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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue von dem Periost der Knochenschicht
abgeleitete immortalisierte Pre- beziehungsweise Präosteoblasten-Zelllinien,
die zu Osteoblasten differenzieren können. Insbesondere, betrifft
die vorliegende Erfindung die Verwendung derartiger Zellen in Tests
zum Nachweis von Substanzen, die die Differenzierung der vom Periost
abgeleiteten Präosteoblasten
zu Osteoblasten steuern und zum Nachweis von Substanzen, die die
Knochenbildung, die Erhaltung von Knochenmasse, die Knochenreparatur
verbessern können und
um den Beginn von Osteoporose zu verhindern.
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In
Knochengeweben werden Knochen ständig
durch wiederkehrende Vorgänge
abgebaut, resorbiert und neu erzeugt, die auf dem zellulären Niveau
durch Osteoclasten beziehungsweise Osteoblasten gesteuert werden.
Osteoblasten sind hauptsächlich
bei den Vorgängen
der Knochenbildung beteiligt, während
der Vorgang des Knochenabbaus und die Resorption des Knochenmaterials
durch Osteoclasten vermittelt zu sein scheint.
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Knochen
wird aus zwei Hauptzonen, einer "Substantia
spongosia" genannten
Innenzone und einer "Substantia
corticalis" genannten
Außenzone
gebildet. Die Außenzone
weist die Haversschen Kanäle und
das Periost auf. Das Periost, die sogenannte Knochenhaut, bedeckt,
abgesehen von solchen, die in Gelenken verwendet werden, den Umfang
aller Knochen. Das Periost versorgt hauptsächlich die Knochen mit Gefäßen, bestimmt
die Anbringung von Sehnen und weist mehrere Nerven auf. In letzter
Zeit wurde festgestellt, dass das Periost ebenfalls am Knochenwachstum
und weiterhin bei (Knochen) Wiederherstellungsvorgängen, beispielsweise
als Knochenreparatur nach einem Bruch, eines Individuums beteiligt
zu sein scheint.
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Das
Periost selbst wird aus zwei Hauptbereichen zusammengesetzt, wobei
der als "Stratum
fibrosum" bezeichnete äußere Anteil
hauptsächlich
Bindegewebe und der als "Kambium" oder "Stratum osteogenicum", das dem Knochen
selbst benachbart ist eine Anzahl nicht differenzierter Zellen,
wie beispielsweise Präosteoblasten,
umfasst. Gegenwärtig
wird angenommen, dass diese Präosteoblasten
oder die davon abgeleiteten Zellen an der Knochenbruchreparatur
und/oder anderen Wiederherstellungsvorgängen beteiligt sind. Diese
Präosteoblasten
sind jedoch von den in der "Substantia
spongosia" aufgefundenen
scheinbar verschieden, da die Zellen so angesehen werden, dass sie
die Fähigkeit
einer Differenzierung zu Adipozyten verloren haben und wobei wird
angenommen, dass sie die Osteoblastendifferenzierung nicht unterstützen.
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Während des
Alterns ist ein Individuum einem schrittweisen Verlust an Knochenmasse
ausgesetzt, was ein Erweitern der Haversschen Kanäle in der
Substantia corticalis und eine Verringerung in der Masse der Substantia
spongosia mit einbezieht. Dieses Phänomen wird hauptsächlich durch
Knochenresorption von Osteoclasten, die die Knochenbildung durch
Osteoblasten übersteigt,
auf dem zellulären
Niveau hervorgerufen, welcher Zustand als Entkopplung bezeichnet
wird. In dem Fall, dass die Entkopplung für eine längere Zeitdauer anhält, wird
mehr und mehr Knochenmaterial abgebaut/resorbiert, wodurch schließlich eine
als Osteoporose bezeichnete Erkrankung erzeugt wird. Bei Osteoporose
werden Schmerzen in den Knochen verursacht und die Knochen brüchig, was
schließlich
zu einem Bruch davon und Lumbago führt.
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In
der Vergangenheit wurde Osteoporose durch unterschiedliche Regimen
behandelt, die eine erhöhte
Calciumaufnahme, leichte Leibesübungen, Sonnenbräune oder
Verabreichen von Verbindungen einbeziehen, die die Aktivität von in
der "Substantia spongosia" vorhandenen Osteoblasten
erhöhen
wird. In diesem Bezug offenbart die
US
5,002,968 eine organische Germanium-Verbindung zum Aktivieren
der Vermehrung von Osteoblasten, um so die Knochenbildung zu stimulieren
und die überdurchschnittliche Aktivität von Osteoclasten
auszugleichen. Weiterhin wird in der
EP
0 725 080 ein neues Protein, der basische Osteoblasten-Wachstums-Fakor
II (bOGF) offenbart, der das Osteoblastenwachstum stimulieren kann.
