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BEREICH DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verstärken der Effizienz eines enzymatischen
Reinigungsverfahrens, z.B., durch Erhöhen der Temperatur zwischen
aufeinanderfolgenden enzymatischen Reinigungsschritten.
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HINTERGRUND
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Wenn
Fluid-Arbeitsschritte durchgeführt
werden in kleinen Reaktionsplatten, wie etwa Mikrotiterplatten,
wird typischerweise eine biologische Reaktion in jeder Vertiefung
der Platte durchgeführt.
Einige Verfahren jedoch erfordern aufeinanderfolgende Reaktionen,
wobei die Reaktanten oder Produkte einer oder mehrerer davon inkompatibel
sein können
mit nachfolgenden Reaktionen, wodurch die Einführung von Zwischenverfahren
erforderlich wird, worin solche ungewünschten Reaktanten oder Produkte
entfernt oder inaktiviert werden. Zum Beispiel erfordert das Genotypisierungsverfahren
durch die Einzelbaseextensionsmethode drei biologische Reaktionen (d.h.
Polymerasekettenreaktion (PCR), enzymatische Reinigung und Mikrosequenzieren
(MIS)). Es ist effizient und vorteilhaft zwei oder mehr dieser aufeinanderfolgenden
Reaktionen in der gleichen Vertiefung (well) einer einzelnen Mikrotiterplatte
durchzuführen,
wobei jedoch ein Hauptproblem beim Durchführen aufeinanderfolgender Reaktionen
in einer einzelnen Vertiefung Interreaktionsverunreinigung ist, d.h.
die Verunreinigung von nachfolgenden Reaktionen durch Biomoleküle aus früheren Reaktionen.
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Zum
Beispiel ist ein Problem, das allgemein mit dem Genotypisieren verbunden
ist, die Verunreinigung durch Deoxynukleotide (dNTPs), die aus Amplifikationsreaktionen,
wie etwa PCR, zurückbleiben von
nachfolgenden Reaktionen, wie etwa Mikrosequenzieren. Um dieses
Problem zu bewältigen,
wird typischerweise ein enzymatischer Reinigungsschritt durchgeführt, in
welchem Enzyme, wie etwa alkalische Phosphatase, zugegeben werden,
um dNTPs zu entfernen, die von der PCR zurückbleiben. Die Effizienz solcher
enzymatischer Reinigungsreaktionen ist kritisch, da dNTPs, die in
der Mikrosequenzierungsreaktion vorliegen, den Mikrosequenzierungsprimer über die
SNP-Stelle hinaus extendieren können,
wobei es ermöglicht
wird, dass das markierte ddNTP stromabwärts des SNP eingebaut wird,
was zu Fehlern beim Genotypisieren führt. Ähnliche Probleme können mit
jedem Verfahren verbunden sein, das aufeinanderfolgende enzymatische
Reaktionen umfasst. Um solche Probleme zu lösen, kann die Dauer des enzymatischen
Reinigungsschritts ausgedehnt werden, die Menge alkalischer Phosphatase kann
erhöht
werden oder das Reaktionsgemisch kann zwischen aufeinanderfolgenden
Reaktionsschritten transferiert werden, wobei bisher in der Praxis
keine dieser potenziellen Lösungen
erfolgreich war beim Eliminieren des Verunreinigungsproblems.
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Es
besteht eindeutig ein großer
Bedarf in der Technik für
neue Verfahren zum Verringern der Verunreinigung aufeinanderfolgender
Reaktionen in experimentellen biologischen Verfahren. Die vorliegende
Erfindung richtet sich auf diese und andere Erfordernisse.
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Die
vorliegende Erfindung liefert neue Verfahren zum Erhöhen bzw.
Verstärken
der Effizienz biologischer Verfahren, die aufeinanderfolgende enzymatische
Reaktionen umfassen, im Besonderen, worin das Vorliegen von einem
oder mehreren Reaktanten oder Produkten einer Reaktion nachteilig
sind für ein
oder mehrere nachfolgende Reaktionen. Die vorliegende Erfindung
basiert auf der Entdeckung, dass ein primäres Hindernis früherer Verfahren,
die verwendet wurden zum Eliminieren von Interreaktionsverunreinigung,
wie etwa enzymatische Reinigungsverfahren, die Adsorption von potenziellen
Verunreinigungen an hydrophobe Oberflächen oder an Luft/Flüssigkeit-
oder Flüssigkeit/Flüssigkeit-Grenzflächen ist.
