DE60126283T2

DE60126283T2 - Verfahren zum Rekonstituieren eines biologisch aktiven rekombinanten Proteins

Info

Publication number: DE60126283T2
Application number: DE60126283T
Authority: DE
Inventors: Roman Necina; Robert Schlegl; Alois Jungbauer; Christine Machold
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim RCV GmbH and Co KG
Priority date: 2001-10-03
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2021-10-04
Also published as: EP1300415A1; DE60126283D1; JP2005510481A; KR20040051594A; EP1300415B1; CA2462232C; CA2462232A1; EP1438327A1; KR100930877B1; EP2298788A1; JP4264000B2; WO2003031465A1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung von rekombinanten Proteinen.
Proteine für industrielle Anwendungen, z. B. zur Verwendung als Biopharmazeutika oder Feinchemikalien, werden entweder durch Extraktion und Reinigung aus einer natürlichen Quelle, wie Pflanzen- oder Tiergewebe oder Mikroorganismen, oder durch rekombinante DNA-Technik erhalten.
Zur Herstellung eines rekombinanten Proteins wird die cDNA, die für das Protein von Interesse kodiert, in einen Expressionsvektor inseriert und der rekombinante Vektor wird in Wirtszellen transformiert, die zur Überexpression des Proteins gezüchtet werden. Die Wirtszellen können aus Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen oder Pilzen, oder aus Tier- oder Pflanzenzellen ausgewählt werden.
Eine Überexpression eines Proteins stellt ein komplexes Ereignis dar. Um die richtige Konformation zu erhalten, ist das Protein bereits in seinem nativen Zustand mit so genannten "Faltungshelferproteinen" und Enzymen assoziiert. Die Faltungshelferproteine, die auch als "Begleiter" oder "Minibegleiter" bezeichnet werden, treten in komplexer Weise so in Wechselwirkung, dass das Protein nach Durchlaufen verschiedener Zwischenstadien seine native Konformation annimmt. Einige diese Zwischenstadien können relativ stabil sein. Enzyme, die an der Proteinreifung beteiligt sind, katalysieren entweder die rasche Bildung von Disulfidbrücken (1; 2), die Isomerisierung von Prolyl-Peptid-Bindungen (3–6) oder kompliziertere Modifikationen, wie eine Verkürzung des Proteins, Seitenkettenmodifikationen oder Modifikationen des N- und C-Terminus. Wenn ein Protein in wirksamer Weise überexprimiert wird, erfolgt die Herstellung des naszierenden Peptids rascher als die Faltung des Proteins. Bei einigen Proteinen können in einem Zwischenstadium auch Aggregate gebildet werden (nachstehend umfasst der Ausdruck "Zwischenprodukt"-Formen auch Aggregatformen).
Insgesamt erfolgt die Aggregatbildung wesentlich rascher als die vollständige Faltung eines Proteins (7; 8).
In Expressionssystemen, bei denen derartige Bedingungen vorliegen, wird das Protein in den Zellen in einer parakristallinen Form, so genannten "Einschlusskörpern", die auch als "refraktile Körper" bezeichnet werden, abgeschieden.
Da das Protein, wenn es in Form von unlöslichen Einschlusskörpern vorliegt, gegen einen enzymatischen Angriff, z. B. eine Proteolyse, abgeschirmt ist und nicht die Physiologie der Zellen stören kann, nützt die rekombinante DNA-Technik diesen abweichenden Weg der Proteinsekretion aus, z. B. zur Herstellung von Proteinen, die für die Zellen toxisch sind.
Um ein Protein aus Wirtszellen, in denen es in einer denaturierten Form angereichert wird, d. h. einem Konformationszustand ohne biologische Aktivität, zu erhalten, werden verschiedene Maßnahmen ergriffen, um das Protein in seiner korrekt gefalteten Form zu gewinnen. Beispielsweise werden bakterielle Zellen, die Einschlusskörper tragen, zerlegt, wonach die Einschlusskörper durch Zentrifugation geerntet und anschließend in einem Puffer mit einem Gehalt an einem chaotropen Mittel gelöst werden. Das denaturierte Protein wird sodann in eine Umgebung übertragen, die die Gewinnung seiner nativen Konformation begünstigt. Bevor das Protein diesen nativen Zustand annimmt, durchläuft es verschiedene halbstabile Zwischenprodukte. Da Zwischenprodukte hochgradig exponierte hydrophobe Domänen aufweisen, die zu einer Assoziation neigen, bilden sie tendenziell Aggregate. Im Prinzip kann eine Rückfaltung als ein Wettkampf gegen die Aggregatbildung angesehen werden, wobei die Aggregatbildung üblicherweise einer Reaktionskinetik zweiter Ordnung folgt, während die Faltung des Proteins einer Reaktionskinetik erster Ordnung folgt (8).
Mit den derzeit verfügbaren Verfahren wird eine Faltung des Proteins entweder durch Verdünnung des Proteins in einem Faltungspuffer in einem absatzweisen oder kontinuierlichen Modus erhalten (9–13). Bei diesen Verfahren führt eine absatzweise Verdünnung zu hochgradig verdünnten Proteinlösungen und daher zu hohen Prozessvolumina, was häufig bei industriellen Verfahren einen Engpass darstellt.
Bei einem anderen Verfahren wird der Faltungsweg in vivo durch Zugabe von Begleitern und/oder Minibegleitern und/oder Enzymen, die bestimmte Stufen im Faltungsweg katalysieren, simuliert (2; 14–18). Komplexe Rückfaltungsreaktorsysteme werden konstruiert, die eine Serie von Behältern umfassen, die dazu bestimmt sind, die Faltungsreaktion zu verbessern (19).
Bei einem weiteren Weg werden die Helferproteine und Enzyme an einer festen Phase immobilisiert. Anschließend wird die Proteinlösung über ein so genanntes gepacktes Bett mit einem Gehalt an den immobilisierten Helferproteinen und/oder Helferenzymen geleitet, wodurch es in seine native Konformation gefaltet wird (20–23). Da die Faltungshelferproteine und Enzyme in einem stöchiometrischen Verhältnis vorhanden sein müssen, erfordert dieses Verfahren eine Menge an Helferproteinen, die beinahe der Menge des schließlich erhaltenen Produkts entspricht, wobei die Helferproteine ihrerseits durch rekombinante DNA-Technik hergestellt werden müssen. Ferner werden zur Verbesserung der Faltung die Helferproteine üblicherweise mit dem Protein von Interesse fusioniert, was eine weitere Bearbeitung des Fusionsproteins erfordert. Aus diesen Gründen ist diese Strategie sehr kostenintensiv.
Da eine bestimmte Proteinfraktion in Form von Aggregaten verloren geht, ist eine Faltung des Proteins in freier Lösung oder im matrixgestützten Prozess nicht ausreichend wirksam, um das denaturierte Protein in quantitativer Weise in die gefaltete Form überzuführen.
