DE602004003334T2

DE602004003334T2 - Assay für isph-inhibitoren

Info

Publication number: DE602004003334T2
Application number: DE602004003334T
Authority: DE
Inventors: Adelbert Bacher; Petra Adam; Wolfgang Eisenreich; Tobias GRÄWERT; Stefan Hecht; Felix Rohdich; Ferdinand Zepeck
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-01-22
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2024-01-16
Also published as: EP1585826A2; US20060099668A1; WO2004065623A3; US7402408B2; DE10302370A1; DE602004003334D1; ATE346164T1; WO2004065623A2; EP1585826B1

Description

Diese Erfindung betrifft einen Assay auf Inhibitoren des Enzyms 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase des Nicht-Mevalonat Isoprenbiosynthesewegs.
Mehrere Jahrzehnte lang wurde der Mevalonatweg als die einzige Quelle der universellen Terpenvorstufen Isopentenyldiphosphat (IPP, 7) und Dimethylallyldiphosphat (DMAPP, 8) angesehen (1). Pionierarbeiten von Bloch, Cornforth, Lynen und ihre Mitarbeiter über diesen Stoftwechselweg (siehe Übersichtsartikel 1-4) stellten die Grundlage zur Entwicklung von Inhibitoren der Cholesterinbiosynthese dar, die eine zentrale Rolle bei der Vorbeugung und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen spielen.
Erst vor ungefähr einem Jahrzehnt bewiesen unabhängige Arbeiten von Arigoni, Rohmer und ihren Mitarbeitern das Vorhandensein eines zweiten Isoprenbiosynthesewegs, der in vielen Eubakterien und in den Plastiden von höheren Pflanzen stattfindet (siehe Übersichtsartikel 5-7). Nachfolgende Studien bewiesen, dass das DxS Protein die Kondensation von Pyruvat (1) mit D-Glyceraldehyd-3-phosphat (2) unter Bildung von 1-Desoxy-D-xylose-5-phosphat (3) (8, 9) katalysiert, welches dann durch eine Gerüstumlagerung und Reduktion mit Hilfe des IspC-Proteins zu 2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (4) umgewandelt wird (1) (10). Dieses Polyolphosphat wird weiter zu 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat (5) durch die aufeinanderfolgende Wirkung der Proteine IspD, IspE und IspF umgewandelt (11-13; siehe Übersichtsartikel 14). 1 zeigt Reaktionsstufen dieses Biosynthesewegs.
Von einem rekombinanten Escherichia coli Stamm, der zur Expression der xylB und ispCDEFGene entwickelt wurde, wurde gezeigt, dass er exogene ¹³C-markierte 1-Desoxy-D-xylose zu dem endogenen cyclischen Diphosphat 5 mit hoher Ausbeute umzuwandeln vermag. Die zusätzliche Tätigkeit eines rekombinanten ispG Gens resultierte in der in-vivo Bildung von 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat (6) (15), welches ebenso aus einer ispH-Mangelmutante von E. coli isoliert wurde (16). Danach wurde die in-vitro Bildung von 6 aus 5 durch radiochemische Methoden bewiesen, und zwar in Rohextrakten von E. coli, die IspG überproduzierten (17). Verbindung 6 wurde durch in-vivo und in-vitro Experimente als Biosynthesevorstufe von IPP (7) und DMAPP (8) belegt, wobei IPP und DMAPP im Verhältnis 6:1 durch die Katalyse des IspH Proteins gebildet wurden (18, 19).
In zahlreichen pathogenen Eubakterien und im Malariaparasiten P. falciparum sind die Enzyme aus dem Nicht-Mevalonatweg essentiell. Die Intermediate des Mevalonat-unabhängigen Stoffwechselwegs können von pathogenen Eubakterien oder von P. falciparum nicht aus ihrer Umgebung aufgenommen und verwertet werden. Die Enzyme des alternativen Isoprenoidwegs kommen nicht in Säugetieren vor, die ihre Isoprenoide und Terpenoide ausschließlich über den Mevalonatweg synthetisieren. Darüber hinaus reduziert die idiosynkratische Natur dieser Stoffwechselreaktionen das Risiko von Kreuzinhibierung mit anderen, vorwiegend Säugerenzymen. Aus diesem Grunde erscheinen die Enzyme des alternativen Isoprenoidwegs besonders geeignet als Targets für neue Wirksubstanzen gegen pathogene Mikroorganismen und als Targets für Herbizide. Zu diesem Zwecke ist die Identifizierung dieser Targets, d.h. der Proteine und ihrer zugrundeliegenden Gene, erforderlich. Um fähig zu sein, ein Zielenzym in einem Testverfahren zur Entwicklung von Hemmsubstanzen zu benutzen, müssen ein Substrat, alle Coproteine, Cofaktoren oder Cosubstrate für dieses Enzym bekannt sein. Bislang konnte das IspH Enzym nicht für das Aufsuchen von Inhibitoren der enzymatischen Umsetzung von 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat in IPP und/oder DMAPP benutzt werden, da das Cosubstrat, welches dieses Enzym mit den notwendigen Reduktionsäquivalenten für diese Reaktion versorgen kann, unbekannt war.
