DE60125035T2

DE60125035T2 - Behandlung von plasmid-haltigen lösungen

Info

Publication number: DE60125035T2
Application number: DE60125035T
Authority: DE
Inventors: Samuel Gulf Breeze NOCHUMSON; Yujing Newton YANG; L. Joe Irvington KINSEY
Original assignee: Pall Corp
Current assignee: Pall Corp
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2021-06-02
Also published as: WO2001094573A3; DE60125035D1; CA2410184A1; JP2003535589A; WO2001094573A2; EP1290158B1; AU2001268153A1; EP1290158A2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Behandeln von plasmidhaltigen Fluiden und betrifft insbesondere die Reinigung oder Abtrennung von Plasmiden aus einem plasmid- und endotoxinhaltigen Fluid und die Gewinnung eines gereinigten Plasmids.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mit der wachsenden Bedeutung von hochgereinigten Plasmiden z.B. in der Molekularbiologie und Medizin ist der Behandlung von plasmidhaltigen Fluiden in den letzten Jahren großes Interesse entgegengebracht worden. Hochgereinigte Plasmide sind für vielfältige Anwendungen in der Molekularbiologie, z.B. für die Sequenzierung, Klonierung und Hybridisierung (z.B. durch PCR), und in der Medizin, z.B. für die Gentherapie und Genimmunisierung, von Nutzen. Die Reinheit des Plasmids ist kritisch in diesen Anwendungen, insbesondere in der Medizin. Da das Plasmid einem Patienten verabreicht werden kann, sollte das Plasmid von pharmazeutischer Qualität sein. Das Plasmid sollte den Qualitätssicherheitsstandards für Arzneimittel entsprechen. So sollte das Plasmid z.B. frei sein von Substanzen wie Endotoxinen, die eine toxische Antwort auslösen könnten.
Plasmide, die extrachromosomale DNAs sind, werden allgemein aus plasmidhaltigen Fluiden, z.B. Bakterienzelllysaten, isoliert. Die Zelllysate enthalten eine Vielfalt von Kontaminanten, z.B. Zelldebris, Protein, RNA, chromosomale DNA und Endotoxine. Es sind bereits Verfahren vorgeschlagen worden zur Behandlung von plasmidhaltigen Fluiden wie Bakterienzelllysaten, z.B. für die Isolierung und Reinigung von Plasmiden, wobei jedoch viele dieser Verfahren mit Nachteilen behaftet sind. Bei einem üblichen Verfahren zum Behandeln eines rohen Bakterienzelllysats wird das rohe Lysat zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen. Das Lysat wird dann mit einem organischen Lösemittel, z.B. Phenol oder Chloroform, extrahiert, um den Protein-Kontaminanten zu entfernen. Der RNA-Gehalt des Lysats wird durch Behandlung mit Enzymen wie RNase vermindert.
Die EP 0 853 123 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Reinigung und/oder Konzentration von Nucleinsäuren in einer Lösung. Das Verfahren beinhaltet den Schritt der Cross-Flow-Filtration, wobei die Nucleinsäuren durch eine Membran zurückgehalten werden und Verbindungen geringeren Molekulargewichts durch die Membran passieren. Alternativ könnten die Verbindungen geringeren Molekulargewichts an der Membran adsorbiert werden. Als eine Folge dieses Verfahrensschrittes werden gereinigte und/oder konzentrierte Nucleinsäurelösungen erhalten. Auf ähnliche Weise können Endotoxine von einer Nucleinsäurezubereitung abgetrennt werden.
Ferner ist ein Schwebedichte-basiertes Trennverfahren vorgeschlagen worden, um plasmidhaltige Fluide zu behandeln. Dieses Verfahren beinhaltet das Mischen einer rohen Probe oder Zubereitung, welche ein Plasmid enthält, mit einem interkalierenden Farbstoff, z.B. Ethidiumbromid, mit nachfolgender Überschichtung der Probe auf eine Cäsiumchlorid-(CsCl-)Lösung höherer Schwebedichte. Die resultierende obere Schicht wird bei hohen Geschwindigkeiten zentrifugiert, um einen CsCl-Gradienten ansteigender Schwebedichte zu bilden. Der Farbstoff-/Plasmid-Komplex trennt sich als diskrete Bande, der Komplex wird aufgetrennt und das Plasmid aus dem Komplex zurückgewonnen.
Ferner sind Verfahren, welche die Verwendung von porösen Beads, Ionenaustauschharzen und Gelfiltrationsmedien beinhalten, zum Behandeln von plasmidhaltigen Fluiden vorgeschlagen worden.
Viele der vorstehenden Verfahren haben einen oder mehrere Nachteile. Beispielsweise enthalten die behandelten Plasmide immer noch Kontaminanten wie Endotoxine. Einige der Verfahren beinhalten mehrfache Schritte und sind arbeitsintensiv oder zeitaufwändig. Als eine Folge davon tendieren die Plasmide, insbesondere die wertvolle "supercoiled" Form des Plasmids dazu, während der Behandlung zu degradieren. Gewisse Verfahren verlangen die Verwendung von schädlichen oder harschen Chemikalien oder Lösemitteln. Beispielsweise ist Ethidiumbromid ein bekanntes Mutagen. Bei einigen Verfahren sind die für die Trennung eingesetzten Medien von begrenzter Bindungsaffinität und/oder -kapazität für das Makromolekül von Interesse. Einige der Verfahren lassen sich nicht leicht upscalen. Bei gewissen Verfahren können die in dem Prozess eingesetzten Materialien nicht wiederverwendet werden.
Gewisse andere Verfahren erzeugen Plasmide, die mit Enzymen kontaminiert sind, da diese Verfahren die Verwendung von Enzymen beinhalten, um den RNA-Kontaminanten zu degradieren und zu entfernen. Die Restenzyme erhöhen das Kontaminationsrisiko des Plasmids mit unerwünschten Materialien wie RNase. Da die Enzyme manchmal von einer Fremdquelle gewonnen werden, z.B. von einem Tier, können die Restenzyme eine Interspezieskontamination verursachen, wenn das Plasmid einem Patienten verabreicht wird. Weiter: da Enzyme das Plasmid verdauen können, kann sich die Qualität des Plasmids mit der Zeit verschlechtern, wenn kontaminierende Enzyme wie DNasen vorhanden sind. Enzyme können ferner teuer sein und die Kosten für die Plasmidreinigung in die Höhe treiben.
Es besteht also Bedarf nach einem Verfahren (sowie einem System und Kit) zur Behandlung von plasmidhaltigen Fluiden, um Plasmide zu erhalten, die frei oder im Wesentlichen frei von Endotoxinen sind. Es besteht ferner Bedarf nach einem Verfahren zum Behandeln von plasmidhaltigen Fluiden, welches die Verwendung von schädlichen oder harschen Chemikalien nicht beinhaltet oder verlangt. Es besteht ferner Bedarf nach einem Verfahren zum Behandeln von plasmidhaltigen Fluiden, welches die Verwendung von Enzymen nicht verlangt.
Die vorliegende Erfindung bessert mindestens einige der Nachteile der Verfahren nach dem Stand der Technik. Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zum Behandeln eines plasmidhaltigen Fluids. Bei einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines plasmid- und endotoxinhaltigen Fluids, umfassend: Inkontaktbringen des Fluids mit einer ersten Membran, die mindestens einen Teil des Plasmids bindet, und mit einer zweiten Membran, die mindestens einen Teil des Endotoxins bindet, und Gewinnen eines plasmidangereicherten und endotoxinverarmten Fluids, z.B. eines Fluids, welches gereinigtes Plasmid enthält.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines plasmid- und endotoxinhaltigen Fluids, umfassend: Inkontaktbringen des Fluids mit mindestens drei Membranen, von denen zwei mindestens einen Teil des Plasmids binden und von denen eine mindestens einen Teil des Endotoxins bindet, und Gewinnen eines plasmidangereicherten und endotoxinverarmten Fluids.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Membranen, welche das Plasmid und das Endotoxin binden, geladene Membranen. Die geladenen Membranen umfassen Ladung stellende Gruppen. Beispiele für Ladung stellende Gruppen umfassen Ionenaustauschgruppen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein System sowie ein Kit zum Behandeln von plasmidhaltigen Fluiden bereit. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zum Behandeln einer Mischung von "supercoiled" und offen-zirkulären Formen eines Plasmids, umfassend das Inkontaktbringen der Mischung mit einer positiv geladenen Membran.
Die vorliegende Erfindung stellt einen oder mehrere der folgenden Vorteile bereit. Das Verfahren, System oder Kit bietet hochgereinigte Plasmide, die frei oder im Wesentlichen frei von Endotoxinen sind. Die erhaltenen Plasmide sind frei von Enzymkontamination. Die erhaltenen Plasmide sind frei oder im Wesentlichen frei von Proteinen, chromosomaler DNA und/oder RNA. Die Plasmide haben einen hohen prozentualen Anteil an der wertvollen "supercoiled" Form.
