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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation von bioaktivem
Eupalitin aus Boerhavia diffusa. Insbesondere betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Isolation von bioaktivem Eupalitin (3-O-β-D-Galactopyranosid)
der Formel 1 mit Antiosteoporoseaktivität durch Extraktion von zerkleinerten
Blättern
von Boerhavia diffusa mit besserer Ausbeute.
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Hintergrund der Erfindung
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Boerhavia
diffusa Linn. (Syn. Boerhavia repens Linn., Boerhavia procumbens
Roxb.; Family Nyctaginaceae), weithin als "Punarnava" bekannt, ist ein wichtiges bei Ayurveda
verwendetes verjüngendes
Arzneimittel. Sie ist über
ganz Indien weit verbreitet und blüht während der Regenzeit. Die oberirdischen
Teile verschwinden dann, leben aber im nächsten Jahr wieder auf oder
sprießen
wieder [Sivarajan, V. V. and Balachandran, I. Ayurvedic drugs and
their plant sources; Oxford & IBH
publishing Co. Ltd., New Delhi, 1994].
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Getrocknete
gereifte ganze Pflanzen bilden das Arzneimittel in Indian Herbal
Pharmacopoeia [Handa, S. S., Deepak, M. and Mangal, A. K. Indian
Herbal Pharmacopoeia, Regional Research Laboratory, Jammu & Indian Drug Manufacturers
Association, Mumbai, 1998, Vol. 1], worin auch deren hervorstechenden
mikroskopischen und mikroskopischen Eigenschaften beschrieben sind.
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Biodiversität, Gruppenzugehörigkeiten
[Anand, R. K. Flora and Fauna 1, 167-170 (1995), Medicinal & Aromatic Plants
Abstracts 18, 2620 (1996)] und Varianten [Mathur, A. and Bhandari,
M. M. Geobios New Reports, 2, 35-38 (1983)], Medicinal & Aromatic Plants
Abstracts 5, 0643 (1983), Varma, S. K. Biological Bulletin of India
5, 50-52 (1983), Medicinal & Aromatic
Plants Abstracts 6, 0467 (1984)] von Boerhavia diffusa und chemotaxonomische
Befunde [Bramadhayalaselvam, A. and Rajasekaran, K. Journal of Economic
and Taxonomic Botany, 18, 499-500 (1994)] in Nyctaginaceae sind
diskutiert worden. Viele Rotenoide sind aus den Wurzeln der Pflanze
isoliert worden [Ahmed, M., Datta, B. K. and Rouf, A. S. S. Phytochemistry
29, 1709-1710 (1990); Kadota, S., Lami, N., Tezuka, Y. and Kikuchi,
T. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 37, 3214-3220 (1989); Lami,
N., Kadota, S., Tezuka, Y. and Kikuchi, T. Chemical and Pharmaceutical
Bulletin 38, 1558-1562
(1990); Lami, N., Kadota, S. and Kikuchi, T. Chemical and Pharmaceutical
Bulletin 39, 1863-1865 (1991)]. Diese beinhalten eine Reihe von
Boeravinones, nämlich
Boeravinon A, Boeravinon B, Boeravinon C, Boeravinon D, Boeravinon
E und Boeravinon F. Es wird berichtet, dass Punarnavosid, ein phenolisches
Glycosid, in Wurzeln vorkommt [Jain, G. K. and Khanna, N. M. Indian
Journal of Chemistry 28B, 163-166 (1989); Seth, R. K., Khanna, M.,
Chaudhary, M. Singh, S. and Sarin, J. P. S. Indian Drugs 23, 583-584
(1986)].
