DE19653685A1 - In vitro Zellsystem vaskulärer glatter Muskulatur für pharmakologische und physiologische Untersuchungen - Google Patents
In vitro Zellsystem vaskulärer glatter Muskulatur für pharmakologische und physiologische UntersuchungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein in vitro Zellsystem für
pharmakologische und physiologische Untersuchungen an vaskulären
glatten Muskelzellen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die
medizinische und pharmakologische Forschung und die
pharmazeutische Industrie.
Eine der charakteristischen Eigenschaften vaskulärer glatter
Muskelzellen (vascular smooth muscle cells = VSMC, VSM-Zellen)
ist ihre Kontraktilität. Bei der Bildung atherosklerotischer
Läsionen infolge postangioplastischer Restenosis und bei
Bluthochdruck verlieren VSM-Zellen jedoch ihren differenzierten
kontraktilen Phänotyp und dedifferenzieren, ein Prozeß, der als
"phänotypische Plastizität" bekannt ist (Owens, G. K., Physiol.
Rev. 75 : 487-517, 1995). Auch unter herkömmlichen in vitro-
Bedingungen dedifferenzieren glatte Muskelzellen, verändern
rasch ihr normales Genexpressionsmuster, die Synthesefähigkeit
kontraktiler Proteine und verlieren ihr spontanes
Kontraktionsverhalten im Verlauf der Kultivierung (Chamley, J.
P. et al., Cell Tissue Res. 177 : 503-22, 1977; siehe Owens,
1995). Die Eigenschaften kultivierter VSM-Zellen sind weiterhin
stark von den verwendeten Isolations- und Kulturbedingungen bei
der Etablierung der Primärkultur abhängig (Sjolund et al., J.
Cell Biol. 106 : 403-413, 1988, siehe Owens, 1995). Dies erschwert
die Analyse der Regulation der Expression VSMC-spezifischer
Marker-Gene an Primärkulturen glatter Muskelzellen sowie
Untersuchungen über die Rolle mechanischer und Stressfaktoren
bei pathologischen Veränderungen, und damit die Möglichkeit,
kultivierte VSM-Zellen als Modellobjekt für pharmakologisch
physiologische Untersuchungen einzusetzen.
Pharmakologisch-physiologische Untersuchungen medizinischer
Wirkstoffe an vaskulären Zellen der glatten Muskulatur werden
derzeit vor allem an Primärkulturen von Aorten von Laborsäugern,
an lebenden Präparaten und in einigen Fällen auch an permanenten
Linien durchgeführt. Sowohl Primärkulturen, aber insbesondere
permanente Linien aus glatten Muskelzellen, sind jedoch in der
Zellkultur mehr oder weniger dedifferenziert, sie zeigen keine
spontane Kontraktilität mehr und sind durch veränderte
Expressionsmuster Gewebe-spezifischer Gene und Proteine
charakterisiert. Die Untersuchung von Einflüssen exogener
modifizierender Faktoren auf die Ausprägung pathologischer
Zustandsformen von VSM-Zellen ist mit den bisherigen Kultur
verfahren nicht möglich, da diese bereits per se dedifferenziert
sind.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Etablierung eines auch
für den Routineeinsatz geeigneten in vitro-Testverfahrens zur
Untersuchung der pharmakologischen Wirksamkeit medizinisch
relevanter Wirkstoffe an vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC),
sowie die Analyse der Wirkung exogener Faktoren, die im Verlauf
der Entwicklung zu pathologischen Veränderungen vaskulärer
Zellen führen können.
Die Zielstellung der Erfindung wird mit einem in vitro-
Zellmodell glatter Gefäßmuskelzellen erreicht, welches gemäß den
Ansprüchen 1-10 aufgebaut wird.
Dieses Modell ist dadurch gekennzeichnet, daß man pluripotente
embryonale Stammzellen in definierte Zellaggregate (embryoid
bodies) überführt, diese Zellaggregate mit Retinsäure und ggf.
weiteren Faktoren im Zeitraum zwischen dem 6. und 12., bevorzugt
dem 7.-11. Tag, inkubiert und die gebildeten vaskulären glatten
Muskelzellen im Testverfahren einsetzt. Von Bedeutung ist die
Einhaltung definierter Verfahrensbedingungen.
Für die Ausführung des Verfahrens sind alle pluripotenten
embryonalen Stammzellinien (z. B. D3, CCE, R1, J1) geeignet.