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung verlangt nicht die Verwendung von harschen oder schädlichen Chemikalien. Das Verfahren verlangt nicht die Verwendung von Enzymen. Das Verfahren ist skalierbar. Das Verfahren kann kleine Mengen sowie große Mengen an hochgereinigten Plasmiden erzeugen. Die für das Verfahren verwendeten Membranen sind wiederverwendbar. Das Verfahren ist schneller, weniger zeitaufwändig und weniger arbeitsintensiv relativ zu zahlreichen, bereits bekannten Verfahren. Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung behandelt das plasmidhaltige Fluid mit wenig oder gar keiner Degradation der Plasmide, insbesondere der "supercoiled" Form des Plasmids.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Zusammensetzung des Eluats als Funktion des Retentionsvolumens aus einer plasmidbindenden Membran, die mit einem Bakterienlysat in Kontakt gebracht wird. Die x-Achse zeigt das Retentionsvolumen in ml. In den Kurven 1–3 zeigt die y-Achse auf der linken Seite die Absorbanz (in Milliabsorbanz-Einheiten oder "mAU") des Eluats bei 260 nm (Kurve 2) und 280 nm (Kurve 3) und der Basislinie bei 260 nm (Kurve 1). In Kurve 4 zeigt die y-Achse auf der rechten Seite die Leitfähigkeit (in Millisiemens/cm oder "mS/cm") des Eluats. Der Peak bei 401,94 ml korrespondiert zu dem Plasmid.
2 zeigt die Zusammensetzung des Eluats als Funktion des Retentionsvolumens aus einer ersten positiv geladenen Membran, die mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, welche "supercoiled" und offen-zirkuläre Formen eines β-Galactosidase-Reporterplasmids enthält. Die x-Achse zeigt das Retentionsvolumen in ml. Die y-Achse zeigt die Absorbanz (in mAU) für Kurve 1 und die Leitfähigkeit (in mS/cm) für Kurve 2. Die Membran erlaubt die Trennung der offen-zirkulären Form des Plasmids (kleiner Peak) von der "supercoiled" Form des Plasmids (großer Peak).
SPEZIFISCHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Behandeln plasmidhaltiger Fluide bereit. Das Verfahren ist schnell und gewinnt hochqualitative gereinigte Plasmide. Die Plasmide degradieren nicht, und die gewonnenen Plasmide sind frei oder im Wesentlichen frei von Endotoxinen.
Bei einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines plasmid- und endotoxinhaltigen Fluids, umfassend: Inkontaktbringen des Fluids mit einer ersten Membran, die mindestens einen Teil des Plasmids bindet, und mit einer zweiten Membran, die mindestens einen Teil des Endotoxins bindet, und Gewinnen eines plasmidangereicherten und endotoxinverarmten Fluids.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines plasmid- und endotoxinhaltigen Fluids, umfassend: Inkontaktbringen des Fluids mit einer ersten Membran und einer zweiten Membran, die mindestens einen Teil des Plasmids binden, und mit einer dritten Membran, die mindestens einen Teil des Endotoxins bindet, und Gewinnen eines plasmidangereicherten und endotoxinverarmten Fluids. Bei einer besonderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines Fluids, welches ein Plasmid, ein Protein und ein Endotoxin enthält, umfassend (a) Inkontaktbringen des Fluids mit einer ersten Membran, um mindestens einen Teil des Plasmids und des Endotoxins zu binden; (b) Inkontaktbringen der ersten Membran aus (a) mit einem Eluenten, um ein plasmid- und endotoxinhaltiges Eluat zu erhalten; (c) Inkontaktbringen des Eluats aus (b) mit einer zweiten Membran, die mindestens einen Teil des Endotoxins bindet; und (d) Gewinnen eines plasmidangereicherten und endotoxinverarmten Fluids.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines Fluids, welches ein Plasmid, ein Protein und ein Endotoxin enthält, umfassend (a) Inkontaktbringen des Fluids mit einer ersten Membran, um mindestens einen Teil des Plasmids und des Endotoxins zu binden; (b) Inkontaktbringen der ersten Membran aus (a) mit einem Eluenten, um ein erstes plasmid- und endotoxinhaltiges Eluat zu erhalten, optional: (b') Inkontaktbringen des ersten Eluats mit einer zweiten Membran, um mindestens einen Teil des Plasmids und des Endotoxins zu binden, und (b'') Inkontaktbringen der zweiten Membran aus (b') mit einem Eluenten, um ein zweites plasmid- und endotoxinhaltiges Eluat zu erhalten; (c) Inkontaktbringen des ersten oder des zweiten Eluats mit einer dritten Membran, um mindestens einen Teil des Endotoxins zu binden; und (d) Gewinnen eines plasmidangereicherten und endotoxinverarmten Fluids.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines ersten Fluids, welches ein Plasmid, ein Endotoxin und mindestens einen oder mehrere der Kontaminanten, die ausgewählt sind aus der aus chromosomaler DNA, RNA und Protein bestehenden Gruppe, enthält, wobei das Verfahren umfasst: (a) Behandeln des ersten Fluids mit einer ersten Membran, um ein zweites Fluid zu erhalten, welches relativ zu dem ersten Fluid mit dem Plasmid angereichert ist, (b) Behandeln des zweiten Fluids mit einer zweiten Membran, um ein drittes Fluid zu erhalten, welches Plasmid und Endotoxin enthält, (c) Behandeln des dritten Fluids mit einer dritten Membran, um mindestens einen Teil des Endotoxins zu binden, und (d) Gewinnen eines plasmidangereicherten und endotoxinverarmten Fluids.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die für die vorliegende Erfindung verwendeten Membranen geladen; z.B. enthalten sie Ionenaustauschgruppen. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines plasmidhaltigen Fluids, umfassend: Inkontaktbringen eines plasmidhaltigen Fluids mit einer ersten positiv geladenen Membran und einer zweiten geladenen Membran und Gewinnen eines gereinigten Plasmids. Vorzugsweise ist die zweite geladene Membran ebenfalls positiv geladen.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines plasmidhaltigen Fluids, umfassend das Inkontaktbringen eines plasmidhaltigen Fluids mit einer ersten positiv geladenen Membran, einer zweiten positiv geladenen Membran und einer dritten geladenen Membran und Gewinnen eines gereinigten Plasmids. Vorzugsweise ist die dritte geladene Membran ebenfalls positiv geladen.
Bei einer besonderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines Fluids, welches ein Plasmid, ein Protein und ein Endotoxin umfasst, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen des Fluids mit einer ersten positiv geladenen Membran, um das Plasmid und das Endotoxin zu binden; (b) Inkontaktbringen der ersten positiv geladenen Membran aus (a) mit einem Eluenten, um ein das Plasmid und das Endotoxin enthaltendes Eluat zu erhalten; (c) Inkontaktbringen des Eluats aus (b) mit einer zweiten geladenen Membran, um das Endotoxin zu binden; und (d) Gewinnen eines gereinigten Plasmids.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines Fluids, welches ein Plasmid, ein Protein und ein Endotoxin enthält, umfassend (a) Inkontaktbringen des Fluids mit einer ersten positiv geladenen Membran, um das Plasmid und das Endotoxin zu binden; (b) Inkontaktbringen der ersten positiv geladenen Membran aus (a) mit einem Eluenten, um ein das Plasmid und das Endotoxin enthaltendes Eluat zu erhalten, optional: (b') Inkontaktbringen des in (b) erhaltenen Eluats mit einer zweiten positiv geladenen Membran, um das Plasmid und das Endotoxin zu binden, und (b'') Inkontaktbringen der zweiten positiv geladenen Membran aus (b') mit einem Eluenten, um ein Eluat zu erhalten, welches Plasmid und das Endotoxin enthält; (c) Inkontaktbringen des Eluats aus (b) oder (b'') mit einer dritten geladenen Membran, um das Endotoxin zu binden; und (d) Gewinnen eines gereinigten Plasmids.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Behandeln eines ersten Fluids, welches ein Plasmid, ein Endotoxin und mindestens einen oder mehrere der Kontaminanten, die ausgewählt sind aus der aus chromosomaler DNA, RNA und Protein bestehenden Gruppe, enthält, wobei das Verfahren umfasst: (a) Behandeln des ersten Fluids mit einer ersten positiv geladenen Membran, um ein zweites Fluid zu erhalten, welches relativ zu dem ersten Fluid mit dem Plasmid und dem En dotoxin angereichert und an einem oder mehreren der Kontaminanten verarmt ist, (b) Behandeln des zweiten Fluids mit einer zweiten positiv geladenen Membran, um ein drittes Fluid zu erhalten, welches das Plasmid und Endotoxin enthält, (c) Behandeln des dritten Fluids mit einer dritten geladenen Membran, um das Endotoxin zu binden, und (d) Gewinnen eines gereinigten Plasmids.
Das gemäß vorliegender Erfindung zu behandelnde plasmidhaltige Fluid kann ein beliebiges geeignetes Plasmid umfassen. Beispielsweise kann das Fluid aus jeder geeigneten Quelle hergestellt, abgeleitet oder gewonnen sein, z.B. aus einem Prokaryoten oder einem Eukaryoten, z.B. Bakterien oder Hefe. Eine bevorzugte Plasmidquelle ist E. coli. Beispiele für Plasmide umfassen pGEM, pCAT, pUC19 und pBR322. Weitere Beispiele umfassen F, R1, Col, Col E1, R6, Ent, Cam und T1. Die Plasmide können offen-zirkulär, linear, "nicked", relaxiert oder, vorzugsweise, "supercoiled" sein. Die Plasmide können Plasmide hoher Kopienzahl, niedriger Kopienzahl oder Runaway-Plasmide sein. Sie können ein Spektrum an genetischen Elementen enthalten, welche selektierbare Gene, Polylinker, Replikationsursprünge, Promotoren, Enhancer, Leader-Sequenzen, Polyadenylierungsstellen und/oder Terminationssequenzen umfassen.