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Drei
Flavonolglycoside, nämlich
Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid,
Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
und 6-Methoxykaempferol 3-O-β-D-(1→6)- Robinosid aus der
ganzen Pflanze von Boerhaavia repens [Li, J., Li, H., Kadota, S.
and Namba, T. Journal of Natural Products 59, 1015-1018 (1996)]
und ein C-Methyl-Flavon sind aus Boerhaavia diffusa-Wurzeln isoliert
worden [Indian Journal of Chemistry 23B, 682-684 (1984)]. Auch sind
aus Boerhaavia diffusa-Wurzeln zwei Lignane isoliert worden, nämlich Liriodendrin
und Syringaresinol-mono-β-D-glucosid
[Lami, N., Kadota, S., Kikuchi, T. and Momose, Y. Chemical and Pharmaceutical
Bulletin 39, 1551-1555 (1991)]. Die Gegenwart einer Purinnucleosid-hypoxanthin-9-L-arabinose
[Ojewole, J. A. O. and Adesina, S. K. Fitoterapia 56, 31-36 (1985)],
eines Dihydroisofuroxanthon-borhavins [Ahmed, B. and Yu, C. P. Phytochemistry
31, 4382-4384 (1992)] und von Phytostyrolen [Kadota, S., Lami, N.,
Tezuka, Y. and Kikuchi, T. Chemical and Pharmaceutical Bulletin
37, 3214-3220 (1989); Kadota, Lami, N., Tezuka, Y. and Kikuchi,
T. Journal of Pharmaceutical Sciences 76, 5201 (1987)] aus der Pflanze sind
berichtet worden.
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Die
hepatoprotektiven Eigenschaften von Boerhavia diffusa sind von verschiedenen
Forschern untersucht und bestätigt
worden [Chakraborti K. K. and Handa, S. S. Indian Drugs 27, 161-166
(1989); Chandan, B. K., Sharma, A. K. and Anand, K. K. Journal of
Ethanopharmacology 31, 299-307 (1991); Rawat, A. K., Mehrotra, S.,
Tripathi, S. C. and Shome, U. Journal of Ethanopharmacology 56,
61-66 (1997); De, S., Ravishankar, B. and Bhavsar, G. C. Indian
Drugs 30, 355-363 (1993)]. Die Pflanze besitzt ausgeprägte antifibrinolytische
und antientzündliche
Aktivitäten
und wird zur Behandlung von IUD-Menorrhagie
empfohlen [Barthwal, M. and Srivastava, K. Advances in Contraception
7, 67-77 (1991); Barthwal, M. and Srivastava, K. Advances in Contraception
6, 113-124 (1990)]. Es wird auch berichtet, dass Boerhavia diffusa
antihypertensive Eigenschaften besitzt [Ramabhimaiah, S., Stalin,
D. and Kalaskar, N. J. Indian Drugs 21, 343-344 (1984)], wofür sowohl
dessen Inhibition des Angiotensin-umwandelnden Enzyms [Aftab, K.,
Usmani, S. B. and Ahmad, S. I. Hamdard Medicus 39, 44-54 (1996);
Medicinal & Aromatic
Plants Abstracts 18, 2920(1996)] als auch Ca2+-Kanalblockierwirkungen
[Hansen, K., Nyman, U. Smith, U. W., Andersen, A., Gudiksen, L.
Rajasekharan, S. and Pushpangadan, P. Glimpses of Indian Ethnopharmacology
(Hrsg. Pushpangadan, P.) 263-273 (1995)] verantwortlich sein können. Die
Verwendbarkeit des Arzneimittels beim nephritischen Syndrom ist
in Albinoratten gezeigt worden [Singh, A., Singh, R. H., Singh,
R. G., Misra, N., Vrat, S., Prakash, M. and Singh, N. Indian Drugs 26,
10-13 (1988)] sowie
auch in Menschen [Singh, R. P., Shukla, K. P., Pandey, B. L., Singh,
R. G., Usha and Singh, R. H. Journal of Research and Education in
Indian Medicine 11, 29-36
(1992)]. Gereinigte Extrakte der Pflanzen erhöhten Amylase-[Goswami, P. and
Sharma, T. C. Journal of Research in Ayurveda and Siddha 13, 48-55
(1992)] und ATPase-[Goswami, P. and Sharma, T. C. Journal of Research
in Ayurveda and Siddha 13, 135-140 (1992)]-Aktivitäten, während Katalaseaktivitäten in vitro
vermindert wurden. Wurzeln der Pflanze zeigten auch antikonvulsive
Eigenschaften [Adesina, S. K. Quarterly Journal of Crude Drug Research
17, 84-86 (1979); Akah, P. A. and Nwambie, A. I. Fitoterapia 64,