Altincicek et al. FEBS Lett. (2002) 532, 437-440 beschreiben die Reinigung und einen Aktivitätsassay für das IspH Enzym. Der Aktivitätsassay umfasste die Verwendung von Natriumdithionit als Reduktionsmittel und eine HPLC/massenspektroskopische Analyse der Reaktionsprodukte. Referenz (19) beschreibt einen Aktivitätsassay für IspH unter Verwendung von NADH und FAD als Reduktionssystem und HPLC-Analyse der Reaktionsprodukte. WO 02/83720 beschreibt ein Screening-Assay für Inhibitoren des IspH Enzyms unter Verwendung von NAD(P)H und FAD als Reduktionssystem und photometrische Analyse.
Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Assay zum effizienten Prüfen von Proben auf die An- oder Abwesenheit einer Inhibierung der enzymatischen Umwandlung von 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat bereitzustellen. Diese Aufgabe wird gelöst durch den Assay von Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert.
Diese Erfindung stellt einen Assay gemäß Anspruch 1 bereit. Diese Erfindung basiert auf der überraschenden Entdeckung des Reduktionsmittels Flavodoxin, das effizient als Elektronenüberträger arbeitet und 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase (z. B. IspH) mit den Elektronen versorgt, die zur enzymatischen Umwandlung von 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat notwendig sind. In Schritt (a) des erfindungsgemäßen Assays enthält die Assaymischung daher ein Flavodoxin oder eine funktionskonservativen Variante desselben. Flavodoxinreduktase oder eine funktionskonservative Variante derselben können zur Reduktion und Rückgewinnung des Flavodoxins verwendet werden. NAD(P)H kann als Reservoir für Reduktionsäquivalente verwendet werden aufgrund seiner Fähigkeit, als reduzierendes Substrat der Flavodoxinreduktase zu wirken.
Als 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase wird vorzugsweise das IspH Enzym oder eine funktionskonservative Variante davon benutzt. Das Gen für das IspH Enzym, das in dem erfindungsgemäßen Assay verwendet wird, kann von jedem Organismus stammen, der den Nicht-Mevalonatweg zu Isoprenoiden besitzt, also z. B. von Pflanzen, Eubakterien oder Plasmodium. Ein Beispiel für die Quelle des ispH Gens ist E. coli. Informationen zur Sequenz, zur Klonierung und Expression von ispH sind erhältlich aus WO 02/83720. Varianten (d.h. Mutanten, verkürzte Formen oder Gene von Fusionsproteinen mit dem IspH Enzym) können verwendet werden vorausgesetzt, dass diese Varianten die enzymatische Aktivität des IspH Enzyms für die enzymatische Umwandlung nicht behindern. Das IspH Enzym kann durch rekombinante Expression des ispH Gens in einem geeigneten Wirt produziert werden gemäß den allgemeinen Methoden der Molekularbiologie. Ein bevorzugter Wirt ist E. coli. Das exprimierte IspH Enzym wird vorzugsweise gereinigt. Zu diesem Zweck wird IspH vorzugsweise als Fusionsprotein exprimiert, das einen Tag enthält, welcher eine Reinigung des Fusionsproteins durch Affinitätschromatographie ermöglicht. Beispiele für solche Tags sind Glutathionreduktase, Maltosebindeprotein oder ein 6 × His-Tag. Eine Fusion des IspH Enzyms mit Maltosebindeprotein erwies sich vorteilhaft in Bezug auf die einfache Reinigung und in Bezug auf die Stabilität des IspH Enzyms im aktiven Zustand. Jedoch können Fusionen mit anderen Tags, die eine leichte Reinigung ermöglichen, ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, dass diese Tags nicht den Assay der Erfindung stören. Am besten wird das IspH Enzym produziert und gereinigt wie in den Beispielen 1-3 beschrieben. Es wird vorzugsweise ein IspH Enzym aus einem Organismus verwendet, der einen Bezug mit dem Zielorganismus für einen zukünftigen Inhibitor aufweist (d. h. aus einem Organismus, der mit einem Antibiotikum bekämpft werden soll, das den Hemmstoff enthält, der mit Hilfe der Erfindung gefunden wurde).