Das plasmidhaltige Fluid, z.B. das plasmid- und endotoxinhaltige Fluid, kann z.B. aus Bakterienzellen wie folgt hergestellt werden. Die Bakterienzellen werden mit einer Alkalilösung, z.B. 0,2 M NaOH mit 1% SDS, lysiert, um ein Lysat zu erhalten, welches das Plasmid, chromosomale DNA, RNA und Protein enthält. Ein größerer Teil des Proteins und der chromosomalen DNA kann durch Zugabe einer Salzlösung, z.B. angesäuertes Kaliumacetat, wie 3–4 M Kaliumacetat bei pH 5,5, ausgefällt werden. Die Präzipitate können mittels Filtration durch ein Filter, z.B. ein Tuch- oder Papierfilter, und optional durch eine mikroporöse Membran, z.B. eine 0,2 μm-Polyethersulfon-Membran, z.B. eine SUPOR^TM-Membran (Pall Corp., East Hills, NY), entfernt werden. Bei einer Ausführungsform kann das Lysat in einer Filterstraße, welche ein 20 μm-Filter, ein 0,7 μm-Filter und ein 0,2–0,8 μm-Filter umfasst, geklärt werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das geklärte Lysatfiltrat mit einer ersten Membran in Kontakt gebracht, z.B. mit einer ersten positiv gela denen Membran. Das Filtrat kann optional verdünnt werden, z.B. mit Wasser, bevor es mit der ersten Membran in Kontakt gebracht wird. Die erste Membran bindet Plasmide und, bei einigen Ausführungsformen, die Endotoxine. Es ist bevorzugt, wenn die erste Membran Kontaminanten, wie Protein, chromosomale DNA und/oder RNA, relativ zu dem Plasmid schwach bindet oder, mehr bevorzugt, wenn die Membran die Kontaminanten nicht bindet.
Typisch kann jedes gebundene Protein, chromosomale DNA oder RNA von der ersten Membran entfernt werden durch Waschen mit einem Puffer mit einer niedrigen Ionen- (oder Salz-)Konzentration, derart, dass das gebundene Plasmid von der Membran nicht entfernt wird, die Kontaminanten aber entfernt werden. Beispielsweise kann eine Salzlösung, wie eine NaCl-Lösung von ca. 0,5 M bis ca. 0,6 M, vorzugsweise ca. 0,6 M, in einem geeigneten Puffer, z.B. Tris-HCl, verwendet werden, um die Kontaminanten selektiv zu entfernen. Das Wort "eluieren" in der vorliegenden Anmeldung bezieht sich auf auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, umfassend Waschen, Entfernen, Desorbieren und/oder Extrahieren.
Nach der Entfernung der Kontaminanten kann das gebundene Plasmid mit einer Salzlösung, z.B. einer NaCl-Lösung, mit höherer Ionenkonzentration, z.B. ca. 0,7 bis ca. 1,0 M, vorzugsweise ca. 0,8 M, in einem geeigneten Puffer, eluiert werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Puffer ist ein Tris-Puffer wie Tris-HCl bei pH 8,0. Der Puffer kann bei einem pH-Wert von ca. 7 bis ca. 9 liegen, vorzugsweise bei ca. 9,0. Der Puffer kann eine Ionenkonzentration von ca. 1 mM bis ca. 50 mM aufweisen. Der Puffer kann eine Leitfähigkeit von z.B. ca. 70 mS/cm aufweisen.
1 zeigt die Zusammensetzung des Eluats aus einer ersten positiv geladenen Membran, die mit dem gefilterten Bakterien-(E. coli-)Lysat kontaktiert wird. Die Membran, in Form eines Moduls mit einer Kapazität von 10 ml konfiguriert, wird mit dem Lysat kontaktiert. Die Membran wird mit 0,5 M NaCl in Tris-Puffer bis zu einem Retentionsvolumen von ca. 300 ml eluiert. Anschließend wird ein Gradient von NaCl, 0,5 M bis 1,0 M, in dem Tris-Puffer für die Elution verwendet. Der Peak bei 401,94 ml korrespondiert zu dem Plasmid pGEM. Die Peaks bei den niedrigeren Retentionsvolumina 343,65, 352,41, 365,85 und 394,06 ml korrespondieren zu den Kontaminanten, welche Proteine, RNA und chromosomale DNA umfassen. Von Kontaminanten, die bei Retentionsvolumina von bis zu ca. 220 ml eluieren, wird angenommen, dass sie Oligonucleotide umfassen.
Optional wird die erste Membran (welche das Plasmid bindet) mit einem nichtionischen Tensid in Kontakt gebracht. Das Inkontaktbringen der Membran mit dem nichtionischen Tensid kann vor oder gleichzeitig mit dem Inkontaktbringen mit dem plasmidhaltigen Fluid durchgeführt werden. Alternativ kann die Membran mit dem nichtionischen Tensid in Kontakt gebracht werden, indem dieses in das plasmidhaltige Fluid mit aufgenommen wird. Es kann jedes geeignete nichtionische Tensid, z.B. ethoxylierte Alkylphenylether, verwendet werden. Ein besonderes Beispiel für ethoxylierten Alkylphenylether ist Polyoxyethylen-(10)-isooctylphenylether, erhältlich als TRITON X-100^TM. Beispielsweise wird das plasmidhaltige Fluid mit einer nichtionischen Tensidlösung, z.B. einer 5% TRITON X-100-Lösung, auf eine Endkonzentration von ca. 1% des nichtionischen Tensids verdünnt, bevor das plasmidhaltige Fluid auf die Membran aufgeladen wird. Die Verwendung des nichtionischen Tensids erhöht die Reinheit des Plasmids. Es wird angenommen, dass das nichtionische Tensid die Bindung von Endotoxin an die Membran, welche Plasmid bindet, verhindert oder vermindert.
Als eine weitere Option kann das aus der ersten Membran erhaltene Eluat behandelt, z.B. mit einer zweiten Membran (die Plasmide bindet) in Kontakt gebracht werden, insbesondere wenn die Kontaminanten übermäßig sind, und die Reinigung wird wiederholt. Beispielsweise kann die Fraktion, die bei oder um 401,94 ml eluiert (1), aufgefangen und mit der zweiten Membran in Kontakt gebracht werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das zu behandelnde plasmidhaltige Fluid mit der ersten Membran in Kontakt gebracht, derart, dass eine wesentliche Menge, z.B. 50% oder mehr, der Kontaminanten rasch entfernt werden während dieses Aspekts des Verfahrens. Das aus der ersten Membran erhaltene Eluat enthält Plasmide, Endotoxine und eine verminderte Menge der Kontaminanten wie Protein, chromosomale DNA und/oder RNA. Eine optionale zweite Membran wird verwendet, um das Eluat aus der ersten Membran weiter zu reinigen. Restkontaminanten wie Protein, chromosomale DNA und RNA werden während dieser optionalen Behandlung mit der zweiten Membran entfernt, da diese Kontaminanten nicht stark an die Membran binden oder leicht weggewaschen werden können. Das gebundene Plasmid und Endotoxin werden von der zweiten Membran mit einem geeigneten Eluenten eluiert.
Das resultierende Eluat ist mit Plasmid angereichert und an Protein sowie anderen Kontaminanten wie chromosomale DNA, RNA und Endotoxinen verarmt. Das plasmidreiche Eluat wird mit einer zweiten Membran (die Endotoxine bindet) nach einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung in Kontakt gebracht. Bei Verwendung einer optionalen zweiten Membran zum Binden des Plasmids sollte die zum Binden des Endotoxins verwendete Membran als dritte Membran bezeichnet werden.
Die zweite Membran, die das Endotoxin bindet (oder, fallweise, die dritte Membran), ist bevorzugt geladen. Die zweite Membran kann positiv geladen oder negativ geladen sein. Eine positiv geladene Membran wird bevorzugt. Die zweite geladene Membran bindet Endotoxine mit einer größeren Affinität und/oder Kapazität als Plasmide. Die mit Plasmid, Endotoxin und anderen Kontaminanten beladene zweite geladene Membran wird mit einer Salzlösung, z.B. einer NaCl-Lösung mit einer Konzentration von ca. 0,5 M bis ca. 0,6 M, vorzugsweise ca. 0,6 M, gewaschen, um die Proteine, RNA und/oder chromosomale DNA zu entfernen. Hieran schließt sich eine Gradientenelution an, wobei die Salzkonzentration graduell erhöht wird, z.B. von ca. 0,5 M auf ca. 0,8 M. Das Plasmid eluiert während der Gradientenelution. Das durch diesen Prozess erhaltene Plasmid ist frei oder im Wesentlichen frei von Endotoxinen, z.B. einem oder mehreren Lipopolysacchariden.
