DE60203692T2

DE60203692T2 - Latency associated peptide von tgf-beta um pharmazeutisch aktive proteine latent zu machen

Info

Publication number: DE60203692T2
Application number: DE60203692T
Authority: DE
Inventors: Yuti Chernajovsky; Hanna Stina Dreja; Gillian Adams
Original assignee: Queen Mary and Westfiled College University of London
Current assignee: Queen Mary University of London
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2002-01-09
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2022-01-10
Also published as: ES2240740T3; DK1349944T3; ATE293169T1; AU2002219345B2; US6942853B2; WO2002055098A3; JP4201253B2; WO2002055098A2; EP1349944B1; GB0100551D0; DE60203692D1; US20020151478A1; EP1349944A2; JP2004520031A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Proteinen, Proteinderivaten und DNA-Konstrukten, die pharmazeutisch aktiven Proteinen Latenz verleihen. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, um pharmazeutisch aktive Proteine mit Latenz zu versehen, sowie Verfahren, um latenten pharmazeutisch aktiven Proteinen eine ortsspezifische Aktivierung zu verschaffen.
Die meisten der Cytokine und Wachstumsfaktoren werden unter streng kontrollierten Bedingungen exprimiert. Ihre Genexpression wird durch Reize aus der Umgebung wie etwa Infektion, Zell-Zell-Interaktionen, Veränderungen der extrazellulären Matrixzusammensetzung und Interaktionen mit Adhäsions-Molekülen oder durch Stimulation mit anderen Cytokinen reguliert.
Es erfolgt nicht nur eine Regulation auf transkriptionalem und posttranskriptionalem Niveau, sondern einige Cytokine werden nur dann in das Medium freigesetzt, wenn ein zweites Signal die Zelle aktiviert. Ein drittes Regulationsniveau der Cytokinaktivität ist bei Molekülen festgestellt worden, die in einer latenten Form sekretiert und durch das Freisetzen der Cytokin-Komponente dort "aktiviert" werden, wo Prozesse der Entzündung, Wundheilung und Gewebereparatur stattfinden (Khalil N, Microbes and Infection, 1, 1255-1263 (1999)). Unter diesem letzteren Gesichtpunkt ist dem transformierenden Wachstumsfaktor Beta (TGFβ) die größte Aufmerksamkeit zuteil geworden (siehe beispielsweise WO 0 020 449).
TGFβ wird als ein dimeres latentes Cytokin synthetisiert, das aus einem amino-terminalen, mit Latenz assoziierten Protein (LAP) und dem aktiven TGFβ-Cytokin an seinem COOH-Terminus besteht (Roberts und Sporn: Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB and Roberts, AB, Springer-Verlag, 419-472 (1996); Roth-Eicchorn et. al.: Hepatology, 28, 1588-1596 (1998)). Das Vorläuferpeptid enthält ein Signalpeptid (Reste 1-29), das für die Proteinsekretion und um das Molekül durch den Golgi-Apparat zu führen, damit es durch proteolytische Spaltung und Glycosylierung bearbeitet wird, erforderlich ist. Die LAP-Domäne wird durch proteolytische Spaltung bei Argininen (277-278) vom TGFβ getrennt. Das reife TGFβ beginnt bei Alanin 279. Das LAP schützt nicht nur das TGFβ, sondern enthält wichtige Reste, die für die Interaktion mit anderen Molekülen erforderlich sind. Mutationen im LAP-Bereich sind vor kurzem mit dem autosomal dominanten Camurati-Engelmann-Syndrom in Zusammenhang gebracht worden (Janssens u.a.: Nature Genetics, 26, 273-275 (2000)). Die Cysteine 224 und 226 sind für die intermolekulare Disulfid-Bindung zwischen zwei LAPs wichtig.
Ihre Mutation zu Serin lässt das Molekül "aktiv" werden (Sanderson et.al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2572-2576 (1995); Brunner et. al.: Mol. Endocrinol 6, 1691-1700 (1992); Brunner et. al.: J. Biol. Chem, 264, 13660-13664 (1989)). Das RGD-Motiv (245-247) fördert die Interaktion mit Integrinen ((Munger et. al.: Mol. Biol. of the Cell, 9, 2627-2638 (1998); Derynck R.: TIBS, 19, 548-553 (1994)). Nukleinsäure, die TGFβ codiert, ist in US 5 801 231 beschrieben.
In den meisten der untersuchten Zelltypen, einschließlich jener mesenchymalen, epithelialen und endothelialen Ursprungs, wird TGFβ in einer latenten Form sekretiert, die aus TGFβ und seinen LAP- (mit Latenz assoziierten Peptid) Propeptid-Dimeren besteht, die kovalent an latente TGFβ-bindende Proteine (LTBPs) gebunden sind. LTBPs werden außerdem für die Sekretion und Faltung von TGFβ benötigt ((Miyazano et.al.: EMBO J. 10, 1091-1101 (1991); Miyazano et.al.: J. Biol. Chem. 267, 5668-5675 (1992); Eklov et.al.: Cancer Res. 53, 3193-3197 (1993)). Das Cystein 33 ist für die Disulfid-Brücke mit der dritten 8-Cystein-reichen Wiederholung des latenten TGFβ-bindenden Proteins (LTBP) wichtig (Saharinen et.al.: The EMBO Journal, 15, 245-253 (1996)). Eine Modifikation des LTBP durch Enzyme, wie etwa Thrombospondin (Schultz et.al.: The Journal of Biological Chemistry, 269, 26783-26788 (1994); Crawford et.al.: Cell, 93, 1159-1170 (1998)), Transglutaminase (Nunes et.al.: J. Cell. Biol. 136, 1151-1163 (1997); Kojima et.al.: The Journal of Cell Biology, 121, 439-448 (1993)) und MMP9, MMP2 (Yu und Stamenkovic, Genes and Dev, 14, 163-176 (2000)) könnte den aktiven Abschnitt des TGFβ von dem latenten Komplex lösen.
Cytokine sind Naturprodukte, die als lösliche, lokale Vermittler von Zell-Zell-Interaktion dienen. Sie zeigen eine Vielfalt von pleiotropen Aktionen, wovon einige für therapeutische Zwecke nutzbar gemacht werden können. Das Targeting von Cytokinen auf spezifische Zelltypen unter Verwendung von scFv (Lode et.al., Pharmacol. Ther, 80, 277-292 (1998)) und vWF (Gordon et.al..: Human Gene Therapy, 8, 1385-1394 (1997)) hat sich ausschließlich auf die aktive Cytokinkomponente des Cytokinkomplexes konzentriert.
Pharmakologisch wirksame Proteine oder andere Arzneistoffe auf der Grundlage solcher Agenzien, die in sehr hohen Konzentrationen systemisch verabreicht werden müssen, damit biologisch wirksame Konzentrationen in dem Gewebe, auf das abgezielt wird, erreicht werden, neigen dazu, unerwünschte systemische Wirkungen zu verursachen beispielsweise Toxizität, wodurch ihr Nutzen und ihre Wirksamkeit beschränkt sind.
Die betreffenden Erfinder haben eine Methode entwickelt, um die toxische Wirkung einer systemischen Verabreichung wirksamer biologischer Agenzien zu überwinden.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Fusionsprotein geschaffen, das ein mit Latenz assoziiertes Peptid (LAP) von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle aufweist, um einem pharmakologisch-aktiven Protein Latenz zu verleihen.
Außerdem schafft der erste Aspekt der Erfindung ein Fusionsprotein, das ein LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle aufweist, um ein latentes pharmazeutisch aktives Protein ortsspezifisch zu aktivieren. So, wie der Ausdruck "ortsspezifisch aktivieren" hier gebraucht wird, hat er eine allgemeine Bedeutung und ist nicht auf das Beseitigen oder Reduktion der Latenz, die einem pharmazeutisch aktiven Protein verliehen worden ist, durch ortsspezifsche Spaltung an der proteolytischen Spaltstelle beschränkt.
Es wird erwartet, dass ein ortsspezifisches Spalten an der proteolytischen Spaltstelle mit der wiedergergestellten Aktivierung des pharmazeutisch aktiven Proteins einhergeht.
So, wie der Ausdruck "latent pharmazeutisch aktives Protein" hier gebraucht wird, schließt er pharmazeutisch aktive Proteine ein, die auf Grund ihrer Assoziation mit LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und einer Matrix-Metallproteinase (MMP)₃-proteolytischen Spaltstelle, latent sind. Insbesondere kann das pharmazeutisch aktive Protein kraft seiner Fusion an eine LAP-assoziierte proteolytische Spaltstelle latent sein, so dass ein latentes Fusionsprotein gebildet wird.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein in vitro-Verfahren geschaffen, um einem pharmazeutisch aktiven Protein Latenz zu verleihen, wobei das Verfahren das Assoziieren eines Fusionsproteins, das ein mit Latenz assoziiertes Peptid (LAP) von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle aufweist, mit dem pharmazeutisch aktiven Agens beinhaltet.
Der Ausdruck "Protein" hat in diesem Text allgemein die Bedeutung von mehreren Aminosäureresten, die durch Peptidbindungen zusammengefügt sind. Er wird austauschbar und in der gleichen Bedeutung wie Peptid, Oligopeptid, Oligomer oder Polypeptid gebraucht und schließt Glykoproteine sowie Derivate davon ein. Außerdem soll der Ausdruck "Protein" Fragmente, Analoge und Derivate eines Proteins einschließen, wobei das Fragment, Analogon oder Derivat im Wesentlichen die gleiche biologische Wirksamkeit oder Funktion wie ein Referenzprotein beibehält.
Das Fragment, Analogon oder Derivat des Proteins, wie in diesem Text definiert, sind mindestens 6, vorzugsweise 10 oder 20 oder bis zu 50 oder 100 Aminosäuren lang sein.
Das Fragment, Derivat oder Analogon des Proteins kann (i) ein solches sein, bei dem einer oder mehrere der Aminosäurereste durch einen konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einen konservierten Aminosäurerest) substituiert sind, wobei ein solcher substituierter Aminosäurerest durch den genetischen Code codiert sein könnte, dies jedoch nicht sein muss, oder (ii) ein solches sein, bei dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine substituierte Gruppe enthalten, oder (iii) ein solches sein, bei dem das reife Peptid mit einer weiteren Verbindung fusioniert ist, wie etwa einer Verbindung, die die Halbwertszeit des Polypeptids erhöht (beispielsweise Polyethylenglykol), oder (iv) ein solches sein, bei dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, wie etwa eine Führungs- oder sekretorische Sequenz, die für die Reinigung des Polypeptids gebraucht wird. Derartige Fragmente, Derivate und Analoge werden ausgehend von den hier gegebenen Ansätzen als im Kompetenzbereich des Fachmanns erachtet.
Besonders bevorzugt werden Varianten, Analoge, Derivate und Fragmente mit der Aminosäuresequenz des Proteins, wobei mehrere z.B. 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste in beliebiger Kombination substituiert, deletiert oder addiert sind. Besonders bevorzugt darunter sind stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten des Proteins der vorliegenden Erfindung nicht verändern. Außerdem werden in diesem Zusammenhang konservative Substitutionen besonders bevorzugt.
Ein Beispiel für eine Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Fusionsprotein wie oben definiert, abgesehen von der Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere andere Aminosäuren. Dem Fachmann ist klar, dass verschiedene Aminosäuren ähnliche Eigenschaften aufweisen. Eine oder mehrere solche Aminosäuren einer Substanz können oftmals durch eine oder mehrere andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne eine gewünschte Aktivität der Substanz auszuschalten.
So können oft die Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin (Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten) gegeneinander ausgetauscht sein. Von diesen möglichen Substitutionen wird bevorzugt, dass Glycin und Alanin gegeneinander austauschbar verwendet werden (da sie verhältnismäßig kurze Seitenketten aufweisen) und dass Valin, Leucin und Isoleucin gegeneinander austauschbar verwendet werden (da sie längere aliphatische Seitenketten aufweisen, die hydrophob sind). Weitere Aminosäuren, die oftmals gegeneinander ausgetauscht sein können, umfassen Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan (Aminosäuren, die aromatische Seitenketten aufweisen); Lysin, Arginin und Histidin (Aminosäuren, die basische Seitenketten aufweisen), Aspartat und Glutamat (Aminäusäuren, die saure Seitenketten aufweisen), Asparagin und Glutamin (Aminosäuren die Amid-Seitenketten aufweisen) und Cystein und Methionin (Aminosäuren, die schwefelhaltige Seitenketten aufweisen). Substitutionen dieser Art werden oftmals als "konservative" oder "semikonservative" Aminosäuresubstitutionen bezeichnet.
Was die Aminosäuresequenz für das Fusionsprotein wie oben angegeben betrifft, so können außerdem Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren vorgenommen werden. So könnten beispielsweise Aminosäuren, die keine wesentliche Wirkung auf die Aktivität des Polypeptids haben oder die zumindest eine solche Aktivität nicht ausschalten, deletiert werden. Derartige Deletionen können vorteilhaft sein, da sich die Gesamtlänge und die relative Molekülmasse eines Polypeptids verringert, wohingegen es seine Aktivität beibehält. Dies kann ermöglichen, das Ausmaß des Polypeptids, das für einen bestimmten Zweck erforderlich ist, zu verringern, wodurch sich beispielsweise Einsatzmengen reduzieren lassen.
