DE60126814T2

DE60126814T2 - Inhalation von stickoxid

Info

Publication number: DE60126814T2
Application number: DE60126814T
Authority: DE
Inventors: Göran Hedenstierna; Luni Chen
Original assignee: AGA AB
Current assignee: INO Therapeutics LLC
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2001-11-15
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2021-11-16
Also published as: CN1481256A; ZA200303845B; DE60126814D1; CN100443119C; IL155968A0; EP1339428A1; SK7312003A3; JP2004513928A; CZ20031617A3; SE0004229D0; EP1339428B1; ES2282310T3; US20040028753A1; ATE354375T1; AU1451902A; CA2429224A1; WO2002040052A1; AR031348A1; EE200300226A; AU2002214519B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von Medikamenten für die Behandlung einer Verengung der Lungengefäße oder einer Verengung der Atemwege bei einem Säugetier, insbesondere beim Menschen. Die Erfindung betrifft die Behandlung von Individuen, bei denen es bei Absetzen einer Stickoxidinhalation zu einem Rezidiv kommt.
Stand der Technik
Stickoxid entspannt Lungengefäße, insbesondere, wenn sie aufgrund verschiedener Störungen verengt sind, wie unten beispielhaft erläutert ist. Stickoxid entspannt außerdem die glatten Atemwegsmuskeln (Belvisi MG, Stretton CD, Barnes PJ. Eur. J. Pharmacol. 1992; 210: 221–222), und die Inhalation von exogenem Stickoxid mildert eine Verengung der Atemwege als Reaktion auf verschiedene Substanzen bei Labortieren und Menschen (Dupuy PM, Shore SA, Drazen JM, Frostell C, Hill WA, Zapol WM. J. Clin. Invest. 1992; 90: 421–428; Högman M, Frostell C, Arnberg H, Hedenstierna G. Eur. Respir. J. 1993; 6: 177–180; Högman M, Frostell CG, Hedenström H, Hedenstierna G. Am. Rev. Respir. Dis. 1993; 148: 1474–1478). So beschreiben beispielsweise EP 560 928 , US 5,485,827 , 5,873,359 und WO 92/10228 die Verwendung von Stickoxid zum Behandeln eines Bronchospasmus und einer Verengung der Lungengefäße. Allerdings wurde festgestellt, dass der Behandlungseffekt große Variabilität zwischen und beim einzelnen Individuum aufweist. Obwohl die NO-Inhalation (INO) bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie eine effiziente Therapie sein kann, spricht darüber hinaus etwa 1/3 der Patienten zu wenig oder gar nicht auf eine INO an. Außerdem wurde beim Versuch des Absetzens der INO eine Verschlimmerung der pulmonalen Hypertonie und der Oxygenierung beobachtet, was als Rezidiv bezeichnet wird. Auch wurden eine lebensbedrohliche hämodynamische Instabilität und Todesfälle durch Absetzen der Inhalation von Stickoxid berichtet. Eine schrittweise Senkung der NO-Dosis verlängert die NO-Therapie, dürfte aber das Rezidiv dennoch nicht beseitigen.
Die für die Hyporesponsivität und das Rezidiv verantwortlichen Mechanismen sind nicht vollständig geklärt. Eine der Hypothesen besagt, dass die endogene NO-Produktion durch NO-Inhalation als negativer Rückmeldemechanismus mit Herunterregulierung der endogenen Synthese gehemmt werden kann. In einer Studie als Basis für die vorliegende Erfindung wurde ein Tiermodell entwickelt, welches bei Absetzen der NO-Inhalation durch Endotoxininfusion über mindestens 3 Stunden ein Rezidiv entwickelt. Darüber hinaus wiesen die Befunde darauf hin, dass das Rezidiv nicht nur durch eine Herunterregulierung der endogenen NO-Produktion, sondern auch durch eine erhöhte Aktivität des Vasokonstriktors Endothelin-1 (ET-1) verursacht wird, was wahrscheinlich wichtiger ist. Eine andere Beobachtung war, dass es eine umgekehrte Korrelation zwischen der Reaktion auf INO und dem Grad des Rezidivs gab. Je geringer daher der Effekt von INO war, desto stärker war das Rezidiv. Eine ähnliche Verknüpfung zwischen einer Unterreaktion und einer nicht vorhandenen Reaktion wurde von Davidson und Mitarbeitern bei Fällen eines Atemnotsyndroms des Neugeborenen festgestellt (D. Davidson, MD; Pediatries. 104 (2): 231–236, 1999).
In unserem Modell bewirkte die Infusion von Endotoxin einen zweiphasigen Anstieg des Lungenarteriendrucks und einen Abfall des PaO₂. Ein anfänglicher starker Anstieg der pulmonalen Hypertonie ergab sich 15–30 Minuten nach Beginn der Endotoxininfusion parallel zu einem Anstieg der Konzentrationen des Vasokonstriktors Thromboxan A2 (TXA2) oder anderer Cyclooxygenase(COX)-Produkten. Eine zweite stabile Phase einer pulmonalen Hypertension und Hypoxie trat 2,5 Stunden nach Beginn der Endotoxininfusion parallel mit einem erhöhten ET-1-Spiegel auf.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass INO nicht in der Lage war, die von einem Thromboxananalog hervorgerufene Verengung der Lungengefäße umzukehren (Welte M et al., Acta Physiol Scand 1995, Juli, 154 (3): 395–405). Ikeda S et al. (Ikeda S., Shirai M., Shimouchi A., Min KY., Ohsawa N., Ninomiya I., J. Physiology 1999 Feb; 49(1): 89–98) meldeten, dass INO in Kombination mit intravenös verabreichtem Prostacyclin einen stärkeren gefäßerweiternden Effekt hervorrufen kann.
