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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft geladene Filtrationsmembranen und ihre Verwendung
zur Trennung eines Proteins von Lösungsmitteln, Gelöststoffen
mit niedrigem Molekulargewicht oder einem Proteingemisch. Die Modifizierung
der Membranen zur Erzeugung von Ladung umfasst die Modifizierung
von Membranporen, um die Ladung in einer Pore zu ändern und
die Größe einer
Pore zu ändern.
Folglich wird das Protein von anderen Gelöststoffen in einem Gemisch
auf Basis der Größe sowie
Nettoproteinladung und Membranladung getrennt.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Eine
zur Proteintrennung zweckdienliche Membran ist eine synthetische
(häufig
polymere) selektive Barriere für
Mikrofiltration (MF) oder Ultrafiltration (UF) im industriellen
oder im Labormaßstab
(siehe Leos J. Zeman und Andrew L. Zydney, „Microfiltration and Ultrafiltration:
Principles and Applications", Marcel
Dekker, Inc., S. 3 (1996)). Bei diesen Prozessen strömen gewisse
Zulaufkomponenten, wie z.B. Proteine, durch Poren der Membran in
ein Filtrat, während
andere, üblicherweise
größere Proteine oder
Komponenten durch die Membran im Retentat zurückgehalten werden (siehe Zeman
und Zydney, siehe oben, S. 3).
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Protein-Ultrafiltration
ist ein druckgetriebener Membranprozess, der zur Aufkonzentrierung
oder Reinigung von Proteinlösungen
verwendet wird (Robert van Reis und Andrew L. Zydney, „Protein
Ultrafiltration",
in: Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis
and Bioseparation, M. C. Flickinger und S. W. Drew (Hrsg.), John
Wiley & Sons,
Inc., S. 2197 (1999)). UF-Membranen weisen typischerweise eine mittlere
Porengröße zwischen 10
und 500 Angström
auf, die zwischen der mittleren Poregröße von Membranen für reverse
Osmose und Mikrofiltration liegt. Ultrafiltration trennt Gelöststoffe auf
Basis von Unterschieden in der Filtrationsgeschwindigkeit verschiedener
Komponenten über
die Membran hinweg als Reaktion auf eine gegebene Druck-Triebkraft
(R. van Reis und A. L. Zydney, siehe oben, S. 2197). Gelöststoff-Filtrationsgeschwindigkeiten
und daher Membranselektivität werden
von thermodynamischen sowie hydrodynamischen Wechselwirkungen bestimmt
(R. van Reis und A. L. Zydney, siehe oben, S. 2197). Ultrafiltration
wird häufig
im Downstream-Processing für
Proteinkonzentration, Pufferaustausch und Entsalzung, Proteinreinigung,
Virusbeseitigung und Klärung
verwendet (R. van Reis und A. L. Zydney, siehe oben, S. 2197).
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Proteinreinigung
wird außerdem
unter Anwendung der Hochleistungs-Querstromfiltration (HPTFF) erzielt,
wobei das gewünschte
Protein abhängig
von den relativen Filtrationsgeschwindigkeiten entweder in Retentat
oder Filtrat gesammelt wird (R. van Reis und A. L. Zydney, siehe
oben, S. 2197). HPTFF ist zur Trennung von Proteinen ähnlicher
Größe unter
Verwendung semipermeabler Membranen zweckdienlich (siehe z.B. R.
van Reis et al., Biotech. Bioeng. 56, 71–82 (1997) und R. van Reis
et al., J. Memb. Sci. 159, 133–142
(1999)). HPTFF erzielt eine hohe Selektivität durch Kontrolle von Filtratfluss
und Geräteströmungsmechanik,
um Verschmutzung zu minimieren und die Wirkungen der Konzentrationspolarisation
auszunutzen (R. van Reis et al., J. Memb. Sci. 159, 133–142 (1999)).
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Trotz
des Werts dieser fortgeschrittenen Filtrationsverfahren besteht
ein Bedarf an verbesserten Membraneigenschaften, so dass die Trenngeschwindigkeit
erhöht
werden kann, ohne die Membranselektivität zu opfern. Derartige Verbesserungen
würden die
Kosten für
die Trennung vermindern und die Ausbeute wertvoller Proteine erhöhen.
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US-Patent
Nr. 4.604.204 beschreibt die kovalente Modifizierung von Celluloseacetat-Membranen durch Hinzufügen geladener
Gruppen, um Membranporengröße und Durchlässigkeit
zu verändern. Die
GB 1 504 261 beschreibt
die Modifizierung asymmetrischer Acetylcellulosemembranen mit Verbindungen,
die geladene oder aufladbare Gruppierungen, insbesondere ionogene
reaktive Farbstoffmoleküle
tragen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Filtrationsmembranen, die eine Nettoladung besitzen,
die entweder positiv oder negativ ist, und betrifft weiters Verfahren
der Herstellung der geladenen Membranen und deren Verwendung bei
der Trennung eines Proteins von einem Gelöststoff oder Gemisch von Gelöststoffen,
wie z.B. Salzen, Puffergelöststoffen
oder Proteinen. Die Proteine werden teilweise auf Basis der Größe der Proteine
und teilweise auf Basis der Nettoladung der Proteine getrennt. Die
geladenen Membranen stoßen
Proteine ab, die dieselbe Ladungspolarität wie die Membran aufweisen,
wodurch derartige Proteine stromauf der Membran zurückgehalten
werden. Proteine passieren die Membranporen, wenn sie eine neutrale
Nettoladung oder eine der Membran entgegengesetzte Polarität aufweisen
und kleiner als der mittlere Porendurchmesser sind. Das Siebvermögen der
geladenen Membranen der Erfindung, das als Siebkoeffizient gemessen
wird, ist im Vergleich zu einer ungeladenen Membran drastisch verbessert, während die
Durchlässigkeit
nicht geopfert wird.
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Herkömmliche
Proteinfiltration wiegt die Membrandurchlässigkeit mit Gelöststoffsiebung
auf. Idealerweise ist die Durchlässigkeit
hoch, während die
Siebung für
die selektive Zurückhaltung
es gewünschten
Proteins niedrig ist. Unter Anwendung herkömmlicher Filtrationsmembranen
opfert der gewöhnliche
Fachmann jedoch die Durchlässigkeit,
um an Selektivität
zu gewinnen, wodurch die Trenngeschwindigkeit bzw. Proteinausbeute
eingeschränkt wird.
Die geladenen Membranen der Erfindung stellen andererseits hohe
Durchlässigkeit
bereit, wodurch die Trennung beschleunigt wird, während die Siebung
für eine
selektivere Trennung und höhere Ausbeute
des gewünschten
Proteins erniedrigt wird.