Was die Sequenz des oben angegebenen Fusionsproteins betrifft, so können auch Insertionen von Aminosäure vorgenommen werden. Diese können erfolgen, um die Eigenschaften einer Substanz der vorliegenden Erfindung zu verändern (z.B. um die Identifizierung, Reinigung oder Expression zu unterstützen, wie weiter oben im Zusammenhang mit Fusionsproteinen erläutert worden ist).
In Bezug auf die oben unter a) angegebene Sequenz können Aminosäureänderungen mit jedem geeigneten Verfahren vorgenommen werden, z.B. mit einer ortsgerichteten Mutagenese.
Es ist darauf zu achten, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung Aminosäuresubstitutionen oder -insertionen mit natürlich vorkommenden oder nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren vorgenommen werden können. Ganz gleich, ob natürliche oder synthetische Aminosäuren verwendet werden, es liegen vorzugsweise nur L-Aminosäuren vor.
Ein Protein gemäß der Erfindung kann zusätzliche N-terminale und/oder C-terminale Aminosäuresequenzen aufweisen. Derartige Sequenzen können aus verschiedenen Gründen vorgesehen sein, beispielsweise für eine Glycosylierung.
Der Ausdruck "Fusionsprotein" hat in diesem Text im Allgemeinen die Bedeutung, dass ein oder mehrere Proteine durch chemische Mittel und/oder mittels Peptidbindungen durch Proteinsynthese miteinander verbunden worden sind.
Das mit Latenz assoziierte Peptid (LAP) der vorliegenden Erfindung enthält die Codierungssequenz für die Vorläuferdomäne von TGFβ oder eine Sequenz, die im Wesentlichen mit dieser identisch ist.
"Identität" ist, wie dem Fachmann bekannt ist, die Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, die durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt wird. Außerdem hat Identität im Fach auch die Bedeutung des Grades der Sequenzverwandtschaft zwischen Polypeptid- bzw. Polynukleotidsequenzen, der anhand der Übereinstimmung der geordneten Folgen solcher Sequenzen bestimmt werden kann. Trotzdem es eine Anzahl von Verfahren gibt, um die Identität zwischen zwei Polypeptiden oder zwei Polynukleotidsequenzen zu messen, sind die Verfahren, die gemeinhin benutzt werden, um die Identität zu bestimmen, in Computerprogrammen codifiziert. Bevorzugte Computerprogramme zur Bestimmung der Identität zweier Sequenzen schließen das GCG-Programmpaket (Devereux et. al.: Nucleic acids Research, 12, 387 (1984)), BLASTP, BLASTN und FASTA (Atschul et.al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)) ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Das LAP der vorliegenden Erfindung weist die Vorläuferdomäne von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 für beispielsweise das Vorläuferpeptid von (menschlichem) TGFβ-1, -2, oder -3 (Derynck et.al.: Nature, 316, 701-705 (1985); De Martin et.al.: EMBO J. 6, 3673-3677 (1987); Hanks et.al.: Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 79-82 (1988); Derynck et.al-: EMBO J. 7, 3737-3743 (1988); Ten Dyke et.al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4715-4719 (1988)), TGFβ-4 (vom Huhn) (Jakowlew et.al.: Mol. Endocrinol. 2, 1186-1195 (1988)) oder TGFβ-5 (vom Krallenfrosch) (Kondaiah et.al.: J. Biol. Chem. 265, 1089-1093 (1990)) auf. Der Ausdruck "Vorläuferdomäne" definiert eine Sequenz, die ein Vorläuferpeptid codiert, das nicht die Sequenz enthält, die das reife Protein codiert. Die Aminosäuresequenzen der Vorläuferdomäne von TGFβ-1, -2, -3, -4 und -5 (Roberts und Sporn: Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB and Roberts, AB, Springer-Verlag, Kapitel 8, 422 (1996)) sind in 3 gezeigt.
Vorzugsweise weist die Aminosäuresequenz des LAP bei Verwendung der voreingestellten Parameter des BLAST-Computerprogramms (Atschul et.al.: J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)), das vom HGMP (Human Genome Mapping Project) zur Verfügung gestellt wird, auf Aminosäureniveau wenigstens eine 50 %-Identität mit der Vorläuferdomäne des TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 (Roberts und Sporn: Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB and Roberts, AB, Springer-Verlag, Kapitel 8, 422 (1996)), die in 3 gezeigt ist, auf. Vorzugsweise kann das LAP eine Identität von wenigstens 60 %, 70 %, 80 %, 90 % und stärker bevorzugt von 95 % (noch stärker bevorzugt von wenigstens 99 %) auf Nukleinsäure- oder Aminosäureniveau mit der Vorläuferdomäne von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5, wie in 3 gezeigt, aufweisen.
Das LAP schließt das LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 und -5 (Roberts und Sporn: Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB and Roberts, AB, Springer-Verlag, Kapitel 8, 422 (1996)), das in 3 gezeigt ist, ein.
Das LAP kann wenigstens zwei, beispielsweise wenigstens 4, 6, 8, 10 oder 20 Cystein-Reste enthalten, die Disulfid-Bindungen ausbilden.
Das LAP kann eine schützende "äußere Hülle" rings um das pharmazeutisch aktive Agens sein. Dadurch wird das pharmazeutisch aktive Agens geschützt, und seine Interaktion mit anderen Molekülen an der Zelloberfläche oder mit Molekülen, die für seine Aktivität wichtig sind, wird aufgehalten oder verhindert.
Das LAP kann die Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotide 1-832 von 1 oder die Nukleotide 598-1352 von 2 codiert ist, aufweisen oder eine Sequenz, die bei Verwendung der voreingestellten Parameter des BLAST-Computerprogramms, das vom HGMP zur Verfügung gestellt wird, eine Identität von wenigstens 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 99 % damit hat.
Die proteolytische Spaltstelle ist eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-Spaltstelle.
Die MMP-Spaltstelle kann irgendeine Aminosäuresequenz aufweisen, die mittels einer MMP spaltbar ist. Die Aminosäuresequenz der MMP-Spaltstelle kann durch die Nukleotide 844-861 von 1 oder die Nukleotide 565-585 von 2 oder eine Sequenz von Nukleotiden, die bei Verwendung der voreingestellten Parameter des BLAST-Computerprogramms, das vom HGMP zur Verfügung gestellt wird, eine Identität von wenigstens 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 99 % damit hat, codiert sein. Vorzugsweise weist die Nukleinsäuresequenz, welche die MMP-Spaltstelle codiert, die kleinstmögliche Anzahl von Aminosäurenresten auf, die für ein Erkennen und Spalten mittels MMP erforderlich ist.
Eine MMP-Spaltstelle kann eine Anzahl von Aminosäureresten aufweisen, die von der MMP erkannt werden können. Außerdem können die Aminosäuren der MMP-Spaltstelle durch eine oder mehrere Peptidbindungen die mittels MMP proteolytisch spaltbar sind, verkettet sein. MMPs, die die MMP-Spaltstelle spalten können, schließen MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 oder MMP10 (Yu und Stamenkovic, Genes and Dev. 14, 163-176 (2000); Nagase und Fields: Biopolymers, 40, 399-416 (1996); Massova et.al.: J. Mol. Model. 3, 17-30 (1997); zusammengestellt in: Vu und Werb: Genes and Dev. 14, 2123-2133 (2000)) ein, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein. Die Sequenzen der Protein-Spaltstellen von MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 und MMP10 sind in 4 gezeigt.
Vorzugsweise wird die proteolytische Spaltstelle der vorliegenden Erfindung an Orten der Entzündung und des Gewebeumbaus gespaltet. Insbesondere ist die proteolytische Spaltstelle der vorliegenden Erfindung eine MMP-Spaltstelle, die z.B. aus der Gruppe aus MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 oder MMP10, wie in 4 gezeigt, ausgewählt ist.
Ferner stellt die Erfindung eine Nukleinsäure bereit, die das Fusionsprotein des ersten und zweiten Aspekts der Erfindung codiert. Die Nukleinsäure, die das Fusionsprotein codiert, kann die Nukleotide 1-861 von 1 oder die Nukleotide 585-1352 von 2 oder eine Sequenz von Nukleotiden, die bei Verwendung der voreingestellten Parameter des BLAST-Computerprogramms, das vom HGMP zur Verfügung gestellt wird, eine Identität von mindestens 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 99 % damit hat, aufweisen.
Die vorliegende Erfindung kann ferner ein "Linker"-Peptid bereitstellen. Vorzugsweise ist das Linker-Peptid an die Aminosäuresequenz der proteolytischen Spaltstelle gekoppelt. Das Linker-Peptid kann am C-Terminus oder am N-Terminus der Aminosäuresequenz, welche die Stelle der proteolytischen Spaltung codiert, vorgesehen sein. Vorzugsweise ist das Linker-Peptid mit der Aminosäuresequenz der proteolytischen Spaltstelle zusammenhängend. Das Linker-Peptid kann die Aminosäuresequenz aufweisen, die durch die Nukleotide 831-843 und/oder 862-873 von 1 oder die Nukleotide 553-564 und/oder 586-597 von 2 oder eine Sequenz von Nukleotiden, die bei Verwendung der voreingestellten Parameter des BLAST-Computerprogramms, das vom HGMP zur Verfügung gestellt wird, eine Identität von wenigstens 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 99 % damit hat, codiert ist.
Der Ausdruck "Linker-Pepid" soll eine Sequenz von Aminosäureresten definieren, die vorzugsweise eine hydrophile Region aufweist, wenn sie in einem exprimierten Protein enthalten ist. Eine solche hydrophile Region kann die Spaltung durch ein Enzym an der proteolytischen Spaltstelle begünstigen.
So, wie der Ausdruck "Latenz" hier gebraucht wird, kann er mit einer abschirmenden Wirkung im Zusammenhang stehen, die eine Interaktion des Fusionsproteins mit anderen Molekülen an der Zelloberfläche behindern könnte. Alternativ kann der Ausdruck "Latenz" gebraucht sein, um eine Verminderung der Aktivität (bis zu und einschließlich einer Ablation der Aktivität) eines Moleküls/Agens, das mit dem Fusionsprotein assoziiert ist, zu beschreiben. Außerdem könnte der Ausdruck "Latenz" mit einer Stabilisierungswirkung des Fusionsproteins im Zusammenhang stehen. Diese Wirkung kann umfassend oder teilweise sein, wobei eine teilweise Wirkung ausreichend ist, um die Latenz des Wirkstoffs zu erzielen.
Das pharmazeutisch aktive Protein kann, ohne hierauf beschränkt zu sein, einen Wachstumsfaktor (z.B. TGFβ, einen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), einen aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF), einen Nervenwachstumsfaktor (NGF), ein kolonienstimulierender Faktor (CSF), einen Leberzellen-Wachstumsfaktor, einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor, einen Plazenta-Wachstumsfaktor); einen Differenzierungsfaktor; ein Cytokin, z.B. Interleukin (beispielsweise IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 oder IL-21, entweder α oder β), Interferon (z.B. IFN-α, IFN-β and IFN-γ), einen Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), einen IFN-γ induzierender Faktor (IGIF), Knochen-morphogenetische Proteine (BMP); Chemokin (z.B. MIPs (Makrophage inflammatorisches Protein), beispielsweise MIP1α und MIP1β; MCPs (Monozyten chemotaktisches Protein) z.B. MCP-1, -2 oder -3; RANTES (regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted ); trophische Faktoren; Cytokininhibitoren; Cytokinrezeptoren; freie Radikale abfangende Enzyme, z.B. Superoxid-Dismutase oder -Katalase, Arnzeimittelvorläufer konvertierende Enzyme (z.B. Angiotensin konvertierendes Enzym, Deaminasen, Dehydrogenasen, Reduktasen, Kinasen und Phosophatasen); Peptidmimetika; Proteaseinhibitoren, einen Metallprotease-Gewebsinhibitor und einen Serinproteaseinhibitor einschließen. Vorzugsweise wird das pharmazeutisch aktive Protein von der zu behandelnden Spezies gewonnen, beispielsweise weist es für die Behandlung von Menschen eine menschliche Herkunft auf. Vorzugsweise ist das pharmazeutisch aktive Protein IFNβ.
So wie der Ausdruck "Peptidmimetika" hier gebraucht wird, schließt er Agenzien ein, ohne darauf beschränkt zu sein, die eine gewünschte Peptid-Hauptkette-Konformation aufweisen, die in ein Nichtpeptid-Gerüst eingebettet ist, welches das Peptid in einer bestimmten Konformation hält. Peptidmimetika, die einige der Nachteile von Peptiden nicht aufweisen, sind in den Fällen interessant, in denen Peptide für Anwendungen in der Medizin nicht geeignet sind.
Peptidmimetika können ein Peptidgerüst mit L- oder D-Konformation aufweisen. Beispiele für Peptidmimetika schließen Melanocortin, Adrenocorticotrophin Hormon (ACTH) und weitere Peptidmimetika, die im Zentralnervensystem bzw. im endokrinen System bei der Signalübertragung sowie bei Infektion und Immunität eine Rolle spielen, ein.
Der Ausdruck "assoziiert mit" soll im Kontext der vorliegenden Erfindung alle Mittel der Assoziation einschließlich der chemischen Vernetzung oder der Peptidbindung, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, einschließen.
