KR100930877B1 - 재조합 단백질을 그의 생물학적 활성형으로 재구성하는방법 - Google Patents

Abstract

변형된 형태 및/또는 생물학적으로 불활성인 중간체 형태의 관심있는 재조합 단백질을 포함하는 공급 용액에 상기 단백질이 단백질의 리폴딩을 촉진하고 중간체 형태가 리폴딩된 단백질로부터 분리되는 조건하에서 재구성되는 크로마토그래피 분리 과정을 수행하여, 변형된 상태에서 활성 형태로 단백질을 재구성된다. 변형된 형태 및/또는 단백질의 불활성 중간 형태는 연속적 또는 준연속 방식으로 리폴딩된 단백질로부터 분리되며, 임의적으로 공급 용액으로 재순환된다.

Description

재조합 단백질을 그의 생물학적 활성형으로 재구성하는 방법 {Method for reconstituting a recombinant protein to its biologically active form}

본 발명은 재조합 단백질의 생산 분야에 관련된다.

단백질은 산업적 적용을 위하여, 예를 들면 생물 약학적 또는 정제 화학 제품으로서의 사용을 위하여, 식물 또는 동물의 조직이나 미생물 등의 천연 원료로부터 추출 및 정제화에 의해 얻거나 재조합 DNA 기술에 의해 얻는다.

재조합 단백질을 생산하기 위해서, 관심있는 단백질을 코딩하는 cDNA를 발현 벡터로 삽입하고 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환시키고 단백질을 과잉발현시키기 위해 배양한다. 숙주세포는 박테리아, 이스트 또는 균류와 같은 미생물이나 동물 또는 식물 세포로부터 선택한다.

단백질의 과잉발현은 복잡한 현상이다. 정확한 입체구조를 얻기 위해, 단백질은, 이미 그것의 자연적 상태에서, "폴딩 헬퍼 단백질(folding helper proteins)"및 효소와 연관된다. 폴딩 헬퍼 단백질은, 또한 "샤페론(chaperones)" 또는 "미니 샤페론(minichaperonees)"으로 칭해지며, 단백질이 다양한 중간체 상태를 통과한 후 그것의 원래의 입체구조를 회복할 수 있도록 하는 복잡한 방법으로 상호작용한다. 중간체 상태의 일부는 꽤 안정적일 수 있다. 효소는 단백질의 성숙에서 이황화 결합의 빠른 형성(1; 2), 프롤릴-펩티드 결합의 이성질체화(3-6)를 촉매하거나 또는 단백질의 절단, 측쇄 변형 또는 N- 및 C-말단의 변형과 같은 그 외의 복잡한 변형을 포함한다. 단백질이 효과적으로 과잉발현될 때, 최초의 펩티드 사슬의 생산이 단백질의 폴딩보다 빨리 발생한다. 일부 단백질에 있어서, 중간체 상태는 또한 응집체를 형성할 수 있다(하기에서, 용어 "중간체 (intermediate)" 형태는 또한 응집체 형태를 포함한다).

전반적으로, 응집체 형성은 단백질의 완전한 폴딩보다 훨씬 빨리 일어난다(7; 8).

그러한 조건이 존재하는, 단백질은 세포 안에 파라결정형(paracrystalline form), 소위 "봉입체(inclusion bodies)" 또는 "굴절반사소체(refractile bodies)"로 저장된다.

단백질이 불용해성의 봉입체 형태로 존재할 때, 단백질은 단백질 분해와 같은 효소적 공격에 보호받을 수 있으므로, 단백질은 세포의 생리에 관여하지 않을 수 없다. 재조합 DNA 기술은 단백질 분비의 이러한, 예컨대 세포에 대해 독성이 있는 단백질의 생산에 대해, 변형 방법의 이점을 가지고 있다.

변형된 형태로 축적되어있는, 즉, 생물학적 활성 없는 입체구조의 상태로 축적되있는 숙주세포로부터 단백질을 얻기 위해서는 다양한 단계를 거쳐야만 그것의 정확한 리폴딩 형태로 단백질을 얻게된다. 예를 들어, 봉입체를 지닌 박테리아 세포를 분해시켜, 봉입체를 원심분리에 의해 수득한 후 카오트로피제(chaotropic agent)를 포함하는 완충액에 용해시킨다. 변형된 단백질을 이어서 그의 자연적 입체 구조의 회복을 촉진하는 환경으로 옮긴다. 그의 자연적 상태를 취하기 이전에, 그 단백질은 다양한 반-안정상태의 중간체를 통한 변이를 겪는다. 중간체는 고도로 노출된 소수성 도메인을 가지며, 이는 서로 결합하려는 경향이 있어 중간체는 응집체를 형성하려고 한다. 원칙적으로 리폴딩은 결합 형성에 반하는 과정으로서 고려될 수 있으며, 대개 이차 반응 속도론을 따르고, 반면에 단백질의 리폴딩은 1차 반응 속도론을 따른다(8).

일반적으로 이용할 수 있는 방법으로, 단백질의 리폴딩은 배취식 또는 연속적 방식 (9-13)으로 리폴딩 완충용액으로 단백질을 희석함으로써 수행할 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 배취방식 희석은 고도로 희석된 단백질과 큰 공정 용량(volumina)을 만들며, 이는 종종 산업적 공정에서의 병목이 된다.

또다른 접근에서 폴딩 경로는 샤페론 및/또는 미니샤페론, 및/또는 폴딩 경로의 특정 단계를 촉진시키는 효소를 가함으로써 생체내에서 모의 실험된다(2; 14-18). 일련의 탱크를 포함하는 복잡한 리폴딩 반응기 시스템은 리폴딩 반응을 개선하기 위해 설계되었다(19).

또다른 접근에서, 헬퍼 단백질 및 효소는 고체상에 고정된다. 이후 단백질 용액을 고정된 헬퍼 단백질 및/또는 헬퍼 효소를 포함하는 소위 팩트 베드(Packed Bed)에 통과시킨 후그것의 자연적 입체구조로 폴딩시킨다(20-23). 폴딩 헬퍼 단백질 및 효소는 화학량적인 비율로 존재해야 하므로, 이 공정은 거의 같은 양의 헬퍼 단백질이 필요하고, 헬퍼 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 최종적으로 얻은 산물 로써 생산되어야만 한다. 또한 폴딩을 개선하기 위해서, 헬퍼 단백질은 대개 관심있는 단백질과 융합시키고 이는 융합 단백질의 추가의 공정을 필요로 한다. 이러한 이유에서, 본 전략법은 매우 비용이 많이 든다.

특정 단백질 분획은 응집체 형태에서 잃어 버리므로, 프리 용액에서 또는 기질 협력 과정에서의 단백질의 리폴딩은 정량적 방법으로 변형된 단백질을 폴딩된 형태로 바꾸는 것보다 효율적이지 않다.

단백질은 자연적 입체구조로의 변화가 유리한 환경으로 그것을 옮김으로써 변형된 입체구조에서 정확하게 폴딩된 입체 구조로 리폴딩될 수 있다. 이러한 재배열 동안, 단백질은 여러 중간체 입체구조 단계를 거치며, 이는 응집체를 형성하는 경향이 있다. 각각의 단백질 및 환경적 조건에 따라, 응집체는 침전될 수 있다. 응집체가 용해적으로 남아 있는지 침전되어 있는지와 관계없이, 이 과정은 정확하게 폴딩된 단백질의 수득에 엄청난 손실을 가져온다. 일반적으로, 자연적 입체구조로의 단백질의 폴딩은 일차 반응 속도론을 따르며, 반면에 중간체로부터 응집체의 형성은 2차 또는 고차 반응 속도론을 따른다.

본 발명의 목적은 변형된 상태로부터 단백질 리폴딩하는 효율적 방법을 제공하는 것이며, 이 방법은 일반적으로 사용되는 방법의 결점을 극복할 수 있고, 헬퍼 단백질의 사용없이도 수행될 수 있다.

본 발명에 내재된 문제점의 해결책은 크로마토그래피 분리 공정이 그것의 연속적인 진행에 의해 개선될 수 있다는 고려에 기초한다. 또한, 그것은 단백질의 중간체 형태를 재순환하는 것이 재조합 단백질의 수득량을 개선시키고 공정 부피를 굉장히 감소시킬 수 있는 고농도의 농도로 수행할 수 있다고 가정을 세우고 있다.

