DE60217142T2

DE60217142T2 - Mutierter lactococcus-stamm

Info

Publication number: DE60217142T2
Application number: DE60217142T
Authority: DE
Inventors: Ulrika Andersson; Peter RADSTRÖM
Original assignee: Forskarpatent I SYD AB
Current assignee: Forskarpatent I SYD AB
Priority date: 2001-10-03
Filing date: 2002-10-03
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2022-10-04
Also published as: WO2003029440A1; US20040259200A1; SE0103294D0; ATE349512T1; DE60217142D1; US20060270011A1; CA2462489A1; US7537925B2; EP1432789A1; EP1432789B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen, Lactat produzierenden Stamm, der zur Gattung der Lactokokken gehört, und zwar die Mutante von Lactococcus lactis spp. lactis 19435 (von ATCC erhalten), sowie auch die Verwendung dieser Mutante für die Lactatproduktion und ein Verfahren zum Herstellen von Lactat.
Allgemeiner Stand der Technik
Milchsäure ist eine natürlich vorkommende organische Säure, die entweder durch chemische Synthese oder Kohlehydratfermentation erzeugt werden kann. Diese beiden Herstellungswege werden kommerziell angewendet (Datta (1995)). Die chemische Synthese führt zu racemischer Milchsäure, wohingegen Fermentationstechnologien die Synthese eines gewünschten Stereoisomers von Milchsäure ermöglichen.
In der Literatur gibt es verschiedene Dokumente, die die Stoffwechseltechnik von Milchsäurebakterien betreffen, um deren Fähigkeit zur Milchsäureproduktion aus unterschiedlichen Kohlehydraten zu bewerten und zu verbessern. Bereits existierende kommerzielle Herstellungsverfahren verwenden homofermentative Milchsäurebakterien, wie Lactobacillus delbrueckii und Lb. bulgaricus (Datta (1995)).
Lactococcus lactis ist einer der am häufigsten untersuchten Organismen, die für industrielle Zwecke verwendet werden. L. lactis fermentiert Glucose auf dem homofermentativen Weg unter Bedingungen mit uneingeschränkter Glucose (Sjörberg (1995)). Dieser Organismus produziert primär das L-Isomer von Milchsäure, das bei mit Lebensmitteln verbundenen Anwendungszwecken bevorzugt wird, da das D-Isomer für den Menschen schädlich ist (Hofvendahl (1997)). Die postglycolytischen Pyruvatstoffwechselwege spielen bei der Bestimmung des Resultats der Fermentation von L. lactis eine Schlüsselrolle.
Die Aktivitäten von Pyruvat umwandelnden Enzymen ändern sich mit unterschiedlichen Züchtungsbedingungen, die zu bedeutenden Änderungen bei der Erzeugung des Endproduktes führen (Cocaign-Bousquet (1996)) (und dort genannte Dokumente). In dieser Untersuchung beschreiben wir eine Mutante von Lactococcus lactis spp. lactis, die unter Bedingungen mit uneingeschränkter Glucose Lactat doppelt so schnell wie der Wildstamm produzieren kann. Unser Dokument betrifft eine physiologische und biochemische Charakterisierung des mutanten Lactokokkenstamms, um Unterschiede bei der Glucoseaufnahme und Aktivitäten von wichtigen Enzymen, die an der Glycolyse und Pyruvatumwandlung beteiligt sind, im Vergleich mit dem Wildstamm zu bewerten.
Milchsäure ist eine Chemikalie, die in der Lebensmitteltechnologie sowie auch in der allgemeinen chemischen Industrie verwendet wird, wozu die Polymertechnologie gehört. Folglich kann sie für die Herstellung von Polymeren verwendet oder hydriert werden, so daß Propylenglycol und andere chemische Kohlenstoffzwischenprodukte erzeugt werden. Milchsäure ist für die Herstellung von biologisch kompatiblen und zersetzbaren Polymeren, Polymilchsäure (PLA), von Interesse, die für die Herstellung von Nähten oder Implantaten verwendet werden, d.h. die in der medizinischen und veterinären Chirurgie benutzt werden sollen.
In der ganzen Welt werden jedes Jahr 50 000 t Lactat produziert, womit deutlich wird, daß es ein relativ interessantes Produkt ist. Zwei Drittel werden aus Fermentationsprozessen gewonnen, wohingegen ein Drittel aus einer synthetischen Produktion hauptsächlich aus Lactonitril stammt. Der Nachteil der Anwendung einer synthetischen Produktion besteht darin, daß das gewonnene Lactat ein Racemat ist, d.h. es enthält gleiche Mengen von L- und D-Isomeren in einem Gemisch. Der Nachteil eines Racemats besteht darin, daß es bei einer solchen Verwendung beträchtlich schwerer ist, das Lactat zu polymerisieren. Reine D- oder L-Lactatpolymere sind kristallin und stabil, wohingegen Polymere von Gemischen amorph sind.
Milchsäure ist eine teure Chemikalie, wenn sie durch Fermentation von verschiedenen Milchsäure produzierenden Mikroorganismen produziert wird, da die Fermentation Lactat, d.h. ein Salz von Milchsäure, produziert, das aus der Fermentationslösung gewonnen werden muß, die auch Proteine und Milchsäure produzierende Zellen enthält. Um Milchsäure und/oder Lactat zu produzieren, die kostengünstiger sind, muß die Fermentation einen Mikroorganismus verwenden, der eine hohe Lactatkonzentration erzeugt, die als Gesamtkonzentration, jedoch auch als spezifische Produktivität (Q_S), d.h. Gramm pro Gramm Substrat, und volumetrische Produktivität (Q_V), d.h. Gramm pro Liter Lösung pro Stunde, angegeben wird.
Milchsäure liegt in zwei optisch isomeren Formen, L-Milchsäure und D-Milchsäure, vor. Da D-Milchsäure für den Menschen toxisch ist und bei Lebensmittelzwecken nicht vorhanden sein sollte, besteht ein Bedarf an einer erhöhten Produktion von L-Milchsäure. Milchsäure wird während der Fermentation durch ein Enzym, Lactat-Dehydrogenase, LDH, produziert. LDH liegt in zwei Formen vor, L-LDH für die Produktion von L-Lactat und D-LDH für die Produktion von D-Lactat. Die Lactokokken produzieren und aktivieren folglich die D-LDH, d.h. die das D-Isomer produzierende Lactat-Dehydrogenase.
