DE602005002233T2

DE602005002233T2 - Verwendung von pflanzenfasern mit feiner korngrösse für die herstellung einer nährstoffzusammensetzung zur verringerung der biologischen verfügbarkeit von mykotoxinen

Info

Publication number: DE602005002233T2
Application number: DE602005002233T
Authority: DE
Inventors: Emmanuel Kossi Tangni; Yvan Larondelle; Ludovic De MEEÜS d'ARGENTEUIL; Nabilla Aoudia
Original assignee: Realdyme SA
Current assignee: Realdyme SA
Priority date: 2004-01-07
Filing date: 2005-01-06
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2025-01-07
Also published as: FR2864749A1; ES2293550T3; EP1711071A1; DE602005002233D1; ATE371377T1; US20110070328A1; US20090191272A1; WO2005067736A1; FR2864749B1; EP1711071B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Pflanzenfasern sehr kleiner Korngröße bei der Herstellung einer Lebensmittelzubereitung, welche die Bioverfügbarkeit von Mykotoxinen verringert.
Die wichtige Rolle der Unschädlichkeit von Lebensmitteln für deren Sicherheit ist weitgehend anerkannt, besonders von den Regierungen der Länder, die 1992 in Rom (Italien) an der Internationalen Konferenz über Ernährung ("International Conference an Nutrition"), sowie im Jahr 1996 am Welternährungsgipfel ("World Food Summit") in Rom (Italien) teilgenommen haben.
Eine große Anzahl von Faktoren kann Qualität und Sicherheit der Lebensmittel bedrohen, u.a. auch durch das Auftreten natürlicher Toxine. In der Tat stellen die Mykotoxine in der langen Liste der Toxine, die sich auf natürliche Weise in marktüblichen Lebensmitteln befinden können, eine besonders wichtige Kategorie dar, über welche die meisten Studien durchgeführt wurden, weil sie überall zugegen sind und ihre verhängnisvolle Wirkung auf die Gesundheit von Mensch und Tier allgemeine Unruhe erzeugt. (FAO, 1999, "Preventing Mycotoxin contamination", Publication n°23, Rom, Italien, S. 55).
Die landwirtschaftlichen Erzeugnisse sind potenzielle Zielgruppen für Schädlinge und Krankheiten. Ihre mikrobische Flora ist umfangreich und vielfältig und enthält vor allem Bakterien, Hefen und faserige Pilze. Ihr Vorkommen kann eine Qualitätsminderung der Agrarprodukte hervorrufen, oder die Produkte gar vollständig zerstören. Innerhalb dieser Mikroorganismen sind gewisse faserige Pilze für die Produktion von Mykotoxine verantwortlich; diese kann man sowohl in den Feldern während der Wachstumsphase der Agrarprodukte, als auch bei deren Lagerung unter günstigen Feuchtigkeits- und Temperaturbedingungen beobachten. Die wesentlichen Pilzarten (fungi), die solche Mykotoxine hervorbringen, sind Penicillium, Fusarium, Aspergillus und Alternaria.
Die Mykotoxine sind Sekundärmetaboliten von sehr unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung, die aber im Allgemeinen ein geringes Molekulargewicht aufweisen. Ihre negativen – akuten oder chronischen – Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit sind ebenfalls sehr vielfältig. Ihre Hauptangriffspunkte sind Nieren, Leber und Darmtrakt, sowie das Nerven- und das Immunsystem. Bis heute hat man ungefähr fünfhundert Mykotoxine entdeckt, und ihre Anzahl wächst mit dem Fortschreiten der Forschung ständig an. Jedoch sind nur ca. zwanzig von ihnen wirklich als Bedrohung für die Lebensmittelsicherheit identifiziert. Innerhalb der unterschiedlichen Familien von Mycotoxinen, die in Lebensmitteln vorgefunden werden, kann man besonders Aflatoxine (AFLA), Ergotoxine, Fumonisine (FB), Ochratoxine A (OTA), Patulin (PAT), Sterigmatocystin, Zearalenon (ZEA) und die Trichotezene, sowie darunter Deoxynivalenol (DON) nennen. Je nach ihren unterschiedlichen Eigenschaften können sich Mykotoxine in vielfältiger Weise negativ auf die Gesundheit von Mensch und Tier auswirken; sie greifen vor allem die Leber oder das Immunsystem an, sind krebserregend, oder wirken teratogen, nervenschädigend oder nephrotoxisch, oder sie können Verdauungsstörungen oder innere Blutungen hervorrufen.
Zu den Haupt-Lebensmitteln, die besonders einer Kontaminierung durch Mykotoxine ausgesetzt sind, zählen Getreide, Nüsse, getrocknete Früchte, Kaffee, Kakao, Gewürze, ölhaltige Kerne, Erbsen und Saubohnen sowie Obst. Also können auch ihre Folgeprodukte kontaminiert sein, was von der Beständigkeit des Toxins während des Umwandlungsprozesses abhängt. Daraus ergibt sich, dass diese Mykotoxine, und besonders das OTA, an zahlreiche Konsumgüter für Mensch und Tier übertragen werden können, wie z.B. Tiermehle, Wein, Bier, Brot und Folgeprodukte von Kaffee oder Kakao (Abarca ML. et al., J. Food Prot., 2001, 64(6), 903–906; Walker R., Adv. Exp. Med. Biol., 2002, 504, 249–255). Es besteht ebenfalls das nicht zu vernachlässigende Risiko einer Sekundär-Kontaminierung über gewisse Lebensmittel tierischen Ursprungs, wie z.B. Fleisch und die Innereien von monogastrischen Tierarten (Pittet A., Rev. Méd. Vét., 1998, 149, 479–492).
Die Mykotoxine sind äußerst beständige Verbindungen, die den meisten Umwandlungsprozessen für Agrarprodukte widerstehen. Angesichts ihrer negativen Auswirkungen auf die Gesundheit ist es somit besonders wichtig über wirksame Mittel zu verfügen; diese Mittel sollten:

– entweder die Kontaminierung der Lebensmittel verhindern,
– oder diese vor dem Umwandlungsprozess oder danach

Der erste Ansatz ist hinsichtlich der Anbau- oder der Lagerbedingungen der Rohstoffe nicht immer durchführbar.
Somit muss der zweite Ansatz auf der Ebene der Industrie umgesetzt werden, und es sind schon verschiedene physikalisch-chemische oder biologische Prozesse in dieser Richtung vorgeschlagen worden. Diese Prozesse der Entgiftung kann man in 3 große Kategorien aufteilen:

1) die erste Kategorie besteht darin, die Toxine in weniger giftige oder ungiftige Produkte abzustufen, so dass ihre Aufnahme für den Organismus weniger abträglich ist;
2) die zweite Kategorie besteht darin, das Lebensmittel einer Mikrofiltrierung zu unterziehen. Hier kann man beispielsweise das amerikanische Patent n° 5,248,382 nennen, das eine Methode beschreibt, mit der sich der Mykotoxingehalt in Obstsäften reduzieren lässt, besonders der Patulingehalt: durch Filtrieren mit einem mikroporösen Harz, dessen Porengröße weniger als 20 Angström beträgt, wird das Patulin per Chemosorption zurückgehalten. Diese Methode ist wirksam, hat aber den Nachteil, dass ein sehr spezifisches und teures Material notwendig ist; zudem ist sie nur auf flüssige Lebensmittel anwendbar.
3) die dritte Kategorie setzt Adsorbenten ein, um wenigstens einen Teil der Mykotoxine zurückzuhalten. Diese Adsorbenten werden entweder während der Produktion der Lebensmittel zugesetzt und hinterher vor dem Verzehr, daraus wieder entfernt (im Allgemeinen durch Filtrierung), um den Mykotoxingehalt im fertigen Lebensmittel zu verringern; oder sie werden den Lebensmitteln beim Verzehr beigefügt, um die Bioverfügbarkeit der Mykotoxine bei der Verdauung zu verringern.

In den zahlreichen, bereits vorliegenden fachspezifischen Dokumenten, die die zu dieser dritten Kategorie zählenden Verfahren beschreiben, werden die Mykotoxine durch das Wirken von nicht-biologischen, im allgemeinen anorganischen Adsorbenten eliminiert.
In der Reihe der anorganischen Adsorbenten wurde insbesondere der Einsatz der folgenden vorgeschlagen:

– hydratisierte Natrium-Kalzium-haltige Aluminosilicate (HSCAS), die in einem Medium gegenwärtigen Aflatoxine zu adsorbieren. Aber ihre Wirkung gegen OTA ist schwächer (Huwig A. et al., Tox. Letters, 2001, 122, 179–188);
– die Phyllosilicate (Diaz D. E. et al., J. Dairy Sci., 1999, 82 (suppl. 1), 838;
– Aktivkohlen, deren Tests in vivo einen vorbeugenden Effekt gegenüber Aflatoxinen gezeigt haben, sowie eine Steigerung der Leistungsfähigkeit der Tiere, wenn sie mit den kontaminierten Futtermitteln ernährt werden (Galvano et al., J. Food Prot., 1997, 60, 985–991), sowie auch eine Verringerung des OTA-Gehaltes in Geweben, Blut und Galle der Tiere, deren Ernährung der Adsorbent beigemischt wurde (Ramos A. J. u. Hernandez E., Animal Feed Science and Technology, 1997, 62, 263–269; Huwig et al., 2001, bereits genannt);
– die Harze wie Cholestyramin und Polyvinylpyrrolidon, die ebenfalls die Fähigkeit haben OTA zu binden (Piva A. und Galvano F., 1999, "Nutritional approaches to reduce the impact of mycotoxins", Proceedings of Alltech's 15th Annual Symposium, T. P. Lyons und K. A. Jacques (eds.), 381–400, Nottingham University Press, Nottingham, UK).