Darüber hinaus sind spezifische substituierte Phenylalkensäuren und -ester, die einen von Leukotrienen oder Arachidonsäure induzierten Bronchospasmus hemmen, an sich aus US 4,536,515 und US 4,537,906 bekannt.
Schließlich beschreiben Lippton H.L. et al; „Influence of cyclooxygenase blockade on a response to isoproterenol, bradykinin and nitroglycerin in the feline pulmonary vascular bed"; Prostaglandins; 1984, Band 28. Nr. 2, S. 253–270, dass Cyclooxygenaseprodukte wie PGI₂ im pulmonalen vaskulären Bett keine gefäßerweiternde Reaktion auf Isoproterenol, Bradykinin und Nitroglycerin vermitteln.
Ausgehend von dem oben Genannten ist es sehr überraschend, dass eine Kombinationstherapie für eine effektive Behandlung einer Verengung der Lungengefäße oder einer Verengung der Atemwege, d. h. bei der die Nebenwirkungen von INO wie oben beschrieben beseitigt oder wenigstens weit reichend reduziert werden können, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Entsprechend ist es eine Aufgabe der Erfindung, geeignete Verbindungen bereit zu stellen, um sie zu verwenden, um einem Rezidiv entgegen zu wirken oder ein Rezidiv zu beseitigen, wenn die Inhalation von Stickoxid abgesetzt wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Verwendung eines reinen inhalierbaren Medikaments zu erreichen.
Die oben erwähnte Aufgabe wird durch die Anwendung, das Verfahren und die pharmazeutische Zubereitung erreicht, die in den beiliegenden Ansprüchen definiert sind.
In Übereinstimmung mit der Erfindung ist eine Anwendung von inhalierbarem Stickoxid (NO) in Kombination mit einem Cyclogenase(COX)-Inhibitor für die Herstellung eines Medikamentes bereit gestellt, um einem Rezidiv im Falle des Absetzens der alleinigen Behandlung mit gasförmigem Stickoxid oder einem Stickoxiddonor entgegen zu wirken, wobei die Kombination in einer therapeutisch wirksamen Menge verwendet wird, um ein solches Entgegenwirken zu erzielen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde somit überraschenderweise festgestellt, dass die reduzierte entspannende Wirkung von exogenem Stickoxid oder sogar die lebensbedrohliche Wirkung bei Absetzen der Inhalation von Stickoxid zumindest teilweise auf Cyclooxygenaseprodukte zurückgeführt werden kann.
Insbesondere wurde festgestellt, dass bei Anwendung eines Cyclooxygenase(COX)-Inhibitors in Kombination mit Stickoxid das bei Absetzen der Stickoxidinhalation auftretende Rezidiv abgeschwächt oder sogar eliminiert wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Kombination von gasförmigem Stickoxid und COX-Inhibitor in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung lässt sich für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln eines Rezidivs verwendet, das nach Absetzen der NO-Inhalation auftritt.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird Stickoxid vorzugsweise in gasförmiger inhalierbarer Form verwendet. Die Inhalation von gasförmigem Stickoxid stellt einen großen Vorteil bei der Therapie dar, z. B. im Vergleich mit einem nicht gasförmigen Stickoxiddonor, da das Gas keine Teilchen oder Tröpfchen aufweist, die verteilt und in die Atemwege transportiert werden müssen. Gase haben lange Wege der freien Diffusion, umgehen Blockaden leichter (beispielsweise verengte Atemwege) als Teilchen oder Tröpfchen und lösen sich im Gewebe direkt, ohne aufgrund der Einwirkung einen Bronchospasmus hervorzurufen. Die günstige Wirkung von NO-Gas auf die Spannung der Gefäßmuskeln in der Lunge und der glatten Muskeln in den Atemwegen wird sofort nach der Inhalation beobachtet, was NO zu einer nützlichen Erstverteidigung gegen einen Bronchospasmus und eine Verengung der Lungengefäße macht, der, falls gewünscht, die Inhalation länger wirkender Substanzen folgen kann.
Nach einer anderen Ausführungsform wird das Stickoxid aber in Form eines Stickoxiddonors verabreicht, d. h. einer Verbindung, die durch Freisetzen von Stickoxid wirkt. Bekannte Stickoxid freisetzende Verbindungen, die zur Ausübung der Erfindung geeignet sind, sind Nitroso- oder Nitrosylverbindungen wie beispielsweise S-Nitroso-N-acetylpenicillamin, S-Nitroso-L-cystein und Nitrosoguanidin, die durch eine -NO-Einheit gekennzeichnet sind, welche unter physiologischen Bedingungen, wie sie beispielsweise in der Lunge vorliegen, spontan abgegeben oder auf andere Weise von der Verbindung übertragen werden. Weitere Verbindungen sind Verbindungen, bei denen NO ein Ligand an einem Übergangsmetallkomplex ist und als solcher unter physiologischen Bedingungen leicht von der Verbindung abgegeben oder von übertragen wird, beispielsweise Nitroprussid, NO-Ferredoxin oder ein NO-Häm-Komplex. Weitere geeignete stickstoffhaltige Verbindungen sind Verbindungen, die von endogenen Enzymen in den Atemwegen und/oder im Gefäßsystem metabolisiert werden, um das NO-Radikal zu produzieren, z. B. Arginin, Glyceroltrinitrat, Isoamylnitrit, anorganisches Nitrit, Azid und Hydroxylamin. Solche Arten von Stickoxid freisetzenden Verbindungen und Verfahren zu deren Synthese sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Stickoxiddonor um eine Verbindung, die Stickoxid derart freisetzt, dass nur die Atemwege und die Lungengefäße beeinflusst werden.