Ein Protein kann aus seiner denaturierten Konformation zur richtig gefalteten Konformation gefaltet werden, indem man es in eine Umgebung überträgt, die die Veränderung in die native Konformation begünstigt. Während dieser Umlagerung durchläuft das Protein mehrere Zwischenprodukt-Konformationszustände, die leicht der Aggregatbildung unterliegen. Je nach dem individuellen Protein und je nach den Umgebungsbedingungen können die Aggregate ausfallen. Unabhängig davon, ob die Aggregate löslich bleiben oder ob sie ausfallen, führt dieses Verfahren zu drastischen Ausbeuteverlusten an korrekt gefaltetem Protein. Im allgemeinen verläuft die Faltung eines Proteins in seine native Konformation nach einer Reaktionskinetik erster Ordnung, während die Bildung von Aggregaten aus Zwischenprodukten nach einer Reaktionskinetik zweiter Ordnung verläuft.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Rückfaltung eines Proteins aus einem denaturierten Zustand bereitzustellen, bei dem die Nachteile der derzeit angewandten Verfahren überwunden werden.
Die Lösung der der Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe beruht auf der Überlegung, dass das Trennverfahren durch kontinuierliche Durchführung verbessert werden kann. Ferner wurde angenommen, dass eine Rückführung von Zwischenproduktformen des Proteins sowohl eine Verbesserung der Ausbeute an einem rekombinanten Protein als auch ein Arbeiten bei hohen Proteinkonzentrationen, wodurch das Prozessvolumen signifikant verringert würde, ermöglichen würde.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Rekonstitution eines Proteins von Interesse aus einem denaturierten Zustand in seine aktive Form, bei dem eine Einsatzlösung, die das rekombinante Protein von Interesse in seiner denaturierten Form und/oder in biologisch inaktiven Zwischenformen enthält, einem Trennverfahren unterworfen wird, bei dem das Protein unter Bedingungen rekonstituiert wird, die die Rückfaltung des Proteins fördern, und die Zwischenformen von dem rückgefalteten Protein getrennt werden, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die denaturierte Form und/oder die inaktiven Zwischenformen von dem rückgefalteten Endprodukt in kontinuierlicher oder quasi kontinuierlicher Weise getrennt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zwischenformen, die von der rückgefalteten Form abgetrennt worden sind, wieder der Einsatzlösung zugeführt (rückgeführt).
Der Ausdruck "denaturierte Form" bezeichnet erfindungsgemäß die biologisch inaktive Form des exprimierten Proteins von Interesse, wie es als Produkt des rekombinanten Herstellungsverfahrens erhalten wird, z. B. nach Lösen der Einschlusskörper.
Die Ausdrücke "Zwischenformen" oder "Zwischenprodukte" bezeichnen erfindungsgemäß die Formen, die das Protein zwischen seiner denaturierten Form und seinem rekonstituierten (rückgefalteten) nativen und biologisch aktiven Zustand durchläuft. Die Zwischenprodukte, die biologisch inaktiv sind oder eine geringere biologische Aktivität als das native Protein aufweisen, können Aggregate bilden.
Bei der Einsatzlösung handelt es sich um die Lösung, die durch Fermentation von Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Pflanzen- oder Tierzellen, die einen Expressionsvektor tragen, unter Bildung eines heterologen Proteins erhalten wird.
Die Trennung der Zwischenprodukte vom korrekt gefalteten Protein kann durch beliebige kontinuierliche oder quasi kontinuierliche (halbkontinuierliche) Chromatographieverfahren, die sich zur Trennung von Proteinen eignen, erreicht werden.
Eine große Anzahl von standardmäßigen chromatographischen Verfahren, die routinemäßig für die Proteintrennung verwendet werden, ist aus der Literatur bekannt, von denen die meisten in handelsüblichen Vorrichtungen, z. B. chromatographischen Säulen, angewandt werden können. Je nach dem Trennprinzip werden die Verfahren eingeteilt in Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, kovalente Chromatographie, Größenausschlusschromatographie oder Adsorptionschromatographie.
Diese chromatographischen Verfahren werden üblicherweise absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt. Beim absatzweisen Betrieb wird die Einsatzlösung auf einen chromatographischen Träger z. B. ein gepacktes Bett oder ein expandiertes Bett, aufgesetzt und das Protein wird je nach seiner Affinität für die stationäre Phase von der Säule entweder in starkem Umfang zurückgehalten oder es passiert die Säule. Für den Fall, dass das Protein in starkem Umfang zurückgehalten wird, kann es durch eine Veränderung der Laufbedingungen desorbiert werden, nachdem ungebundenes Material ausgewaschen worden ist.
Das absatzweise Verfahren kann in ein quasi kontinuierliches Verfahren umgewandelt werden, indem man entweder mit mehreren Säulen in sequenzieller Weise arbeitet oder indem man die Säulen zur Ermöglichung eines kontinuierlichen Betriebs, der als "Karussell-Chromatographie" bezeichnet wird, mit Verteilerventilen ausrüstet.
Beliebige chromatographische Protein-Trennverfahren können erfindungsgemäß herangezogen werden, vorausgesetzt, dass sie in quasi kontinuierlicher oder kontinuierlicher Weise durchgeführt werden können. Der Fachmann ist mit derartigen Verfahren vertraut und kann die für eine gegebene Trennanforderung geeignetste Methode auswählen.
Annulare Chromatographie (AC), simuliertes Bewegtbett (SMB) und echtes Bewegtbett (TMB) stellen die am stärksten verbreiteten kontinuierlichen chromatographischen Trennsysteme dar. Die Vorteile von AC gegenüber SMB und TMB liegen in der Anwendung einer Gradientenelution und in der Trennung von Multikomponentengemischen (24).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedient sich das erfindungsgemäße Verfahren der annularen Chromatographie, die für eine große Vielzahl von Trennproblemen, die von der Trennung kleiner Moleküle bis zur Trennung von Biopolymeren reichen, vorgeschlagen wurde (25–51). Das ursprüngliche Konzept einer annularen Chromatographie, wie es von Martin (6) vorgeschlagen und von Fox et al. (52–54) realisiert wurde, wurde vom Oak Ridge National Laboratory weiter entwickelt, um das System unter einem bestimmten Druck zu betreiben (25; 38; 49). Die unter Druck ablaufende kontinuierliche annulare Chromatographie (P-CAC) wurde als geschlossenes System konzipiert. Zwei konzentrische Zylinder bilden einen Ring, in dem das Chromatographiemedium gepackt ist. Einsatzmaterial und Elutionsmittel werden am Kopf des Bettes kontinuierlich zugeführt. Das gesamte Bett dreht sich langsam, während das Einsatzmaterial aus einem stationären Zugang zugeführt wird und das Elutionsmittel gleichmäßig an sämtlichen Stellen im Verlauf des Rings vorhanden ist. Die Trennung der Einsatzlösung in einzelne Komponenten wird durch die Rotation des Sorptionsmittels hervorgerufen. Die abgetrennten Komponenten erscheinen als helikale Banden, die jeweils einen charakteristischen, stationären Ausgangspunkt aufweisen. Drei Faktoren besitzen einen Einfluss auf die Position des Ausgangspunkts: (a) die Elutionsgeschwindigkeit, (b) die Rotationsgeschwindigkeit des Rings und (c) der Verteilungskoeffizient.
Jeder beliebige Annularchromatograph, der im kontinuierlichen Modus betrieben werdenkann, kann erfindungsgemäß verwendet werden. Beispiele für Annularchromatographen, die sich zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, sind in der Literatur (vergl. den vorstehenden Absatz) und in folgenden Patentanmeldungen beschrieben: WO-98/45699, WO-99/28740, WO-01/388866, EP-1 134 581. Die Vorrichtungen können von der Fa. Prior, Götzis, Österreich, bezogen werden.