Zur Bildung der embryoid bodies wird in an sich bekannter Weise
eine Suspensionskultur, vorzugsweise in einem hängenden Tropfen
innerhalb von 2-3 Tagen, durchgeführt. Dabei werden zur Bildung
der embryoid bodies mindestens jeweils 600-800 Stammzellen in 20 µl
Kulturmedium verwendet. Die Bildung von embryoid bodies unter
Masse-Kulturbedingungen in bakteriologischen Petrischalen ergibt
weniger effiziente Differenzierung.
Die gebildeten embryoid bodies werden nach der Kultivierung in
hängenden Tropfen (2-3 Tage) sowie in Suspension für weitere 4-5
Tage differenziert, auf adhäsiven Unterlagen ausplattiert und
weiter kultiviert.
Der wichtigste Schritt des erfindungsgemäßen in vitro
Zellsystems ist die Induktion der Differenzierung mit Retinsäure
und bevorzugt db-cAMP (Dibutyryl-cyclisches Adenosinmono
phosphat). Nach dieser Induktion erhält man in annähernd 70% der
embryoid bodies spontan kontrahierende glatte Muskelzellen,
während in der unbehandelten Kontrolle in nur ca. 10% der
embryoid bodies solche Zellen auftreten.
Anstelle von bzw. zusätzlich zu db-cAMP können auch weitere
Wachstumsfaktoren wie EGF (epidermaler Wachstumsfaktor), VEGF
(vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor), ECGF (endothelialer
Wachstumsfaktor), FGF (Fibroblasten Wachstumsfaktor) oder TGF-β
(transformierender Wachstumsfaktor β) eingesetzt werden. Als
zusätzliche Differenzierungsinduktoren neben Retinsäure sind
auch extrazelluläre Matrixproteine wie Kollagene, Fibronektin,
Laminin oder Thrombospondin-1 anwendbar. Gleichermaßen kann auch
eine Kombination von einem oder mehreren Wachstumsfaktoren und
einem oder mehreren Matrixproteinen bzw. das komplexe Matrix- und
Differenzierungsfaktor-Gemisch MATRIGEL eingesetzt werden.
Von wesentlicher Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg des
VSM-Zellsystems ist ein häufiger Wechsel des Kulturmediums.
Damit werden offenbar humorale Faktoren entfernt, die sich
während der embryoid body-Differenzierung bilden und die die
weitere Differenzierung von vaskulären glatten Gefäßmuskelzellen
beeinträchtigen. Dieser Wechsel kann entweder periodisch
(bevorzugt täglich) oder kontinuierlich (im strömenden Medium
unter Perfusionsbedingungen) erfolgen.
Das neue Verfahren erlaubt auch unter Bedingungen der Zellkultur
die Entwicklung spontan kontrahierender und funktionsfähiger
glatter Muskelzellen, die entwicklungsabhängig VSMC-spezifische
Gene, Proteine und Rezeptoren exprimieren. Es konnte eindeutig
der Nachweis der Expression der vaskulären splice-Variante des
smooth muscle myosin heavy chain (SM-MHC) Gens in Abhängigkeit
vom Differenzierungsstadium mit Hilfe der "single cell" RT-PCR
erbracht werden, und eindeutig zwischen der Expression der
intestinalen und vaskulären Variante des SM-MHC unterschieden
werden. Mit immunhistochemischen Analysen wurde die Bildung
charakteristischer Proteine, wie SM-MHC, SM-α-Actin sowie des
Angiotensin II-Rezeptors nachgewiesen. Die in vitro
differenzierten vaskulären glatten Muskelzellen reagieren
gegenüber spezifischen Agonisten, wie Angiotensin, Bradykinin,
Histamin, PDGF AB, Thrombin und Endothelin mit einer Erhöhung
der intrazellulären Ca2⁺ Konzentration (siehe Beispiel 2, C).
Elektrophysiologische (patch-clamp) Analysen bestätigten die
Expression von spannungsabhängigen Ionenkanälen glatter
Muskelzellen.
Damit liegt erstmals ein funktionsfähiges Zellsystem glatter
Gefäßmuskelzellen vor, bei dem ein normales Entwicklungsprogramm
in vitro abläuft und funktionelle Eigenschaften in Kultur
erhalten werden.
Aufgrund des Erhalts der normalen Zellfunktionen unter in vitro-
Bedingungen bietet das Zellsystem die Möglichkeit, Unter
suchungen über die phänotypische Plastizität in vitro
durchzuführen, da bei den ES-Zell-differenzierten VSMC keine
"Kultur-Artefakte" vorliegen. Daher können Untersuchungen
durchgeführt werden, die Beziehungen zwischen Proliferation und
Differenzierung im Verlauf artherosklerotischer Prozesse
aufklären, z. B. die Beeinflussung der Bildung von Myosin- und
Actin-Filamenten, von intrazellulären Signalmolekülen, bzw. der
gewebespezifischen Genexpressionsmuster von VSMC.