Der in der Erfindung verwendete Stickoxiddonor kann als Pulver (d. h. als fein verteilter Feststoff, entweder rein oder als Gemisch mit einem biologisch verträglichen Trägerpulver oder mit einer oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Verbindungen bereit gestellt) oder als eine Flüssigkeit (d. h. in einem biologisch verträglichen flüssigen Trägerstoff gelöst oder suspendiert, wahlweise gemischt mit einer oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Verbindungen) verabreicht werden und kann praktischerweise in vernebelter Form inhaliert werden (vorzugsweise Teilchen oder Tröpfchen enthaltend, die einen Durchmesser von unter 10 μm haben). Trägerflüssigkeiten und -pulver, die für eine Inhalation geeignet sind, werden bei klassischen Asthmainhalationstherapeutika häufig verwendet und sind daher aus dem Stand der Technik gut bekannt. Der optimale Dosisbereich kann durch Routinepraktiken, wie sie einem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden.
Der in der Erfindung zu verwendende Cyclooxygenaseinhibitor kann jede Verbindung sein, die als für Säugetiere geeignet anerkannt ist, vor allem für den Gebrauch beim Menschen, und die bequem verabreicht werden kann. Die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente sind Experimente mit einem nicht selektiven COX-Inhibitor. Die Blockierung des COX-2-Enzyms scheint jedoch den Effekt einer INO zu unterstützen und zu verlängern. Das Rezidiv könnte sowohl durch Blockierung des Enzyms COX-1 als auch des Enzyms COX-2 gemildert werden. Die Verwendung eines nicht selektiven COX-Blockers sollte daher nützlich sein, aber auch mit einem selektiveren COX-Blocker dürften vorteilhafte Effekte erzielt werden.
Einige Beispiele von COX-Inhibitoren, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung arbeiten sollten, sind: Diclofenac, Aceclofenac, Nabumeton, Meloxicam, Meclofenamic, Nimesulid, Paracetamol, Rofecoxib, Celecoxib, DuP 697 (5-Brom-2-(4-fluorphenyl)-3-[4(methylsulfonyl)-phenyl]thiophen), GR 32191 (((IR-α(Z),2β,3(3,5α))-(+)-7-5(((1,1'-biphenyl)-4-yl)-methoxy)-3-hydroxy-2-(1-piperidinyl)-cyclopentyl)-4-heptensäure), Flosulid (oder cGP 28238), NS 398 (N-(2-(Cyclohexyloxy)-4-nitrophenyl)-methansulfonamid), L-745,337 (N-[6-[(2,4-Difluorphenyl)thio]-2,3-dihydro-1-oxo-1H-inden-5-yl]methansulfonamid), DFU ((5,5-Dimethyl-3-(3-fluorphenyl)-4-(4-methylsulfonyl)phenyl-2(5H)-furanon), HN-56249 ((3-2,4-Dichlorthiophenoxy)-4-methylsulfonylaminobenzolsulfonamid), JTE-522 ((4-(4-Cyclohexyl-2-methyloxazol-5-yl)-2-fluorbenzolsulfonamid, Aspirin, Indometacin und Ibuprofen.
Von diesen spezifischen Verbindungen scheinen Aspirin, Indometacin und Ibuprofen in Bezug auf die COX-1-Hemmung selektiver zu sein, während die anderen Verbindungen (zumindest die meisten davon) in Bezug auf die COX-1- und COX-2-Hemmung selektiver oder im Wesentlichen in Bezug auf die COX-2-Hemmung ähnlich selektiv zu sein scheinen. Auch deren Säureadditionssalze, z. B. Hydrochlorite, könnten geeignet sein.
Die nach der Erfindung verwendeten Bestandteile können durch im Handel erhältliche Inhalationsvorrichtungen verabreicht werden. Komprimiertes NO-Gas kann von einem kommerziellen Anbieter erhalten werden, typischerweise als ein Gemisch von 200–2000 ppm NO in reinem N₂-Gas. Dieses NO-N₂-Gasgemisch kann in einer Menge von 1–100.000 nmol/Min. in das Inhalationsgas abgegeben werden oder kann mit Luft, Sauerstoff oder einem anderen geeigneten Trägergas oder einem Gasgemisch gemischt werden, im Allgemeinen in einer Konzentration von 1 ppm bis 180 ppm des Gemisches. Für Inhalationen über längere Zeiträume wird im Allgemeinen ein Bereich von 1–40 ppm verwendet, während für kürzere Zeiträume 1–80 ppm oder 1–180 ppm verwendet werden können, wenn ein unmittelbarer starker Effekt erwünscht ist. Besonders bevorzugte Bereiche in letzteren Fällen sind 20–80 ppm (z. B. 40–80 ppm) bzw. 40–180 ppm. Was weitere Einzelheiten zur Inhalation von NO anbelangt, wird diesbezüglich auf den Stand der Technik verwiesen, z. B. EP 560 928 B1 .
Das Stickoxid und der Cyclooxygenaseinhibitor können nacheinander in beliebiger Reihenfolge verabreicht werden oder sie können gleichzeitig verabreicht werden, wobei im letzteren Fall die beiden Bestandteile entweder gleichzeitig aus separaten Quellen oder zusammen oder in Form einer Zusammensetzung, die sowohl das Stickoxid als auch den Cyclooxygenaseinhibitor aufweist, verabreicht werden.