42-44 (1993). Es wurde gefunden, dass das Arzneimittel keine teratogenen
Wirkungen aufweist [Singh, A., Singh, R. G., Singh, R. H., Misra,
N. and Singh, N. Planta Medica 57, 315-316 (1991)]. Punarnavosid
wies in Affen antifibrinolytische Aktivität auf [Jain, G. K. and Khanna,
N. M. Indian Journal of Chemistry 28B, 163-166 (1989). Liriodendrin
blockierte Ca2+-Kanäle in einzelnen Froschherzzellen
[Lami, N., Kadota, S., Kikuchi, T. and Momose, Y. Chemical and Pharmaceutical
Bulletin 39, 1551-1555 (1991)] und Hypoxanthin-9-L-arabinosid erzeugte
Depressor- und negative
chronotrope Effekte in Ratten und Katzen [Ojewole, J. A. 0. and
Adesina, S. K. Fitoterapia 56, 31-36 (1985)]. Es wurde gefunden, dass
ein Methanolextrakt der ganzen Pflanze von Boerhavia repens die
durch Parathyroidhormon (PTH) induzierte Knochenresorption in Gewebekultur
inhibiert [Li, J., Li, H., Kadota, S. and Namba, T. Journal of Natural Products
59, 1015-1018 (1996)]. Eine Bioaktivi täts-geleitete Fraktionierung
des Methanolextrakts zeigte die Konzentration von Aktivität in der
n-Butanol-löslichen
Fraktion. Aus der n-Butanol-löslichen
Fraktion wurde Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
isoliert, und es wurde ermittelt, dass dieses eine signifikante
(p < 0,001) Inhibition
der durch Parathyroidhormon (PTH) induzierte Knochenresorption in
Gewebekultur aufwies. Die von Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid gezeigte Aktivität war mehr
als die durch Ipriflavon gezeigte Aktivität, ein klinisch verwendetes
Naturproduktderivat zur Behandlung von Osteoporose in Japan und
Italien, unter identischen Bedingungen.
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Die
Verbindung Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
wurde von Li et al. [Li, J., Li, H., Kadota, S. and Namba, T. Journal
of Natural Products 59, 1015-1018 (1996)] wie folgt isoliert: Die
im Schatten getrocknete ganze Boerhavia repens-Pflanze (1,2 kg)
wurde in kleine Stücke
zerschnitten und mit Methanol für
3 h (900 ml × 2)
rückflussbehandelt.
Das gesamte Filtrat wurde unter vermindertem Druck verdampft, wobei
eine dunkelgrüne
Masse erhalten wurde, und dieser Extrakt wurde in destilliertem
Wasser suspendiert und mit Chloroform und n-Butanol nacheinander getrennt. Die n-Butanol-lösliche Fraktion
wurde wiederholt durch präparative
TLC gereinigt, wobei Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid erhalten
wurde (14,4 mg, 0,0012%) erhalten wurde.
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Das
Verfahren von Li et al weist die folgenden hauptsächlichen
Nachteile auf:
- 1. Bei dem Verfahren wird die
ganze Boerhavia repens-Pflanze eingesetzt, die geringere Mengen
enthält.
- 2. 6 Stunden Rückfluss
mit Methanol ist nicht ausreichend für eine vollständige Extraktion
von Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid.
- 3. Der Methanolextrakt wird in destilliertem Wasser suspendiert
und mit Chloroform und n-Butanol nacheinander ge trennt. Während der
Trennung mit Chloroform wird Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid auch in die
Chloroformschicht verteilt, wodurch die endgültige Ausbeute der Verbindung
der Formel 1 aus der Butanolfraktion vermindert wird.
- 4. Die Verbindung wurde durch teure, aufwendige und zeitaufwendige
präparative
Dünnschichtchromatografie
gereinigt, wobei winzige Mengen von Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
erhalten wurden (14,4 mg, 0,0012%). Dieses Isolationsverfahren,
welches aufwendig und unwirtschaftlich ist, kann für eine gewerbliche
Produktion von Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
nicht akzeptiert werden.