Die US-A-4,885,247 betrifft ein Verfahren zum Gewinnen und Reinigen von Lactatsalzen aus der gesamten Fermentationslösung unter Anwendung der Elektrodialyse, wobei angegeben wird, daß das Verfahren das Lactat effizient als konzentrierte Flüssigkeit gewinnt. Das gewonnene Lactat wird dann in Milchsäure umgewandelt.
Sjöberg, A., Persson, L., Quednau, M. und Hahn-Hägerdahl, B. erläutern in Applied Microbiology and Biotechnology 42 (6):931–938 (1995) den Einfluß von Bedingungen mit eingeschränkten und uneingeschränkten Kohlehydraten auf den Glucose- und Maltosestoffwechsel bei den Stämmen Lactococcus lactis spp. lactis. In diesem Dokument ist die Lactatproduktion für drei unterschiedliche Lactokokkenstämme beim Wachstum unter Bedingungen mit eingeschränkten und uneingeschränkten Kohlehydraten aufgeführt. Die untersuchten Kohlehydrate sind Maltose und Glucose. Eine Mutante, AS211, wurde nach einer Novobiocinbehandlung aus 19435 erzeugt. AS211 weist bei einer kontinuierlichen Fermentation von Glucose im Vergleich mit dem Stamm 19435 eine 20 % höhere Lactatproduktion auf. AS211 wurde bei D = 0,6 h^-1 gezüchtet.
Die STN-Datenbank, CAPLUS, Acc. No. 1992:549358, L-Lactate production from xylose employing Lactococcus lactis IO-1, Biotechnology Letters, 14(7):599–604 (1992) und die Dialog-Datenbank, Acc. No. 0137847, L-Lactate production from xylose employing Lactococcus lactis IO-1 effect if inoculum C-source, xylose concentration, product inhibition and, mixed substrate on L-Lactic acid production, Biotechnology Letters, 14(7):599–604 (1992) von Ishizaki, A. et al. betreffen die Arbeit mit Lactococcus lactis IO-1 in bezug auf unterschiedliche Parameter, die die Produktion von L-Lactat aus einem Gemisch von Glucose und Xylose beeinflussen können.
Die Basis für diese Untersuchung bestand in der Erforschung, ob die Produktion von L-Lactat optimiert werden kann, wenn ein kostengünstiges Ausgangsmaterial, wie Lignocellulose-Hydrolysat, verwendet wird. Lignocellulose-Hydrolysat enthält sowohl Xylose als auch Glucose, die für die Umwandlung in L-Lactat verwendet werden. Bei Verwendung eines Gemischs von Glucose und Xylose beträgt die Produktion von L-Lactat 0,67 Gramm Lactat pro Gramm Zucker. In diesem Dokument gibt es keinen Hinweis darauf, zur welcher Unterart (spp) L. lactis IO-1 gehört.
Die Dialog-Datenbank, Acc. No. 07450183, General character and taxonomic studies of Lactococcus lactis IO-1 JCM 7638, Jour. of the faculty of agricultre, Kyushu University, 35(1-2):1–8 (1990) von Ishazaki, A. et al. betrifft die Kennzeichnung des Stamms L. lactis IO-1, d.h. des vorstehend erläuterten Stamms. In diesem Dokument gibt es keinen Hinweis darauf, zur welcher Unterart (spp) L. lactis IO-1 gehört.
Die Dialog Datenbank, Acc. No. 00324956, Fermentative production of L-lactate from xylose, Conference paper, Developments in food engineering: Proceedings of the 6th International Congress on Engineered Food, Chiba, 2(4):552–554 (1993) von Ueda, T. et al. betrifft L. lactis IO-1. Es wird dessen Fähigkeit zur Produktion von L-Lactat aus Xylose erläutert.
Die STN-Datenbank, CAPLUS Acc. No. 1994:571806, Cloning, sequencing, and comparison of three lactococcal L-lactate dehydrogenases genes, Microbiology 140(6):1301–1305 (1994) von Swindell, S. R., et al. vergleicht DNA-Sequenzen von Genen, die das Enzym L-Lactat-Dehydrogenase (LDH) von verschiedenen Lactokokkenstämmen codieren. Sie beweist, daß die DNA-Sequenzen zwischen den verschiedenen Stämmen sehr gut erhalten bleiben.
Die STN-Datenbank Acc. No. 0167424, Stimulation of the rate of L-lactate fermentation using Lactococcus lactis IO-1 by periodic electrodialysis L-lactic acid and production, Jour. of Fermentation and Bioengineering, 77(5):508–512 (1994) von Vonktaveesuk, P., et al. offenbart die Elektrodialyse der durch Fermentationen mit dem Stamm L. lactis IO-1 erhaltenen Produkte.
Die STN-Datenbank, Acc. No. 1991:523825, Differences between Lactobacillus casei spp casei 2206, and citrate-positive Lactococcus lactis spp. lactis 3022 in the characteristics of diacetyl production, Applied and Environmental Microbiology, 57 (10):3040–3042 (1991) von Kaneko, T., et al. vergleicht Lactokokken, Lactococcus lactis spp. lactis, und Lactobazillen, Lactobacillus casei spp. casei bezüglich der Diacetylproduktion. Tatsächlich wird die LDH-Produktion der beiden Stämme verglichen, wobei der Lactobacillusstamm eine dreimal höhere Produktion von LDH als der Lactokokkenstamm hat. Das verwendete Grundmedium wird nicht offenbart.
Kurze Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Es wurde nunmehr eine neue Mutante des Wildstamms L. lactis spp. lactis 19435 entwickelt, wobei dieser mutante Stamm unter vorgegebenen Bedingungen hohe Konzentrationen von L-Lactat produziert, die sowohl als Q_S als auch Q_V angegeben werden. Diese Mutante aktiviert D-LDH und L-LDH mit unterschiedlichen Optimalwerten, die für eine differenzierte Produktion von D- und L-Milchsäure sorgen.