Der Cyclooxygenaseinhibitor kann auf die gleiche Weise wie NO verabreicht werden, d. h. durch Inhalation, aber auch durch andere gängige Verabreichungswege für Pharmazeutika. Unter solchen Wegen kann auf sublinguale, orale und rektale Verabreichungen, Auftragung auf Epithelflächen und Injektion verwiesen werden, welche subkutan, intramuskulär, intravenös oder intraperitoneal sein kann. Vorzugsweise wird der Cyclooxygenaseinhibitor aber durch Inhalation verabreicht. Er kann damit als ein Pulver (d. h. als ein fein verteilter Feststoff, entweder rein oder als ein Gemisch mit einem biologisch verträglichen Trägerpulver oder mit einer oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Verbindungen bereit gestellt) oder als eine Flüssigkeit (d. h. in einem biologisch verträglichen flüssigen Trägerstoff gelöst oder suspendiert, wahlweise gemischt mit einer oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Verbindungen) verabreicht werden, kann aber praktischerweise in vernebelter Form inhaliert werden (vorzugsweise Teilchen oder Tröpfchen enthaltend, die einen Durchmesser von unter 10 μm haben). Trägerflüssigkeiten und -pulver, die für eine Inhalation geeignet sind, werden bei klassischen Asthmainhalationstherapeutika häufig verwendet und sind daher aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Der Cyclooxygenaseinhibitor wird, unter anderem in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Verbindung und dem Verabreichungsweg, in einer therapeutisch wirksamen Menge verwendet, beispielsweise in einer Menge, die von einem Fachmann leicht bestimmt werden kann. Wie einem Fachmann klar sein sollte, umfasst der Begriff „therapeutisch" in dieser Beziehung sowie auch im Allgemeinen in der Beschreibung und in den Ansprüchen eine prophylaktische Behandlung sowie eine Behandlung eines etablierten Zustandes. Darüber hinaus wird „therapeutisch wirksam" in einem Sinn verwendet, der auf diesem technischen Gebiet üblich ist, wie beispielsweise definiert in EP 560 928 B1 , auf das oben Bezug genommen wird, obgleich in diesem spezifischen Fall der Cyclooxygenaseinhibitor im Allgemeinen therapeutisch wirksam ist, sobald er einen negativen Effekt umkehrt, der erhalten wird, wenn nur gasförmiges Stickoxid verwendet wird. Als Richtlinie in dieser Beziehung könnte auch hinzugefügt werden, dass die Verbindung Diclofenac im Allgemeinen wirksam ist, wenn sie in einer Gesamtmenge von 50–150 mg/Tag bei einem Erwachsenen verwendet wird und als orale Tablette, Zäpfchen, intramuskuläre Injektion oder intravenöse Infusion verwendet wird. Dies sollte einer Dosis von etwa 0,1 bis 5 mg/kg Körpergewicht entsprechen, wie beispielsweise 0,15 bis 3 mg/kg Körpergewicht, wenn in Form eines Aerosols verwendet. Effekte können jedoch bisweilen auch bei einer niedrigeren Dosis erreicht werden, und bisweilen können auch noch höhere Dosen erforderlich sein. Für andere Verbindungen könnte dies als Basis für die Bestimmung geeigneter Dosen davon verwendet werden.
Es ist ein Verfahren für die Behandlung einer Verengung der Lungengefäße oder eine Verengung der Atemwege bei einem Säugetier beschrieben, insbesondere beim Menschen, um einer Unterreaktion oder nicht vorhandenen Reaktion auf eine alleinige Behandlung mit gasförmigem Stickoxid oder einem Stickoxiddonor entgegen zu wirken und/oder einem Rezidiv im Fall des Absetzens der alleinigen Behandlung mit gasförmigem Stickoxid oder einem Stickoxiddonor entgegen zu wirken. Das Verfahren umfasst die Verabreichung von Stickoxid (NO) in der Form als gasförmiges Stickoxid oder Stickoxiddonor in Kombination mit einem Cyclooxygenaseinhibitor durch Inhalation an ein Säugetier, das eine solche Behandlung braucht, wobei die Kombination in einer therapeutisch wirksamen Menge verwendet wird, um das Entgegenwirken zu erreichen.
Was spezifische und bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens anbelangt, wird auf solche spezifischen und bevorzugten Ausführungsformen verwiesen, die in Verbindung mit der Anwendung in Übereinstimmung mit der Erfindung beschrieben worden sind.
Schließlich ist eine pharmazeutische Zubereitung für die Behandlung einer Verengung der Lungengefäße oder einer Verengung der Atemwege bei einem Säugetier, insbesondere beim Menschen, beschrieben, um einer Unterreaktion oder nicht vorhandenen Reaktion auf eine alleinige Behandlung mit gasförmigem Stickoxid oder einem Stickoxiddonor entgegen zu wirken und/oder einem Rezidiv im Fall des Absetzens der alleinigen Behandlung mit gasförmigem Stickoxid oder einem Stickoxiddonor entgegen zu wirken, welche Stickoxid (NO) in Form von gasförmigen Stickoxid oder eines Stickoxiddonors in Kombination mit einem Cyclooxygenaseinhibitor umfasst, wobei das gasförmige Stickoxid und der in einer therapeutisch wirksamen Menge vorhanden sind, um das Entgegenwirken zu erreichen.
Unter Bezugnahme auf spezifische und bevorzugte Ausführungsformen der Zubereitung wird auch auf die spezifischen und bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Anwendung verwiesen.
Die Erfindung wird nun durch folgende nicht einschränkende Beispiele veranschaulicht:
Beispiel
Es wurden Experimente durchgeführt, um den Effekt eines COX-Inhibitors, Diclofenac, in Verbindung mit Inhalation von NO insbesondere auf das Rezidiv bei Absetzen der Inhalation zu untersuchen.