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In
einem ihrer Aspekte umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eine Cellulosefiltrationsmembran, die kovalent mit einer im Anspruch
1 dargelegten geladenen Verbindung modifiziert ist. Filtrationsmembranen
sind im Handel aus verschiedenen Quellen erhältlich, einschließlich von,
jedoch nicht eingeschränkt
auf Millipore Corp., Bedford, MA, USA und Pall Filtron Corp., Northborough,
MA, USA. Die Filtrationsmembran weist Hydroxylgruppen auf, die an
der Membranoberfläche
für die Reaktion
mit einer Derivatisierungsverbindung zur Verfügung stehen. Diese Hydroxylgruppen
sind in erster Linie Alkoholgruppierungen einer Cellulosematrix.
Die Membran ist Cellulose, bevorzugter ist die Membran zusammengesetzte
regenerierte Cellulose (CRC) (siehe beispielsweise US-Patent Nr.
5.522.991 für
eine Beschreibung von Cellulosemembranen). Eine Cellulosemembran
hat die Vorteile der innewohnenden Eigenschaften geringer Verschmutzung,
Hydrophilie, Verfügbarkeit
primärer
Alkoholgruppen (aus Glucosegruppierungen der Cellulose) zur Reaktion
mit einer geladenen Verbindung, und Stabilität unter alkalischen Bedingungen.
Eine CRC-Membran hat den zusätzlichen
Vorteil der mechanischen Festigkeit.
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Die
Membran ist eine Cellulosemembran, vorzugsweise eine CRC-Membran,
die so modifiziert ist, dass sie eine Nettoladung (positiv oder
negativ) aufweist, worin die Durchlässigkeit gegenüber der Siebleistung
erhöht
wird. Beispielsweise wird für
eine gegebene Membrandurchlässigkeit
der Siebkoeffizient für
ein stromauf der Membran zurückgehaltenes Protein
um zumindest das 1,5-fache vermindert wenn die Membran und das zurückgehaltene
Protein dieselbe Polarität
(positiv oder negativ) aufweisen.
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In
einer ihrer Ausführungsformen
umfasst die Erfindung eine Membran, vorzugsweise eine CRC-Membran,
in der eine Vielzahl der primären
Alkoholgruppen an eine geladene Verbindung gebunden ist. Vorzugsweise
behält
die geladene Verbindung ihre Ladung unter den Bedingungen bei, die
zur Trennung des Proteins von Gelöststoffen oder einem Gemisch
von Proteinen verwendet werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist die geladene Verbindung positiv geladen. Die positive Ladung
kann aus jeder Verbindung erzeugt werden, die ihre Ladung unter
den Bedingungen der Proteintrennung beibehält. Beispielsweise kann die
Ladung durch ein Amin, ein quaternäres Amin und dergleichen erzeugt
werden, ist aber nicht darauf beschränkt. Wo die Verbindung ein
Amin ist, weist das Amin vorzugsweise zwei oder drei Niederalkylgruppen
auf, die kovalent angebunden sind, um ein Amin zu liefern, das zur
Beibehaltung seiner Ladungspolarität unter den Bedingungen der
Proteintrennung fähig
ist. Vorzugsweise weisen die Niederalkylgruppen ein bis acht Kohlenstoffatome
auf, bevorzugter sind die Alkylgruppen Methyl-, Ethyl- und Propylgruppen. Beispielsweise
kann die Amingruppierung der positiv geladenen Verbindung ein Trialkyl-
oder Dialkylamin, wie z.B. Trimethylamin, Triethylamin, Diethylaminoethyl
und dergleichen sein.
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In
anderen Ausführungsformen
ist die geladene Verbindung negativ geladen. Die negative Ladung
kann aus jeder Verbindung erzeugt werden, die ihre Ladung unter
den Bedingungen der Proteintrennung beibehält. Beispielsweise kann die
Ladung durch eine Säure,
wie z.B. Carbonsäure,
eine Sulfonsäure,
Carboxymethylsulfonat, Methylsulfonat und dergleichen erzeugt werden.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
umfasst die geladene Verbindung einen Linkerarm zwischen der geladenen
Gruppierung und der kovalent an eine reaktive Gruppe der Membran
gebundenen Gruppierung. Wenn die Membran eine CRC-Membran ist, trennt
der Linkerarm die geladene Gruppierung und eine primäre Alkoholgruppe
der Cellulosematrix, mit welcher der Linker reagiert. Der Linkerarm ermöglicht der
geladenen Gruppierung, aus der Oberfläche der Membran vorzustehen.
Wo die geladen Verbindung die Oberfläche einer Membranpore modifiziert,
ermöglicht
der Linkerarm es der Verbindung, in das Lumen der Pore vorzustehen,
wodurch die Größe der Pore
modifiziert wird. Größere Membranporen
werden in ihrer Größe vermindert,
kleinere Poren werden aufgefüllt
und noch kleinere Poren können
von der Verbindung aufgrund sterischer Behinderung und/oder elektrostatischer
Abstoßung nicht
durchdrungen werden. Folglich wird die Porengrößenverteilung eingeengt, was
für eine
verbesserte Proteintrennung sorgt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst der Linkerarm eine Alkylkette von einem bis einschließlich 20
Kohlenstoffatomen. Die Alkylkette kann verzweigt sein und die Verzweigung
kann eine erste geladene Gruppierung an eine zweite (oder zusätzliche)
geladene Gruppierung binden. Der Linkerarm kann jegliche Kette von
Atomen oder Molekülgruppierungen
sein, die selbst inert gegen die Reaktionsbedingungen, die zur Bindung
der Ladung an die Membran verwendet werden, und inert gegen die
Bedingungen der Proteintrennung sind. Die Länge des Linkerarms wird entspre chend
der gewünschten
Porengrößenmodifizierung
gewählt.
Vorzugsweise ermöglicht
es die Linkerarmlänge
der geladenen Verbindung, in einige der Poren einzudringen und mit
ihnen zu reagieren, wodurch die Porengrößenverteilung eingeengt wird.
Linkerarme können
Kohlenhydrate, Dextrane, Saccharide, Peptide (die geladene oder
ungeladene Aminosäureseitenketten
aufweisen), Polymere (wie z.B. Polyvinylderivate, Polyetherderivate
und dergleichen) und ähnliche
Ketten umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Wenn die Filtrationsmembran
hydrophil ist und wässrige
Reaktionsbedingungen verwendet werden, um die geladene Verbindung
an die Membran zu binden, ist der Linkerarm vorzugsweise hydrophil
und die geladene Verbindung in ihrer reaktiven Form (zur Reaktion
mit der Membran) in der wässrigen
Reaktionslösung
löslich.