Weiterhin erlaubt der Einsatz des vorliegenden Zellsystems:
- 1) Untersuchungen der pharmakologischen Wirkung medizinisch relevanter Pharmaka und Wirkstoffe unter in vitro Bedingungen bei einem Erhalt der "normalen" physiologischen Eigenschaften vaskulärer glatter Muskelzellen.
- 2) Eine Verringerung der Einsatzes von Laborsäugern (z. B. Meerschweinchen, Ratte, Maus) durch die Etablierung des in vitro Modells VSM-Zellen,
- 3) Die Durchführung pharmakologischer und physiologischer Untersuchungen unter standardisierten in vitro-Bedingungen, und
- 4) Untersuchungen zur Wirkung exogener Faktoren auf die phänotypische Modifikation und Dedifferenzierung im Verlauf der Entstehung pathologischer Zustandsformen glatter Muskelzellen.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher
erläutert werden.
Ausgangsmaterial ist die embryonale Stammzellinie D3, die in
undifferenziertem Zustand auf einem feeder layer primärer
embryonaler Fibroblasten der Maus (Wobus et al., Differentiation
48 : 173-182, 1991) kultiviert wurde. Die Zellen wurden auf mit
Gelatine (0,1%) behandelten Petri Schalen (Falcon) in
Kulturmedien, basierend auf Dulbecco's modifiziertem Eagles
Medium (DMEM, Gibco BRL, Life Technologies GmbH) kultiviert,
ergänzt durch 15% fetales Kälberserum (FCS, Gibco), L-Glutamin
(Gibco, 2 mM), β-Mercaptoethanol (Serva, Heidelberg, FRG;
Endkonzentration 5 × 10⁻5 M), nicht-essentiellen Aminosäuren
(Gibco, Stammlösung 1 : 100 verdünnt) und Penicillin/Streptomycin
(Seromed, 100 U/ml oder 100 µg/ml, entsprechend). Zur
Differenzierung in glatte Muskelzellen wurden embryonale
Stammzellen in hängenden Tropfen in embryoid bodies wie
beschrieben (Rohwedel et al., Dev. Biol. 164 : 87-101, 1994)
kultiviert; 800 Zellen in 20 µl Kultivierungsmedium ergänzt mit
20% FCS, L-Glutamin, β-Mercaptoethanol und nichtessentiellen
Aminosäuren (s. o.), werden in Petri Schalen, die mit phosphat
gepufferter Saline (PBS) gefüllt sind, überführt und in
hängenden Tropfen 2 Tage kultiviert. Die embryoid bodies werden
dann in bakteriologische Schalen überführt, 5 weitere Tage in
Suspension kultiviert und einzeln in 24-well Schalen (Nunclon)
zur morphologischen Analyse plattiert. Zur weiteren
Differenzierung werden diese embryoid bodies in die mit
Gelatine bedeckten Schalen überführt, wo sie in spontan
kontrahierende glatte Muskelzellen differenzieren. Die ersten
Kontraktionen sind am Tag 14 der Kultivierung zu beobachten.
All-Trans-Retinsäure (RA, Serva) wurde im Dunkeln in 96% Ethanol
in einer Stammlösung von 10⁻3 M gelöst. Aliquots wurden bei
-20°C eingefroren und jeweils nur für ein einzelnes Experiment
verwendet. Dibutyryl-cAMP (db-cAMP, Dibutyryl-A-3 : 5-MP,
Boehringer Mannheim) wird in deionisiertem Wasser zu einer 100
mM Vorratslösung gelöst. Aliquots von db-cAMP wurden bei -20°C
eingefroren und in der Endkonzentration 0,5 × 10⁻3 M verwendet.