본 발명은 연속적 또는 준연속적 크로마토그래피 방법으로 변형된 형태 및/또는 불활성 중간체 형태의 단백질이 리폴딩된 단백질로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 변형된 형태 및/또는 생물학적으로 불활성인 중간체 형태의 관심있는 재조합 단백질을 포함하는 공급 용액에 상기 단백질이 단백질의 리폴딩을 촉진하고 중간체 형태가 리폴딩된 단백질로부터 분리되는 조건하에서 재구성되는 크로마토그래피 분리 과정을 수행하여, 변형된 상태에서 활성 형태로 단백질을 재구성함으로써 생물학적으로 활성인 재조합 단백질을 얻는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 의미에 있어서 용어 " 변형된 형태(denatured form)"는 재조합 생산 과정의 산물로서, 대개 봉입체를 분해시킨 후에 얻을 수 있는 관심있는 발현된 단백질의 생물학적으로 불활성인 형태를 나타낸다.

본 발명의 의미에 있어서 용어 "중간체 형태(intermediate forms)" 또는 "중간체(intermediates)"는 단백질이 변형된 형태와 재구성된(리폴딩된) 자연적 및 생물학적으로 활성 상태의 사이를 거치는 형태를 나타낸다. 생물학적으로 불활성이거나 자연적 단백질보다 생물학적으로 낮은 활성을 갖는 중간체는 응집체 형태로 있을 수 있다(중간체 형태와 관련하여 본 명세서에서 용어 "불활성"은 단백질의 생물학적으로 완전히 활성인 형태와 비교했을 때 더 낮은 활성을 갖는 단백질의 형태를 포함한다.)

바람직한 구체예로, 리폴딩된 단백질로부터 분리된 중간체 형태를 공급 용액으로 재도입하고(재순환시키고) 이어서 추가로 적어도 1번 재구성을 공정을 거치게 한다. 본 발명의 공정에 의해 분리할 때, 중간체는 변형된 단백질 분획을 여전히 포함하고 있을 수 있다.

크로마토그래피 매질, 대개는 겔이 적절하게 수행하도록 하기 위하여 재생산되어야한다. 팩트 베드에 적용되는 재생 용액에 의해 이를 수행할 수 있다. 크로마토그래피 매질의 화학적 특성에 따라, 이 용액은 강알칼리성 용액 또는 강산성 용액 또는 카오트로피 완충액, 또는 유기 용매, 예컨대 에탄올, 또는 유기 용매로 보충된 수용성 완충액, 또는 이온성 또는 비이온성 세제로 보충된 수용성 완충액일 수 있다. 재생 용액(재생산물(regenerate))은 비가역적으로 결합된 단백질 분획을 크로마토그래피 매질로부터 제거할 수 있어야한다. 재생산물은 공급 용액 그 자체일 수 있거나 또는 공급 용액과 다르고 공급 용액과는 별개로 크로마토그래피 매질에 적용할 수 있는 것 일 수 있다.

크로마토그래피 공정에서 배출한 재생산물이 상당량의(≥10%) 중간체를 포함하는 경우에 있어서, 바람직한 구체예로, 이는 별개로 또는 중간체를 포함하는 용출액 스트림(eluate stream)과 함께 공정을 재순환시키는 것이다.

특히 바람직한 구체예로, 출발 공급 용액으로 재도입하기 전에 중간체 형태를 포함하는 용출액 및/또는 재생산물을 농축 및/또는 여과시킬 수 있다. 이에 따라 리폴딩 과정의 수득 및 생산성은 보다 개선될 수 있다. 농축은 통상의 수단, 예컨대 한외여과(가용성 중간체의 경우) 또는 정밀여과(불용성 중간체/응집체의 경우)에 의해 수행할 수 있다.

하기에서, 단백질과 관련되는, 용어 "리폴딩(refolding)"은 "변형된 상태로 부터 활성 형태로의 재구성"에 대해 사용된다.

(출발) 공급 용액은 관심있는 이종 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 수반하는 박테리아, 이스트, 균류, 식물 또는 동물세포의 발효에 의해 얻게 되는 용액이다.

본 발명에서, 공급 용액은 대개 통상적인 미생물학적 발효로부터 얻는다. 공급 용액은 봉입체로부터 얻은 것으로써 용해된 형태의 재조합 단백질을 포함한다.

공급 용액은 완충 물질외에도 재순환된 응집체의 분리를 촉진하는 성분, 예컨대 우레아, 구아니디니움 클로라이드(GuHCl), 나트륨 및/또는 칼륨 티오시아네이트와 같은 카오트로픽 제제 및 머캅토에탄올, 디티오트레이톨, 모노티오글리세롤과 같은 환원제를 포함한다. 전형적인 성분 및 조건은 당업계에 알려져 있으며, 그들은 문헌(11;12;58)에 자세히 기술되어 있다. 크기 배제 크로마토그래피의 경우에 있어서, 변형화제 및/또는 환원제를 포함하는 공급 용액을 재생 용액으로서 동시에 사용할 수 있다.

제공된 공급 용액으로부터 출발하여 본 발명의 크로마토그래피 공정동안 리폴딩를 촉진하는 조건, 즉, 적당한 리폴딩 환경을 제공하기 위하여 채택되는 방법에 에 대하여 당업자는 잘 알고 있다. 첫째, 단백질의 리폴딩을 촉진하는 조건을 얻기 위하여, 공급 용액 내에 포함되어 있는 봉입체의 용해화 및 단백질의 변형에 필요한 카오트로픽 및/또는 환원제를 완전히 또는 단백질에 의해 용인되는 범위까지 제거해야 한다. 본 발명에서, 이는 크로마토그래피 공정 동안 적합한 리폴딩 완충액, 예컨대 Tris 또는 인산염 완충액으로 상기의 제제를 세척하여 주어진 pH, 전도율, 온도의 면에서 최상의 리폴딩 환경을 제공한다(11,12, 58).

크로마토그래피 리폴딩 과정을 거치기 전에 공급 용액을 희석시켜 단백질의 부분적인 리폴딩을 수행할 수 있다.

리폴딩을 위한 최상의 조건을 보장하기 위하여, 리폴딩 완충액은 최상의 산화환원 반응 전위를 제공하고 이황화 결합의 정확한 형성을 촉진하기 위한 제제, 예컨대 산화 및 환원된 글루타티오 또는 시스틴/시스테인, 및/또는 응집을 막기 위한 제제, 예컨대 L-아르기닌, 우레아, 폴리에틸렌글리콜(11,12,58)에 의하여 보충될 수 있다.

정확하게 폴딩된 단백질로부터의 중간체 분리는 단백질의 분리에 유용한 것으로 증명된 임의의 연속 또는 준연속적 크로마토그래피 방법에 의해 달성될 수 있다.

단백질의 분리를 위해 통상적으로 사용되는 표준적인 크로마토그래피 방법의 다수는 문헌으로 알려져 있으며, 그들의 대다수가 예컨대 크로마토그래피 컬럼과 같은 상업적으로 이용가능한 설비로 적용가능하다. 분리의 원칙에 따라, 방법은 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 공유결합 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 또는 흡착 크로마토그래피로 나눌 수 있다.

원칙적으로, 이들 크로마토그래피 방법은 배취, 준연속적 또는 연속적 수행방식으로 수행될 수 있다. 배취방식에 있어서, 공급 용액은 크로마토그래피 지지제, 예컨대, 팩트 베드 또는 익스펜드 베드에 로딩하고, 단백질은 그것의 고정상에의 친화성에 따라, 강하게 체류되거나 컬럼을 통과한다. 단백질이 강하게 체류되는 경우, 비결합 물질을 세척한 후 수행 조건을 변경하여 제거할 수 있다.

배취 과정은 순차적 방식으로 여러 컬럼으로 작업하거나 " 회전식 원형 켄베이어(carousel) 크로마토그래피"로 명명되는 연속적으로 수행시키기 위하여 칼럼을 다수의 밸브에 위치시켜 준연속적 방식으로 전달될 수 있다.

준연속 또는 연속 방식으로 수행될 수 있다면 임의의 크로마토그래피 단백질 분리 방법을 본 발명에 사용할 수 있다. 당업자는 이들 방법에 대해 잘 알고 있으며, 주어진 분리 요구에 가장 적당한 것을 선택할 수 있다.

환상 크로마토그래피(annularchromatography, AC), 회전식 원형 켄베이어 크로마토그래피 (carrousel chromatography), 모사 이동층(Simulated Moving Bed)(SMB) 및 진 이동상 방식(true moving bed)(TMB) 크로마토그래피는 굉장히 널리 이용되는 연속 또는 준연속 방식으로 수행되는 크로마토그래피 분리 체계이다. SMB 및 TMB에 대하여 AC가 갖는 잇점은 구배 용출액의 적용 및 다-구성물 혼합물 분리에 있다(24).