Materialien und Verfahren
Präparation der Tiere
Die Studie wurde vom Ethikausschuss für Tierversuche der Universität Uppsala genehmigt. In der Studie wurden sechsundzwanzig Schweine einer schwedischen Landrasse mit einem Gewicht von 24–29 kg verwendet. Vor dem Transport vom Bauernhof wurden die Schweine mit einem Neuroleptikum Azaperonum (STRESNIL, Janssen, Belgien), 40 mg intramuskulär (i.m.) sediert. Die Narkose wurde eingeleitet mit Atropin i.m. (0,04 mg/kg), Tiletamin/Zolazepam (ZOLETIL, Virbac Laboratories) (6 mg/kg) und Xylzry (ROMPUN, Bayer AG, Deutschland) (2,2 mg/kg). Nach der Einleitung wurde eine Kanüle in eine Ohrvene eingeführt und ein Opioid (FENTANYL, Antigen Pharmaceuticals Ltd, Roscrea, Irland) (5 μg/kg) injiziert. Muskelentspannung erfolgte durch Gabe von Pancuronium (PAVULON, Organon Technika AB, Göteborg, Schweden) (0,2 μg/kg). Die Aufrechterhaltung der Narkose erfolgte durch kontinuierliche Infusion eines Hypnotikums (Chlomethiazol, HEMINEVRIN, Astra, Södertälje, Schweden) (400 mg/Stunde), Pancuronium (2 mg/Stunde) und Fentanyl (150 μg/Stunde). Bei Bedarf wurden wiederholte Dosen Fentanyl 0,2–0,5 mg i.v. gegeben. Die Tiefe der Narkose wurde als adäquat betrachtet, wenn Hauteinschnitte keine Veränderungen der Herzfrequenz oder des Blutdrucks hervorriefen. Zur Hydratation wurde 500 ml vorgewärmte (38°C) isotope Salzlösung je Stunde gegeben. Die Tiere wurden für den Rest der Studie in Rückenlage (dorsales Liegen) platziert.
Nach Einleitung der Anästhesie wurde eine Tracheotomie durchgeführt, und es wurde ein Trachealtubus mit Cuff (Innendurchmesser 6 mm) eingeführt. Ein volumenkontrollierter Ventilator (Siemens 900c) lieferte die mechanische Beatmung. In den Ventilator eingebaute Messfühler zeichneten den Atemwegsdruck und das Atemminutenvolumen auf. Die Atemfrequenz wurde bei 20 Atemzügen je Minute aufrechterhalten, wobei das Tidalvolumen angepasst wurde, um ein endtidales CO₂ (PetCO2) zwischen 36 und 41 mmHg (4,8–5,4 kPa) aufrecht zu erhalten. Die Inspirationszeit war 25%; es wurde eine endinspiratorische Pause von 5% des respiratorischen Zyklus angewandt sowie ein endexspiratorischer Druck (PEEP) von 5 cmH₂O. Der Inspirationsanteil von Sauerstoff (FIO2) war 0,5.
Legen der Katheter und Blutmessungen
Zur Entnahme von Blutproben und für Druckaufzeichnungen wurde über die rechte äußere Halsvene (Vena jugularis externa) ein Katheter mit Dreifachlumen und Ballonspitze (Swan Ganz Nr. 7F) in die Lungenarterie eingeführt. Zu Infusionszwecken wurde in die kontralaterale Vena jugularis ein Katheter mit großem Durchmesser eingeführt, dessen Spitze sich in der oberen Hohlvene befand. Zur Entnahme von Blutproben und zur Aufzeichnung des arteriellen Blutdrucks wurde die rechte Arteria carotis kanüliert.
Die arteriellen, zentralvenösen und Lungenarterienkatheter wurden an geeignete Druckwandler (Sorenson Transpac Transducers, Abbott Critical Care Systems, IL, USA) angeschlossen und Drücke wurde auf einem Marquette 7010 Monitor (Marquette Electronics Inc., WI, USA) aufgezeichnet. Es wurden der mittlere arterielle Druck (MAP), der mittlere Lungenarteriendruck (MPAP), die Herzfrequenz (HF), der zentralvenöse Druck (ZVD), der Wedge-Druck (PCWP) und das Herzminutenvolumen (Qt) aufgezeichnet. Die Atemwegsdrücke wurden vom Ventilator registriert. Die Gefäßdrücke wurden über den gesamten Atemzyklus gemittelt und die Mitte des Thorax wurde als Nullreferenzhöhe verwendet.
Qt wurde mittels Thermoverdünnung gemessen: 10 ml eiskalte isotope Salzlösung wurden als Bolus injiziert und das Qt wurde aufgezeichnet (Herzminutenvolumenrechner Marquette 7010, Marquette Electronics Inc., WI, USA). Für jede Messung wurden mindestens drei Injektionen gegeben und der Mittelwert wurde berechnet. Die Injektionen wurden gleichmäßig über den Atemzyklus verteilt. Bei jeder Messung wurde das ausgeatmete Atemminutenvolumen aufgezeichnet. Für die Analyse von Blutgas (ABL 3, Radiometer, Kopenhagen, Dänemark), der Sauerstoffsättigung und der Hämoglobinkonzentration (OSM 3, Radiometer, Kopenhagen, Dänemark) wurden gemischte venöse und arterielle Blutproben entnommen. Gleichzeitig wurden fünf ml arterielles Blut entnommen, wobei das Plasma für biochemische Analysen getrennt wurde (siehe unten).
Lungenschädigung
Eine akute Schädigung der Lunge wurde durch intravenöse Infusion von 25 μg Endotoxin/kg/Stunde für 3 Stunden induziert und anschließend während des verbleibenden experimentellen Zeitraums bei 10 μg/kg/Stunde aufrechterhalten.