Hingegen weisen die in-vivo-Studien bei den Adsorbenten keinen systematischen Schutz gegenüber der Giftigkeit der Mycotoxine und insbesondere der OTA nach. Tatsächlich hat die von Bauer J. (Monatsh Veterinarmed, 1994, 49, 175–181) durchgeführte Studie keine Verminderung der Konzentration von OTA in Blut und Gewebe von Tauben gezeigt, sofern die Aufnahme der Lebensmittel, die durch dieses Gift kontaminiert waren, mit der Aufnahme von Bentonit (deutscher Patentantrag DE 3 810 004 ), von HSCAS, von Cholestyramin oder von Hefezellwänden einherging. Die gleichen Beobachtungen machten auch Scheideler S. E. (Poultry Science, 1993, 72, 282–288) und Ledoux D. R. et al., 2001 ("In vitro binding mycotoxins by adsorbents does not always translate into in vivo efficacy.", In: Mycotoxins and phycotoxins in perspective at the turn of the millennium. Proceedings of the X^th International IUPAC Symposium in Mycotoxins and Phycotoxins, hgg. von W. J. de Koe, R. A. Samson, H. P. Van Egmond, J. Gilbert und M. Sabino, Wageningen, The Netherlands, 279–287). Unlängst haben Santin E. et al. (J. Appl. Poultry Res., 2002, 11(1), 22–28) aufgezeigt, dass der Zusatz von HSCAS in einer Dosis von 0,25 % den negativen Effekt der OTA (2 ppm) auf die physiologischen Parameter bei Hühnern kaum verringert.
Weiterhin können die obengenannten Liganden Verluste an nährstoffreichen Elementen hervorrufen und die organoleptische Qualität der Lebensmittel verändern.
Außerdem ist es unmöglich, Mykotoxine vollständig zu beseitigen. Darum erscheint es wichtig, die Reihe der vorab genannten Vorbeugungs- und Korrekturmaßnahmen zu vervollständigen, und zwar durch für den Organismus ungefährliche und unter dem sensorischen Aspekt akzeptable Mittel, die die Fähigkeit haben, die Mykotoxine zu binden und deren Bioverfügbarkeit im Organismus nach der Aufnahme eines kontaminierten Lebensmittels zu verringern.
Die Erfinder haben sich zum Ziel gesetzt, eine biologische Methode zur Entgiftung von Lebensmittel Media zu erarbeiten, die es ermöglicht, den genannten Nachteilen in ihrer Gesamtheit Abhilfe zu schaffen und die Bioverfügbarkeit der Mykotoxine nach der Aufnahme von kontaminierten Lebensmitteln zu verringern.
Bei dieser Gelegenheit haben die Erfinder überraschenderweise aufgezeigt, dass sich die Fähigkeit der im wesentlichen unlöslichen Pflanzenfasern, Mykotoxine au adsorbieren, in hohem Maße verbessert, wenn man Pflanzenfasern wählt, die als Mikropartikel auftreten, von deren Gewicht mindestens 90 % einen Größenwert von kleiner oder gleich 700 μm aufweisen. Dies kann man nutzen und einen Nährstoffkomplex erstellen, der die Bioverfügbarkeit der Mykotoxine, die potentiell in den aufgenommenen Lebensmitteln vorhanden sind, merklich reduziert.
Der Einsatz von Lebensmittelfasern zur Reduzierung der Aufnahme von Mykotoxinen ist auch bekannt unter der Patentnummer US 4,770,880 ; Carson und Smith, J. Nutz 1983; 113: 304–313 und Smith, J. Anim. Sci. 1980; 90: 278–285.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun der Einsatz von mikronisierten, im wesentlichen unlöslichen Pflanzenfasern, die unter der Form von Mikropartikeln auftreten, von deren Gewicht mindestens 90 % einen Größenwert von kleiner oder gleich 700 μm aufweisen, als Komponente bei der Herstellung eines Nährstoffkomplexes, der die Bioverfügbarkeit der Mykotoxine bei Mensch oder Tier nach Aufnahme eines eventuell von den genannten Mykotoxinen kontaminierten Lebensmittels verringern soll.
In der Tat haben die Erfinder beobachten können, dass die Adsorptionsfähigkeit in vitro dieser Pflanzenfasern gegenüber Mykotoxinen auch in vivo Bestand hat, was erlaubt, die Bioverfügbarkeit und somit auch die schädlichen Effekte der Mykotoxine nach Aufnahme in den Organismus zu verringern. Außerdem haben die Erfinder bei Versuchen in vitro festgestellt, dass bei Pflanzenfasern der entsprechenden Korngröße die Fähigkeit Mykotoxine zu adsorbieren merklich höher ist als bei Pflanzenfasern, die größer als 700 μm sind.
Im Rahmen der Erfindung versteht man unter „im wesentlichen unlöslich" eine Zusammensetzung, deren Anteil an löslichen Fasern (Enzymatische Analyse) den Anteil von 55 % des gesamten Fasergehaltes nicht überschreitet. Weiterhin bezieht sich der Begriff « Pflanzenfasern » in der nachfolgenden Beschreibung (soweit nicht explizit anders genannt) auf im Wesentlichen unlösliche Pflanzenfasern, deren Eigenschaften bzgl. der Korngröße den im Rahmen der Erfindung vorab definierten Eigenschaften entsprechen.
Für eine günstige Durchführung der vorliegenden Erfindung sollten die eingesetzten Pflanzenfasern die Form von Mikropartikeln haben, von deren Gewichtsanteil ca. 90 % eine Größe von bis zu 400 μm aufweisen, vorzugsweise zwischen ca. 2 μm und einschließlich 200 μm; die Korngrößenbestimmung erfolgt durch Aussieben mit einem Sieb vom Typ A 200 LS Air Jet Sieve vertrieben von der Firma Alpine (Augsburg, Deutschland): die Fasern werden 6 Minuten lang einem Luftdrucksabfall von 250 auf 700 mm per Wassersäule ausgesetzt.
Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Pflanzenfasern können insbesondere durch Mikronisierung vorbereitet werden, nach einem Vorgang den z.B. der Patentantrag FR 2 433 910 beschreibt. Die in dieser Erfindung einsetzbaren Mikropartikel von Pflanzenfasern haben eine sphärische oder deutlich sphärische Form.
Für eine günstige Ausführung der vorliegenden Erfindung hat der genannte Nährstoffkomplex zum Ziel, die Bioverfügbarkeit der hydrophoben Mykotoxine zu reduzieren, da die Erfinder bei In-vitro-Versuche festgestellt haben, dass hydrophobe Mykotoxine ein größere Affinität für Pflanzenfasern aufweisen als hydrophile Mykotoxine. Als Beispiele für hydrophobe Mykotoxine sind Aflatoxine und Ochratoxine A zu nennen.
Für die Ausführung der vorliegenden Erfindung, werden die Pflanzenfasern folgender Herkunft ausgewählt:

– Getreide, Hülsenfrüchte, Gemüse, Früchte (inkl. Tropischer Herkunft) und im Allgemeinen alle im Lebensmittel verwendete Pflanzen,
– Pflanzen, die von der Papierindustrie verwendet werden wie Bäume, Zuckerrohr, Bambus und Getreidestroh.

Unter den Getreidefasern kann man besonders Weizen, Gerste, Hafer, Mais, Hirse, Reis, Roggen, Sorghum, nennen, oder deren gemälzten Äquivalenten.
Im Rahmen der Erfindung versteht man unter « gemälzten Äquivalenten » die gekeimten Körner, deren Keimung durch eine Hitzebehandlung unterbrochen wurde, und deren Keim man dann entfernt hat.
Unter den Fasern nahrungspflanzlicher Herkunft sind außer Getreide besonders die Fasern von Äpfeln, Birnen, Weintraubenkernen, Lupinenkernen und Soja, sowie von Tomaten, Erbsen, Kaffee usw. zu nennen.
Unter diesen Pflanzenfasern werden folgende besonders bevorzugt:

– mikronisierte Weizenfasern, vertrieben unter dem Produktnamen Realdyme^® und Realdyme^® M. die Mikropartikel des letztgenannten Produkts sind zu mindestens 90 % ihres Gewichtes ein Maximalgröße von 100 μm;
– mikronisierte Haferfasern, vertrieben unter dem Produktnamen Realdyme^® A;
– mikronisierte Gerstenfasern, vertrieben unter dem Produktnamen Realdyme^® O, und insbesondere Realdyme^® OF und Realdyme^® OM;
– mikronisierte Apfelfasern, vertrieben unter dem Produktnamen Realdyme^® P.