In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung ferner das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung, wahlweise mit einem latent TGFβ-bindenden Protein (LTBP) assoziiert, bereit. Typisch ist das Fusionsprotein kovalent an das LTBP gebunden, so dass ein Komplex entsteht. Vorzugsweise ist die Assoziation durch Disulfid-Bindungen zwischen Cys Nr. 33 des LAP und dem dritten 8-Cys-Rest des LTBP vermittelt. Das mit dem Fusionsprotein assoziierte LTBP kann, ohne darauf beschränkt zu sein, LTBP-1, -2, -3 oder -4 (Kanzaki et.al..: Cell, 61, 1051-1061 (1990); Tsuji et.al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8835-8839 (1990); Moren et.al.: J. Biol. Chem. 269, 32469-32478 (1994); Yin et.al.: J. Biol. Chem. 270, 10147-10160 (1995); Gibson et.al.: Mol. Cell. Biol. 15, 6932-6942 (1995); Saharinen et.al.: J. Biol. Chem. 273, 18459-18469 (1998)) oder Fragmente von LTBP einschließen, wie etwa jene, die die dritte 8-Cys-Wiederholung aufweisen, oder Homologe mit einer Aminosäure- oder Nukleotidsequenz, die bei Verwendung der voreingestellten Parameter des BLAST-Computerprogramms, das von HGMP zur Verfügung gestellt wird, eine Identität von mindestens 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 99 % mit der von LTBP hat.
Die LTBP-Spaltung kann das Fusionsprotein von dem LTBP-Komplex freisetzen. Enzyme, die LTBP auf diese Weise spalten können, umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Thrombospondin (Schultz et.al.: The Journal of Biological Chemistry, 269, 26783-26788 (1994); Crawford et.al.: Cell, 93, 1159-1170 (1998)), Transglutaminase (Nunes et.al.: J. Cell. Biol. 136, 1151-1163 (1997); Kojima et.al.: The Journal of Cell Biology, 121, 439-448 (1993)), MMP9 und MMP2 (Yu und Stamenkovic, Genes and Dev, 14,163-176 (2000)).
Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt ein Nukleinsäurekonstrukt zur Verfügung, das eine erste Nukleinsäuresequenz, welche ein pharmazeutisch aktives Protein codiert und eine zweite Nukleinsäuresequenz enthält, die ein LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 codiert, wobei eine Nukleinsäuresequenz, die eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle codiert, zwischen der ersten und der zweiten Nukleinsäuresequenz vorgesehen ist.
Der Ausdruck "Nukleinsäurekonstrukt" bezieht sich allgemein auf eine Nukleinsäure beliebiger Länge, die DNA, cDNA oder RNA, wie etwa mRNA, sein kann, die durch Klonieren erhalten oder durch chemische Synthese erzeugt sein kann. Die DNA kann einzel- oder doppelsträngig sein. Eine einzelsträngige DNA kann der Strang codierende gleichsinnige oder kann der nicht codierende oder antisense-Strang sein. Für eine therapeutische Verwendung liegt das Nukleinsäurekonstrukt vorzugsweise in einer Form vor, die in dem zu behandelnden Subjekt exprimiert werden kann.
Vorzugsweise codiert die erste Nukleinsäuresequenz das Protein IFNβ. Die erste Nukleinsäuresequenz kann die Sequenz der Nukleotide von 874-1376 von 1 oder der Nukleotide 598-1452 von 2 oder eine Sequenz, die im Wesentlichen homolog dazu ist, aufweisen. In einer Ausführungsform der Erfindung codiert die erste Nukleinsäuresequenz IFNβ von Maus oder Mensch.
Das Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung kann in Form eines Vektors, beispielsweise eines Expressionsvektors, vorliegen und kann u.a. aus Chromosomal, Episomal und Viren abgeleitete Vektoren, beispielsweise Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, Bakteriophagen, Transposonen, Hefe-Episomen, Insertionssequenzen, Hefe-Chromosomenelementen, Viren, wie etwa Baculo-Viren, Papova-Viren wie etwa SV40, Vakziniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabies-Viren und Retrovieren, gewonnen sind, und Vektoren, die aus Kombinationen davon gewonnen sind, wie etwa jene, die aus Plasmid- und Bakteriophagen-Genelementen gewonnen sind, wie etwa Cosmide und Phagemide, einschließen. Im allgemeinen, jeder Vektor der fähig ist Nukleinsäure aufrecht zu erhalten, zu vermehren und zu exprimieren, um in einer Wirtszelle ein Polypeptid zu exprimieren, kann in diesem Zusammenhang verwendet werden.
Vorzugsweise ist das Nukleinsäurekonstrukt LAP-huIFNβ oder huIFNβ-LAP wie hier im Beispiel 4 definiert. Alternativ kann das Nukleinsäurekonstrukt LAP-mIFNβ sein, wie in 1 und schematisch in 5 gezeigt ist, oder mIFNβ-LAP, wie in 2 und schematisch in 5 gezeigt ist.
Ferner stellt die Erfindung ein Protein bereit, das durch das Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung codiert ist, wahlweise mit latent TGFβ-bindendem Protein (LTBP) wie hierin beschrieben assoziiert. Typisch ist das durch das Nukleinsäurekonstrukt codierte Protein kovalent an LTBP gebunden, so dass ein Komplex entsteht. Vorzugsweise ist die Assoziation durch Disulfid-Bindungen zwischen Cys Nr. 33 des LAP und dem dritten 8-Cys-Rest des LTBP vermittelt.
Das Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung enthält vorzugsweise eine Promotorsequenz oder eine andere Regulationssequenz, die die Expression der Nukleinsäure steuert. Die Expression einer Nukleinsäure steuernde Promotorsequenzen und andere Regulationssequenzen sind identifiziert worden und im Fach bekannt. Der Fachmann wird bemerken, dass es nicht erforderlich zu sein braucht, die gesamte Promotorsequenz oder davon verschiedene Regulationssequenzen zu verwenden. Es könnte nur das kleinste, unentbehrliche Regulationselement erforderlich sein, wobei genau genommen derartige Elemente benutzt werden können, um chimäre Sequenzen oder andere Promotoren zu bilden. Selbstverständlich ist es unbedingt erforderlich, die Gewebe- und/oder zeitliche Spezifität zu bewahren. Der Promotor kann irgendein geeigneter bekannter Promotor sein, beispielsweise der menschliche Cytomegalovirus- (CMV-) Promotor, der unmittelbar frühe CMV-Promotor, die HSV-Thymidinkinase, der frühe und späte SV40-Promotor oder die Promotoren retroviraler LTRs, wie etwa jene des Rous Sarcoma Virus (RSV), und Metallothionin-Promotoren wie etwa der Maus-Metallothionin-I-Promotor. Der Promotor kann das Minimum aufweisen, das für eine Promotoraktivität erforderlich ist (wie etwa TATA-Elemente ohne Verstärkerelemente), beispielsweise die Minimalsequenz des CMV-Promotors.
Vorzugsweise grenzt der Promotor an die erste und/oder zweite Nukleinsäuresequenz an. Wie hier dargelegt ist, kann das Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung in Form eines Vektors sein. Vektoren schließen häufig einen oder mehrere Expressionsmarker ein, die eine Selektion der damit transfizierten (oder transformierten) Zellen ermöglichen, um vorzugsweise eine Selektion von Zellen, die Vektoren enthalten, in die heterologe DNA eingebaut ist, zu ermöglichen. Im Allgemeinen werden geeignete Start- und Stoppsignale vorhanden sein.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Zelle, die das Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung enthält. Die Zelle kann als eine "Wirtszelle" bezeichnet werden, wobei sie für die Manipulation der Nukleinsäure, das Klonieren eingeschlossen, nützlich ist. Alternativ kann die Zelle eine Zelle sein, in der eine Expression der Nukleinsäure erzielt werden soll. Repräsentative Beispiele für Wirtszellen, die sich für eine Expression des Nukleinsäurekonstrukts der Erfindung eignen, schließen Virus-Hüllzellen, die einen Einschluss der Nukleinsäure in einen viralen Vektor ermöglichen, Bakterienzellen wie etwa von Streptococci, Staphylococci, E.coli, Streptomyces und Bacillus subtilis, Einzelzellen wie etwa Hefezellen, beispielsweise Zellen von Saccharomyces Cerevisiae and Aspergillus; Insektenzellen wie etwa S2-Zellen von Drosophila und Sf9-Zellen von Spodoptera, tierische Zellen wie etwa CHO, COS, C127, 3T3, PHK.293 und Bowes-Melanom-Zellen sowie weitere geeignete menschliche Zellen und Pflanzenzellen, beispielsweise von Arabidopsis thaliana, ein.
Die Induktion eines Expressionsvektors in die Wirtszelle kann durch Calcium-Phosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Mikroinjektion, kationische lipidvermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, "scrape loading"-Technik, Einbringung unter Verwendung von Mikroprojektilen, Infektion oder weitere Verfahren beeinflusst werden. Derartige Verfahren sind in vielen Standard-Laborhandbüchern, wie etwa Sambrook et.al.: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Zweite Auflage, Coldspring Harbor Laboratory Press, Coldspring Harbor, New York (1989), beschrieben.
In Wirtszellen, Säugerzellen wie etwa CHO-Zellen, Hefe, Bakterien oder weiteren Zellen inbegriffen, können unter der Steuerung durch entsprechende Promotoren reife Proteine exprimiert werden. Es können zellfreie Translationssysteme benutzt werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs, die vom dem Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind, zu erzeugen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen sind von Sambrook et.al.: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Zweite Auflage, Coldspring Harbor Laboratory Press, Coldspring Harbor, New York (1989), beschrieben worden.
Proteine können mittels wohl bekannter Verfahren, einschließlich der Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Präzipitation, Säureextraktion, der Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, der Phosphozellulose-Chromatographie, hydrophoben Wechselwirkungschromatographie, der Affmitätschromatographie, der Hydroxylapatit-Chromatographie, der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und der Lectin-Chromatographie, aus rekombinanten Zellkulturen gewonnen und gereinigt werden. Für Therapiezwecke könnte das Nukleinsäurekonstrukt, z.B. in Form eines rekombinanten Vektors, mittels im Fach bekannten Verfahren, etwa mittels Säulenchromatographie, wie in Sambrook et.al.: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Zweite Auflage, Coldspring Harbor Laboratory Press, Coldspring Harbor, New York (1989), beschrieben, gereinigt werden.
Unter einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung für eine Verwendung in der Medizin bereit. Das Konstrukt kann als Teil eines Expressionskonstrukts, z.B. in Form eines Expressionsvektors wie etwa eines Plasmids oder Virus verwendet werden. Das Konstrukt kann sich für die Verabreichung auf intravenösem, intradermalem, intramuskulärem, oralem oder einem anderen Weg eignen.
Das Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung und die darauf beruhenden Proteine können allein oder zusammen mit weiteren Verbindungen, wie etwa therapeutischen Verbindungen, z.B. entzündungshemmenden Arzneistoffen, zytotoxischen Agenzien, zytostatischen Agenzien oder Antibiotika, verwendet werden. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlichen Nukleinsäurekonstrukte und Proteine werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt, wobei sie vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt sind. Gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung schließt die Verwendung des Konstruktes in der Medizin an, angeschlossen ist jede Behandlungsweise, die einem Menschen oder einem nicht-menschlichen Tier Vorteile bringt. Der Ausdruck „nicht-menschliche Tiere" erstreckt sich auf Haustiere, darunter Pferde und Gefährten des Menschen (z.B. Katzen und Hunde) sowie Nutztiere, darunter Spezies der Familien der Schafe, Ziegen, Schweine, Rinder und Pferde. Die Verwendung kann hinsichtlich bestehender Beschwerden oder einer bestehenden Krankheit sein oder kann prophylaktisch (Präventivbehandlung) sein. Die Verwendung kann sich auf ein geerbtes oder erworbenes Leiden beziehen. Sie kann sich auf akute oder chronische Beschwerden beziehen. Vorzugsweise betrifft die Verwendung Beschwerden/Erkrankungen, die mit einer Entzündung verbunden sind. Die erste Nukleinsäuresequenz des Nukleinsäurekonstrukts des dritten Aspekts der Erfindung kann ein Protein für eine Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen codieren, wobei die Erkrankungen Osteoarthritis, Sklerodermie, Nierenkrankheit, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmkrankheit, Multiple Sklerose, Atherosklerose oder jede entzündliche Erkrankung oder Krebs einschließen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein.
Das Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung kann therapeutisch bei einer Gentherapie verwendet werden. Alternativ kann das Protein, das durch das Nukleinsäurekonstrukt codiert ist, für eine direkte Verabreichung geeignet sein, wie hier beschrieben worden ist. Eine Verabreichung des Nukleinsäurekonstrukts des dritten Aspekts kann mittels physikalischer Verfahren zum Zielort geleitet werden. Beispiele dafür schließen die topische Verabreichung von "nackter" Nukleinsäure in Form eines Vektors in einem geeigneten Transportmittel, beispielsweise in Lösung in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff, wie etwa phosphatgepufferte Kochsalzlösung, oder die Verabreichung eines Vektors mittels physikalischer Verfahren, wie etwa einen Beschuss mit Teilchen entsprechend den im Fach bekannten Verfahren, ein.
Weitere physikalische Verfahren zur Verabreichung des Nukleinsäurekonstrukts oder der Proteine des dritten Aspekts der Erfindung direkt an den Empfänger schließen Ultraschall, elektrische Stimulation, Elektroporation und Mikroimpfung ein. Weitere Verabreichungsverfahren umfassen die orale Verabreichung oder die Verabreichung durch Inhalation.