Im Fall der Anwendung der Annularchromatographie im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Ring mit einem speziellen Chromatographieharz gepackt, das die Trennung durch Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, kovalente Chromatographie, Größenausschlusschromatographie oder Adsorptionschromatographie ermöglicht. Die Wahl des chromatographischen Prinzips hängt von der Struktur des Proteins, der Konzentration des Proteins, der Menge und der Art der Verunreinigungen, dem gesamten Prozessströmungsschema und der Verfügbarkeit eines bestimmten Liganden ab (im letztgenannten Fall handelt es sich beim Verfahren der Wahl üblicherweise um die Affinitätschromatographie).
Die Einsatzlösung, die das denaturierte Protein (und gegebenenfalls spontan gebildete Zwischenprodukte und Aggregate) enthält, wird kontinuierlich dem rotierenden Ring, der mit dem Chromatographieharz gepackt ist, zugeführt. Das Harz wird mit einem Puffer, der die Rückfaltung des Proteins fördert, perfundiert, wie nachstehend beschrieben. Während die Proteine die Säule passieren, findet der Rückfaltungsvorgang statt. Aufgrund der physikochemischen Eigenschaften (wie Molekülgröße, Hydrophobizität, zugängliche geladene und hydrophobe Gruppen, Löslichkeit und dergl.) der Zwischenprodukte werden das native Protein und die Zwischenprodukte in unterschiedlicher Weise zurückgehalten. Entsprechend ihren unterschiedlichen Retentionseigenschaften werden die unterschiedlichen Zustände des Proteins an unterschiedlichen Austrittspunkten des Rings eluiert. Der austretende Strom, der die Zwischenprodukte, möglicherweise in Form von löslichen oder suspendierten Aggregaten, enthält, wird gewonnen und zur Einsatzlösung zurückgeführt.
Bei einer alternativen Ausführungsform, die sich der Annularchromatographie bedient, wird das denaturierte Protein adsorbiert und während des Adsorptionsvorgangs rückgefaltet. Damit das Protein seine native Konformation annimmt, müssen adsorbierte Proteinmoleküle unter Bedingungen, die die Rückfaltung fördern, desorbiert werden. Die Proteinfraktionen, bei denen keine Rückfaltung stattgefunden hat, passieren die Säule und werden in einer bevorzugten Ausführungsform zurückgeführt, indem man sie der Einsatzlösung zusetzt.
Dieses Verfahren führt zu einer stöchiometrischen Umwandlung des denaturierten Proteins in dessen korrekt gefalteten nativen Zustand. Ein weiterer Vorteil besteht in der Verringerung des Prozessvolumens und der Möglichkeit, ein kontinuierliches Verfahren aufrechtzuerhalten. Um das Chromatographieharz in einer einwandfrei arbeitenden Beschaffenheit zu halten, muss es regeneriert werden. Eine Regenerationslösung wird auf das gepackte Bett in einer Position aufgesetzt, die ausreichend weit von der Einlassposition entfernt ist, um ein Vermischen der Regenerationslösung mit dem Einsatzmaterial zu vermeiden. Je nach den chemischen Eigenschaften des Chromatographieharzes handelt es sich bei dieser Lösung entweder um eine stark alkalische Lösung oder eine stark saure Lösung oder um einen chaotropen Puffer oder um ein organisches Lösungsmittel oder um einen wässrigen Puffer, der mit einem organischen Lösungsmittel ergänzt ist, oder um einen wässrigen Puffer mit einem ionischen oder nicht-ionischen Detergens. Die Regenerationslösung muss dazu befähigt sein, verschmutzte Schichten aus dem Chromatographieharz zu entfernen.
Bei einer weiteren bevorzugen Ausführungsform handelt es sich beim Chromatographieverfahren, das beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, um das simulierte Bewegtbettverfahren (SMB)-Verfahren, das erstmals in den frühen 60er Jahren von der Fa. Universal Oil Product Company entwickelt wurde (55; 56). Es wurde vorwiegend auf Trennungen im industriellen Maßstab angewandt, z. B. auf die Trennung von Xylolen oder die Trennung von Fructose und Glucose. Durch Verwendung eines geeigneten Systems aus Adsorptionsmittel und Eluat wird ein Einsatzmaterialstrom in zwei Entnahmeströme aufgetrennt, die die reinen Komponenten eines binären oder pseudobinären Gemisches enthalten. Das SMB-Verfahren unterteilt eine große Säule in eine endliche Anzahl von kleinen Abschnitten, zwischen denen sich Entnahmerohre befinden. Diese Rohre sind mit Einlässen und Auslässen in einer zyklischen Art und Weise über ein speziell konstruiertes Drehventil verbunden. Ein Schalten des Drehventils zu einem definierten Zeitpunkt simuliert einen Gegenstrom. Hidajat et al., 1986 (57), haben gezeigt, dass das SMB-Verfahren gleichwertig mit dem TMB-Verfahren ist. Für SMB-Anwendungen kann die große Säule durch eine Anzahl von kleineren Säulen ersetzt werden. Es gibt Einlässe oder Auslässe für die Einsatzlösung, den Elutionspuffer, den Extrakt und das Raffinat, die als Knoten ("nodes") bezeichnet werden, die die Anordnungen der Säule in vier Abschnitten, die auch als Zonen bezeichnet werden, unterteilen. Spezielle Ventile ermöglichen den Strom der Flüssigkeit in nur einer Richtung. Die Einlässe und Auslässe sind in einer vorher definierten Art und Weise angeordnet. Diese Knoten werden in der gleichen Richtung, wie die Flüssigkeit strömt, geschaltet oder die Säulen werden entgegen dieser Richtung in einem definierten Zeitabstand geschaltet. Dadurch ergibt sich ein Gegenstrom einer festen Phase und einer flüssigen Phase.
Beim SMB-Verfahren wird die Erfindung folgendermaßen durchgeführt:
Zum Zeitpunkt t₀ wird die Einsatzlösung, die das denaturierte Protein und die Zwischenprodukte enthält, kontinuierlich zwischen den Zonen II und III injiziert. Die Zonen werden in analoger Weise zum echten Bewegtbett definiert: in Zone I wird die Flüssigkeit eingeleitet, zwischen den Zonen I und II wird der Extrakt gewonnen, zwischen den Zonen II und III wird das Einsatzmaterial eingeleitet, zwischen den Zonen III und IV wird das Raffinat gewonnen. Dabei ist die Komponente A (die Aggregate) als die am wenigsten adsorbierbare Fraktion definiert und die Komponente B (das rückgefaltete Protein, einschließlich der Zwischenprodukte und zusätzlicher verunreinigender Proteine) als die stärker zurückgehaltene Komponente. Die Einsatzlösung wird durch das Elutionsmittel in die Zone III gedrängt. Die Komponente A (am wenigsten adsorbierbar) wandert schneller als die Komponente B (stark adsorbiert oder zurückgehalten). Bevor die Komponente A die Zone IV erreicht, wird ein Teil der Proteinlösung durch den Raffinatauslass entnommen. Der restliche Teil wird in die Zone IV transportiert. Unmittelbar bevor die Front der Komponente B den Raffinatauslass erreicht, müssen die Einlässe und Auslässe in die nächste Position geschaltet werden, um eine Verunreinigung des Raffinats zu vermeiden. Das Schalten muss in der gleichen Richtung wie der Flüssigkeitsstrom erfolgen, während die Säule stationär im Raum verbleibt. Die gesättigten Säulen in Zone II werden durch frisches Elutionsmittel gereinigt. Das Gemisch, das aus der Zone II strömt, wird mit der Einsatzlösung vermischt und in die Zone III transportiert. In diesem Abschnitt wird die Komponente A durch die Komponente B verdrängt. Die rascher wandernde Komponente A erreicht erneut den Raffinatauslass. Bevor die Komponente B am Raffinatauslasspunkt durchbricht, erfolgt ein Schalten in den dritten Zustand. Ein vollständiger Zyklus ist nach dem vierten Schalten beendet, und zwar unter der Annahme der einfachsten Konfiguration eines SMB oder TMB.