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Demgemäß kann die
Erfindung einen Linkerarm umfassen, der eine Alkylkette mit einer
Länge zwischen
einem und zwanzig Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einem und zehn,
bevorzugter einem und sieben Kohlenstoffatomen, ist. Alternativ
dazu kann der Linkerarm eine Kohlenhydrat- oder Dextrankette aus
einer bis einschließlich
fünfzehn
Saccharidgruppierungen, vorzugsweise einer bis zehn, bevorzugter
einer bis fünf
Saccharidgruppierungen, sein. Der Linkerarm kann ein Peptid aus
einer bis fünfundzwanzig
Aminosäuren,
vorzugsweise einer bis fünfzehn,
bevorzugter einer bis zehn Aminosäuren, sein. Außerdem kann
der Linkerarm jegliches Polymer aus einer bis fünfundzwanzig Grundeinheiten
sein, das gegen die Reaktions- und
Trennbedingungen inert ist. Der Linkerarm kann verzweigt sein, worin
jeder Zweig kürzer
als die Länge
des Hauptzweigs (der Linkerarm) ist, der an die reaktive Gruppe
gebunden ist. Jeder Zweig kann in einer geladenen Gruppierung enden,
und die Ladung jeder geladenen Gruppierung hat dieselbe Polarität (entweder
positiv oder negativ).
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In
einer der Ausführungsformen
hat die reaktive geladene Verbindung die allgemeine Formel X-L-Y,
wobei X eine reaktive Gruppe ist, die mit einer reaktiven Gruppe
an der Membran reagiert, L der Linkerarm ist und Y die geladene
Gruppe ist. Demgemäß ist das
X der reaktiven geladenen Verbindung, wenn die Membran eine CRC-Membran ist und die reaktiven
Gruppen an der Membran primäre
Alkoholgruppen sind, eine Gruppierung, die die Reaktion mit den
primären
Alkoholgruppen unter wässrigen Bedingungen
fördert.
Als solche ist X vorzugsweise eine Abgangsgruppe, die für nukleophilen
Angriff durch eine primäre
Alkoholgruppe zugänglich
ist, um eine Etherbindung zwischen der Cellulosekohlenhydratmatrix
und dem Linkerarm der geladenen Verbindung auszubilden. Folglich
sind zweckdienliche geladene Verbindungen Alkylhalogenide, und die
reaktive Gruppe ist ein Halogenid, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf
Chlorid, Bromid oder Iodid.
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Die
Erfindung umfasst ein Verfahren der Herstellung einer geladenen
Membran der Erfindung, wobei das Verfahren das Umsetzen einer reaktiven geladenen
Verbindung mit einer Hydroxylgruppe an der Membran umfasst, so dass
der geladene Abschnitt der geladenen Verbindung kovalent an die Membran
gebunden wird. Nach der Reaktion ist die Nettoladung der Membran
positiv oder negativ. Die reaktive geladene Verbindung durchdringt
eine Vielzahl von Membranporen und modifiziert die Porengrößenverteilung
dermaßen,
dass die Porengrößenverteilung
eingeengt wird.
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Wo
die geladene Gruppe positiv ist, kann die geladene Gruppe ein Amin,
ein quaternäres
Amin, wie z.B. ein Dialkyl oder Trialkyl oder dergleichen sein.
Wenn die geladene Gruppe negativ ist, ist die geladene Gruppe eine
Säure,
wie z.B. eine Sulfonsäure,
eine Carbonsäure,
eine Carboxymethylsulfonylgruppe und dergleichen. Die geladene Gruppe wird
als Gruppierung gewählt,
die ihre Ladung unter den Bedingungen des Proteintrennverfahrens
der Erfindung beibehält.
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In
einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Membranfiltrationsverfahren
zur Trennung eines Proteins von einem Gelöststoff oder einem Gemisch
von Gelöststoffen
(wie z.B. Salzen, Puffergelöststoffen
oder Proteinen) unter Verwendung einer geladenen Membran der Erfindung.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren (1) das Kontaktieren eines Proteins
in einem Gelöststoffgemisch
mit einer geladenen Cellulosemembran, bevorzugter einer CRC-Membran,
die mit einer reaktiven geladenen Verbindung umgesetzt worden ist,
um über
einen Linkerarm eine Verbindung zu einer geladenen Gruppe zu bilden,
worin das zurückzuhaltende
Protein eine Nettoladung aufweist, die dieselbe wie die Ladungspolarität der Membran
unter den Trennbedin gungen ist, und (2) das Trennen des Proteins
von zumindest einem anderen Gelöststoff
oder Protein im Gemisch, worin das andere Protein unterschiedliche
Nettoladung aufweist oder neutral ist.
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In
einer der Ausführungsformen
der Erfindung wird vor dem Kontaktieren eines Proteins in einem
Gemisch mit der Membran der pH des Gemischs verändert, was bewirkt, dass die
Nettoladung des gewünschten
Proteins dieselbe wie die Ladungspolarität der Membran ist. Gleichzeitig
macht die pH-Änderung
zumindest einen vom gewünschten Protein
abzutrennenden Gelöststoff
neutral oder entgegengesetzt zur Membranladung. Während der Kontaktierungs-
und Trennschritte geht der neutrale Gelöststoff durch die geladene
Membran in das Filtrat über,
während
das gewünschte
geladene Protein stromauf der Membran zurückgehalten wird. Diese Ausführungsform
der Erfindung kann wiederholt werden, um nacheinander Gelöststoffe
aus dem Proteingemisch zu entfernen.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung ist das Filtrationsverfahren eine Ultrafiltration
(siehe allgemein van Reis und Zydney, „Protein Ultrafiltration", siehe oben, S.
2197). In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist das Filtrationsverfahren Hochleistungs-Querstromfiltration
(siehe allgemein R. van Reis et al., J. Memb. Sci. 159, 133–142 (1999)).
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Diese
und andere Ziele, Vorteile und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung
werden für
einen Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bei Lektüre der unten
vollständiger
dargestellten Einzelheiten der Zusammensetzungen, Verfahren und
Verwendungen klar.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Grafik, die geladene Kugeln zeigt, die Proteine darstellen,
die eine Nettoladung auf Basis der pKa-Werte der Oberflächenaminosäuren bei
einem vorgegebenen pH der Trennlösungen (Retentat
und Filtrat) aufweisen. Es ist eine Filtrationsmembran grafisch
dargestellt, die eine positive Landung aufweist. Der Fluss der Trennlösung ist
in Abwärtsrichtung
durch die Membran, wobei zurückgehaltene
Proteine dieselbe Ladung wie die Membran (positiv) im Retentat aufweisen,
während
nettoneutrale und nettonegative Proteine mit dem Filtrat durch die
Membran fließen.