Besonders bevorzugt ist die Zuführung in Form der Mikroimpfung, wobei es sich um eine Methode handelt, um genetisches Material in situ in Zellen eines Patienten zu liefern. Diese Methode ist in dem US-Patent Nr. 5 697 901 beschrieben.
Außerdem kann das Nukleinsäurekonstrukt gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung mit Hilfe von Zuführungsvektoren verabreicht werden. Diese schließen virale Zuführungsvektoren wie etwa die im Fach bekannten Adenovirus- oder Retrovirus-Zuführungsvektoren ein. Weitere nichtvirale Zuführungsvektoren schließen Lipid-Zuführungsvektoren, darunter die im Fach bekannten Liposomen-Zuführungsvektoren, ein.
Die Verabreichung kann auch mittels transformierter Wirtszellen erfolgen. Derartige Zellen schließen Zellen ein, die von dem Subjekt, in welches das Nukleinsäurekonstrukt durch im Fach bekannte Gentransferverfahren zu übertragen ist, geerntet worden sind, wobei anschließend die transformierten Zellen in einer Kultur herangezogen und dem Subjekt transplantiert werden.
So wie der Begriff "Gentherapie" hier gebraucht wird, bezeichnet er das Einbringen von Genen durch rekombinante Genmanipulation von Körperzellen (somatische Gentherapie) zum Nutzen des Patienten. Außerdem kann die Gentherapie in ex vivo- und in vivo-Verfahren unterteilt werden. Die ex vivo-Gentherapie ist mit der Entnahme von Körperzellen eines Patienten, der Behandlung der entnommenen Zellen mit einem Vektor, d.h. einem rekombinanten Vektor, und einer anschließenden Rückgabe der behandelten Zellen an den Patienten verknüpft. Die in vivo-Gentherapie ist mit der direkten Verabreichung des rekombinanten Genvektors, beispielsweise durch intravenöse oder intravaskuläre Mittel, verknüpft.
Vorzugsweise wird für ein Nukleinsäurekonstrukt zur Verwendung in der Gentherapie der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung in dem zu behandelnden Subjekt exprimiert. Folglich ist für Menschen der Promotor vorzugsweise ein Promotor menschlichen Ursprungs von einem menschlichen Gen oder von einem Gen, das typisch in Menschen exprimiert wird, wie etwa der Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (CMV). Die vorliegende Erfindung stellt ein Nukleinsäurekonstrukt wie oben definiert für eine Verwendung bei der Manipulation von somatischen Zellen von Menschen oder nicht-menschlichen Säugetieren oder der Manipulation von Keimbahnzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt folglich ein therapeutisches Protein bereit, das aus menschlichen Zellen gewonnen ist, die in vitro behandelt werden, um ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung in diese einzufügen.
Die Manipulation der einem Patienten entnommenen Zellen erfolgt mit dem Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung in einem geeigneten Vektor. So, wie er hierin gebraucht wird, deckt der Ausdruck "manipulierte Zellen" mit einem rekombinanten Vektor transfizierte Zellen ab.
Außerdem wird die Verwendung der transfizierten Zellen bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit einer Entzündung einhergehenden Funktionsstörung in Erwägung gezogen.
Ein fünfter Aspekt der Erfindung stellt ein Nukleinsäurekonstrukt oder ein dadurch codiertes Protein gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung für eine Verwendung in der Medizin, vorzugsweise für eine Verwendung bei der Gentherapie, bereit.
Außerdem kann die vorliegende Erfindung in der Veterinärmedizin bei der Behandlung/Prophylaxe von Haustieren, darunter Pferde und Gefährten des Menschen (z.B. Katzen und Hunde), und von Nutztieren, darunter Spezies der Familien der Schafe, Schweine, Ziegen, Rinder und Pferde, Anwendung finden.
Ein sechster Aspekt der Erfindung schafft die Verwendung des Nukleinsäurekonstrukts gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit einer Entzündung einhergehenden Funktionsstörung. Im vorliegenden Kontext kann die mit einer Entzündung einhergehende Funktionsstörung irgendeinen oder mehrere der weiter oben erörterten, mit einer Entzündung verbundenen Zustände einschließen.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die das Nukleinsäurekonstrukt oder Proteine des dritten Aspekts der Erfindung aufweisen. Daher kann das Nukleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung in Kombination mit dem pharmazeutisch akzeptablen Trägermittel oder pharmazeutisch akzeptablen Trägermitteln verwendet werden. Solche Trägermittel können physiologische Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Liposomen, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon einschließen, ohne hierauf beschränkt zu sein.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf jede wirksame und zweckmäßige Weise, die für eine Behandlung einer Krankheit des Patienten effektiv ist, verabreicht werden, wobei beispielsweise eine Verabreichung auf oralem, topischem, intravenösem, intramuskulärem, intranasalem oder intradermalem Wege u.a. eingeschlossen ist. Bei der Therapie oder als ein Prophylaktikum kann das aktive Agens einem Individuum als eine injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, beispielsweise als eine sterile wässrige Dispersion, die vorzugsweise isotonisch ist.
Es wird erwartet, dass bei einer Verabreichung an Säuger und insbesondere an Menschen die Tagesdosierung des aktiven Agens wenigstens 0,01 mg/kg Körpergewicht, typisch ungefähr 1 mg/kg sein wird. Auf alle Fälle wird der Arzt die tatsächliche Dosierung bestimmen, die für ein Individuum am besten geeignet ist, wobei sie von Faktoren, die das Alter, das Gewicht, das Geschlecht und die Reaktion des Individuums einschließen, abhängig sein wird. Die oben genannten Dosierungen gelten in beispielhafter Weise für einen Durchschnittsfall. Es kann selbstverständlich Fälle geben, in denen höheren oder niedrigeren Dosierungen der Vorzug zu geben ist, wobei diese im Rahmen dieser Erfindung sind.
Ein siebter Aspekt der Erfindung stellt ein Fusionsprotein zur Verfügung, das ein LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle aufweist, wobei das Fusionsprotein mit einem pharmazeutisch aktiven Protein assoziiert ist. Ferner stellt die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt bereit, welches das Fusionsprotein des siebten Aspekts der Erfindung codiert. Das Nukleinsäurekonstrukt weist vorzugsweise eine ein LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 codierende Nukleinsäuresequenz auf, die an eine Nukleinsäuresequenz angrenzt, die eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle codiert. Vorzugsweise ist die ein LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 codierende Nukleinsäuresequenz mit einer eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle codierenden Nukleinsäuresequenz funktional verbunden. Das Nukleinsäurekonstrukt, das das Fusionsprotein codiert, kann die Nukleotide 1-861 von 1 oder die Nukleotide 585-1352 von 2 oder eine Sequenz von Nukleotiden, die bei Verwendung der voreingestellten Parameter des BLAST-Computerprogramms, das vom HGMP zur Verfügung gestellt wird, eine Identität von mindestens 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 99 % damit hat, aufweisen.
Die Erfindung stellt ferner das Fusionsprotein des siebten Aspekts der Erfindung, optional mit dem hier beschriebenen latent TGFβ-bindenden Protein (LTBP) assoziiert, bereit.
Das Fusionsprotein des siebten Aspekts der Erfindung kann über eine Peptidbindung mit dem pharmazeutisch aktiven Protein assoziiert sein. Alternativ kann das Fusionsprotein mit dem pharmazeutisch aktiven Protein über eine chemische Bindung, z.B. durch Vernetzen des Fusionsproteins mit einer chemischen Verbindung wie etwa einem chemotherapeutischen Agens, einem synthetischen Wirkstoff oder PNA, assoziiert sein.
Vorzugsweise ist das pharmazeutisch aktive Protein an den C-Terminus der Aminosäuresequenz der Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytischen Spaltstelle in dem Fusionsprotein des siebten Aspekts der Erfindung gebunden. Vorzugsweise ist das pharmazeutisch aktive Protein mit dem C-terminalen Rest der Aminosäuresequenz der Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytischen Spaltstelle kontinuierlich.
Ein achter Aspekt der Erfindung schafft ein Verfahren zur Aufbereitung des Fusionsproteins und des assoziierten pharmazeutisch aktiven Proteins des siebten Aspekts der Erfindung, das die Herstellung des Fusionsproteins auf rekombinante Weise durch Expression in einer Wirtszelle, Reinigung des exprimierten Fusionsproteins und Verbindung des pharmazeutisch aktiven Proteins mit dem gereinigten Fusionsprotein mittels Peptidbindungen oder chemischer Vernetzung aufweist.
Ein neunter Aspekt der Erfindung stellt ein Fusionsprotein und assoziiertes pharmazeutisch aktives Protein gemäß dem siebten Aspekt der Erfindung für eine Verwendung in der Medizin bereit.
Das Fusionsprotein mit assoziiertem pharmazeutisch aktivem Protein des siebten Aspekts der Erfindung kann allein oder zusammen mit weiteren Verbindungen, wie etwa therapeutischen Verbindungen, z.B. entzündungshemmenden Arzneistoffen, zytotoxischen Agenzien, zytostatischen Agenzien oder Antibiotika, verwendet werden.
Vorzugsweise eignet sich das Fusionsprotein und assoziierte pharmazeutisch aktive Protein des siebten Aspekts der Erfindung für eine direkte Verabreichung an einen Patienten, wie hierin beschrieben wird.
Ein zehnter Aspekt der Erfindung schafft die Verwendung des Fusionsproteins und assoziierten pharmazeutisch aktiven Proteins gemäß dem siebten Aspekt der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit einer Entzündung einhergehenden Funktionsstörung. Im vorliegenden Kontext kann die mit einer Entzündung einhergehende Funktionsstörung irgendeine oder mehrere der weiter oben erörterten, mit einer Entzündung verbundenen Krankheiten umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen, die das Fusionsprotein und assoziierte pharmazeutisch aktive Protein des siebten Aspekts der Erfindung aufweisen. Deshalb kann das Fusionsprotein und assoziierte pharmazeutisch aktive Protein in Kombination mit dem pharmazeutisch akzeptablen Trägermittel oder pharmazeutisch akzeptablen Trägermitteln verwendet werden. Solche Trägermittel können physiologische Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Liposomen, Wasser, Glycerin, Polyethylenglykol, Ethanol und Kombinationen davon einschließen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf jede wirksame und zweckmäßige Weise, die für eine Behandlung einer Krankheit des Patienten effektiv ist, verabreicht werden, wobei beispielsweise eine Verabreichung auf oralem, topischem, intravenösem, intramuskulärem, intranasalem oder intradermalen Wege u.a. eingeschlossen ist. Bei einer Therapie oder als ein Prophylaktikum kann das aktive Agens dem Individuum als eine injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, beispielsweise als eine sterile wässrige Dispersion, die vorzugsweise isotonisch ist.
Außerdem schafft die Erfindung einen Komponentensatz, der ein Nukleinsäurekonstrukt des dritten Aspekts der Erfindung oder ein Fusionsprotein und assoziiertes pharmazeutisch aktives Protein gemäß dem siebten Aspekt der Erfindung sowie ein Verabreichungshilfsmittel, darunter Tabletten für eine orale Verabreichung, Inhalatoren für eine Verabreichung über die Lunge und injizierbare Lösungen für eine intravenöse Verabreichung, ohne hierauf beschränkt zu sein, enthält.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schafft eine Verwendung, bei der einem pharmazeutisch aktiven Protein Latenz verliehen worden ist, welches ein Cytokin, vorzugsweise Interferon, ist, wobei das Verfahren das Bilden eines Fusionsproteins, das ein mit Latenz assoziiertes Peptid (LAP) von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 aufweist, in Assoziation mit einer Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytischen Spaltstelle und dem pharmazeutisch aktiven Protein einschließt. Vorzugsweise folgen die MMP-proteolytische Spaltstelle und das LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 auf das pharmazeutisch aktive Protein, in der Art: aktives Agens – Spaltstelle – LAP.
Alle bevorzugten Merkmale des zweiten Aspekts sowie der nachfolgenden Aspekte der Erfindung gelten wie für den ersten Aspekt mit den notwendigen Änderungen.
