 119). Die zweite Gruppe enthält die Familien, bei denen kein Kind DR3/4 ist ("Kein Geschwister DR3/4", n = 137). Die IBD-Verteilung in diesen Untergruppen ist in der Tabelle 13 gezeigt. Es gab keine statistisch signifikante Abweichung von der erwarteten Verteilung des IBD-Sharing in der "einer/beide Geschwister DR3/4"-Untergruppe der Familien. Es gibt eine statistisch signifikante Abweichung von der erwarteten Verteilung des IBD-Sharing in der "keine Geschwister DR3/4"-Untergruppe der Familien (Tabelle 13). Dies zeigt, dass es einen Beweis für die Verknüpfung der IL4R-Loci auf IDDM in den "keine Geschwister DR3/4-Familien" gibt.
  • Assoziation durch AFBAC
  • Die Association der IL4R-Haplotypen mit Diabetes Typ 1 wurde mit dem AFBAC(Kontrolle auf der Basis betroffener Familien)-Verfahren bestimmt (Thomson 1995). Im Wesentlichen werden zwei Gruppen von Haplotypen, und die Haplotyp-Häufigkeiten in den Gruppen miteinander wie bei dem Fall/Kontrollschema der Probennahme verglichen. Diese beiden Gruppen sind die Fall-(übertragen) und die Kontroll(AFBAC)-Haplotypen.
  • Die Fall-Haplotypen, nämlich diejenigen, die an die betroffenen Kinder übertragen werden, werden wie folgt gesammelt und gezählt. Für jedes Geschwisterpaar zählen wir ungeachtet des Status der Eltern (homozygot oder heterozygot) alle vier übertragenen Chromosomen. Die Haplotypen in den beiden Geschwistern in einem Paar sind jedoch nicht unabhängig voneinander. Der Weg zur Erzeugung einer statistisch konservativen und gültigen Auszählung ist das Teilen aller Zählungen durch zwei.
  • Die Kontroll(AFBAC)-Haplotypen sind diejenigen, die niemals an das betroffene Kinderpaar übertragen werden (Thomson, 1995). Die AFBAC-Haplotypen ermöglichen eine unbefangene Abschätzung der Kontroll-Haplotyp-Häufigkeiten. AFBACs können nur aus heterozygoten Eltern bestimmt werden, und nur wenn der Elternteil einen Haplotyp an beide Kinder überträgt, wird zudem der niemals übertragene Haplotyp in der AFBAC-Population gezählt. Die AFBAC-Population dient als gut passender Satz von Kontroll-Haplotypen für die Untersuchung.
  • Die Tabelle 14A zeigt den Vergleich der übertragenen und AFBAC-Häufigkeiten für alle HBDI-Haplotypen, die mindestens fünfmal in dem vollständigen Probensatz beobachtet wurden. Jede Zeile veranschaulicht Daten über einen individuellen Haplotyp. Insgesamt wurden jedoch 16 verschiedene Haplotypen in dem HBDI-Datensatz beobachtet, jedoch einige ziemlich selten. Die sieben seltensten Haplotypen sind in der Zeile "Andere" zusammengefasst. Jeder Haplotyp ist durch das Allel aufgeführt, das an jedem der neun IL4R SNPs aufgeführt ist.
  • Die Tabellen 13B und 13C zeigen den Vergleich der übertragenen und AFBAC-Häufigkeiten für alle HBDI-Haplotypen, die in den "einer/beide Geschwister DR3/4" und "keine Geschwister DR3/4"-Familien-Untergruppen beobachtet wurde. Dieses Tabellen zeigen, dass das Schichten der Familien auf der Basis des DR3/4-Genotyps der Kinder die Identifikation der Haplotypen ermöglicht, die mit IDDM assoziiert sind. Insbesondere in der "keine Geschwister DR3/4"-Untergruppe ist ein Haplotyp (der als "2 1 2 2 2 2 2 1" bezeichnet wird) in dem Pool der transmittierten Chromosomen signifikant unterrepräsentiert (P < 0,005)
  • Aus der Information bezüglich der übertragenen und AFBAC-Haplotyp-Häufigkeit in den Tabellen 14B und 14C kann man durch Zählen die Frequenzen der transmittierten und AFBAC-Allele herleiten. Die AFBAC-Analysen von Locus zu Locus sind in den Tabellen 15A und 15B gezeigt.