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2A ist
eine Grafik einer Cellulosemembran, die mit einer reaktiven geladenen
Verbindung, 3-Brompropyltrimethylammoniumbromid reagiert. Die -OH-Gruppen
stellen die primären
Alkohole einer CRC-Matrix dar. Die primären Alkohole reagieren mit dem
Alkylhalogenid in dieser Grafik, um eine kovalente Etherbindung
auszubilden, die die geladene Gruppierung mit der Cellulosematrix
verbindet. 2B ist eine ähnliche Grafik einer Cellulosemembran,
bei der die primären
Alkohole mit einer reaktiven geladenen Verbindung, 3-Brompropylsulfonat
reagiert haben, um eine kovalente Etherbindung auszubilden. Bei
diesen Beispielen sind die Reaktionen basenkatalysiert.
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3 ist
eine Grafik, die eine mit 3-Brompropyltrimethylammoniumbromid umgesetzte
Pore einer Filtrationsmembran zeigt. Eine der Poren ist vergrößert, um
die an die Oberfläche
der Pore und in das Lumen der Pore vorstehende geladene Verbindung zu
zeigen. Als Folge der Oberflächenmodifzierung
ist die Porengröße wirksam
verringert. Außerdem
stößt die positive
Ladung der Pore ein Protein derselben Ladung ab, was die Wahrscheinlichkeit
erhöht,
dass das Protein relativ zu neutralen Proteinen in einem Gemisch
zurückgehalten
wird.
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4 ist
eine Grafik, die den Zusammenhang zwischen Membrandurchlässigkeit
(x-Achse) und Proteinsiebung
(y-Achse) für
zehn im Handel erhältliche
ungeladene Filtrationsmembranen zeigt. Die Grafik zeigt, dass die
Erhöhung
der Durchlässigkeit
einer Erhöhung
der Siebung entspricht. Der Testgelöststoff für die handelsüblichen
Membranen mit einer mittleren Größe von 10
kD war ungeladenes Dextran. „F" und „M" beziehen sich auf
die Membranhersteller Filtron bzw. Millipore.
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5 ist
eine Grafik, die den Zusammenhang zwischen Filtratfluss (ml/min,
x-Achse) und Siebung (y-Achse) für
ungeladene und geladene Membranen zeigt, die einen Cutoff von 300
kD oder 1.000 kD MW aufweisen. Der Fluss ist proportional zur Mem brandurchlässigkeit
(siehe Zeman und Zydney, siehe oben, S. 16). Die Siebung erhöht sich
mit der Erhöhung
des Flusses. Im Gegensatz zu herkömmlichen Membranen vermindert
sich jedoch der Siebkoeffizient eines geladenen Proteins für einen
gegebenen Wert des Flusses, wenn der Membran eine gleiche Ladung
hinzugefügt
wird.
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6 ist
eine Grafik, die den Zusammenhang zwischen Membrandurchlässigkeit
(y-Achse) und Siebung
(x-Achse) für
eine ungeladene Membran mit einer mittleren Porengröße von 300
kD (weiße
Raute) und eine ungeladene Membran mit einer mittleren Porengröße von 1.000
kD (weiße
Kreise) zeigt, die die durchgezogene Linie definieren. Eine positiv
geladene Membran mit einer mittleren Poregröße von 300 kD (schwarze Raute)
und eine positiv geladene Membran mit einer mittleren Poregröße von 1.000
kD (schwarzer Kreis) definieren die gestrichelte Linie. Das Gelöststoffprotein
ist positiv geladener, rekombinanter, menschlicher monoklonaler
Anti-HER2-Antikörper (rhuMab
HER2). Die Daten zeigen, dass für
eine gegebene Durchlässigkeit
die Siebung drastisch vermindert wird (in diesem Beispiel um ungefähr zwei
Größenordnungen),
wenn die Membran dieselbe Ladung wie das getestete Protein aufweist.
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Bevor
die vorliegenden Filtrationsmembranen und Verfahren ihrer Herstellung
und Verwendung beschrieben werden, versteht es sich, dass diese
Erfindung nicht auf die beschriebenen speziellen Zusammensetzungen
von Materialien und Verfahren beschränkt ist, da derartige Zusamensetzungen
und Verfahren selbstverständlich
variieren. Es versteht sich außerdem,
dass die hierin verwendete Terminologie ausschließlich dem
Zweck der Beschreibung spezieller Ausführungsformen dient und keinerlei Einschränkung beabsichtigt,
da der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ausschließlich durch
die beigefügten
Ansprüche
beschränkt
ist.
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BESCHREIBUNG
DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Definitionen
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„Cellulosemembran" bezieht sich auf
ein Cellulosepolymer auf einer mikroporösen Membran, wobei es sich
bei Cellulose um D-Glucose-Grundeinheiten handelt. Die primäre Alkoholgruppe
eines Glucosemonomers stellt die reaktiven Spezies auf der Membran
bereit, an die die geladene Verbindung kovalent gebunden wird.
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„CRC-Membran" bezieht sich auf
eine zusammengesetzte Cellulosemembran, die durch Gießen von
Cellulose auf ein mikroporöses
Substrat hergestellt wird, um die mittlere Porengröße zu kontrollieren
und die Anzahl von Defekten im Celluloseblatt einzuschränken. CRC-Membranen
sind bei der praktischen Ausführung
der Erfindung bevorzugt, da sie eine höhere mechanische Festigkeit
als Cellulosemembranen aufweisen, während die Hydrophilie und geringe
Verschmutzungseigenschaften von Cellulose erhalten bleiben, die
bei Proteintrennungen zweckdienlich sind.
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„Geladene
Verbindung" bezieht
sich auf die an die Filtrationsmembran gebundene Verbindung, worin
die Verbindung eine Gruppierung umfasst, die unter den zur Trennung
eines Proteins von einem Gemisch von Proteinen verwendeten Bedingungen eine
positive oder negative Ladung aufweist. Gemäß der Erfindung kann die geladene
Verbindung weiters einen Linkerarm zwischen der Membran und der
geladenen Gruppierung aufweisen, so dass die geladene Verbindung
aus der Oberfläche
der Membran vorsteht. Wenn die geladene Verbindung aus der Oberfläche einer
Pore in das Lumen der Pore vorsteht, modifiziert die geladene Verbindung
die wirksame Größe der Pore
und modifiziert die Porengrößenverteilung
der Membran.