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Vor
kurzem wurde jedoch festgestellt, dass Osteoblasten nicht nur eine
Aufgabe bei der Verknöcherung
ausführen,
sondern ebenfalls eine Rolle als Steuerungszentrale für das Phänomen der
Knochenneugestaltung zu spielen scheinen, das mit der Differenzierung
und Aktivierung von Osteoclasten, den Knochenabbau vermittelnden
Zellen, eng verbunden ist. Angesichts davon wird jetzt vielmehr
die einfache Aktivierung vorhandener Osteoblasten zur Förderung
und Aufrechterhaltung der Knochenmasse angezweifelt wirksam zu sein.
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Gleichzeitig
wurde festgestellt, dass zur gleichen Zeit während ein Knochenverlust im
Knochen auftritt, Knochen an der Periost-Oberfläche, doch viel langsamer als
während
des Wachstums, hinzugefügt wird,
was anzeigt, dass dieser Vorgang der durch Knochenabbau bewirkten
Destabilisierung des Knochens entgegensteht.
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Daher
wäre es
von Interesse die in dem Periost vorhandenen Osteoblasten und deren
Wirkung bei Knochenreparatur und Knochenaufbau zu beurteilen und
zu untersuchen, um so Substanzen bereitzustellen, die die Vorgänge im Periost
beeinflussen.
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Um
derartige Verbindungen bereitzustellen, sind wirksame Mittel zum
Beurteilen der Wirkung davon auf Zellen notwendig, die am Knochenmetabolismus
beteiligt sind.
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Wie
im Stand der Technik anerkannt wird, sind die besten Mittel für derartige
Experimente Zellen, die an den Vorgängen beteiligt sind. Zellen,
die so genannten primären
Zellen, die jedoch unmittelbar von einem Spender erhalten werden,
weisen lediglich eine begrenzte sich vermehrende Lebensdauer auf,
die die Verwendung davon auf in vitro Untersuchungen beschränkt. Zusätzlich können nicht
alle Zelltypen isoliert und kultiviert werden. Dies gilt insbesondere
für Vorläuferzellen,
die häufig
nicht in ausreichender Menge isoliert werden können, so dass Experimente an
den Zellen ausgeführt
werden können.
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Obwohl
sich in der Vergangenheit einige Zellen als resistent gegenüber einer
Manipulation dieser Art erwiesen haben, konnte die Vermehrung bestimmter
Zellen, wie beispielsweise von Darm- oder Hornhaut-Zellen, durch
Infektion von Zellen einer primären
Zellkultur mit Oncogenen, wie beispielsweise dem Large T Antigen
des Simian-Virus 40 (SV40 T Antigen), prolongiert beziehungsweise
erweitert werden. Das SV40 Large T-Antigen ist bekannt die Inaktivierung
von Proteinen zu bewirken, die im Zellzyklusablauf eine Schlüsselrolle
spielen, insbesondere das p53 und das Retinoblastoma (pRb) Protein.
Obwohl jedoch die (Über)-Expression
derartiger Oncogene in menschlichen Primärzellen die Vermehrung der
Zellen für
eine begrenzte Anzahl von Zellteilungen prolongieren konnten, hörten die
Zellen bei einem als "Krise" genannten Stadium
auf zu wachsen. Während
dieses Stadiums, das normalerweise bei ungefähr Passage 10 bis 20 der Zellen
auftritt, blieben die Zellen in einem als "Seneszenz" genannten Stadium am Leben oder starben
einfach. In seltenen Fällen
konnte einige Zellen diesem Stadium entkommen und begannen sich
erneut zu vermehren. Diese Fähigkeit
die Vermehrung de novo zu starten, wird durch eine genomische Reorganisation
durch zusätzliche
in der Zelle stattfindende epigenetische Ereignisse erklärt. Doch
diese wesentlichen genomischen Modifikationen führen häufig dazu, dass die Zellen
die anfänglichen
beziehungsweise ursprünglichen
Eigenschaften der primären
Zellen verlieren, von denen sie abgeleitet sind.
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Folglich
besteht eine der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe
darin ein derartiges Mittel zum weiteren Bestimmen von Substanzen
bereitzustellen, das Knochenbildung und verschiedene Wirkungen davon
auf den Knochenmetabolismus beeinflusst.
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Diese
Aufgabe wurde durch Bereitstellen neuer immortalisierter Pre- beziehungsweise
Präosteoblasten-Zelllinien
gelöst,
die von den periostalen Knochenschichten beziehungsweise der Knochenschicht
des Periosts abgeleitet sind, welche in Osteoblasten differenzieren
können.
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In
den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten transfizierten
die Erfinder vom Periost des Knochens gesunder menschlicher Erwachsener
erhaltene primäre
Osteoblasten-Vorläuferzellen
mit einem Konstrukt, das DNA-Sequenzen umfasst, die das SV40 Large
T-Antigen kodieren. Die so erhaltenen Zellen (hPOB-Zellen genannt)
konnten in Osteoblasten ähnliche
Zellen differenzieren, die einen den primären Osteoblasten im wesentlichen identischen
Phänotyp
zeigten, der durch die alkalische Phosphataseaktivität, die Expression
spezifischer Marker, wie beispielsweise den Osteoblasten spezifischen
Faktor-1 (OSF-1 oder Cbfa-1), Osteopontin und Osteocalcin und die
Fähigkeit
mineralisierte Knötchen
zu bilden, bestimmt wurde. Von diesen Zellen wurde jedoch erwartet,
dass sie lediglich eine begrenzte Lebensdauer aufweisen und anschließend, mit
einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase, in die Krise eintreten.