Das Reduktionsmittel, das 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase mit Reduktionsäquivalenten versorgen kann, die für die enzymatische Umsetzung erforderlich sind, ist das Redoxprotein Flavodoxin. Es ist klar, dass das Redoxprotein in seiner reduzierten Form eingesetzt werden muss. Das Redoxprotein (in seiner reduzierten Form) kann in Mengen verwendet werden, die ausreichen, um mehrfache Umsatzzyklen der 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase zu ermöglichen. Alternativ kann das Redoxprotein in vergleichbaren molaren Mengen wie die 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase eingesetzt werden. Im letzteren Fall wird jedoch vorzugsweise ein System eingesetzt, das die reduzierte Form des Redoxproteins wieder herstellen kann. Ein wichtiges Beispiel für solch ein Recyclingsystem ist Flavodoxinreduktase/NAD(P)H, das vorzugsweise mit Flavodoxin als Reduktionsmittel verwendet wird.
Flavodoxin kann produziert werden wie in den Beispielen 4 und 6 beschrieben. Alternativ kann es von einer kommerziellen Quelle bezogen werden. Vorzugsweise benutzt man Flavodoxin aus einem Organismus, der mit dem Organismus, aus dem 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase abgeleitet wird, verwandt ist. Am besten werden Flavodoxin und IspH aus dem gleichen Organismus erhalten, z. B. beide aus E. coli. Als funktionskonservative Variante von Flavodoxin kann jede mutierte oder verkürzte Version verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie als Elektronenüberträger zwischen IspH Enzym und Flavodoxin-Reduktase fungieren kann. Diese Fähigkeit kann leicht experimentell bestimmt werden, z. B. mit Hilfe des Assays in Beispiel 8 und Vergleich mit dem Flavodoxin aus Beispiel 4.
Flavodoxinreduktase kann gewonnen werden gemäß Beispiel 5 und 7 oder kann kommerziell bezogen werden. Funktionskonservative Varianten von Flavodoxinreduktase können in ähnlicher Weise verwendet werden wie für Flavodoxin beschrieben. Flavodoxin und Flavodoxinreduktase sollten von verwandten oder vorzugsweise vom gleichen Organismus abgeleitet sein, um zu garantieren, dass das Flavodoxin gut von der Flavodoxinreduktase reduziert wird.
Als NAD(P)H werden NADPH oder NADH verwendet, die beide kommerziell von allgemein bekannten Quellen bezogen werden können. NADPH wird NADH vorgezogen, weil Flavodoxin Reduktase mit NADPH aktiver ist als mit NADH. Als Ersatz von NAD(P)H kann NAD(P)⁺ im Testsystem der Erfindung verwendet werden, und zwar zusammen mit einem System, das befähigt ist, NAD(P)⁺ zu NAD(P)H zu reduzieren. Verschiedene enzymatische Systeme sind bekannt, die NAD(P)⁺ in NAD(P)H reduzieren können. Beispiele sind Alkoholdeydrogenase, Glukosedehydrogenase und Lactatdehydrogenase.
Mit 1-Hydroxy-2-methy-(E)-butenyl-4-diphosphat und verschiedenen Isotop-markierte Formen sind wie von Hecht et al. (20) und in WO 02/83720 beschrieben zugänglich.
Der Assay der Erfindung wird vorzugsweise in einem wässrigen Puffer ausgeführt. Der pH-Wert des Puffers sollte in einem Bereich liegen, in dem die beteiligten Enzyme ausreichend aktiv sind. Vorzugsweise liegt der pH in einem Bereich zwischen 7 und 9, noch besser zwischen 7 und 8. Die Temperatur des Assays kann in einem Bereich zwischen 5 und 50 °C liegen, vorzugsweise zwischen 15 und 40 °C; am besten bei 37 °C. Der Puffer für den Assay enthält vorzugsweise eine Sulfhydrylverbindung wie Dithiothreitol (DTT) in einer Konzentration von z. B. 0.5 bis 5 mM. Der Assay der Erfindung kann unter aeroben oder anaeroben Bedingungen ausgeführt werden. Unter anaeroben Bedingungen können höhere Raten der enzymatischen Umwandlung mit IspH erzielt werden. Die Assayreaktion kann gestartet werden durch Zugabe irgendeiner der notwendigen Verbindungen, die in Punkt (a) des Anspruchs 1 oder 2 angegeben sind. Vorzugsweise wird die Reaktion gestartet durch die Zugabe von 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat oder von 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase.