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Osteoporose
ist eines der Hauptprobleme in unserer alternden Gesellschaft. Osteoporose
führt zu Knochenbruch
bei älteren
Mitgliedern der Bevölkerung,
insbesondere bei Frauen nach der Menopause. In der traditionellen
Medizin haben viele natürliche
Roharzneimittel eine potenzielle Verwendung bei der Behandlung von
Knochenerkrankungen. Da Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid eine größere Antiosteoporoseaktivität aufweist
als Ipriflavon, ein Naturproduktderivat, das klinisch zu diesem
Zweck verwendet wird, werden große Mengen an Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
benötigt.
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Nur
eine winzige Menge dieser Verbindung (14,4 mg aus der getrockneten
ganzen Pflanze Boerhavia repens, 1,2 kg) wird unter Verwendung des
von Li et al. entwickelten Verfahrens isoliert [Li, J., Li, H.,
Kadota, S. and Namba, T. Journal of Natural Products 59, 1015-1018
(1996)]. Daher besteht ein dringendes Bedürfnis nach der Entwicklung
eines effizienten, weniger zeitintensiven Verfahrens zur Isolation
von Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
in großem
Maßstab,
um dessen leichte Erhältlichkeit
für weitere
Untersuchungen zu ermöglichen.
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Ziele der
Erfindung
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Das
Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Isolation
von bioaktivem Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
mit der Formel 1 aus Boerhavia diffusa bereitzustellen.
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Ein
anderes Ziel der Erfindung ist es, den Pflanzenteil von Boerhavia
diffusa zu identifizieren, welcher eine maximale Ausbeute von 3-O-β-D-Galactopyranosid
der Formel 1 liefert.
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Ein
anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Verfahren
zur Isolation von Eupalitin (3-O-β-D-Galactopyranosid)
bereitzustellen, wobei das Verfahren einfach ist und zu einer schnellen
Isolation des gewünschten
Produkts führt.
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Es
ist ein anderes Ziel der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen,
bei dem ein hochgradig wirtschaftliches Rohmaterial verwendet wird,
welches in der Natur im Überfluss
ist.
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Es
ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen,
das für
einen Scale-up ideal ist und kein aufwendiges chromatografisches
Verfahren zur Reinigung und Isolation der Verbindung vorschreibt wie
im Stand der Technik, wo eine teure, aufwendige und zeitintensive
präparative
Dünnschichtchromatografie erforderlich
ist.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Das
obige und andere Ziel der Erfindung werden durch das hier beschriebene
neue Verfahren der Extraktion von Eupalitin (3-O-β-D-Galactopyranosid)
aus zerkleinerte Blättern
von Boerhaavia diffusa erreicht, mit Ausbeuten von etwa 300-mal
mehr als im Stand der Technik berichtet wird.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Isolation von 3-O-β-D-Galactopyranosid
der Formel 1 aus Boerhavia diffusa bereitgestellt, umfassend:
- (a) Zerkleinern des Pflanzenmaterials,
- (b) Herstellen eines Extrakts des zerkleinerten Pflanzenmaterials
mit einem protischen Lösungsmittel,
- (c) Konzentrieren des in Schritt (b) oben erhaltenen Extrakts,
- (d) Triturieren des oben erwähnten
konzentrierten Extrakts nacheinander mit organischen Lösungsmitteln in
der Reihenfolge zunehmender Polarität, um eine angereicherte bioaktive
Fraktion zu erhalten, und
- (e) Kristallisieren und Umkristallisieren der bioaktiven Fraktion
mit einem polaren Lösungsmittel,
um 3-O-β-D-Galactopyranosid
zu erhalten, wobei
das für die Extraktion
in Schritt (b) verwendete protische Lösungsmittel aus Feinsprit,
Methanol und wässerigem
Methanol ausgewählt
wird, und wobei das in Schritt (d) verwendete organische Lösungsmittel
aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus Hexan, Dichlormethan, Chloroform, Ethylacetat, Methanol,
Ethanol und wässerigem
Methanol besteht.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird das Pflanzenmaterial aus oberirdischen Teilen
der Pflanze ausgewählt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird das Pflanzenmaterial aus der Gruppe ausgewählt, umfassend
die Blätter
und die Stängel
bzw. Stiele von Boerhavia diffusa und eine Kombination davon.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Verfahren zur Isolation von 3-O-β-D-Galactopyranosid
der Formel 1 aus Boerhavia diffusa das Extrahieren der zerkleinerten
Blätter
hiervon in einem polaren Lösungsmittel,
das aus der Gruppe ausgewählt
ist, bestehend aus Feinsprit, Methanol und wässerigem Methanol, in einem
Glasperkolator oder in einem Soxhlet-Extraktor, Entfernen nicht-polarer
Fettbestandteile durch Triturieren mit einem organischen Lösungsmittel,
ausgewählt
aus Hexan, Dichlormethan, Chloroform und Ethylacetat, um eine angereicherte
bioaktive Fraktion zu erhalten, und Kristallisieren mit einem polaren
Lösungsmittel,
um 3-O-β-D-Galactopyranosid
(1) im Bereich von 0,25-0,5% (Gew./Gew.) zu erhalten.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung überwindet Nachteile des Standes
der Technik, da:
- 1. Oberirdische Teile, wie
z.B. Blätter
von Boerhavia diffusa, die von hierin identifizierten spezifischen
Orten gesammelt werden (enthaltend die maximale Menge der Verbindung,
wie durch Analyse der Proben der Pflanze, die während drei Jahren gesammelt
wurden, bestätigt
wurde).