Die Mutante kann für die Produktion von Lactat mit hoher Ausbeute verwendet werden, das für die Lebensmitteltechnologie oder allgemein als Gebrauchsmaterial in der chemischen Industrie verwendet werden soll.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf einer Mutante des Wildstamms Lactococcus lactis spp. lactis 19435 (von ATCC erhalten), wobei diese Mutante am 4. September 2001 gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen unter der Hinterlegungsnummer DSM 14489 hinterlegt worden ist.
Gegenwärtig ist nicht bekannt, wo die Mutation im genetischen Code erfolgt ist und bis zu welchem Ausmaß die Mutation den genetischen Code verändert hat.
Die Lactatproduktion ist bei gesteuerten, überwachten Fermentationen (kontinuierlichen Fermentationen) der neuen Mutante, die hier als TMB5003 bezeichnet wird, analysiert worden, und es sind Berechnungen vorgenommen worden, um aufzuzeigen, daß TMB5003 im Vergleich mit dem Wildstamm 19435 die doppelte volumetrische Produktion aufweist und eine spezifische Produktivität hat, die das 1,5-Fache von der des Wildstamms beträgt. Die Lactatausbeute, die als Gramm erzeugtes Lactat pro Gramm bei der Fermentation zugesetzte Glucose berechnet wird, wurde bei kontinuierlichen Fermentationen für beide Stämme als gleich berechnet.
Die verschiedenen Tests, die bei der neuen Mutante TMB5003 vorgenommen worden sind, zeigen, daß die neue Mutante eine uneingeschränkte Aufnahme von Glucose aufweist, die über eine verdoppelte Stoffwechselkapazität in Lactat überführt wird, wie es nachfolgend deutlich wird.
Es hat sich gezeigt, daß L-LDH und D-LDH bei unterschiedlichen Wachstumsbedingungen produziert oder aktiviert werden, und somit können die Bedingungen so gewählt werden, daß optimale Mengen des bevorzugten Lactats, in diesem Fall die L-Milchsäure oder das L-Lactat, produziert werden.
Bakterienstämme und Züchtungsbedingungen
Escherichia coli DH5α (Life Technologie Inc.) wurde bei 37°C im Medium Luria-Bertani gezüchtet, und falls erforderlich wurde Erythromycin bis zu einer Konzentration von 250 μg·ml^-1 zugesetzt. Für ruhende Batch-Kulturen wurden die Stämme L. lactis bei 30°C im Medium M17 (Oxoid) gezüchtet, das 10 g·l^-1 Zucker enthielt. Bei allen Lactokokkenkulturen wurden für die Auswahl von TMB5003 Zucker einer Autoklavenbehandlung unterzogen und den Kulturen getrennt zugesetzt, falls erforderlich wurde auch Erythromycin bis zu einer Endkonzentration von 2 μg·ml^-1 zugegeben.
Bei Versuchen unter Verwendung von pH-gesteuerten Batch-Kulturen wurden die Lactokokkenstämme in einem Medium mit der folgenden Zusammensetzung gezüchtet (pro Liter): 5 g Trypton (Merck), 5 g Hefeextrakt (Merck), 1 g Casaminosäuren (Difco Laboratories), 2,5 g K₂HPO₄, 2,5 g KH₂PO₄ und 0,5 g MgSO₄·7H₂O (pH = 6,8). Kohlehydrate wurden bis zu einer Endkonzentration von 10 g·l^-1 zugesetzt. Die pH-gesteuerten Batch-Fermentationen erfolgten bei 30°C in Fermentoren mit einem Arbeitsvolumen von 800 ml.
Das Rühren wurde bei 250 U/min eingestellt und der pH-Wert bei 6,5, der durch die automatische Zugabe einer Base (3,0 m KOH) gesteuert wurde. Die Steuerungseinrichtung war ein Labormeßgerät für den pH-Wert (Radiometer, Kopenhagen, Dänemark). Die Stammkulturen wurden über Nacht in den gleichen Medien wie die entsprechenden Versuchskulturen, in ruhenden Batch-Kulturen bei 30°C, gezüchtet. Das Inokulum 5 % (Vol./Vol.) wurde zentrifugiert, zweimal gewaschen und erneut in einem frischen Kulturmedium ohne Zucker suspendiert, bevor es den Versuchskulturen zugesetzt wurde.
Für die physiologische Kennzeichnung und den Vergleich von L. lactis spp. lactis ATCC19435 und L. lactis spp. lactis TMB5003 wurden diese Stämme in einem halbdefinierten Medium (SD3) gemäß van Niel und Hahn-Hägerdahl (1999) gezüchtet. Alle Komponenten, abgesehen von Kaliumphosphaten und Wasser, wurden steril filtriert. Glucose wurde einer Autoklavenbehandlung unterzogen und dem Medium getrennt mit einer Endkonzentration von 5 g·l^-1 zugesetzt. In Biostat^® A-Fermentoren (B. Braun Biotech International, Deutschland) wurden unter Anwendung von Chemostat-Bedingungen kontinuierliche Kulturen vorgenommen.
Das Volumen in den Fermentoren wurde bei 1 l gehalten. Die Temperatur wurde bei 30°C eingestellt und der pH-Wert wurde bei 6,5 gehalten, wobei die automatische Zugabe einer Base (10 m KOH) unter Verwendung einer automatischen Steuerungseinrichtung, Mikro-DCU-System (B. Braun Biotech International, Deutschland) angewendet wurde. Das Rühren wurde unter Verwendung eines MCU-200-Systems (B. Braun Biotech International, Deutschland) bei 150 U/min eingestellt. Anaerobe Bedingungen wurden vermieden, indem Stickstoff mit 0,2 ml·min^-1 kontinuierlich durch das Medium gespült wurde. Vorkulturen für die Fermentationen wurden über Nacht im Medium M17 gezüchtet, das 10 g·l^-1 Glucose enthielt.