더욱 바람직한 구체예에서 본 발명의 방법은 환상 크로마토그래피이다. 이 방법은 저분자부터 바이오폴리머 분리에 이르는 분리의 문제점의 많은 다양성에 대해 제시되었다(25-51). 마틴(59)에 의해 제시되고 폭스 등에 의해 실현된(52-54) 환상 크로마토그래프의 최초의 개념은 특정 압력하에서 시스템을 수행한 오크 릿지 국립 연구소에서 더욱 발전되었다(25; 38; 49). Pressurized-Continuous Annular Chromatograph(P-CAC)가 폐쇄 시스템으로서 설계되었다. 두 개의 동심 실린더는 고리를 만들고, 거기에 크로마토그래피 매질을 채운다. 공급 및 용리액(eluent)(본 발명의 방법에서, 이는 리폴딩 완충액)을 베드의 꼭대기에 연속 방식으로 도입한다. 공급 용액이 고정 입구로부터 도입되고 용리액이 일정하게 고리 주변의 어느 곳에나 위치하는 동안에 천체 베드는 서서히 회전한다. 공급 용액을 싱글 성분으로부터의 분리는 흡수제의 회전에 의해 일어난다. 분리된 성분들은 나선의 띠를 나타내며, 그것의 각각은 특징적이고, 고정적인 배출 지점를 가지고 있다. 세가지 요소: (a) 용리액 속도, (b) 고리의 회전속도, 및 (c) 분배계수가 배출 지점의 위치에 영향을 미친다.

본 발명에서는 임의의 환상 크로마토그래피 방법 및 장치가 사용될 수 있다. 환상 크로마토그래프의 예로 본 발명에서의 사용에 적합한 것은 문헌 및 하기 특허 출원에 기술되어 있다: WO 98/45699, WO 99/28740, WO01/388866, EP 1134 581. 장치는 상업적으로, 예를 들어 Prior,Gtzis, Austria로부터 얻을 수 있다.

본 발명에서의 방법으로 환상 크로마토그래피를 사용하는 경우, 고리는 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 공유결합 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 또는 흡착 크로마토그래피에 따른 분리를 허용하는 특별한 크로마토그래피 매질로 패킹된다. 크로마토그래피 원리의 선택은 단백질의 구조, 단백질의 농도, 오염물질의 양과 성질, 전체 공정 흐름 개요 및 특정 단백질 리간드의 유용성(후자의 경우, 선택의 방법은 대개 친화성 크로마토그래피)에 달려있다.

변형된 단백질(및 임의로 자발적으로 형성된 중간체 및 응집체)을 포함하는 공급 용액은 연속적으로 크로마토그래피 매질로 패킹된 회전식 고리에 공급된다. 매질에는, 대개 겔, 단백질의 리폴딩을 촉진하는 완충액(상기의 리폴딩 완충액)이 뿌려진다. 단백질이 컬럼을 통과하는 동안에 리폴딩 과정이 일어난다. 중간체의 이화학적 특성(분자크기, 소수성, 접근 가능한 전하 및 소수성 그룹, 용해도 등)에 기인하여, 자연적 리폴딩된 단백질 및 중간체는 다르게 체류한다. 그들의 상이한 체류 특성에 따라, 단백질의 상이한 상태, 즉, 중간체 및 생물학적으로 활성인 단백질 각각이 고리의 다른 배출 포인트에서 용출된다. 바람직한 구체예에서, 가능하게는 가용성 또는 현탁된 응집체 형태로 중간체를 포함하는 배출 스트림을 회수하고, 공급 용액으로 재순환시킬 수 있다. 중간체/응집체의 양을 증가시키기 위하여, 그들을 임의의 적당한 농축장치, 예컨대, 접선 흐름 한외여과 유니트에 의하여 농축시킬 수 있다. 임의적으로 농축된, 재순환된 중간체/응집체는 공급 용액의 성분이 되거나 추가로 적어도 한번 리폴딩 공정을 겪게 된다.

환상 크로마토그래피를 사용하는 대안적인 구체예에서는, 변형된 단백질은 흡착 공정 동안 흡착되고 완전히 또는 부분적으로 리폴딩되고, 이는 리폴딩 완충액의 존재하에서 일어난다. 그 후 일어나는 제거를 위한 조건은 리폴딩에 유리하여야 하고, 즉 한편으로는, 흡착 동안에 이미 폴딩된 단백질은 그들의 자연적 입체구조를 유지하고, 다른 한편으로는 남아있는 단백질의 리폴딩을 촉진함을 보장해야 한다. 리폴딩되지 않은 단백질 분획은 흡수 및/또는 제거 단계에서 리폴딩된 단백질로부터 분리될 수 있으며, 바람직한 구체예에서, 공급 용액에 그들을 첨가하여 재순환시킬 수 있다.

환상 크로마토그래피 공정은 변형 단백질의 그것의 정확히 폴딩된 자연적 상 태로의 화학량적 전환을 낳는다. 다른 잇점은 공정 부피에 있어서의 감소 및 연속적 공정을 유지할 가능성이다. 크로마토그래피 겔이 적당히 수행하도록 유지시키기 위하여 그것은 재생되어야한다. 재생 용액은 공급 용액과 재생 용액의 혼합을 피하기 위하여 공급 입구 위치에서 충분히 떨어진 위치에서 팩트 베드에 적용된다. 재생 용액의 조성은 상기 기술한 바 대로, 크로마토그래피 겔의 화학적 특성에 달려있다. 재생산물들은 중간체 및 자연적 리폴딩된 단백질을 포함하고 있는 용출액으로부터 상이한 위치에서 용출된다. 재생산물들은, 그것이 상당한 농도의 단백질을 포함하는 경우, 재순환된다. 이는 그 자체로 또는 중간체를 포함하고 있는 용출액과 함깨 조합되어 출발 공급 용액으로 재도입시켜 수행될 수 있다.

다른 바람직한 구체예로, 본 발명의 방법으로 사용된 크로마토그래피 방법은 모사 이동층 (SMB) 과정이며, 이는 60년대 초반 Universal Oil Product Company에 의해 발전되었다 (55; 56). 그것은 크실렌의 분리 또는 과당 및 포도당의 분리과 같은 산업적 규모의 분리에 주로 적용되었다. 흡착 및 용출에 적합한 시스템의 사용에 의해, 공급 스트림은 2원의 또는 가-2원의 혼합물(그들의 상이한 이화학적 특성에 기인하는, 두개의 분획으로 나누어질 수 있는 두개 이상의 화합물의 혼합물)의 순수한 성분을 포함하는 2개의 회수 흐름으로 나누어진다. SMB 과정은 회수 튜브가 놓인 사이에서, 커다란 컬럼을 한정된 수의 "구역(zone)"이라 칭하는 작은 구획(section)으로 나눈다. 이들 튜브들은 특별하게 설계된 회전 밸브를 통하여 순환방식으로 투입구와 배출구로 연결된다. 시간의 특정 시점에서 회전 밸브의 스위칭은 고체상 및 액체상의 역류를 모의실험할 수 있다. Hidajat et al.1986 (57)은 SMB이 TMB와 동등함을 보여준다. SMB 적용을 위해서 하나의 큰 컬럼이 사용되거나 큰 컬럼이 다수의 작은 컬럼에 의해 치환될 수 있다. 거기에는 공급 용액, 용리액 완충액, 추출액 및 라피네이트에 대한 투입구 또는 배출구, 컬럼의 배열을 4개의 구역으로 나누는 노드라고 불리는 것이 있다. 특별한 밸브는 오직 한쪽 방향으로만 액체가 흐르도록 허용한다. 투입구와 배출구는 앞서 정의한 방식대로 배열된다. 정해진 시간 간격에 이 노드는 액체가 흐르는 방향과 동일한 방향으로 바뀌거나 칼럼은 이 방향에 반대로 바뀐다. 결과적으로, 고체상 및 액체상의 역류가 있게 된다.