Alle diese Fasern sind verfügbar bei der Firma REALDYME (Garancières en Beauce, La Haute Epine, Frankreich).
Der Erfindung entsprechend hängt die Auswahl der eingesetzten Faser vorzugsweise von dem oder den Mykotoxinen ab, die potentiell im Lebensmittelumfeld vorhanden sind, und deren Bioverfügbarkeit nach Aufnahme in den Organismus verringert werden soll.
Wenn die Lebensmittelzubereitung hauptsächlich die Bioverfügbarkeit von Ochratoxin A, Aflatoxine, Fumonisine und/oder Deoxynivalenol verringern soll, werden die Pflanzenfasern vorzugsweise unter mikronisierte Weizenfasern wie Realdyme^® und Realdyme^® M ausgewählt, oder unter mikroniserte Haferfasern wie z.B. das Produkt Realdyme^® A, bzw. deren Mischungen. Der Erfindung nach, und wenn es darum geht, die Bioverfügbarkeit von Ochratoxin A zu verringern, ist besonders der Einsatz von Realdyme^® M zu bevorzugen.
Laut der Erfindung ist die Lebensmittelzubereitung sowohl für Tiernahrung wie auch für die Nahrung der Menschen geeignet.
Der dieser Erfindung entsprechende Lebensmittelzubereitung kann in verschiedenen Formen auftreten z.B. als separate Beigabe zur Nahrung, als Zutat (Lebensmittel-Zwischenprodukt) oder als Rohstoff.
Wenn die Lebensmittelzubereitung in Form eines beigegebenen Präparates eingesetzt wird, so kann der Faseranteil dieses Präparates bis zu 100 % seines Eigengewichtes betragen, vorzugsweise sollte die Menge zwischen 80 % und 100 % des Gewichtes betragen.
Wenn die Lebensmittelzubereitung in Form eines Lebensmittelzwischenproduktes eingesetzt wird, so ist dieses vorzugsweise für die menschliche Ernährung bestimmt und wird während der Herstellung des Lebensmittels, das eventuell von Mykotoxine kontaminiert ist, zugefügt. In diesem Fall stellt das Präparat zwischen 0,05 bis 20 % des Gewichtes dar, und sollte außerdem vorzugsweise 0,1 à 5 % des Gewichtes im Vergleich zum Gesamtgewicht des Lebensmittel-Endproduktes ausmachen.
Wenn die Lebensmittelzubereitung in Form eines Lebensmittel-Rohstoffes einsetzt wird, sollte dieser vorzugsweise für Tiernahrung bestimmt sein. Die Lebensmittelzubereitung kann dann zur täglichen, eventuell durch Mykotoxine kontaminierten Futterration zugefügt werden, die den Haus- oder Zuchttieren verabreicht wird, und zwar vor Aufnahme der kontaminierten Ration. Das Zusatzprodukt kann auch als Rohstoff oder Beigabe im Laufe der Herstellung von Vollnahrungen für Haus- und Zuchttiere eingesetzt werden. In diesen beiden letztgenannten Fällen stellt der Lebensmittelkomplex vorzugsweise zwischen 0,05 und 10 % des Gewichtes dar, oder noch besser zwischen 0,3 à 2 % Gewichtsanteil im Vergleich zum Gesamtgewicht der Ration oder des Vollnahrungsmittels.
Außer den vorab genannten Bestimmungen umfasst die Erfindung noch andere Bestimmungen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen, welche sich auf folgende Beispiele beruft: auf ein Beispiel, welches die Adsorptionsfähigkeit von löslichen Pflanzenfasern gegenüber OTA sowie Screening-Tests zur Auswahl der verschiedenen Pflanzenfasern darstellt; auf ein Studienbeispiel, welches die Auswirkung der pH-Wert-Schwankungen auf die OTA-Adsorption in einer Modell-Lösung bearbeitet; auf ein Beispiel, das die Adsorption von Aflatoxinen B1 an lösliche Pflanzenfasern in einer Modell-Lösung zeigt; auf eine Vergleichsstudie über die Abhängigkeit von Dosierung und Adsorption von AFB1 an mikronisierte und nicht-mikronisierte Weizenfasern und auf eine Studie über die Verringerung der Bioverfügbarkeit von OTA nach Zugabe von mikronisierte Weizenfasern, die vermischt mit OTA kontaminiertem Futter an Ratten verabreicht wurde. Bezug genommen wird auch auf die 1 bis 5 im Anhang:
1 stellt die Entwicklung der OTA-Adsorption (prozentualer Restgehalt im Vergleich zum anfänglichen Gehalt) nach der Adsorption von OTA an 3 verschiedene Fasern dar (Realdyme^® M: Kreuz; Realdyme^® OF: volle Kreise und Realdyme^® OM: Dreiecke) in einer Modell-Lösung mit einer anfänglichen OTA-Konzentration von 30 ng/ml für ein Anfangsvolumen von 25 ml und eine Dauer von 45 Minuten je nach Fasermenge in Gramm pro Liter Modell-Lösung;
2 stellt die Entwicklung der Adsorption von OTA (prozentuale Verringerung der Menge von OTA im Vergleich zur anfänglich vorhandenen Menge) an die Fasern Realdyme^® M in einer Modell-Lösung dar, und zwar im Zusammenhang mit den Variationen des pH-Wertes: schwarze Striche: pH = 6; graue Striche: pH = 2,2; weiße Striche: nach Erhöhung des pH-Wertes von 2,2 auf 4,8;
3 stellt die Menge von AFB1 dar, die in einer auf einen pH-Wert von 3 eingestellten und anfänglich mit AFB1 kontaminierten PBS-Lösung adsorbiert werden; die Menge ist prozentual im Vergleich zur anfänglich in der Modell-Lösung enthaltenen Menge an AFB1 angegeben; schwarze Quadrate: mikronisierte Weizenfasern und schwarze Rauten: nicht-mikronisierte Weizenfasern;
4 zeigt die Gesamtmenge der ausgeschiedenen Fäkalien (in g) im Vergleich zur ablaufenden Zeit (ausgedrückt in Tagen nach Beginn des Versuchs: J0 = Tag 0) bei Ratten, an die verschiedene Nahrungstypen verfüttert wurden, seien diese mit OTA kontaminiert oder nicht, mit oder ohne Beigabe von mikronisierte Weizenfasern (graue Striche: Nahrungstyp 1 = Futterration, die nicht mit OTA kontaminiert ist, schwarze Striche: Nahrungstyp 2 = mit OTA kontaminierte Futterration, und weiße Striche: Nahrungstyp 3 = mit OTA kontaminierte Futterration unter Zuführung mikronisierter Weizenfasern);
5 zeigt die OTA-Menge in den während der 4. Woche gefundenen Rattenkot (in μg), je nach den vorab in der Beschreibung des 4 genannten Nahrungstypen
BEISPIEL 1: NACHWEIS DER ADSORPTIONSFÄHIGKEIT VON OTA AN PFLANZENFASERN UND VORHERIGES SCREENING ZUR AUSWAHL DER VERSCHIEDENEN PFLANZENFASERN
Überraschenderweise haben die Erfinder festgestellt, dass die Beimischung von mikronisierten Pflanzenfasern in einer Modell-Lösung erlaubt, die in der Lösung vorhandene Mikotoxinmenge durch die Adsorption des OTA an die Fasern zu verringern. Die in diesem Beispiel zitierten in vitro-Versuche wurden mit der Zielsetzung durchgeführt, die Adsorptionsfähigkeit an mikronisierte Pflanzenfasern zu zeigen, wenn diese einer mit OTA kontaminierten Lösung beigemischt werden, und um die optimale Kontaktdauer für eine optimale Adsorption der OTA an diese Fasern festzulegen. Danach wurden die verschiedenen Pflanzenfasern getestet (Screening), um herauszufinden, welche Fasern die beste Leistung bei der OTA-Adsorption zeigen. Weiterhin wurde die Adsorptionsfähigkeit von Realdyme^® M mit den Adsorptionswerten des nicht-mikronisierten Rohstoffes (nicht-mikronisierte Weizenfasern) verglichen.
1)Versuchsprotokoll
In einem sterilen Reagenzglas von 50 ml (15 Min. Sterilisierung bei 121°C) wird eine bestimmte Menge von Pflanzenfasern (ca.20 g/l) mit 25 ml wässriger Lösung vermischt, die 2 % Dextrose (vertrieben unter dem Produktnamen D(+) Glukose-Monohydrat von der Firma Merck), 5 % Hefeextrakt (vertrieben unter dem Produktnamen Hefeextrakt in Puderform von der Firma ICN Biomedical) und 1 % Pepton (vertrieben unter dem Namen Pepton von der Firma Duchefa) enthält. Diese wässrige Lösung hat einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,2 und wird im folgenden "DYP" (Modell-Lösung) genannt. Die DYP-Modell-Lösung wird nun durch unterschiedliche Mengen einer OTA-Ethanol-Lösung kontaminiert. Die OTA-Konzentration in der Modell-Lösung beträgt 57 ng/ml. Der Inhalt des Reagenzglases wird dann durch 30 Sekunden langes Schütteln mit der Hand homogenisiert, und wird danach 45 Minuten lang in einem konstant 25°C warmen Raum bei 90 Umdrehungen pro Minute (rpm) umgerührt. Für jeden Versuch wird zum Vergleich ein Kontrollmuster ohne Adsorbent, d.h. ohne Pflanzenfaser erstellt, und jeder Versuch wird dreimal durchgeführt.
Danach wird der Schwebestoff 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 25°C bei 1830 g zentrifugiert, und der ausgefallene Niederschlag vom Überstand getrennt. Danach wird 1 ml Überstand in einem sterilen Reagenzglas mit 9 ml Methanol-Wasser-Lösung (50:50; v/v) versetzt. Das Reagenzglas wird nun 30 Sekunden lang vortexturiert, danach 10 Minuten lang bei 820g zentrifugiert bei einer Temperatur zwischen 5 und 10°C. Dieses Extrakt wird dann verdünnt, gefiltert und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) analysiert.
Das HPLC-System besteht aus einer isokratischen Pumpe Perkin Elmer^® LC049, vertrieben von der Firma Norwalk (USA) mit einer Injektionsschleife von 50 μl vertrieben von der Firma Cotati (USA) unter dem Namen Rheodyne^®, ausgestattet mit einer C_18-Säule von 150 mm Länge, 4 mm Durchmesser und einer Porosität von 3 μm, vertrieben unter dem Namen Hypersil^® BDS von der Firma Tracer Analytica (Spanien), einem Fluoreszenz-Messgerät RF 551 vertrieben von der Firma Shimadzu (JapAn), das mit einer 150W starken, auf eine Exitationswellenlänge (λ_Excitation) von 332 nm und eine Emissionswellenlänge (λ_Emission) von 462 nm eingestellten Xenon-Lampe ausgestattet ist, sowie mit einem Integrator SP4290 vertrieben von der Firma Spectra Physics (USA). Das Laufmittel ist Gemisch von Azetonitril/Wasser/Essigsäure (450/540/10; v/v), das mit einer Membran von 0,25 μm gefiltert und dann 15 Minuten lang mit Helium entgast wurde. Die Durchflussgeschwindigkeit des Laufmittels ist festgelegt auf 1 ml/mn bei einem Druckwert zwischen 2900 und 3000 psi.
Die insgesamt adsorbierte Menge von OTA wird bestimmt durch die Differenz zwischen der am Anfang des Versuchs und am Ende des Versuchs im Supernant vorhandener OTA-Menge.
In diesem Beispiel wurden folgende mikronisierte Pflanzenfasern verwendet: Realdyme^® M, Realdyme^® OF und Realdyme^® OM, und zwar in unterschiedlichen Dosierungen.
2) Ergebnisse
Die erzielten Ergebnisse wurden in die folgenden Tabellen I bis IV, sowie in das 1 im Anhang übertragen.