  • Die Daten in den Tabellen 15A und 15B zeigen, dass es einen statistisch signifikanten Beweis in der "kein Geschwister DR3/4"-Familien-Untergruppe gibt, dass Allele der SNPs Nummer 3, 4, 5, 6, und 7 mit IDDM assoziiert sind. Der Beweis für die Assoziation ist besonders stark für SNP#6. In der "einer/beide Geschwister DR3/4"-Untergruppe besteht der gleiche Trend der allelischen Assoziation, obschon der Trend nicht ganz statistische Signifikanz erreicht.
  • Assoziation durch TDT auf Haplotyp-Basis
  • Die TDT-Analyse kann zum Bestimmen der Transmission (oder Nicht-Transmission) von Haplotypen an Locus 8 aus Eltern betroffener Kindern verwendet werden, sobald die Haplotypen durch molekulare Maßnahmen abgeleitet oder zugeordnet wurden. Die Tabellen 16A, B und C fassen die TDT-Ergebnisse für die HBDI-Familien zusammen. Die Tabelle 16A zählt informative Transmissions-Ereignisse nur für ein Kind (den Probanden) pro Familie, die Tabelle 16B zählt informative Transmissionen auf die beiden primär betroffenen Kinder pro Familie, und Tabelle 16C zählt informative Transmissionen für alle betroffenen Kinder. Der Ergebnisse der Haplotyp TDT an Locus 8 erreicht statistische Signifikanz, wenn alle betroffenen Kinder (2 oder mehr pro Familie) enthalten sind.
  • Die TDT-Analysen können nach dem Schichten auf DR3/4-Genotyp der Kinder an Familien durchgeführt werden. Die Zusammenfassung der Zählungen der informativen Transmissionen für die beiden primär betroffenen Kinder pro Familie, in der "einer/beide Geschwister DR3/4"- und der "keine Geschwister DR3/4"-Untergruppen der Familien sind in den Tabellen 17A bzw. 17B gezeigt. Wie oben veranschaulicht gibt es einen signifikanten Beweis der Verknüpfung von IDDM mit IL4R in der "keine Geschwister DR3/4"-Untergruppe. Die Daten in der Tabelle 17B zeigen, dass es einen signifikanten Beweis für die Assoziation der IL4R-Haplotypen mit IDDM in der Anwesenheit dieser Verknüpfung gibt. Insbesondere in der "keine Geschwister DR3/4"-Untergruppe wird ein Haplotyp (der als "2 1 2 2 2 2 2 1" bezeichnet wird) an betroffene Kinder signifikant unter-transmittiert.
  • Beispiel 6: Assoziation mit Diabetes Typ 1 in Proben von den Philippinen
  • Der Genotyp von Proben aus 183 Individuen von den Philippinen wurde mit dem Umkehr-Line-Blot-Verfahren bestimmt. 89 Individuen haben Diabetes Typ 1, 94 sind passende Kontrollen.
  • Genotyp-Bestimmungsverfahren
  • Bei diesen Individuen wurden die Genotypen durch die gleichen Verfahren bestimmt, wie oben für die HBDI-Proben beschrieben. Die molekulare Haplotyp-Bestimmung der IL4R SNPs wurde ebenfalls wie oben beschrieben durchgeführt.
  • Statistische Verfahren und Algorithmen
  • Die Allel- und Haplotyp-Häufigkeiten zwischen den Gruppen wurden mit dem z-Test verglichen. Die Haplotyp-Zusammensetzungen und Häufigkeiten wurden aus den Genotyp-Daten mit dem Arlequin-Programm bestimmt (L. Excoffier, Universität Genf, CH) Excoffier und Slatkin 1995, Slatkin und Excoffier, 1996).
  • Ergebnisse
  • Die Wildtyp-Allel-Häufigkeiten für jeden der 8 IL4R SNPs in der Philippinischen Kontrolle und in der Diabetes-Gruppen sind in der Tabelle 18 gezeigt. Die Tabelle 18 beweist, dass die Allelhäufigkeiten für SNPs #3 und 4 zwischen den beiden Gruppen signifikant verschieden sind, und legen eine Assoziation mit IDDM nahe.