Protokoll
Dreißig Minuten nach der Operation wurden Basislinienmessungen der Hämodynamik durchgeführt, Blutproben entnommen und Blut für die anschließende biochemische Analyse entnommen. Eine akute Lungenschädigung wurde durch intravenöse Infusion von 25 μg Endotoxin (LPS, E. coli 0111:B4, Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) je kg je Stunde für 3 Stunden ausgelöst. Die Reaktion wurde 30, 60, 120 und 150 Minuten nach Einsetzen der Endotoxininfusion gemessen. Die Tiere wurden dann in drei Gruppen aufgeteilt, um den potenziellen INO-verstärkenden Effekt eines COX-Inhibitors zu analysieren. Dies wurde erreicht, indem die Schweine in eine „Cyclooxygenase(COX)-Blockadegruppe", eine Gruppe „Ohne Blockade" und eine „Kontrollgruppe" eingeteilt wurden.

1. In der COX-Blockadegruppe dauerte die Endotoxininfusion drei Stunden, bevor die Inhalation von 30 ppm INO begonnen wurde. Es wurde 30 Minuten vor der NO-Inhalation ein nicht selektiver COX-Inhibitor Diclofenac (Sigma D6899) in Salzlösung (300 mg/kg) als i.v.-Bolus gegeben. Vor dem Absetzen der INO 30 Minuten später erfolgten Messungen der Hämodynamik und des Gasaustauschs, und es wurde Blut für biochemische Analysen entnommen. Es wurden außerdem Messungen durchgeführt, wenn das NO 5, 10, 15, 30 Minuten lang ausgesetzt wurde, um auf Hinweise auf ein Rezidiv zu prüfen. Die NO-Inhalation wurde für eine weitere halbe Stunde fortgesetzt (d. h vier Stunden nach Beginn der Endotoxininfusion) und erneut abgesetzt. Die Ergebnisse wurden zu den gleichen Zeitpunkten wie zuvor untersucht. Dies erfolgte um zu sehen, ob die Reaktion auf INO gleich geblieben war oder sich verändert hatte und ob ein etwaiges Rezidiv stärker war als beim ersten Auftreten oder nach dem ersten Auftreten eingetreten war.
2. In der Gruppe ohne Blockierung wurde kein COX-Inhibitor gegeben. Ansonsten war das Protokoll gleich wie das in der Gruppe mit COX-Blockierung Verwendete. Bei 5 Schweinen wurden zu 4 Gelegenheiten (vor, während und nach NO-Inhalation) während der Studie durch Sternotomie Lungengewebeproben entnommen.
3. Die Kontrollgruppe erhielt die gleiche Infusion von Endotoxin, aber keine INO oder einen COX-Inhibitor. Die Kontrollschweine wurden an der Basislinie und zu Zeitpunkten untersucht, die dem Beginn und dem Ende der beiden INO-Behandlungen entsprachen, sowie am Ende des Experiments, fünf Stunden nach Beginn der Endotoxinverabreichung.

Der Prüfzeitraum nach Beginn der Endotoxininfusion war deshalb 300 Minuten (fünf Stunden) und die gesamte Prüfzeit, einschließlich Narkose, Präparation und Basislinienmessung vor Endotoxingabe betrug etwa 7 Stunden.
NO-Verabreichung und Aufzeichnung von NO in der Atemluft
NO, 1000 ppm in N₂, wurde mit einem Gemisch von O₂/N₂ gemischt und mit dem Niedrigfluss(Low-Flow)-Eingang des Ventilators verbunden. Das eingeatmete Gas wurde durch einen Kanister geleitet, der Natronkalk enthielt, um etwaiges NO₂ zu absorbieren. Die Konzentration des eingeatmeten NO und NO₂ wurde durch Chemilumineszenz (9841 NOx, Lear Siegler Measurement Controls Corporation, Englewood CO, USA) im Inspirationsschenkel des Beatmungsschlauchs gemessen. Das eingeatmete NO wurde auf 30 ppm gesetzt, und das eingeatmete NO₂ war stets weniger als 0,5 ppm.
COX-1- und COX-2-Expression durch Westernblotting
Die Lungengewebeblöcke wurden mit PBS bei 4°C gespült. Das Gesamtprotein des Lungengewebes wurde durch Homogenisation (Ultra-Turrax, Jenke und Kunkel, IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland) in 5 Volumen eiskaltem 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,4) extrahiert, der zur Hemmung der Proteolyse 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt. Der Überstand wurde gesammelt und bis zur Analyse bei –80°C aufbewahrt. Die Konzentration von Gesamtprotein im Überstand wurde mit dem Verfahren nach Lowry bestimmt. Anschließend wurde das Protein durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Der Blot wurde mit 5% BSA in TBS über Nacht bei 4°C geblockt und anschließend mit Anti-COX-1 (1:2500, Cayman Chemical, MI, USA, Bestellnr. 160108), COX-2 (1:1500, Cayman Chemical, MI, USA, Bestellnr. 160108) in TBS, enthaltend 1% BSA, über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit TBS wurden die Blots zur Erkennung von ET-1 1 Stunde mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchenimmunglobulin G (IgG) (1:2500 Verdünnung, Vector Laboratories, Burlingame, USA) inkubiert. Der Blot wurde fünfmal in TBS gewaschen und der Antigen-Antikörper-Komplex wurde auf photographischen Filmen festgestellt, wobei ein Reagens für verstärkte Chemilumineszenz (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) verwendet wurde. Alle Experimente wurden dreimal durchgeführt und die Banden jedes Experiments wurden mithilfe des Programms des National Institutes of Health (NIH) Image 1.6 C für statistische Analyse analysiert.