SMB 방식에서,본 발명에서의 방법은 준연속 방식으로 수행되고, 바람직하게는 하기의 방법대로 수행된다:

t_o에서 변형된 단백질(및 임의적으로 중간체)를 포함하는 공급 용액을 연속적으로 구역 II와 III 사이에 주입한다. 구역들은 진 이동상 방식과 유사하게 정의된다; 구역 I에 액체를 도입하고, 구역 I과 II 사이에서 추출물을 수거하고, 구역 II 와 III 사이에서 공급 용액을 도입하고, 구역 III와 IV 사이에서 라피네이트를회수한다. 이로써 성분 A(응집체)는 흡수 가능성이 가장 낮은 분획으로써 정의되며, 성분 B (중간체와 부가적 오염된 단백질을 포함한 리폴딩된 단백질)는 더 강하게 체류하고 있는 성분으로써 정의된다. 공급 용액은 용리액 (리폴딩 완충액)에 의해 구역 III에 넣어진다. 성분 A (흡착가능성이 가장 낮음)는 성분 B (강하게 흡착되거나 잔류됨)보다 빠르게 이동된다. 성분 A가 구역 IV에 도달하기 전에, 단백질 용액의 일부는 라피네이트 배출구에 의해 회수된다. 남은 부분은 구역 IV로 옮겨진 다. 성분 B의 앞부분이 라피네이트 배출구에 도달되기 전에, 투입구와 배출구는 라피네이트의 오염을 피하기 위해 다음 위치로 스위칭 되어야한다. 컬럼이 공간에서 정지되어 있는 동안에, 액체가 흐르는 대로 같은 방향으로 스위칭 되어야한다. 구역 II의 포화된 컬럼을 새로운 용리액으로 세정한다. 구역 II로 흘러나온 혼합물을 공급 용액과 혼합하여 구역 III로 옮긴다. 이 구획 내에서, 성분 A는 성분 B로 교체된다. 더 빠르게 이동하는 성분 A는 라피네이트 배출구로 다시 도달한다. 라피네이트 배출구 지점에서의 성분 B의 돌파 전에, 세번째 상태로의 스위칭이 있다. SMB 또는 TMB의 가장 간단한 구성을 가정할때, 전체 순환은 네번째 스위칭 후에 완결된다.

360°의 뚜렷한 컬럼 회전이 있다. 시스템의 순환적 지속 상태는 여러번의 전체 순환 후에 도달한다. 추출물과 라피네이트 배출구에서, 제거 및 성분 A와 B의 앞부분의 돌파는 모여질 수 있다. 중간체 (성분 B)는 연속적으로 공급 용액으로 재순환된다.

연속적인 수행 방식에 있어서, 예컨대 환상 크로마토그래피내 주어진 출구에서, 용출액 스트림의 단백질 농도는 내내 일정하다. 대조적으로 준연속 방식에서는, 예컨대 구별된 구역 때문인 SMB에서는 순환적으로 내내 변화한다.

극단적 형태에서, 연속적 분리 과정은 분리 구획의 무한한 수로 나뉜다.

크로마토그래피 공정 동안의 리폴딩 환경에 대하여는, 많은 산업적으로 유용한 단백질에 대하여 리폴딩을 촉진하는 매개변수들을 정의함을 위한 안내가 문헌에서 유용하다 (11; 12; 58). 흥미있는 새로운 단백질에 대하여, 특정한 단백질에 따 라, 발효과정으로부터 주어진 공급 용액, 리폴딩 매개변수는 작은 규모 배취 방식으로 희석 실험 수행함으로써 연속적인 실험에서 결정되고, 최적화될 수 있다. 이들 실험들은 상기 나열된 요소들, 예컨대 pH, 산화환원반응의 전위 등에 관해 리폴딩 완충액를 변화시킴으로써 수행할 수 있다. 얻은 조건들은 크로마토그래피 컬럼 상으로 이입한다. 다양한 단백질 형태, 즉 리폴딩, 중간체 및 응집체 형태에 대해 용리 위치가 결정된다. 적합한 크로마토그래피 과정은 이러한 수치에 기초를 두고 설계된다.

리폴딩 완충액의 구성과 유사하게, 다른 크로마토그래피 과정의 매개변수, 예컨대, 공급 흐름 속도, 용리액 흐름속도, 공급 농도, 컬럼의 길이 및 직경, 온도 등이 개개의 단백질에 따라 결정되고 최적화될 수 있다. 분리를 위한 필요조건은 응집체, 중간체 및 단백질의 리폴딩된 형태에 대한 다른 선택성을 가지는 것이다. 응집된 형태와 중간체는 적어도 크기, 소수성 및 전하에서 다르다.

본 발명의 바람직한 구체예로, 중간체를 포함한 용리액이 재순환에 있어, 재순환(재-순환) 비는 크로마토그래피 분리의 방식에 따라 조절된다. 이온교환 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피와 같은 흡착 분리 방법에 대해, 공급 용액은 재순환된 응집체를 포함한 용액으로 임의의 양으로 희석될 수 있다. 재순환(재-순환) 비는 중간체/응집체를 포함하는 용출액 스트림에 따라 결정된다. 크기 배제 방법에 있어서, 재순환 공급의 부피는 이 방법에 있어서 분리가 공급 부피 및 용리액의 흐름속도에 크게 영향을 받기 때문에 중요하다. 이 방법에서, 공급 용액의 양을 전체 컬럼 부피의 1/3을 넘지않도록 하는 주의가 필요하다. 중요한 분리 문제점은 이 양이 또한 더 낮은 경우다. 이로써 용출된 중간체/응집체를 수거한 후 농축 단계를 삽입하여야 한다. 이는 통상적인 한외여과 시스템에 의해 수행될 수 있다.

또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 회전식 원형 켄베이어 크로마토그래피이다. 적합한 장치는 예컨대 SepTorTechnologies BV, Utrecht로부터 상업적으로 이용할 수 있다. Septor는 회전식 원형 켄베이어 타입 준연속 시스템이다. 공정 싸이클의 모든 단계를 통하여 크로마토그래피 컬럼을 이동하기 위해서는, 회전하는 회전식 원형 켄베이어에 탑재시킨다. 회전식 원형 켄베이어은 통상적으로 시계 방향으로 회전하고, 통상적인 크로마토그래피 단계에서 적용되는 모든 공정 단계(평형, 공급 용액의 로딩, 세척, 용출, 재생산)를 포함한다. 칼럼이 공정 사이클에서 모든 다른 구획을 따라 움직이도록 하기 위하여 컬럼들은 멀티포트 인덱싱 밸스에 연결된다. 중간체/응집체를 포함하는 용출액 스트림은 바람직하게 공급 스트림으로 재순환된다. 재순환에 앞서, 용출액 용액은 바람직하게 농축된다.

도 10 은 회전식 원형 켄베이어 크로마토그래피의 전형적인 개요를 보여준다.

전체적으로 본 발명의 방법은 하기의 잇점을 갖는다: 본 발명은 공급 용액에서의 높은 단백질 농도를 허용하고, 리폴딩 수득율과 관련하여 고도로 효율적이며, 중간체로부터의 리폴딩된 단백질의 분리를 허용하고, 사페론의 사용없이도 수행될 수 있다(그러나 본 발명의 방법은 샤페론의 사용을 배제하지는 않으며, 샤페론은 크로마토그래피 컬럼에서 고정될 수 있고, 이어서 촉매적 리폴딩 반응자로서 작용하거나 리폴딩 완충액의 성분으로 사용될 수 있다).

본 발명의 방법은 작은 실험실 규모부터 산업적 규모로 조작될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 크로마토그래피 장치는 상업적으로 이용가능하며, 크기와 수행의 관점에서, 재조합 단백질, 대개 수 mg 에서 kg까지의 범위의 필요한 용량에 대한 고객의 필요에 따라 제조업자로부터 공급받을 수 있다.

도 1: 선속도 30cm/h에서 Superdex 75 PrepGrade 컬럼 상의 크기 배제 크로마토그래피에 의한 변형되고 환원된 α-락트알부민의 리폴딩

도 2: 250°/h 및 30cm/h에서 Superdex 75 PrepGrade 컬럼 상의 환상 크기 배제 크로마토그래피에 의한 변형된 α-락트알부민의 연속적 리폴딩

도 3: 환상 크로마토그래피에 의한 연속적 리폴딩 및 응집체의 재순환에 대한 실험적 설정에 대한 개략도

도 4A: HIC로 리폴딩을 돕는 기질로부터의 분획의 역상 HPLC 크로마토그램

도 4B: 자연적 α-락트알부민의 역상 HPLC 크로마토그램

도 4C: 변형되고 환원된 α-락트알부민의 역상 HPLC 크로마토그램

도 5: Sephacryl 200HR상에서의 rHuAFP의 리폴딩을 돕는 기질

도 6: Q-Sepharose상에서의 리폴딩된 rHuAFP의 포착단계

도 7: Q-Sepharose XL로부터 용출된 자연적 단백질 분획의 SDS-PAGE (은 염색)