Die vorliegende Erfindung wird nun lediglich beispielhaft anhand der beigefügten Figuren beschrieben, worin:
1 eine Nukleotidsequenz (A) und die entsprechende Aminosäuresequenz (B) des LAP-mIFNβ-Konstrukts zeigt, wobei die eingerahmte Folge der Sequenz der MMP-Spaltstelle einschließlich der Linker-Sequenz entspricht;
2 eine Nukleotidsequenz (A) und die entsprechende Aminosäuresequenz (B) des mIFNβ-LAP-Konstrukts zeigt, wobei die eingerahmte Folge der Sequenz der MMP-Spaltstelle einschließlich der Linker-Sequenz entspricht;
3 Aminosäuresequenzen der Vorläuferdomäne von TGFβ-1, -2, und -3 (menschlich, Hu), TGFβ-4 (Huhn, Ck), TGFβ (Frosch, Fg) zeigt, wobei Pfeile die Position der proteolytischen Bearbeitung angeben, die zu einer Abspaltung des Signalpeptids von TGFβ-1 und von den reifen TGFβs führt; N-gebundene Glycosylierungsorte sind wie die zelluläre Integrin-Erkennungssequenz unterstrichen (Roberts und Sporn: Peptide Growth Factors and their Receptors: Sporn, MB and Roberts, AB, Springer-Verlag, Kapitel 8, 422 (1996));
4 Sequenzen von Proteinspaltstellen von Matrix-Metallproteinasen (MMPs) (Nagase und Fields, Biopolymers, 40, 399-416 (1996)) zeigt;
5 eine schematische Darstellung der in dieser Studie verwendeten Fusions-Proteine und ihre mutmaßliche Faltung zeigt: (A) Primärstruktur rekombinanter, latenter Proteine. Die lineare Sequenzanordnung der LAP-, MMP- und mIFNβ-Komponenten in den zwei Konfigurationen, die in dieser Studie verwendet werden, LAP-mIFNβ und mIFNβ-LAP, sind gezeigt. Das Kästchen am Amino-Terminus des LAP-mIFNβ und mIFNβ-LAP stellt das natürlich vorkommende Signalsequenzpeptid für eine Sekretion von entweder TGFβ oder mIFNβ dar. (B) Mutmaßliche Faltung und Wechselwirkungen eines latenten Cytokins mit LTBP. Bei dem LTBP sind die einem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF-) ähnlichen Wiederholungen als kleine Rechtecke dargestellt, die cysteinreichen Wiederholungen und die Hybrid-Domäne sind als Kreise und die für eine proteolytische Spaltung empfindliche Hinge Region ist als eine durchgehende schwarze Linie dargestellt. Disulfid-Brücken sind als durchgehende graue Linien dargestellt;
6 den Nachweis rekombinanter Fusionsproteine in Überständen von CHO-Zellen zeigt: Nicht denaturierende SDS-PAGE von Überständen von CHO-Zellen (Spur 1), LAP-mIFNβ-transfiziert (Spur 2) und mIFNβ-LAP (Spur 3); die Positionen der Doppelbanden der neu exprimierten Fusionsproteine sind mit einem Doppelpfeil markiert; es sind die Positionen der Markierungen der relativen Molekülmasse (M. W.) in kDa dargestellt;
7 eine Immunpräzipitation von CHO-Zellüberständen mit anti-LAP-Antikörpern und – schneiden mit MMP1 und MMP3 zeigt LAP-mIFNβ (Spuren 1, 3 und 5) und mIFNβ-LAP (Spuren 2, 4 und 6). Unbehandelte Kontrollen (Spuren 1 und 2), mit MMP3 behandelt (Spuren 3 und 4), mit MMP1 behandelt (Spuren 5 und 6). Das SDS-PAGE-Verfahren wurde unter denaturierenden Bedingungen ausgeführt. Die Positionen des LTBP und der Fusionsproteine sind durch Pfeile angegeben. Die mit einem Sternchen (*) markierten Pfeile geben das Vorhandensein von MMP-Spaltprodukten an. Es sind die Positionen der Markierungen der relativen Molekülmasse (M.W.) eines Markers in kDa dargestellt;
8 eine Immunpräzipitation von MTX-selektierten CHO-Zellüberständen mit anti-LAP- und anti-IFNβ-Antikörpern sowie eine Spaltung mit MMP1, MMP3 und Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis zeigt: (A) LAP-mIFNβ und (B) mIFNβ-LAP. Unbehandelte Überstände (Spuren 1 und 5), mit MMP1 behandelt (Spuren 2 und 6), mit MMP3 behandelt (Spuren 3 und 7) und mit Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis behandelt (Spuren 4 und 8). Immunpräzipitationen mit monoklonalen anti-LAP- (Spuren 1-4) und anti-IFNβ-Antikörpern (Spuren 5-8). Die Positionen des LTBP und der Fusionsproteine sind durch Pfeile angegeben. Die mit einem Sternchen (*) markierten Pfeile geben das Vorhandensein von MMP-Spaltprodukten an;
9 Kinetiken der IFN-Aktivität nach einer Inkubation in einem Medium, allein oder mit Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumotider Arthritis zeigt: A. LAP-mIFNβ; Tafel B: mIFNβ-LAP;
10 die Inhibierung einer durch Kollagen herbeigeführten Arthritis durch eine DNA-Injektion mit LAP-mIFNβ zeigt: Die Tafel A zeigt die Schwellung der Hinterpfote, und die Tafel B zeigt die Entwicklung des klinischen Scores ab dem Zeitpunkt der Re-Immunisierung mit Kollagen vom Typ II;
11 die vorausgesagte Nukleotidsequenz (A) und die entsprechende Aminosäuresequenz (B) des huIFNβ-LAP-Konstrukts zeigt;
12 die vorausgesagte Nukleotidsequenz (A) und die entsprechende Aminosäuresequenz (B) des LAP-huIFNβ-Konstrukts zeigt.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht einschränkend sind.
Beispiel 1: Bildung von hLAP-mIFNβ-, mIFNβ-hLAP und pLAP-mIFNβ-Fusionsproteinen
Verfahren
Klonieren eines GS-MMP-GS-Linkers in EcoR1-Not1-Stellen von pcDNA3
Es wurde ein Vektor gebildet, indem der GS-MMP-GS-Linker in mit EcoR1-Not1 gespaltene pcDNA3 eingefügt wurde. pcDNA3 ist ein Expressionsvektor (von Invitrogen), der den unmittelbar frühen Promotor und Enhancer des menschlichen Cytomegalovirus zusammen mit RNA-Verarbeitungs-Signalen, die eine Transkription ermöglichen, aufweist.
Ein doppelsträngiges Desoxyoligonukleotid, das die Sequenz GLY GLY GLY GLY SER PRO LEU GLY LEU TRP ALA GLY GLY GLY SER codiert, wurde wie folgt konstruiert:
Sense-Oligo:
5'AATTCGGGGGAGGCGGATCCCCGCTCGGGCTTTGGGCGGGAGGGGGCTCAGC3'
Antisense-Oligo:
5'GGCCGCTGAGCCCCCTCCCGCCCAAAGCCCGAGCGGGGATCCGCCTCCCCCG3'
Es wurden synthetische Desoxyoligonukleotide von Life Technologies Ltd. (Paisley, GB) bezogen. Reassoziierte Desoxyoligonukleotide wurden in mit EcoR1-Not1 gespaltene pcDNA3 (Invitrogen, Groningen, Die Niederlande) kloniert. Der rekombinante Klon verlor seine EcoRV-Stelle und gewann eine zusätzliche BamH1-Stelle hinzu. Die Plasmidklone wurden mittels Southern-Blot-Hybridisierung mit endmarkierten Oligos beurteilt. Der Klon wurde als GS-MMP-GS bezeichnet. Die Restriktionsenzyme und die DNA-modifizierenden Enzyme wurden von New England Biolabs, Hitchin, GB, bezogen.
Bildung von LAP (TGFβ) am NH₂-Ende, gefolgt von GS-MMP-GS und reifem IFNβ
Ein LAP (TGFβ) gefolgt von GS-MMP-GS und reifem IFNβ aufweisender Vektor wurde folgendermaßen gebildet:
LAP von TGFβ als eine 5'-Einheit (mit Signalpeptid) mit HindIII- und EcoR1-Enden wurde mittels PCR aus Plasmid-TGFβ-Babe neo (Chernajovsky et.al.: Gene Ther. 4, 553-559 (1997)) kloniert. Es wurden folgende Primer verwendet:
Sense-Primer: 5' CCAAGCTTATGCCGCCCTCCGGGCTGCGG 3'
Antisense-Primer: 5' CCGAATTCGCTTTGCAGATGCTGGGCCCT 3'
Nach der PCR wurde das Produkt mit Phenol extrahiert, seine Enden wurden mit Klenow aufgefüllt, und es wurde mit HindIII und EcoR1 verdaut. Das 820 Basenpaare umfassende Produkt wurde in mit den gleichen Enzymen geschnittenem GS-MMP-GS-Plasmid kloniert. Der Klon wurde TGFβ-GS-MMP-GS-Linker genannt. Reifes mIFNβ (von der Maus) mit 5'Not1- und 3'Xba1-Stellen wurde mittels PCR vom Klon Aphrodite (Triantaphyllopoulos et.al.: Gene Ther. 5, 253-263 (1998)) synthetisiert. Dazu wurden die folgenden Primer verwendet:
Sense-Primer: 5' CGCGGCCGCAATCAACTATAAGCAGCTCCAG 3'
Antisense-Primer: 5' GGTCTAGATCAGTTTTGGAAGTTTCTGGTAAG 3'
Nach der PCR wurde das Fragment mit Phenol extrahiert, die Enden wurden mit Klenow aufgefüllt und es wurde mit Not1 und Xba1 verdaut. Der LAP-mIFNβ-Klon wurde durch Klonieren des Fragments in Not1- und Xba1-Stellen des TGFβ-GS-MMP-Gs-Linker-Plasmids erhalten. Die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des LAP-mIFNβ-Inserts sind in 1 gezeigt.
Bildung von mIFNβ am NH₂-Ende gefolgt von GS-MMP-GS und reifem LAP (TGFβ)
Ein reifes mIFNβ gefolgt von GS-MMP-GS und LAP (TGFβ) aufweisender Vektor wurde folgendermaßen gebildet:
Vorläufer-IFNβ mit Signalpeptid und ohne Stoppcodon wurde mittels PCR wie oben angegeben unter Verwendung der folgenden Primer synthetisiert:
Sense-Primer: 5' CCAAGCTTATGAACAACAGGTGGATCCTC 3'
Antisense-Primer: 5' CCGAATTCGTTTTGGAAGTTTCTGGTAAG 3'
Nach der PCR-Synthese, der Phenolextraktion und dem Auffüllen mit einem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase wurde das DNA-Produkt mit HindIII und EcoR1 verdaut und in Plasmid-pCDNA3-GS-MMP-GS an den gleichen Stellen kloniert. Der Klon wurde IFNβ-GS-MMP-GS-Linker genannt. Reifes LAP (TGFβ) mit Stoppcodon wurde mittels PCR wie oben angegeben unter Verwendung der folgenden Primer synthetisiert:
Sense-Primer: 5' CGCGGCCGCACTATCCACCTGCAAGACTATC 3'
Antisense-Primer: 5' GGTCTAGATCAGCTTTGCAGATGCTGGGCCCT 3'
Nach der PCR und der Phenolextraktion wurden die Enden mit Klenow aufgefüllt, und es wurde mit Not1 und Xba1 verdaut. Der mIFNβ-LAP-Klon wurde durch Klonieren des PCR-Framents an den gleichen Stellen des Plasmids IFNβ-GS-MMP-GS erhalten. Die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des mIFNβ-LAP-Inserts sind in 2 gezeigt.
Klonieren von LAP (Schwein) vor mIFNβ
Mutierte Schweine-cDNA, die von Cys bis Ser (223/225) mutiert war, wurde als Plasmid pPK14 (Sanderson et.al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2572-2576 (1995)) freundlicherweise von P.J. Wirth, NIH, Bethesda, Maryland, zur Verfügung gestellt. Das Klonieren des Schweine-LAP erfolgte mittels PCR unter Verwendung des folgenden Primer-Satzes.
Der Sense-Primer, der am Signalpeptid begann, war:
5' CGCCCATGGCGCCTTCGGGGCCT 3'. Dieser Primer weist in der Umgebung des Initiator-ATG eine modifizierte Sequenz auf um eine Nco1-Stelle zu schaffen.
Antisense-Primer: 5' CCGAATTCGCTGTGCAGGTGCTGGGCCCT 3'
Nach der PCR-Synthese wurde das PCR-Produkt an den Enden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt, mit EcoR1 geschnitten, in mit HindIII geschnittenem LAP-mIFNβ-Plasmid kloniert (aufgefüllt) und dann mit EcoR1 geschnitten (Austausch des menschlichen LAP). Das Konstrukt wurde PorcLap-mIFNβ genannt.
Ergebnisse
Strukturbetrachtungen
Um ein latentes Cytokin unter Verwendung der LAP-Domäne von TGFβ zu entwickeln wurden Fusionsproteine mit zwei Konformationen gebildet, wovon die eine LAP am Amino-Terminus von Maus-IFNβ (siehe 1) und das andere an dessen COOH-Ende (siehe 2) aufwies. Um ein Processing des LAP-mIFNβ-Proteins bei Arg 278 des LAP zu vermeiden, wurde sich von den Aminosäuren Met1 bis Ser273 erstreckendes LAP kloniert. Auf diese Sequenz folgten ein flexibler Linker (GGGGS), ein mutmaßliches MMP9 (Peng et.al.: Human Gene Therapy, 8, 729-738 (1997); Ye et.al.: Biochemistry, 34, 4702-4708 (1995)) oder ein mutmaßliches MMP1 (Nagase und Fields, Biopolymers, 40, 399-416 (1996)) oder ein mutmaßliches MMP1 (Nagase und Fields: Biopolymers, 40, 399-416 (1996)), eine Schnittstelle (PLGLWA) und ein weiterer flexibler Abschnitt (GGGGSAAA), gefolgt von reifem mIFNβ (bei der Aminosäure Ile-22 beginnend). Das Einbetten der MMP-Schnittstelle in einen hydrophilen Bereich sollte die Zugänglichkeit für Enzymangriffe erleichtern. Es ist gezeigt worden, dass das Kernstück der Schnittstelle (PLGL) als Peptid durch MMP2 und in einer anderen Version (PLGI) auch durch MMP3, MMP7 und MMP8 gespaltet wird (Nagase und Fields: Biopolymers, 40, 399-416 (1996)).