Plasma-TXB2
Blut wurde in vorgekühlte Röhrchen abgenommen, die EDTA (10 mM, Endkonzentration) enthielten, und zentrifugiert (10 Min. bei 40°C). Messungen der TXB2-Konzentration wurden mithilfe eines im Handel erhältlichen Enzymimmunassays (Thromboxane B2 EIA-Kit, Cayman Chemical, MI, USA, Bestellnr. 519031) durchgeführt. Aus jedem Teströhrchen wurde Serum entnommen und bei –70°C gelagert, bis die TXB2-Messungen durchgeführt wurden. Zur Sicherstellung, dass alle Proben frei von organischen Lösungsmitteln waren, wurde das Serum vor seiner Zugabe in die Testvertiefung gereinigt. Die Reinigung von TXB2 erfolgte in Übereinstimmung mit der Einführung von Cayman Chemical, indem zuerst jeder Probe 10.000 cpm Tritium-markiertes TXB2 (3H-TXB2) und anschließend 2 ml Ethanol zugegeben wurden, gefolgt von Vortexmischen bei 4°C für 5 Minuten und Zentrifugation bei 1500 g für 10 Minuten zur Entfernung ausgefällter Proteine. Der Überstand wurde abgenommen und mit ultrareinem Wasser gemischt. Die Probe wurde durch eine C-18-Umkehrphasenkartusche geleitet. Zehn Prozent des Eluats wurden zur Szintillationszählung entfernt.
Enzymimmunassays wurden in doppelter Ausführung durchgeführt, indem 50 μl gereinigte Probe mit 50 μl Spurensubstanz (Tracer) und 50 μl Antiserum auf Mikrotiterplatten gemischt wurde. Nach 18-stündiger Inkubation wurden 200 μl Ellmans-Reagenzien zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu starten, und 30 Minuten später wurde die Absorption einzelner Gefäße bei 405 nm mit einem photometrischen Mikrotiterplattenlesegerät (Thermo Max, Molecular Devices) gemessen. Die Konzentration von TXB2 in den Proben wurde aus Standardkurven geschätzt, die durch nichtlineare Regression der Absorption von acht bekannten TXB2-Konzentrationen im Bereich von 7,5 bis 1000 pg/ml erhalten wurden. Die Intraassay- und Interassay-Variationskoeffizienten waren < 10%. Weitere Einzelheiten sind im Handbuch des TXB2-Enzymimmunassay-Kits 519031 von Cayman Chemical beschrieben.
Statistische Analyse
Für alle Variablen wurden unter allen Prüfbedingungen der Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts berechnet. Vergleiche erfolgten unter Verwendung von Varianzanalyse (ANOVA) für Wiederholungsmessungen; es wurden Korrekturen für Mehrfachvergleiche vorgenommen. Unterschiede wurde bei einem Niveau von p < 0,05 als signifikant betrachtet.
Ergebnisse
Endotoxin-induzierte Lungenschädigung
Die Hämodynamik und arterielle Oxygenierung an der Basislinie waren ähnlich wie die in vorherigen Experimenten bei gesunden Schweinen gemessenen (Freden F. et al., Br J Anaesth, 77(3): 413–8, 1996). Es gab keine Unterschiede zwischen den drei Gruppen.
Die Endotoxininfusion erhöhte den MPAP in allen Gruppen nach 150-minütiger Infusion um mehr als das Doppelte. PaO2 war signifikant reduziert auf die Hälfte des Basislinienwerts. Darüber hinaus erhöhte sich die Herzfrequenz, wohingegen sich das Herzminutenvolumen verringerte. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen Messungen, die in der UN-COX-Gruppe 3 und 4 Stunden nach Beginn der Endotoxininfusion vorgenommen wurden, und in der Kontrollgruppe nach 3, 4 und 5 Stunden vorgenommen wurden.
NO-Inhalation und Absetzen
In der Gruppe „Ohne Blockade" führte die Inhalation von 30 ppm NO 3 Stunden nach der Endotoxininfusion zu einem 28%igen Abfall des MPAP und einer 54%igen Erhöhung des PaO₂. Wenn die NO-Inhalation nach 30 Minuten abgesetzt wurde, erhöhte sich der MPAP schnell (innerhalb von 5 Minuten) auf ein Niveau, das 23% (9 mmHg) höher war als vor der NO-Inhalation; also hatte sich ein Rezidiv entwickelt. Der PaO2 verringerte sich schnell auf den Wert vor der NO-Inhalation, zeigte aber kein klares Rezidiv-Phänomen.
Wenn die NO-Inhalation nach 4-stündiger Endotoxininfusion wiederholt wurde, waren der Abfall des MPAP und der Anstieg des PaO2 schwächer und für PaO2 nicht mehr signifikant im Vergleich zu einer Stunde früher während des Tests. Fünf Minuten nach Absetzen der NO-Inhalation war der MPAP erneut signifikant auf einen Wert über dem Niveau vor der NO-Inhalation angestiegen (+26%) und der PaO₂ war auf unter den Wert vor der NO-Inhalation abgefallen. Also wurde ein eindeutiges Hypoxämie-Rezidiv beobachtet.
Es lag eine umgekehrte Beziehung zwischen der Verbesserung des PaO₂ bei NO-Inhalation und der Größenordnung des Rezidivs bei Absetzen von NO vor. Je schwächer daher die Reaktion auf inhaliertes NO, desto größer der Abfall des PaO₂ bei Absetzen von NO. Für MPAP wurde ein solcher Zusammenhang nicht beobachtet.
In der COX-Blockade-Gruppe senkte die Vorbehandlung mit Diclofenac den MPAP. INO bewirkte einen signifikanten Abfall des MPAP und einen Anstieg des PaO₂. Bei Absetzen der INO wurde weder hinsichtlich des MPAP noch des PaO₂ ein Rezidiv beobachtet. Die Größenordnung der PAP-Senkung war durch Kombination von INO und Diclofenac nicht größer. Es verlängerte sich aber die Dauer der Wirkung von inhaliertem NO im Vergleich zur Gruppe „Ohne Blockade". Darüber hinaus produzierte die INO die gleiche Verbesserung von MPAP und PaO₂ in der zweiten Studie der NO-Inhalation wie in der ersten Studie eine Stunde zuvor, im Gegensatz zu der abgeschwächten Reaktion auf NO in der Gruppe „Ohne Blockade". Wiederum wurde bei Absetzen der INO kein Rezidiv beobachtet. Der Atemwegswiderstand erhöhte sich während der Endotoxininfusion. INO alleine bewirkte keine Prävention oder Abschwächung des Anstiegs. In der COX-Blockade-Gruppe war aber der Anstieg des Widerstands signifikant geringer (p < 0,01), und es gab keinen Anstieg während der INO-Zeiträume.