Die Prozentsätze des an die Fasern Realdyme^® M adsorbierten OTA sind unter Berücksichtigung der Kontaktdauer mit der Modell-Lösung, welche bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 6,2 57 μg/l OTA enthält, in der folgenden Tabelle I aufgezeichnet TABELLE I

	Menge der adsorbierten Mykotoxine (%)
	Kontaktdauer (in Stunden)
Menge von Realdyme^® M (g/l)	3	24	48
0 (Kontrolle)	0	0	0
10	46,7	52,5	49,8
16	59,8	65,3	61,6
20	68,9	69,7	71,7
30	68,0	72,3	73,6

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Adsorption der Fasern bei einer Kontaktdauer von 3 bis 24 Stunden nicht variiert. Weiterhin steigt die Menge von adsorbierten OTA je mehr Fasern in der Lösung vorhandenen sind.
Die Wirkung auf die Adsorptionsrate (in %) von OTA (20 g des Fasertyps Realdyme^® M pro Liter Modell-Lösung von pH 5,2 die 35 ng OTA/ml enthält) an die Fasern bei einer Kontaktdauer von weniger als 24 Stunden sind in der folgenden Tabelle II festgehalten: TABELLE II

Kontaktdauer (in Minuten) % von adsorbiertem OTA

0 0

5 21

15 20

45 25

90 29

169 28

360 30

1440 43
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Adsorption sich sehr schnell vollzieht (annähernd zwischen 5 und 45 Minuten) und dass diese mindestens bis zum Ende des Versuches Bestand hat.
Die Auswirkungen der Mikronisierung auf die Adsorption von OTA an die Fasern Realdyme^® M im Vergleich zu deren nicht-mikronisiertem Rohstoff sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt: TABELLE III

Menge von adsorbiertem OTA (%)

Menge der Fasern (g/l) Nicht-mikronisiserter Rohstoff Realdyme^® M

20 17 % 33 %

30 22 % 37 %
Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die Adsorptionsfähigkeit der Fasern durch Mikronisierung fast verdoppelt.
1 im Anhang zeigt die Adsorptionsfähigkeit von 3 unterschiedlichen Fasern (Realdyme^® M: Kreuz; Realdyme^® OF: Kreise und Realdyme^® OM: Dreiecke) in einer DYP-Lösung, die bei einer anfänglichen Lösungsmenge von 25 ml und einer Kontaktdauer von 45 Minuten eine anfängliche OTA-Konzentration von 30 ng d'OTA/ml aufweist. In diesem Figur ist der Restanteil von OTA für jede Faser im Vergleich zur Fasermenge in Gramm pro Liter DYP-Lösung ausgedrückt.
Die in 1 übertragenen Ergebnisse zeigen, dass selbst bei so schwachen Konzentrationen wie 5 g Faseranteil pro Liter Lösungsflüssigkeit eine gute Adsorption von OTA beobachtet werden kann, insbesondere bei der Faser Realdyme^® M.
BEISPIEL II: STUDIE ÜBER DIE WIRKUNG DES PH-WERTES AUF DIE ADSORPTION VON MYKOTOXINEN AN WEIZENFASERN
Der pH-Wert der Versuchslösung ist im Stande, die Adsorption von OTA an die Fasern zu beeinträchtigen, denn er beeinflusst die Verteilung der elektrischen Ladung sowohl auf die Fasern, wie auch auf die Toxine und innerhalb der Lösungsflüssigkeit. Im Laufe des Verdauungsvorgangs nimmt der pH-Wert im Speisebrei stark ab.
Um den Einfluss des pH-Wertes auf die Adsorptionsfähigkeit der Fasern zu untersuchen, wurde in einer Modell-Lösung eine Studie durchgeführt, die darin bestand, die Adsorptionswerte vor und nach einer Senkung und einer erneuten Steigerung des pH-Wertes zu messen.
1) Versuchsprotokoll:
Eine bekannte Menge des Fasertyps Realdyme^® M, die einer Konzentration von 20 g Faseranteil/Liter entspricht, wird in einer sterilen 50ml-Röhre mit 25 ml DYP-Modell-Lösung, wie vorab in BEISPIEL 1 beschrieben, vermischt. Die Modell-Lösung wurde vorab kontaminiert mit einer OTA – Ethanol-Lösung. Der pH-Wert der Lösung liegt bei 6.
Nun wird der Inhalt des Reagenzglases inkubiert, getrennt, extrahiert und gereinigt wie vorab in BEISPIEL 1 beschrieben.
Parallel hierzu wird der pH-Wert der gleichen DYP-Lösung in zwei weiteren, bereits mit Fasern ausgestatteten Röhren durch Zuführung von Milchsäure in Puderform auf einen Wert von 2,2 abgesenkt. Der Inhalt eines der beiden Reagenzgläser wird nun inkubiert, getrennt, extrahiert, gereinigt und analysiert wie vorab in BEISPIEL 1 beschrieben.
Nach Zuführung von Natriumhydroxid in Granulatform in das zweite Reagenzglas stieg der pH-Wert der Lösung auf 4,8 an. Der Inhalt des Reagenzglases wird dann inkubiert, getrennt, extrahiert, gereinigt und analysiert wie vorab in BEISPIEL 1 beschrieben.
Jeder Versuch wird dreimal durchgeführt.
2) Ergebnisse:
Die erhaltenen Ergebnisse wurden in 2 im Anhang übertragen. Dieses Figur zeigt die Entwicklung der Adsorption von OTA (prozentuale Abnahme der OTA-Menge in der DYP-Lösung im Vergleich zur anfänglich enthaltenen Menge) an die Fasern nach Abfall und nach erneutem Anstieg des pH-Wertes in der DYP-Lösung. In diesem Figur entspricht der schwarze Strich den bei einem pH von 6 gemessenen Werten, der graue Strich den bei einem pH von 2,2 gemessenen Werten und der weiße Strich den nach Anstieg des pH-Wertes von 2,2 auf 4,8 gemessenen Werten.
Offensichtlich ist die Adsorption von OTA an die Fasern umso stärker je niedriger der pH-Wert ist, und sogar bei einem pH-Wert von 2,2 beträgt die Adsorption noch 82,4 %. Die Freisetzung der Toxine bei Anstieg des pH-Wertes scheint nicht so stark zu sein wie der Anstieg der Adsorption bei einer Senkung des pH-Wertes.
Die Senkung des pH-Wertes erlaubt es also, bei konstanter Fasermenge die Adsorption von OTA an diese Fasern beträchtlich zu steigern.
BEISPIEL III: NACHWEIS DER ADSORPTION VON AFLATOXINEN B1 AN UNLÖSLICHE PFLANZENFASERN
Eine bestimmte Menge von Pflanzenfasern (Realdyme^®: 20 g/l) wird in ein steriles 50 ml-Reagenzglas eingegeben und mit 25 ml Phosphat-Puffer vermischt, dessen pH-Wert bei 7 (PBS) liegt und der vorab durch Aflatoxine B1 (ca. 8,5 ppb) kontaminiert wurde. Die Mischung wird 30 Sekunden lang mit der Hand homogenisiert und danach 45 Minuten lang in einem konstant 25°C warmen Raum bei 90 Umdrehungen pro Minute umgerührt. Ein Kontrollmuster ohne Adsorbent diente als Vergleichsgröße.
Nach dieser Frist wird der Schwebestoff 10 Minuten lang bei 25°C bei 1830 g zentrifugiert und der Bodensatz vom Überstand getrennt. Der Versuch wird dreimal durchgeführt.
Die Aflatoxine B1 (anfängliche Rate und Rückstand) werden nach der Immuno-chemischen Methode ELISA analysiert und mit Hilfe eines speziellen hochempfindlichen Mengentests, vertrieben von der Firma Neogen Corporation (USA) unter dem Produktnamen Veratox^® HS. Das vom Hersteller vorgeschriebene Protokoll wurde angewendet.
Dieser immuno-chemische Test (ELISA) wurde wie folgt durchgeführt:

– Einfüllen von 100 μl Konjugat in jedes Reaktionsgefäß, das nicht mit Antikörpern beschichtet ist;
– Zusatz von 100 μl Standard oder von 100 μl Muster, und Vermischen;
– Entnahme der gesamten Mischung und Einfüllen in ein mit Antikörpern beschichtetes Reaktionsgefäß;
– Inkubation 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur;
– 5-malige Reinigung mit deionisiertem Wasser;
– Ablage von 100 μl Substrat;
– Inkubation 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur;
– Zufügen von 100 μl "Red Stop"-Lösung, die mit dem Test geliefert wird, um die Reaktion von Substrat-Enzym zu stoppen.

Parallel hierzu führt man den gleichen Versuch bei einem pH-Wert von 3 in einer PBS-Lösung (deren pH-Wert mittels einer ausreichenden Menge an Milchsäure auf 3 eingestellt wurde) und erstellt eine Eichkurve mit Standardwerten.
Die visuelle/optische Dichte der Färbungen wird dann an einer Wellenlänge von 620 nm mit Hilfe eines Mikroplatten-Lesegerätes vertrieben unter dem Produktnamen Labsystem Multiscan MCC/340-RS232C (Labsystems, Finnland) abgelesen.
Die Grenzwerte dieser Analysemethode für den Nachweis und die Mengenbestimmung werden jeweils auf 3 und 10 ppt geschätzt, während der Rückgewinnungssatz bei 100 % liegt.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt: TABELLE IV

Kontaktdauer (Mm) Adsorbierte Aflatoxine B1 bei einem pH-Wert von 7 (%) Adsorbierte Aflatoxine B1 bei einem pH-Wert von pH 3 (%)