Diese Adsorption verringert die Zugangsmöglichkeit auf die Verunreinigungen
durch die Mittel (z.B. Enzyme), die verwendet werden, um sie zu
eliminieren, wobei die Effizienz des Verunreinigungsentfernungsverfahrens
erniedrigt wird. Zum Beispiel macht die Adsorption von dNTPs, die
während
des ersten Schritts eines Genotypisierungsverfahrens (z.B. PCR)
zugegeben werden, an die Oberfläche
einer Mikrotiterplatte sie weniger zugänglich für alkalische Phosphatase (z.B.
SAP) während
eines nachfolgenden enzymatischen Reinigungsschritts und die adsorbierten
dNTPs werden daher nicht dephosphoryliert. Da sich dNTPs von der
Oberfläche
der Mikrotiterplatte bei hoher Temperatur lösen (z.B. während der Denaturierung von
EXO- und SAP-Enzymen oder während
des Temperaturzyklisierens der MIS-Reaktionen) können sie dramatisch den dritten Schritt
des Genotypisierungsverfahrens (d.h. MIS) verunreinigen. Zusätzlich führt Adsorption
von Biomolekülen
an die Oberfläche
einer Mikrotiterplatte häufig
zu einer verringerten Ausbeute biologischer Reaktionen. Diese Verunreinigung
und verringerte Ausbeute wird noch signifikanter wenn Reaktionen
in sehr kleinen Volumina (z.B. High-density-Platten) durchgeführt werden, da die Anzahl von
Wechselwirkungen von Molekülen
aus der Masselösung
mit Oberflächen
rasch zunimmt, wenn das Reaktionsvolumen abnimmt.
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In
einigen Fällen
werden Reaktionsgemische auf eine neue Mikrotiterplatte übergeführt zwischen den
beiden aufeinanderfolgenden Reaktionen. Zum Beispiel im Falle eines
Genotypisierungsverfahrens kann PCR in einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden
und enzymatische Reinigung, gefolgt von MIS, wird in einer anderen
Mikrotiterplatte durchgeführt. Jedoch,
während
dies eine Verbesserung gegenüber traditionellen
Verfahren darstellt, worin alle Reaktionen in einer einzelnen Vertiefung
durchgeführt
werden, ist dieses Verfahren nicht vollständig effektiv beim Eliminieren
von Verunreinigungen, da viele MIS-Reaktionen nichtsdestotrotz verunreinigt
werden durch verbleibende dNTPs aus PCR-Reaktionen. Ebenfalls verringert der
Transfer der Proben die Ausbeute von MIS-Reaktionen. Darüber hinaus
ist es technisch mehr geeignet und billiger ein Verfahren zu verwenden,
das den Transfer von Proben zu einer neuen Mikrotiterplatte nicht
erfordert.
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Um
die oben beschriebenen Probleme zu lösen, liefert die vorliegende
Erfindung eine neue Methode zum Durchführen von Verfahren, wie etwa
enzymatischer Reinigung, worin ein zusätzlicher Schritt bei erhöhter Temperatur
in das Verfahren aufgenommen wird. Dieser Schritt bei erhöhter Temperatur
fördert
die Desorption von Reaktanten und Produkten von Oberflächen und
Grenzflächen,
wobei die Effizienz des Verfahrens verstärkt wird.
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Demgemäß umfasst
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verstärken der
Effizienz eines enzymatischen Reinigungsverfahrens. Dieses Verfahren
ist geeignet zum Verringern der Adsorption eines Reaktanten oder
eines Produkts, das aus einem früher
durchgeführten
Fluidarbeitsschritt zurückbleibt,
an eine Oberfläche
oder Grenzfläche
während enzymatischer
Reinigung durch Erhöhen
der Temperatur, wobei die Zugriffsmöglichkeit auf den Reaktanten
oder das Produkt für
das Enzym erhöht
wird und sein Abbau oder seine Inaktivierung erleichtert wird.
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Die
Erfindung umfasst weiterhin allgemeine Methoden zum Durchführen von
biologischen Verfahren auf Oberflächen, sodass die Adsorption
von ungewünschten
Komponenten aus einem oder mehreren Schritten des Verfahrens an
die Oberfläche oder
Grenzfläche
minimiert wird, durch Erhöhen
der Temperatur zwischen den Schritten. In anderen Worten, wird das
Verfahren, das typischerweise ein oder mehrere nicht wiederholte
Schritte umfasst, nun in einer zyklischen Art durchgeführt, worin
jeder Zyklus einen zusätzlichen
Schritt umfasst, in welchem die Temperatur erhöht wird über die optimale Temperatur für die anderen,
vorausgehenden nicht wiederholten Schritte. Auf diese Art wird die
Adsorption von bestimmten Komponenten des Verfahrens an eine hydrophobe
Oberfläche,
z.B. die Oberfläche
einer Mikrovertiefungsplatte oder an eine Grenzfläche z.B. eine
Luft/Luft- oder Luft/Flüssig-Grenzfläche, verringert.