Es ergibt sich eine scheinbare Rotation der Säulen um 360°. Der zyklische stationäre Zustand des Systems wird nach mehreren vollständigen Zyklen erreicht. Am Extrakt- und Raffinatauslass können die Desorptions- und Durchbruchsfronten der Komponenten A und B gesammelt werden. Die Zwischenprodukte (Komponente B) werden kontinuierlich in die Einsatzlösung zurückgeleitet.
Was die Zusammensetzung der Einsatzlösung betrifft, so stehen für zahlreiche Proteine von industriellen Wert Richtlinien zur Definition der Parameter, die die Rückfaltung fördern, in der Literatur bereit (11; 12; 58). Für ein neues Protein von Interesse können je nach dem spezifischen Protein die Zusammensetzung der Einsatzlösung in seriellen Experimenten unter Durchführung von absatzweisen Verdünnungsexperimenten festgelegt und optimiert werden. Die erhaltenen Bedingungen werden auf eine Chromatographiesäule übertragen. Die Elutionspositionen für verschiedene Proteinformen, d. h. die rückgefaltete Form, die Zwischenform und die Aggregatform, werden festgelegt. Der geeignete SMB-Vorgang wird sodann auf der Grundlage dieser Werte konzipiert.
Die Einsatzlösung enthält neben Puffersubstanzen Komponenten, die die Dissoziation der rückgeführten Aggregate fördern, z. B. chaotrope Mittel, wie Harnstoff, Guanidiniumchlorid, Natrium- und/oder Kaliumthiocyanat, und Reduktionsmittel, wie Mercaptoethanol, Dithiothreit und Monothiogylcerin. Geeignete Zusammensetzungen und Bedingungen sind aus dem Stand der Technik bekannt und wurden ausführlich in der Literatur beschrieben (11; 12; 58).
Ähnlich wie die Zusammensetzung der Einsatzlösung können die chromatographischen Prozessparameter, z. B. Fließgeschwindigkeit des Einsatzmaterials, Fließgeschwindigkeit des Eluats, Einsatzkonzentration, Säulenlänge und -durchmesser und dergl. je nach dem individuellen Protein bestimmt und optimiert werden. Eine Voraussetzung für die Trennung besteht darin, dass eine unterschiedliche Selektivität für die Aggregate, die Zwischenprodukte und die rückgefaltete Form des Proteins vorliegt. Die aggregierten Formen und die Zwischenprodukte unterscheiden sich vom nativen Molekül zumindest in Bezug auf Größe, Hydrophobizität und Ladung.
Je nach der Art der chromatographischen Trennung wird das Rückführverhältnis (Rückflussverhältnis) eingestellt. Für adsorptive Trennverfahren, wie Ionenaustauschchromatographie und Adsorptionschromatographie, kann die Einsatzlösung in beliebigem Umfang mit der Lösung, die die rückgeführten Aggregate enthält, verdünnt werden. Das Rückführverhältnis (Rückflussverhältnis) hängt vom Eluatstrom der Aggregate ab. Bei Größenausschlussverfahren ist die Menge des rückgeführten Einsatzmaterials kritisch, da bei diesen Verfahren die Trennung stark durch die Fließgeschwindigkeit des Einsatzmaterials beeinflusst wird. Bei diesen Verfahren muss darauf geachtet werden, dass die Menge des Einsatzmaterials niemals ein Drittel des Gesamtvolumens der Säule übersteigt. Für kritische Trennprobleme ist diese Menge wesentlich geringer. Somit muss eine Konzentrationsstufe nach der Gewinnung der eluierten Aggregate eingeschoben werden. Dabei kann es sich um ein herkömmliches Ultrafiltrationssystem handeln.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Matrixgestützte Rückfaltung von α-Lactalbumin durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Superdex 75 Prep.
2: Kontinuierliche Rückfaltung von Lactalbumin durch Größenausschlusschromatographie.
3: Schematische Darstellung der experimentellen Anordnung für eine kontinuierliche Rückfaltung durch Annularchromatographie und Rückführung von Aggregaten.
4: Umkehrphasen-HPLC von Fraktionen aus einer matrixgestützten Rückfaltung mit HIC.
5: Matrixgestützte Rückfaltung von rHuAFP an Sephacryl 200HR.
Beispiel 1
Kontinuierliche Rückfaltung von α-Lactalbumin durch matrixgestützte Rückfaltung bei Gelpermeationschromatographie

a) Vor Übertragung des Verfahrens auf eine kontinuierliche Betriebsweise wurde die Rückfaltung an einem herkömmlich gepackten Bett unter Verwendung einer Superdex 75 PrepGrade-Säule der Fa. Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) getestet. α-Lactalbumin wurde in einem 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,5, der mit 6 M Guanidinium-hydrochlorid und 20 mM Dithiothreit ergänzt war, gelöst. Diese Bedingungen induzieren eine vollständige Denaturierung des Proteins und ein Aufspalten von Disulfidbrücken zu freien Sulfhydrylgruppen. Die Proteinkonzentration betrug 3,7 mg/ml. Eine Superdex 75 PrepGrade-Säule mit einem Innendurchmesser von 16 mm und einer Höhe von 350 mm wurde gepackt und 1 ml Einsatzmaterial (reduziertes α-Lactalbumin) wurde injiziert, nachdem die Säule mit einem 50 mM Tris-Puffer, der mit 2 mM Cystein, 2 mM Cystin und 10 mM CaCl₂ mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 cm/h äquilibriert worden war, injiziert. Beim Durchlaufen der Säule wurden die rückgefalteten Proteine von den Aggregaten getrennt (1). Das native Protein und die Aggregate wurden durch analytische Größenausschlusschromatographie und RP-HPLC analysiert. Die Rückfaltungsausbeute betrug etwa 26 %. Durch Zugabe von 0,25 M L-Arginin zum Rückfaltungspuffer wurde die Ausbeute auf 40 % erhöht.

1 zeigt die matrixgestützte Rückfaltung von α-Lactalbumin durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Superdex 75 PrepGrade. Das aus der Säule ausströmende Produkt wurde kontinuierlich bei 280 nm überwacht.