Die Vorkulturen wurden durch zehnminütiges Zentrifugieren mit 5000 × g bei 2°C gewonnen, zweimal gewaschen und erneut in zweimal destilliertem, sterilem Wasser suspendiert und schließlich mit 2,5 % (Vol./Vol.) in das Medium SD3 geimpft, das 5 g·l^-1 Glucose enthielt. Die kontinuierlichen Kulturen begannen, als die Glucosekonzentration aus den Batch-Kulturen stark abgenommen hatte. Die kontinuierlichen Fermentationen erfolgten für beide Lactokokkenstämme bei der jeweiligen Verdünnungsrate zweifach.
Messung von Wachstum Substratverbrauch und Produkterzeugung
Die Messung der optischen Dichte (OD) bei 620 nm unter Anwendung von geeigneten Verdünnungen mit einem Spektrophotometer Hitachi U-2000 (Hitachi Ltd., Tokio, Japan) überwachte das Zellwachstum. Bei allen Kulturen wurde das Trockengewicht gemessen. Proben für die Bestimmung von Substrat und Produkt wurden sofort nach der Probenentnahme durch 0,2 μm Filter filtriert und bis zur Analyse bei –20°C gehalten. Glucose, Lactat, Formiat, Acetat und Ethanol wurden bei 45°C auf einer Ionenaustauschsäule (Aminex HPX-87H, BioRad) abgetrennt und mit einem Brechungsindexdetektor (Shimadzu, Japan) mengenmäßig erfaßt. Die mobile Phase war 5 mm H₂SO₄ mit einer Strömungsrate von 0,6 ml·min^-1.
Vorbereitung des Zellextrakts Bestimmung von Protein und Enzymassays
Lactokokkenzellen wurden den Kulturen zu geeigneten Zeitpunkten entnommen und gewonnen, indem bei 2°C 10 min mit 5000 × g zentrifugiert wurde. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und erneut in 20 mm Triethanolamin-Puffer, pH 7,2, suspendiert, der 0,5 mm EDTA und 0,5 mm Dithiotreitol enthielt. Die Zersetzung der Zellen erfolgte durch Verwirbelung (3 × 5 min) bei 8°C unter Verwendung von Glaskügelchen (0,5 mm, KEBO). Die Zelltrümmer wurden entfernt, indem 15 Minuten bei 2°C mit 19500 × g zentrifugiert wurde. Die Zellextrakte wurden bis zur Verwendung bei –80°C gehalten. Die Proteinkonzentration wurde gemäß dem Verfahren von Bradford (Bradford (1976)) bestimmt. Als Standard wurde Rinderserumalbumin verwendet.
Alle bei den Enzymassays verwendeten Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich erhalten. LDH und die PK-Aktivität wurden gemäß Hillier und Jaga (1982) bzw. Crow und Pritchard (1982) in bezug auf die NADH-Oxidation bei 340 nm gemessen. Die Aktivität von PFK und GAPDH wurde gemäß den Verfahren von Plaxton und Storey (1986) bzw. Brooks und Storey (1988) bestimmt.
Messung des Glucosetransports
Die Glucoseaufnahme durch Lactokokkenzellen wurde gemäß dem Zero-trans-Influx-Assay gemessen, der Bakterienzellen angepaßt ist. Die Zellen wurden zu geeigneten Zeitpunkten aufgenommen und gewonnen, indem 10 Minuten bei 2°C mit 5000 × g zentrifugiert wurde. Die Zellpellets wurden zweimal in eiskaltem 0,1 m Kaliumphosphat-Puffer, pH = 6,5, gewaschen und schließlich unter Verwendung des gleichen Puffers erneut bis zu einem Trockengewicht von 25 bis 30 mg·m·l^-1 suspendiert. Die Zellen wurden bis zur Verwendung auf Eis aufbewahrt. Bei dem Asssay wurden 20 μl 0,1 m Kaliumphosphat-Puffer, pH = 6,5, und 20 μl Zellsuspension in eine 5 ml Reaktionsampulle aus Kunststoff (Sarstedt) gegeben und 5 Minuten bei 30°C inkubiert.
Dem Gemisch wurden 10 μl von mit ¹⁴C markierter Glucose (Amersham Life Science) mit Konzentrationen von 0,3125 bis 200 mm bis zu einer abschließenden spezifischen Aktivität von 200 Einzelimpulsen pro Minute (cpm) pro nMol zugegeben, und der Assay begann, indem die Ampulle kurz verwirbelt wurde. Der Assay konnte 10 Sekunden andauern, das wurde durch die Verwendung eines Metronoms gemessen, und er wurde beendet, indem 3 ml eiskalte 0,5 m Glucose aus einem Spender zugegeben wur den. Das Reaktionsgemisch wurde schnell durch einen Mikrofaserfilter aus Glas filtriert (GF/F, 25 mm, Merck Eurolab).
Die Reaktionsampulle wurde zweimal mit 3 ml eiskalter 0,5 m Glucoselösung gewaschen und schließlich wurde auch die Filterausrüstung zweimal mit eiskalter 0,5 m Glucoselösung gewaschen. Der Filter wurde in eine Szintillationsampulle gegeben, die 5 ml Szintillationslösung enthielt (Ecoscint^® A, Hinzte AB, Schweden). Die Assays erfolgten zweifach und für jede erneute Zellsuspension und für jede Glucosekonzentration wurde eine Hintergrundprobe hergestellt. Diese Proben wurden wie bei den anderen Tests hergestellt und behandelt, der Assay begann jedoch nicht durch Verwirbeln, statt dessen wurden 3 ml eiskalte 0,5 m Glucoselösung in die Ampulle gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde sofort filtriert.
Genetische Verfahren und Entwicklung von L. lactis TMB5003
Alle DNA modifizierenden Enzyme wurden von Roche Diagnostics Scandinavia AB, Schweden erhalten. Die Herstellung von Plasmiden erfolgte mit einem Bio-Rad Quantum-Präparations-Kit (Bio-Rad), und die Chromosomen-DNA wurde mit dem Kit Easy-DNA^® (Invitrogen) hergestellt. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde entsprechend der Beschreibung vom Hersteller unter Verwendung von Polymerase PwoII durchgeführt. Die DNA-Fragmente wurden aus Agarosegel gereinigt, wobei ein Qiaquick-Kit (Qiagen) verwendet wurde. Die Restriktionsenzymaufschlüsse und -ligationen erfolgten nach Standardverfahren (Sambrook (1989)). Ultrakompetente Zellen von E. coli wurden wie bereits beschrieben hergestellt und transformiert (Inoue (1990)). Die Herstellung und Transformation von Lactokokkenzellen erfolgte nach einem Protokoll von Holo und Nes (1989).