Zur Steigerung der Aktivität von 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase kann die Assaymischung außerdem kleine Konzentrationen von zweiwertigen Metallionen enthalten, wie Ni²⁺, Co²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺ oder Zn²⁺. Co²+ ist bevorzugt. Die Konzentration kann zwischen 0,1 und 5 mM liegen, vorzugsweise zwischen 0,5 und 2 mM.
Im Screening-assay der Erfindung wird die enzymatische Umwandlung von 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat zu Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat verfolgt, und zwar bei Ab- und Anwesenheit einer Probe, die als Inhibitor der enzymatischen Umwandlung geprüft werden soll. Wenn die Umwandlung bei Anwesenheit der Probe unter sonst gleichen Bedingungen langsamer verläuft, dann ist die Probe ein Inhibitor der Umwandlung. Der Verlauf der enzymatischen Umwandlung kann über den Verbrauch von 1-Hydroxy-2-methy-(E)-butenyl-4-diphosphat verfolgt werden oder über die Bildung von Isopentenyldiphosphat oder Dimethylallyldiphosphat oder über den Verbrauch des Reduktionsmittels. Wenn ein Redoxprotein als Reduktionsmittel verwendet wird, kann der Verbrauch eines Bestandteils des Systems verfolgt werden, das die Wiederherstellung der reduzierten Form des Redoxproteins ermöglicht. Wenn Flavodoxinreduktase/NAD(P)H als das Recyclingsystem verwendet wird, dann wird der Verbrauch von NAD(P)H verfolgt. Alternativ kann die Bildung von NAD(P)⁺ verfolgt werden. Verbrauch oder Bildung von 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat, Isopentenyldiphosphat und Dimethylallyldiphosphat können durch HPLC quantifiziert werden, gekoppelt mit einem UV-Absorptionsdetektor oder vorzugsweise mit einem Szintillationsdetektor. Verbrauch von NAD(P)H oder Bildung von NAD(P)⁺ kann photometrisch verfolgt werden bei einer Wellenlänge um 340 nm.
Die Umwandlung kann kontinuierlich oder in Intervallen verfolgt werden. Alternativ kann die Reaktion eine vorbestimmte Zeit lang (z. B. einige Minuten lang) ablaufen, nach der vorbestimmten Zeit abgestoppt werden, und mit den Methoden, die oben erwähnt wurden, analysiert werden. HPLC Analytik ist am besten geeignet, die Umwandlung in Zeitabschnitten zu verfolgen, indem HPLC Proben nach vordefinierten Zeitabschnitten aus der Reaktionsmischung gezogen werden. HPLC Analytik ist auch am besten geeignet für eine abschließende Analyse, nachdem die Reaktion gestoppt wurde. Die Reaktion kann nach einer vorbestimmten Zeit beendet werden. Diese Zeit kann z. B. zwischen 1 Minute und 1 Stunde liegen, vorzugsweise zwischen 2 und 15 Minuten. Zur kontinuierlichen Verfolgung der Umwandlung ist die charakteristische Absorption von NADH bei 340 nm das bevorzugte Mittel der Wahl.
Der Assay der Erfindung kann im kleinen Maßstab ausgeführt werden, d. h. mit einer kleinen Anzahl an Testsubstanzen. Der Assay der Erfindung kann auch im großen Maßstab durchgeführt werden, d. h. mit vielen Testsubstanzen. Der Assay kann auf einfache Weise automatisiert werden, und zwar so, dass viele Proben gleichzeitig getestet werden können. Mit dem Assay der Erfindung kann eine Hochdurchsatzsuche („High Throughput Screening") nach Inhibitoren der enzymatischen Umsetzung durchgeführt werden. Wenn viele Proben gleichzeitig analysiert werden müssen, wird der Assay vorzugsweise in Mehrfachlochplatten, wie 24iger-, 96iger- oder 256iger-Lochplatten durchgeführt und die Reaktionen werden vorzugsweise photometrisch bei 340 nm verfolgt. Auf einer Mehrfachlochplatte kann ein Loch oder eine kleine Anzahl von Löchern, in denen die Umsetzung bei Abwesenheit einer Testprobe verfolgt wird, ausreichend sein; dagegen wird in der Mehrheit der Löcher die Umwandlung in Anwesenheit von verschiedenen Testproben verfolgt.