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Diese
Zellen wurden anschließend
mit einem Konstrukt transfiziert, das das Telomerase-Reverse-Transcriptase-Gen
(Bodnar, A.G. et al., Extension of life-span by introduction of
telomerase into normal human cells. Science, 279 (5349)(1998), 349–52) aufwies.
Auf weiteres Passagieren der transfizierten Zellen (hPOB-tert genannt)
wurde festgestellt, dass diese Zellen nicht in die Krise eintreten, jedoch
fortsetzen sich zu vermehren. Folglich ermöglicht ein Transfizieren von
vor-immortalisierten Zellen mit einem das Telomerase-Gen aufweisenden
Konstrukt eine wirklich immortalisierte Zelllinie zu erhalten, in
der keine genomische Reorganisation stattfand. Da die Zellen deren
genomische Struktur nicht wesentlich änderten, ist die Gentranskription
und Expression zu den Zellen der Primärkultur ebenfalls im Wesentlichen
identisch.
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Die
Zelllinien der vorliegenden Erfindung können für mindestens 60, noch bevorzugter
mindestens 80 und sogar noch bevorzugter mindestens 100 Passagen
in Kultur kultiviert werden. Ausführlich, die erfindungsgemäßen Zelllinien
sind tatsächlich
immortalisiert und können
in vitro so lang wie gewünscht,
kultiviert werden. Sie können
aus einer beliebigen Quelle hergestellt werden, aus der Präosteoblasten
erhalten werden können,
die von Knochenschichten des Periosts, insbesondere von Säugern, wie
beispielsweise Menschen, abgeleitet werden können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist
eine Zelllinie die Zelllinie, die bei dem Institut Pasteur gemäß des Budapester
Vertrags am 25. Oktober 2000 hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer CNCM
I-2573 erhalten hat.
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Außerdem wurde überraschend
gezeigt, dass der Phänotyp
der Zellen der Primärkultur
im Wesentlichen erhalten blieb, insbesondere, können die erfindungsgemäßen vom
Periost abgeleiteten Zellen in Osteoblasten differenzieren, die
die verantwortlichen Zellen für
eine Knochenmassenbildung in diesem Bereich sind. Dieses Merkmal
ist von besonderem Interesse für
die Untersuchung der Entwicklung einer Knochenbildung und einer
Knochenreparatur.
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Die
erfindungsgemäßen Präosteoblasten-Zelllinien
zeigen ebenfalls verglichen mit den Zellen der primären Zellkultur
von denen sie abgeleitet sind, einen im Wesentlichen identischen
Phänotyp. Insbesondere
zeigen sie eine alkalische Phosphataseaktivität, eine Expression von spezifischen
Markern, wie beispielsweise Osteoblasten spezifischen Faktor-1 (OSF-1
oder Cbfa-1), Osteopontin und Osteocalcin, etc., und eine Fähigkeit
mineralisierte Knötchen
zu bilden, die im Wesentlichen die gleiche ist, die in den Zellen
der Primärkultur
aufgefundenen wird.
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Im
Fall einer Differenzierung der erfindungsgemäßen Präosteoblasten-Zelllinien zu
Osteoblasten durch Stimulieren der Zellen mit eine derartige Differenzierung
induzierenden Agenzien, beispielsweise durch Stimulieren mit einem
Gemisch von Dexamethason und Vitamin D3, zeigen die so erhaltenen
Osteoblasten ebenfalls im Wesentlichen die gleichen Differenzierungsmarker,
wie eine unmittelbar von einem Spender erhaltene Osteoblastenzelle. Diesbezüglich wurde
gezeigt, dass das Niveau der alkalischen Phosphatase, der spezifischen
Marker, wie beispielsweise der Osteoblasten spezifische Faktor-1
(OSF-1 oder Cbfa-1), das Osteopontin und Osteocalcin und die Fähigkeit
mineralisierte Knötchen
zu bilden von Osteoblasten, die von den vorliegenden Zelllinien
durch induzierende Differenzierung abgeleitet wurden im Wesentlichen
die gleichen sind, verglichen mit dem von Osteoblasten aufgefundenen,
von denen sie abgeleitet wurden.
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Zusammengefasst,
verglichen zu Zellen einer Primärkultur
von der sie abgeleitet wurden, zeigen die erfindungsgemäßen Zelllinien
ein im Wesentlichen identisches morphologisches Muster und können in
Osteoblasten differenzieren. Daher kann geschlossen werden, dass
aufgrund des kombinierten Mittels einer Prä-Immortalisation und Expression
einer Telomerase die genomische Organisation der Zelle erhalten
bleibt.