  • Man kann die Multi-Locus-Haplotypen in den Individuen von den Philippinen auch ableiten und konstruieren, und zwar entweder mit dem Computer durch die Bestimmung der Maximalen Wahrscheinlichkeit (MLE) oder durch die zuvor beschriebenen molekularen Haplotyp-Bestimmungsverfahren. Die Tabelle 19 führt die 5 häufigsten mit dem Computer errechneten Haplotypen und ihre Häufigkeiten bei den philippinischen Diabetikern und Kontrollen auf und liefert die Signifikanz der Unterschiede der Häufigkeiten.
  • Die Tabelle 20 führt die beobachteten Haplotypen auf, wie sie durch molekulare Haplotyp-Bestimmung hergeleitet und abgeleitet wurden; die eindeutigen Haplotypen an Locus 7 (SNP#1 Allel nicht gezeigt, wie durch das "x" gezeigt) werden erstellt. Die Tabellen 18 und 19 beweisen jeweils einen statistisch signifikanten Unterschied in der Häufigkeit von einem oder mehreren Haplotypen zwischen der philippinischen Kontrolle und den Diabetes-Populationen und unterstützen die Anwesenheit einer Assoziation von IL4R mit IDDM. Insbesondere der Haplotyp (der als "x 1 2 2 2 2 2 1" bezeichnet wird, ist in der philippinischen Diabetes-Gruppe signifikant unterrepräsentiert.
  • Literatur
    • Devlin, B. und N. Risch (1995). "A comparison of linkage disequilibrium measures for fine scale mapping." Genomics 29(2): 311–22.
    • Excoffier, L. und M. Slatkin (1995). "Maximum-likelihood estimation of molecular haplotype frequencies in a diploid population." Mol Biol Evol 12(5): 921–7.
    • Glantz, S. A. (1997). Primer of biostatistics. New York, McGraw-Hill Health Professions Division.
    • Hill, W. G. (1974). "Estimation of linkage disequilibrium in randomly mating populations." Heredity 33(2): 229–39.
    • Kruglyak, L., M. J. Daly, et al. (1996). "Parametric and nonparametric linkage analysis: a unified multipoint approach." Am J Hum Genet 58(6): 1347–63.
    • Noble, J. A., A. M. Valdes, et al. (1996). "The role of HLA class II genes in insulin dependent diabetes mellitus: molecular analysis of 180 Caucasian, multiplex families." Am J Hum Genet 59(5): 1134–48.
    • Slatkin, M. und L. Excoffier (1996). "Testing for linkage disequilibrium in genotypic data using the Expectation-Maximization algorithm." Heredity 76 (Pt 4): 377–83.
    • Spielman, R. S. und W. J. Ewens (1996). "The TDT and other family-based tests for linkage disequilibrium and association." Am J Hum Genet 59(5): 983–9.
    • Spielman, R. S. und W. J. Ewens (1998). "A sibship test for linkage in the presence of association: the sib transmission/disequilibrium test." Am J Hum Genet 62(2): 450–8.
    • Spielman, R. S., R. E. McGinnis, et al. (1993). "Transmission test for linkage disequilibrium: the insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM)." Am J Hum Genet 52(3): 506–16.
    • Thomson, G. (1995). "Mapping disease genes: family-based association studies." Am J Hum Genet 57(2): 487–98.
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • TABELLE 5
    SNP Betroffene Genotypen (n = 89) Kontroll-Genotypen (n = 94)
    A398G (50 I/V) AA = 21 (0.236) AG = 40 (0.449) GG = 28 (0.315) AA = 32 (0.340) AG = 41 (0.436) GG = 21 (0.223)
    C676G (142 N/N) CC = 89 (1) CC = 92 (0.979) CG = 2 (0.021)
    A1374C (375 E/A) AA = 70 (0.787) AC = 17 (0.191) CC = 2 (0.023) AA = 55 (0.630) AC = 30 (0.341) CC = 3 (0.034)
    G1417T (389 L/L) GG = 78 (0.876) GT = 10 (0.112) TT = 1 (0.011) GG = 63 (0.670) GT = 29 (0.309) TT = 2 (0.022)
    T1466C (406 C/R) TT = 70 (0.787) TC = 17 (0.191) CC = 2 (0.023) TT = 60 (0.638) TC = 32 (0.340) CC = 2 (0.022)
    T1682C (478 S/P) TT = 70 (0.787) TC = 17 (0.191) CC = 2 (0.023) TT = 61 (0.649) TC = 31 (0.330) CC = 2 (0.022)
    A1902G (551 Q/R) AA = 50 (0.562) AG = 35 (0.393) GG = 3 (0.034) AA = 54 (0.532) AG = 36 (0.383) GG = 8 (0.085)
    T2531C (761 S/P) TT = 89 (1) TT = 94 (1)
    SNP # LOCUS SNP Variation Genbank Zugriffs #.