- 2. Das Verfahren eine heiße
kontinuierliche Extraktion (Soxhlet-Extraktion) vorschreibt, wodurch
eine vollständige
Extraktion der Verbindung der Formel 1 gewährleistet wird. Da die Verbindung
der Formel 1 in Methanol nicht hochgradig löslich ist, führt das
berichtete Verfahren des Standes der Technik zu einer unvollständigen Extraktion.
- 3. Eine Triturierung des durch Extraktion durch Feinsprit erhaltenen
Rückstands
mit Hexan und Chloroform vorgeschrieben ist, wobei die Verbindung
der Formel 1 nicht in die Chloroformschicht abgeteilt wird, wodurch
die Gegenwart der gesamten extrahierten Verbindung der Formel 1
in der Fraktion des Feinsprits nach Triturierung zur Isolation gewährleistet
wird.
- 4. Die Verbindung durch direkte Kristallisation aus dem nach
der in 3 beschriebenen Triturierung erhaltenen Rückstand gereinigt wird, wodurch
es zum einfachsten, schnellsten, hochgradig wirtschaftlich praktikablen, Scale-up-kompatiblen Verfahren
zur kommerziellen Anwendung und einem neuen Verfahren zur Isolation der
Verbindung der Formel 1 mit einer Ausbeute bis zu 0,4% wird, was
mehr als das 300-fache der von Li et al. berichteten Ausbeute ist.
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Ein
vorläufiges
Screenen nach der Menge an Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid (1) in ganzen Pflanzenproben
von Boerhavia diffusa, die von acht phytogeografisch verschiedenen
Regionen von Indien gesammelt wurden, zeigte signifikante quantitative
Variationen (Tabelle 1). Tabelle
1: HPLC-Bestimmung von Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid (1) in verschiedenen
Proben von B. diffusa und in verschiedenen Teilen von Jammu-Proben.
- an=3, Standardabweichung
von Mittelwerten war im Bereich 0,000-0,005; ND = Nicht detektiert
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Interessanterweise
wurde gefunden, dass die Jammu-Probe die maximale Menge (fast das
Doppelte der nächstliegenden
Probe mit der maximalen Menge, d.h. der Ramgarh-Probe) aufwies.
Weiterhin wurde gefunden, dass Verbindung 1 in Blättern konzentriert
war (das 5-fache der Menge, die in Stämmen/Stängeln/Stielen vorliegt) und
in Wurzeln abwesend war.
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Durch
die Ergebnisse wurde auch das Erfordernis hervorgehoben, in einer
weiteren Untersuchung von B. diffusa zur Inhibition von PTH-stimulierter
Knochenresorption standard isierte Extrakte zu haben, die bekannte
Mengen der Verbindung der Formel 1 enthielten. Weiterhin kann der
Blätterextrakt
der ganzen Pflanze vorgezogen werden, da der Erstgenannte reich
an Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
(1), dem aktiven Bestandteil, ist.