Das IFNβ-LAP-Molekül bestand aus der Vorläufer-mIFNβ-Sequenz, deren Stoppcodon mutiert war, um ein Überlesen des flexiblen Linkers und der MMP-Stelle gefolgt von der reifen Sequenz des LAP (von Leu-29 bis Ser-273) zu ermöglichen.
Die nicht verarbeiteten LAP-mIFNβ- und mIFNβ-LAP-Fusionsproteine weisen eine erwartete relative Molekülmasse von 52,375 bzw. 51,768 Dalton auf. Die Primärsequenz dieser Fusionsproteine enthält vier mögliche N-Glycosylierungsorte. Eine schematische Darstellung der Primärstruktur und der mutmaßlichen Faltung dieser Proteine sowie ihre möglichen Interaktionen mit LTBP sind in 5 gezeigt. Auf der rechten Tafel von 5B ist die Faltung von LAP-mIFNβ gezeigt, die der Faltung von nativen TGFβ ähnlich ist. Nahe dem Amino-Terminus (N) des LAP-mIFNβ interagiert Cys 33 mit der dritten 8-Cystein-reichen Wiederholung von LTBP, während von Cys 224 und 226 erwartet wird, dass sie das Protein durch intermolekulare Disulfid-Bindungen dimerisieren (Saharinen et.al.: Cytokine and Growth Factors, 10, 99-117 (1999)). Auf der linken Tafel von 5B ist die Struktur von mIFNβ-LAP gezeigt. Cys 33 befindet sich nun hinter der MMP-Spaltstelle, und Cys 224 und 226 sind dem Carboxy- (C-) Ende des Proteins näher.
Beispiel 2 – Zelltransfektionsuntersuchungen
Verfahren
Transfektion in DHFR-defiziente Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO)
Dihydrofolatreduktase (DHFR) -defiziente CHO-Zellen wurden in einem HAM-F12-Medium (Life Technologies Ltd., Paisley, GB) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Life Technologies Ltd.), Penicillin/Streptomycin und Glutamin gehalten.
LAP-mIFNβ oder mIFNβ-LAP exprimierende pcDNA3-Plasmide (20 μg) wurden jeweils mit PvuI linearisiert und gesondert mit PvuI-geschnittenem pSV₂DHFR (1 μg) ligiert (Chernajovsky et.al.: DNA, 3, 297-308 (1984)). Nach einer Phenolextraktion wurden die Plasmide in 300 μl mit T4-DNA-Ligase bei 16°C über einen Zeitraum von 3 Tagen ligiert. Die DNA wurde in 0,4 M NH₄-Acetat gefällt und in Wasser wieder resuspendiert, um als 1 ml Calcium-Phosphat-Co-präzipitat zu 0,5 × 10⁶ CHO-Zellen auf 9-cm-Platten, die 24 h früher angeimpft wurden, hinzugefügt zu werden. 4 h später wurden die Zellen mit 10 %-igem Glycerin in HAM-F12 ohne FBS behandelt, in FBS-freien Medien gewaschen und 48 h in Ruhe gelassen. Die transfizierten Zellen wurden trypsiniert und auf sechs 9-cm-Platten aufgeteilt. Die Selektion wurde in einem nukleosidfreien Alpha-DMEM-Medium (PAA Laboratories. Linz, Österreich), 10 % dialysiertem FBS (PAA Laboratories) und 1 mg/ml G418 (Geneticin, von Life Technologies Ltd.) durchgeführt Das Selektionsmedium wurde zweimal wöchentlich gewechselt. Zwei bis drei Wochen später zeigten sich Zellklone, die als eine Polulation gehalten wurden (Chernajovsky et.al.: DNA, 3,297-308 (1984)).
Für eine Genamplifikation wurden außerdem Zellen mit Methotrexat (MTX) (Sigma, Poole, GB) bei Einsatz von 50 nM (LAP-mIFNβ) bzw. 12,5 nM (mIFNβ-LAP) selektiert.
Die Zellklone wurden durch Ring-Klonieren isoliert und in Selektionsmedien expandiert.
Bestimmung der biologischen Aktivität des IFNβ
Die biologische Aktivität von Maus-IFNβ wurde durch Inhibieren des zytopathischen Effekts einer Infektion mit dem EMC-Virus (freundlicherweise von I. Kerr, Imperial Cancer Research Fund, London) in Maus-LTK-Zellen unter Verwendung von doppelt verdünnten Zellüberständen wie beschrieben (Triantaphyllopoulos et.al.: Gene Ther. 5, 253-263 (1998)) bestimmt. Wie angegeben wurden serumfreie CHO-Überstände durch Zentrifugieren unter Verwendung von Vivaspin-Filtern (Sartorious, Göttingen, Deutschland) mit einer Grenze bei 30 000 kDa konzentriert.
Metabolische Markierung von CHO-Zellen
Konfluente Platten mit dauerhaft transfizierten Zellen oder nicht transfizierten CHO-Zellen wurden mit einem cystein-methionin-freien Medium (Life Technologies Ltd.), das 10 % dialysiertes FBS enthielt und mit Thymidin, Glutamin, Penicillin/Streptomycin und 150 μg/ml L-Prolin supplementiert war, gewaschen. Die Markierung erfolgte entweder über Nacht oder über 48 h bei Anwesenheit einer ³⁵S-Methionin-Cystein-Mischung (Amersham-Pharmacia Biotech, Bucks, GB) mit 1 Ci/mmol bei 250 mCi/Platte in 5 ml Medium.
Nach Ablauf der Markierungsperiode wurden die Überstände gesammelt, Zellreste zentrifugiert und klare Überstände wie angegeben mit Serin-Protease-Inhibitoren (SPI) (Pepstatin-A mit 10 μg/ml, Aprotinin mit 1 μg/ml, Chymostatin mit 10 μg/ml, Leupeptin mit 10 μg/ml und AEBSF (4-(2-Aminoethyl)-Benzol-Sulfonylfluorid, HCl) bei 200 μM (alle von Calbiochem, Beeston, GB) versetzt. Diese Überstände wurde bis zu ihrer Verwendung für Immunfällungsuntersuchungen bei –70°C eingefroren aufbewahrt.
Immunpräzipitation
Überstände von metabolisch markierten Zellen wurden mit (400 μl) Protein-G-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech), äquilibriert in PBS mit 0,1 % NP40 (50 % Kügelchen/vol) (BDH, Poole, GB), vorgeklärt. Es wurden Überstände verwendet, die insgesamt 25 × 10⁶ cpm mittels Trichloressigsäure (TCA) (Sigma) gefälltes Protein enthielten (ungefähr 5-7 ml Zellüberstände). Nach 4 h Mischen durch Stürzen und Nichtstürzen bei 4°C wurde die Protein-G-Sepharose durch Zentrifugieren (2000 Umdrehungen/min, 5 min) entfernt. Der geklärte Überstand wurde entweder mit Ziegen-Antihuman-LAP-Antikörpern (R&D Systems, Oxon, GB, mit 0,9 μg/ml) oder monoklonalem Ratten-Anti-mIFNβ (7F-D3, AMS, Abingdon, GB, bei einer Verdünnung von 1/250) 3 bis 4 h bei 4°C inkubiert.
Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden dann durch Mischen mittels Stürzen und Nichtstürzen bei 4°C über Nacht an Protein-G-Sepharose (700 μl einer 50 % Lösung) gebunden. Die Protein-G-Sepharose-Kügelchen wurden dreimal mit 5 ml 0,1 % NP40 in PBS gewaschen. Die an die Kügelchen gebundenen Proteine wurden in Fraktionen von 50 μl Kügelchen in enge Röhrchen aufgeteilt und entweder direkt in Laemmli-Puffer resuspendiert oder für MMP-Reaktionen prior zu einer SDS-PAGE in 10 %-igem Acrylamid-Gel verwendet. Alternativ wurden Überstände mit MMPs behandelt und dann immunpräzipitiert. Die Gele wurden 30 min lang in 7 %-iger Essigsäure und 10 %-igem Methanol fixiert und mit 1 M Natriumsalicylat behandelt, bevor sie getrocknet und einer Autoradiographie mit einem Röntgenfilm ausgesetzt wurden. Die Protein-Farbmarker für die relative Molekülmasse waren von Amersham-Pharmacia Biotech.
Überstände von MTX-selektierten Zellen wurden mit MMPs oder Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA/SF: 1/5) über Nacht behandelt, die Reaktionen wurden mit 10 mM EDTA abgestoppt, anschließend erfolgte die Immunpräzipitation.
MMP-Verdauung
Rekombinant hergestelltes pro-MMP9 (freundlicherweise von R. Fridman, Wayne University, Detroit, zur Verfügung gestellt) oder aktives MMP1 und MMP3 (freundlicherweise von H. Nagase, Kennedy Institute of Rheumatology, London, zur Verfügung gestellt) wurde über Nacht bei 37°C mit immunpräzipitierten Überständen von CHO-Zellen in 20 mM TrisHCl pH 7,4, 5 mM CaCl₂, 140 mM NaCl und 0,1 % Brij 35 (alle von Sigma) in 50 μl bei 1 μg/ml inkubiert oder wurde direkt zu Zellüberständen (4 μg/ml) hinzugegeben. Bei einigen Versuchen wurde Aminophenyl-Quecksilberacetat (APMA) (Sigma) mit 10 μM eingesetzt, um über Nacht bei 37°C das pro-MMP9 zu aktivieren (Ogata et.al.: J. Biol. Chem. 270, 18506-18511 (1995)).
Ergebnisse
Tabelle 1: Bestimmung der biologischen Aktivität von mIFNβ
Mittelwert aus drei Bestimmungen
LAP-mIFNβ- und mIFNβ-LAP-rekombinante Proteine wurden nach einer dauerhaften Cotransfektion linearisierten Plasmids mit dem DHFR-Plasmid (pSV₂DHFR) (Chernajovsky et.al.:, DNA, 3, 297-308 (1984)) und Selektion sowohl in G418 als auch in dialysiertem Serum in Dihydrofolatreduktase-defizienten Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (DHFR CHO) (Klon CHO-K1) exprimiert.
Wie in der Tabelle 1 gezeigt ist, wurde mIFNβ-LAP sekretiert, das eine niedrige biologische Restaktivität aufweist, während das LAP-mIFNβ völlig "latent" oder inaktiv war. Der Grad der Proteinexpression war ähnlich, wie auch durch Western Blotting mit einem anti-LAP-Antikörper bestätigt wurde (nicht gezeigt).
Biochemische Charakterisierung rekombinanter Proteine
Sekretierte Proteine von dauerhaft transfizierten Zellen wurden mit ³⁵S-Methionin und Cystein metabolisch markiert. Sowohl die LAP-mIFNβ- als auch die mIFNβ-LAP-markierten Proteine zeigten unter nicht reduzierenden Bedingungen zwei Hauptbanden bei ungefähr 97 kDa, die bei Überständen aus nicht transfizierten CHO-Zellen nicht festzustellen waren (6).
Bei einer Immunpräzipitation mit anti-LAP-Antikörpern zeigten LAP-mIFNβ- und mIFNβ-LAP-Überstände unter reduzierenden Bedingungen drei Banden: eine bei 57 kDa, eine weitere bei 135 kDa und eine weitere, schwächere Komponente bei ungefähr 75 kDa (7). Das Protein bei 135 kDa ist wahrscheinlich das von CHO abgeleitete (LTBP), über Disulfid an LAP gebundene (Saharinen et.al.: Cytokine and Growth Factors, 10, 99-117 (1999))
Die schwächere Komponente bei 75 kDa (7, Spuren 1, 3 und 5) wird bei einer Genamplifikation mit MTX (8A, Spuren 1-4) zur von anti-LAP-Antikörpern erkannten Hauptkomponente. Interessanterweise scheint der monoklonale anti-mIFNβ-Antikörper, das glycosylierte Produkt mit 75 kDa nicht zu erkennen (8A und 7, Spuren 5-8), und das anti-LAP erkennt es schlecht in der mIFNβ-LAP-Konfiguration des Proteins (8A, Spuren 5-8), was darauf schließen lässt, dass die Fusionsproteine verschiedene Konformationen aufweisen. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn das immunpräzipitierte Material mit Enzymen (MMP1 oder MMP3) behandelt und dann mittels SDS-PAGE getrennt wurde. Der Unterschied in der Konformation könnte die unterschiedliche Empfindlichkeit dieser Proteine gegenüber verschiedenen MMPs (siehe unten) und ihren Latenzgrad erklären.
Die vorausgesagte relative Molekülmasse der sekretierten rekombinanten Proteine beträgt sowohl für LAP-mIFNβ als auch für mIFNβ-LAP 49,376 Da. Die festgestellte höhere relative Molekülmasse, könnte auf eine Glycosylierung dieser Proteine zurückzuführen sein. Ein Inkubieren der immunpräzipitierten Proteine mit N-Glycosidase F liefert zwei Hauptproteine mit relativen Molekülmassen von 70 kDa und 51 kDa, die dem LTBP bzw. dem Fusionsprotein entsprechen (nicht gezeigt).
MMP-Spaltung rekombinanter Proteine
Immunpräzipitierte Komplexe wurden über Nacht mit einzelnen MMPs oder Kombinationen davon behandelt. Wie in 7 gezeigt ist, spalteten pro-MMP9 oder MMP1 das rekombinante Produkt mit 57 kDa nicht sehr effizient. MMP1 war zu einer Spaltung der glycosylierten Form des Fusionsproteins (7, Spuren 3 und 4; 8A, Spur 2) fähig, wohingegen MMP3 allein fähig war, es in verschiedene, getrennte Banden zu verdauen (7, Spuren 5 und 6; 8A und 8B, Spuren 3 und 7).