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„Reaktive
geladene Verbindung" bezieht
sich auf die geladene Verbindung vor der Bindung an die Membran,
so dass die reaktive geladene Verbindung nach wie vor die reaktive
Gruppierung beibehält,
die die Reaktion der Membran-reaktiven geladenen Verbindung fördert. Wenn
beispielsweise die geladene Verbindung ein Propyl trimethylammoniumion
ist, das kovalent an eine CRC-Membran gebunden ist, kann die reaktive
geladene Verbindung Brompropyltrimethylammoniumbromid sein. Die
kovalente Bindung umfasst die nukleophile Verdrängung des Alkyl-Broms durch
einen primären
Alkohol der Cellulosematrix (siehe beispielsweise 2A).
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„Linkerarm" bezieht sich auf
den Abschnitt des Moleküls
der geladenen Verbindung zwischen dem Abschnitt, der mit einer reaktiven
Gruppe an der Oberfläche
einer Filtrationsmembran reagiert oder reagiert hat, und der geladenen
Gruppierung. Vorzugsweise ist der Linkerarm eine Kette von Atomen oder
Moleküluntereinheiten,
wobei die Kette gegen die Reaktionsbedingungen inert ist, die zur
kovalenten Bindung der geladenen Verbindung an die Membran verwendet
werden, und weiters gegen die wässrigen
Bedingungen inert ist, die während
der Proteintrennung verwendet werden. Ein Linkerarm kann eine Alkylkette
aus einem bis zwanzig Kohlenstoffatomen, eine Kohlenhydratkette
aus einer bis fünfzehn Saccharidgruppierungen
(einschließlich
beispielsweise Ribose und Desoxyribose), eine Dextrankette aus einer
bis fünfzehn
Saccharidgruppierungen, eine Aminosäurekette aus einer bis fünfundzwanzig
Aminosäuren
und andere Polymere (wie z.B. jene, die zur Herstellung der Membran
selbst verwendet werden) aus einer bis fünfundzwanzig Grundeinheiten umfassen,
ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Wenn eine geladene Verbindung eine Aminosäurekette als Linkerarm umfasst
und die geladene Gruppierung die endständige Aminosäure der
Kette ist, ist die Seitenkette der endständigen Aminosäure vorzugsweise eine
geladene Seitenkette.
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„Sieben" bezieht sich auf
das Verhältnis
der Konzentration eines bestimmten Gelöststoffs im Filtrat (stromab
der Membran) zur Konzentration desselben Gelöststoffs in der Zulauflösung (stromauf
der Membran) (siehe Zeman und Zydney, siehe oben, S. 308). Im Allgemeinen
legt ein hoher Siebwert nahe, dass der Gelöststoff leicht durch die Membran
strömt, währen eine
niedriger Siebwert nahe legt, dass der Gelöststoff größtenteils von der Membran zurückgehalten
wird. Wenn gewünscht
wird, einen Gelöststoff stromauf
der Membran zurückzuhalten,
ist ein niedrigerer Siebkoeffizient bevorzugt.
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„Durchlässigkeit" bezieht sich auf
die Filtrationsgeschwindigkeit, dividiert durch den Nettodruckabfall über die
Membran. Durchlässigkeit
ist daher der Reziprokwert des Membranwiderstands. Membrandurchlässigkeit
wird in erster Linie durch Porengrößenverteilung, Porosität (Porendichte),
Membrandicke und Lösungsmittelviskosität bestimmt.
Im Allgemeinen erhöht
sich die Siebung mit steigender Durchlässigkeit. Wenn die Siebung
aufgrund der Anfügung
einer geladenen Verbindung an die Membran verbessert wird, ist die
Verbesserung der Siebung eine Verbesserung bezüglich einer Membran, die im Wesentlichen
dieselbe Durchlässigkeit
(innerhalb von 50%, vorzugsweise 30%, bevorzugter innerhalb von
10% derselben Durchlässigkeit)
wie die geladene Membran aufweist, der jedoch die geladene Verbindung
fehlt. Wo daher die Verbesserung eine Verminderung der Siebung ist,
da ein geladener Gelöststoff,
wie z.B. ein Protein durch eine gleich geladene Membran zurückgehalten
wird, ist die Siebung eine Verminderung bei vergleichbarer oder
im Wesentlicher gleicher Durchlässigkeit.
Folglich wird die Filtrationsgeschwindigkeit beibehalten, während die
Selektivität
der Membran verbessert wird.
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Unter „Nettoladung" wird bei Bezugnahme auf
eine Membran- oder Proteinladung eine Ladung verstanden, die vorwiegend
positiv oder negativ ist, bezieht sich jedoch, falls nicht anders
angegeben, nicht auf einen speziellen Wert für die Anzahl positiver Ladungen
gegenüber
der Anzahl negativer Ladungen an der Membran oder am Protein. Gleichermaßen beziehen
sich „gleiche
Ladung" oder „dieselbe
Ladung" auf die
Situation, in der ein Protein mit einer gegebenen, entweder positiven
oder negativen Ladung mit einer Membran oder einem anderen Protein
mit einer gegebenen, entweder positiven oder negativen Ladung verglichen
wird.
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„Proteingemisch" bezieht sich auf
verschiedene Proteine unterschiedlicher Größen und Nettoladungen unter
gegebenen Trennbedingungen von pH und Ionenstärke. Gemäß dem Trennverfahren der Erfindung
kann ein Protein von Interesse, wenn die Nettoladung des Proteins
bekannt ist oder durch Verändern
der pH-Bedingungen manipuliert wird, um eine positive Nettoladung
oder negative Nettoladung aufzuweisen, von unterschiedlich anders
geladenen oder neutralen Proteinen getrennt werden, indem das Proteingemisch
durch eine Membran der Erfindung mit derselben Ladung wie das Protein
von Interesse (d.h., entweder einer positiven Nettoladung oder einer
negativen Nettoladung) filtriert wird. Beispielsweise sieht die
Erfindung ein Verfahren der Trennung eines gewünschten Proteins von zumindest
einem Protein eines Gemischs von Proteinen in einer wässrigen
gepufferten Lösung
vor, wobei der pH der Lösung
so verändert
wird, dass das gewünschte
Protein eine Nettoladung und ein davon zu trennendes Protein neutral
ist oder eine Nettoladung aufweist, die der Nettoladung des gewünschten
Proteins entgegengesetzt ist. Als nächstes wird das Proteingemisch
mit einer geladenen Cellulosefiltrationsmembran der Erfindung kontaktiert,
worin das gewünschte
Protein und die Membran gleiche Nettoladungen aufweisen. Das gewünschte Protein
wird vom neutralen Protein und dem entgegengesetzt geladenen Protein
getrennt, indem das gewünschte Proteine
stromauf der Membran zurückgehalten
und das neutrale oder entgegengesetzt geladene Protein durch die
Membran filtriert wird. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis das
gewünschte
Protein von einer gewählten
Anzahl an Proteinen des Gemischs getrennt ist.