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Das
Verfahren zur Isolation von bioaktivem Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
der Formel 1 aus Boerhavia diffusa umfasst:
- (a)
Zerkleinern des Pflanzenmaterials durch bekannte Verfahren,
- (b) Herstellen eines Extrakts des zerkleinerten Pflanzenmaterials
mit einem alkoholischen Lösungsmittel, ausgewählt aus
Feinsprit, Methanol und wässerigem
Methanol,
- (c) Konzentrieren des alkoholischen Extrakts mittels eines herkömmlichen
Verfahrens,
- (d) Triturieren des oben erwähnten
Extrakts nacheinander mit organischem Lösungsmittel in der Reihenfolge
zunehmender Polarität,
um eine angereicherte bioaktive Fraktion zu erhalten,
- (e) Kristallisieren und Umkristallisieren mit Methanol durch
herkömmliche
Verfahren, um Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
zu erhalten.
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Charakterisierung von
Verbindung 1
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Verbindung
1, der als gelber amorpher Feststoff erhalten wird [[α]D-26,6 (c 0,03, Methanol). Das UV-Spektrum
der Verbindung von Formel 1 wies Banden auf (Bande-I-342 nm, Bande-II-270
nm), die für
Flavonoide charakteristisch sind. Ein bathochromer Shift (+45 nm)
der Bande-I bei Zugabe von Natriummethoxid zeigte die Gegenwart
einer Hydroxygruppe in 3-Position
an. 1H-NMR-Signale bei 6,88(2H, d, J=9 Hz)
und 8,11(2H, d, J=9 Hz) wies stark auf die Gegenwart von 4' OH mit keinen anderen
Substitutionen im B-Ring hin. Das 1H-NMR-Spektrum zeigte auch
die Gegenwart zweier Methoxylgruppen (δ 3,75, 3,93, 3H jeweils, s),
einer Hydroxygruppe an 5-Position (δ 12,56, br s) und eines anomeren
Zuckerprotons (δ 5,41,
1H, d, J=7,5 Hz). Ein Literaturvergleich der 13C-Signale
des Zuckers führte
zu dessen Identität
als Galactose [Markham, K. R.; Chari V. M. Carbon-13 NMR spectroscopy
of flavonoids. In The flavonoids: Advances in Research; Harborne,
J. B.; Mabry, T. J., Eds; Chapman & Hall: London, 1982; Kapitel 2, S.
19-134)]. Das Molekulargewicht
von 1 wurde zu 492 ermittelt (aus FAB-MS), und das des Aglycons
zu 330(aus EI-MS). Das Aglycon wies somit drei Hydroxygruppen auf,
von denen eine an Galactose gebunden war, und zwei Methoxylgruppen,
was durch die Bildung von Hexaacetat bestätigt wurde. Da freie Hydroxyle
an 5- und 4'-Positionen
bestätigt
waren, war die glycosidische Bindung an 3-Position offensichtlich.
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Die
Positionen der zwei Methoxylgruppen wurden den C-6- und 7-Positionen
zugeordnet, da das NMR-Signal des Protons (δ 6,86, 1H, s) keine Verschiebung
bei Acetylierung von 5-OH zeigte, wodurch die Möglichkeit dessen Gegenwart
in 6-Position ausgeschlossen
wurde. Weiterhin waren die 13C-Signale bei δ 92,0 (C-6),
60,9 (6-OCH3) und 57,3 (7-OCH3)
in Übereinstimmung
mit den für ähnliche
Substitutionen im B-Ring vorgeschlagenen Werten [Horie, T.; Ohtsuru,
Y.; Shibata, K.; Yamashita, K.; Tsukayama, M.; Kawamura, Y. Phytochemistry
47, 865-874(1998)].
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Somit
wurde die Struktur von 1 als 5,4'-Dihydroxy-6,7-dimethoxy-flavonol-3-O-β-D-galactosid
(Eupalitin oder 3-O-β-D-Galactopyranosid)
abgeleitet. Die höhere
Ausbeute von Verbindung 1 aus den Blättern der Jammu-Probe wurde
weiter bestätigt
und durch die Tatsache standardisiert, dass ähnliche Ausbeuten der Verbindung
1 (~ 0,2 bis zu 0,4%). aus der Pflanze erhalten wurde, die aus Jammu
in 1996, 1998 und 1999 gewonnen wurde. Die Pflanze ist in der Jammu-Region
während
und nach der Regenzeit (Juli – Oktober)
im Überfluss erhältlich.