    1 IL4R A398G I50V X52425
    2 IL4R C676T N142N X52425
    3 IL4R A1374C E375A X52425
    4 IL4R G1417T L389L X52425
    5 IL4R T1466C C406R X52425
    6 IL4R T1682C S478P X52425
    7 IL4R A1902G Q551R X52425
    8 IL4R T2531C S761P X52425
    Tabelle 6: Erfasste SNPs
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
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  • Figure 00550001
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  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
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  • Figure 00670001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
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  • Figure 00900001

Claims (21)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Gefährdung eines Individuums durch Diabetes Typ 1, bei dem man das Vorliegen eines mit IDDM assoziierten IL4R-Allels in einer Nukleinsäureprobe des Individuums nachweist, wobei das Vorliegen dieses Allels die Gefährdung des Individuums durch Diabetes Typ 1 anzeigt, und wobei das Allel dadurch nachgewiesen wird, daß man die Nukleinsäureprobe mit einem oder mehreren sequenzspezifischen Oligonukleotiden, das/die fähig ist/sind, mit einem oder mehreren in Tabelle 2 angeführten Polymorphismen zu hybridisieren, in Kontakt bringt und das hybridisierte sequenzspezifische Oligonukleotid nachweist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Gefährdung durch Diabetes Typ 1 um eine erhöhte Gefährdung handelt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das mit der Krankheit assoziierte Allel ein prädisponierendes Allel ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Gefährdung durch Diabetes Typ 1 um eine verringerte Gefährdung handelt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das mit der Krankheit assoziierte Allel ein schützendes Allel ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäureprobe DNA umfaßt.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäureprobe RNA umfaßt.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäureprobe amplifiziert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Nukleinsäureprobe durch eine Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Allel durch Amplifikation nachgewiesen wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Allel durch eine Polymerasekettenreaktion nachgewiesen wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Allel durch Sequenzieren nachgewiesen wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eine bzw. die mehreren sequenzspezifische(n) Oligonukleotid(e) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 der in Tabelle 2 angeführten SNPs umfaßt/umfassen.
  14. Verwendung eines Kits zur Bestimmung der Gefährdung eines Individuums durch Diabetes Typ 1, wobei das Kit folgendes umfaßt: (a) ein oder mehrere sequenzspezifische(s) Oligonukleotid(e), die jeweils einzeln eine Sequenz umfassen, die zu einer Sequenz in einem mit IDDM assoziierten in Tabelle 2 angeführten IL4R-Allel vollständig komplementär ist, wobei diese Sequenz einen oder mehrere mit dem Allel assoziierte Polymorphismen umfaßt, und (b) Anweisungen zur Verwendung des Kits zur Bestimmung der Gefährdung des Individuums durch Diabetes Typ 1.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Kit zusätzliche Sequenzier-Primer enthält.
  16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei eine oder mehrere sequenzspezifische Oligonukleotide des Kits markiert sind.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Kit ein Mittel zum Nachweisen der Markierung beinhaltet.
  18. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren sequenzspezifischen Oligonukeotide des Kits jeweils einzeln zu einer Sequenz in einem prädisponierenden IL4R-Allel komplementär sind.
  19. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren sequenzspezifischen Oligonukeotide des Kits jeweils einzeln zu einer Sequenz in einem schützenden IL4R-Allel komplementär sind.
  20. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren sequenzspezifischen Oligonukeotide des Kits 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 der in Tabelle 2 angeführten SNPs umfassen.
  21. In-vitro-Verwendung von einem oder mehreren in Tabelle 2 angeführten SNPs für die Bestimmung der Gefährdung eines Individuums durch Diabetes Typ 1.
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