Das Plasmid kann aus dem Eluat nach dem Fachmann bekannten Verfahren wiedergewonnen werden, z.B. durch Ultrafiltration/Diafiltration, die z.B. in einem Tangentialflussfiltrationsmodus betrieben werden kann. Vorzugsweise wird Diafiltration verwendet, um die in dem oben erhaltenen Plasmid vorhandenen Salze zu entfernen. Es kann eine beliebige geeignete Diafiltrations membran verwendet werden, z.B. eine Ultrafiltrationsmembran, beispielsweise eine Ultrafiltrationsmembran mit einem MWCO von ca. 30 000 bis ca. 300 000, vorzugsweise von ca. 70 000 bis ca. 100 000. Es kann eine beliebige geeignete Diafiltrationslösung verwendet werden, z.B. 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0; 1 mM EDTA. Die resultierende Plasmidlösung kann konzentriert werden, um ein Plasmidkonzentrat zu erhalten.
Die Plasmidlösung kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren konzentriert werden, z.B. durch Tangentialflussfiltration, z.B. über eine Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran. Das Plasmid kann sterilisiert werden, z.B. sterilfiltriert durch eine mikroporöse Membran, z.B. eine Membran mit Porenkenndaten von ca. 0,1 bis ca. 0,2 μm, vorzugsweise ca. 0,2 μm. Das so isolierte Plasmid ist von hoher Reinheit (und kann in hoher Ausbeute erzeugt werden) und ist für viele kritische Anwendungen geeignet, einschließlich für die Gentherapie.
Bei einer Ausführungsform ist das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung besonders geeignet zum Behandeln von Fluiden, welche "supercoiled" Plasmid enthalten; und bei einer anderen Ausführungsform ist es geeignet zum Behandeln von Fluiden, welche relaxiertes Plasmid enthalten.
Die erste Membran kann jede geeignete Membran sein, die Bindungskapazität für Plasmide aufweist. Beispiele für solche Membranen sind in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 00/50161, mit Veröffentlichungsdatum vom 31. August 2000, offenbart. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Membran positiv geladen, und bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erste positiv geladene Membran hydrophil. Bei einer Ausführungsform umfasst die erste positiv geladene hydrophile Membran ein poröses Substrat und eine vernetzte Beschichtung mit kationischen Gruppen. Vorzugsweise umfasst die vernetzte Beschichtung ein vernetztes Polyamin, z.B. ein Polyalkylenimin wie Polyethylenimin (PEI).
Die kationische Gruppe der ersten positiv geladenen Membran kann eine Ammonium-, Sulfonium-, Phosphonium- oder andere Gruppe sein, bevorzugt eine Ammonium-Gruppe. Eine bevorzugte Ammonium-Gruppe ist eine quaternäre Ammonium-Gruppe, z.B. eine Tetraalkylammonium-Gruppe. Die kationischen Gruppen liegen vorzugsweise als angehängte Gruppen vor. Es wird angenommen, dass die kationischen Gruppen, wenn sie mehr als angehängte Gruppen als als Teil des Grundgerüsts vorliegen, verbesserte Bindungskapazität und/oder Selektivität bereitstellen.
Die kationische Gruppe kann direkt, d.h. ohne Spacer, mit dem Grundgerüst des vernetzten Beschichtungspolymers verknüpft sein oder durch eine Spacer-Gruppe. Bevorzugt ist die Verknüpfung über eine Spacer-Gruppe. Beispiele für Spacer-Gruppe umfassen eine oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Hydroxy, Hydroxyalkyl, Amino, Aminoalkyl, Amido, Alkylamido, Ester und Alkoxyalkyl besteht. Weitere Beispiele für Spacer-Gruppen umfassen eine oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Hydroxyalkyl, Alkylamino, Hydroxyalkylaminoalkyl, Hydroxyalkylaminoalkylhydroxyalkyl, Alkylaminoalkyl und Alkylamido besteht. Eine bevorzugte Spacer-Gruppe ist Hydroxyalkyl. Es wird angenommen, dass die Spacer-Gruppen räumliche Ladungstrennung bereitstellen und dafür sorgen, dass den Festladungen mehr Gelegenheit gegeben wird, mit den zu behandelnden Materialien, insbesondere dem Plasmid, in Wechselwirkung zu treten. Die Spacer-Gruppe stellt verbesserte Bindungskapazität und/oder Selektivität bereit.
Die Spacer-Gruppe kann eine beliebige geeignete Länge aufweisen; so kann die Spacer-Gruppe zum Beispiel eine Gruppe sein, welche 1 bis ca. 10 Atome, z.B. Kohlenstoffatome, aufweist. Somit kann die Spacer-Gruppe 1 bis ca. 10 Kohlenstoffatome lang sein, bevorzugt 2 bis ca. 6 Kohlenstoffe lang, mehr bevorzugt ca. 3 Kohlenstoffatome lang.
Die kationische Gruppe kann nach einem beliebigen geeigneten Verfahren bereitgestellt werden. Beispielsweise kann das Polyamin mit einer Glycidyl-Verbindung kontaktiert werden, welche eine kationische Gruppe aufweist, so dass der Epoxy-Ring an der primären oder sekundären Amino-Gruppe eines Polyamins, z.B. eines Polyalkylenamins, öffnet. Ferner kann eine Lösung von einem Polyamin wie PEI z.B. mit Glycidyltrimethylammoniumchlorid kombiniert oder umgesetzt und ein Polyamin mit durch Hydroxyalkyl-Gruppen verknüpften angehängten Trimethylammoniumchlorid-Gruppen erhalten werden.
Bei einer Ausführungsform ist die kationische Gruppe durch eine Reaktion mit einer Glycidyl-Verbindung, z.B. einer Polyglycidyl-Verbindung mit einer kationischen Gruppe, mit PEI verknüpft. Ein Beispiel für eine Polyglycidyl-Verbindung ist ein Polyalkylenglycolpolyglycidylether, z.B. Ethylenglycoldiglycidylether oder Butylenglycoldiglycidylether.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste positiv geladene Membran ein hydrophiles poröses Polyethersulfon-Substrat und eine vernetzte Beschichtung, umfassend das Reaktionsprodukt eines PEI mit angehängten quaternären Ammoniumgruppen und eines Polyalkylenglycolpolyglycidylethers.
Eine Ausführungsform der ersten positiv geladenen Membran kann wie folgt hergestellt werden. Die Membran kann hergestellt werden durch Bereitstellen einer Beschichtungszusammensetzung auf dem porösen Substrat, bei dem es sich vorzugsweise um ein hydrophiles poröses Substrat handelt, und Härten des beschichteten Substrates. Die Beschichtungszusammensetzung kann z.B. hergestellt werden durch Lösen des Polyamins in einem geeigneten Lösemittel. Bevorzugte Lösemittel umfassen Wasser, niedrigsiedende Alkohole, wie Methanol, Ethanol und Propanol, und Kombinationen hiervon. Das Lösemittel kann in einer Menge von ca. 40 Gew.-% bis ca. 99 Gew.-%, bevorzugt in einer Menge von ca. 90 Gew.-% bis ca. 99 Gew.-% der Beschichtungszusammensetzung vorliegen. Das Polyamin kann in einer Menge von ca. 1 Gew.-% bis ca. 5 Gew.-%, bevorzugt in einer Menge von ca. 1 Gew.-% bis ca. 2,5 Gew.-% der Beschichtungszusammensetzung vorliegen.
Das hydrophile poröse Substrat kann aus einem beliebigen geeigneten Material hergestellt sein; bevorzugt umfasst das Substrat ein Polymer. Beispiele für geeignete Polymere umfassen Polyaromaten, Polysulfone, Polyamide, Polyimide, Polyolefine, Polystyrole, Polycarbonate, cellulosische Polymere, wie Celluloseacetate und Cellulosenitrate, Fluorpolymere und PEEK. Aromatische Polysulfone sind bevorzugt. Beispiele für aromatische Polysulfone umfassen Polyethersulfon, Bisphenol A-Polysulfon und Polyphenylsulfon. Polyethersulfon ist besonders bevorzugt. Das hydrophile poröse Substrat kann eine beliebige geeignete Porengröße aufweisen, z.B. eine Porengröße im Bereich von ca. 0,01 oder 0,03 μm bis ca. 10 μm, bevorzugt ca. 0,1 μm bis ca. 5 μm, mehr bevor zugt ca. 0,2 μm bis ca. 5 μm. Das hydrophile poröse Substrat kann asymmetrisch oder symmetrisch sein.
Das hydrophile poröse Substrat kann nach Verfahren hergestellt werden, wie sie dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Beispielsweise kann es nach einem Phaseninversionsprozess hergestellt werden. Hierbei wird eine das Polymer, ein Lösemittel, einen Porenbildner, ein Benetzungsmittel und optional eine kleine Menge eines Nicht-Lösemittels enthaltende Lösung hergestellt durch Kombinieren und Mischen der Bestandteile, bevorzugt bei erhöhter Temperatur. Die resultierende Lösung wird gefiltert, um Verunreinigungen zu entfernen. Die gefilterte Lösung wird in die Form eines Flachmaterials oder einer Hohlfaser gegossen oder extrudiert. Das resultierende Flachmaterial oder Faser wird als eine phaseninvertierte Membran fest werden oder gelieren gelassen. Die so verfestigte Membran wird dann "geleacht", um das Lösemittel und andere lösliche Bestandteile zu entfernen.