0 0 0

5 66 72

25 68 69

45 68 70

120 67 74
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Fasern Realdyme^® es erlauben, ab einer Kontaktdauer von 5 Minuten eine große Menge von Aflatoxine B1 zu adsorbieren, sei es bei neutralem pH oder bei saurem pH.
BEISPIEL IV: STUDIE DER DOSIS/WIRKUNG/RELATION BEI DER ADSORPTION VON AFB1 AN MIKRONISIERTE UND NICHT-MIKRONISIERTE WEIZENFASERN
Dieses Beispiel hat zum Ziel festzulegen, ab welcher Dosis die mikronisierten Weizenfasern (REALDYME^®) die gleiche Menge AFB1 adsorbieren wie nicht mikronisierte Weizenfasern.
Der Versuch wurde in einem PBS-Puffer von pH 3 (der pH-Wert wird durch Milchsäure eingestellt) durchgeführt. Der PBS-Puffer wurde vorab mit AFB1 kontaminiert bei einem Gehalt von ca. 8 ppb AFB1.
Die Dosis/Wirkung/Relation wurde ermittelt für die Dosierungen 0,5 %, 1 %, 2 %, 5 % und 10 % Gewichtsanteil der beiden analysierten Fasertypen; die Dosierung von AFB1 erfolgte wie vorab in BEISPIEL 3 beschrieben.
Die erhaltenen Ergebnisse werden im Anhang in 3 dargestellt: die Adsorption von AFB1 drückt sich in einer reduzierten Konzentrationsrate von AFB1 im Überstand, im Vergleich zur anfänglich vorhandenen Konzentration aus; sie ist abhängig von der Menge der verwendeten Fasern (% Gewichtsanteil); die mikronisierten Weizenfasern sind durch schwarze Quadrate dargestellt, die nicht-mikronisierten Weizenfasern sind durch schwarze Rauten dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die mikronisierten Weizenfasern bei der Adsorption von AFB1 wesentlich leistungsfähiger sind.
Aus kaufmännischer Sicht ist es interessant anzumerken, dass die Dosis von 0,75 % mikronisierter Weizenfasern die gleiche Wirkung hat wie eine Dosis von 5 % der gleichen, aber nicht mikronisierten Faser. In einer anfänglich von ca. 8 ppb AFB1 kontaminierten PBS-Lösung mit einem pH-Wert von 3 adsorbieren beide Mengen jeweils 50 % des Mykotoxins. Folglich ist der Einsatz mikronisierter Pflanzenfasern wirtschaftlich von großem Nutzen, da diese es erlauben, die zur Adsorption einer bestimmten Menge von Mykotoxine notwendige Rohstoffmenge zu reduzieren.
BEISPIEL V: NACHWEIS DER WIRKUNG AUF DIE ABNAHME DER BIOVERFÜGBARKEIT VON OTA BEI RATTEN UNTER ZUGABE EINER LEBENSMITTELZUBEREITUNG, DER MIKRONISIERTE PFLANZENFASERN ENTHÄLT,
Dieses Beispiel wurde mit dem Ziel durchgeführt, dass die besonders im oben genannten Beispiel 1 in vitro festgestellten Effekte auf die Adsorption der Mykotoxine an die Pflanzenfasern auch in vivo Bestand haben und somit erlauben, die Bioverfügbarkeit der Mykotoxine nach Aufnahme eines kontaminierten Nahrungsmittels zu verringern.
Das vorliegende Beispiel zielt besonders darauf ab, einerseits die Wirkung dieser biologischen Adsorbenten auf die Wachstumsleistung sowie auf die Menge der Fäkalien bei Ratten zu bewerten, die dem Giftstoff mittels eines auf natürliche kontaminierten Futters ausgesetzt sind. Andererseits wird darauf abgezielt, den Schutzeffekt zu bewerten, den diese Fasern im Blut und in den Organen gegen den OTA-Gehalt ausüben.
Fachspezifisch gesehen hat dieses Beispiel folgende Zielsetzungen:

– den Einfluss einer Beimischung von mikronisierten Weizenfasern in auf natürliche Weise mit OTA kontaminiertem Futtermittel auf das Wachstum und die Entwicklung der Körpermasse bei Ratten, die diesem Giftstoff ausgesetzt wurden, zu messen;
– den Einfluss zu testen, den die Beimischung von mikronisierten Weizenfasern auf die Menge der ausgeschiedenen Fäkalien hat, wenn OTA vorhanden ist;
– die Fähigkeit der mikronisierten Weizenfasern, die Menge von OTA in Blutplasma, Nieren und Leber von Ratten, die dem OTA auf natürliche Weise ausgesetzt sind, zu bewerten;
– den Einfluss zu testen, den die Beimischung von mikronisierten Weizenfasern auf den OTA-Gehalt in den Fäkalien hat.

I) Material und Methoden
1) Produkte

– Kartoffelextrakt, Dextrose/Glukose und E406 (Agar-Agar) (in Puderform) vertrieben von der Firma Scharlan Chemie S. A., Barcelona, Spanien;
– Pepton in Puderform (Duchefa, Haarlem, Niederlande);
– Ochratoxin A (O-1877) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA);
– Toluol für Analysezwecke (Lab Scan, Dublin, Irland);
– Chloroform (Qualität für Analysezwecke) (Lab Scan, Dublin, Irland);
– Äther (Labscan, Dublin, Irland);
– Methanol von HPLC-Qualität (Acros Organics, Geel, Belgien);
– Azetonitril von HPLC-Qualität (Lab Scan, Dublin, Irland);
– Phosphat-Puffer: Phosphat-Buffer-Saline PBS (NaCl 120 mmol/l, KCl 2,7 mmol/l, Phosphat Buffer 10 mmol/l; pH 7,4) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA);
– Natriumbicarbonat (Merck, Darmstadt, Deutschland);
– Kochsalz Natriumchlorid (Merck, Darmstadt, Deutschland);
– Destilliertes Wasser Milli-Q Plus(Millipore, Molsheim, Frankreich);
– Essigsäure 99–100 % für Analysezwecke (UCB, Brüssel, Belgien);
– Orthophosphorsäure (für Analysezwecke) (UCB, Brüssel, Belgien);
– Stickstoff und Helium in Gasflaschen (Air Liquide, Lüttich, Belgien);
– sterile Polypropylen-Reagenzgläser (Falcon) von 15 ml und 50 ml (Greiner-Labortechnik, Frickenhausen, Deutschland);
– Immunoaffinitätssäulen Ochratest^® (Vicam, Watertown, MA, USA);
– Filter vom Typ Millex^®-HV GVHP 04700 (0,22 μm) (Millipore, Bedford, MA, USA);
– Filter Acrodisk^® 13 mm für Spritzen mit Nylon-Membran 0,45 μm (Pall Gelman Laboratory, Karlstein, Deutschland).

2) Geräte

– Ständer Vac-Elut^® (Analytichem International, Harbour City, CA, USA);
– Ultraturax^® T-25 basic (IKA-Werke, Janke und Kunkel GMBH & Co, Staufen, Deutschland);
– Verdampfer Rotavapor <R> (Büchl, Flawil, Schweiz);
– Zentrifuge Jouan CR (Jouan, Saint Nazaire, Frankreich);
– Spectrophotometer OPI-4 (Shimadzu, Kyoto, Japan);
– Autoclav Druckgefäss (Fedegari Autoclavi, Spa-Albuzzano-Pv, Italien);
– System für Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) bestehend aus: – einer isokratischen Pumpe: Perkin Elmer LC049 (Norwalk, CO, USA), mit einer Injektionsschleife von 50 μl (Rheodyne, Cotati, CA, USA); – einer Säule C18 von 150 mm × 4.0 Hypersil^® BDS (inverse Phase), Porosität 3 μm, (Tracer Analytica, Barcelona, Spanien); – einem Fluoreszenz-Messgerät RF 551 (Shimadzu, Kyoto, Japan) mit einer 150W Xenon-Lampe mit Einstellung λexcitation: 332 nm und λemission: 462 nm; – einem Integrator Spectra Physics SP4290 (San Jose, CA, USA); – einem Laufmittel: Azetonitril: Wasser: Essigsäure (450: 540: 10), mit einer Membran (0.25 μm) gefiltert und mit Helium entgast (15 Minuten); – Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/Minute; – Druck: 2900–3000 psi.

3) Mikronisierte Pflanzenfasern
Bei den getesteten Pflanzenfasern handelt es sich um die mikronisierte Weizenfasern Realdyme^® M (Realdyme, Garancières-en-Beauce, Frankreich), die in Form von Mikropartikeln auftreten, von deren Gewichtsanteil 90 % kleiner als 100 μm sind,
4) Herstellung von Ochratoxin A
Das Futter der Ratten wurde auf natürliche Weise mit dem OTA kontaminiert, das im Labor für Ernährungsbiochemie in enger Zusammenarbeit mit dem Labor für Pilzkunde des Fachbereichs Mikrobiologie der Katholischen Universität in Lüttich (Belgien) hergestellt wurde.
4.1. Mikroorganismus
Das OTA wurde durch Zucht eines Bakterienstammes Penicillium verrucosum (Art. Nr. MUCL: CWL 44468 der Pilzsammlung (Mykothek) der Universität in Louvain la Neuve, Belgien) auf Weizenkörnern hergestellt.
4.2. Herstellung des Inoculums
Der Bakterienstamm wurde eine Woche lang revitalisiert durch Umsetzung in ein Medium aus Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) bestehend aus einer Brühe von Kartoffelextrakt (0,4 %), Dextrose (2 %) und Agar (1,5 %). Das PDA-Agar wurde vorher in einem Autoklav sterilisiert (15 Minuten bei 121°C), schräg abgegossen und bei einer Temperatur von +4°C im Kühlschrank aufbewahrt. Die auf dem PDA hergestellten Konidien wurden nach 10 Tagen Zucht auf antiseptische Weise mit einem sterilen Bügel abgezogen, und in sterilisiertem Pepton-Wasser (9 %) aufgeschlämmt. Es war notwendig, diese Lösung 2- oder 3-mal im Verhältnis 1/10 zu verdünnen, um die Konidien direkt unter dem Mikroskop zählen zu können. Ein Teil der Suspension von 10⁴ Konidien/ml wurde zur Einimpfung in die Weizenkörner in einer Dosierung von 2 ml pro 60 Gramm benutzt.
4.3. Zucht
Der Bakterienstamm wurde auf Weichweizen gezüchtet. Hierfür wurde die Feuchtigkeit der Weizenkörner durch Zugabe der notwendigen Wassermenge auf 24–25 % eingestellt. Für die Zucht wurden Erlenmeyer-Behälter von 250 ml benutzt, die 60 g Weizenkörner, die vorab im Autoklav sterilisiert wurden (bei 121°C während 20 Min), enthielten. Nach Einimpfung von 2 ml Konidiensuspension unter aseptischen Bedingungen wurden die Erlenmeyer-Behälter zur Inkubation 24 Tage lang im Dunkeln bei 22°C geregelter Raumtemperatur aufbewahrt. Nach Ablauf dieser Frist wurden die Muster nochmals wie zuvor sterilisiert, eingefroren und gefriergetrocknet, um das Vermahlen zu erleichtern. Auf diese Weise wurden 2kg mit 22 μg OTA/g kontaminierter Weizen hergestellt.
4.4. Zusammensetzung und Vorbereitung der Futterkost
Das Grundnahrungsmittel der Ratten wurde in 15kg-Säcken von Carfil geliefert (Parvan Service PVBA Carfil quality, Oud-Turnhout, Belgien). Es besteht hauptsächlich aus Proteinen (21 %), Fetten (4,5 %), Zellulose (4 %), Asche (7,0 %), Vitamin A (20 000 IE/UI/kg), Vitamin D3 (2000 IE/UI/kg) und Vitamin E (40 mg/kg).
Ausgehend von diesem Standardfutter wurden die drei in Tabelle IV aufgeführten Kosttypen entwickelt: TABELLE IV