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Die
vorliegenden Zelllinien können
gemäß eines
Verfahrens erhalten werden, das die Schritte umfasst, (a) Isolieren
von Präosteoblasten
von einer geeigneten Quelle, (b) Transfizieren der Zellen mit einem
Konstrukt, das ein den normalen Zellzyklus entkoppelndes Gen aufweist,
(c) gegebenenfalls Isolieren transfizierter Zellen aus der Kultur,
(d) Transfizieren der in Schritt (b) oder (c) erhaltenen Zellen
mit einem Konstrukt, das die Expression des Telomerase-Reversen-Transkriptase-Gens
ermöglicht,
und (e) Selektionieren der Zellen von Schritt (d), um Zellen zu
erhalten, die beide Gene darin eingebaut umfassen.
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In
einem ersten Schritt (Schritt (a)) werden Präosteoblasten von dem Periost
eines Individuums isoliert. Diese Zellen werden in Kultur übertragen, und
anschließend
mit einem Konstrukt transfiziert, das ein oder mehrere Gene aufweist,
das/die den normalen Zellzyklus entkoppeln kann/können, wie beispielsweise
mit derartigen Genen, deren Produkte die Proteinprodukte von den
p53- und den Retinoblastoma-Genen binden und inaktivieren, wodurch den
Primärzellen
ermöglicht
wird deren Lebensdauer zu prolongieren. Dies kann dadurch erreicht
werden, dass die Zellen mit einem rekombinanten Vektor, wie beispielsweise
einem rekombinanten Plasmid, oder einem Stück linearer DNA transfiziert
wird, die an deren Enden DNA-Sequenzen aufweist, die zu endogenen
DNA-Sequenzen des zellulären
Genoms homolog sind. Dieses Verfahren ermöglicht eine Integration der
das Konstrukt umfassenden linearen DNA in das Wirtschromosom mit
dem gleichzeitigen Vorteil von dessen Weitergabe an Vorläuferzellen.
Alternativ können
die Zellen ebenfalls mit einem rekombinanten Virus infiziert werden,
beispielsweise einem Virus der das Large T-Antigen des SV40 Virus
(Simian-Virus) oder das die E6/E7 Gene des HPV Virus (menschliches
Papilloma Virus) aufweist.
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Die
so behandelten Zellen können
anschließend
auf Zellen selektioniert werden, die das eingeführte Konstrukt aufweisen, was
durch einfaches Kultivieren der Zellen für einige zusätzliche
Passagen ausgeführt
werden kann. Zellen, in die das Konstrukt eingeführt wurde, werden eine erweiterte
Lebensdauer zeigen und fortsetzen sich in Kultur zu vermehren, während nicht
transfizierte Zellen aufhören
werden zu wachsen. Alternativ kann ein Selektionsmarker in das Konstrukt
eingeschlossen und transfizierte Zellen auf die Anwesenheit des
Markers selektioniert werden.
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Die
so selektionierten Zellen werden dann mit einem Konstrukt transfiziert,
mit dem das darin beinhaltete Telomerase-Gen exprimiert werden kann. Dies
kann durch die gleichen vorstehend beschriebenen Verfahren, wie
beispielsweise die Verwendung eines rekombinanten Vektors, eines
linearen Stücks DNA,
das auf dem Phänomen
der homologen Rekombination beruht oder durch Infizieren der Zellen mit
einem rekombinanten Retrovirus, die jeweils das Telomerase-Gen aufweisen,
erreicht werden. Neben dem das Telomerase-Gen codierenden Gen umfasst das
Konstrukt regulatorische Sequenzen, die die Transkription des mit
den regulatorischen Sequenzen betriebsbereit verbundenen Gens steuern.
Als solche ist eine regulatorische Sequenz, eine die Transkription
einer benachbarten DNA-Sequenz steuernde Promotor-Sequenz, vorgesehen.
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Die
so erhaltenen Zellen können
auf immortalisierte Zellen selektioniert werden, die beide der in den
ersten Verfahrensschritten eingeführten Gene beinhalten, was
beispielsweise durch Verdünnen
der Zellen ausgeführt
und dadurch beurteilt werden kann ob eine Krise in den verschiedenen
Kulturen aufgetreten ist oder nicht. Außerdem kann das genomische Material
der Zellen selbst auf die Anwesenheit der verschiedenen Konstrukte
durch Isolieren von DNA Material von den Zellen beurteilt und die
Anwesenheit der eingeführten
Gene bestimmt werden, was beispielsweise durch PCR-Technologie,
etc. ausgeführt
werden kann.
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Folglich
betrifft eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform die Verwendung derartiger
Zellen in einem Test beziehungsweise Assay zum Durchsuchen von Substanzen,
die beim Beeinflussen der Entwicklung von Präosteoblasten zu Osteoblasten
nützlich
sind. Gemäß einer
mehr bevorzugten Ausführungsform
werden die vorliegenden Zelllinien in einem Test zum Auffinden von
Sunstanzen verwendet, die die Differenzierung der Präosteoblasten
zu Osteoblasten leiten beziehungsweise anweisen. Dies kann von besonderem
Interesse sein falls mehr Osteoblasten in dem Knochen eines Individuums
vorhanden sein sollten, um eine Knochenbildung selbst zu verbessern
oder die Erhaltung der Knochenmasse und die Knochenreparatur zu
fördern.