In der Kontrollgruppe blieben MPAP und PaO₂ die beiden Stunden, die den INO-Behandlungen in den Prüfgruppen entsprachen, über stabil. Ein Vergleich zwischen der INO und den Kontrollgruppen legte also die Verbesserung des MPAP und des PaO₂ durch die beiden INO-Behandlungen, das Rezidiv bei Absetzen der INO und die Auswirkungen des COX-Inhibitors offen.
Die Inhalation bzw. das Absetzen von NO hatte weder in der 3-stündigen noch in der 5-stündigen INO-Studie einen Einfluss auf die Expression von COX-1. Die Expression von COX-2 war in der Gruppe „Ohne Blockade" nach 3-stündiger Endotoxininfusion deutlich erhöht und erhöhte sich nach 5 Stunden weiter bis auf fast das 10-Fache über den normalen Basislinienwerten (p < 0,01). Eine dreißigminütige INO hatte weder im 3-stündigen noch im 5-stündigen Inhalationstest einen Einfluss auf die Expression. Außerdem blieb die Expression von COX-2 nach den INO-Zeiträumen erhöht.
TXB-2-Plasmakonzentration:
Es gab keinen signifikanten Unterschied der Basislinienwerte zwischen den drei Gruppen. Das Plasma-TXA2 war eine halbe Stunde nach Beginn der Endotoxininfusion drastisch erhöht (6000–80000 pg/ml) und verringerte sich dann nach 3 Stunden auf das Doppelte der Basislinie, wobei sich kein Unterschied zwischen den Gruppen ergab. In der Gruppe „Ohne Blockade" ergab sich keine Veränderung des TXB2-Plasmaspiegels während der NO-Inhalation, dieser war aber fünf Minuten nach Absetzen von INO erhöht und erreichte 15 Minuten nach INO einen Spitzenwert (p < 0,05). Er blieb erhöht, als die zweite INO-Studie 30 Minuten später begann (20000–40000 pg/ml), mit einem weiteren Anstieg, als das INO das zweite Mal abgesetzt wurde. In der COX-Blockade-Gruppe wurde der TXA2-Plasmawert durch die erste INO-Behandlung und das erste Absetzen der INO nicht erhöht. Es ergab sich ein Abfall des TXB2-Plasmawerts während der zweiten INO-Studie, und es fand nach Absetzen der INO kein Anstieg statt.

Claims

Verwendung von inhalierbarem Stickoxid (NO) in Form von gasförmigem Stickoxid oder einem Stickoxiddonor in Kombination mit einem Cyclooxigenaseinhibitor für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer Verengung der Lungengefäße oder einer Verengung der Atemwege bei einem Säugetier, insbesondere beim Menschen, um einer Unterreaktion oder nicht vorhandenen Reaktion auf eine alleinige Behandlung mit gasförmigem Stickoxid oder einem Stickoxiddonor entgegen zu wirken und/oder einem Rezidiv im Fall des Absetzens der alleinigen Behandlung mit gasförmigem Stickoxid oder einem Stickoxiddonor entgegen zu wirken.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verengung der Lungengefäße oder die Verengung der Atemwege mit einem klinischen Zustand assoziiert ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer traumatisch bedingten Verletzung, einer Fettembolie in der Lunge, Azidose, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen, akuter Höhenkrankheit, akutem Lungenhochdruck nach einer Herz- oder Lungenoperation, persistierendem Lungenhochdruck bei Neugeborenen, perinatalem Aspirationssyndrom, Surfactantmangelsyndrom, akuter Lungenthromboembolie, akutem Lungenödem, Heparin-Protamin-Reaktionen, Hypoxie und Asthma bronchiale besteht.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Verengung der Atemwege mit Asthma bronchiale assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Verengung der Atemwege mit einer akuten Kondition von Asthma bronchiale oder Status asthmaticus assoziiert ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprü che, wobei es sich bei dem Medikament um ein inhalierbares Medikament handelt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich die Herstellung auf ein Medikament für die aufeinander folgende Verabreichung des Stickoxids und des COX-Inhibitors in beliebiger Reihenfolge bezieht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das Medikament in der Form einer Zusammensetzung vorliegt, welche das Stickoxid und den Cyclooxigenaseinhibitor zu deren gleichzeitiger Verabreichung aufweist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Cyclooxigenaseinhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Diclofenac, Aceclofenac, Nabumeton, Meloxicam, Meclofenamic, Nimesulid, Paracetamol, Rofecoxib, Celecoxib, DuP 697, GR 32191, Flosulid, NS 398, L-745,337, DFU, HN-56249, JTE-552, Aspirin, Indometacin und Ibuprofen oder Säureadditionssalzen davon besteht.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei NO in dem Medikament in einer Menge von 1–100 nmol/min vorhanden ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zu inhalierende Konzentration des NO im Bereich von 1–180 ppm, vorzugsweise 1–80 ppm, insbesondere 1–40 ppm liegt, wobei das NO in einem Trägergas oder einem Gasgemisch vorhanden ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stickoxiddonor aus S-Nitroso-N-acetylpenicillamin, S-Nitrosocystein, Nitroprussid, Nitrosoguanidin, Glyceroltrinitrat, Isoamylnitrit, anorganischem Nitrit, Azid und Hydroxylamin ausgewählt ist.