Ein internes 850 bp Fragment des L. lactis Maltose-Phosphorylase codierenden Gens, malP, (Nilsson, Microbiology, 147:1565–1573 (2001)) wurde durch PCR amplifiziert, wobei die Primer 5'-ggcggatcctaaaggatttactgg-3' (vorwärts), der einen Erkennungsort für das Restriktionsenzym BamHI enthielt, und 5'-ggcctgcagcaacttcttcgcttg-3' (rückwärts), der einen PstI-Restriktions-Erkennungsort enthielt, und die Chromosomen-DNA von L. lactis ssp. lactis 19435 als Templat verwendet wurden. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und RsaI gespalten, was zu einem Produkt mit 450 bp führte.
Ein Minimalintegrationsvektor, pFL20, der sich in Lactokokken nicht replizieren kann, der von Levander et al. (2001) entwickelt worden ist, wurde mit geeigneten Restrikti onsenzymen aufgeschlossen und mit dem internen 450 bp malP-Fragment ligiert. Der resultierende Konstrukt, der als pTMB5003 bezeichnet wurde, wurde in E. coli vermehrt und ferner in L. lactis spp. lactis 19435 transformiert. Durch einen einzigen Crossing-over-Vorgang im malP von L. lactis wurden auf für Erythromycin selektiven Platten 4 Transformanten erhalten. Alle Transformanten hatten anscheinend das gleiche Wachstumsverhalten in Glucose- bzw. Maltosekulturen. Eine Transformante, die als L. lactis spp. lactis TMB5003 bezeichnet wurde, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Diese neue Mutante wurde bei Glucosefermentationsversuchen getestet und dadurch mit dem Stammtyp verglichen.
Wachstum und Produkterzeugung
L. lactis spp. lactis 19435 und L. lactis spp. lactis TMB5003 wurden in pH-gesteuerten Batch-Kulturen gezüchtet, um deren Wachstumsverhalten auf Glucose zu bewerten und zu vergleichen (2). Die maximale spezifische Wachstumsrate von TMB5003 betrug das Doppelte von der, die bei den gleichen Wachstumsbedingungen für den Laktokokken-Wildstamm bestimmt worden war. Bei der Messung des Glucoseverbrauchs während der Kultur wurde deutlich, daß TMB5003 Glucose etwa doppelt so schnell wie der Wildstamm verbraucht. Batch-Kulturen unter Verwendung von Lactose oder Maltose als einzige Kohlenstoffquelle führten bei keiner der Kulturen zum Wachstum von TMB5003, wohingegen 19435 auf Lactose mit der gleichen spezifischen Wachstumsrate wie in Glucosekulturen und auf Maltose mit einer etwas geringeren Rate wuchs (diese Werte sind nicht aufgeführt).
Die Unfähigkeit von TMB5003, Lactose zu fermentieren, wurde bestätigt, indem der Plasmidgehalt dieser Zellen untersucht wurde. TMB5003 hatte im Vergleich mit dem Lactokokken-Wildstamm ein Plasmid verloren, das sehr wahrscheinlich das ist, das das lac-Operon beherbergt (die Werte sind nicht aufgeführt) (de Vos (1990), de Vos (1989), Maeda (1986)). Die Unfähigkeit des mutanten Stamms, Maltose zu fermentieren, beruhte auf der Tatsache, daß das Maltoseoperon durch die Insertion von pTMB5003 in das Maltose-Phosphorylase codierende Gen, malP, zerstört worden war (Nilsson und Rådström (2001)). Es wird angenommen, daß die Veränderung im Maltoseoperon den Einfluß auf den Glucosestoffwechsel in TMB5003 nicht fördert, und folglich wird dies in der vorliegenden Darlegung nicht weiter erläutert.
Die Produkterzeugung wurde untersucht, als Laktokokkenzellen unter Verwendung von Glucose als einzige Kohlenstoffquelle unter eingeschränkten und uneingeschränkten Bedingungen kontinuierlich gezüchtet wurden. Es wurde deutlich, daß TMB5003 unter Bedingungen mit uneingeschränkter Glucose Lactat mit einer volumetrischen Produktivität erzeugt, die doppelt so hoch wie die für 19435 ist (Tabelle 1). Als Glucose eingeschränkt wurde, nahm die Lactatproduktivität für TMB5003 jedoch deutlich über die Werte für den Lactokokken-Wildstamm hinaus ab.
Diese Ergebnisse legen nahe, daß der mutante Stamm einen höheren Bedarf nach einem Glucoseüberschuß als der Wildstamm hat, um Lactat als hauptsächliches Endprodukt der Fermentation zu erzeugen. Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, daß eine Verschiebung in Richtung der Bildung eines gemischten Säureproduktes auftritt, wenn Lactose in einer Lactokokkenkultur eingeschränkt wird oder wenn bestimmte andere Zucker, wie Maltose, als einzige Kohlenstoffquellen verwendet werden (Lohmeier-Vogel (1986), Cocaign-Bousquet (1996), Sjöberg (1995)). Das beruht auf einem verringertem Fluß durch die Glycolyse und einem geringerem NADH/NAD⁺-Verhältnis. Es ist ferner erklärt worden, daß der Engpaß unter solchen Bedingungen sehr wahrscheinlich bei dem Wert des Zuckertransports liegt.