Kosttyp Grundnahrungsmittel (%) Weizenmehl (*) nichtkontaminiert (%) Weizenmehl kontaminiert mit 22 μg OTA/g (%) Mikronisierte Weizenfaser

1 88 12 0 0

2 88 2 10 0

3 88 0 10 2

*: Zu Beginn wurde der OTA-Gehalt im Weizenmehl gemessen (OTA-Gehalt < Nachweisgrenzwert (LD))

Für jeden Kosttyp werden die verschiedenen Komponenten gut vermischt und in zylinderförmige Granulate gepresst (Durchmesser = 5 mm). So wurde ein Lagerbestand von 10,8 kg für jeden Futtertyp hergestellt. Der OTA-Gehalt wurde an einem Muster jedes Futtertypen gemessen; diese Muster wurden im Laufe des Versuchs an drei verschiedenen Zeitpunkten entnommen. Die 3 Sub-Muster werden vermischt und zermahlen.
5) Tiere und Versuchsplan
Die 36 männlichen, 9 Wochen alte Ratten der Rasse Wistar/AF EOPS stammen aus der Zuchtstation Janvier Laboratoire (Genest-St-Isle, Frankreich). Bei ihrer Ankunft wurden die Ratten gewogen (die anfängliche Körpermasse variierte zwischen 248,0 und 294,0 g bei einem Mittelwert von 268,6 ± 10,5 g) und dann in mit Etiketten versehene Einzelkäfige gesetzt. Die Tiere in den Käfigen wurden dann in einem auf 22°C eingestellten klimatisierten Tierhaltungsraum untergebracht, in dem Licht und Dunkelheit in einem 12-Stunden-Zyklus abwechselten.
Nachdem sich die Ratten 7 bis 12 Tage lang an die Bedingungen im Tierhaltungsraum gewöhnen konnten, wurden sie wahllos in 3 Gruppen aufgeteilt (n = 12).
5.1. Vorbereitende Versuche
Die vorbereitenden Versuche wurden über 3 Monate an einer Mustergruppe von 4 weiteren Ratten vorgenommen; diese Versuche hatten zum Ziel, die Methoden bei der Entnahme der Stichproben und bei der Analyse von OTA in Plasma, Leber und Nieren (mittels Doping) gut zu beherrschen. Sie zielten auch auf die Bestimmung der Rückgewinnungsrate von OTA für die unterschiedlichen, vom Labor entwickelten Analysemethoden, ab.
5.2. Versuchsplan
Die Durchführung der Studie erfolgte nach einem Plan mit Kontrollrichtwerten: die 36 Ratten wurden in 3 Gruppen aufgeteilt, jeder Gruppe wurde einer der 3 Futtertypen aus der nachstehenden Tabelle IV zugeteilt.

– Behandlung 1 (Nullmessung): Futtertyp 1 nicht kontaminiert;
– Behandlung 2 (Kontrollfall): Futtertyp 2 kontaminiert;
– Behandlung 3: Futtertyp 3 kontaminiert unter Zufügung der mikronisierten Weizenfasern (REALDYME^®).

Für jeden Futtertyp betrug die Tagesration systematisch 22g Futter pro Tag und pro Ratte. Dieser Verbrauch liegt knapp unter der ad-libitum-Fütterung. Die einem Verbrauch von 48 Stunden entsprechenden Futtermengen wurden den Ratten früh morgens vor 8 Uhr vorgesetzt (es ist darauf hinzuweisen, dass die Ratten am Tag ihrer Tötung nicht gefüttert wurden). Die Ratten verfügten ad libitum über Wasser.
Für die Hygiene wurde die Streu 2-mal wöchentlich gewechselt und die ausgeschiedenen Fäkalien wurden von der Streu getrennt und gewogen.
Während der Betreuungszeit wurden die Ratten alle 3 Tage gewogen bis zum 28. Tag. Nach dieser Frist wurden die Ratten mit Äther betäubt und geköpft (mit einer Guillotine), um die Entnahme von Blut, Leber und Nieren zu ermöglichen. Das Blut wurde sofort in einem vorab heparnisierten Polypropylen-Reagenzglas von 15 ml aufgefangen. Das nach 20 Minuten langem zentrifugieren bei 1830 g gewonnene Blutplasma (2,5–5 ml) wurde bis zur Extraktion des OTA bei –20°C gelagert. Die Lebern und Nieren wurden gewogen, in flüssigem Stickstoff gefroren (freeze-clamping) und sofort bei –80°C gelagert. Die Reste der Tierleichen wurden bei –20°C gelagert.
6) Bestimmung des OTA-Gehaltes in der unterschiedlichen biologischen Matrix
6.1 Extraktion des OTA aus Getreide und Futtergranulaten
Die Extraktion des OTA aus dem Getreide und den Futtergranulaten basiert auf der Technik (ISO FDIS 1541.2) des Europäischen Komitees für Normung (CEN/TC 275, 1998) der Europäischen Gemeinschaft:

– Abwiegen von 50,0 g Mehl in einem Zentrifugierglas (vorab gereinigt und getrocknet);
– Zugabe von 200 ml Chloroform und 20 ml Phosphorsäure (0,1 M, pH 3);
– 3 Minuten lang bei 13 500 Umdrehungen pro Minute (rpm) mit einem Ultraturax^® homogenisieren;
– Zentrifugieren über 10 Minuten bei 820g und niedriger Temperatur (5–10°C);
– vollständige Rückgewinnen der chloroformischen Phase
– Eine zweite Extraktion vornehmen, indem man die vorab genannten Punkte wiederholt;
– Rückgewinnung und Zusammengießen der beiden chloroformischen Phasen;
– Entnahme von 350 ml der gewonnenen chloroformischen Phase;
– Verdampfen des Chloroforms in einem Rotavapor (30–40°C);
– Zugabe von 100 ml Natriumkarbonatlösung (0,5 M, pH = 9) Bicarbonatlösung zu dem nach der Verdampfung zurückgebliebenen Reststoff;
– 10 Minuten lang bei 820g und niedriger Temperatur (5–10°C) zentrifugieren;
– 20 ml dieser Bicarbonatlösung entnehmen und in einer Immunoaffinitätssäule reinigen unter Anwendung des nachfolgend in Punkt 6.4 beschriebenen Protokolls.

6.2. Extraktion des OTA aus dem Blutplasma

– 2,5 ml Plasma entnehmen;
– Zugabe von 20 ml Chloroform und 10 ml Phosphorsäure (0,1 M, pH 3);
– 3 Minuten lang mit einem Vortex homogenisieren;
– 10 Minuten lang bei 820g und niedriger Temperatur (5–10°C) zentrifugieren;
– Die gesamte chloroformische Phase mit Hilfe einer Pipette zurückgewinnen;
– Eine zweite Extraktion vornehmen durch Wiederholung der vorab genannten Schritte;
– Die gesamte chloroformische Phase mit Hilfe einer Pipette zurückgewinnen und die beiden chloroformischen Phasen zusammengießen;
– Das Chloroforme im Rotavapor (30–40°C) verdampfen;
– Zugabe von 20 ml Natriumcarbonatlösung (0,5 M, pH = 9) zu dem nach der Verdampfung zurückgebliebenen Reststoff;
– 10 Minuten bei 820g und niedriger Temperatur (5–10°C) zentrifugieren;
– 15–20 ml Bicarbonatlösung entnehmen und in einer Immunoaffinitätssäule reinigen unter Anwendung des nachfolgend in Punkt 6.4 beschriebenen Protokolls

6.3. Extraktion des OTA aus Nieren, Leber und Exkrementen
Die folgenden Anweisungen gelten sowohl für Leber, Nieren und Exkremente (es sei denn Gegenteiliges wird ausdrücklich aufgeführt).

– in einem Zentrifugierglas abwiegen; – Für die Nieren: 2.5 g Nieren – Für die Leber: das gesamte Organ – Für die Exkremente: 4 g Exkremente
– Nur für Nieren und Leber: 2 g Natriumchlorid hinzugeben;
– Zugabe von 50 ml Chloroform und 20 ml Phosphorsäure (0,1 M, pH 3);
– 3 Minuten lang bei 13 500 rpm mittels eines Ultraturax^® homogenisieren;
– 10 Minuten lang bei 820g und niedriger Temperatur (5–10°C) zentrifugieren;
– die untere organische Phase auffangen;
– eine zweite Extraktion vornehmen durch Wiederholung der vorab genannten Schritte;
– Das Chloroform im Rotavapor bei einer Temperatur zwischen 30 und 40°C verdampfen lassen;
– Nur für die Nieren und die Exkremente: Zugabe von 100 ml Natriumcarbonatlösung (0,5 M, pH = 9) zum nach der Verdampfung zurückgebliebenen Reststoff;
– Nur für die Leber: Zugabe von 50 ml Natriumcarbonatlösung (0,5M, pH = 9) zum nach der Verdampfung zurückgebliebenen Reststoff
– 10 Minuten lang bei 820g bei niedriger Temperatur (5–10°C) zentrifugieren;
– 15–20 ml der Bicarbonatlösung entnehmen und in einer Immunoaffinitätssäule reinigen unter Anwendung des nachfolgend in Punkt 6.4 beschriebenen Protokolls.