Diese biologischen Verfahren können,
ohne darauf begrenzt zu sein, Reaktionen, Inkubationen, Verdünnungen,
Titrationen, Reinigungen, Nachweise, Mischen und Arzneimittelscreeningassays
umfassen. Weiterhin kann in bestimmten Ausführungsformen dieses zyklische
Verfahren, das einen Schritt bei erhöhter Temperatur umfasst, durchgeführt werden
vor oder nachfolgend auf andere biologische Verfahren, wie etwa
Amplifikationsreaktionen, Sequenzierungsreaktionen oder Genotypisierungsverfahren,
wie etwa Mikrosequenzierungs- oder Primerextensionsreaktionen. Es
wird jedoch zu einzuschätzen
sein, dass das zyklische biologische Verfahren, das den Schritt
bei erhöhter
Temperatur umfasst, keine Polymerasekettenreaktion (PCR) ist.
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In
einer ersten Hinsicht umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Verstärken der
Effizienz eines enzymatischen Reinigungsverfahrens, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfasst:
- a) Inkubieren
auf einer hydrophoben Oberfläche eines
Reaktionsgemischs, umfassend einen Reaktanten oder ein Produkt aus
einer früher
durchgeführten
Reaktion und ein Enzym, das in der Lage ist zum Zerstören oder
Inaktivieren des Reaktanten oder des Produkts, bei einer ersten
Temperatur, die optimal für
die Aktivität
des Enzyms ist;
- b) Erhöhen
der Temperatur des Reaktionsgemischs auf eine zweite Temperatur,
die höher
ist als die erste Temperatur, jedoch bei welcher eine wesentliche
Menge des Enzyms nicht denaturiert wird, wobei die Adsorption des
Reaktanten oder des Produkts an die Oberfläche verringert wird und wodurch
seine Zugänglichkeit
für das
Enzym erhöht
wird;
- c) Wiederholen der Schritte a) und b) bis eine gewünschte Menge
des Reaktanten oder des Produkts zerstört oder inaktiviert worden
ist; und optional
- d) Erhöhen
der Temperatur des Reaktionsgemischs auf eine dritte Temperatur,
die ausreichend ist, um das Enzym zu denaturieren. Es wird einzuschätzen sein,
dass das enzymatische Reinigungsverfahren keine Polymerasekettenreaktion
(PCR) ist.
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In
einer anderen Hinsicht umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Verstärken der
Effizienz eines enzymatischen Reinigungsverfahrens, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfasst:
- a) Inkubieren
eines Reaktionsgemischs, umfassend einen Reaktanten oder ein Produkt
aus einer früher
durchgeführten
Reaktion und ein Enzym, das in der Lage ist zum Zerstören oder
Inaktivieren des Reaktanten oder des Produkts, bei einer ersten
Temperatur, die optimal für
die Aktivität
des Enzyms ist;
- b) Erhöhen
der Temperatur des Reaktionsgemischs auf eine zweite Temperatur,
die höher
ist als die erste Temperatur, jedoch bei welcher eine wesentliche
Menge des Enzyms nicht denaturiert wird, wobei die Adsorption des
Reaktanten oder des Produkts an die Luft/Flüssig- oder Flüssig/Flüssig-Grenzfläche verringert
wird und wobei seine Zugänglichkeit
für das
Enzym erhöht
wird;
- c) Wiederholen der Schritte a) und b) bis eine gewünschte Menge
des Reaktanten oder des Produkts zerstört oder inaktiviert worden
ist; und
- d) Erhöhen
der Temperatur des Reaktionsgemischs auf eine dritte Temperatur,
die ausreichend ist, um das Enzym zu denaturieren. Es wird einzuschätzen sein,
dass alle oben beschriebenen Ausführungsformen diesem Aspekt
der Erfindung gleichermaßen
entsprechen.
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In
einer anderen Hinsicht umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Optimieren
eines enzymatischen Reinigungsverfahrens, umfassend die Schritte:
a) Durchführen
des enzymatischen Reinigungsverfahrens, umfassend den Reaktanten
oder das Produkt auf einer Oberfläche; b) Erhöhen der Temperatur des enzymatischen
Reinigungsverfahrens auf mehrere Temperaturen; c) Wiederholen der
Schritte a) und b); d) Bestimmen der Menge des Reaktanten oder des
Produktes, die an die Oberfläche
der Fläche adsorbiert
ist oder der Ausbeute des enzymatischen Reinigungsverfahrens; und
e) Bestimmen der optimalen Temperatur zum Erhalten der geringsten
Adsorptionsmenge des Reaktanten oder des Produktes an die Oberfläche oder
der höchsten
Ausbeute des enzymatischen Reinigungsverfahrens.