Zusätzlich
sind die erfindungsgemäßen Zelllinien
ebenfalls zum Durchsuchen von Substanzen perfekt geeignet, die durch
spezifisches Aktivieren der Knochenbildung im Periost den Beginn
von Osteoporose hinauszögern
oder sogar verhindern, da die im Periost vorhandenen Präosteoblasten
beziehungsweise Osteoblasten an Knochenstrukturmaßnahmen,
wie beispielsweise während
des Abbaus der inneren Knochenmasse mit einem möglichen gleichzeitigen Knochenaufbau
im Umfang des Knochens, das heißt
im Periost, beteiligt zu sein scheinen.
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In
den Figuren,
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zeigt 1 eine
Immunfärbung
von hPOB-Zellen mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das menschliche
SV40 T-Antigen gerichtet ist, wobei konfluente Zellen unter Verwendung
eines spezifisch gegen menschliches SV40 T-Antigen gerichteten primären Antikörpers durch
ein Immunfluoreszenz-Verfahren gefärbt wurden;
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zeigt 2 die
Telomerase-Aktivität
in hPOB- und hPOB-tert-Zellen: Spur 1: Telomerase-Aktivität im Kontrollzustand,
das heißt
ohne Zellen; Spur 2 und 3: Telomerase-Aktivität in hPOB-Zellen bei zwei unterschiedlichen
Passagen; Spur 4 bis 10: Telomerase-Aktivität in hPOB-tert-Zellen bei unterschiedlichen
Passagen.
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3 zeigt
die Regulation der alkalischen Phosphataseaktivität während der
Differenzierung von hPOB- und hPOB-tert-Zellen, wobei die alkalische
Phosphataseaktivität
vor Konfluenz (Tag-1) und bei Tagen 2, 4, 6 und 9 nach Konfluenz
in hPOB-Zellen (A) und hPOB-tert-Zellen (B) erfasst wurde, die mit
keinen Effektoren (o), 10 nM Dexamethason (Δ), 10 nM Vitamin D (•) oder mit
beiden Effektoren (∎) inkubiert wurden. Die Daten sind
Mittelwerte ± SEM von
mindestens drei Experimenten. Werte, die von unbehandelten Zellen
statistisch verschieden sind, werden durch * (p < 0,05); ** (p < 0,01) angezeigt.
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4 zeigt
die Regulation der Cbfa-1 Expression in hPOB- und hPOB-tert-Zellen,
wobei RNA von hPOB- (A) und hPOB-tert-Zellen (B) hergestellt wurde,
die für
6 Tage ohne Effektoren oder in der Anwesenheit von 10 nM Dexamethason,
10 nM Vitamin D oder mit beiden Effektoren kultiviert wurden. Die RNA-Expression
von Cbfa-1 und Aktin wurde parallel durch semi-quantitative RT-PCR
analysiert. Die erhaltenen Signale wurden quantifiziert und Aktin
wurde als interner Standard verwendet. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von
mindestens drei Experimenten. Werte, die von unbehandelten Zellen
statistisch verschieden waren, wurden durch * (p < 0,05) angezeigt.
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5 zeigt
die Regulation der Osteonectinexpression in hPOB- und hPOB-tert-Zellen, wobei RNA
von hPOB- (A) und hPOB-tert-Zellen (B) hergestellt wurde, die für 6 Tage
ohne Effektoren oder in der Anwesenheit von 10 nM Dexamethason,
10 nM Vitamin D oder mit beiden Effektoren kultiviert wurden; die
RNA-Expression von Osteonectin und Aktin wurde parallel durch semi-quantitative
RT-PCR analysiert; die erhaltenen Signale wurden quantifiziert und
Aktin wurde als interner Standard verwendet; die Daten sind Mittelwerte ± SEM von
mindestens drei Experimenten; Werte, die von unbehandelten Zellen statistisch
verschieden waren, werden durch * (p < 0,05), ** (p < 0,01) angezeigt.
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6 zeigt
die Regulation der Osteocalcinexpression in hPOB- und hPOB-tert-Zellen; RNA wurde
von hPOB- (A) und hPOB-tert-Zellen (B) hergestellt, die für 6 Tage
ohne Effektoren oder in der Anwesenheit von 10 nM Dexamethason,
10 nM Vitamin D oder mit beiden Effektoren kultiviert wurden; die
RNA-Expression von Osteocalcin und Aktin wurde parallel durch semi-quantitative
RT-PCR analysiert; die erhaltenen Signale wurden quantifiziert und Aktin
wurde als interner Standard verwendet; die Daten sind Mittelwerte ± SEM von
mindestens drei Experimenten. Werte, die von unbehandelten Zellen statistisch
verschieden waren, werden durch * (p < 0,05), ** (p < 0,01) angezeigt.