6.4. Reinigung in einer Immunoaffinitätssäule (Ochra-Test^®)

– die Säule an einem Vac-Elut^®-Ständer befestigen und darüber mittels eines Adapters eine Spritze von 20 ml anbringen;
– Immunoaffinitätssäule mit 20 ml PBS-Lösung aufbereiten;
– 15–20 ml der Bicarbonatlösungen mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 bis 2 ml/Minute über die Säule laufen lassen;
– Säule mit 20 ml Milli-Q plus – Wasser reinigen;
– OTA zurückgewinnen durch Auswaschen mittels 2 ml Methanol und 2 ml Milli-Q plus-Wasser;
– Mit Hilfe der Spritze 20 ml Luft durch die Säule pumpen, um das Eluat vollständig zurückzugewinnen.

6.5. Nachweis und Mengenbestimmungen durch HPLC
100 μl des gefilterten Extraktes wurden eingespritzt, um die Injektionsschleife, deren Kapazität 50 μl beträgt, vollständig zu füllen Die Eluierphase bestand aus einem Azetonitril/Wasser/Essigsäure-Gemisch (540/450/10; v/v/v). Der Nachweis von OTA fand bei 332 nm (Excitation) und bei 462 nm (Emission) statt. Die OTA-Konzentration wurde bestimmt durch die Interpolation der Höhepunkte auf der Eichungsgeraden bei gleicher Retentionszeit.
Parallel dazu wurde mit Hilfe einer Lösung, die mit Standards von 0,5; 1; 2; 3; 4; und 5ng OTA/ml in einem Wasser/Methanol-Gemisch (50/50; v/v) verdünnt wurde, eine Kalibriergerade erstellt. Die Kalibriergerade wurde nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate festgelegt.
7) Leistungseigenschaften der Analysemethoden
Nachweisgrenzen
Unter Berücksichtigung aller Analysevorgänge (Extraktion, Reinigung und Mengebestimmung) werden die Nachweisgrenzen für Getreide auf 10 ng/kg, für Plasma auf 20 ng/l und für Nieren auf 20 ng/kg eingeschätzt, für die Leber auf 20 ng/kg und für die Exkremente auf 20 ng/kg.
8) Datenverarbeitung und statistische Analyse
Die Wachstumsgeschwindigkeit der Ratten wurde berechnet durch die Differenz zwischen 2 konsekutiven Körpermassen im Vergleich zum Zeitabschnitt zwischen den beiden Messungen.
Die vom kontaminierten Futter induzierte Wirkung wurde anhand der Abweichung der erhaltenen Ergebnisse im Vergleich zum Futtertyp 1 (Nullmessung) bewertet.
Mit Hinblick auf den heterogenen Charakter der erhaltenen Daten wurde nach einem nicht-parametrierten Analyseprozess vorgegangen. Mit dem Kruskal-Wallis-Test konnte die Varianz der verschiedenen Aufbereitungen analysiert werden. Über den Wilcoxon-Test konnte man den Unterschied (zu Beginn und im Laufe der 4 Wochen Versuchszeit) der Körpermasse-Mittelwerte der Ratten, die dem kontaminierten Futter ausgesetzt waren im Vergleich zu den Mittelwerten der Ratten, die das Blanc-Futter bekamen, bewerten. Währenddessen wurde der Mann-Whitney-Test angewandt, um den Unterschied der Mittelwerte der Zubereitungen im Vergleich zum Null-Muster oder zum Kontrollmuster zu bewerten. Mit dem Korrelationstest von Spearman wurde die Konsistenz der Relation von Plasma-OTA und Nieren-OTA überprüft.
Die Ergebnisse sind in Mittelwerten ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Daten wurden mit dem Statistikprogramm SPSS Version 10.0 (1999) ausgewertet. Ab einem Wert von p < 0,05 sind die Differenzen als bedeutsam zu werten.
II) Ergebnisse
1) Futterkonsum und Exposition der Ratten gegenüber OTA

Die Ergebnisse der OTA-Dosierung in den 3 Futtertypen sind hiernach in der Tabelle V dargestellt: TABELLE V

Futtertyp	Behandlung	OTA-Gehalt im Futter (μg/kg)	Insges. aufgenommenes OTA* (μg)	Tagesdosis von OTA (μg/kg von mc/Tag)
Futtertyp	Behandlung	OTA-Gehalt im Futter (μg/kg)	Insges. aufgenommenes OTA* (μg)	Mittelwert ± SD	Variationsspanne
Futter 1	Nullmessung	10,3	6,345	1,99 ± 0,40	2,57 – 1,23
Futter 2	Kontrollmuster	2240,67	1380,252	438,42 ± 84,27	559,33 – 276,51
Futter 3	Weizenfasern	2201,64	1356,210	433,52 ± 84,41	555,46 – 273,23

*: Expositionsdauer = 28 Tage, Tagesration von de 22 g

Diese Ergebnisse zeigen, dass das benutzte Grundnahrungsmittel (Carfil) schwach mit OTA kontaminiert ist (10,3 μg/kg) und dass durch die Zugabe von auf natürliche weise kontaminiertem Mehl in die anderen zwei Rationen ein Kontaminationsmittelwert von 2221,16 μg OTA/kg erreicht werden konnte. Werden 22 g des Grundnahrungsmittels pro Tag und pro Ratte verfüttert, bringt dies schon eine Tagesdosis von 1,99 ± 0,4 μg/kg an Körpermasse (mc) mit sich. Die beiden anderen Rationen der gleichen Menge setzten die Ratten einer mittleren Tagesdosis aus, die je nach Futtertyp zwischen 433,52 und 438,42 μg OTA/kg von mc betrug.
2) Auswirkung der Beimischung von mikronisierten Weizenfasern in das Futter auf die Menge der ausgeschiedenen Fäkalien der den verschiedenen Futtertypen unterzogenen Ratten
Die erzielten Ergebnisse wurden in die 4 im Anhang übertragen. Das 4 stellt für jeden Futtertyp (graue Striche: Futter1; schwarze Striche: Futter 2 und weiße Striche: Futter 3) und unter Berücksichtigung des Zeitfaktors die gesamte Menge der ausgeschiedenen Fäkalien (in g) dar. Diese Ergebnisse decken bei den mit 3 Futtertypen ernährten Ratten einen deutlichen Mengenunterschied der ausgeschiedenen Fäkalien auf. Der multiple Vergleichstest unterscheidet und ordnet die drei Klassen wie folgt: Ratten unter Futtertyp 2 < Ratten unter Futtertyp 1 < Ratten unter Futtertyp 3.
Die über 28 Tage wiederholte Verabreichung von OTA via Futtertyp 2, d.h. ohne mikronisierte Weizenfasern, verringert ständig die Menge der ausgeschiedenen Fäkalien (5). Im Gegensatz hierzu steigt die Ausscheidung von Exkrementen bei Zugabe von Fasern. Tatsächlich ergibt sich durch die Fasern ein Anstieg von ca. 35 % im Vergleich zum Futtertyp 2 und 15 % im Vergleich zum Futtertyp 1. Die Erhöhung der Fäkalienmenge ist ein wohlbekannter Effekt der Nahrungsmittelfasern.
3) Auswirkung der Beimischung von mikronisierten Pflanzenfasern in das Futter auf Blutplasma, Nieren, Leber und Exkremente der den verschiedenen Futtertypen unterzogenen Ratten
3.1. OTA-Dosierung im Plasma

Die Tabelle VII rekapituliert den OTA-Gesamtmenge im Plasma, sowie die Gesamtwerte bezügl. der OTA-Zugabe während der Zeitspanne, in der die Ratten den auf natürliche Weise kontaminierten Futtertypen ausgesetzt waren. TABELLE VII

Futtertypen	OTA-Gehalt im	Blutplasma	OTA-Gehalt im Blutplasma im Vgl. zur insges. aufgenommenen OTA-Menge
Futtertypen	ng/ml	% Abnahme^b	ng/ml/μg an aufgenommen en OTA i	% Abnahme
1	21,1±39,0	–	3.3±0,36	–
2	830,3±411,9	–	0,60±0,30	–
3	494,1±186,3^a	40,5	0,37±0,14	49,13

^a: Dieser Mittelwert differiert merklich von dem der Ratten, die dem Kontrollmuster Futtertyp 2 ausgesetzt waren (p < 0,05)
^b: Prozentsatz der Menge von Plasma-OTA der Ratten unter Futtertyp 3 im Vergleich zur Konzentration im Kontrollmuster Futtertyp 2.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Weizenfasern eine deutliche Wirkung auf die Abnahme der OTA-Menge im Blutplasma haben. Es ist anzumerken, dass die Beimischung der mikronisierten Weizenfasern zum Futter in einer Dosis von 2 % eine Absenkung von 40,5 % der OTA-Konzentration im Plasma bewirkt. Diese Fähigkeit ist auch zu bemerken, wenn man die Gehaltswerte mit den Mengen des insgesamt während der Versuchszeit aufgenommenen OTA in Beziehung setzt.
Folglich senkt die Beimischung mikronisierter Weizenfasern in einem Lebensmittel spürbar die Bioverfügbarkeit von OTA.
3.2. OTA-Dosierung in den Nieren

Die Bruttowerte des OTA Gehaltes in den Nieren sowie die Werte bezügl. der gesamten OTA-Zugabe während der Zeitspanne, in der die Ratten den auf natürliche Weise kontaminierten Futtertypen ausgesetzt waren, sind n der folgenden Tabelle VIII dargestellt: TABELLE VIII

Futtertypen	OTA-Gehalt in den Nieren		OTA in den Nieren im Vgl. zur aufgenommenen OTA-Gesamtmenge
Futtertypen	ng/g	% Abnahme^b	ng/g/μg aufgenommenenes OTA	% Abnahme ^b
1	1,39±1,66	–	0,2±0,259	–
2	79,38±31,4	–	0,057±0,023	–
3	57,07±42,5^a	28,11	0,043±0,032	24,56