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In
einer anderen Hinsicht liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Bestimmen einer Temperatur zum Optimieren eines enzymatischen Reinigungsverfahrens,
umfassend die Schritte a) Durchführen
des oben beschriebenen Verfahrens zum mehrfachen Verstärken der
Effizienz einer enzymatischen Reinigungsreaktion, worin für jedes
Mal die zweite Temperatur verschieden ist; b) Vergleichen der relativen
Menge des Reaktanten oder Produkts, die in jeder der Reaktionsgemische
am Ende jeder Zeit verbleibt; und c) Bestimmen der zweiten Temperatur,
bei welcher die verbleibende Menge Reaktant oder Produkt am geringsten
ist.
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Für einen
beliebigen der Aspekte der vorliegenden Erfindung ist in einer Ausführungsform
die Oberfläche
hergestellt aus einem beliebigen aus einer Vielzahl von Materialien,
einschließlich,
ohne darauf begrenzt zu sein, Silikon, Kunststoff, Quarz, Glas, Keramik,
oder einer Kombination aus beliebigen dieser oder anderer Materialien.
Vorzugsweise ist der Kunststoff ein hydrophobes Polymer, wie etwa
Polystyrol, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid,
Polymethylpenten, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfon, Polystyrol,
Fluorpolymere, Polyamide, Silikone und Elastomere. In einer Ausführungsform
ist die hydrophobe Oberfläche
ein Teil einer Mikrotiterplatte, einer Mikrofluidvorrichtung, eines
Reagenzglases, einer Platte mit mehreren Vertiefungen, einer Reaktionsvertiefung
oder eines Eppendorf-Röhrchens.
Vorzugsweise ist die Mikrotiterplatte eine Polypropylenmikrotiterplatte.
Mikrotiterplatten der Erfindung sind vorzugsweise High-density-Mikrotiterplatten,
wie etwa Mikrotiterplatten mit 96, 384, 1536 oder mehr Vertiefungen.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist der Reaktant oder das Produkt eine biologische Verbindung (einschließlich natürliche oder
nichtnatürliche
Verbindungen, die verwendet werden können in einer biologischen
Reaktion, wie etwa einem beliebigen molekularbiologischen Verfahren),
wie etwa dNTP oder ddNTP. In einer anderen Ausführungsform ist die früher durchgeführte Reaktion
eine Amplifikationsreaktion und das Enzym eine alkalische Phosphatase, z.B.
alkalische Phosphatase aus Garnelen. In einer anderen Ausführungsform
umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt des Durchführens einer
nachfolgenden Reaktion auf der hydrophoben Oberfläche, umfassend
das Reaktionsgemisch, worin die Reaktion inhibiert wird durch das
Vorliegen des Reaktanten oder des Produkts. In einer solchen Ausführungsform ist
die nachfolgende Reaktion eine Genotypisierungsreaktion, wie etwa
eine Mikrosequenzierungsreaktion. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird jede dieser Reaktionen (z.B. die vorhergehenden und nachfolgenden
Reaktionen als auch die Verfahren, die durch die vorliegenden Methoden
umfasst sind), auf einer einzelnen Oberfläche durchgeführt, z.B.
in einer einzelnen Vertiefung, einem einzelnen Rohr oder Kanal.
In einer noch weiteren Ausführungsform
ist das Volumen des Reaktionsgemisches weniger als 50, 40, 30, 20,
15, 10, 8, 5, 4, 3, 2 oder 1 Mikroliter. In einer weiteren Ausführungsform
ist die erste Temperatur 37°C.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die zweite Temperatur
mindestens 10°C
höher als
die erste Temperatur. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die dritte Temperatur
94°C.
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Die
vorliegende Erfindung liefert auch Kits, Vorrichtungen und Geräte zum Durchführen der
hier beschriebenen Verfahren.
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Eine
andere Möglichkeit
zum Verhindern von Verunreinigung, die in Verbindung mit der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann, ist die Beschichtung der Oberfläche mit
einem Polymer, um Adsorption von wertvollen Biomolekülen zu verhindern,
wie in PCT/US01/42631 beschrieben, wobei die gesamten Lehren hiervon
hier durch Bezugnahme offenbart werden.