Glucoseaufnahme und Enzymaktivitäten
Durch die Verwendung mit ¹⁴C markierter Glucose wurden Messungen der Glucoseaufnahme in Lactokokkenzellen möglich, die unter Bedingungen mit uneingeschränkter Glucose gezüchtet worden waren. Beim Assay für 19435 zeigte sich bei der Verwendung eines Bereichs der Glucosekonzentrationen von 0,3125 bis 200 mm, daß die Tendenz beim Glucosetransport den Endwert erreicht, wenn höhere Glucosekonzentrationen als etwa 20 mm angewendet werden (1). Wenn andererseits TMB5003 beim gleichen Assay verwendet wurde, zeigte die Tendenz der Glucoseaufnahme keine Sättigungskurve, obwohl geringere Werte der spezifischen Aufnahmeraten erhalten wurden, wofür uns die Ursache unbekannt ist.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die regulierende Funktion, die bei der Steuerung des Zuckerzulaufs in Lactokokken erzielt wurde, bei den mutanten Zellen beeinflußt wird. Darüber kann auch nachgedacht werden, wenn bei dem mutanten Lactokokkenstamm der stärker ausgeprägte Effekt der Verschiebung in Richtung der Bildung eines gemischten Säureproduktes für Glucosewerte betrachtet wird, bei denen nicht angenommen wird, daß sie eine Einschränkung für den Lactokokken-Wildstamm darstellen (Tabelle 1). Es gibt Hinweise auf zwei Glucosetransportsysteme bei L. lactis, vom PTS bzw. von Permease vermittelte (Thompson (1985), Thompson (1983)).
Aufgrund der Tatsache, daß Glucose in L. lactis von dem für Mannose spezifischen PTS transportiert wird, wurde versucht die Wachstumsrate von Laktokokkenstämmen auf diesem Kohlehydrat zu überprüfen. Somit wurde nachgewiesen, daß beide Stämme mit der gleichen spezifischen Wachstumsrate wie in ihren Glucosekulturen wachsen (die Werte sind nicht aufgeführt).
Trotz der Tatsache, daß viele Dokumente die regelnde Rolle des PTS bei der Aufnahme von PTS-Zuckern und nicht vom PTS stammenden Zuckern durch den Glucoseeffekt beschreiben, gibt es nicht viele Informationen zur Regelung der Aufnahme von Glucose selbst. Das wärmebeständige Protein (HPr) vom PTS und die HPr-Kinase sind bekanntlich an den Induktorausstoßungs- und -ausschlußphänomenen beteiligt, und es gibt auch Deutungen, daß diese eine Rolle bei der Steuerung der Glucoseaufnahme spielen (Cocaign-Bousquet (1996), Saier Jr. (1996)).
Man versucht zu spekulieren, daß diese Proteine in TMB5003 beeinflußt sein könnten und folglich den geänderten Modus der Glucoseaufnahme in diesem Stamm vermitteln. Aufgrund der Tatsache, daß TMB5003 auch eine höhere spezifische Wachstumsrate hat, wenn er auf Mannose gezüchtet wird, jedoch nicht auf Trehalose, wobei vermutet wird, daß es ebenfalls vom PTS transportiert wird (Nilsson und Rådström (2001)), kommt es zu weiteren Spekulationen, daß die für Mannose spezifischen Komponenten des Mannose/Glucose-Aufnahmesystems im mutanten Stamm beeinflußt werden.
In L. lactis sind Phosphofructokinase (PFK), Pyruvat-Kinase (PK) und Lactat-Dehydrogenase (LDH) die Schlüsselenzyme auf dem zentralen Weg der Energieerzeugung, der Umwandlung von Kohlehydrate in Milchsäure (Llanos (1993)). Die diese Enzyme codierenden Gene befinden sich zusammen in einem Operon, das als las-Operon bezeichnet wird, auf dem Chromosom. Kürzlich wurde Ergebnisse erhalten, die die Rolle von PFK beim Glycolysefluß in L. lactis betreffen (Anderson (2001)). Die Schlußfolgerungen lauteten, daß der Glycolyse- und der Lactatfluß durch die zweifache Verringerung der PFK-Aktivität proportional vermindert wurden.
Die Aktivitäten der vom las-Operon codierten Enzyme wurden bei 19435 und TMB5003 untersucht, die mit unterschiedlichen Verdünnungsraten gezüchtet wurden (Tabelle 2). Für die mutanten Lactokokken konnte bei allen Zellextrakten aus den Kulturen bei den drei unterschiedlichen Verdünnungsraten kein Unterschied der Akti vitäten von PK und PFK nachgewiesen werden. Die Aktivitäten von LDH, die in Zellen von TMB5003 nachgewiesen wurden, die bei unterschiedlichen Wachstumsraten gewonnen worden waren, unterschieden sich jedoch deutlich.
Die LDH-Aktivität war bei schnell wachsenden Zellen höher, und es wurde deutlich, daß sie bei einem Vergleich bei der höchsten Verdünnungsrate für jeden entsprechenden Stamm bei TMB5003 zwanzigmal höher als bei 19435 war. Diese Ergebnisse stimmen mit den kürzlichen Erkenntnissen von hohen LDH-Aktivitäten bei hohen Glycolyseraten für Lactokokken überein (Even (2001)).
Die deutlich höhere LDH-Aktivität bei TMB5003 ist sehr wahrscheinlich eine Reaktion auf den geänderten Glucosetransport in die Zellen. Da die Lactokokken mit einem Glucoseüberschuß ausgestattet sind und der Glycolysefluß hoch ist, muß die Art der Pyruvatumwandlung folglich aufgrund der geforderten Regenerierung von NAD⁺ ablaufen. Das erfolgt durch die Reduktion von Pyruvat zu Lactat, die von LDH katalysiert wird, dessen Aktivität folglich bei einem hohen Wert gehalten werden muß. Bei L. lactis wurde aufgezeigt, daß die Aktivität von Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (GAPDH) in vivo den Glycolysefluß bei schnell metabolisierbaren Zuckern aufgrund der Hemmung eines hohen NADH/NAD⁺-Verhältnisses einschränkt (Even (1999)). Deshalb wollten wir untersuchen, ob TMB5003 eine geänderte Aktivität von GAPDG im Vergleich mit dem Lactokokken-Wildstamm besitzt. Bei den Stämmen konnte jedoch kein Unterschied der Aktivitäten nachgewiesen werden (Tabelle 2).