Das poröse Substrat kann mit der Beschichtungszusammensetzung nach dem Durchschnittsfachmann bekannten Methoden beschichtet werden, z.B. durch Tauchbeschichtung, Sprühbeschichtung, Meniscusbeschichtung und dergleichen. Beispielsweise kann eine Tauchbeschichtung wie folgt durchgeführt werden. Das Substrat wird für einen gegebenen Zeitabschnitt, der ausreichend ist, um das Beschichten der Porenwände zu gewährleisten, in die Zusammensetzung getaucht. Die Tauchzeit kann von ca. 1 s bis ca. 5,0 min reichen, bevorzugt von ca. 1 s bis ca. 1,0 min, mehr bevorzugt von ca. 0,1 min bis ca. 0,3 min. Nach dem Tauchen wird die überschüssige Beschichtungszusammensetzung entfernt durch Ablaufenlassen des Substrats unter der Einwirkung der Schwerkraft oder mittels einer Rakel oder Luftrakel. Das resultierende beschichtete Substrat wird gehärtet, um das Härten oder Vernetzen der Beschichtungszusammensetzung zu bewirken. So kann die Membran beispielsweise bei einer Temperatur unterhalb 130°C, z.B. in einem Bereich von ca. 50°C bis ca. 130°C, bevorzugt bei einer Temperatur von ca. 70°C bis ca. 130°C, für einen geeigneten Zeitabschnitt, welcher in einem Bereich von ca. 5 min bis ca. 60 min, bevorzugt ca. 10 min bis ca. 30 min, angesiedelt sein kann, gehärtet werden. Die resultierende Membran kann gewaschen werden, um Extrahierbares in der Membran zu "leachen". Beispielhaft kann das "Leaching" der Membran in heißem Wasser, z.B. in deionisiertem Wasser, welches bei über 73°C gehalten wird, durchgeführt werden. Die resultierende Membran wird in Luft oder in einem Ofen getrocknet, um das Wasser zu entfernen. Die so hergestellte erste positiv geladene Membran ist zur Bindung von Plasmiden befähigt. Bei einigen Ausführungsformen weist die erste positiv geladene Membran eine Plasmidbindungskapazität von ca. 15 bis ca. 25 mg/ml Membran auf.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die zweite Membran, die selektiv Endotoxin bindet, geladen und kann positiv geladen oder negativ geladen sein. Eine positiv geladene Membran ist bevorzugt. Beispiele für derartige Membranen sind in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 00/69549, mit Veröffentlichungsdatum vom 23. November 2000, offenbart. Die Membran ist vorzugsweise eine hydrophile Membran, mehr bevorzugt eine hydrophile positiv geladene mikroporöse Membran.
Bei einer Ausführungsform umfasst die zweite Membran ein poröses hydrophobes Substrat und eine Beschichtung, welche ein Ladung stellendes Agens umfasst. Das Ladung stellende Agens kann ein Polymer sein, z.B. ein positiv geladenes Polymer, welches quaternäre Ammoniumgruppen enthält. Ein Beispiel für ein solches Polymer ist ein Polyamin, welches quaternäre Ammoniumgruppen enthält. Es ist weiter bevorzugt, wenn das Polyamin vernetzt ist, z.B. durch die Ringöffnungsreaktion einer Epoxy-Gruppe.
Beispiele für bevorzugte positiv geladene Polymere umfassen PEI, mehr bevorzugt PEI, welches dahingehend modifiziert ist, dass es quaternäre Ammoniumgruppen enthält. Beispielhaft kann ein modifiziertes PEI hergestellt werden durch Reagierenlassen von PEI mit Epichlorhydrin, derart, dass ein Teil oder alle der tertiären Aminogruppen des PEI in quaternäre Ammoniumgruppen umgewandelt werden. Derartige Epichlorhydrin-modifizierte PEIs sind auch kommerziell erhältlich. Beispielsweise ist LUPASOL^TM SC-86X ein Epichlorhydrin-modifiziertes PEI, welches von der Firma BASF Corp., Mount Olive, NJ, erhältlich ist. Vorzugsweise umfasst das positiv geladene Polymer ferner ein quaternisiertes Polyamin, z.B. ein Polydialkylamin wie Polydimethylamin. Ein Beispiel für ein quaternisiertes Polyamin ist Poly-(dimethylamin-co-epi chlorhydrin), erhältlich unter der Bezeichnung Catalog No. 652 von der Firma Scientific Polymer Products, Inc., Ontario, NY.
Das hydrophobe Substrat kann ein beliebiges geeignetes Material umfassen; vorzugsweise umfasst das Substrat ein hydrophobes Polymer. Beispiele für hydrophobe Polymere umfassen Polysulfone, Polyolefine, Polystyrole, Polyaromaten, Cellulosederivate, Polyester, Polyamide wie aromatische Polyamide und aliphatische Polyamide mit langen Alkylsegmenten, z.B. mit C₈-C₁₆-Segmenten, Polyimide, Polytetrafluorethylen, Polycarbonate und PEEK. Aromatische Polysulfone sind bevorzugt. Beispiele für aromatische Polysulfone umfassen Polyethersulfon, Bisphenol A-Polysulfon und Polyphenylsulfon. Polyethersulfon ist besonders bevorzugt. Das hydrophobe poröse Substrat kann asymmetrisch oder symmetrisch sein.
Das poröse hydrophobe Substrat kann eine beliebige geeignete Porengröße aufweisen, z.B. eine Porengröße von ca. 10 μm oder weniger, z.B. im Bereich von ca. 0,1 μm bis ca. 10 μm, bevorzugt von ca. 0,1 μm bis ca. 5 μm, mehr bevorzugt ca. 0,2 μm bis ca. 1 μm.
Das poröse hydrophobe Substrat kann nach Verfahren hergestellt werden, wie sie dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Beispielsweise kann es nach einem Phaseninversionsprozess hergestellt werden. Hierbei wird eine das hydrophobe Polymer, ein Lösemittel, einen Porenbildner und optional eine kleine Menge eines Nicht-Lösemittels enthaltende Gießlösung hergestellt durch Kombinieren und Mischen der Bestandteile, bevorzugt bei erhöhter Temperatur. Die resultierende Lösung wird gefiltert, um Unlösliches oder Verunreinigungen zu entfernen. Die Gießlösung wird in die Form eines Flachmaterials oder einer Hohlfaser gegossen oder extrudiert. Das resultierende Flachmaterial oder Faser wird als eine phaseninvertierte Membran fest werden oder gelieren gelassen. Die Membran wird "geleacht", um das Lösemittel und andere lösliche Bestandteile zu entfernen.
Eine Ausführungsform der zweiten Membran (die selektiv Endotoxine bindet) kann wie folgt hergestellt werden. Das poröse hydrophobe Substrat wird mit einer Beschichtungszusammensetzung in Kontakt gebracht, welche ein Ladung stellendes Agens oder einen Vorläufer hiervon umfasst. Das Inkontaktbringen wird so durchgeführt, dass das Ladung stellende Agens oder der (die) Vorläufer hiervon vorzugsweise die Porenwände des hydrophoben Substrats bedeckt. So kann zum Beispiel das Ladung stellende Agens oder sein(e) Vorläufer in einem geeigneten Lösemittel gelöst werden, welches mit dem hydrophoben Substrat verträglich ist, um eine Lösung bereitzustellen, die nachfolgend mit dem Substrat in Kontakt gebracht wird.
Bevorzugte Lösemittel umfassen Wasser, niedrigsiedende Alkohole, wie Methanol, Ethanol und Isopropanol, sowie Kombinationen hiervon. So ist beispielsweise eine Mischung von Wasser und Ethanol bevorzugt. Das Lösemittel oder die Mischung von Lösemitteln liegt in einer Menge von ca. 80 Gew.-% bis ca. 99 Gew.-%, vorzugsweise in einer Menge von ca. 88 Gew.-% bis ca. 97 Gew.-% der Beschichtungszusammensetzung vor.
Zur Herstellung einer positiv geladenen Membran liegt das Polyamin oder die Mischung von Polyamin-Vorläufern typisch in einer Menge von ca. 0,5 Gew.-% bis ca. 20 Gew.-%, vorzugsweise in einer Menge von ca. 1 Gew.-% bis ca. 9 Gew.-% der Beschichtungszusammensetzung vor. Zusätzlich kann die Beschichtungslösung einen pH-Regler enthalten, z.B. μm einen pH-Wert von ca. 9,5 bis ca. 11,5, vorzugsweise von ca. 10,5 bis ca. 11,0 bereitzustellen. Der pH-Wert kann durch die Verwendung einer Base, z.B. ein Alkali wie Kaliumhydroxid, eingestellt werden.
Das poröse hydrophobe Substrat kann mit der Beschichtungszusammensetzung nach dem Durchschnittsfachmann bekannten Methoden beschichtet werden, z.B. durch Tauchbeschichtung, Sprühbeschichtung, Meniscusbeschichtung und dergleichen. Beispielsweise kann eine Tauchbeschichtung wie folgt durchgeführt werden. Das Substrat wird für einen geeigneten Zeitabschnitt in die Zusammensetzung getaucht. Die Tauchzeit kann von ca. 1 s bis ca. 15 min reichen, bevorzugt ca. 2 s bis ca. 15 s, mehr bevorzugt von ca. 3 s bis ca. 5 s.