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Alternativ
dazu sieht die Erfindung ein Verfahren zur Trennung eines gewünschten
Proteins von zumindest einem Protein aus einem Gemisch von Proteinen
in einer wässrigen
gepufferten Lösung vor,
indem der pH der Lösung
so verändert
wird, dass das gewünschte
Protein neutral ist und das davon zu trennende Protein eine Nettoladung
aufweist, die dieselbe wie die geladene Membran ist. Als nächstes wird
das Proteingemisch mit der geladenen Cellulosefiltrationsmembran
der Erfindung kontaktiert. Das gewünschte Protein wird vom geladenen
Protein getrennt, indem das geladene Protein stromauf der Membran
zurückgehalten
und das gewünschte
Protein durch die Membran filtriert wird. Dieser Vorgang wird wiederholt,
bis das gewünschte
Protein von einer gewählten
Anzahl an Proteinen des Gemischs getrennt ist.
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„Porengrößenverteilung" bezieht sich grundsätzlich auf
die Anzahl von Poren, die einen tatsächlichen Radius R nahe dem
theoretischen Radius r aufweisen, ausgedrückt als Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion
(siehe L. J. Zeman und A. L. Zydney, siehe oben, S. 299–301). Bei
Anstieg der Standardabweichung der tatsächlichen Porenradien steigt
die Porengrößenverteilung
entsprechend an. Eine eingeengte Porengrößenverteilung resultiert aus
einer Verminderung der Standardabweichung der Po ren vom theoretischen
Wert. Dies wird beispielsweise erzielt wenn die Größe von einigen
der größeren Poren durch
Hinzufügen
einer geladenen Verbindung in die Poren der geladenen Membran verringert
wird. 3 stellt eine derartige Porengrößenverminderung
grafisch dar. Das Prinzip der Flüssig-Flüssig-Intrusion
ist zur Messung der Porengrößenverteilung
zweckdienlich (siehe R. van Reis und A. L. Zydney, siehe oben, S.
2201). Nach diesem Prinzip werden zwei nicht mischbare Flüssigkeiten,
wie z.B. Lösungen
eines Sulfat-Salzes und eines Polyethylenglykols durch Mischen kontaktiert,
um die Gleichgewichtsverteilung zu erreichen. Die zu testende Membran
wird mit einer der Flüssigkeiten
vorbehandelt, so dass alle Poren gefüllt sind. Nach dem Entleeren
der Zulaufkanäle wird
die zweite Flüssigkeit
in das System eingeführt. Die
erste Flüssigkeit
wird dann durch die zweite Flüssigkeit
aus den Poren verdrängt
und die Flussrate wird als Funktion des Transmembrandrucks gemessen.
Die resultierenden Daten liefern Informationen über die Porengrößenverteilung
und können
mit dem nominellen Molekulargewichts-Cutoff korreliert werden (siehe
R. van Reis und A. L. Zydney, siehe oben, S. 2201).
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele werden angeführt, um
für den
gewöhnlichen
Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung eine vollständige Offenbarung
und Beschreibung bereitzustellen, wie die Zusammensetzungen der
Erfindung hergestellt werden können
und wie die Verfahren der Erfindung praktisch durchgeführt werden
können,
und sollen keine Einschränkung
des Schutzumfangs dessen darstellen, was der Erfinder als seine
Erfindung betrachtet. Es sind Anstrengungen unternommen worden,
um Genauigkeit bezüglich
der verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperaturen usw.) zu gewährleisten,
jedoch sollten gewisse experimentelle Fehler und Abweichungen berücksichtigt
werden. Sofern nicht anders angegeben, ist die Temperatur in Grad
Celsius angegeben und wurden die Reaktionen bei Atmosphärendruck durchgeführt.
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Beispiel 1: Herstellung
geladener Filtrationsmembranen
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Zu
illustrativen Zwecken offenbart dieses Beispiel geladene CRC-Membranen
und Verfahren ihrer Herstellung. Es versteht sich, dass einer Membran
eine Ladung durch chemische Reaktionen, die einem gewöhnlichen
Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verliehen werden
kann, so dass die Produkt-Membran geladen ist und selektiv ein gewünschtes
Protein im Retentat zurückhält und ungeladene
oder entgegengesetzt geladene Proteine ins Filtrat durchlässt. Die
geladene Produkt-Membran hat die Eigenschaft eines niedrigeren Siebkoeffizienten
für eine
gegebene Durchlässigkeit
im Vergleich zu einer ungeladenen Membran oder einer höheren Durchlässigkeit
für einen
gegebenen Siebkoeffizienten.
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CRC-Membranen
sind aufgrund ihrer Hydrophilie sowie ihrer mechanischen Stabilität gegen Druckumkehr
bevorzugt. Stabilität
unter alkalischen Bedingungen ermöglicht eine vollständige, schnelle Reinigung
und Lagerung. Die CRC-Membran-Hydrophilie minimiert Proteinverschmutzung
und vereinfacht die Membranreinigung. Die Membranen werden vorzugsweise
mit einer reaktiven geladenen Verbindung in einer wässrigen
Lösung
umgesetzt. Wässrige
Reaktionsbedingungen sind vorteilhaft, da entflammbare organische
Verbindungen vermieden und die wasserlöslichen Verbindungen leichter
und vollständiger
von der zur Verwendung in pharmazeutischen Anwendungen vorgesehenen
geladenen CRC-Membran entfernt werden. CRC-Membranen wurden von
Millipore, Corp. erhalten (Bedford, MA, USA. Die 300-kD-MW-Membranen wurden
als PLCMK bezeichnet. Die 1.000-kD-MW-Membranen wurden als PLCXK
bezeichnet).
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Es
wurde auf die primären
Alkoholgruppen der D-Glucose-Gruppierungen von Cellulose abgezielt,
da sie regieren können,
ohne die Intaktheit der Cellulosematrix zu untergraben. Primäre Alkohole (R-OH)
reagieren mit Alkylhalogeniden (R'-X, wobei X beispielsweise Brom ist),
um Ether (R-O-R')
zu bilden. In diesem Beispiel wurde eine CRC-Membran mit 2-molarem
3-Brompropyltrimethylammoniumbromid (wie in 2A grafisch
dargestellt) in 0,1 N NaOH bei Raumtemperatur über Nacht umgesetzt.
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Die
umgesetzten Membranen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen
und zur Proteinfiltration verwendet oder in 0,1 N NaOH bei Umgebungstemperatur
gelagert. Die Membranen sind unter diesen Bedingungen für zumindest
sechs Monate stabil.