Proben, die auf die Hemmung der Umsetzung getestet werden sollen, können z. B. gezielt ausgewählte Verbindungen sein, von denen angenommen wird, dass sie Inhibitoren sind, wie z. B. Substratanaloga. Um das Potential der Erfindung voll auszuschöpfen, werden jedoch große Sammlungen von Verbindungen getestet, wie z. B. kombinatorische Substanzbibliotheken. Solche Bibliotheken können Peptidbibliotheken sein oder andere Bibliotheken von organisch chemischen Verbindungen. Viele Substanzbibliotheken sind kommerziell erhältlich.
Im typischen Fall wird eine Probe, die im Assay positiv geprüft wurde, anschließend validiert. Validierung kann beinhalten, dass eine Probe, die im Assay positiv geprüft wurde, auf die Hemmung von Flavodoxinreduktase oder auf die Hemmung der Elektronenübertragung von NAD(P)H auf Flavodoxin getestet wird. Dies kann z. B. gemacht werden, indem ein artefizieller unspezifischer Reduktionsmittel wie ein Viologen (z. B. Methylviologen) oder ein Deazaflavinderivat unter Belichtung anstelle des Flavodoxin/Flavodoxinreduktase Systems verwendet wird. Eine positive Probe hemmt vorzugsweise die 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase auch dann, wenn sie mit dem unspezifischen Reduktionsmittel getestet wird.
Ein Inhibitor von 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase, der durch das Testsystem der Erfindung identifiziert wird, kann als Arzneistoff verwendet werden oder zu einem Arzneistoff entwickelt werden, um Organismen zu bekämpfen, die den Nicht-Mevalonatweg zur Biosynthese von Isoprenoiden besitzen, im besonderen Bakterien und Plasmodium. Da Menschen diesen Stoffwechselweg nicht besitzen, dürften Arzneistoffe entwickelt werden, die nur wenig Nebenwirkungen beim Menschen haben. Ein Hemmstoff, der im Assay der Erfindung gefunden wird, kann selbstverständlich für die Anwendung als Arzneistoff optimiert werden. Somit kann ein solcher Hemmstoff als Grundverbindung (oder Grundstruktur) für die Entwicklung von pharmazeutischen Verbindungen fungieren. Diese Optimierung kann den Austausch oder die Addition von chemischen Gruppen beinhalten, um die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften eines solchen Hemmstoffs oder einer solchen Grundstruktur anzupassen. Die Optimierung kann durch bekannte Methoden der medizinischen Chemie und Pharmakologie durchgeführt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Klonierung und Expression des ispH Gens aus Escherichia coli als Maltosebindefusionsprotein (MalE/IspH)
Das ispH Gene aus E. coli (früher genannt lytB; GenBank Zugangsnummer AY062212) wird durch PCR unter Verwendung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize und den Oligonukleotiden lytBvo und lytBhi (Tabelle 1) als Primer amplifiziert. Das Amplifikat wird gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und PstI (New England Biolabs) behandelt und in den Expressionsvektor pMALC2 ligiert, der mit den gleichen Enzymen behandelt worden war. Das erhaltene Plasmid pMALispH wird in den E. coli Stamm B ER2566 (New England Biolabs, 21) unter Verwendung des rekombinanten E. coli Stammes BL21-pMALispH elektrotransformiert.
Beispiel 2
Herstellung von E. coli Zellmasse
Der E, coli Stamm BL21-pMALispH wird in Minimalmedium M9 (22) unter Verwendung eines 2 l Fermenters (BioFlo3000, New Brunswick Scientific) angezogen. Autoklaviertes Kulturmedium, welches Natrium-D,L-Lactat (1,3 g/l) enthält, wird auf 37 °C gekühlt. Ampicillin (180 mg/l), FeCl₃ (30 mg/l, MgCl₂ (376 mg/l) und CaCl₂ (225 mg/l) werden zugegeben und der pH auf 7,0 eingestellt. Das Medium wird mit einer Übernachtkultur eines rekombinanten E. coli Stammes im Verhältnis 1:100 angeimpft. Die Kulturen werden bei 37° C mit einer variablen Schüttelgeschwindigkeit von 300-1000 rpm inkubiert und der pH auf 7,0 durch regelmäßige Zugabe von 6 M Salzsäure eingestellt. Die relative Sauerstoffsättigung wird über die Rührergeschwindigkeit bei 30 % beibehalten. Nachdem eine Sauerstoffsättigung von 30 % erreicht wird, wird Natrium-D,L-Lactat, Ammoniumchlorid und Ammoniumsulfat (1,3:0,1:0,05 (w/w)) kontinuierlich, zwischen den Werten 30,5 und 50,0 Sauerstoffsättigung, durch ein Pulsfütterungsprogramm zugegeben. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 20 wird IPTG mit einer Endkonzentration 1,5 mM zugegeben und die Inkubation für 4 h fortgeführt. Die Zellen werden zentrifugiert, mit 0,9 % (w/v) Natriumchlorid gewaschen und bei –20°C gelagert.