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7 zeigt
die Mineralisierung der extrazellulären Matrix durch hPOB- und
hPOB-tert-Zellen; wobei
hPOB- (A) und hPOB-tert-Zellen (B) in der Anwesenheit von 10 nM
Dexamethason und 10 nM Vitamin D kultiviert wurden, und wobei an
Tag 21 die Zellen fixiert und mit dem in Material und Methoden beschriebenen
Alzarin-Rot gefärbt
wurden.
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Die
folgenden Beispiele werden lediglich zu erläuternden Zwecken gegeben und
sind nicht als die vorliegende Erfindung einschränkend vorgesehen.
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Material und Methoden
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Material
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Zellkulturmaterial,
Medien und fötales
Rinderserum (FBS) wurden von Gibco BRL (Basel, Schweiz) erworben.
Alzarin-Rot S und Vitamin D3, 1α,25-Dihydroxy
wurden von Sigma (Buchs, Schweiz) beziehungsweise Calbiochem (Luzern, Schweiz)
erworben. Ascorbinsäure
und β-Glycerophosphat
wurden von Merck (Schweiz) erhalten.
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Beispiel 1
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Herstellung und Vermehrung
der retroviralen Vektoren
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Ein
rekombinanter Vektor, der das Large T-Antigen des Simian-Virus (SV40-T-Antigen) oder die
menschliche Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTERT, von CAMBIA,
Canberra, Australien bereitgestellt) aufweist, wurde durch Insertion
mit standardisierten DNA-Rekombinationsverfahren in die BamHI-Stelle
des pLHXSD retroviralen Vektors (Stockschlaeder et al., Hum. Gene
Ther. 2 (1991), 33–39) konstruiert,
der das Histidinol-Gen als Selektionsmarker aufweist.
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Infektiöse rekombinante
Viruspartikel wurden durch Transfektion des rekombinanten retroviralen
Vektors in der amphotropen Verpackungszelllinie (Clontech) erzeugt,
gefolgt durch Co-Kultivieren mit der ecotropen Verpackungszelllinie,
Psi2, die bei ATCC erhältlich
ist, um eine "Ping-Pong"-Infektion zu ermöglichen,
so dass ein Virus mit hohem Titer (Lynch C, Miller D, 1991) erzeugt
wird. Die Herstellung hoher Helfer-Virus freier retroviraler Vektoren wurde
durch Co-Kultivierung der Verpackungszellen ausgeführt, die
die Hüllen
unterschiedlicher Wirtsbereiche (J. Virol. 65; 3887–3890) aufweisen.
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Beispiel 2
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Herstellung
und Infektion der menschlichen Osteoblastenvorläufer
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Zellen
aus dem Periost eines Femur beziehungsweise Oberschenkelknochens
einer 13 Jahre alten Patientin, wurden durch Kultivieren von Gewebestücken des
Periosts in mit 10% FBS ergänztem Opti-MEM
(Gibco BRL, Basel, Schweiz) in 95% Luft/5% CO2 für 3 Wochen
hergestellt. Bei Konfluenz wurden die Zellen mit Trypsin behandelt
und in einem 25 cm2 Behälter ausplattiert. Bei 70–80% Konfluenz wurden
die Zellen für
3 Stunden bei 37°C
(90% Feuchtigkeit) in der Anwesenheit von 20 μg/ml DEAE-Dextran mit dem rekombinanten
Virus inkubiert, der das, wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte,
SV40-T-Antigen beinhaltet.
Nach Infektion wurde das Kulturmedium gegen mit 10% FBS und Penicillin/Streptomycin
ergänztem α-MEM ausgetauscht.
Nach 3 bis 4 Passagen hörten
nicht infizierte primäre
Zellen auf zu wachsen, wohingegen sich Zellen aus dem infizierten
Pool bis Passage 12–15
fortgesetzt vermehrten. Diese das SV40 T-Antigen exprimierenden
Zellen wurden hPOB genannt.
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Bei
Passage 9 wurden die Zellen, wie vorstehend beschrieben mit einem
das hTERT-Gen aufweisenden
rekombinanten Virus infiziert. Diese Zellen wurden hPOB-tert genannt.
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Beispiel 3
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Kultur und
Differenzierung von hPOB-tert
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Infizierte
Zellen wurden in der Anwesenheit von mit 10% FCS und Penicillin/Streptomycin
ergänztem α-MEM kultiviert.
Dieses Medium wird als das Grundmedium bezeichnet. Zur Differenzierung wurden
die Zellen auf Kollagen 1 (30 μg/ml;
Rinderhauttyp 1 Kollagen, Roche Biomedical; Basel, Schweiz) beschichteten
Schalen mit einer Dichte von 12.000 Zellen/cm2 in
dem Grundmedium ausgesät. Konfluente
Zellen wurden für
2 bis 21 Tage in dem mit 1 mM Glycerophosphat und 50 μg/ml Ascorbat
ergänztem
Grundmedium inkubiert, dass mit 10 nM Dexamethason oder 10 nM Vitamin
D ergänzt
war.