^a: Dieser Mittelwert differiert merklich von dem der Ratten, die dem Futtertyp Kontrollmuster 2 ausgesetzt waren (p < 0,05).
^b: Prozentsatz der Menge von OTA in den Nieren der Ratten unter Futtertyp 3 im Vergleich zur Konzentration im Kontrollmuster Futtertyp 2.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Weizenfasern ebenfalls eine spürbare Wirkung ausüben auf die Abnahme der OTA-Konzentration in den Nieren.
In der Tat ist anzumerken, dass die Beimischung von mikronisierten Weizenfasern in das Futter bei einer Dosis von 2 % eine Absenkung der OTA-Konzentration von 28,11 % in den Nieren bewirkt.
Der OTA-Gehalt in den Nieren steht in einer linearen Beziehung zur Konzentration von OTA im Plasma, was die folgende Regressionsgleichung illustriert: OTA_Nieren = (15,45 ± 6,512) + (0,081 ± 0,02)·OTA_plasma (R² = 0,620; p < 0,0001).
Wenn die Nieren das Depotorgan für OTA darstellen, so sind die dort vorhandenen Gehaltswerte ein guter Anzeiger für die Kontaminierung, welcher der Organismus tatsächlich während einer vergleichsweise langen Zeitspanne unterworfen ist.
3.3. OTA-Dosierung in der Leber

Der hepatische OTA-Gehalt sowie die Werte bezüglich der gesamten OTA-Zugabe während der Zeitspanne, in der die Ratten den auf natürliche Weise kontaminierten Futtertypen ausgesetzt waren, werden in der folgenden Tabelle IX dargestellt. TABELLE IX

Futtertypen	OTA-Gehalt in der Leber		OTA-Gehalt in der Leber im Vgl. zur insges. aufgenommenen OTA-Menge
	ng/g	% Abnahme^b	ng/g/μg aufgenommenes OTA	% Abnahme^b
1	1,43 ± 3,5	–	0,24 ± 0,56	–
2	73,68 ± 31,43	–	0,0483 ± 0,0515	–
3	45,13 ± 17,38^a	38,58	0,0250 ± 0,0452^a	40,05

^a: Dieser Mittelwert differiert merklich von dem der Ratten, die dem Futtertyp Kontrollmuster 2 ausgesetzt waren (p < 0,05)
^b: Prozentsatz der hepatischen OTA-Konzentration bei Ratten unter Futtertyp 3 im Vergleich zur Konzentration im Kontrollmuster Futtertyp 2.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Weizenfasern eine spürbare Wirkung auf die Abnahme der OTA-Konzentration in der Leber haben. Die Beimischung von mikronisierten Weizenfasern in das Futter bewirkt bei einer Dosis von 2 % eine Absenkung der OTA-Konzentration von 38,58 % in der Leber.
3.4. OTA-Dosierung in den Exkrementen

Je nach Absorptionsleistung im Magen-Darm-Trakt und je nach hepatischem Stoffwechel werden die Mykotoxine und ihre Metaboliten vorzugsweise über Urin und Fäkalien ausgeschieden. TABELLE X

Futtertyp	OTA-Menge in den Exkrementen während Woche 1		OTA-Menge in den Exkrementen während Woche 4
Futtertyp	μg	% Steigerung^b	μg	% Steigerung^b
1	0,046 ± 0,0004	–	0,098 ± 0,0016	–
2	35,27 ± 0,12	–	43,47 ± 0,17	–
3	58,41 ± 0,17^a	65.60	82,94 ± 0,13^a	90,80

^a: Dieser Mittelwert differiert merklich von dem der Ratten, die dem Futtertyp Kontrollmuster 2 ausgesetzt waren (p < 0,05)
^b: Prozentsatz der OTA-Menge in den Fäkalien der Ratten unter Futtertyp 3 im Vergleich zur Konzentration im Kontrollmuster Futtertyp 2.

Die Dosierung des OTA in den Fäkalstoffen zeigt die positive Wirkung der Nahrungsmittelfasern bei der Adsorption von OTA. Den erzielten Ergebnissen (Tabelle X) zufolge steigerte in der Tat der Zusatz von biologischen Fasern zur Futterration die ausgeschiedene OTA-Menge. Diese Steigerung liegt bei 65,60 % in der ersten Woche und bei 90,80 % für die 4. Woche.

Die OTA-Brutto-Gehalte in den Fäkalstoffen der Wochen 1 und 4 sowie die Werte bezügl. der gesamten OTA-Zugabe während der Zeitspanne, in der die Ratten den auf natürliche Weise kontaminierten Futtertypen ausgesetzt waren, sind in den Tabellen XI und XII aufgeführt. Die erzielten Werte zeigen erneut, dass die mikronisierten Weizenfasern eine Adsorptionskraft auf OTA ausüben. TABELLE XI

Futtertyp	OTA-Gehalt in denExkrementen (Woche 1)		OTA-Gehalt in den Exkrementen (Woche 4)
Futtertyp	μg/g	% Steigerung^b	μg/g	% Steigerung^b
1	0,0014 ± 0,0004	–	0,003 ± 0,0016	–
2	1,251 ± 0,11	–	1,68 ± 0,168	–
3	1,75 ± 0,17^a	40,20	2,55 ± 0,13^a	51,9

^a: Dieser Mittelwert differiert merklich von dem der Ratten, die dem Futtertyp Kontrollmuster 2 ausgesetzt waren (p < 0,05)
^b: Prozentsatz der OTA-Konzentration in den Exkrementen der Ratten unter Futtertyp 3 im Vergleich zur Konzentration im Kontrollmuster Futtertyp 2.

Futtertyp	OTA-Gehalt in den Exkrementen im Vgl. zur insges. aufgenommenen OTA-Menge (Woche 1)		OTA-Gehalt in den Exkrementen im Vgl. zur insges. aufgenommenen OTA-Menge (Woche 4)
Futtertyp	ng/g/μg aufgenommenes OTA	% Zunahme^b	ng/g/μg aufgenommenes OTA	% Zunahme^b
1	0,86 ± 0,08	–	2,01 ± 0,34	–
2	3,62 ± 0,65	–	4,85 ± 0,14	–
3	5,15 ± 0,91^a	42,27	7,48 ± 0,13^a	54,23

Die erzielten Versuchsergebnisse sind folglich besonders bedeutsam für die Wirkung von mikronisierten Pflanzenfasern auf die Abnahme der Bioverfügbarkeit von OTA nach Aufnahme kontaminierter Nahrung.
In ihrer Gesamtheit zeigen diese Ergebnisse folglich, dass die mikronisierten Pflanzenfasern die Mykotoxine adsorbieren und binden, und zwar nicht nur in Modell-Lösungen, sondern auch im Magen-Darm-Chymus von Tieren. Die Bioverfügbarkeit von Mykotoxinen ist somit vermindert Diese Fasern sind natürliche, in Getreide enthaltene Elemente, was für ihren Einsatz in Nahrungsmitteln für Tiere oder Menschen von Vorteil ist.

Claims

Verwendung von im Wesentlichen unlöslichen, mikronisierten Pflanzenfasern in Form von Mikropartikeln, von denen mindestens 90 Gew.-% kleiner als 700 μm groß sind, als Bestandteil in einer Zubereitung einer Nahrungsmittelzusammensetzung, die dazu bestimmt ist, die Bioverfügbarkeit von Mykotoxinen bei Menschen oder Tieren während der Nahrungsaufnahme eines Nahrungsmittels, das mit Mykotoxinen verseucht sein kann, zu verringern.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mikronisierten Pflanzenfasern in Form von Mikropartikeln vorliegen, von denen mindestens 90 Gew.-% kleiner oder gleich 400 μm groß sind.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mikronisierten Pflanzenfasern in Form von Mikropartikeln vorliegen, von denen mindestens 90 Gew.-% zwischen 2 μm und 200 μm, jeweils eingeschlossen, groß sind.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nahrungsmittelzusammensetzung dazu bestimmt ist, die Bioverfügbarkeit von hydrophoben Mykotoxine zu verringern.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzenfasern aus Fasern ausgewählt sind, die von: – Nahrungsmittelpflanzen, die ausgewählt sind aus Getreidesorten, Hülsenfrüchten, Gemüsepflanzen und Früchten, – in der Papierindustrie verwendeten Pflanzen, die ausgewählt sind aus Bäumen, Zuckerrohr, Bambus und Getreidestroh. stammen.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die von Getreidesorten stammenden Pflanzenfasern ausgewählt sind aus Fasern von Weizen, Gerste, Hafer, Mais, Hirse, Reis, Roggen, Sorghum und den entsprechend mit Malz versetzten Fasern.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die von Nahrungsmittelpflanzen, anderen als Getreidesorten, stammenden Fasern, ausgewählt sind aus Fasern, die von Äpfeln, Birnen, Beeren, Lupinen- und Sojakörnern, Tomaten, Erbsen und Kaffee stammen.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nahrungsmittelzusammensetzung dazu bestimmt ist, die Bioverfügbarkeit von Ochratoxin A, Aflatoxine, Fumonisine und/oder Desoxynivalenol zu verringern, und die mikronisierten Pflanzenfasern aus Weizenfasern, Haferfasern und deren Mischungen ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nahrungsmittelzusammensetzung dazu bestimmt ist, die Bioverfügbarkeit von Ochratoxin A zu verringern, und die Pflanzenfasern mikronisierte Weizenfasern in Form von Mikropartikeln sind, von denen 90 Gew.-% kleiner oder gleich 100 μm groß sind.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nahrungsmittelzusammensetzung in Form eines Nahrungsmittelzusatzes vorliegt und die Menge an mikronisierten Pflanzenfasern in dem Zusatz bis zu 100 Gew.-% des Gesamtgewichts des Zusatzes ausmacht.
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an mikronisierten Pflanzenfasern in dem Zusatz zwischen 80 und 100 Gew.-% des Gesamtgewichts des Zusatzes ausmacht.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass die Nahrungsmittelzusammensetzung für die Nahrungsversorgung von Menschen bestimmt ist und in Form eines Nahrungsmittelbestandteils in einem Anteil von 0,05 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Nahrungsmittelprodukts, während der Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts beigefügt wird.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nahrungsmittelzusammensetzung für die Nahrungsversorgung von Tieren bestimmt ist und in Form eines Rohstoffs in einem Anteil von 0,05 bis 10 Gew.-%; bezogen auf das Gesamtgewicht einer Nahrungsration oder einer Vollnahrung, der täglichen Nahrungsration, die Haustieren oder Zuchttieren gegeben wird, beigefügt oder während der Herstellung der Vollnahrung für Haustiere oder Zuchttiere als Bestandteil darin eingeschlossen wird.