VEGF (BioConcept GmbH, Endkonzentration 20 ng/ml), ECGF
(Boehringer Mannheim, Endkonzentration 100 µg/ml), bFGF
(BioConcept, Endkonzentration 20 ng/ml), aFGF (Boehringer
Mannheim, Endkonzentration 10 ng/ml) oder TGF-β (5 ng/ml) wurden
dem Medium in ähnlichen Zeitintervallen wie für Retinsäure
beschrieben zugesetzt. In einigen Experimenten wurden
extrazelluläre Matrix-Proteine, wie Collagen I und III (Type S
bovine, Boehringer Mannheim), Fibronectin (Biomol, 40 µg/ml),
Laminin (10 µg/ml) und Thrombospondin-1 (Biomol, 100 ng/ml), zur
0,1%igen Gelatinelösung zugesetzt und auf die Petrischalen vor
dem Plattieren der 7 Tage alten embyoid bodies übertragen. In
anderen Experimenten wurden extrazelluläre Matrix-Proteine,
extrahiert vom Engelbrecht-Holm-Swarm Tumor (Matrigel, Gibco
BRL), zur Bedeckung der Petri-Schalen verwendet.
Die Differenzierung wird mit Retinsäure (RA) und mit oder ohne
db-cAMP induziert, während folgender Zeitintervalle: vom Tag 0
bis 2, vom Tag 0 bis 7, vom Tag 7 bis 11 und vom Tag 9 bis 11
der embryoid body Differenzierung. In allen Fällen wurden die
embryoid bodies am Tag 7 plattiert. Die differenzierten
Phänotypen wurden in den differenzierten embryoid bodies
("embryoid body outgrowths") durch mikroskopische morphologische
Analyse und mit Immunofluoreszenz identifiziert. In jeder
experimentellen Gruppe wurden 24 embryoid bodies ausgewählt und
die Zahl der embryoid bodies mit kontrahierenden glatten
Muskelzellen ermittelt.
Dabei zeigten sich nach Behandlung mit RA (10⁻8 M) und db-cAMP
(5 × 10⁻2 M) zwischen dem 7. und 11. Tag der Kultivierung in ca.
60% der embryoid bodies 3-4 Wochen nach Kulturbeginn Areale
spontan kontrahierender VSMC (siehe Abbildung, Teil A).
Vor der Einzelzell RT-PCR Analyse wurden die Areale glatter
Muskelzellen mit chirurgischen Methoden unter einem
Präparations-Mikroskop ausgeschnitten, mit Collagenase IA
(Sigma, Konzentration 0,5 mg/ml) dissoziiert und für 30 min 37°C
auf Cellocate (Eppendorf) Glas Deckgläser, die vorher mit 0,1%
Gelatine bedeckt wurden, plattiert und in Kulturmedium für 48
Stunden bis zur Cytoplasma-Gewinnung kultiviert.
Die Expression gewebespezifischer Gene wurde mit Hilfe der
single-cell RT-PCR (Johanson et al., Neurochem. Int. 26 : 239-243,
1995) analysiert. Die Proben der embryoid bodies wurden in
Lysispuffer lysiert und die RNA isoliert (Biotecx Laboratories,
Inc.). Die reverse Transkription wurde mit Super Script II RNase
H⁻ Reverse Transkriptase und Random Hexameren (Boehringer
Mannheim) durchgeführt und die cDNA mit AmpliTaq DNA Polymerase
nach Vorschrift (Perkin Elmer) amplifiziert. Die folgenden Gene
wurden analysiert:
V-SM-MHC-A (vaskuläre Splice-Variante A des smooth muscle myosin heavy chain Gens)
I-SM-MHC-B (intestinale Splice-Variante B des smooth muscle myosin heavy chain Gens)
SM-α-Aktin (smooth muscle-α-Actin)
AII-R (Angiotension-II-Rezeptor)
β-Tubulin (als interne Kontrolle).
V-SM-MHC-A (vaskuläre Splice-Variante A des smooth muscle myosin heavy chain Gens)
I-SM-MHC-B (intestinale Splice-Variante B des smooth muscle myosin heavy chain Gens)
SM-α-Aktin (smooth muscle-α-Actin)
AII-R (Angiotension-II-Rezeptor)
β-Tubulin (als interne Kontrolle).
Es zeigte sich eine entwicklungskontrollierte Expression der
vaskulären splice Variante des smooth muscle-Myosin heavy chain
Gens (siehe Abbildung, Teil B).
Die Rezeptor-Funktion wurde mit Hilfe der Messung des Anstiegs
der intrazellulären Ca2⁺ Konzentration nach Zugabe spezifischer
Agonisten (AII = Angiotensin, PDGF AB = platelet-derived growth
factor Typ AB) untersucht (siehe Abbildung, Teil C).
Es ist die funktionelle Antwort (intrazelluläres freies Kalzium
(Ca2⁺)i) in differenzierten glatten Muskelzellen von embryoid
bodies, die mit verschiedenen vasoaktiven Agonisten behandelt
wurden, dargestellt. Die Rezeptorfunktion, gemessen durch das
Ansteigen der Fluoreszenz, wurde auf einer Vergleichsskala
aufgetragen, die von - (keine merkliche Veränderung) bis +++
(maximale beobachtete Antwort) reichte.