Außerdem wurde die LTBP-Bande durch MMP3 aufgespaltet (7, Spur 3 und Spur 4 und 8B, Spuren 3 und 7), wobei ein Produkt mit 78 kDa entstand. Zwei der verdauten Produkte (MW 36 kDa und 20 kDa) entsprechen den erwarteten LAP- bzw. IFNβ-Polypeptid-Fragmenten. Es könnte sein, dass die bei diesen in vitro-Versuchen ersichtlich gewordene Spezifität die antivirale Aktivität, die in Zellüberständen nach einer MMP-Behandlung gemessen wird, nicht vollständig widerspiegelt. Die Tatsache, dass die Zellüberstände schon in einem gewissen Maße aktiviert waren, lässt darauf schließen, dass weitere proteolytische Enzyme, die in dem Überstand vorhanden sind, die latente Cytokin-Komponente aktivieren können. Es trat in vitro keine gesteigerte Proteolyse der Fusionspolypeptide nach der Immunpräzipitation mit einer Kombination von rekombinantem pro-MMP9 mit MMP1 oder MMP3 oder mit APMA-aktiviertem proMMP9 allein auf (nicht gezeigt).
Aktivierung von latentem IFNβ durch MMPs
Tabelle 2 Biologische Aktivität (U/ml) von mIFNβ aus mit MMPs behandelten konzentrierten Überständen
Konzentrierte serumfreie Überstände wurden wie gezeigt mit MMPs behandelt.

–: = nicht ausgeführt

Überständen wurden wie angegeben Serinprotease-Inhibitoren (SPI) zugesetzt oder nicht (letzte Spalte) sowie MMPs zugesetzt. Die Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA.SF) ist die gleiche, die auch bei 6 verwendet wurde.
Der nicht konzentrierte Überstand wies eine antivirale Aktivität von ungefähr 210 U/ml auf, was ungefähr 0,3 ng Protein entspricht (Iwakura et.al.: J. Biol. Chem. 253, 5074-5079 (1978)). Durch Zentrifugieren durch poröse Membranen wurden Zellüberstände hundertfach konzentriert, um die MMP-Aktivität bei höheren Substratkonzentrationen zu berücksichtigen.
Nach dem Konzentrieren zeigte sogar der LAP-IFNβ-Überstand ohne weitere Behandlung eine antivirale Aktivität (Tabelle 3). Dieses Ergebnis könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass die CHO-Zellen, wie berichtet wurde, verschiedenste Proteinasen sekretieren (Goldman et.al.: Cytotechnology, 23, 103-111 (1997); Satoh et.al.: Cytotechnology, 13, 79-88 (1993)), darunter MMPs (Masure et.al.: Eur. J. Biochem. 244, 21-30 (1997)). Möglicherweise können einige natürliche Inhibitoren von MMPs (TIMPs) durch dieses Konzentrationsverfahren von den Proteinasen abgetrennt werden, wodurch ihre Aktivität gefördert wird.
Überstände von nicht transfizierten CHO-Zellen hatten selbst nach einer Behandlung mit MMPs oder Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA-S.F.) mit 1/5 des Endvolumens (Daten nicht gezeigt) keine biologische Aktivität.
Eine Zugabe von MMP1 zu konzentrierten Überständen erhöhte die biologische Aktivität leicht, derweil eine Zugabe von sowohl MMP 1 und pro-MMP9 oder MMP3 und pro-MMP9 zu dem gleichen Ergebnis führte (siehe Tabelle 2) Interessanterweise führt eine Behandlung von IFNβ-LAP mit MMP 1 und pro-MMP9 zu einer Erhöhung der antiviralen Aktivität auf das 3- bis 6- fache, was darauf schließen lässt, dass eine weitere Aktivierung dieses Moleküls erzielt werden kann.
Anhand nichtkonzentrierter Überstände von MTX-amplifizierten Zellen wurde gezeigt, dass sowohl MMP1 als auch MMP3 LAP-IFNβ um das 21- bzw. 32-fache aktivieren können (Tabelle 3) und dass Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis es bis zu vierfach aktivieren kann (Tabelle 3). mIFNβ-LAP kann ebenfalls aktiviert werden, jedoch ist, wie an früherer Stelle gezeigt worden ist (Tabelle 1), das Niveau seiner Grundaktivität hoch. Aus 8A und 8B (Spuren 4 und 8) ist ersichtlich, dass Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis die Fusionsproteine ebenfalls in getrennte Produkte mit 36 kDa und 20 kDa spalten kann, die LAP bzw. IFNβ entsprechen.
Wie weiter oben erwähnt worden ist, bewirkt die Inkubation der Überstände ohne Protease-Inhibitoren eine erhöhte biologische Aktivität, was darauf schließen lässt, dass die von den CHO-Zellen sekretierten Enzyme eine Spaltung bewirken können. Die Tatsache, dass die Empfindlichkeit der zwei Fusionsproteine gegen Anwesenheit von MMP9 unterschiedlich ist, zeigt, dass mIFNβ-LAP aktiviert werden kann, während für LAP-mIFNβ, MMP9 inhibitorisch wirkt, die vielleicht einen weiteren Abbau durch andere Enzyme, die in den CHO-Zellüberständen vorhanden sind, herbeiführen.
Aktivierung von latentem IFNβ mit Proben von entzündeten Stellen
8 und Tabelle 3 zeigten, dass Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis fähig ist, das latente Cytokin zu aktivieren.
Um abzuschätzen, ob eine langzeitige Inkubation des latenten Cytokins mit diesen Proben zu seinem Abbau oder zu einer Anhäufung in die aktive Verbindung führt, wurde sowohl LAP-mIFNβ als auch mIFNβ-LAP bis zu fünf Tage bei 37°C bei Anwesenheit oder Abwesenheit von Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis inkubiert und dann mittels IFN biologischen Test geprüft. Leere Symbole repräsentieren Proben, die in einem Medium mit 10 % FBS inkubiert wurden, während ausgefüllte Symbole Proben repräsentieren, die mit 1/5 vol/vol Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA.SF) inkubiert wurden.
In Abständen von 24 h wurden Proben genommen. 9 zeigt, dass eine Inkubation über diesen ausgedehnten Zeitraum zu einer erhöhten Aktivität, d.h. zu einer Aktivierung des LAP-mIFNβ bis auf das 10-fache während der ersten 24-48 h, bei einer stetigen Abnahme danach führte. Die Aktivierung des mIFNβ-LAP scheiterte; es war nur eine Abnahme seiner Aktivität festzustellen. Dieses Ergebnis zeigt klar an, dass die LAP-IFNβ-Konformation therapeutische Verwendungsmöglichkeiten besitzt.
Mit mIFNβ-LAP war keine Aktivierung festzustellen. Allgemein, in beiden Fällen, nahm die Proteinaktivität über die Zeit ab, da Proteasen, die in dem Medium der Zellen festgestellt wurden, in der Lage sind, die gentechnisch hergestellten Proteine abzubauen.
Um festzustellen, ob sich die Aktivierung des latenten Cytokins mit Proben von anderen pathologischen entzündlichen Konditionen bestätigen lässt, wurde Zerebrospinal-Flüssigkeit von Versuchsaffen mit allergischer Enzephalomyelithis getestet. Nach einer Inkubation über Nacht war bei zwei der drei untersuchten Proben die biologische Aktivität der Fusionsproteine bis zu viermal höher als bei den parallellaufenden Serumproben (Daten nicht gezeigt), was darauf schließen lässt, das eine ortsspezifische Aktivierung erzielt werden kann.
Beispiel 3
Um zu beurteilen, ob die bei LAP-mIFNβ festgestellte Latenz die Bildung einer mutmaßlich geschlossenen Hüllstruktur, die durch das dimere disulfidgekoppelte LAP begrenzt ist, erforderte, wurde ein Fusionsprotein unter Verwendung von LAP vom Schwein hergestellt, das in Cys 223 und 225 zu Ser mutiert war.
Verfahren
Herstellung des Konstrukts
LAP vom Schwein wurde wie im Beispiel 1 dargelegt mittels PCR kloniert. Die benutzten Primer waren wie im Beispiel (Klonieren von LAP vom Schwein) dargelegt. Das klonierte Schweine-LAP wurde in Cys 223 und 225 zu Ser mutiert (Sanderson et.al.: Proc. Natl. Acad. Science, 92, 2572-2576 (1995)).
Transiente Transfektion in Affen-COS-7-Zellen
20 μg Plasmid-DNA, PorcLAP-mIFNβ und mIFNβ-LAP sowie LAP-mIFNβ-Kontrollen wurden mittels des Calcium-Phosphat-Co-präzipitationsverfahren jeweils zweifach in 0,5 × 10⁶ COS-7-Zellen transfiziert, mit denen wie oben beschrieben 9 cm-Platten beimpft worden waren. Die DNA-Co-präzipität wurde statt 4 h über Nacht auf den Zellen gelassen. Es wurden COS-7-Zellen in DMEM mit Antibiotika und 10 % FBS aufgezogen. 48 h nach dem Glycerin-Schock wurden die Überstände für den IFN-Antivirustest abgenommen.
Ergebnisse
Das mutierte PorcLAP-mIFNβ-Konstrukt wurde hinsichtlich seiner biologischen Aktivität in vitro nach einer transienten Transfektion in COS-7-Zellen mit den anderen Konstrukten verglichen. Die Tabelle 4 zeigt, dass PorcLAP-mIFNβ genauso aktiv wie mIFNβ-LAP in diesem Test war. Tabelle 4
Die gezeigten Ergebnisse sind für einen von zwei Versuchen repräsentativ.
Schlussfolgerung
Die Ergebnisse zeigen, dass für eine Latenz von LAP-mIFNβ Disulfid-Bindungen an den Positionen 223 und 225 erforderlich sind.
Beispiel 4
Klonierung und Expression von menschlichen IFNβ-, IL-2- und IL-10-LAP-Fusionsproteinen
Das Bilden von humanen IFNβ-MMP-LAP und LAP-MMP-humanen IFNβ wird die Prüfung der Expression dieser Konstrukte in CHO-Zelllinien und die anschließende Prüfung der Aktivität des exprimierten Produkts mit einigen menschlichen Zelllinien in vitro und in vivo erleichtern.
Menschliches IL-2 und IL10 aufweisende Konstrukte werden wie oben angegeben exprimiert und untersucht. Bei der Reinigung der exprimierten Fusionsproteine wird von einem poly-His-Schwanz als Verankerung für die Reinigung Gebrauch gemacht. Derartige Reinigungsschemata sind im Fach wohl bekannt.
Bildung von humanen IFN-LAP- und LAP-humanen IFN-Fusionsproteinen
Verfahren
Wie das Maus-IFNβ-Gen (siehe Beispiel 1) wurde das menschliche IFN-Gen am COOH-Ende der MMP-Stelle (nach LAP) an den Not1/Xba1-Stellen kloniert, was das Molekül OM52 (LAP-huIFNβ) zur Folge hatte. Dazu wurden die folgenden Primer benutzt:
Sense-Primer:
5' cgc/g gcc gca ATG AGC TAC AAC TTG CTT GG
Antisense-Primer:
5' ggt/ctaga TCA GTT TCG GAG GTA ACC
Das PCR-Produkt wurde mittels PCR von Plasmid-PSVEIF (Chernajovsky et.al.: DNA 3, 297-308, (1984)) erhalten, mit Not1 und Xba1 verdaut und in das LAP-mIFNβ exprimierende Plasmid kloniert, das mit den gleichen Enzymen verdaut wurde und aus dem das Mausgen entfernt worden war.
Menschliches Vorläufer-IFNβ wurde kloniert, bevor menschliches LAP zu dem Molekül OM53 (huIFNβ-LAP) führte. Dazu wurden die folgenden PCR-Primer benutzt:
Sense-Primer:
5' cca/agc tt ATG ACC AAC AAG TGT C
Antisense-Primer
5' ccg/aat tc GTT TCG GAG GTA ACC TG
Es wurde Plasmid-PSVEIF als Matrize für die PCR wie oben benutzt, und das PCR-Produkt wurde mit HindIII und EcoR1 verdaut und an denselben Stellen des mIFNβ-LAP kloniert, von denen die Maus-cDNA entfernt worden war.
Die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des huIFNβ-LAP-Konstrukts und des LAP-huIFNβ-Konstrukts sind in 11 bzw. 12 gezeigt.
Um die Latenz oder Aktivität dieser Moleküle abzuschätzen wurden CHO-Zellen dauerhaft mit 20 Mikrogramm linearisierter OM52- und OM53-Plasmid-DNA und mit 1 Mikrogramm pSV2DHPR (wie zuvor) co-transfiziert. Die Selektion wurde in G418 (Genetician von Life Technologies Ltd.), 10 % dialysiertem fötalem Rinderserum (FBS) und α-DMEM-Medium durchgeführt. Überstände von 24 h alten konfluenten Kulturen wurden in einem Antivirus-Test unter Verwendung menschlicher Fibroblasten (MRC5-Linie) und des EMC-Virus wie im Beispiel 2 beschrieben untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
Ergebnisse
Diese Daten lassen erkennen, dass eine Latenz des Fusionsproteins nicht vorausgesagt werden kann, da sich menschliches IFNβ, das mit LAP-MMP fusioniert ist, anders gegenüber dem Maus-Protein verhält, wenn es mit dem LAP-MMP-Peptid fusioniert ist. Während bei der Maus-Sequenz die LAP-MMP-IFNβ-Konformation latent war, war im Falle des menschlichen OMS2 dieses Konstrukt aktiv und umgekehrt, d.h. die Maus-IFN-LAP-Konformation war aktiv, während die menschliche (OM53) inaktiv war.