Nach dem Tauchen wird die überschüssige Beschichtungszusammensetzung ablaufen gelassen oder entfernt, z.B. mittels einer Rakel oder Luftrakel. Das resultierende beschichtete Substrat wird erhitzt, um das Lösemittel zu entfernen und – bei einigen Ausführungsformen – um die Vorläufer zu einem Ladung stellenden polymeren Agens aushärten zu lassen. So wird z.B. eine Was ser/Ethanol-Lösung der Vorläufer, z.B. Epichlorhydrin-modifiziertes PEI und quaternisiertes Poly-(dimethylamin-co-epichlorhydrin), und einer Base, z.B. Kaliumhydroxid, hergestellt.
Ein hydrophobes Substrat, z.B. ein poröses Polyethersulfon-Flachmaterial, wird für ca. 3 s in die Beschichtungszusammensetzung getaucht. Die überschüssige Beschichtungszusammensetzung wird ablaufen gelassen oder entfernt, und das Substrat wird dann z.B. in einem Konvektionsofen bei einer Temperatur von ca. 90°C bis ca. 150°C, vorzugsweise ca. 130°C bis ca. 140°C, für einen geeigneten Zeitabschnitt härten gelassen. So kann das Substrat beispielsweise bei 135°C für einen Zeitabschnitt von ca. 15 min bis ca. 30 min gehärtet werden. Die resultierende Membran kann gewaschen oder "geleacht" werden, um extrahierbare Rückstände in der Membran zu entfernen. Beispielhaft kann das "Leaching" der Membran in siedendem deionisiertem Wasser durchgeführt werden. Die resultierende Membran wird in Luft oder in einem Ofen getrocknet, um das Wasser zu entfernen.
Wie bereits erörtert, bindet die zweite Membran Endotoxine. Die Befähigung der zweiten Membran zur Bindung von Endotoxinen kann nach jedem geeigneten Verfahren demonstriert werden. Als Beispiel sei folgendes Verfahren genannt. Eine Probenlösung, enthaltend ein Plasmid, z.B. pGEM, bei einer Konzentration von 23 μg/ml und ein Endotoxin bei einer Konzentration von 1,2 × 10³ EU/ml in einem 0,75 M NaCl-50 mM-Tris-Puffer bei pH 8, kann mit einer positiv geladenen 25 mm-Membranscheibe (geschätzte Filterfläche = 3,7 cm²) in Kontakt gebracht werden. Die Fließrate der Probenlösung kann bei 1 ml/min (lineare Fließrate = 0,27 cm/min) gehalten werden. Es können 1-ml-Fraktionen des Eluats aufgefangen und die Endotoxin-Konzentrationen bestimmt werden, z.B. mittels des Standard-Limulus-Amebocyte-Lysate-(LAL-)-Tests nach 1:10-Verdünnung der Eluatfraktionen mit pyrogenfreiem Wasser. Die Nachweisgrenze des LAL-Tests liegt bei 0,5 EU/ml.
Endotoxin ist in den ersten paar Fraktionen, z.B. den ersten 10 Fraktionen, nicht detektierbar. In den folgenden 10 Fraktionen beträgt die Endotoxin-Konzentration weniger als 2 EU/ml, in weiteren 10 Fraktionen weniger als 4 EU/ml und in nachfolgenden 10 Fraktionen weniger als 10 EU/ml.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist die zweite (oder dritte) Membran eine Endotoxin-Bindungskapazität von mindestens ca. 100 000 EU/cm², z.B. von ca. 120 000 EU/cm² bis ca. 200 000 EU/cm² oder größer, vorzugsweise größer als ca. 130 000 EU/cm², in Wasser sowie in 0,9%iger Salzlösung auf. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Membran eine Endotoxin-Bindungskapazität von mindestens ca. 50 000 EU/cm², z.B. von ca. 50 000 EU/cm² bis ca. 150 000 EU/cm² oder größer, vorzugsweise größer als ca. 100 000 EU/cm², in 0,15 M NaCl in 10 mM Tris-Puffer bei pH 8 auf.
Die zweite Membran (die Endotoxin bindet) ist zur Verminderung der Endotoxin-Konzentration von Proben, welche Plasmide und Endotoxine enthalten, befähigt. Ausführungsformen der Membran können in Nucleinsäure- (z.B. Plasmid-DNA-)Proben vorliegende Endotoxine von über 1000 EU/ml Fluid auf weniger als 10 EU/ml (> 2 logs) vermindern. Die Endotoxin-Konzentration kann von über 52 000 EU/mg Plasmid-DNA auf weniger als 500 EU/mg Plasmid-DNA vermindert werden.
In biologischen Proben, welche Kontaminanten wie Proteine, chromosomale DNA und andere enthalten, liefern gewisse Ausführungsformen der zweiten Membran eine 20fache Verminderung der Endotoxin-Konzentration pro mg Plasmid. Es ist beabsichtigt, dass größere Verminderungen erzielt werden können durch geeignete Wahl der Verfahrens- oder Membranparameter, z.B. durch Vergrößerung der Membranfläche, Inkontaktbringen der ersten Membran mit einem nichtionischen Tensid und/oder Verdünnen des Bakterienlysats.
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung ist geeignet zur Reinigung von Plasmiden in einem weiten Mengenbereich. Beispielsweise kann Plasmid in Nanogramm- bis Kilogrammmengen gereinigt werden. Bei gewissen Ausführungsformen können Plasmide in Mengen von ca. 1 g bis ca. 20 g erhalten oder behandelt werden. Die Plasmidausbeuten sind hoch; z.B. liegt in gewissen Ausführungsformen die Ausbeute höher als ca. 70 Gew.-%, vorzugsweise höher als ca. 99 Gew.-%.
Das gereinigte Plasmid weist einen hohen Gehalt der "supercoiled" Form auf. Beispielsweise beträgt die "supercoiled" Form mehr als ca. 90 Gew.-%, vorzugsweise mehr als ca. 95 Gew.-%. Die relaxierte oder offen-zirkuläre Form beträgt weniger als ca. 10 Gew.-%, vorzugsweise weniger als ca. 5 Gew.-%.
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung erzeugt gereinigte Plasmide mit einem sehr niedrigen Gehalt an Kontaminanten. Beispielsweise liegt Endotoxin in einer Menge von weniger als ca. 50 EU/mg, und in einigen Ausführungsformen in einer Menge von weniger als ca. 10, 2 oder 0,4 EU/mg Plasmid vor. Der Gehalt an chromosomaler DNA liegt bei weniger als ca. 1 Gew.-%, vorzugsweise weniger als ca. 0,5 Gew.-%. Der RNA-Gehalt ist kleiner als ca. 1 Gew.-%, vorzugsweise kleiner als ca. 0,2 Gew.-%. Der Proteingehalt beträgt weniger als ca. 1 Gew.-%, vorzugsweise weniger als ca. 0,1 Gew.-%.
Die in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendeten Membranen sind besonders vorteilhaft, weil die große Oberfläche zugänglich ist zum Binden des Plasmids oder des Endotoxins. Die poröse Struktur erlaubt relativ uneingeschränkten oder freien Zugang zu den Bindestellen der Membranen. Die angehängten Ionenaustauschgruppen sowie die hydrophile Natur des porösen Substrates der ersten positiv geladenen Membran erleichtern oder verbessern die selektive Bindung von Plasmiden. Die Ionenaustauschgruppen sowie die hydrophobe Natur des porösen Substrates der zweiten geladenen Membran erleichtern oder verbessern die Bindung von Endotoxinen.
Die Membranen können in jeder geeigneten Form konfiguriert sein, z.B. zur Bereitstellung einer Vorrichtung. Beispielsweise kann die Vorrichtung eine Mehrzahl von Membranen umfassen, z.B. um ein mehrschichtiges Filterelement bereitzustellen, oder in gestapelter Form, um ein Membranmodul bereitzustellen, z.B. ein Membranmodul zur Verwendung in der Chromatographie. Bei einer Ausführungsform kann die Vorrichtung zwei oder mehr Typen von Membranen umfassen, z.B. eine Membran, die ein Plasmid bindet, und eine Membran, die ein Endotoxin bindet; eine erste positiv geladene Membran und eine zweite geladene Membran; oder eine erste positiv geladene Membran, eine zweite positiv geladene Membran und eine dritte geladene Membran.
Die Membranen können als kleinvolumige oder großvolumige Vorrichtungen konfiguriert sein. Zum Beispiel ist die erste positiv geladene Membran vorzugsweise als eine großvolumige Vorrichtung konfiguriert, z.B. als eine Membranpatrone mit einer Volumenkapazität von ca. 1 l oder weniger bis ca. 10 l oder mehr. Beispiele für eine geeignete Patronenkonfiguration umfassen die in der UK-Patentanmeldung GB 2 275 626 A offenbarten, z.B. ein im Wesentlichen zylindrisches Medium, wobei die Membran in gefalteter Form vorliegt. Mehrlagige Strukturen, welche überlappende Lagen von Membranen beinhalten, können bereitgestellt werden.
Beispielhaft kann die Vorrichtung ein Filterelement umfassen, welches die erste oder die zweite Membran in einer im Wesentlichen planaren oder gefalteten Form umfasst. Bei einer Ausführungsform kann das Filterelement eine hohle, im Wesentlichen zylindrische Form aufweisen. Falls gewünscht, kann die Vorrichtung ferner Stromaufwärts- und/oder Stromabwärtsstütz- oder -drainageschichten umfassen. Die Vorrichtung kann eine Mehrzahl von Membranlagen umfassen. Für Ausführungsformen der Membran, welche in Form eines Rohrs oder einer Faser vorliegen, können Bündel von Rohren oder Fasern in Module überführt werden durch Einbetten ihrer Enden z.B. mittels eines Klebemittels. Membranpatronen können konstruiert werden durch Einbeziehung eines Gehäuses und Endkappen, um eine Fluidabdichtung bereitzustellen, sowie von mindestens einem Einlass und mindestens einem Auslass.