Beispiel 3
Reinigung von rekombinantem MalE/IspH Fusionsprotein
Gefrorene Zellmasse (3,5 g) E. coli BL21-pMALispH werden in 35 ml 50 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, der 0,2 M Natriumchlorid enthält, (Puffer A) aufgetaut. Die Suspension wird mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Amylose Resin FF (Amersham Pharmacia Biotech; Säulenvolumen 22 ml) aufgetragen, die mit Puffer A bei einer Flussrate von 3 ml/min äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 200 ml Puffer A gewaschen. Die Säule wird danach mit einem Gradienten von 0-10 mM Maltose in 150 ml Puffer A entwickelt. Das Retentionsvolumen von MalE/IspH Fusionsprotein ist 40 ml. Die Fraktionen werden vereinigt und über Nacht gegen 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, der 1 mM DTT enthält, dialysiert. Die Lösung wird durch Ultrafiltration eingeengt und bei –80°C gelagert.
Beispiel 4
Klonierung und Expression des f1dA Gens aus Escherichia coli
Das f1dA Gen aus E. coli (GenBank Zugangsnummer AE005246), welches Flavodoxin 1 spezifiziert, wird von Position 7191 bis 7721 durch PCR unter Verwendung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize und den Oligonukleotiden fldAvo und fldAhi (Tabelle 1) amplifiziert. Das Amplifikat wird gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und PstI behandelt und in den Expressionsvektor pQE30 (Qiagen, Hilden, Deutschland) ligiert, der mit den gleichen Enzymen behandelt wurde. Das erhaltene Plasmid pQEfldA wird in den E. coli Stamm XL1-Blue (Stratagene, Bullock et al., 1978) elektrotransformiert, wodurch der rekombinante E. coli Stamm XI1-pQEfldA erhalten wird.
Beispiel 5
Klonierung und Expression des fpr Gens aus Escherichia coli
Das fpr Gen aus E. coli (GenBank Zugangsnummer AE005623), welches Ferredoxin(Flavodoxin):NADP⁺ Oxidoreduktase spezifiziert, wird durch PCR von Position 5082 bis 5828 unter Verwendung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize und den Oligonukleotiden fprvo und fprhi (Tabelle 1) als Primer amplifiziert. Das Amplifikat wird gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und PstI behandelt und in den Expressionsvektor pQE30 (Qiagen, Hilden, Deutschland) ligiert, der mit den gleichen Enzymen gehandelt wurde. Das erhaltene Plasmid pQEfpr wird in den E. coli Stamm XL1- Blue (Stratagene, Bullock et al., 1978) unter Verwendung des rekombinanten E. coli Stammes XI1-pQEfpr, elektrotransformiert.
Beispiel 6
Reinigung von rekombinanten Flavodoxin (FldA Protein)
Der rekombinante E. coli Stamm XL1-pQEfldA wird in Luria-Bertani broth Medium, welches Ampicillin (180 mg/l) und Riboflavin (1 mg/l) enthält, angezogen. Die Kulturen werden unter Schütteln bei 37 °C angezogen. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,7, wird IPTG mit einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben und die Kultur für 5 h inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, mit 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0 gewaschen und bei –20 °C gelagert.
Gefrorene Zellmasse (8 g) wird in 40 ml 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, das 0,5 M Natriumchlorid und 20 mM Imidazolhydrochlorid enthält, aufgetaut. Die Suspension wird mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Ni-chelatierende Sepharose FF (2,0 × 2 cm, Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen, die mit 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, 0,5 M Natriumchlorid und 20 mM Imidazol, äquilibriert wurde (Flussrate 2 ml/min. Die Säule wird mit 50 ml 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, das 0,5 M Natriumchlorid und 20 mM Imidazol enthält, gewaschen und dann mit einem Gradienten von 20-100 mM Imidazol in 20 ml 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, gefolgt von einem Gradienten von 100-500 mM Imidazol in 100 mM Trishydrochlorid pH 8,0, das 0,5 M Natriumchlorid enthält (Gesamtvolumen 120 ml), entwickelt. Fraktionen, die Flavodoxin enthalten, werden vereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert und über Nacht gegen 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, das 5 mM DTT und 0,02 % Natriumazid enthält, dialysiert.