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Das
quaternäre
Ammoniumion hat eine positive Ladung in wässriger Lösung mit etwa pH 2 bis einschließlich pH
10. Dieser pH-Bereich entspricht dem pH-Bereich, bei dem die meisten
Proteine strukturell intakt sind oder in einem aktiven Zustand gewonnen
werden können,
was ein quaternäres
Amin als geladene Gruppierung der geladenen Verbindung zweckdienlich
macht. Halogene, wie z.B. Bromid, Chlorid und Iodid, sind zweckdienliche
reaktive Gruppierungen, da sie gute Abgangsgruppen bei nukleophilem
Angriff durch den Sauerstoff der primären Alkoholgruppe sind. Es
versteht sich jedoch, dass auch andere anionische Gruppen, die dem
gewöhnlichen Fachmann
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden können, um
die Reaktion zu erleichtern.
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Das
Umsetzen des Alkylhalogenids direkt mit dem primären Alkohol der Cellulose ist
vorteilhaft, da es eine Einstufenreaktion ist. Dieses Verfahren hat
außerdem
den Vorteil, dass die Notwendigkeit vermieden wird, die Membran
zuerst mit einer stark nukleophilen Gruppierung zu derivatisieren,
die während
anschließender
Schritte möglicherweise
nicht vollständig
umgesetzt wird oder weitere Reaktionen erfordern kann, um das hinzugefügte Nukleophil
zu entfernen. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist es, dass zahlreiche
Alkylhalogenide im Handel erhältlich sind.
Daher ist das Verfahren der Herstellung geladener Membranen der
Erfindung schnell und zweckdienlich, wodurch Zeit und Kosten gespart
werden.
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Negativ
geladene Membranen wurden unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens erzeugt.
Die reaktive Verbindung war 2-molare 3-Brompropansulfonsäure in 0,1
N NaOH. Die Reaktion ist in 2B grafisch
dargestellt, und die Reaktionsbedingungen waren die oben für 3-Brompropyltrimethylammoniumbromid
offenbarten. Die Sulfonsäuregruppierung bleibt
in einem pH-Bereich negativ geladen, der für zahlreiche Proteintrennungen
zweckdienlich ist.
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Um
zu verifizieren, dass eine positiv oder negativ geladene CRC-Membran
einheitlich derivatisiert war, wurden die Membranen mit einem Farbstoff gefärbt, der
eine Ladung aufwies, die derjenigen der getesteten Membran entgegengesetzt
war. CRC-O-Propyltrimethylammoniumbromid-Membranen
wurden in destilliertem Wasser ausgiebig gespült und in wässrige Ponceau-Rot-Lösung getaucht.
Der negativ geladene Farbstoff färbte
die positiv geladene Membran einheitlich, färbte jedoch eine Kontrollmembran,
die 0,1 N NaOH ohne 3-Brompropyltrimethylammoniumbromid ausgesetzt
wurdem nicht. Gleichermaßen
wurden CRC-O-Propansulfonsäure-Membranen
in destilliertem Wasser ausgiebig gespült und in wässrige Methylenblau-Lösung getaucht. Der
positiv geladene Farbstoff färbte
die negativ geladene Membran, färbte
jedoch nicht die Kontrollmembran, die 0,1 N NaOH in Abwesenheit
von 3-Brompropansulfonsäure
aufgesetzt wurde. Daher waren in diesem Beispiel die Membranen einheitlich mit
den Alkylhalogeniden derivatisiert.
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Beispiel 2: Die Membran-Porengrößenverteilung
wird modifiziert
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Membranen
werden mit reaktiven, geladenen Verbindungen infiltriert, wenn sterische
Faktoren, wie z.B. Größe und Linkerarmlänge, und
elektrostatische Faktoren, wie z.B. Ladungsabstoßung, es erlauben. Daher werden
gemäß der Erfindung
Membranporen, die groß genug
sind, um die Infiltration einer gegebenen geladenen Verbindung zu
erlauben, mit der geladenen Verbindung derivatisiert, so dass die
Größe des Porenlumens
vermindert wird. 3 zeigt eine Grafik einer Membranpore,
in der Propyltrimethylammoniumionen kovalent an die Wand der Pore
gebunden ist und in das Lumen vorsteht.
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Die
Länge des
Linkerarms kontrolliert das Ausmaß, um das die geladene Verbindung
in das Lumen vorsteht und seinen effektiven Durchmesser vermindert.
Die Ladung erzeugt eine positiv geladene Region, aus der ein ähnlich geladenes
Protein ausgeschlossen wird. Daher wird ein Protein, das eine Gesamtladung
aufweist, die dieselbe wie jene der derivatisierten Membran ist,
von der Oberfläche der
Membran sowie von den Poren der Membran abgestoßen, wodurch die Zurückhaltung
des ge wünschten
Proteins verbessert wird. Neutrale Proteine werden dazu neigen,
mit dem Filtrat durch die geladenen Membranporen zu strömen, da
sie von der Oberfläche
oder den Poren der Membran weder angezogen noch abgestoßen werden.
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Verwendung
einer geladenen CRC-Membran zur Trennung von Proteinen
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Unter
Verwendung herkömmlicher
Membranen wird die Durchlässigkeit
zugunsten verbesserter Siebung geopfert oder es wird die Siebung
zugunsten verbesserter Durchlässigkeit
geopfert. Im Allgemeinen erhöht
sich der Siebkoeffizient mit der Erhöhung der Durchlässigkeit
einer Membran. Dies widerspiegelt die Tatsache, dass mehr des zurückzuhaltenden
Proteins durch eine höchst
durchlässige Membran
strömt,
was den Filtrationsprozess schneller, jedoch weniger selektiv macht
(hoher Siebkoeffizient), was in niedrigerer Ausbeute des gewünschten Proteins
und in einer weniger vollständigen
Trennung resultiert. 4 ist eine Grafik, die zeigt,
dass handelsübliche
Ultrafiltrations-(UF-)Membranen Siebung zugunsten verbesserter Durchlässigkeit
opfern. Die UF-Membranen aus 4 wurden
unter Verwendung eines standardisierten gemischten Dextrantests
getestet (siehe beispielsweise Zeman und Zydney, siehe oben, S.
183–88).
Die getesteten Membranen waren von Pall Filtron (Cellulose, OmegaTM (Polysulfon mit hydrophiler Modifizierung),
AlphaTM (Polyethersulfon, modifiziert zur
Reduktion der Verschmutzung) und NovaTM (Polyethersulfon))
und Millipore (regenerierte Cellulose (RC), BiomaxTM mit Sieb
A, BiomaxTM mit Sieb B und PES (Polyethersulfon)).