Die zweite Membran ist vorzugsweise als eine kleinvolumige Vorrichtung konfiguriert, z.B. als ein Modul mit einer Volumenkapazität von ca. 1 ml oder mehr bis ca. 100 ml oder mehr. Beispiele für geeignete Konfigurationen sind in den internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 00/50888 und Nr. WO 00/50144, beide mit Veröffentlichungsdatum vom 31. August 2000, offenbart. Beispielsweise kann das Modul ein Hohlgehäuseelement, eine Mehrzahl von Membranen, welche in dem Hohlgehäuseelement gestapelt sind, und eine Abdichtung, welche zwischen den gestapelten Membranen und dem Hohlgehäuseelement angeordnet ist und eine äußere Peripherie der gestapelten Membranen abdichtet, umfassen.
Die zweite Membran oder die dritte Membran (z.B. Membranen mit einer größeren Affinität für Endotoxine als für Plasmide) kann in jeder geeigneten Form konfiguriert sein, vorzugsweise als eine kleinvolumige Vorrichtung wie z.B. das oben beschriebene Modul.
Die für die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Membranen können auch zur Verwendung mit Mikrotiterplatten konfiguriert sein, z.B. als Hochdurchsatz-Mikrotiterplatten. Bei einer Ausführungsform können die Membranen zur Verwendung als Spin-Säulen konfiguriert sein.
Durch die Verwendung der Membranen gemäß vorliegender Erfindung können – relativ zu vielen Verfahren, welche konventionelle Harze oder Beads als Adsorbentien benutzen – größere Plasmidmengen gereinigt werden. Die Fließrate der durch die erfindungsgemäßen Membranen passierten Fluiden kann relativ hoch sein, und der Druckabfall relativ niedrig. Die Plasmidbindung an der ersten positiv geladenen Membran findet nahezu instantan statt. Die zweite geladene Membran bindet Endotoxine nahezu instantan. Da das Verfahren in einer relativ kurzen Zeit durchgeführt werden kann, degradiert das Plasmid während der Behandlung nicht wesentlich. Beispielsweise wird die "supercoiled"-Form des Plasmids nicht in die "nicked" Form überführt.
Die mittels Ausführungsformen gemäß vorliegender Erfindung erhaltenen Plasmide zeigen eine hohe Reinheit und können für eine Anzahl von Anwendungen Verwendung finden, einschließlich Restriktionsenzymverdau, Klonierung, PCR, Ligation und Sequenzierung sowie in der Gentherapie.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein System bereit zur Behandlung eines plasmidhaltigen Fluids, umfassend mindestens zwei Membranen wie oben beschrieben, z.B. eine erste Membran und eine zweite Membran, beispielsweise eine erste positiv geladene Membran und eine zweite geladene Membran. Bei einer Ausführungsform umfasst das System eine erste positiv geladene Membran, welche ein poröses Substrat und eine vernetzte Beschichtung mit angehängten kationischen Gruppen umfasst, und eine zweite geladene Membran. Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das System zum Behandeln eines plasmidhaltigen Fluids eine erste positiv geladene Membran und eine zweite geladene mikroporöse Membran, die hydrophil ist und ein poröses hydropho bes Substrat und eine ein Ladung stellendes Agens umfassende Beschichtung umfasst. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das System eine erste positiv geladene Membran, welche ein poröses Substrat und eine vernetzte Beschichtung mit angehängten kationischen Gruppen umfasst, und eine zweite geladene mikroporöse Membran, die hydrophil ist und ein poröses hydrophobes Substrat und eine ein Ladung stellendes Agens umfassende Beschichtung umfasst.
Das System kann ferner umfassen: eine Anordnung zum Bereitstellen des plasmidhaltigen Fluids an die erste Membran; eine Anordnung zum Inkontaktbringen des plasmidhaltigen Eluats mit der zweiten Membran; und Anordnungen zum Eluieren der ersten Membran und der zweiten Membran.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein System bereit, welches Membranvorrichtungen umfasst, z.B. membranbasierte Chromatographie-Vorrichtungen, umfassend eine Membran, die ein Plasmid bindet, und eine Membran, die ein Endotoxin bindet, z.B. eine erste positiv geladene Membran und eine zweite geladene Membran. Die Vorrichtungen können in jeder geeigneten Form vorliegen. Beispielsweise können die Vorrichtungen ein Gehäuse mit mindestens einem Einlass und mindestens einem Auslass, wobei ein Fluidströmungspfad zwischen dem Einlass und dem Auslass definiert ist, und eine Membran, welche quer über den Fluidströmungspfad (Crossflow) oder tangential zu dem Fluidströmungspfad (Tangentialfluss) angeordnet ist, umfassen. Das zu behandelnde Fluid kann beispielsweise tangential zur Membranoberfläche strömen gelassen werden (wobei z.B. ein Teil des Fluids von der ersten Oberfläche zu der zweiten Oberfläche zu einem ersten Auslass und ein anderer Teil über die erste Oberfläche zu einem zweiten Auslass passieren gelassen wird), oder es kann senkrecht zur Membranoberfläche strömen gelassen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Kit bereit zum Behandeln eines plasmidhaltigen Fluids. Das Kit umfasst eine Membran, die ein Plasmid bindet, und eine Membran, die ein Endotoxin bindet, z.B. eine erste positiv geladene Membran und eine zweite geladene Membran, und einen oder mehrere Puffer und Salzlösungen. Die Membranen können als kleine, leicht bedienbare Chromatographie-Vorrichtungen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zum Behandeln eines Fluids, welche eine Mischung von verschiedenen Plasmidformen enthält, z.B. eine Mischung der "supercoiled" und der offen-zirkulären Form des Plasmids. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen des zu behandelnden Fluids mit einer ersten positiv geladenen Membran. Die gebundenen Plasmide können eluiert, d.h. von der Membran entfernt oder gewaschen werden, mittels eines geeigneten Eluenten, z.B. NaCl-Lösung, in einem geeigneten Puffer, z.B. Tris. Verschiedene Formen des Plasmids können voneinander getrennt werden, z.B. die "supercoiled" Form von der relaxierten oder offen-zirkulären Form, durch Einstellen der Bedingungen für die Bindung und die Elution, z.B. Typ und Konzentration des bei der Elution verwendeten Salzes. Die Bedingung oder Umgebung zum bevorzugten Binden der "supercoiled" Form gegenüber der relaxierten offen-zirkulären Form umfasst das Bereitstellen einer Salz/Puffer-Lösung, z.B. ca. 0,62 M NaCl in 10 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 8,0. Alternativ oder zusätzlich ist die elektrische Leitfähigkeit der Salz/Puffer-Lösung in einem Bereich von ca. 60 bis ca. 64 mS/cm angesiedelt.
2 zeigt die Zusammensetzung des Eluats als Funktion des Retentionsvolumens aus einer ersten positiv geladenen Membran, die mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, welche "supercoiled" und offen-zirkuläre Formen eines β-Galactosidase-Reporterplasmids enthält. Die Membran umfasst eine Polyethersulfon-Unterlage und eine vernetzte Beschichtung von PEI mit quaternären Ammoniumgruppen, und die Beschichtung wird durch die Verwendung von Ethylenglycoldiglycidylether vernetzt.
Die Probe enthält ca. 95 Gew.-% der "supercoiled" Form und ca. 5 Gew.-% der offen-zirkulären Form. Wie aus 2 ersichtlich, trennt die Membran die offen-zirkuläre Form des Plasmids (kleiner Peak) von der "supercoiled" Form des Plasmids (großer Peak). Die Auflösung ist hervorragend. Das Verfahren ist skalierbar von einer kleinen Skala auf eine große Skala, z.B. eine präparative Skala.
Das folgende Beispiel soll die vorliegende Erfindung weiter veranschaulichen; es versteht sich jedoch, dass es den Bereich der Erfindung in keiner Weise einschränken soll.
BEISPIEL
Das vorliegende Beispiel illustriert ein Verfahren zum Behandeln eines plasmidhaltigen Fluids gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
20 g E. coli-Zellen, welche ein pGEM-Plasmid enthalten, werden suspendiert in 150 ml von 50 mM Tris-Puffer bei pH 8,0 mit 10 mM EDTA pro Gramm Zellen. Die Zellen werden durch Zugabe eines gleichen Volumens von 0,2 M NaOH mit 1% SDS über eine Zeit von ca. 3–5 Minuten unter leichtem Mischen lysiert. Eine größere Fraktion von Protein-, chromosomalen DNA- und RNA-Kontaminanten wird durch die Zugabe von 300 ml von 4 M Kaliumacetat-Lösung ausgefällt. Das resultierende Rohlysat wird durch ein DACRON^TM-Tuch und durch eine 0,2 μm-SUPOR CAP^TM-Filterpatrone (Pall Corp., East Hills, NY) filtriert.