- A) Nach Entwicklung von embryoid bodies werden diese am Tag 7 plattiert und vom 7. bis 11. Tag der Differenzierung in Anwesenheit von Retinsäure und db-cAMP kultiviert. Die ersten spontan kontrahierenden glatten Muskelzellen werden 2 Wochen nach Kulturbeginn beobachtet. Im Durchschnitt zeigen 60% der embryoid bodies Areale spontan kontrahierender VSMC.
- B) Die Expression gewebespezifischer Gene wurde mit Hilfe der single cell-PCR und nachfolgender Sequenzierung analysiert, und eine vaskuläre splice-Variante des smooth muscle myosin heavy chain (V-SM-MHC) Gens isoliert. Während die intestinale splice-Variante keine gewebespezifische Expression zeigte, nimmt die Anzahl der V-SM-MHC A-Transkripte entwicklungsabhängig zu. Ebenso werden die Gene, die smooth muscle α-Aktin (SM-α-actin) und den Angiotensin-Rezeptor (AII-R) kodieren, entwicklungsabhängig exprimiert. β-Tubulin dient als interne Kontrolle.
- C) Die Rezeptor-Funktion wurde mit Hilfe der Messung des Anstiegs der intrazellulären Ca2⁺ Konzentration nach Zugabe spezifischer Agonisten (AII = Angiotensin, PDGF AB ist platelet derived growth factor Typ AB) untersucht.
Claims (10)
1. In vitro Zellsystem für pharmakologische und physiologische
Untersuchungen an vaskulären glatten Muskelzellen, dadurch
gekennzeichnet, daß pluripotente embryonale Stammzellen in
definierte Zellaggregate (embryoid bodies) überführt werden,
diese Zellaggregate durch Behandlung mit Retinsäure und ggf.
weiterer Faktoren im Zeitraum vom 6.-12. Tag, bevorzugt 7.-11.
Tag, der Differenzierung in vaskuläre glatte Muskelzellen
induziert und im Testverfahren eingesetzt werden.
2. In vitro Zellsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß embryoid bodies für die Dauer von 7-8 Tagen in
Suspensionskultur, davon 2-3 Tage bevorzugt in einem hängenden
Tropfen, kultiviert werden.
3. In vitro Zellsystem nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß zur Bildung der embryoid bodies mindestens jeweils
600-800 Stammzellen verwendet werden.
4. In vitro Zellsystem nach Anspruch 1-3, dadurch gekenn
zeichnet, daß die gebildeten embryoid bodies auf adhäsive
Unterlagen, z. B. Gewebekulturschalen oder Mikrotiterplatten,
ausplattiert und weiter kultiviert und in glatte Muskelzellen
differenziert werden.
5. In vitro Zellsystem nach Anspruch 1-4, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Differenzierung mit Retinsäure und db-cAMP
(Dibutyryl-cyclisches Adenosinmonophosphat) induziert wird.
6. In vitro Zellsystem nach Anspruch 1-4, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Differenzierung mit Retinsäure und anderen
Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, wie VEGF, ECGF, FGF
oder TGF-β, induziert wird.
7. In vitro Zellsystem nach Anspruch 1-4, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Differenzierung mit Retinsäure und extra
zellulären Matrixproteinen, wie Kollagen, Fibronektin, Laminin
oder Thrombospondin-1, induziert wird.
8. In vitro Zellsystem nach Anspruch 1-7, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Differenzierung mit Retinsäure und einer
Kombination von einem oder mehreren Wachstumsfaktoren und einem
oder mehreren Matrixproteinen, bzw. dem komplexen Matrix- und
Differenzierungsfaktor-Gemisch MATRIGEL, induziert wird.
9. In vitro Zellsystem nach Anspruch 1-8, dadurch gekenn
zeichnet, daß ein häufiger Austausch des Kulturmediums während
der in vitro Differenzierung, z. B. durch einen Mediumwechsel
alle 1-2 Tage, bevorzugt täglich, erfolgt.
10. In vitro Zellsystem nach Anspruch 1-9, dadurch gekenn
zeichnet, daß die in vitro Kultur und Differenzierung der
embryoid bodies unter Bedingungen kontinuierlichen
Medienwechsels, z. B. unter Bedingungen einer Perfusionskultur
erfolgt.
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| Country | Link |
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