b) Für die kontinuierlichen Rückfaltungsexperimente wurden die gleichen Proteinlösungen und Puffer verwendet. Das Superdex 75 PrepGrade-Chromatographiemedium wurde auf ein ringförmiges Chromatographiesystem, PCAC der Fa. Prior Separation Technology, Götzis, Österreich, gepackt (P-CAC = Preparative Continuous Annular Chromatograph). Die P-CAC-Vorrichtung besteht aus zwei konzentrischen Zylindern, die einen Ring bilden, in dem die stationäre Phase gepackt ist. Der äußere Zylinder weist einen Durchmesser von 15 cm und der innere einen Durchmesser von 14 cm auf, was eine Ringbreite von 0,5 cm ergibt. Der obere Teil des äußeren Zylinders ist aus Glas und der untere Teil aus Polypropylen gefertigt. Der innere Zylinder ist aus Polypropylen gefertigt und ist kürzer als der äußere Zylinder, so dass oben ein Kopfbereich verbleibt. Beide Zylinder sind mit einem Kopf aus PEEK (Polyetheretherketon) verschlossen, durch den Elutionsmittel- und Einsatzströme eingeführt werden. Der Einsatzstrom wurde oben am Gelbett durch ein Festbettventil, dessen Spitze sich innerhalb der Schicht der Glasperlen befand, gepumpt. Am Boden der Anlage sind die zwei Zylinder auf einer Platte aus rostfreiem Stahl befestigt, die 90 Ausgangslöcher enthält, die mit einem Nylon-Filter (Porengröße 11 μm) bedeckt sind. Der Boden der rotierenden Säule ist mit einem fixierten Schleifring aus Teflon verbunden, der ebenfalls 90 Ausgangsöffnungen enthält, die mit einem kurzen Abschnitt eines Tygon-Schlauches (Norton Performance Plastic Corporation, Akron, Ohio, USA) verbunden sind. Die Ausgangsöffnungen sind gleichmäßig in Abständen von 4° über den Ring verteilt. Die Säule wurde in einer Höhe von 35 cm mit Superdex 75 PrepGrade gepackt. Das Bett von Glasperlen wies eine Höhe von 2,6 cm auf.

Das System war zusätzlich mit einer Pumpe zur Rückführung der Aggregate in die Einsatzlösung ausgestattet. Die Übertragung einer absatzweisen Trennung in eine kontinuierliche Trennung wird durch Umwandlung der Elutionszeit (t) und der Winkelgeschwindigkeit (ω) in eine anguläre Verdrängung (θ) durchgeführt. θ = ω·t
Aus dieser Berechnung lässt sich der Ausgangspunkt der verschiedenen abgetrennten Komponenten bestimmen.
Anschließend wurde der Rückfaltungsvorgang kontinuierlich durchgeführt. Eine Rotationsgeschwindigkeit von 250°/h wurde realisiert und die Fließgeschwindigkeit des Elutionsmittels betrug 30 cm/h. Eine Fließgeschwindigkeit des Einsatzmaterials von 0,15 ml/min wurde realisiert. Das nach kontinuierlichem Rückfalten von Lactalbumin durch Größenausschlusschromatographie erhaltene Chromatogramm ist in 2 dargestellt.
Nachdem die Trennung einen stationären Zustand erreicht hatte, wurde mit dem Sammeln der Fraktionen, die die Aggregate enthalten, begonnen. Eine kontinuierliche Konzentration wurde eingeleitet, nachdem 50 ml gesammelt worden waren. Proben wurden entnommen und die Menge an aggregiertem Protein und nativem Protein wurden bestimmt.
Das aus diesen Öffnungen, an denen die Aggregate eluiert werden, eluierte Produkt wurde kontinuierlich gesammelt und durch tangentiale Fließfiltration unter Verwendung eines Millipore-Tangentialfluss-Filtrationssystems mit Biomax 5K-Membranen eingeengt. Die Konzentration wurde so eingestellt, dass das Verhältnis zwischen ursprünglichem Einsatzmaterial und rückgeführtem Einsatzmaterial 2:1 betrug. Eine schematische Darstellung der experimentellen Anordnung für die kontinuierliche Rückfaltung durch Annularchromatographie und Rückführung der Aggregate ist in 3 dargestellt: 1 bezeichnet die Zufuhrpumpe, die das reduzierte Lactalbumin liefert; 2 den Mischer zum Mischen von frischem Einsatzmaterial mit rückgeführtem Einsatzmaterial nach Einengen durch tangentiale Strömungsfiltration; 3 die Reaktionsschleife zur vollständigen Reduktion von rückgeführten Aggregaten; 4 die Eluatpumpe für das ringförmige Chromatographiesystem; 5 das ringförmige Chromatographiesystem; 6a die Sammelvorrichtung, bestehend aus einer einfachen Glasflasche, 7 eine Tangentialstrom-Filtrationsvorrichtung; 8 ein Gefäß zum Sammeln von konzentrierten Aggregaten und 9 die Rückführpumpe.
Nachdem das System den Gleichgewichtszustand erreicht hatte, wurde der Rückfaltungswirkungsgrad bei einer Proteinkonzentration von 3,7 mg/ml von 26 % ohne Rückführung auf > 95 % mit Rückführung erhöht.
Beispiel 2
Kontinuierliche Rückfaltung von humanem α-Fetoprotein (AFP) mit dem ringförmigen Chromatographiesystem PCAC und Östradiol-sepharose
Humanes α-Fetoprotein wurde gemäß den Angaben von Boismenu et al. (1997) in Escherichia coli exprimiert. Die Zellen wurden in 10 × 5 Liter-Schüttelkolben expandiert und mit einer Becherzentrifuge geerntet. Die resuspendierten Zellen wurden mit einem Hochdruck-Homogenisator bei 500 bar zerlegt. Das Homogenisat wurde durch Zentrifugation mit 10 000 g geklärt und das Sediment, das die Einschlusskörper enthielt, wurde in 6 M Harnstoff unter heftigem Rühren gelöst. Diese Lösung wurde partiell durch Verdünnung rückgefaltet. Die partiell rückgefaltete Lösung wurde ferner durch eine kontinuierliche Adsorption/Desorption an Östradiol-sepharose bearbeitet. Die Östradiol-sepharose wurde gemäß den Angaben von Feng et al. (1999) hergestellt und in den Annularchromatographen gepackt. Es wurde der gleiche Annularchromatograph wie in Beispiel 1 verwendet. Das rückgefaltete AFP wurde an die Östradiol-sepharose gebunden und konnte in konzentrierter Form eluiert werden, während der nicht-rückgefaltete Teil sich im Durchgangsstrom befand und in die Einsatzlösung rückgeführt wurde. Um eine übermäßige Verdünnung des Einsatzmaterials zu vermeiden, wurde die rückgeführte Lösung durch Tangentialstromfiltration eingeengt. Harnstoff wurde zugesetzt, um die chaotrope Aktivität in der Einsatzlösung zu ergänzen.