Andererseits enthielten Proben, die von anderen Orten von Indien
gewonnen wurden, weniger Mengen an 1, wie durch HPLC bestimmt wurde
(Tabelle 1), was diese weniger geeignet und zu weniger wirtschaftlichen
Ausgangsmaterialien zur Isolation von 1 machte.
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Somit
ist der Ort der Gewinnung des Rohmaterials (Boerhavia diffusa),
die Extraktion und das Isolationsverfahren von 1 für eine maximale
Ausbeute der Verbindung standardisiert worden. Das einfache und
neue Verfahren ist insbesondere zur schnellen Isolation der Verbindung
aus der Pflanze für
alle Zwecke geeignet.
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Bevorzugt
umfasst das Verfahren zur Isolation von bioaktivem Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
(1) aus Boerhavia diffusa:
- (a) Zerkleinern
des Pflanzenmaterials,
- (b) Herstellen eines alkoholischen Extrakts des Pflanzenmaterials
durch heiße
kontinuierliche Extraktion in einer Soxhlet-Apparatur unter Verwendung
von Feinsprit, Methanol oder wässerigem
Methanol,
- (c) Konzentrieren des alkoholischen Extrakts,
- (d) aufeinanderfolgendes Triturieren [Triturieren bedeutet schütteln des
Extrakts mit dem Lösungsmittel] des
alkoholischen Extrakts mit Hexan, Dichlormethan, Chloroform oder
Ethylacetat, um eine angereicherte bioaktive Fraktion zu erhalten,
und
- (e) Kristallisieren und Umkristallisieren mit polaren Lösungsmitteln,
um Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid zu
erhalten.
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Die
durch das Verfahren der Erfindung, wobei Rohmaterial von einem geeigneten
Ort gewonnen wird, der Teil der Pflanze verwendet wird, der die
maximale Menge an 1 enthält,
und wobei aufwendige chromatografische Verfahren nicht eingesetzt
werden, erhaltene Ausbeute an 1 ist fast 300-mal mehr als die in
der Literatur berichtete Ausbeute, wo ein Verfahren eingesetzt wird,
bei dem eine aufwendige und zeitintensive präparative Dünnschichtchromatografie eingesetzt
wird, die nicht zur Isolation großer Mengen des Bestandteils geeignet
ist.
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Die
Erfindung wird ausführlich
durch die unten angegebenen Beispiele beschrieben, die nicht als
den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränkend angesehen werden sollten.
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Beispiel 1
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Die
im Schatten getrockneten, zerkleinerten Boerhaviadiffusa-Blätter (1
kg) wurden mit Feinsprit durch heiße kontinuierliche Extraktion
in einer Soxhlet-Apparatur für
32 Stunden extrahiert. Der Feinsprit wurde unter vermindertem Druck
verdampft, wobei eine dunkelgrüne
Masse erhalten wurde, und dieser Extrakt wurde nacheinander mit
Hexan, Chloroform und Ethylacetat trituriert. Der Rückstand
wurde in Methanol gelöst
und über
Nacht im Kühlschrank
belassen, der Feststoff mittels Filtration abgetrennt, und mit Methanol
kristallisiert, wobei Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid (4,0 g)
erhalten wurde.
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Beispiel 2
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Die
im Schatten getrockneten, zerkleinerten Boerhaviadiffusa-Blätter (1
kg) wurden mit Methanol durch heiße kontinuierliche Extraktion
in einer Soxhlet-Apparatur für
32 Stunden extrahiert. Methanol wurde unter vermindertem Druck verdampft,
wobei eine dunkelgrüne
Masse erhalten wurde, und dieser Extrakt wurde nacheinander mit
Hexan, Chloroform und Ethylacetat trituriert. Der Rückstand
wurde in Methanol gelöst
und über
Nacht im Kühlschrank
belassen, der Feststoff mittels Filtration abgetrennt, und mit Methanol
kristallisiert, wobei Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid (3,5 g)
erhalten wurde.