Beispiel 7
Reinigung von rekombinanter Flavodoxinreduktase (Fpr Protein)
Der rekombinante E. coli Stamm XL1-pQEfpr wird in Luria-Bertani broth Medium, welches Ampicillin (180 mg/l) und Riboflavin (1 mg/l) enthält, angezogen. Die Kulturen werden bei 37 °C unter Schütteln angezogen. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,7, wird IPTG mit einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben und die Kultur für 5 h inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, mit 100 mM Trishydrochlorid, pH 8.0 gewaschen und bei –20 °C gelagert.
Gefrorene Zellmasse (8 g) wird in 40 ml 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, das 0,5 M Natriumchlorid und 20 mM Imidazolhydrochlorid enthält, aufgetaut. Die Suspension wird mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Ni-chelatierende Sepharose FF (2,0 × 2 cm, Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen, die mit 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, 0,5 M Natriumchlorid und 20 mM Imidazol äquilibriert wurde (Flussrate 2 ml/min). Die Säule wird mit 50 ml 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, das 0,5 M Natriumchlorid und 20 mM Imidazol enthält, gewaschen und dann mit einem Gradienten von 20-100 mM Imidazol in 20 ml 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, gefolgt von einem Gradienten von 100-500 mM Imidazol in 100 mM Trishydrochlorid pH 8,0, das 0,5 M Natriumchlorid enthält (Gesamtvolumen 120 ml), entwickelt. Fraktionen, die Ferredoxin(Flavodoxin):NADP⁺-Oxidoreduktase enthalten werden vereinigt, durch Ultrafiltration eingeengt und über Nacht gegen 100 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, das 5 mM DTT und 0,02 % Natriumazid enthält, dialysiert.
Beispiel 8
Radiochemischer Assay zur Bestimmung der 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase (IspH Protein) Aktivität
Die Assaymischung enthält 50 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, 2 mM DTT, 5,3 μM [1-³H]-1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat (86 μCi/μmol), 2 mM NADPH, 54 μg Flavodoxin (FldA Protein), 45 μg Flavodoxinreduktase (Fpr Protein) und 50 μg MalE/IspH Fusionsprotein in einem Volumen von 150 μl. Die Mischung wird bei 37 °C 1 h unter aeroben Bedingungen inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 μl 30 %iger (w/v) Trichloressigsäure abgebrochen, gefolgt von sofortigem Neutralisieren mit 20 μl 1 M Natriumhydroxid. Die Mischungen werden zentrifugiert und die Überstände werden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Luna C8 Säule (5 μm, 4 × 250 mm, Phenomenex) analysiert. Die Säule wird mit 10 ml einer 3 %igen (v/v) methanolischen 10 mM Tetra-n-butylammoniumphosphat Lösung, pH 6,0, gefolgt von einem linearen Gradienten von 2 ml einer 3-21 %igen (v/v) methanolischen 10 mM Tetra-n-butylammoniumphosphat Lösung, pH 6,0, einem linearen Gradienten von 13 ml einer 21-35 %igen (v/v) methanolischen 10 mM Tetra-n-butylammoniumphosphat Lösung, pH 6,0, einem linearen Gradienten von 10 ml einer 35-49 %igen 10 mM Tetra-n-butylammoniumphosphat Lösung, pH 6,0 und einem linearen Gradienten von einer 49-56 %igen (v/v) methanolischen 10 mM Tetra-n-butylammoniumphosphat Lösung, pH 6,0 bei einer Flußrate von 1 ml/min entwickelt. Der Durchfluss wird durch online-Flüssigszintillations-Analyse (Beta-Ram, Biostep GmbH, Jahnsdorf, Deutschland) verfolgt. Das Retentionsvolumen von 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat 6 ist 25 ml. IPP (7) und DMAPP (8) werden beide bei einem Retentionsvolumen von 36 ml eluiert.
Beispiel 9
Photometrischer Assay der 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktaseaktivität (IspH Protein)
Die Assaymischungen enthalten 50 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, 0,5 mM DTT, 0,4 mM NADPH, 0,2 mM 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat, 100 μg Flavodoxin, 80 μg Flavodoxinreduktase und 50 μg IspH Protein in einem Gesamtvolumen von 1 ml. Die Mischungen werden bei 37 °C inkubiert. Die Oxidation von NADPH wird photometrisch bei 340 nm beobachtet. Alternativ wird die Konzentration von NADPH durch Messung der relativen Fluoreszenz von NADPH bei 340 nm Anregung/460 nm Emission bestimmt.