Beispiel 5
Durch Kollagen herbeigeführte Arthritis (CIA) und DNA-Injektion
DBA/1-Mäuse wurde mit Kollagen vom Typ II (CII) wie in Dreja et.al.: Arthritis and Rheumatism, 43, 1698-1708 (2000), beschrieben immunisiert und drei Wochen später mit CII in inkomplettem Freud'schen Adjuvans re-immunisiert. 100 Mikrogramm Plasmid-DNA in PBS wurden am Tag des Arthritisausbruchs an 3 Stellen in den Quadrizeps intramuskulär injiziert, und die Mäuse wurden jeden weiteren Tag für das klinische Bild der Arthritis bepunktet, wobei die Schwellung der Hinterpfote mit Messlehnen wie beschrieben (Dreja et.al.: Arthritis and Rheumatism, 43, 1698-1708,(2000)), gemessen wurde.
Bei einem Arthritismochel (CIA) wurde die relative Wirksamkeit des latenten Cytokins (LAP-mIFNβ) versus die aktiven Versionen (PorcLAP-mIFNβ und mIFNβ-LAP) gemessen. Das latente LAP-mIFNβ zeigte im Vergleich zu der Kontrolle, die mit einem leeren pCDNA3-Plasmidvektor behandelt war, eine größere Wirksamkeit als beide aktiven Komponenten, mIFNβ-LAP und PorcLAP-mIFNβ.
Es ist festgestellt worden, dass bei einer Zuführung mittels Gentherapie durch intramuskuläre Injektion das latente Cytokin wirksamer bei der Behandlung einer bestehenden Krankheit war.
Schlussfolgerungen
Es ist hierin gezeigt worden, dass ein aktives Cytokin-Molekül gentechnisch so konstruiert werden könnte, dass es durch das Hinzufügen der Latenzdomäne von TGFβ entweder an seinem NH₂- oder an seinem COOH-Terminus "latent" wird. In den Modellversuchen wurde das Cytokin IFNβ benutzt.
Die LAP-Domäne von TGFβ verlieh dem IFNβ "Latenz", die durch Inkubieren des Fusionsproteins mit MMPs außer Kraft gesetzt werden konnte. Möglicherweise hat die Latenz mit einem sterischen Hindernis durch LAP bei der Interaktion der IFNβ-Komponente mit ihren zellulären Rezeptoren zu tun. Anscheinend ist trotz der Tatsache, dass das NH₂-Ende und das COOH-Ende des Moleküls in der Kristallstruktur des IFNβ eng beieinander sind, dem TGFβ durch Fusionieren der LAP-Domäne an den NH₂-Terminus eine bessere "äußere Hülle" verliehen worden, als sie bei TGFβ allein angetroffen wird. Es ist plausibel, dass dies bei anderen Cytokinen in Abhängigkeit von ihrer Tertiärstruktur und der Oberfläche für Interaktionen mit ihren Rezeptoren anders sein kann.
Die MMP-Stelle, die sich zwischen LAP und IFNβ befand, konnte in vitro durch MMP-3 und MMP-1 gespaltet werden. MMP-3 und MMP-1 weisen homologe Bereiche Aktivitätszentrum auf (Massova et.al.: J. Mol. Model. 3, 17-30 (1997)). Es ist völlig plausibel, dass andere MMPs diese Stelle ebenfalls spalten werden, wie die Aktivierung, die in konzentrierten serumfreien Überständen von CHO-Zellen auftritt (Tabelle 2), erkennen lassen hat. Die Expression von MMPs ist sehr streng reguliert (Han et.al.: Autoimmunity, 28, 197-208 (1998)). MMPs sind während eines Gewebeumbaus, einer Wundheilung und bei einer Entzündung aktiv (Kubota et.al.: J. Oral & Maxillofacial Surgery, 55, 20-27 (1997); Van Meurs et.al.: Arthritis & Rheumatism, 42, 2074-2084 (1999); Leppert et.al.: Brain, 121, 2327-2334 (1998); Uhm et.al.: Annals of Neurology, 46, 319-324 (1999); Louis et.al.: Clin. Exp. Immunol. 120, 241-246 (2000); Baugh et.al.: Gastroenterology, 117, 814-822 (1999)). Außerdem werden MMPs von Tumorzellen benötigt, um in das umgebende Gewebe einzudringen. In der Tat kann eine Expression von Gewebeinhibitor Metalloproteasen (TIMPs) die Tumorinvasion und Metastasis hemmen (DeClerck et.al.: Cancer Res. 52, 701-708 (1992)).
MMP9 konnte die Fusionsproteine nicht spalten. Bei Verwendung von fluorogenen Peptidsubstraten mit der Sequenz PLGLWA-d-R scheint der Wert der Hydrolysegeschwindigkeit (kcat/Km) der Matrix-Metallproteinasen der Reihe MMP9 > MMP2 > MMP7 > MMP3 > MMP1 zu folgen (Nagase und Fields: Biopolymers, 40, 399-416 (1996)). Diese Diskrepanz in der Hydrolyseempfindlichkeit zwischen dem Peptidsubstrat und den gentechnisch hergestellten Proteinen, die bei dieser Untersuchung verwendet wurden, kann ihrer Tertiärstruktur zugeschrieben werden.
Es zeigt sich, dass die gentechnische Konstruktion des "latenten" Cytokins verschiedene Vorteile bietet. Erstens wird das Cytokin nach der Verabreichung von den Zellen, die Rezeptoren dafür besitzen, anscheinend nicht schnell aufgenommen; diese könnte sich auf seine Toxizität auswirken und für eine längere Halbwertszeit sorgen. Es ist gezeigt worden, das LAP-enthaltendes TGFβ in vivo eine größere Halbwertszeit aufweist (Wakefield et.al.: J. Clin. Invest. 86, 1976-1984 (1990)). Demzufolge könnte eine systemische Verabreichung zu Therapiezwecken niedriger dosiert sein.
Zweitens können sowohl LAP als auch LTBP die Wechselwirkung des latenten Cytokins mit der extrazellulären Matrix erleichtern.
Drittens, ülicherweise wird das Cytokin nicht freigesetzt, um mit zellulären Rezeptoren zu interagieren, sofern nicht Entzündungs- oder Gewebeumbauprozesse stattfinden, die mit einer MMP-Aktivität einhergehen. Eine solche Aktivität ist bei Osteoarthritis, rheumotoider Arthritis (Kubota et.al.: J. Oral & Maxillofacial Surgery, 55, 20-27 (1997); Van Meurs et.al.: Arthritis & Rheumatism, 42, 2074-2084 (1999); Singer et.al.: Osteoarthritis & Cartilage, 5, 407-418 (1997)) und bei anderen Typen chronischer Krankheiten, wie etwa bei der entzündlichen Darmkrankheit (Louis et.al.: Clin. Exp. Immunol, 120, 241-246 (2000); Baugh et.al.: Gastroenterology, 117, 814-822 (1999)), Multipler Sklerose (Leppert et.al.: Brain, 121, 2327-2334)), Atherosklerose (Libby: Vascular Medicine, 3, 225-229 (1998)), und während der Krebsinvasion (DeClerck u.a.: Cancer Res. 52, 701-708 (1992)) festgestellt worden.
Es könnte der Standpunkt vertreten werden, dass bei einer Spaltung das Freisetzen von LAP antagonistische Wirkungen auf das TGFβ haben könnte, da gezeigt worden ist, dass in vitro LAP fähig ist, die Wirkung des aktiven TGFβ zu hemmen (Wakefield et.al.: Growth Factors, 1, 203-218 (1989)). Es wird jedoch erwartet, dass das vorliegende LAP-Fusionsprotein seine Wirkung an entzündeten Stellen entfalten kann, wo freie Radikale im Überfluss vorhanden ist. Es ist gezeigt worden, dass eine Nitrosylierung von LAP seine Fähigkeit, an TGFβ zu binden, unwirksam macht (Vodovotz et.al.: Cancer Res. 59, 2142-2149 (1999)). Folglich ist es unwahrscheinlich, dass an entzündeten Stellen das freigesetzte LAP der Funktion des TGFβ entgegenwirken wird.
Weitere Modifikationen an der MMP-Spaltstelle könnten für eine zusätzliche Gewebespezifität sorgen.
Übersetzung der Figurenlegenden

EPA 02 729 440.4

Fig. 1, 2
Fig. 3
Fig. 4
Fig. 6, 7
Fig. 9A+B
Fig. 10
Fig. 11, 12

Claims

Fusionsprotein, das ein mit Latenz assoziiertes Peptid (LAP) von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle aufweist, um einem pharmazeutisch aktiven Protein Latenz zu verleihen.
Fusionsprotein, das ein mit Latenz assoziiertes Peptid (LAP) von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle aufweist, um ein latentes pharmazeutisch aktives Protein ortsspezifisch zu aktivieren.
Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die MMP-Spaltstelle durch eine Matrix-Metallproteinase gespalten ist, die aus der Gruppe MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 oder MMP10 ausgewählt ist.
Fusionsprotein zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmazeutisch aktive Protein ein Wachstumsfaktor, Differenzierungsfaktor, Cytokin, Chemokin, trophischer Faktor, Cytokininhibitor, Cytokinrezeptor, freie Radikale abfangendes Enzym, Arzneimittelvorläufer konvertierendes Enzym, Peptidmimetikum, Proteaseinhibitor, Metallproteinase-Gewebsinhibitor oder Serinproteaseinhibitor ist.
Fusionsprotein zur Verwendung nach Anspruch 4, bei dem das Cytokin ein Interleukin oder ein Interferon ist.
Fusionsprotein zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein mit einem latenten TGFβ-bindenden Protein assoziiert ist.
Nukleinsäurekonstrukt, das eine erste, ein pharmazeutisch aktives Protein codierende Nukleinsäuresequenz und eine zweite Nukleinsäuresequenz enthält, die ein LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 codiert, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz, die eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle codiert, zwischen der ersten und der zweiten Nukleinsäuresequenz vorgesehen ist.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die MMP-Spaltstelle durch eine Matrix-Metallproteinase gespalten ist, die aus der Gruppe MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9 oder MMP10 ausgewählt ist.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmazeutisch aktive Protein ein Wachstumsfaktor, Differenzierungsfaktor, Cytokin, Chemokin, trophischer Faktor, Cytokininhibitor, Cytokinrezeptor, freie Radikale abfangendes Enzym, Arzneimittelvorläufer konvertierendes Enzym, Peptidmimetikum, Proteaseinhibitor, Metallproteinase-Gewebsinhibitor oder Serinproteaseinhibitor ist.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, bei dem das Cytokin ein Interleukin oder ein Interferon ist.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Nukleinsäuresequenz das Protein IFNβ codiert.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 11, welches in der Form eines Vektors vorliegt.
Zelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 12 enthält.
Cytokin, das das Expressionsprodukt eines Nukleinsäurekonstruktes nach den Ansprüchen 7 bis 12 ist.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 12 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Nukleinsäurekonstruktes nach einem der Ansprüche 7 bis 12 bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Osteoarthritis, Sklerodermie, Nierenkrankheit, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmkrankheit, Multipler Sklerose, Atherosklerose, entzündlicher Krankheit oder Krebs.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 12 enthält.
Fusionsprotein, das ein LAP von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle enthält, wobei das Fusionsprotein mit einem pharmazeutisch aktiven Protein verbunden ist.
Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach Anspruch 18, der die Herstellung des Fusionsproteins rekombinant durch Expression in einer Wirtszelle, Reinigung des exprimierten Fusionsproteins und Verbindung des pharmazeutisch aktiven Proteins mit dem gereinigten Fusionsprotein mittels chemischer Vernetzung umfasst.
Fusionsprotein nach Anspruch 18 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Fusionsproteins nach Anspruch 18 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Osteoarthritis, Sklerodermie, Nierenkrankheit, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmkrankheit, Multipler Sklerose, Atherosklerose, entzündlicher Krankheit oder Krebs.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Fusionsprotein nach Anspruch 18 enthält.
Ein in vitro-Verfahren zur Ausstattung eines pharmazeutisch aktiven Proteins mit Latenz, die das Verbinden eines Fusionsproteins, das ein mit Latenz assoziiertes Peptid (LAP) von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle enthält, mit dem vorerwähnten pharmazeutisch aktiven Protein beinhaltet.
Komponentensatz, der ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 12 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 18 und eine Trägersubstanz zur Verabreichung enthält.
Verwendung eines Fusionsproteins, das ein mit Latenz assoziiertes Peptid (LAP) von TGFβ-1, -2, -3, -4 oder -5 und eine Matrix-Metallproteinase (MMP)-proteolytische Spaltstelle enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein mit einem pharmazeutisch aktiven Protein bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Osteoarthritis, Sklerodermie, Nierenkrankheit, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmkrankheit, Multipler Sklerose, Atherosklerose, entzündlicher Krankheit oder Krebs verbunden ist.