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Beispiel 3
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Die
im Schatten getrockneten, zerkleinerten Blätter von Boerhavia diffusa
(1 kg) wurden mit Feinsprit (4 × 4
l) für
einen Zeitraum von 64 Stunden perkoliert. Der Feinsprit wurde unter
vermindertem Druck verdampft, wobei eine dunkelgrüne Masse
erhalten wurde, und dieser Rückstand
wurde nacheinander mit Hexan, Chloroform und Ethylacetat trituriert.
Der Rückstand
wurde in Methanol gelöst
und über
Nacht im Kühlschrank stehen
gelassen, filtriert, der Feststoff abgetrennt, und mit Methanol
kristallisiert, wobei Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid (2,8 g)
bereitgestellt wurde.
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Beispiel 4
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Die
im Schatten getrockneten, zerkleinerten Stämme/Stiele/Stängel von
Boerhavia-diffusa (1 kg) wurden mit Feinsprit durch heiße kontinuierliche
Extraktion in einer Soxhlet-Apparatur
für 32
Stunden extrahiert. Der Feinsprit wurde unter vermindertem Druck
verdampft, wobei ein Rückstand
erhalten wurde, und dieser Rückstand
wurde nacheinander mit Hexan, Chloroform und Ethylacetat trituriert.
Der Rückstand
wurde in Methanol gelöst
und über
Nacht im Kühlschrank
belassen, der Feststoff mittels Filtration abgetrennt, und mit Methanol
kristallisiert, wobei Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid (0,7 g)
erhalten wurde.
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Beispiel 5
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Die
im Schatten getrockneten, zerkleinerten oberirdischen Teile von
Boerhavia diffusa (1 kg) wurden mit Feinsprit durch heiße kontinuierliche
Extraktion in einer Soxhlet-Apparatur für 32 Stunden extrahiert. Der Feinsprit
wurde unter vermindertem Druck verdampft, wobei eine dunkelgrüne Masse
erhalten wurde, und dieser Extrakt wurde nacheinander mit Hexan,
Chloroform und Ethylacetat trituriert. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und über Nacht
im Kühlschrank
belassen, der Feststoff mittels Filtration abgetrennt, und mit Methanol
kristallisiert, wobei Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid (1,2 g)
erhalten wurde.
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Beispiel 6
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Die
im Schatten getrockneten, zerkleinerten Blätter von Boerhavia diffusa
(1 kg) wurden mit 80% wässerigem
Methanol (4 × 4
l) für
einen Zeitraum von 64 Stunden perkoliert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem
Druck verdampft, wobei eine dunkelgrüne Masse erhalten wurde, und
dieser Extrakt wurde nacheinander mit Hexan, Chloroform und Ethylacetat
trituriert. Der Rückstand
wurde in Methanol gelöst
und über Nacht
im Kühlschrank
belassen, filtriert, der Feststoff abgetrennt, und mit Methanol
kristallisiert, wobei Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid (3,0 g)
erhalten wurde.
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Vorteile:
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- 1. Dies ist ein neues Verfahren, durch welches
Eupalitin 3-O-β-D-Galactopyranosid
isoliert werden kann.
- 2. Das einfache Verfahren ist insbesondere zur schnellen Isolation
der Verbindung aus der Pflanze für
alle Zwecke geeignet.
- 3. Im Verfahren wird ein hochgradig wirtschaftliches Rohmaterial
eingesetzt, welches in der Natur im Überfluss vorhanden ist.
- 4. Das in dem Verfahren verwendete Konzept macht es ideal und
leicht für
einen Scale-up.
- 5. Das Verfahren liefert eine garantierte Ausbeute, da es bezüglich des
Orts der Gewinnung des Pflanzenmaterials standardisiert worden ist.
- 6. Bei dem Verfahren ist keine aufwendige chromatografische
Prozedur zur Reinigung und Isolation der Verbindung vorgeschrieben,
wohingegen die zuvor berichtete Prozedur eine teure, aufwendige
und zeitintensive präparative
Dünnschichtchromatografie
beinhaltet, bei der winzige Mengen der Verbindung der Formel 1 erhalten
werden.
- 7. Das Verfahren bietet eine Ausbeute, die das 300 mal höher ist
als die, die in der Literatur berichtet wurde.