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Die
mineralisierte Matrixbildung wurde in infizierten Zellen verfolgt,
die an Tag 0 und 21 nach Konfluenz unter unterschiedlichen Bedingungen
kultiviert wurden. Nach Zellfixierung durch Inkubation mit eiskaltem
70% Ethanol für
1 Stunde wurde die mineralisierte Matrix basierend auf einer colorimetrischen Reaktion
mit Alzarin-Rot S gefärbt.
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Beispiel 4
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Erfassung der alkalischen
Phosphataseaktivität
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hPOB-tert-Zellen,
die unter den Differenzierungsbedingungen kultiviert wurden, wurden
an Tag 0, 2, 4, 6 und 9 nach Konfluenz geerntet und in einem 10
mM Tris (pH-Wert 7,5), 0,5 mM MgCl2 und
0,1% 100X Triton beinhaltenden Lysepuffer homogenisiert. Die alkalische
Phosphataseaktivität
(ALP) wurde an den Zellhomogenaten unter Verwendung eines im Handel
erhältlichen
Kits (Sigma) erfasst, wobei die Ergebnisse auf den mit dem Bradford-Testverfahren erfassten
Gesamtproteingehalt normalisiert wurden.
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Beispiel 5
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Immunnachweis des SV40-T-Antigenproteins
in hPOB-Zellen
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hPOB-Zellen,
die auf gekammerten Glasobjektträgern
mit acht Vertiefungen auf 90% Konfluenz gezüchtet wurden, wurden mit Hanks-Salzpuffer (HBSS)
gewaschen und 30 Min. bei mindestens –20°C mit einem eiskalten Gemisch
von Methanol/Aceton (v/v) fixiert. Die fixierten Zellen wurden 1 Stunde
bei Raumtemperatur mit einem monoklonalen Antikörper der Maus, der gegen das
SV40-T-Antigen (1/30 Verdünnung)
gerichtet ist, in einem Puffer inkubiert, der 0,05 M Tris pH-Wert
8,6, 1,8% NaCl und 0,2% Polyethylenglycol (TNP-Puffer), ergänzt mit 1% Rinder-Serum-Albumin
(BSA), beinhaltet. Nach 3 Waschvorgängen mit TNP-Puffer wurden
die Zellen für
1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln mit TNP-Puffer inkubiert, der mit 1% BSA und
mit einem mit Fluorescein konjugierten Anti-Maus IgG Antikörper (1/250
Verdünnung)
ergänzt
war. Die Zellkerne wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) beobachtet.
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Beispiel 6
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Herstellung von RNA und
Expressionsanalyse durch RT-PCR
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An
Tag 6 nach Konfluenz wurden die unter Differenzierungsbedingungen
kultivierten Zellen mit HBSS gewaschen und bei –80°C gelagert bis unter Verwendung
des RNeasy Gesamt-RNA Reinigungssystems (Qiagen AG, Basel, Schweiz)
RNA extrahiert wurde.
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Es
wurde eine Reverse Transkription mit einem Einsatz von 10 μg Gesamt-RNA
unter Verwendung des 1st Strang cDNA Synthese-Kits
für RT-PCR (AMV;
Roche Biomedical, Basel, Schweiz) mit Oligo d(T)15 als
Primer ausgeführt.
Die für
die Vermehrung der cDNAs von Interesse verwendeten Primer wurden
durch Mycrosynth (Windisch, Schweiz) synthetisiert.
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Die
Sequenz der Vorwärts-
beziehungsweise Rückwärts-Primer
war:
5'-GTTGCTATCCAGGCTGTG-3' und
5'-CATAGTCCGCCTAGAAAGC-3' für das Aktin-Gen.
5'-ATGAGAGCCTCACACTCCGT-3', und
5'-GATGTGGTCAGCCAACTCGT-3', für das Osteocalcin-Gen,
5'-AGAGGTGGTGGAAGAAACTG-3', und
5'-GCTTCTGCTTCTCAGTCAGA-3' für das Osteonectin-Gen.
5'-CAGTGATTTAGGGCGCATTC-3' und
5'-GAAATGCGCCTAGGCACATC-3'für das Cbfa-1-Gen.
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Die
PCR-Reaktion wurde für
2 Zyklen auf 98°C
für 1 Min.,
60°C für 2 Min.
und 72°C
für 2 Min. erhitzt
und anschließend
mit einem 1 Min. Denaturierungsschritt bei 94°C, einem 1 Min. Annealingschritt bei
60°C und
einem 2 Min. Extensionsschritt bei 72°C in einem DNA-Thermalzyklisiergerät (Bioconcept, Allschwill,
Schweiz) 28-mal zyklisiert. Die Aktin-Primer wurden in die Reaktion
als interne Kontrolle eingeschlossen. Die PCR-Produkte (10 μl) wurden
auf einem 2% Agarosegel aufgetrennt und durch eine Ethidiumbromid-Färbung sichtbar
gemacht. Eine Quantifizierung der PCR-Produkte wurde unter Verwendung
des densitometrischen NIH-Imager-Programms ausgeführt.