Das oben erhaltene Filtrat wird mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von ca. 90 mS/cm verdünnt. Das verdünnte Filtrat wird auf eine Patrone aufgeladen, welche eine erste positiv geladene Membran enthält, umfassend eine Polyethersulfon-Unterlage und eine vernetzte Beschichtung von PEI mit quaternären Ammoniumgruppen, und die Beschichtung wird durch die Verwendung von Ethylenglycoldiglycidylether vernetzt. Die erste positiv geladene Membran weist eine Plasmidbindungskapazität von 20 mg/ml auf.
Membrangebundene Kontaminanten werden mit einer 0,60 M NaCl-Lösung in 10 mM Tris-Puffer bei pH 8,0 weggewaschen. Das gebundene Plasmid wird mit 1,0 M NaCl in 10 mM Tris-Puffer bei pH 8,0 eluiert und als Plasmid-Pool für eine Weiterbehandlung aufgefangen.
Der oben erhaltene Plasmid-Pool wird optional mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 50 mS/cm verdünnt und auf ein Chromatographie-Modul mit einer Kapazität von 10 ml, welches eine erste positiv geladene Membran wie oben enthält, aufgeladen. Das Modul wird mit einer 0,5 M NaCl-Lösung gewaschen, um Proteine, RNA und chromosomale DNA zu entfernen, gefolgt von einer Gradientenelution. Das "supercoiled" Plasmid eluiert während der Gradientenelution bei einer Eluentenleitfähigkeit von ca. 67 bis ca. 70 mS/cm.
Der aus dem Gradienteneluat erhaltene Plasmid-Pool wird mit einem gleichen Volumen an Wasser verdünnt und wird durch eine dritte geladene Membran passiert, welche ein poröses hydrophobes Polyethersulfon-Substrat und eine vernetzte Beschichtung, umfassend Epichlorhydrin-modifiziertes PEI und quaternisiertes Poly-(dimethylamin-co-epichlorhydrin), umfasst. Diese Membran bindet das Endotoxin. Das Filtrat enthält hochgereinigtes Plasmid. Das Plasmid ist frei oder im Wesentlichen frei von RNA, und das Verfahren verwendet keine RNase. Das Plasmid ist ferner frei oder im Wesentlichen frei von Proteinen.
Das plasmidhaltige Filtrat wird einer Diafiltration durch eine Membran mit einem MWCO von ca. 100 000 unterworfen. Die resultierende Plasmid-Lösung wird durch Tangentialflussfiltration konzentriert. Das Konzentrat wird sterilfiltriert. Das resultierende Plasmid ist geeignet zur Verwendung in zahlreichen pharmazeutischen Anwendungen.

Claims

Verfahren zum Behandeln eines Fluids, welches ein Plasmid und ein Endotoxin enthält, umfassend (a) Inkontaktbringen des Fluids mit einer ersten Membran, um mindestens einen Teil des Plasmids und des Endotoxins zu binden; (b) Inkontaktbringen der ersten Membran aus (a) mit einem Eluenten, um ein plasmid- und endotoxinhaltiges Eluat zu erhalten; (c) Inkontaktbringen des Eluats aus (b) mit einer zweiten Membran, die mindestens einen Teil des Endotoxins bindet; und (d) Gewinnen eines plasmidangereicherten und endotoxinverarmten Fluids.
Verfahren zum Behandeln eines Fluids, welches ein Plasmid und ein Endotoxin enthält, umfassend (a) Inkontaktbringen des Fluids mit einer ersten Membran, um mindestens einen Teil des Plasmids und des Endotoxins zu binden; (b) Inkontaktbringen der ersten Membran aus (a) mit einem Eluenten, um ein erstes plasmid- und endotoxinhaltiges Eluat zu erhalten; (b') Inkontaktbringen des ersten Eluats mit einer zweiten Membran, um mindestens einen Teil des Plasmids und des Endotoxins zu binden; und (b'') Inkontaktbringen der zweiten Membran aus (b') mit einem Eluenten, um ein zweites plasmid- und endotoxinhaltiges Eluat zu erhalten; (c) Inkontaktbringen des zweiten Eluats mit einer dritten Membran, um mindestens einen Teil des Endotoxins zu binden; und (d) Gewinnen eines plasmidangereicherten und endotoxinverarmten Fluids.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das zu behandelnde Fluid umfasst: ein Plasmid, ein Endotoxin und mindestens einen oder mehr der Kontaminanten, die ausgewählt sind aus der aus chromosomaler DNA, RNA und Protein bestehenden Gruppe, wobei das Verfahren umfasst: Behandeln des Fluids mit einer ersten Membran, um mindestens einen Teil des Plasmids, des Endotoxins und mindestens einen der Kontaminanten zu binden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das zu behandelnde Fluid mindestens eine der Komponenten umfasst, welche sind chromosomale Desoxyribonucleinsäure, Ribonucleinsäure und Protein.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend das Wiedergewinnen eines gereinigten Plasmids.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das gereinigte Plasmid ein "supercoiled" Plasmid umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das zu behandelnde Fluid ein Bakterienlysat umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die zweite Membran eine positiv geladene Membran ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die erste Membran eine positiv geladene Membran ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die positiv geladene Membran ein poröses Substrat und eine vernetzte Beschichtung mit kationischen Gruppen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die vernetzte Beschichtung ein vernetztes Polyamin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das vernetzte Polyamin ein Polyalkylenimin umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die kationische Gruppe eine quaternäre Ammoniumgruppe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die kationische Gruppe mit einer Spacer-Gruppe verknüpft ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die kationische Gruppe durch Reaktion mit einer Glycidyl-Verbindung mit dem Polyalkylenimin verknüpft ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Beschichtung durch die Verwendung einer Polyglycidyl-Verbindung vernetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zweite Membran umfasst: ein hydrophiles poröses Polyethersulfon-Substrat und eine vernetzte Beschichtung umfassend das Reaktionsprodukt von einem Polyethylenimin mit quaternären Ammoniumgruppen und einem Polyalkylenglycolpolyglycidylether.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 17, wobei die erste Membran umfasst: ein hydrophiles poröses Polyethersulfon-Substrat und eine vernetzte Beschichtung umfassend ein Reaktionsprodukt von einem Polyethylenimin mit quaternären Ammoniumgruppen und einem Polyalkylenglycolpolyglycidylether.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 7, wobei die zweite Membran eine hydrophile geladene Membran umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei die dritte Membran eine hydrophile geladene Membran umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei die hydrophile geladene Membran ein poröses hydrophobes Substrat und eine Beschichtung umfasst, welche ein Ladung stellendes Agens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Ladung stellende Agens ein positive Ladung stellendes Agens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das positive Ladung stellende Agens ein positiv geladenes Polymer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das positiv geladene Polymer quaternäre Ammoniumgruppen umfasst.
Verfahren nach 23 oder 24, wobei das positiv geladene Polymer ein quaternäre Ammoniumgruppen enthaltendes Polyamin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Polyamin vernetzt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16 und 21 bis 26, wobei das poröse Substrat der Membran, die mindestens einen Teil des Plasmids oder des Endotoxins bindet, ein Substratpolymer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Substratpolymer ausgewählt ist aus der Gruppe, welche aus Polyaromaten, Polysulfonen, Polyolefinen, Polystyrolen, Polyamiden, Polyimiden, Fluorpolymeren, Polycarbonaten, Polyestern, Celluloseacetaten und Cellulosenitraten besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, umfassend das Inkontaktbringen der ersten Membran mit einem nichtionischen Tensid.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 29, umfassend das Inkontaktbringen der zweiten Membran mit einem nichtionischen Tensid.
Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei das nichtionische Tensid ein ethoxylierter Alkylphenylether ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei der ethoxylierte Alkylphenylether Polyoxyethylen-(10)-isooctylphenylether ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, wobei das zu behandelnde Fluid "supercoiled" und offen-zirkuläre Formen eines Plasmids enthält.
Verfahren nach Anspruch 33, umfassend das Abtrennen der "supercoiled" Form von der offen-zirkulären Form des Plasmids.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei die erste oder die zweite Membran eine Faltenmembran ist.
System zum Behandeln eines plasmid- und endotoxinhaltigen Fluids, umfassend eine erste Membran und eine zweite Membran, wobei die erste Membran mindestens einen Teil des Plasmids bindet und wobei die zweite Membran mindestens einen Teil des Endotoxins bindet.
System nach Anspruch 36, welches eine zusätzliche Membran umfasst, die mindestens einen Teil des Plasmids bindet.
System nach Anspruch 36, wobei die erste Membran ein poröses Substrat und eine vernetzte Beschichtung mit kationischen Gruppen umfasst.
System nach Anspruch 36, wobei die zweite Membran hydrophil ist und ein poröses hydrophobes Substrat und eine Beschichtung umfasst, welche ein Ladung stellendes Agens umfasst.
System nach Anspruch 36, wobei die erste Membran ein poröses Substrat und eine vernetzte Beschichtung mit kationischen Gruppen umfasst und wobei die zweite Membran hydrophil ist und ein poröses hydrophobes Substrat und eine Beschichtung umfasst, welche ein Ladung stellendes Agens umfasst.
System nach einem der Ansprüche 36 bis 40, umfassend einen oder mehr Puffer und/oder eine oder mehr Salzlösungen.
System nach einem der Ansprüche 36 bis 41, wobei die erste oder die zweite Membran eine Faltenmembran ist.