Beispiel 10
Radiochemischer Assay der 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat Reduktaseaktivität
Alle Schritte werden unter anaeroben Bedingungen ausgeführt. Die Assaymischungen enthalten 50 mM Trishydrochlorid, pH 8,0, 7,5 mM DTT, 1,5 mM CoCl₂, 5,3 μM [1-³H]-1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat (86 μCi μmol^–1) und Protein in einem Volumen von 200 μl. Eine Lösung (20 μl) von 2,6 mM 10-Methyl-5-deazaisoalloxazin in Dimethylsulfoxid wird zugegeben und die Mischung wird mit einer Quecksilberdampflampe bestrahlt, welche in einem Abstand von 15 cm planiert ist. Während der Bestrahlung wird die Probe auf Eis gekühlt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 30 %iger (g/v) Trichloressigsäure abgebrochen, gefolgt durch sofortige Neutralisation mit 1 M Natriumhydroxid. Die Assaymischungen werden zentrifugiert. Die Überstände werden einer Ultrafiltration (Nanosep 100 kDa, Pall Gelman) unterzogen und durch Umkehrphasen-Ionenpaar HPLC unter Verwendung einer Luna C8 Säule (4 × 250 mm, 5 μm, Phenomenex) analysiert, welche mit 15 ml einer 10 mM Tetra-n-butylammoniumphosphat Lösung, pH 6,0, gefolgt von einem linearen Gradient von 45 ml einer 0-42 % (v/v) methanolischem 10 mM Tetra-n-butylammoniumphosphat Lösung, pH 6,0, bei einer Flußrate von 0,75 ml min^–1 entwickelt wird. Der Durchfluss wird durch online-Flüssigszintillations-Analyse (Beta-Ram, Biostep GmbH, Jahnsdorf, Deutschland) verfolgt. Das Retentionsvolumen von 6 ist 48 ml. IPP (7) und DMAPP (8) werden beide bei einem Retentionsvolumen von 66 ml eluiert. Der Assay wird in der Gegenwart einer Probe, die für die Inhibierung der genannten enzymatischen Umsetzung getestet wird, wiederholt.
Tabelle 1. Verwendete Oligonucleotide, die hier eingesetzt wurden
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Claims

Assay zur Prüfung einer Probe auf die An- oder Abwesenheit einer Inhibierung der enzymatischen Umsetzung von 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat in Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat in einer Probe durch folgende Schritte: (a) Reagierenlassen einer wässrigen Mischung, die 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat, eine 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase, NAD(P)H, Flavodoxin und eine Flavodoxinreduktase enthält, unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen für eine vorbestimmten Zeitdauer; (b) Analysieren der in Schritt (a) erhaltenen Reaktionsmischung auf die verbrauchte Menge an 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat und/oder NAD(P)H und/oder auf die gebildete Menge an Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallydiphosphat und/oder NAD(P)⁺; (c) Wiederholen des Schrittes (a) in der Gegenwart einer zu testenden Probe; (d) Wiederholen des Schrittes (b) mit der in Schritt (c) definierten Reaktionsmischung; und (e) Vergleichen der Ergebnisse von Schritt (b) und (d).
Der Assay gemäß Anspruch 2, wobei die verbrauchte Menge an NAD(P)H photometrisch gemessen wird.
Der Assay gemäß Anspruch 1, wobei in Schritt (b) oder (d) die gebildete Menge an NAD(P)⁺ oder Isopentenyldiphosphat und/oder Dimethylallyldiphosphat gemessen wird.
Der Assay gemäß Anspruch 3, wobei die gebildete Menge an NAD(P)⁺ photometrisch gemessen wird.
Der Assay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei NADPH als NAD(P)H verwendet wird.
Der Assay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei nach einer vorbestimmten Zeitdauer die Reaktion durch Zugabe von Trichloressigsäure beendet wird.
Assay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Schritte (a) und (c) unter aeroben Bedingungen bei 37 °C 1 Stunde lang durchgeführt werden.
Der Assay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Schritte (a) und (c) unter anaeroben Bedingungen durchgeführt werden.
Der Assay aus einem dem Ansprüche 1 bis 8, wobei die 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase IspH ist.
Verwendung von Flavodoxin in einem Assay auf die Aktivität einer 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase.
Wässrige Mischung umfassend 1-Hydroxy-2-methyl-(E)-butenyl-4-diphosphat-Reduktase und ein Flavodoxin.