Es wurden Untersuchungen der Glucoseaufnahme des entsprechenden Stamms bei gesteuerten Fermentationsversuchen mit der höchsten möglichen Verdünnungsrate für jeden der einzelnen Stämme durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß die neue Mutante TMB5003 eine unbegrenzte Glukoseaufnahme aufweist, während beim Wildstamm 19435 eine bestimmte Sättigung der Aufnahme von Glucose festgestellt wird. Das wird aus 1 deutlich, die die spezifischen Aufnahmeraten, die in nMol/min/mg der dem Assay zugesetzten Zellen angegeben sind, gegenüber der Glucosekonzentration zeigt, die in dem Assay zugesetzte Millimol angegeben ist.
Die Glucosekonzentrationen wurden von 0 bis 80 mm geändert, und die spezifische Aufnahmerate variierte zwischen 10 und 150 nMol/min/mg zugesetzte Zellen beim Wildstamm und zwischen 5 und 55 nMol/min/mg zugesetzte Zellen bei der neuen Mutante.
Die Fermentationsraten bei der Züchtung auf einem Glucosemedium wurden ebenfalls verglichen, wie es in 2 ersichtlich ist. Die neue Mutante TMB5003 fermentiert Glucose im Vergleich mit dem Wildstamm mit der doppelten Rate. 2 zeigt sowohl das Wachstum auf Glucose (graphische Darstellung der optischen Dichte, OD-Kurve) als auch den Glucoseverbrauch des Wildstamms 19435 bzw. von TMB5003.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse der untersuchten Lactaterzeugung aufgeführt. Tabelle 1

Y_LA/ges. steht für die Ausbeute von Milchsäure, bezogen auf die gesamte Erzeugung von Fermentationsprodukten
Q_S ist die spezifische Produktivität, d.h. Gramm pro Gramm Substrat
Q_V ist die volumetrische Produktivität, d.h. Gramm pro Liter Lösung pro Stunde.

Außerdem wurde die Produktion verschiedener vorhandener Enzyme analysiert. Die Enzyme, die dabei von Interesse sind, sind LDH, Phosphofructokinase (PFK), Pyruvat-Kinase (PK) und Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (GAPDH). Die Vergleiche erfolgten bei der höchsten D des entsprechenden Stamms. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Wie aus der vorangegangenen Tabelle 2 deutlich wird, sind die Produktion und Aktivierung von LDH im Vergleich mit dem Wildstamm herausragend, da sie mindestens das 20-Fache von der des Wildstamms betragen, was bedeutet, daß der erfindungsgemäße neue Stamm eine höhere Kapazität für die Erzeugung von Lactat in das Wachstumsmedium aufweist. Bezüglich der anderen analysierten Enzyme sind zwischen den beiden Stämmen keine Unterschiede zu erkennen.
Das erzeugte und gewonnene L-Lactat kann zur Steuerung des pH-Wertes in Lebensmitteln, als Geschmacksverstärker in Lebensmitteln sowie auch als Konservierungsmittel von Lebensmitteln verwendet werden, wobei die Konservierungswirkung auf einer Verringerung des pH-Wertes sowie auch darauf beruht, daß es selbst eine schwache Säure ist, die das Wachstum einer Anzahl von Mikroorganismen in Lebensmitteln und Futtermitteln verringert. Die intrazelluläre Akkumulation von Anionen oder das Loslösen von ATP-Syntase stellt dabei den wahrscheinlichsten Mechanismus der Wachstumshemmung dar.
Außerdem kann das Lactat für die Behandlung von Papier- und Metalloberflächen verwendet werden.
Das Lactat kann für die Polymerisation zu Polymilchsäure, PLA, verwendet werden, die ein biologisch abbaubares Polymer darstellt. Ferner kann das Lactat bei der Herstellung anderer Verbindungen, wie Propylenglycol, Propylenoxid, Acetaldehyd, Ethanol, Acrylate und Acrylester, verwendet werden.
Die PLA kann als solche bei medizinischen Anwendungszwecken in Form von Implantaten und Nähten, bei der Herstellung von Produkten, die für die geregelte Freiset zung von Wirkstoffen verwendet werden, und Pestiziden verwendet werden. Das Polylactat kann bei der Herstellung von Verpackungsmaterialien sowie auch biologisch abbaubaren Wegwerfprodukten verwendet werden.
Der erfindungsgemäße Stamm kann in unterschiedlichen Medien, wie komplexen Medien, die auf Trypton basieren, Hefeextrakten und Casaminosäuren, gezüchtet werden. Glucose kann als externe Kohlenstoffquelle zugesetzt werden. Komplexe Medien sind jedoch nicht bevorzugt, da die Zuckermenge (Glucose), die zur Lactatbildung führt, gesteuert werden sollte. In Trypton- und Hefeextrakten liegen unbekannte Komponenten vor, die dies erschweren können. Es können ein halbdefiniertes Medium, wie SD3, und ein Zusatz von Glucose von bis zu 5 g/l verwendet werden.

Das halbdefinierte Medium (E. W. J. van Niel und B. Hahn-Hägendal (1999), "Nutritient requirements of lactococci in defined growth media", Applied Microbial Biotechnology 52:617–627), das in den durchgeführten Untersuchungen für die Züchtung des vorliegenden Stamms TMB5003 verwendet wurde, besteht aus folgendem: Medium SD3 (pro Liter)

Casaminosäuren	10 g
K₂HPO₄	2,5 g
KH₂PO₄	2,5 g
MgSO₄·7H₂O	0,5 g
Hefestickstoffbase (außer Casaminosäure (Difco))	5 g
Asparagin	0,4 g
Reduziertes Glutathion	10 mg
Uracil	60 mg
Adenin	30 mg
Guanin	30 mg
Vitaminlösung	10 ml
Lösung von Spurenelementen	1 ml
Glucose	5 g

Vitaminlösung (pro Liter)

D-Biotin	10 mg
Pyridoxal-HCl	206 mg
Folsäure	100 mg
Riboflavin	100 mg
Nicotinamid	100 mg
Thiamin-HCl	100 mg
Ca-D-panthotenat	95 mg
p-Aminobenzoesäure	10 mg

Lösung von Spurenelementen (pro Liter)

Ca₂-EDTA	15 g
ZnSO₄·7H₂O	4,5 g
MnCl₂·2H₂O	1 g
CoCl₂·6H₂O	0,3 g
CuSO₄·5H₂O	0,3 g
Na₂MoO₄·H₂O	0,4 g
CaCl₂·2H₂O	4,5 g
FeSO₄·7H₂O	3 g
H₃BO₃	1 g
KI	0,1 g

Die Lösungen von Vitaminen, Spurenelementen, Nucleinsäurebasen, der Hefestickstoffbase, von Apsaragin und reduziertem Glutathion wurden filtersterilisiert und dem Medium aseptisch zugesetzt. Die anderen Komponenten wurden separat einer Autoklavenbehandlung unterzogen. Bei der Auswahl von TMB5003 wurden 2 μg Erythromycin/ml Medium zugegeben.