도 8: Q-Sepharose XL로부터 추출된 자연적 단백질 분획의 분석적 크기 배제 크로마토그래피

도 9: 환상 이온교환 크로마토그래피에 의한 변형되고 환원된 α-락트알부민의 연속 리폴딩

도 10: 회전식 원형 켄베이어 크로마토그래피의 개략적 도해

실시예 1

겔-침투 크로마토그래피 상에서의 기질-조력 리폴딩에 의한 α-락트알부민의 연속적 리폴딩

a) 연속 방식으로의 공정 이전 전에, 리폴딩은 통상적인 팩트 베드 상에서 P biotech (Uppsala, Sweden)의 Superdex 75 PrepGrade 컬럼 상에서 시험했다. α-락트알부민을 6M GuHCl 및 20mM 디티오트레이톨로 보충된 50mM tris 완충액, pH 8.5로 용해시켰다. 이 조건은 단백질의 완전한 변형 및 이황화 결합의 설프히드릴기로 분리를 감소시켰다. 단백질 농도는 3.7 mg/ml 였다. 1.6 cm i. d. 및 37 cm 높이로 Superdex 75 PrepGrade 컬럼을 채우고, 1ml 공급액(환원된 α-락트알부민)은 컬럼이 유속 30cm/h에서 2mM 시스테인, 2mM 시스틴 및 lOmM CaC1₂가 보충된 Tris 완충액과 평형을 이룬 후에 주입했다. 컬럼을 통과하는 동안, 리폴딩된 단백질은 응집체로부터 분리되었다(도. 1). 컬럼 유출액은 연속적으로 280nm에서 관찰했다. 자연적 단백질 및 응집체는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 및 RP-HPLC에 의해 분석했다. 리폴딩 수득율은 약 26 퍼센트였다. 리폴딩-완충액에 0. 25M L-아르기닌을 부가하자 40%로 수득율이 증가했다.

b) 연속적 리폴딩 실험에 대하여, 동일한 단백질 용액 및 완충액을 사용했다. Superdex 75 PrepGrade 크로마토그래피 매질을 환상 크로마토그래피 시스템, Prior Seperation Technology(Gotzis, Austria)의 PCAC상에 채웠다. PCAC는 정지상이 채워진 고리를 형성하는 두 개의 동심 실린더로 구성된다. 바깥쪽의 실린더는 직경 15 cm이고 안쪽 것은 14 cm이며, 결과적으로 고리의 폭은 0.5 cm이다. 바깥쪽 실린더의 윗부분은 유리로 구성되고 아랫부분은 폴리프로필렌으로 구성된다. 안쪽 실린더은 폴리프로필렌으로 구성되고 바깥쪽 것보다 더 짧아 꼭대기에 헤드 공간을 남기고 있다. 양 실린더는 용리액 및 공급 흐름이 삽입되는 PEEK(폴리에테르에테르케톤)로부터 헤드에 의해 막혀있다. 공급 흐름은 고정된 공급 노즐을 통하여 겔 베드의 꼭대기에서 펌프되었으며, 공급 노즐의 끝은 유리구슬 층 안에 위치하게 했다. 장치의 바닥에서, 두개의 실린더는 나일론 필터(11㎛의 구멍 크기)에 의해 싸여진 90개의 배출 구멍을 포함한 스테인레스 스틸 판에 부착되어 있다. 회전하는 컬럼의 바닥은 Tygon tubing (Norton Performance Plastic Corporation, Akron, Ohio, USA)의 짧은 구획과 연결된 90개의 배출 포트를 또한 포함하는 고정된 테플론 슬립-링과 연결된다. 배출 포트는 고리를 따라 4°간격으로 고르게 배분한다. 컬럼은 Superdex 75 PrepGrade로 높이 41cm로 채웠다. 유리 구슬의 베드는 2.6 cm 높이 였다.

시스템은 부가적으로 공급 용액에 응집체 재순환을 위한 펌프를 부가적으로 갖추었다. 배취방식 분리에서 연속적 분리로의 이동은 용리 시간(t) 및 각속도(ω)의 각변위(θ)로의 변환에 의해 만들 수 있다.

θ=ω*t

이 계산에서, 다양한 분리 성분의 배출 지점이 결정될 수 있다.

다음, 리폴딩 과정은 연속적으로 수행되었다. 250°의 회전율이 적용되고, 용리액의 유속은 30 cm/h 였다. 0.31 ml/min의 공급유속이 적용되었다. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 락트알부민의 연속적 리폴딩 후에 얻어진 크로마토그램은 도 2 에서 보여준다.

분리가 안정된 상태에 도달한 후에, 응집체를 포함하는 분획의 수집이 시작되었다. 50 ml가 모였을 때, 연속적 농축이 시작되었다. 샘플이 그려졌고, 응집된단백질과 자연적 단백질의 양이 결정되었다.

응집체가 용리된 이들 포트의 유출물은 연속적으로 모여졌고, Biomax 5K 막의 Millipore 접선 흐름 여과 시스템을 사용한 접선 흐름 여과에 의하여 농축되었다.

농도는 대략 1 mg/ml로 조절되었다. 환상 크로마토그래피에 의한 연속적 리폴딩 및 응집체의 재순환에 대한 실험 설정의 개략도는 도 3에서 보여준다. 1은 환원된 락트알부민을 배달하는 공급펌프이고, 2는 접선 흐름 여과에 의한 농축 후 재순환된 공급액과 새로운 공급액과의 혼합을 위한 혼합기이다. 3은 재순환된 응집체의 완전한 환원을 위한 반응 루프이고; 4는 환상 크로마토그래피 시스템을 위한 용리액 펌프이며, 5는 환상 크로마토그래피 시스템이고, 6은 단순한 유리병으로 구성된 수집 장치, 7은 접선 흐름 여과 장치, 8은 농축된 응집체의 수집을 위한 용기, 9는 재순환 펌프이고, 10은 리폴딩된 단백질의 수집을 위한 용기이다.

시스템이 평형에 도달한 후에, 3.7 mg/ml의 단백질 농축에서 리폴딩 효율은 재순환 없이 26%에서 재순환으로 >80%로 증가했다.

실시예 2

환상 크로마토그래피 시스템 PCAC 및 에스트라이올 세파로즈로의 인간 알파-페토단백질(human alpha-fetoprotein, rHuAFP)의 연속적 리폴딩

인간 알파-페토단백질은 Boismenu et al. (60)에 의해 기술된 바대로 대장균에서 발현되었다. 세포는 10 x 5 L의 세이크 플라스크에서 증식되었고, 버킷 원심분리기에 의해 수확되었다. 재현탁된 세포들은 500기압에서 고압력 균질기에 의해 붕괴되었다. 균등액은 10.000g에서 원심분리기에 의해 맑게 하였고, 봉입체를 포함하는 침전은 엄청난 휘젓기로 6M 우레아로 용해시켰다. 이 용액은 희석에 의하여 부분적으로 다시 접혀졌다. 부분적으로 리폴딩된 용액은 에스트라디올 세파로즈 상에서 연속적 흡착/제거에 의해 처리되었다. 에스트라디올 세파로즈는 Feng et al. (61)에서 기술된 바대로 준비되고, 환상 크로마토그래프에 채워졌다. 실시예 1에서와 같은 동일한 환상 크로마토그래프가 사용되었다. 리폴딩된 rHuAFP는 에스트라디올 세파로즈에 부착되었고, 농축된 형태로 용리될 수 있으며, 반면 재차 접히지 않은 부분은 흐름 속에서 찾을 수 있고 공급 용액으로 재순환되었다. 공급 용액의 과도학 희석을 피하기 위하여 재순환 용액은 접선 흐름 여과에 의해 농축되고, 공급 용액에서의 카오트로픽 활성을 위하여 우레아가 부가물로 가해졌다.

실시예 3

소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 흡수제 상에서의 α-락트알부민의 연속적 리폴딩

소 α-락트알부민을 50 mM Tris/HCI, 10 mM CaCI2, pH 7.0에서 용해시켰고, 6 M GuHCl 및 250mM-머캅토에탄올로 변형시켰다. 이는 실온에서 5mg/ml에서 수행되었다. 리폴딩은 HIC 흡수제에서 발생했다. 하나의 예로써 BioRad (Hercules, CA, USA)의 Macroprep Methyl이 선택되었다. 변형된 단백질의 로딩 이전에 컬럼을 1.5 M 암모늄 설페이트로 평형화시켰다. 암모늄 설페이트는 50mM Tris/HCl, 10mM CaCl, 2mM 시스테인/시스틴 완충액 pH 7.0 에서 용해시켰다. 고체 암모늄 설페이트을 변형된 단백질 용액에 가해 최종적으로 1.5 M의 농도에 도달하도록 했다. 이어서 암모늄 설페이트로 보충된 변형된 단백질 용액 2.5 ml을 14cm x 1.0 cm i. d. 메틸 세파로즈 컬럼 상에 선속도 100cm/h로 올려놓았다. 컬럼 유출액을 280 nm에서 관찰했다. 단백질의 25분의 체류시간은 50mM Tris/HCI, lOmM CaCI₂, 2mM 시스테인/시스틴 완충액 pH 7.0로 리폴딩된 단백질을 용리시키기에 충분했다. 컬럼은 물에 용해시킨 20% 에탄올로 재생되었다. 이 최고치는 접히지 않은 상태에서의 잔여 α-락트알부민을 포함했다.

리폴딩은 역상 HPLC(Vydac C4,214TP54)에 의해 시험되었다. 완전히 변형된 α-LA는 15분 내 1 ml/min 및 30 ℃로 0.1% TFA를 포함한 37% 내지 45% 아세토니트릴/물 선형 기울기 용리에 의해 산화적 폴딩 중간체 및 자연적 단백질로부터 분리되었다.

모든 실행은 Agilent LC 1100 시스템 상에서 수행되었다. 기질이 HIC로 리폴딩을 도운 후 리폴딩된 단백질은 포함하는 분획의 역상 HPLC 크로마토그램은 도.4A 에서 보여주고 있다. 자연적 변형된/환원된 α-락트알부민의 RP-HPLC크로마토그램은 도.4B 및 4C에서 각각 보여주고 있다.

이러한 리폴딩 조건은 연속적 환상 크로마토그래피로 이동되었다. Macroprep Methyl 매질은 Prior Seperations Technologies(Gotzis Austria)의 환상 크로마토그래프에 채워졌다. 시스템은 실시예 1에서 설명된다. 컬럼 높이는 14 cm로 선태갛고 고리의 폭은 0.5cm였다. 위치 0-12°에서 변형된 α-락트알부민이 도입되었다.

위치 200°에서 락트알부민이 50 mM Tris/HCI,1OmM CaCl₂, 2mM 시크테인/시스틴 완충액 pH 7.0 로 용리되었고, 위치 300°에서 컬럼이 물에 용해된 20% 에탄올로 재생되었다. 재생물은 Biomax 5 필터를 사용하여 Millipore 시스템에 의해 연속적으로 초-정용여과되었다. 정용여과 완충액으로 6 M GuHCl 내의 50 mM Tris/HCl,lOmM CaCl₂, pH 7.0 , 250 mM(3-머캅토에탄올 및 1.5 M 암모늄 설페이트가 사용되었다.초-정용여과 용액은 공급으로 재순환되고, 연속적 리폴딩은 안정 상태에 도달할 때까지 수행되었다.

실시예 4

자연적 재조합 인간 알파-페토단백질 (rHuAFP), 폴딩 중간체 및 응집체의 연속적 리폴딩 및 분리

rHuAFP는 복잡한 단백질로, 이는 16개의 이황화 결합을 포함한다. 이는 봉입체로서 대장균에서 제시된다.

a) 결합된 연속 방식으로 공정을 옮기기 전에, 리폴딩 및 rHuAFP의 포착단계는 AP biotech (Uppsala, Sweden)의 Sephacryl 200HR 및 Q-Sepharose XL로 채워진 통상적인 크로마토그래피 칼럼 상에서 시험되었다.

rHuAFP을 포함하는 봉입체는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 분리되어 있으며, 50mM Tris-HCl, pH 8.5, 6M GuHCl 및 1OOmM DTT로 용해되었다. 최종적 rHuAFP 농도는 약 0.5 mg/ml이었고, 숙주세포로부터의 단백질 불순물을 포함한 총 단백질 농도는 대략 5mg/ml였다.

단백질의 리폴딩은 겔-침투 크로마토그래피를 사용하여 리폴딩을 도와주는 기질에 의하여 행해졌다. 컬럼은 선속도 11cm/h에서 PBS (pH 7.4)로 평형화되었다.lml의 공급 용액이 2. 6 cm i. d. 및 26 cm 높이 Sephacryl 200HR로 채워진 컬럼에 로딩되었다. 컬럼을 통과하는 동안 카오트로픽 및 환원 성분은 rHuAFP 및 리폴딩 시작한 단백질로부터 분리되었다(참조 도 5, 이는 Sephacryl200HR 상에서의 rHuAFP의 기질 조력 리폴딩을 보여준다).

리폴딩 후에, 오직 단백질의 20%가 자연적 입체구조로 있고, 나머지 단백질은 비-자연적 이황화결합으로부터 생겨난 안정한 폴딩된 중간체 및 변경할 수 없는 응집체로 구성된다. 분획이 모였고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다.

다음 단계에서, 단백질은 이온교환 크로마토그래피(Q- SepharoseXL)에 의해 포착되었다. 모인 단백질 분획은 PBS로 평형화된 Q-Sepharose XL 컬럼(10mm i. d.,50mm 높이)상에 로딩된다. 폴딩된 중간체는 기질과 상호작용하지 않고 흐름을 따라 용리되었으며, 자연적 rHuAFP는 수지에 부착되어 PBS+0.2M NaCl 단계 기울기에서 용리되었다. 포착 단계의 크로마토그램은 도 6에서 보여준다. 모인 자연적 최고치 분획 (용출액 1)은 은착색된 SDS-PAGE (도. 7) 및 Superdex 200HR 컬럼(AP biotech, Uppsala, Sweden) (도. 8)을 사용한 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다.

b) 연속적 리폴딩 실험에 대하여, 동일한 단백질 용액, 겔 및 완충액이 a)에서와 같이 사용되었다.

두 개의 크로마토그래피 매질이 Prior Seperation Technology Gotzis의 환상 크로마토그래피 시스템, PCAC 안에 채워졌다. 아랫층은 5cm Q-Sepharose XL로 구성되고 윗층은 35cm Sephacryl 200HR로 구성된다.

시스템은 선속도 20cm/h에서 PBS로 평형화되었다. 실린더의 회전 속도는 250° /h였다.

공급 흐름은 고정된 공급 노즐을 통하여 겔 베드의 꼭대기에서 펌프되고, 노즐 말단은 유리 구슬층 안에 위치되었다. PBS+0.2M NaCl은 겔의 꼭대기 상의 공급-노즐로부터 -60도의 shift의 다른 노즐에 의해 펌프된다.

첫번째 겔 층(Sephacryl200HR)에서 변형 및 환원된 단백질이 접히기 시작했다. 고분자량 응집체는 리폴딩된 단량체적 자연적 rHuAFP 및 단량체적 폴딩중간체로부터 분리되었다. 첫번째 겔 층을 떠난 후 단백질은 두번째 낮은 겔 층 (QSepharoseXL)에서 포착된다. 자연적 단량체적 rHuAFP는 연속적으로 PBS+0.2M NaCl로 용리되었고, 응집체는 6M GuHCI 및 O. 1M DTT를 포함하는 염 분횐에서 용리되었다.

샘플이 그려졌고 응집된 단백질 및 자연적 단백질은 SDS-PAGE에 의해 결정되었다.

실시예 5

이온교환 크로마토그래피에 의한 α-락트알부민의 연속적 리폴딩

a) 이온 크로마토그래피에 의한 모형 단백질 α-락트알부민의 리폴딩에 대한 조건은 배취 방식에서 최적화되었다. 컬럼 (0.5 cm i. d. )은 DEAE Sepharose 4FF (AP biotech, Uppsala, Sweden)로 채워졌다. 얻어진 베드 높이는 8 cm였고, 이는 연속 방식에서 사용된 것과 대략 동일한 범위 내였다. 평형화 완충액은 20mM Tris/HCl, 2mM CaCl₂, 2M 우레아였고 pH 8로 조절되었다. 용리 완충액은 평형화 완충액과 동일했고, 0.5M NaCl로 보충되었다. 재생 완충액으로는, lOOmM 모노티오글리세롤을 포함한 6M GuHCI 또는 0. 5M NaOH이 사용되었다.

변형되고 환원된 α-락트알부민의 3mg의 총량은 DEAE Sepharose 4FF에 로딩되었다. 변형및 환원제를 씻어낸 후, 단백질이 용리되었다. 환원된 α-락트알부민을 포함한 모여진 풀(pool)은 최종적 농도가 각각 2 mM가 되도록 시스테인 및 시스틴으로 보충되었다. 리폴딩 완충액에서의 6-7동안의 인큐베이션 후에, 최초로 올려 진 단백질의 약 80%가 자연적 입체구조로 있다. 이러한 조건하에 총 단백질의 회복은 90-100% 였다.

대안적으로, 2mM 시스틴 및 2mM 시스테인을 평형화 및 용리 완충액에 가했다. 이 경우에 있어서, 단백질은 자연적 입체구조로 용리된다. 자연적 단백질의 수득율은 약 10% 및 회복 80%였다. 연속적 과정에 대해 요구되는 조건을 모의실험하기 위하여, 샘플 로드의 흐름율 및 양에 관한 제한을 했다.

b) 응집체의 재순환없는 연속적 리폴딩

연속 방식에 대한 매개 변수는 배취 실험에서 사용된 바 대로 유지되었다. 상이한 완충액의 유속 및 완충액의 적용을 위한 각을 계산했다. O.lmg/ml의 용액 및 l mg/ml의 변형되고 환원된 α-락트알부민이 DEAE Sepharose 4FF로 채워진 일정압력이 유지되는 연속적 환상 크로마토그래프(PCAC)에 적용되었다. 평형화 완충액 (20mM Tris/HCl, 2mM CaCl₂, 2M 우레아)은 주된 투입구 포트를 통하여 22 ml/min의 흐름율로 P-6000 (AP biotech, Uppsala, Sweden)로 펌프되었다. 로드는 0°에서 흐름율 4.2 ml/min로 P-500 pump (AP biotech, Uppsala, Sweden)로 적용되었다. 용리는 135°에서 용리 완충액(20mM Tris/HCI, 2 mM CaCl₂, 2M 우레아, 0.5M NaCl) 흐름율 2. 1ml/min P-500 pump (AP biotech, Uppsala, Sweden)로 영향을 받았다. 재생 용액 (6M GuHCI, lOOmM 모노티오글리세롤)은 222°에서 환상 크로마토그래프로 연동적 연구 펌프로 흐름율1.5ml/min로 펌프된다. 일정한 상태 평형화에 도달한 이후, 모든 90분획은 20분 동안 두 번 모여진다. 전도율이 결정되고 UV 흡수가 external photometer (Hitachi)로 측정되었다. 대표적 크로마토그램은 도 9에서 볼 수 있다. 단백질이 용리된 분획이 결정되었고, 샘플이 얻어졌다.

분취량의 200mM 시스테인 및 200mM 시스틴 stock 용액은 최종 농도 2mM가 되도록 각각의 분획에 가해졌다. 7 시간 동안의 인큐베이션 후에, 단백질 내용 및 폴딩 입체구조는 역상 HPLC에 의해 결정되었다. 자연적 단백질의 수확 및 회복은 각각 80% 및 95% 였다.

c) 응집체 재순환으로 연속적 리폴딩

모형 단백질의 리폴딩은 2mM 시스테인 및 2mM 시스틴을 평형화 및 용리 완충액에 가함으로써 가속화될 수 있다. 단백질은 크로마토그래피 동안 자연적 구조로 회복된다. 더 빠른 리폴딩 속도론에 의해, 응집체는 컬럼 상의 더 넒은 면적에 위치한다. 이러한 조건 하에서, 단백질은 컬럼으로부터 자연적 상태로 용리된다. 그러나 단백질의 대부분이 크로마토그래피 동안 집합된다. 응집체는 환원제로서의 lOOmM 모노티오글리세롤을 포함한 6M GuHCl로 컬럼으로부터 정량적으로 제거할 수 있다. 용해된 응집체를 이온 교환 수지로 되돌리는 재순환을 위하여, 전도율은 1 mS/cm이하가 되어야한다. 따라서 용해된 응집체는 8M에 대응하여 정용여과 되어야만 한다.

변형되고 환원된 α-락트알부민의 O.lmg/ml 및 0.5mg/ml 용액이 로딩되었다. 재상산은 환원제로서의 lOOmM 모노티오글리세롤을 포함한 6M GuHCl로 영향을 받았다. 모든 90 분획은 모여져 용출액 및 재생물을 결정한다. 재생물을 포함하는 분획이 모여지고 공급 용액에서의 전도율과 동일해질 때까지 3M 우레아에 대응하여 정 용여과시켰다. 초정용여과는 접선 흐름 연구 한외여과 단위(Labscale TFF 시스템, Millipore)의 영향을 받는다. 최종적 단백질 내용물은 역상 HPLC에 의해 결정된다. 마지막으로, 정용여과는 공급 용액으로 펌프된다. 자연적 단백질의 수득율은 재순환없이 14% 에서 응집된단백질 분획의 재순환으로 78%로 증가한다.

참고문헌

1 Horwich, A. L. , Neupert, W. and Hartl, F. U. (1990) Protein-catalysed protein folding Trends Biotechnol, 8,126-131.

2 Noiva, R. (1994) Enzymatic catalysisof disulfide formation Proteifz Expr Purif, 5, 1-13.

3 Schonbrunner, E. R., Schmid, F. X. , Mayer, S.,Tropschug, M. , Fischer, G. and Takahashi, N. (1992) Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase improves the efficiency of protein disulfide isomerase as a catalyst of protein folding catalysis of protein folding by cyclophilins from different species Proc Natl

Acad Sci USA, 89,4510-4513.

4 Lilie, H. , Lang, K., Rudolph, R., Buchner, J. , Schonbrunner, E. R., Schmid, F. X. , Mayer, S., ., Tropschug, M., Fischer, G. and Takahashi, N. (1993) Prolyl isomerases catalyze antibody folding in vitro Protein Sci, 2, 1490-1496.

5 Jager, M., Pluckthun, A., Yang, H.P., Zhong, H.N., Zhou, H.M., Lilie, H., Lang, K., Rudolph, R., Buchner, J., Schonbrunner, E.R., Schmid, F.X., Mayer, S., Tropschug, M., Fischer, G. and Takahashi, N. (1997) The rate-limiting steps for the folding of an antibody scFv fragment FEES Lett, 418, 106-110.

6 Yang, H.P., Zhong, H.N., Zhou, H.M., Lilie, H., Lang, K., Rudolph, R., Buchner, J., Schonbrunner, E.R., Schmid, F.X., Mayer, S., Tropschug, M., Fischer, G. and Takahashi, N. (1997) Catalysis of the refolding of urea denatured creatine kinase by peptidyl-prolyl cis-trans Biochim Biophys Acta, 1338, 147-150.

7 Kane, J.F. and D.L., H. (1988) Formation of recombinant inclusion bodies in Escherichia coli TIBTECH, 6, 95-100.

8 Buchner, J. and Rudolph, R. (1991) Routes to active proteins from transformed microorganisms Current Opinion Biotechnology, 2, 532-538.

9 Halenbeck, R., Kawasaki, E., Wrin, J. and Koths, K. (1989) Renaturation and purification of biologicla active recombinant human macrophage colony-stimulating factor expressed in E.coli Bio/technology, 7, 710-715.

10 Kiefhaber, T., Rudolph, R., Kohler, H.H. and Buchner, J. (1991) Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation Biotechnology (N Y), 9, 825-829.

11 Lilie, H., Schwarz, E. and Rudolph, R. (1998) Advances in refolding of proteins produced in E. coli Curr Opin Biotechnol, 9, 497-501.

12 Clark, E.D. (2001) Protein refolding for industrial processes Curr Opin Biotechnol, 12, 202-207.

13 Yoshi, H., furuta, T., Yonehara, T., ito, D. and Linko, P. (2001) Refolding of denaturated and reduced lysozyme with cysteine/cystine red/ox solution in diafuiltration J Chem Eng Japan, 34, 211-215.

14 Buchner, J., Brinkmann, U. and Pastan, I. (1992) Renaturation of a single-chain immunotoxin facilitated by chaperones and protein disulfide isomerase Biotechnology (N Y), 10, 682-685.

15 Carlson, J.D. and Yarmush, M.L. (1992) Antibody assisted protein refolding Biotechnology (N Y), 10, 86-91.

16 Guise, A.D. and Chaudhuri, J.B. (1998) Recovery and reuse of the molecular chaperone GroEL for in vitro protein refolding Biotechnol Prog, 14, 343-346.

17 Kohler, R.J., Preuss, M. and Miller, A.D. (2000) Design of a molecular chaperone-assisted protein folding bioreactor Biotechnol Prog, 16, 671-675.

18 Shimizu, H., Fujimoto, K. and Kawaguchi, H. (2000) Renaturation of reduced ribonuclease A with a microsphere-induced refolding system Biotechnol Prog, 16, 248-253.

19 Katoh, S. and Katoh, Y. (2000) Continuous refolding of lysozyme with fed- batch addition of denatured protein solution 2000, 35,1119-1124.

20 Phadtare, S. , Fisher, M. T. and Yarbrough, L. R. (1994) Refolding and release of tubulins by a functional immobilized groEL column Biochim Biophys

Acta, 1208, 189-192.

21 Altamirano, M. M. , Golbik, R. , Zahn, R. , Buckle, A. M. andFersht, A. R. (1997) Refolding chromatography with immobilized mini-chaperones Proc Natl Acad Sci USA, 94, 3576-3578.

22 Altamirano, M. M. , Garcia, C. , Possani, L. D. and Fersht, A. R. (1999)

Oxidative refolding chromatography : folding of the scorpion toxin Cn5 Nat Biotechnol, 17, 187-191.

23 Preston, N. S. , Baker, D. J. , Bottomley, S. P. and Gore, M. G. (1999) The production and characterisation of an immobilised chaperonin system

Biochim Biophys Acta, 1426,99-109.

24 Heuer, C., Kniep, H. , Falk, T. and Seidel-Morgenstern, A. (1997) Vergleich verschiedener verfahrenstechnischer Konzepte der praparativen Flussigchromatographie Chemie Ingenieur Technik, 69,1535-1546.

25 Begovich, J. M. , Byers, C. H. and Sisson, W. G. (1983) A high- capacity pressurized continuous chromatograph Sep.Sci. Tech., 18,1167-1191.

26 Begovich, J. M. and Sisson, W. G. (1984) A rotating annular chromatograph for continuous separations AIChE Journal, 30,705-710.

27 Bloomingburg, G. F. , Carta, G., Bauer, J. S. and Byers, C. H. (1991)

Continuous separation of proteins by annular chromatography Ind. Eng. Chenl.Res., 30,1061-1067.

28 Bloomingburg, G. F. and Carta, G. (1994) Separation of protein mixtures by continuous annular chromatography with step elution Chenz.Eng. J., 55, B 19-B27.

29 Buchacher, A., Iberer, G. , Jungbauer, A.,Schwiim, H. and Josic, D. (2000)

Continuous removal of protein aggregates by annular chromatography Biotechnology Progress, 17,140-149.

30 Byers, C. H. , Sisson, W. G.,DeCarli, I. -J. P. and Carta, G. (1989) Pilot-scale studies of sugar separations by continuous chromatography Appl. Biochen. Biotechnol., 20-21,635-654.

31 Byers, C. H. , Sisson, W. G. , De Carli II, J. P. and Carta, G. (1990) Sugar separations on a pilot scale by continuous annular chromatography

Biotechnol.Prog., 6,13-20.

32 Canon, R.M., Begovich, J. M. and Sission, W. G.(1980) Pressurized continuous chromatography Separation Science arzd Technology, 15, 655-678.

33 Canon, R. M. and Sisson, W. G. (1978) Operation of an improved, continuous annular chromatograph J.Liqzi. Chrom., 1,427-441.

34 Carta, G.,DeCarli, J. P. , Byers, C. H. and Sisson, W. G. (1989) Separation of metals by continuous annular chromatography with step elution Chem. Eng. Com.., 79,207-227.

35 Carta, G. and Byers, C. H. (1989) Novel Applications of Continuous Annular Chromatography. New Directions in Sorption technology. Keller, G. E.,

Yang, R. T. , Butterworth.

36 Dalvie, S. K., Gajiwala, K. S. and Baltus, R. E. (1990) Mathematical model of a rotating annular continuous size exclusion chromatograph. In Hamel, J.-F.P., Hunter, J.B. and Sikdar, S.K. (eds.), Downstream Processing and Bioseparation, pp. 268-284.

37 Reissner,K., Bart, H. J. , Prior, A. , Wolfgang, J. and Byers, C. H. (1997) Preparative desalting of bovine serum albumin by continuous annular chromatography J. Chromatogr., 763,49-56.

38 Scott, C. D. , Spence, R. D. and Sisson, W. G. (1976) Pressurized, annular chromatograph for continuous separations J. Chromatogr., 126,381-400.

39 Uretschlager, A. , Einhauer, A. and Alois, J. (2000) Continuous separation of green fluorescent protein byannular chromatography J. Chrom. A, in press.

40 Wolfgang, J. , Prior, A. , Bart, H. J.,Messenbock, R. C. and Byers, C. H. (1997)

Continuous separation of carbohydrates by ion-exchange chromatography Sep. Sci. Tech., 32,71-82.

41 Yamanishi, Y. and Yonemoto, T. (1997) Complete separation of amino acids using continuous rotating annular ion-exchange chromatography with partial recycle of effluent In. Eng. Chem. Res., 36,3809-3814.

42 Tagahashi, Y. and Goto, S. (1994) Continuous separation of fructooligosaccharides using an annular chromatograph Sep. Sci. Techn., 29.

43 Takahashi, Y. and Goto, S. (1991) Continuous separation using an annular chromatograph with non isocraticelution J. Clze7a. Ezg., 24,121-123.

44 Takahashi, Y. and Goto, S.(1991) Continuous separations of amino acids by using an annular chromatograph with rotating inlet and outlet Sep. Sci. Tech., 26,1-13.

45 Takahashi, Y. and Goto, S.(1991) Continuous concentration of single component using an annularchromatography.J. Chena. Erag., 24,460-465.

46 Takahashi, Y. and Goto, S.(1992) Continuous separation and concentration of proteins using an annular chromatograph J. Chem. Eng., 25,403-407.

47 Takahashi, Y. and Goto, S. (1994) Continuous separation offiuctooligosaccharides using an annular chromatograph Sep. Sci.Techn., 29,

1311-1318.

48 Sisson, W. G., Begovich, J.M., Byers, C. H. and Scott, C. D.(1988)

Continuous chromatography CHEMTECH, 498-501.

49 Sisson, W. G. , Scott, C. D. , Begovich, J. M. and Byers, C. H. (1989)

Application of continuous annular chromatography to size exclusion separations Prep. Chrom., 1 (2), 139-162.

50 Goto, M. and Goto, S. (1987) Continuous separation using an annular chromatograph with rotating inlet and outlet J. Chez. Eng., 20,598-603.

51 Kitakawa, A. , Yamanishi, Y. , Yonemoto, T. and Tadaki, T. (1995) Modeling and simulation of continuous rotating annular ion-exchange chromatography for separation of amino acids Sep. Sci. Tech., 30,3089-3110.

52 Fox, J. B. , Calhoun, R. C. and Eglinton, W. J. (1969) Continuous chromatography apparatus, I. Construction J.Claromatogr. A, 43,48-54.

53 Fox, J. B. and Nicholas, R. A. (1969) Continuous chromatography apparatus,III. Application J. Chromatogr. A, 43,61-65.

54 Fox, J. B. (1969) Continuous chromatography apparatus,II. Operation J.chromatogr A, 43,55-60.

55 Broughton, D. B. (1984) Production scale separations of liquid muixtures by simulated moving-bed technology Sep.Sci. Technol., 19,723-736.

56 Schulte, M. and Strube, J. (2001) Preparative enantioseparation by simulated moving bed chromatography J Chromatogr A, 906,399-416.

57 Hidajat, K. , Ching, C. andRuthven, D.M. (1986) Simulated countercurrent adsoption processes: A theroretical analysis of the effect of subdividing the adsorbent bed Chein. Eng. Sci., 41,2953-2956.

58 Clark, E. D., Schwarz, E. and Rudolph, R. (1999) Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding Methods Enzymol., 309,217- 236.

59 Martin, A. V. P. (1949) Summarizing paper of a general discussion on chromatographic analysis Faraday Soc., 7,332-336.

60 Bosmenu, R., Semeniuk, D. and Murgita, R. A. (1997) Purification and characterization of human and mouse recombinant alpha-fetoprotein expressed in Escherichia coli Protein Expr. Purif., 10,10-26

61 Feng, W. , Graumann,K., Hahn, R. and Jungbauer, A. (1999) Affinity chromatography of human estrogen receptor-αexpressed in Sacharomyces cerevisiae Combinationof heparin-and 17β-estradiol-affinity chromatography J Chromatogr A, 852,161-173

Claims (6)

1. 연속적 또는 준연속적 크로마토그래피 방법으로 변형된 형태, 불활성 중간체 형태, 또는 변형된 형태 및 불활성 중간체 형태 양자 모두의 단백질을 리폴딩된 단백질로부터 분리하는 것을 특징으로 하는, 변형된 형태, 생물학적으로 불활성인 중간체 형태, 또는 변형된 형태 및 생물학적으로 불활성인 중간체 형태 양자 모두의 관심있는 재조합 단백질을 포함하는 공급 용액에 상기 단백질이 단백질의 리폴딩을 촉진하고 중간체 형태가 리폴딩된 단백질로부터 분리되는 조건하에서 재구성되는 크로마토그래피 분리 과정을 수행하여, 변형된 상태에서 활성 형태로 단백질을 재구성함으로써 생물학적으로 활성인 재조합 단백질을 얻는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 리폴딩된 단백질로부터 분리된 중간체 형태가 공급 용액에 재도입되어 적어도 하나의 재구성 과정을 거치는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 분리 과정이 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 공유결합 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피로부터 선택되는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 분리 과정이 환상 크로마토그래피 형태에서 연속적으로 수행되는 방법.
5. 제 3항의 방법에 있어서, 분리 과정이 모사 이동층(simulated moving bed) 크로마토그래피 형태에서 준연속적으로 수행되는 방법.
6. 제 3항에 있어서, 분리 과정이 회전식 원형 켄베이어(carrousel) 크로마토그래피의 형태에서 준연속적으로 수행되는 방법.

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