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Beispiel 7
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TRAP-Test
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Der
Telomerase-Wiederholungs-Vermehrungs-Protokol (TRAP)-Test wurde
an den Zellextrakten, wie vorher beschrieben (Kirn et al., Science
266 (1994), 2011–2015)
ausgeführt.
Es wurden 106 Zellen in 200 μl Lysepuffer
(10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM MgCl2,
1 mM EGTA, 0, 5% CHARPS, 10% Glycerol) lysiert. Die Zelllysate wurden für 20 Min.
bei 14.000 Upm bei 4°C
zentrifugiert. Es wurde der Überstand
gesammelt und die Proteinmenge unter Verwendung des Bradford-Proteintests
(Biorad) bestimmt. Es wurden 2 μl
Zelllysat, die 50 μg
Protein entsprechen, zu 48 μl
eines Reaktionsgemisches zugegeben, welches beinhaltet: 5 μl TRAP-Puffer
10 × (200
mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 3, 15 mM MgCl2,
10 mM EGTA, 680 mm KCl, 0,5% Tween), 0,25 μl 10 mM dNTPs, 1, 8 μl 50 ng/μl Primer
M2, 1,8 μl
50 ng/μl
Primer CX und 0,4 μl
5U/μl Taq-Polymerase.
Die Sequenz der Primer war:
5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' für den Primer
M2, und
5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3' für den Primer
CX.
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Die
Telomerasereaktion wurde für
30 Min. bei Raumtemperatur fortgesetzt bevor die PCR-Reaktion gestartet
wurde: Erwärmen
für 1 Zyklus
auf 94°C
für 2 Min.
und dann mit einem 10 Sek. Denaturierungsschritt bei 94°C, einem
25 Sek. Annealingschritt bei 50°C
und einem 30 Sek. Extensionsschritt bei 72°C für 30-mal, und einem zusätzlichen
Zyklus mit einem 15 Sek. Denaturierungsschritt bei 94°C, einem
25 Sek. Annealingschritt bei 50°C
und einem 1 Min. Extensionsschritt bei 72°C in einem DNA Thermozyklisiergerät zyklisiert.
Es wurden 20 μl
des PCR-Produkts in einem 10% Acrylamidgel aufgetrennt und durch
eine SYBR-Grün
I Gelfärbung
(Molecular Probes) sichtbar gemacht.
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Beispiel 8
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Karyotyp-Analyse
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Es
wurden semi-konfluente Kulturen zu dem Zellkultur-Labor im Kinderkrankenhaus
von Michigan für
Karyotyp-Analysen geschickt. Für
Chromosomenuntersuchungen wurden exponentiell wachsende Kulturen
mit 0,04 μg/ml
von Colcemid für
1–2 Stunden
behandelt, mit Trypsin behandelt und mit 0,0375 M KCl für 9 Minuten
behandelt und in einem 3:1 Methanol: Eisessig-Gemisch fixiert. Die
Suspension wurde zentrifugiert und einige Male in Fixiermittel gewaschen
und schließlich
auf kalte feuchte Objektträger
(Peterson, W. D. Jr. et al, Methods in Enzymology 58 (1979); 164–178) getropft.
Die Objektträger
wurden an der Luft getrocknet und mit einer 4% Giemsa-Lösung gefärbt. Die
mit Giemsa gefärbten
Objektträger
wurden für
Ploidie-Verteilung, Zählungen
und konstitutionelle Abenationen verwendet. Für ein Giemsa-Banding mit Trypsin
wurden Karyotypen durch ein modifiziertes Ver fahren von Seabright
(Seabright, M. A, Lancet (1971); 971–972) (2) hergestellt. Die
Objektträger
wurden bei 60°C
auf einem Objektträger-Heizgerät für 16–20 Stunden
gereift, in 0,025% Trypsin für
1–2 Sekunden
eingetaucht, mit 4% Giemsa-Lösung
für 11
Minuten gefärbt,
in Puffer gewaschen, getrocknet und in Permount eingebettet. Es
wurden gut bandierte Metaphasen unter Verwendung des AKSII Image-Analysatorsystems
karyotypisiert.
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Es
wurde ein Minimum von 7 Karyotypen von diesen Drucken hergestellt
und gemäß des standardisierten
menschlichen Karyotyps angeordnet. Die Karyotypen wurden gemäß der Standardnomenklatur
(ISCN An International System for Human Cytogenetic Nomenclature,
Mitelman F. (ed.) Basle, Karger, 1995) beschrieben.
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Es
wurden zwei Chromosomenmarker ausführlicher untersucht. Die Chromosomen
11 und 15, welche eine bedeutende Beteiligung in hPOB-Zellen zeigten,
zeigen nun bewährte
Marker in hPOB-tert-Zellen. Die Isoenzym-Phänotyp-Muster stimmen mit denen
von hPOB-Zellen überein.
Diese Befunde identifizieren hPOB-tert-Zellen praktisch bestimmt
als einen Abkömmling
von hPOB-Zellen. Es wurden keine anderen Zellen als die der Zelllinie hPOB-tert (Passage 39)
in der Kultur festgestellt.