Es ist bevorzugt, daß die erfindungsgemäße Mutante TMB5003 mit einer hohen Verdünnungsrate, d.h. bei einer vollständigen Zugabe von Glucose und vollkommen ohne deren eingeschränkte Zugabe gezüchtet wird, so daß die maximale Lactatproduktion erreicht und beibehalten wird. Folglich wird eine Verdünnungsrate von mindestens 0,5 h^-1, vorzugsweise von mindestens 0,7 h^-1 und besonders bevorzugt von mindestens 0,8 h^-1 angewendet. Bei einer eingeschränkten Zugabe von Glucose während des Wachstums besteht die Tendenz, daß die Lactatproduktion zum Vorteil der Bildung von Nebenprodukten, wie anderen Säuren, wie Acetat (Essigsäure) und Formiat (Ameisensäure), abnimmt.
Bis jetzt ist es sehr wahrscheinlich, daß der begrenzende Faktor für den Wildstamm, Lactat zu produzieren, die Fähigkeit des Stamms ist, Glucose zu transportieren. Der Fluß durch die Glycolyse ist wahrscheinlich nicht einschränkend. Der abschließende Pyruvatmetabolismus kann einschränkend sein. LDH ist das Enzym, das Pyruvat in Lactat überführt, und es hat sich gezeigt, daß dieses Enzym in Abhängigkeit davon unterschiedliche Optimalwerte der Temperatur hat, welcher Lactokokkenstamm bei der Fermentation von Glucose verwendet wird. Auch der pH-Wert kann einen Einfluß auf die Aktivität des LDH haben. Das Redox-Gleichgewicht beeinflußt ferner die Wirksamkeit des LDH. Das Vorhandensein der Cofaktoren NAD⁺/NADH stellt den regelnden Faktor dar.
Die Bedingungen für eine Erhöhung der L-LDH-Aktivität sind die Fermentation in einem Medium mit einem pH-Wert von mehr als 6 und eine Temperatur von bis zu 30°C, bei diesen Bedingungen stellt L-Lactat im wesentlichen das einzige erzeugte Isomer dar, wohingegen D-LDH bei pH = 4 bis 5 und 33,5 bis 40°C aktiviert wird. Somit sollte die Fermentation der erfindungsgemäßen Mutante bei solchen Bedingungen erfolgen, daß die Aktivität von L-LDH erhöht wird, so daß die Bildung von L-Lactat verstärkt wird. Folglich lauten die pH- und die Temperaturbedingungen für die Produktion von L-Lactat: pH = 6 bis 7, vorzugsweise 6,0 bis 6,5, und eine Temperatur von 25 bis 30°C, vorzugsweise von 27,5 bis 30 °C.
Beschreibung der Zeichnungsfiguren
1A zeigt die spezifische Glucoseaufnahmerate von Lactococcus lactis spp. lactis 19435, der bei einer Verdünnungsrate von 0,4 h^-1 gezüchtet wurde;
1B zeigt die spezifische Glucoseaufnahmerate von Lactococcus lactis spp. lactis TMB5003, der bei einer Verdünnungsrate von 0,8 h^-1 gezüchtet wurde;
2 zeigt den Glucoseverbrauch gegenüber der Zeit und die Änderung der optischen Dichte (OD) gegenüber der Zeit.

Claims

Mutante von Lactococcus lactis spp. lactis, die Lactat mit einer hohen, auf das Volumen bezogenen Produktivität erzeugt, die mindestens das Doppelte von der von Lactococcus lactis spp. lactis 19435 beträgt, und Lactat mit einer spezifischen Produktivität erzeugt, die mindestens das 1,5-fache von der von Lactococcus lactis spp. lactis 19435 beträgt, und große Mengen von Lactat-Dehydrogenase erzeugt, die mindestens das 20-fache von der von Lactococcus lactis spp. lactis 19435 betragen, wobei der Stamm die Bezeichnung TMB5003 erhalten hat, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen unter der Hinterlegungsnummer DSM 14489 hinterlegt worden ist.
Verwendung von Lactococcus lactis spp. lactis TMB5003 nach Anspruch 1 bei der Herstellung von Lactat.
Verwendung von Lactococcus lactis spp. lactis TMB5003 nach Anspruch 1 bei der Herstellung des Enzyms Lactat-Dehydrogenase, LDH, insbesondere L-Lactat-Dehydrogenase, L-LDH.
Verfahren zum Herstellen von Lactat auf einem glucosehaltigen Medium, wobei ein Impfmaterial von Lactococcus lactis spp. lactis TMB5003 gemäß Anspruch 1 auf einem Medium gezüchtet wird, das Glucose als Kohlenstoffquelle aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Züchtung bei für die Produktion von L-Lactat optimierten Bedingungen erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 5, wobei die Züchtung kontinuierlich mit einer Verdünnungsrate von mindestens 0,5 h^-1 erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Züchtung kontinuierlich mit einer Verdünnungsrate von mindestens 0,7 h^-1 erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Züchtung kontinuierlich mit einer Verdünnungsrate von mindestens 0,8 h^-1 erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 8, wobei die Züchtung bei einer uneingeschränkten Glucosezufuhr erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüche 4 bis 9, wobei die Züchtung bei einem pH-Wert von mehr als 6, vorzugsweise bei pH = 6 bis 7 erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 10, wobei die Züchtung bei einer Temperatur von 25°C bis 30°C, vorzugsweise von 27,5°C bis 30°C erfolgt.