Beispiel 3
Kontinuierliche Rückfaltung von Lactalbumin an Sorptionsmitteln für die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC)
Rinder-Lactalbumin wurde in 50 mM Tris/HCl, 10 mM CaCl₂, pH-Wert 7,0. gelöst und mit 6 M Guanidinium-hydrochlorid und 250 mM β-Mercaptoethanol denaturiert. Dieser Vorgang wurde bei Raumtemperatur bei einer Konzentration von 5 mg/ml durchgeführt. Die Rückfaltung fand am HIC-Sorptionsmittel statt. Als ein Beispiel wurde Macroprep Methyl der Fa. BioRad (Hercules, CA, USA) gewählt. Vor dem Aufsetzen des denaturierten Lactalbumins war die Säule mit 1,5 M Ammoniumsulfat äquilibriert worden. Das Ammoniumsulfat wurde in einem Puffer mit 50 mM Tris/HCl, 10 mM CaCl₂, 2 mM Cystein/Cystin, pH-Wert 7,0, gelöst. Festes Ammoniumsulfat wurde zu der denaturierten Proteinlösung zum Erreichen einer Endkonzentration von 1,5 M gegeben. Sodann wurden 2,5 ml der denaturierten Proteinlösung, die mit Ammoniumsulfat versetzt war, auf eine Säule von 14 cm Länge und 1,0 cm Innendurchmesser mit Methylsepharose aufgesetzt. Die Säule wurde mit einer linearen Geschwindigkeit von 100 cm/h betrieben. Das aus der Säule ausströmende Produkt wurde bei 280 nm überwacht. Eine Verweilzeit des Proteins von 25 min reichte aus, um ein rückgefaltetes Protein mit einem Puffer aus 50 mM Tris/HCl, 10 mM CaCl₂, 2 mM Cystein/Cystin, pH-Wert 7,0, zu eluieren. Die Säule wurde mit einer Lösung von 20 % Ethanol in Wasser regeneriert. Der Peak enthielt das restliche α-Lactalbumin im ungefalteten Zustand.
Die Rückfaltung wurde durch Umkehrphasen-HPLC geprüft. Eine Analyse der verschiedenen Faltungszustände wurde unter Verwendung eines Acetonitril/Wasser-Puffersystems mit einem Gehalt an 0,1 % Trifluoressigsäure durchgeführt. Als stationäre Phase diente eine Jupiter C4-Säule mit 5 μm Teilchengröße und einem Porendurchmesser von 300 Å.
Es wurde eine 150 mm-Säule mit einem Innendurchmesser von 2 mm verwendet. Der folgende Gradient wurde verwendet: 35–60 % Acetonitril, 15 Minuten; 60–95 % Acetonitril, 5 Minuten; und 95 %, 2 Minuten. Sämtliche Läufe wurden an einem Agilent LC 1100-System durchgeführt. Die Umkehrphasen-HPLC von Fraktionen der matrixgestützten Rückfaltung mit HIC sind in 4 dargestellt.
Diese Rückfaltungsbedingungen wurden auf eine kontinuierliche Annularchromatographie übertragen. Die Methylsepharose wurde in einen Annularchromatographen der Fa. Prior Separations, Götzis, Österreich, gepackt.
Das System wurde in Beispiel 1 beschrieben. Es wurde eine Säulenhöhe von 14 cm gewählt. Die Ringbreite betrug 0,5 cm. In den Positionen 0–12° wurde das denaturierte α-Lactalbumin eingeführt. In der Position 200° wurde das Lactalbumin mit einem Puffer aus 50 mM Tris/HCl, 10 mM CaCl₂, 2 mM Cystein/Cystin, pH-Wert 7,0, eluiert. In der Position 300° wurde die Säule mit einer Lösung von 20 Ethanol in Wasser regeneriert. Das Regenerat wurde einer kontinuierlichen Diafiltration durch ein Millipore-System unter Verwendung eines Biomax 5-Filters unterzogen. Als Diafiltrationspuffer diente 50 mM Tris/HCl, 10 mM CaCl₂, pH-Wert 7,0, mit 6 M Guanidiniumhydrochlorid, 250 mM β-Mercaptoethanol und 1,5 M Ammoniumsulfat. Die diafiltrierte Lösung wurde in das Einsatzmaterial rückgeführt und die kontinuierliche Rückfaltung wurde durchgeführt, bis Bedingungen eines stationären Zustands erreicht waren.
Beispiel 4
Kontinuierliche Rückfaltung und Trennung von nativem rekombinantem humanem α-Fetoprotein (rHuAFP), Faltungszwischenprodukten und Aggregaten
rHuAFP ist ein komplexes Protein, das 16 Disulfidbrücken enthält. Es wird in E. coli als Einschlusskörper erzeugt.

a) Vor Übertragung des Verfahrens auf einen kombinierten, kontinuierlichen Modus wurden die Rückfaltungs- und Abfangstufe von rHuAFP an herkömmlichen Chromatographiesäulen, die mit Sephacryl 200HR und Q-Sepharose XL der Fa. Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala Schweden) gepackt waren, getestet.

Die Einschlusskörper mit einem Gehalt an rHuAFP wurden in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,5, 6 M Guanidinium-hydrochlorid und 100 mM DTT gelöst. Die endgültige rHuAFP-Konzentration betrug etwa 0,5 mg/ml und die Konzentration an Gesamtprotein einschließlich Proteinverunreinigungen aus Wirtszellen betrug etwa 5 mg/ml.
Die Rückfaltung des Proteins wurde durch matrixgestützte Rückfaltung unter Anwendung von Gelpermeationschromatographie durchgeführt. 1 ml Einsatzlösung wurde auf eine Säule mit einem Innendurchmesser von 26 mm und einer Länge von 260 mm, die mit Sephacryl 200HR gepackt war, aufgesetzt. Die Strömungsgeschwindigkeit des Äquilibrationspuffers PBS (pH-Wert 7,4) betrug 11 cm/h. Beim Durchlaufen der Säule wurden die chaotropen und reduzierenden Komponenten von rHuAFP abgetrennt und beim Protein setzte die Rückfaltung ein (vergl. 5, die die matrixgestützte Rückfaltung von rHuAFP an Sephacryl 200HR zeigt).
Nach der Rückfaltung liegen nur 20 % des Proteins in der nativen Konformation vor, während das restliche Protein aus stabilen Rückfaltungszwischenprodukten, die sich aus nicht-nativen Disulfidbrücken und irreversiblen Aggregaten ergeben, besteht. Die Fraktionen wurden gesammelt und durch SDS-PAGE und Western-Blot analysiert.
In der nächsten Stufe wurde das Protein durch Ionenaustauschchromatographie (Q-Sepharose XL) abgefangen.
Die gesammelten Proteinfraktionen wurden auf eine Q-Sepharose XL-Säule (10 mm Innendurchmesser, 50 mm Höhe), die mit PBS äquilibriert war, aufgesetzt. Faltungszwischenprodukte traten nicht in Wechselwirkung mit der Matrix und wurden im durchströmenden Produkt eluiert. Natives rHuAFP wurde am Harz gebunden und in einem Stufengradienten PBS + 0,2 M NaCl eluiert. Aggregate wurden in einem zweiten Stufengradienten mit PBS + 0,5 M NaCl eluiert. Das Chromatogramm und die Analyse der Fraktionen sind in 6 dargestellt.

b) Für die kontinuierlichen Rückfaltungsexperimente wurden die gleichen Proteinlösungen, Gele und Puffer wie in a) verwendet.

Zwei Chromatographiemedien wurden in ein ringförmiges Chromatographiesystem, PCAC, der Fa. Prior Separation Technology, Götzis, Österreich, gepackt. Die untere Schicht bestand aus 5 cm Q-Sepharose XL und die obere Schicht aus 35 cm Sephacryl 200HR.
Das System wurde mit PBS mit einer linearen Geschwindigkeit von 20 cm/h äquilibriert. Die Rotationsgeschwindigkeit des Zylinders betrug 250°/h.
Der Einsatzmaterialstrom wurde oben auf das Gelbett durch ein fixiertes Zufuhrventil gepumpt, dessen Spitze sich innerhalb der Schicht der Glasperlen befand. PBS + 0,2 M NaCl wurde durch eine weitere Düse mit einer Verschiebung von –60° aus der Zufuhrdüse oben auf dem Gelbett zugepumpt.
In der ersten Gelschicht (Sephacryl 200HR) setzte die Rückfaltung des denaturierten und reduzierten Proteins ein. Hochmolekulare Aggregate wurden von rückgefaltetem, monomerem, nativem rHuAFP und monomeren Faltungszwischenprodukten abgetrennt. Nach Verlassen der ersten Gelschicht wurden die Proteine in der zweiten unteren Gelschicht (Q-Sepharose XL) abgefangen. Natives monomeres rHuAFP wurde kontinuierlich mit PBS + 0,2 M NaCl eluiert. Aggregate wurden in der Salzfraktion mit einem Gehalt an 6 M Guanidinium-hydrochlorid und 0,1 M DTT eluiert.
Proben wurden entnommen und die Mengen an aggregiertem Protein und nativem Protein wurden durch SDS-PAGE bestimmt.
Literatur

1 Horwich, A.L., Neupert, W. and Hartl, F.U. (1990) Proteincatalysed protein folding Trends Biotechnol, 8, 126–31.
2 Noiva, R. (1994) Enzymatic catalysis of disulfide formation Protein Expr Purif, 5, 1–13.
3 Schonbrunner, E.R., Schmid, F.X., Mayer, S., Tropschug, M., Fischer, G. and Takahashi, N. (1992) Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase improves the efficiency of protein disulfide isomerase as a catalyst of protein folding Catalysis of protein folding by cyclophilins from different species Proc Natl Acad Sci USA, 89, 4510–3.
4 Lilie, H., Lang, K., Rudolph, R., Buchner, J., Schonbrunner, E.R., Schmid, F.X., Mayer, S., Tropschug, M., Fischer, G. and Takahashi, N. (1993) Prolyl isomerases catalyze antibody folding in vitro Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase improves the efficiency of protein disulfide isomerase as a catalyst of protein folding Catalysis of protein folding by cyclophilins from different species Protein Sci, 2, 1490–6.
5 Jager, M., Pluckthun, A., Yang, H.P., Zhong, H.N., Zhou, H.M., Lilie, H., Lang, K., Rudolph, R., Buchner, J., Schonbrunner, E.R., Schmid, F.X., Mayer, S., Tropschug, M., Fischer, G. and Takahashi, N. (1997) The rate-limiting steps for the folding of an antibody scFv fragment Catalysis of the refolding of urea denatured creatine kinase by peptidyi-prolyl cis-trans isomerase Prolyl isomerases catalyze antibody folding in vitroPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase improves the efficiency of protein disulfide isomerase as a catalyst of protein foldingCatalysis of protein folding by cyclophilins from different species FEBS Lett, 418 106–10.
6 Yang, H.P., Zhong, H.N., Zhou, H.M., Lilie, H., Lang, K., Rudolph, R., Buchner, J., Schonbrunner, E.R., Schmid, F.X., Mayer, S., Tropschug, M., Fischer, G. and Takahashi, N. (1997) Catalysis of the refolding of urea denatured creatine kinase by peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Prolyl isomerases catalyze antibody folding in vitro Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase improves the efficiency of protein disulfide isomerase as a catalyst of protein folding Catalysis of protein folding by cyclophilins from different species Biochim Biophys Acta, 1338, 147–50.
7 Kane, J.F. and D.L., H. (1988) Formation of recombinant inclusion bodies in Escherichia coli TIBTECH, 6, 95–100. 8 Buchner, J. and Rudolph, R. (1991) Routes to active proteins from transformed microorganisms Current Opinion Biotechnology, 2, 532–538.
9 Halenbeck, R., Kawasaki, E., Wrin, J. and Koths, K. (1989) Renaturation and purification of biologicla active recombinant human macrophage colony-stimulating factor expressed in E. coli Bio/technology, 7, 710–715.
10 Kiefhaber, T., Rudolph, R., Kohler, H.H. and Buchner, J. (1991) Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation Biotechnology (NY), 9, 825–9.
11 Lilie, H., Schwarz, E. and Rudolph, R. (1998) Advances in refolding of proteins produced in E. coli Curr Opin Biotechnol, 9, 497–501.
12 Clark, E.D. (2001) Protein refolding for industrial processes Curr Opin Biotechnol, 12, 202–7.
13 Yoshi, H., furuta, T., Yonehara, T., ito, D. and Linko, P. (2001) Refolding of denaturated and reduced lysozyme with cysteine/cystine red/ox solution in diafuiltration J Chem Eng Japan, 34, 211–215.
14 Buchner, J., Brinkmann, U. and Pastan, I. (1992) Renaturation of a single-chain immunotoxin facilitated by chaperones and protein disulfide isomerase Biotechnology (NY), 10, 682–5.
15 Carlson, J.D. and Yarmush, M.L. (1992) Antibody assisted protein refoiding Biotechnology (NY), 10, 86–91.
16 Guise, A.D. and Chaudhuri, J.B. (1998) Recovery and reuse of the molecular chaperone GroEL for in vitro protein refolding Biotechnol Prog, 14, 343–6.
17 Kohler, R.J., Preuss, M. and Miller, A.D. (2000) Design of a molecular chaperone-assisted protein folding bioreactor Biotechnol Prog, 16, 671–5.
18 Shimizu, H., Fujimoto, K. and Kawaguchi, H. (2000) Renaturation of reduced ribanuclease A with a microsphereinduced refolding system Biotechnol Prog, 16, 248–53.
19 Katoh, S. and Katoh, Y. (2000) Continuous refolding of lysozyme with fed-batch addition of denatured protein solution 2000, 35, 1119–1124.
20 Phadtare, S., Fisher, M.T. and Yarbrough, L.R. (1994) Refolding and release of tubulins by a functional immobilized groEL column Biochim Biophys Acta, 1208, 189–92.
21 Altamirano, M.M., Golbik, R., Zahn, R., Buckle, A.M. and Fersht, A.R. (1997) Refolding chromatography with immobilized minichaperones Proc Natl Acad Sci USA, 94, 3576–8.
22 Altamirano, M.M., Garcia, C., Possani, L.D. and Fersht, A.R. (1999) Oxidative refolding; chromatography: folding of the scorpion toxin Cn5 Nat Biotechnol, 17, 187–91.
23 Preston, N.S., Baker, D.J., Bottomley, S.P. and Gore, M.G. (1999) The production and characterisation of an immobilised chaperonin system Biochim Biophys Acta, 1426, 99–109.
24 Heuer, C., Kniep, H., Falk, T. and Seidel-Morgenstern, A. (1997) Vergleich verschiedener verfahrenstechnischer Konzepte der präparativen Flüssigchromatographie Chemie Ingenieur Technik, 69, 1535–1546.
25 Begovich, J.M., Byers, C.H. and Sisson, W.G. (1983) A highcapacity pressurized continuous chromatograph Sep. Sci. Tech., 18, 1167–1191.
26 Begovich, J.M. and Sisson, W.G. (1984) A rotating annular chromatograph for continuous separations AlChE Journal, 30, 705–710.
27 Bloomingburg, G.F., Carta, G., Bauer, J.S. and Byers, C.H. (1991) Continuous separation of proteins by annular chromatography Ind. Eng. Chem. Res., 30, 1061–1067.
28 Bloomingburg, G.F. and Carta, G. (1994) Separation of protein mixtures by continuous annular chromatography with step elution Chem. Eng. J., 55, B19–B27.
29 Buchacker, A., Iberer, G., Jungbauer, A., Schwinn, H. and Josic, D. (2000) Continuous removal of protein aggregates by annular chromatography Biotechnology Progress, 17, 140–149.
30 Byers, C.H., Sisson, W.G., DeCarli, I.-J.P. and Carta, G. (1989) Pilot-scale studies of sugar separations by continuous chromatography Appl. Biochem. Biotechnol., 20–21, 635–54.
31 Byers, C.H., Sisson, W.G., De Carli II, J.P, and Carta, G. (1990) Sugar separations on a pilot scale by continuous annular chromatography Biotechnol. Prog., 6, 13–20.
32 Canon, R.M., Begovich, J.M. and Sission, W.G. (1980) Pressurized continuous chromatography Separation Science and Technology, 15, 655–678.
33 Canon, R.M. and Sisson, W.G. (1978) Operation of an improved, continuous annular chromatograph J. Liqu. Chrom., 1, 427–441.
34 Carta, G., DeCarli, J.P., Byers, C.H. and Sisson, W.G. (1989) Separation of metals by continuous annular chromatography with step elution Chem. Eng. Com., 79, 207–227.
35 Carta, G. and Byers, C.H. (1989) Novel Applications of Continuous Annular Chromatography. New Directions in Sorption technology. Keller, G.E., Yang, R. T., Butterworth.
36 Dalvie, S.K., Gajiwala, K.S. and Baltus, R.E. (1990) Mathematical model of a rotating annular continuous size exclusion chromatograph. In Hamel, J.-F.P., Hunter, J.B. and Sikdar, S.K. (eds.), Downstream Processing and Bioseparation, pp. 268–284.
37 Reissner, K., Bart, H.J., Prior, A., Wolfgang, J. and Byers, C.H. (1997) Preparative desalting of bovine serum albumin by continuous annular chromatography J. Chromatogr., 763 49–56.
38 Scott, C.D., Spence, R.D. and Sisson, W.G. (1976) Pressurized, annular chromatograph for continuous separations J. Chromatogr., 126, 381–400.
39 Uretschläger, A., Einhauer, A. and Alois, J. (2000) Continuous separation of green fluorescent protein by annular chromatography J. Chrom. A, in press.
40 Wolfgang, J., Prior, A., Bart, H.J., Messenböck, R.C. and Byers, C.H. (1997) Continuous separation of carbohydrates by ion-exchange chromatography Sep. Sci. Tech., 32, 71–82.
41 Yamanishi, Y. and Yonemoto, T. (1997) Complete separation of amino acids using continuous rotating annular ion-exchange chromatography with partial recycle of effluent In. Eng. Chem. Res., 36, 3809–3814.
42 Tagahashi, Y. and Goto, S. (1994) Continuous separation of fructooligosaccharides using an annular chromatograph Sep. Sci. Techn., 29.
43 Takahashi, Y. and Goto, S. (1991) Continuous separation using an annular chromatograph with non isocratic elution J. Chem. Eng., 24, 121–123.
44 Takahashi, Y. and Goto, S. (1991) Continuous separations of amino acids by using an annular chromatograph with rotating inlet and outlet Sep. Sci. Tech., 26, 1–13.
45 Takahashi, Y. and Goto, S. (1991) Continuous concentration of single component using an annular chromatograph J. Chem. Eng., 24, 460–465.
46 Takahashi, Y. and Goto, S. (1992) Continuous separation and concentration of proteins using an annular chromatograph J. Chem. Eng. 25. 403–407.
47 Takahashi, Y. and Goto, S. (1994) Continuous separation of fructooligosaccharides using an annular chromatograph Sep. Sci. Techn., 29, 1311–1318.
48 Sisson, W.G., Begovich, J.M., Byers, C.H. and Scott, C.D. (1988) Continuous chromatography CHEMTECH, 498–501.
49 Sisson, W.G., Scott, C.D., Begovich, J.M. and Byers, C.H. (1989) Application of continuous annular chromatography to size exclusion separations Prep. Chrom., 1 (2), 139–162.
50 Goto, M. and Goto, S. (1987) Continuous separation using an annular chromatograph with rotating inlet and outlet J. Chem. Eng., 20, 598–603.
51 Kitakawa, A., Yamanishi, Y., Yonemoto, T. and Tadaki, T. (1995) Modeling and simulation of continuous rotating annular ionexchange chromatography for separation of amino acids Sep. Sci. Tech., 30, 3089–3110.
52 Fox, J.B., Calhoun, R.C. and Eglinton, W.J. (1969) Continuous chromatography apparatus, I. Construction J. Chromatogr. A, 43, 48–54.
53 Fox, J.B. and Nicholas, R.A. (1969) Continuous chromatography apparatus, III. Application J. Chromatogr. A, 43, 61–65.
54 Fox, J.B. (1969) Continuous chromatography apparatus, II. Operation J. Chromatogr. A, 43, 55–60.
55 Broughton, D.B. (1984) Production scale separations of liquid muixtures by simulated moving-bed technology Sep. Sci. Technol., 19, 723–736.
56 Schulte, M. and Strube, J. (2001) Preparative enantioseparation by simulated moving bed chromatography J Chromatogr A, 906, 399–416.
57 Hidajat, K., ching, C. and Ruthven, D.M. (1986) Simulated countercurrent adsoption processes: A theroretical analysis of the effect of subdividing the adsorbent bed Chem. Eng. Sci., 41, 2953–2956.
58 Clark, E.D., Schwarz, E. and Rudolph, R. (1999) Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding Methods Enzymol., 309, 217–236.

Claims

Verfahren zur Rekonstitution eines rekombinanten Proteins aus einem denaturierten Zustand in seine aktive Form, bei dem eine Einsatzlösung, die das rekombinante Protein in seinen denaturierten und/oder in biologisch inaktiven Zwischenformen enthält, einem Trennverfahren unterworfen wird, bei dem das Protein unter Bedingungen rekonstituiert wird, die die Rückfaltung des Proteins fördern, und die Zwischenformen von dem rückgefalteten Protein getrennt werden, dadurch gekennzeichnet, dass die denaturierte Form und/oder die inaktiven Zwischenformen des Proteins von dem rückgefalteten Protein in kontinuierlicher oder quasikontinuierlicher Weise getrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zwischenformen, die von dem rückgefalteten Protein getrennt worden sind, wieder der Einsatzlösung zugeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Trennverfahren aus Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophober Wechselwirkungschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, kovalenter Chromatographie, Größenausschlusschromatographie und Adsorptionschromatographie ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Trennverfahren als annulare Chromatographie durchgeführt wird.