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Die
geladenen Membranen der Erfindung vermindern den Siebkoeffizienten
bei gegebener Durchlässigkeit
im Vergleich zu einer ungeladenen Membran. Durch Ladungsmodifizierung
einer ungeladenen Membran wird das Problem der Opferung der Siebung
zugunsten der Durchlässigkeit
(oder umgekehrt) gelöst.
Die Membranen der Erfindung weisen eine drastisch verbesserte Siebung
bei gegebener Durchlässigkeit
im Vergleich zu einer ungeladenen Kontrollmembran auf.
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5 zeigt
den Zusammenhang zwischen Filtratfluss (ml/min, x-Achse) und Siebung
(y-Achse) für
ungeladene und geladene Membranen mit Cutoffs von 300 kd oder 1.000
kD. Bei Erhöhung
des Flusses, einem Faktor, der zur Membrandurchlässigkeit proportional ist (siehe
Zeman und Zydney, siehe oben, S. 16), erhöht sich die Siebung. Im Gegensatz zu
herkömmlichen
Membranen vermindert sich jedoch bei Hinzufügung einer Ladung der Siebkoeffizient
für einen
vorgegebenen Wert des Flusses. Bei einem relativ hohen Fluss von
8 ml/min (siehe „a" der 5)
weist eine geladene 1.000-kD-CRC-Membran (CRC 1000+) oder eine geladene 300-kD-CRC-Membran (CRC 300+)
einen ungefähr 10-mal
niedrigeren Siebkoeffizienten auf als die ungeladene Kontrollmembran.
Bei einem niedrigeren Fluss von 5 ml/min (siehe „b" der 5) ist der
Siebkoeffizient für
die geladenen 1.000-kD- sowie 300-kD-CRC-Membranen um ungefähr das 100fache vermindert.
In diesem Beispiel war die an die Oberfläche und den Poren der CRC-Membran hinzugefügte geladene
Verbindung Propyltrimethylammoniumion. Die Membranen wurden wie
im Beispiel 1 offenbart hergestellt. Das Protein war rhuMAb HER2
unter Bedingungen, die es wie die CRC+-Membran positiv machten.
Der Siebkoeffizient wurde unter Verwendung der rhuMab-HER2-Konzentration
(ng/ml) in der Zulauflösung
(bekannt), geteilt durch die rhuMAb-HER2-Konzentration im Filtrat (mittels
ELISA bestimmt) berechnet.
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Die
Daten am Punkt „b" aus 5 wurden neu
berechnet und aufgetragen, um den Zusammenhang zwischen Durchlässigkeit
und Siebung in 6 zu zeigen. Diese Daten zeigen
außerdem,
dass bei vorgegebener Durchlässigkeit
die Siebung für 300-kD-
sowie 1.000-kD-Cutoff-CRC-Membranen um das 100fache vermindert wird,
wenn eine Ladung hinzugefügt
wird. Folglich kann eine optimale Durchlässigkeit gewählt werden,
um eine rasche Trennung zu ermöglichen,
während
der Siebkoeffizient für
die Membran stark verbessert (und nicht beeinträchtigt) wird und eine verbesserte
Trennung und Ausbeute des gewünschten
Proteins ermöglicht
wird. Diese drastischen und unerwarteten Verbesserungen der Membraneigenschaften
resultieren aus der Hinzufügung
geladener Verbindungen an die Oberfläche und Poren der Membran.
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Trennung
eines Gemischs von Proteinen gemäß der Erfindung.
Ein Gemisch aus Proteinen, die jeweils einen anderen pI aufwiesen,
wurde unter Verwendung der geladenen Membranen der Erfindung getrennt.
In einem ersten Beispiel wurden zwei Proteine getrennt. RhuMAb HER2,
das gewünschte
Protein, hat einen pI von 8,9. Rinderserumalbumin (BSA), eine Verunreinigung,
hat einen pI von 4,8. Die Proteine wurden in einem Puffer mit pH
4,5 vermischt, was bewirkte, dass rhuMAb HER2 positiv geladen und
BSA neutral war. Eine positiv geladene Membran der Erfindung, wie
z.B. eine CRC-O-Propyltrimethylammonium-Membran, wurde für die Trennung
verwendet. Die Proteine und der Puffer wurden mit der positiv geladenen
Membran kontaktiert. Von den beiden Proteinen strömte nur
BSA durch die Membran in das Filtrat, da es von der/den positiven Oberfläche oder
Poren der Membran nicht abgestoßen
wurde. Das gewünschte
Protein, rhuMAb HER2, wurde stromauf der positiv geladenen Membran
zurückgehalten.
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Eine ähnliche
Strategie ist zur Zurückhaltung eines
Proteins, wie z.B. BSA in diesem Beispiel zweckdienlich, das einen
pI von 4,8 aufweist, während
es dem gewünschten
Produktprotein, beispielsweise Fab (z.B. Anti-VEGF-Fab) mit einem
pI von 8,1 ermöglicht
wird, durch eine Membran zu strömen,
um die Trennung der beiden Proteine ähnlicher Größe, in diesem Beispiel 68 kD
bzw. 45 kD, zu bewirken. Die Trennung wird unter Verwendung eines
Puffers mit pH 8 durchgeführt,
wodurch bewirkt wird, dass Fab neutral ist. Das Proteingemisch aus
BSA und Fab im Puffer pH 8 wird mit einer CRC-O-Propansulfonsäure-Membran
der Erfindung (negativ geladen bei pH 8) kontaktiert, um es dem
Protein mit höherem
pI (Fab, pI 8,1) zu ermöglichen,
durch die Membran ins Filtrat zu strömen, und das negativ geladene
Protein mit niedrigerem pI (BSA, pI 4,8) stromauf der negativ geladenen
Membran zurückzuhalten.
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Ein
pH-Gradient kann gegenüber
der oben beschriebenen schrittweisen pH-Änderung bevorzugt sein, obgleich
eine ähnliche
Strategie zur selektiven Proteinzurückhaltung und Entfernung verfolgt wird.
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Die
vorangehende niedergeschriebene Patentbeschreibung wird als ausreichend
erachtet, um einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung die praktische
Ausführung
der Erfindung zu ermöglichen. Der
Schutzumfang der vorliegenden Erfindung wird durch die oben bereitgestellten
Beispiele nicht eingeschränkt,
da die Beispiele für
gewisse Aspekte der Erfindung illustrativ sind und jegliche Zusammensetzungen
oder Verfahren, die funktionell gleichwertig sind, im Schutzumfang
dieser Erfindung liegen. In der Tat werden verschiedene Modifizierungen
der Erfindung zusätzlich
zu jenen, die hierin dargestellt und beschrieben sind, dem Fachmann
auf dem Gebiet der Erfindung aus der vorangehenden Beschreibung offensichtlich
und liegen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche.