DE60118793T2 - Cystein protease inhibitoren - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft Inhibitoren von Cystein Proteasen, besonders denen der Papain Superfamilie. Die Erfindung bietet neue Verbindungen an, die nützlich in der Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen verursacht durch das Ungleichgewicht von physiologischen Proteasen, wie Katepsin K oder pathogenen Proteasen, wie Malaria Falcipain, sind.
  • Die Papain Superfamilie von Cystein Proteasen ist weit verbreitet in verschiedenen Spezien, einschließlich Säugetieren, Invertebraten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien. Eine Anzahl von Säugetier Katepsin Enzymen, einschließlich die Katepsine B, F, H, K, L, N und S, wurden dieser Superfamilie zugeschrieben, und ungeeignete Regulation ihrer Aktivität wurde in Verbindung gebracht mit einer Reihe von metabolischen Funktionsstörungen, einschließlich Arthritis, muskuläre Distrophie, Entzündung, Glomerulonephritis und Tumorbefall. Pathogenes Katepsin, wie Enzyme, schließen die bakteriellen Gingipainen, die Malaria Falcipaine I, II, III und Folgende und Cystein Proteasen aus Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzei und brucei, Crithidia fusiculata, Schistosoma spp. ein.
  • Die ungeeignete Regulation von Katepsin K wurde in Verbindung gebracht mit einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich Osteoporose, Zahnfleisch-Krankheiten, wie Zahnfleischentzündung und Periodontitis, Krankheit Pagets, Hypercalcaemia eines bösartigen Tumors und metabolische Knochen-Krankheit. In anbetracht seiner erhöhten Konzentration in Chondroclasten aus osteoarthritischem Synovium wurde Katepsin K in Verbindung gebracht mit Krankheiten, charakterisiert durch überhöhter Knorpel oder Matrix Degradation, wie Osteoarthritis und rheumatischer Arthritis. Metastasenbildende neoplastische Zellen exprimieren typischerweise hohe Konzentrationen an proteolytischen Enzymen, die die umgebende Matrix abbauen, und die Inhibition von Katepsin K könnte deshalb in der Behandlung von Neoplasien helfen.
  • WO 98/50533 beschreibt die Verwendung von Verbindungen gemäß folgender Formel (I).
  • Figure 00010001
  • Es wird vorgeschlagen, dass die Verbindungen dieser Formel nützlich als Inhibitoren für Proteasen, insbesondere der Papain Superfamilie, sind; besonders die der Katepsin Familie; und insbesondere Katepsin K. Die ketontragende Ringstruktur in diesen Verbindungen hat eine Tendenz zu spontaner Razemisierung, was ihre klinische Verwendung limitiert. Andere SKB Anwendungen beschreiben Keton Katepsin K Inhibitoren, einschließlich WO 98 46582, WO 9964399, WO 0029408, WO 0038687 und WO 0049011. Jedoch offenbart keine dieser Anwendungen α-Ring Substituenten neben der Bindung an die peptidomimetische Kette.
  • Shenai et al, J Biol. Chem. 275 37 29000–29010 beschreibt die Isolierung von großen Cystein Proteasen, bezeichnet mit Falcipain 2, von Trophozoiten aus Plasmodium falciparium. Das Enzym scheint unter anderem, Erythrozyten Hämoglobin in säuerlichen Nahrungsvakuolen zu hydrolysieren. Die Veröffentlichung beschreibt außerdem die Isolierung des entsprechenden Gens unter Verwendung eines N-terminalen Tags, der autokatalytisch während der Faltung entfernt wird.
  • SmithKline Beecham's WO 99/53039 beschreibt die Inhibitionsaktivität von Cystein Proteasen für einen großen Bereich von Peptidomimetika in eine Trophozoit Zubereitung von Plasmodium falciparium. Keine Anleitung ist bereitgestellt worden, welche Cystein Protease inhibiert ist. Obwohl die meisten Peptidomimetika lineare Strukturen sind, gehört eine Verbindung (R,S)-3-[N-(3-benzyloxybenzoyl)-L-leucinylamino]tetrahydrofuran-4-on zu den Furanonen der oben dargestellten Formel I. Wie von solchen Strukturen erwartet, ist der ketontragende Ring razemisch.
  • Unsere ebenfalls anhängige PCT Anmeldung WO 00/69855 veröffentlicht nach dem derzeitigen Prioritätsdatum, offenbart Katepsin S Inhibitoren, die eine monozyclische P3 füllende Gruppe umfassen.
  • Ein erster Aspekt der Erfindung bietet Verbindungen der Formel (IVa) an, wie im beigefügten Anspruch 1 bezeichnet.
  • Verbindungen dieser Erfindung haben einen Nutzen in der Behandlung oder Prophylaxe von verschiedenen Funktionsstörungen, die durch die Anwesenheit oder der fehlerhaften Aktivität der Cystein Proteasen der Papain Superfamilie, wie Katepsine B, F, L, S und besonders Katepsin K oder Falcipain charakterisiert sind.
  • 'C1-7-Alkyl', wie hier angewandt, soll gerade und verzweigt kettige aliphatische Kohlenstoffketten einschließen, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl, Heptyl und jedes einfache Isomer davon. Zusätzlich kann jedes C1-7-Alkyl gegebenenfalls durch ein oder zwei Halogene und/oder ein Heteroatom S, O, NH ersetzt werden. Wenn das Heteroatom am Kettenende lokalisiert ist, dann wird es geeignet ausgetauscht durch ein oder zwei Wasserstoffatomen, so zum Beispiel durch Hydroxymethyl. Schwefel Heteroatome können zudem zu Sulphonen oxidiert werden.
  • 'C1-3-Alkyl', wie hierin angewandt, schließt Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Cyclopropyl ein, jedes von denen kann gegebenenfalls ersetzt werden, wie in dem Paragraphen darüber beschrieben wurde.
  • 'Amin' schließt NH2, NHC1-3-Alkyl oder N(C1-3-Alkyl)2 ein.
  • 'Halogen', wie hierin angewandt, soll F, Cl, Br, I einschließen, besonders Chlor und vorzugsweise Fluor.
  • 'C3-6-Cycloalkyl' (oder C3-7-Cycloalkyl), wie hierin angewandt, soll jede Variation von 'C1-7-Alkyl' einschließen, welche zusätzlich einen C3-6 (oder C3-7) carbozyklischen Ring, wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl enthält. Alternativ kann das C3-6 oder C3-7 Cyclopropyl an das benachbarte Kohlenstoff ohne ein dazwischenliegendes C1-C7 Alkyl spiro gebunden sein.
  • 'Ar-C1-7-Alkyl', wie hierin angewandt, soll ein Phenyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazinolyl, Isothiazinolyl, Thiazolyl, Oxadiazolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,2,4-Triazolyl, Furanyl oder Thienyl aromatischen Ring (Ar), angehängt durch ein 'C1-7-Alkyl' (oben definiert) an das Dihydro-(3H)-Furanon Ringsystem oder in dem Fall von R2, R3 oder R4 direkt an das Molekülrückgrat gebunden, einschließen. Gegebenenfalls kann der aromatische Ring Ar mit Halogen, C1-3-Alkyl, OH, OC1-3-Alkyl, SH, SC1-3-Alkyl, Amin und ähnlichem substituiert werden.
  • Der zyklische Substituent a) auf R' kann gesättigt, ungesättigt oder aromatisch sein und hat 0 bis 4 Heteroatome, einschließlich monozyklische Ringe, wie Phenyl, Cycloalkenyl, wie Cyclohexenyl oder Cyclopentenyl, Furyl, Thienyl, Pyranyl, Pyrrolyl, Pyrrolinyl, Pyrrolidinyl, Pyrazolyl, Pyrazolinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolyl, Imidazolinyl, Imidazolidinyl, Pyridyl, Piperidinyl, Pyrazinyl, Piperazinyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Oxazolyl, Oxazolidinyl, Isoxazolyl, Isoxazolidinyl, Morpholinyl, Thiazolyl, Thiazolidinyl, Isothiazolyl, Isothiazolidinyl, und ähnliches oder bizyklische Ringe, wie Napthyl und besonders jedes oben benannte, das an einen Phenylring, wie Indolyl, Quinolinyl, Isoquinolinyl, Benzimidazolyl, Benzothiazolyl, Benzoxazolyl, Benzothienyl etc. fusioniert ist. Der Kohlenstoff oder heterozyklische Ring Substituent kann durch einen Kohlenstoff oder durch ein Heteroatom, typischerweise ein Stickstoffatom, wie N-Piperidyl, N-morpholinyl etc., gebunden sein. Der Ring Substituent a) kann selbst substituiert werden mit Substituenten, wie für Ar oben gezeigt. Der Ring Substituent a) schließt Cycloalkyl, wie in Untergruppe b) definiert, aus.
  • Die optionale Alkyl, Alkylether, Alkylthioether, Alkylamin, Alkylamid, Alkylsulphonamid, Alkylsulphon, Alkylharnstoff, Alkyketon oder Alkylester Bindung zwischen R' und Ring Substituent a) kann bis zu 6 Kohlenstoffatomen umfassen, typischerweise bis zu vier Kohlenstoffatomen, zum Beispiel 1 oder 2. Wenn vorhanden, kann der Ether, Thioether, Amin, Amid, Sulphonamid, Sulphon, Harnstoff, Keton oder Ester Bestandteil neben dem R' Ring lokalisiert sein (zum Beispiel ein Morpholinoethoxy Substituent), neben dem Ring Substituent (zum Beispiel ein Phenylsulphonethyl Substituent) oder zwischen zwei Alkylgruppen (zum Beispiel ein Benzoyloxymethyl Substituent).
  • 'C1-3-Alkyl-CONR''', Riv, wie hierin angewandt, soll eine gerade oder verzweigte Kohlenstoffkette einschließen, substituiert mit 1°, 2° oder 3° Carboxamid, worin R''', Riv H und Me einschließt.
  • 'C1-3-Alkyl-SO2-Rix, wie hierin angewandt, soll eine gerade oder verzweigte Kohlenstoffkette einschließen, substituiert mit einem Sulphon, worin Rix 'C1-7-Alkyl', 'Ar-C1-7-Alkyl', 'C3-6-Cycloalkyl' einschließt.
  • 'C1-3-Alkyl-C(O)-NHRix, wie hierin angewandt, soll eine gerade oder verzweigte Kohlenstoffkette einschließen, substituiert mit einem sekundären Carboxamid, worin Rix 'C1-7-Alkyl', 'Ar-C1-7-Alkyl', 'C3-6-Cycloalkyl' einschließt.
  • Bevorzugte R' Gruppen schließen bizyklische Ringe, wie Naphtyl, Quinoloyl, Benzofuranyl, Benzothienyl, Indolyl und Indolinyl ein, besonders wo die Bindung an der Position 2 des R' Ringes ist.
  • Zusätzliche bizyklische Gruppen schließen Naphthalenyl ein, besonders Naphthylen-2-yl; Benzo[1,3]dioxolyl, besonders Benzo[1,3]dioxol-5-yl, Benzofuranyl, besonders Benzofuran-2-yl, und besonders C1-6 Alkoxy substituiertes Benzofuranyl, ganz besonders 5-(2-Piperazin-4-carbonsäure-tert-butyl-ester-etboxy)-benzofuran-2-yl, 5-(2-Morpholino-4-yl-ethoxy)-benzofuran-2-yl, 5-(2-Piperazin-1-yl-ethoxy)-benzofuran-2-yl, 5-(2-Cyclohexyl-ethoxy)-benzofuran-2-yl; 7-Methoxy-benzofuran-2-yl, 5-Methoxy-benzofuran-2-yl, 5,6-Dimethoxy-benzofuran-2-yl, besonders Halogen substituiertes Benzofuranyl, ganz besonders 5-Fluor-benzofuran-2-yl, 5,6-Difluor-benzofuran-2-yl, besonders C1-6 Alkyl substituiertes Benzofuranyl, ganz besonders 3-Methyl-benzofuran-2-yl; Benzo[b]thiophenyl, besonders benzo[b]thiophen-2-yl; besonders C1-6 Alkoxy substituiertes Benzo[b]thiopheny, ganz besonders 5,6-Dimethoxy-benzo[b]thiophen-2-yl-quinolinyl, besonders Quinolin-2-yl, Quinolin-3-yl, Quinolin-4-yl, Quinolin-6-yl und Quinolin-S-yl; Quinoxalinyl, besonders Quinoxalin-2-yl; 1,8 Naphthyridinyl, besonders 1,8 Naphthyridin-2-yl; Indolyl, besonders Indol-2-yl, besonders Indol-6-yl, Indol-5-yl, besonders C1-6Alkyl substituiertes Indolyl, ganz besonders N-methylindol-2-yl; Furo[3,2-b]pyridinyl, besonders Furo[3,2-b]pyridin-2-yl, und C1-6Alkyl substituiertes Furo[3,2-b]pyridinyl, besonders 3-Methyl-furo[3,2-b]pyridin-2-yl; Thieno[3,2-b]thiophen, besonders Thieno[3,2-b]thiophen-2-yl, ganz besonders C1-6 Alkyl substituiertes Thieno[3,2-b]thiophen-2-yl, ganz besonders 5-Tert-butyl-3-methylthieno[3,2-b]thiophen-2-yl.
  • Monozyklische R' Gruppen schließen substituiertes Pyridyl, substituiertes Pyrimidyl, substituiertes Phenyl, besonders Phenyl substituiert mit einer zyklischen Gruppe, wie Pyrrolidin-1-yl, Piperidin-1-yl, Morpholin-4-yl, 4-Methylpiperazin-1-yl, 2-Morpholin-4-yl-ethylamino und Piperazin-1-yl, ein. Ein Phenyl R' ist in geeigneter Weise an der Position 3 oder 4 mit einer zyklischen Gruppe substituiert worden.
  • Wenn ein chirales Zentrum vorhanden ist, sollten alle isomerischen Formen abgedeckt sein. Beide (R) und (S) Stereochemien an der Position, die der Furan 5-Position entspricht (d. h. R5 grenzt an die Bindung an die peptidomimetische Kette), sind durch die Erfindung umfaßt, wobei (R) in manchen Fällen geeignet ist, zum Beispiel in Katepsin K oder Falcipain Inhibitoren, insbesondere in Verbindung mit R Stereochemie an der Pyranon 4 Bindung. Alternativ haben R5 und die Furanon/Pyranon C4-Bindung beide in geeigneter Weise die S Stereochemie.
  • Die Verbindungen der Erfindung sind Cystein Proteasen Inhibitoren, vor allem gegen Katepsin oder Katepsin-ähnliche Proteasen der Papain Superfamilie. Idealerweise zeigt die Verbindung selektive Inhibition gegen eine einzelne Protease in der komplexen Mischung von proteolytischen Enzymen, welche die physiologische Umwelt charakterisieren, zum Beispiel eine größere als 10-fache Selektivität, vorzugsweise größer als 100-fach. Die am meisten bevorzugte inhibitorische Spezifität wird über andere Mitglieder derselben Enzymklasse oder Familie ausgeübt, wie die Katepsin Familie, die einen hohen Grad an Homologie haben, so kann die inkorrekte Regulation der proteolytischen Aktivität zu ungewollten pathologischen Zuständen, wie Bluthochdruck, Blutgerinnung oder Schlimmeres führen. Dies ist besonders bestrebenswert für Funktionsstörungen, wie Autoimmunfunktionsstörungen, wo die Verabreichung des Wirkstoffs voraussichtlich langwierig ist.
  • Allerdings können die Komponenten gleichwohl nützlich sein, wenn sie einen Grad an Vermischtheit in Beziehung auf die Inhibition physiologischer Proteasen aufweisen. Zum Beispiel sind die physiologischen Funktionen vieler Katepsine redundant, so kann die Inhibition einer einzelnen Cystein Protease durch die Anwesenheit oder Hochregulation anderer nicht-inhibierter Proteasen oder alternativer metabolischer Wege kompensiert werden. Alternativ können Kurzzeitbehandlungen nur in vorübergehende Toxizität oder anderen Nebeneffekten resultieren.
  • Die Kreuz-Spezifität von Cystein Proteasen für einen gegebenen putativen Inhibitor (d. h. die Selektivität des Inhibitors) ist leicht festgestellt worden, indem konventionelles Enzym und Zellkulturuntersuchungen parallel mit dem entsprechenden Enzymen durchgeführt wurden.
  • Die Erfindung bietet zudem die Verwendung der Verbindungen der Formel (IVa) an, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten oder abgeschwächten oder gemilderten Zuständen durch die Inhibition von Katepsin K.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bietet die Verwendung der Verbindungen der Formel (IVa) zur Herstellung eines Medikaments an, für die Behandlung oder Prophylaxe einer parasitischen Infektion, wie einer Protozoen- oder bakterielle Infektion.
  • In geeigneter Weise ist der Protozoen- oder bakterielle Parasit eine Plasmodium, Leishmania, Schistosoma, Giardia, Entamoeba, Trypansoma, Crithidia, Pneumocystis oder Porphyromonas Spezie.
  • Geeigneter Weise umfasst die Behandlung oder Prophylaxe von Plasmodium falciparium die Inhibition eines Falcipain II Enzyms.
  • Bevorzugte R3 Gruppen für die Parasiten Behandlung und Prophylaxe schließen 2-Methylpropen-1-yl; oder Isobutyl oder Benzyl, besonders mit der Stereochemie korrespondierend zu der Seitenkette von L-Leucin und L-Phenylalanin, ein.
  • Bevorzugte R3 Gruppen für die Katepsin K Inhibition schließen die Seitenkette korrespondierend zu L-Leucin ein.
  • Der R5 Substituent überträgt viele vorteilhafte Qualitäten auf Moleküle allgemeiner Formel (IVa), einschließlich der Optimierung in Wirksamkeit, und bietet die Möglichkeit, Inhibitor Moleküle mit einer grundlegenden Funktionalität anzuhängen, um die Löslichkeit und pharmakokinetische Wirksamkeit zu verbessern. Es sollte daran erinnert werden, dass viele Katepsine, wie Katepsin K und Falcipain, in säuerlichen Vakuolen oder physiologischen Mikroumgebungen, welche grundlegende Funktionalität an dieser Position bevorzugen könnten, aktiv sind. Zusätzlich tendieren Moleküle der Formel (IVa), wo R5 ein Alkyl oder ein anderer Substituent und nicht einfach Wasserstoff ist, dazu, gute chirale Stabilität an dem Furanon- (oder korrespondierend für das Pyranon) α-Kohlenstoff zu zeigen (hierin angegebene Ringposition 4 oder C4, außer der Kontext setzt etwas anderes voraus). Mit chiral stabil ist gemeint, dass die Verbindungen der Erfindung überwiegend als ein Stereoisomer vorliegen, eher als eine gleiche Mischung von Stereoisomeren, die sich in der Stereochemie an der Position C4 unterscheiden. Vorzugsweise sind die Verbindungen der Erfindung mindestens zu 90% diastereomerisch rein.
  • Man beachte besonders die Anwesenheit des Substituenten R5 in der Formel (IVa) im Vergleich zu der Abwesenheit aller Substituenten an derselben Position in der Formel (I) gemäß WO 98/50533, WO 98/46582, WO 99/64399, WO 00/29408, WO 00/38687 und WO 00/49011.
  • Interessante Verbindungen der Formel (IVa), besonders in dem Kontext der Katepsin K Inhibition, schließen ein:
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl-)-butyl]-2-phenethyl-benzamid
    Benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-pentyl]-amid
    Benzofuran-2-carbonsäure-[1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-cyclohexyl]-amid
    Benzofuran-2-carbonsäure-[1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-cyclopentyl]-amid
    Naphthalen-2-carbonsäure-[1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-cyclohexyl-amid
    Benzofuran-2-carbonsäure-[2-cyclopropyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-ethyl]-amid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-pyrrol-1-yl-benzamid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-piperidin-1-yl-benzamid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-morpholin-4-yl-benzamid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-piperazin-1-yl-benzamid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-(4-methyl-piperazin-1-yl)-benzamid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-pyrrolidin-1-yl-benzamid
    4-(3,3-Dimethyl-piperazin-1-yl)-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    4-(2,2-Dimethyl-piperazin-1-yl)-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    4-(4-Allyl-piperazin-1-yl)-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    4-(4-Cyclopropylmethyl-piperazin-1-yl)-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    1,2,3,4-Tetrahydro-quinolin-6-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    Benzothiazol-5-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    4-Azepan-1-yl-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    4-[1,4]Diazepan-1-yl-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    4-(2-Methylamino-ethylamino)-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    Naphthalen-1-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    Benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    Benzo[b]thiophen-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    5-Methoxy-benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    5-Methoxy-benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-but-3S-enyl]-amid
    4-Acetylamino-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-morpholin-4-ylmethyl-benzamid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-piperidin-1-ylmethyl-benzamid
    Piperidin-1-carbonsäure-{4-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butylcarbamoyl]-phenyl}-amid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-N'-phenyl-terephthalamid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-N'-phenyl-terephthalamid
    N-Ethyl-N'-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-terephthalamid
    N-Ethyl-N'-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-terephthalamid
    4-Hydroxy-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-3-morpholin-4-ylmethyl-benzamid
    4-Hydroxy-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-3-morpholin-4-ylmethyl-benzamid
    Biphenyl-4-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    4-tert-Butyl-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    4-tert-Butyl-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-benzamid
    4-Guanidino-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    4-Guanidino-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-benzamid
    5-(2-Morpholin-4-yl-ethoxy)-benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    5-(2-Morpholin-4-yl-ethoxy)-benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-amid
    Naphthalen-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    4-Benzolsulfonylamino-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    3,4,5,6-Tetrahydro-2H-[1,4']bipyridinyl-4-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    4-(1-Methyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    4-(Benzyl-methyl-amino)-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-phenylamino-benzamid
    4-Benzylamino-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    1-Methyl-1,2,3,4-tetrahydro-quinolin-6-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    und die korrespondierenden R5 Hydroxymethyl Verbindungen; und pharmazeutisch verträglichen Salze davon
  • Die Verbindungen der Erfindung können Salze formen, was einen weiteren Aspekt der Erfindung darstellt. Geeignete, pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen der Formel (IVa) schließen Salze von organischen Säuren, besonders Carbonsäuren, ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Acetat, Trifluoracetat, Laktat, Glukonat, Citrat, Tartrat, Maleat, Malat, Pantothenat, Isethionat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Butyrat, Diglukonat, Cyclopentanat, Glukoheptanat, Glycerophosphat, Oxalat, Heptanoat, Hexanoat, Fumarat, Nikotinat, Palmoat, Pektinat, 3-Phenylpropionat, Pikrat, Pivalat, Proprionat, Tartrat, Laktobionat, Pivolat, Camphorat, Undecanoat und Succinat, organische Sulphonsäuren, wie Methansulphonat, Ethansulphonat, 2-Hydroxyethansulphonat, Camphorsulphonat, 2-Naphtalensulphonat, Benzolsulphonat, p-Chlorbenzolsulphonat und p-Toluolsulphonat; und anorganische Säuren, wie Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, Sulphat, Bisulphat, Hemisulphat, Thiocyanat, Persulphat, Phosphor- und Sulphonsäuren. Die Verbindungen der Formel (IVa) können in einigen Fällen als das Hydrat isoliert sein.
  • Es wird geschätzt werden, dass sich die Erfindung auf Pro-Pharmakons wie Solvate, Komplexe und andere Formen, die eine Verbindung der Formel (IVa) in vivo freisetzen, erstreckt.
  • Obwohl es möglich ist, das aktive Mittel alleine zu verabreichern, liegt es bevorzugt als Teil einer pharmazeutischen Formulierung vor. So eine Formulierung wird das oben definierte aktive Mittel zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Trägern/Excipienten und gegebenenfalls andere therapeutische Bestandteile umfassen. Der (die) Träger müssen in der Art verträglich sein, dass sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und nicht schädlich für den Empfänger sind.
  • Die Formulierungen schließen solche geeignete für rektale, nasale, topische (einschließlich wangenwärts gerichtete und sublinguale), vaginale oder parenterale (einschließlich subkutane, intramuskulare, intravenöse und intradermale) Verabreichung ein, aber vorzugsweise ist die Formulierung eine oral zu verabreichende Formulierung. Die Formulierungen können in geeigneter Weise in einer einheitlichen Dosis vorgelegt werden, zum Beispiel Tabletten und anhaltende Freisetzungskapseln, und können durch jedes Verfahren, das im Stand der Technik für Pharmazie bekannt ist, zubereitet werden.
  • Solche Verfahren schließen den Schritt des in Verbindungbringens des oben definierten aktiven Mittels mit dem Träger ein. Normalerweise werden die Formulierungen durch einheitliches und ganz genaues in Verbindungbringen des aktiven Mittels mit den flüssigen Trägern oder fein getrennten festen Trägern oder mit beiden zubereitet, und dann wird das Produkt, falls notwenig, geformt. Die Erfindung erstreckt sich auf Verfahren für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei die Verfahren das in Verbindungbringen oder Assoziieren einer Verbindung der Formel (IVa), oder ihrem pharmazeutisch verträglichen Salz mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikel umfasst. Wenn die Herstellung der pharmazeutischen Formulierungen das ganz genaue Mischen pharmazeutischer Excipienten und die aktiven Bestandteile in Salzform umfasst, dann wird oft die Verwendung von Excipienten bevorzugt, die natürlicherweise nicht basisch sind, d. h. entweder sauer oder neutral.
  • Formulierungen für die orale Verabreichung könnten in der vorliegenden Erfindung als separate Einheiten vorgelegt werden, so wie Kapseln, Kapseln aus Stärkemasse oder Tabletten, wobei jede eine vorgegebene Menge des aktiven Mittels enthält; als ein Pulver oder Körnchen; als eine Lösung oder eine Suspension des aktiven Mittels in einer wässrigen Flüssigkeit oder einer nicht-wässrigen Flüssigkeit; oder als eine Öl-in-Wasser Flüssigemulsion oder eine Wasser-in-Öl Flüssigemulsion und als eine große Pille etc..
  • Bezüglich der Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung (z. B. Tabletten und Kapseln), schließt der Ausdruck „geeignete Träger" Vehikel, wie gewöhnliche Excipienten, z. B. Bindemittel, zum Beispiel Sirup, Akazie, Gelatine, Sorbitol, Tragant, Polyvinylpyrrolidon (Povidon), Methylcellulose, Ethylcellulose, Natrium Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Saccharose und Stärke, ein; Füllstoffe und Träger, zum Beispiel Maisstärke, Gelatine, Laktose, Saccharose, mikrokristalline Cellulose, Kaolin, Mannitol, Dicalciumphosphat, Natriumchlorid und Alginsäure; und Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Natriumstearat und andere metallische Stearate, Glycerinstearat Stearinsäure, Silikonflüssigkeit, Talkwachse, Öle und kolloidales Silika. Geschmacksstoffe, wie Pfefferminze, Öl der Moosbeere, Kirscharoma oder ähnliches können auch verwendet werden. Es kann wünschenswert sein, ein färbendes Mittel zuzufügen, um die Dosierungsform leicht identifizierbar zu machen. Tabletten können auch mittels Verfahren aus dem Stand der Technik umhüllt werden.
  • Eine Tablette kann durch Kompression oder Formpressen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen, gemacht werden. Komprimierte Tabletten können in einer geeigneten Maschine durch Kompression des aktiven Mittels in einer freifließenden Form, wie Pulver, oder Körnchen, gegebenenfalls gemischt mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inerten Verdünnungsmittel, Konservierungsstoff, oberflächenaktiven oder Dispersionsmittel zubereitet werden. Geformte Tabletten können durch die Formung eines Gemisches einer gepulverten Verbindung, die mit einem inerten, flüssigen Verdünnungsmittel benetzt ist, in einer geeigneten Maschine gemacht werden. Die Tabletten können gegebenenfalls umhüllt oder angeritzt werden und können so gestaltet werden, dass eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des aktiven Mittels gewährleistet wird.
  • Andere Formulierungen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, schließen Lutschtabletten ein, die das aktive Mittel in einer Lauge mit Geschmack, gewöhnlich Saccharose und Akazie oder Tragant, umfassen; Pastillen, die das aktive Mittel in einer inerten Lauge, wie Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Akazie, umfassen; und Mundwasser, die das aktive Mittel in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen.
  • Die geeignete Dosis für die Verbindungen oder Formulierungen der Erfindung wird von der Indikation und dem Patienten abhängen und ist durch konventionelle Tierversuche, leicht zu bestimmen. Dosen, die intrazelluläre (für die Inhibition physiologischer Proteasen der Papain Superfamilie) Konzentrationen der Anforderung 0,01–100 μM, vorzugsweise 0,01–10 μM, wie 0,1–25 μM, zur Verfügung stellen, sind typischerweise erstrebenswert und erreichbar. Ex vivo oder topische Verabreichung gegen Parasiten wird typischerweise höhere Konzentrationen benötigen.
  • Der Begriff „N-schützende Gruppe" oder „N-geschützt" und ähnliches, wie hierin verwendet, nimmt Bezug auf die Gruppen, die dazu gedacht sind den N-Terminus einer Aminosäure oder eines Peptids zu schützen, oder eine Aminogruppe gegen unerwünschte Reaktionen während synthetischer Prozeduren zu schützen. Üblich verwendete N-schützende Gruppen sind offenbart in Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" (John Wiley & Sons, New York, 1981), welches hiermit als Referenz eingebunden ist. N-schützende Gruppen schließen Acyl Gruppen ein, wie Formyl, Acetyl, Propionyl, Pivaloyl, t-Butylacetyl, 2-Chloracetyl, 2-Bromacetyl, Trifluoracetyl, Trichloracetyl, Phthalyl, o-Nitrophenoxyacetyl, α-Chlorbutyryl, Benzoyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brombenzoyl, 4-Nitrobenzoyl, und ähnliches; Sulfonyl Gruppen, wie Benzolsulfonyl, p-Toluolsulfonyl, und ähnliches, Carbamat formende Gruppen, wie Benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, 3,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,4,5-Trimethoxybenzyloxycarbonyl, 1-(p-Biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, Benzhydryloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, Phenoxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluorenyl-9-Methoxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Phenylthiocarbonyl, und ähnliches; Alkyl Gruppen, wie Benzyl, Triphenylmethyl, Benzyloxymethyl und ähnliches; und Silyl Gruppen, wie Trimethylsilyl und ähnliches. Bevorzugte N-schützende Gruppen schließen Formyl, Acetyl, Allyl, Fmoc, Benzoyl, Pivaloyl, t-Butylacetyl, Phenylsulfonyl, Benzyl, t-Butoxycarbonyl (Boc) und Benzyloxycarbonyl (Cbz) ein.
  • Hydroxy und/oder Carboxy schützende Gruppen sind auch umfangreich in Greene ebenda besprochen und schließen Ether ein, wie Methyl, substituiertes Methylether, wie Methoxymethyl, Methylthiomethyl, Benzyloxymethyl, t-Butoxymethyl, 2-Methoxyethoxymethyl und ähnliches, Silylether, wie Trimethylsilyl (TMS), t-Butyldimethylsilyl (TBDMS) Tribenzylsilyl, Triphenylsilyl, t-Butyldiphenylsilyl (TBDPS), Triisopropylsilyl und ähnliches, substituiertes Ethylether, wie 1-Ethoxymethyl, 1-Methyl-1-methoxyethyl, t-Butyl, Allyl, Benzyl, p-Methoxybenzyl, Dipehenylmethyl, Triphenylmethyl und ähnliches, Aralkyl Gruppen, wie Trityl, und Pixyl (9-Hydroxy-9-phenylxanthen Derivate, besonders das Chlorid). Esterhydroxy schützende Gruppen schließen Ester ein, wie Format, Benzylformat, Chloracetat, Methoxyacetat, Phenoxyacetat, Pivaloat, Adamantoat, Mesitoat, Benzoat und ähnliches. Carbonathydroxy schützende Gruppen schließen Methylvinyl, Allyl, Cinnamyl, Benzyl und ähnliches ein.
  • Verbindungen der Erfindung werden durch eine Kombination aus chemischen Reaktionen, durchgeführt entweder in Lösung oder auf einer festen Phase, synthetisiert. Das Syntheseprotokoll wurde in den Schemata 1–8 unserer ebenfalls anhängigen PCT/GB00/01894 beschrieben, aber die R' bedeckende Gruppe einzusetzen, ist angemessen für die Verbindungen der Erfindung, die geeignet sind.
  • Schema 1. Zubereitung des Dihydro-2(3H)-5-Alkyl Furanon Ringsystems Schema 1
    Figure 00170001
    • a) Fmoc-Cl, Na2CO3 or Boc2O; b) iBuOCOCl, NMM, THF; c) CH2N2 in Et2O; d) AcOH; e) LiCl in 80% AcOH
  • Figure 00180001
    Schema 2. Zubereitung der chiralen β-Alkylserin Aminosäuren, beispielhaft erläutert durch (2S,3S)-β-Ethylserin (15)
  • Figure 00190001
    Schema 3. Der Zuckerweg für die Zubereitung der chiralen -Alkylserin Aminosäuren, beispielhaft erläutert durch (2S,3S)-β-Ethylserin (15)
  • Figure 00200001
    Schema 4. Neue P2 Hybride durch die CuCN katalysierte Kreuzkopplung eines Zn aktivierten – Iodalanins mit Allylbromiden (mit Erlaubnis von Dexter & Jackson ebenda)
  • Figure 00210001
    Schema 5. Festphasensynthese der Dihydro-2(3H)-5-alkyl Furanon Inhibitoren von Kathepsin (auch geeignet für die korrespondierenden Pyranonen)
  • Figure 00220001
    Schema 6. Zubereitung der Lösungsphase der 3(2H)-Furanon Inhibitoren
  • Zusätzliche Wege für Bausteine schließen ein: Schema 7
    Figure 00230001
    • a) iBuOCOCl, NMM; b) Diazomethan in Et2O; c) LiCl (10 Äq) in 80% Essigsäure; d) 4 M HCl in Dioxan; e) Boc-Leu-Opfp, HOBt, NMM, DMF; f) 4 M HCl in Dioxan; g) 2-Naphthoesäure, HBTU, HOBt, NMM, DMF.
  • Die Verbindungen der allgemeinen Formel (IVa) werden durch die Verfahren, die in Schema 7 gezeigt sind, zubereitet. Aktivierung der bekannten Boc-Aminosäure 1-Schema-7 durch Isobutylchlorformat und 4-Methylmorpholin stellt 2-Schema-7 zur Verfügung. Nachfolgende Behandlung von 2-Schema-7 mit Diazomethan stellt das Diazoketon 3-Schema-7 zur Verfügung. Zyklisierung von Diazoketon 3-Schema-7 kann durch Lithiumchlorid/wässrige Essigsäure beeinflusst werden, um das Dihydro-3(2H)-Furanon 4-Schema-7 zu liefern. Die tert-Butoxycarbonyl Gruppe kann von 4-Schema-7 durch die Behandlung mit Säure entfernt werden und stellt das Aminsalz 5-Schema-7 zur Verfügung. Das Aminsalz 5-Schema-7 kann mit einer Carbonsäure durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gekoppelt werden, wie das Koppeln mit einem Pentafluorphenol Derivat in der Gegenwart von HOBT und NMM, um das Amid 6-Schema-7 zur Verfügung zu stellen. Die tert-Butoxycarbonyl Gruppe kann von 6-Schema-7 durch die Behandlung mit einer Säure entfernt werden, wie Hydrogenchlorid in Dioxan, um das Aminsalz 7-Schema-7 zur Verfügung zu stellen. Das Aminsalz 7-Schema-7 kann mit einer Carbonsäure durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gekoppelt werden, wie das Koppeln mit einer Säure in der Gegenwart von HBTU und HOBT, um das Amid 8-Schema-7 zur Verfügung zu stellen.
  • Zusätzliche Wege für 5-Methyl- und Ethyl-furanon als Bausteine gegen Inihibitoren oder als Intermediate, um den Zugang zu anderen R5 Funktionalitäten zu erhalten, sind wie in den Schemata 12 und 13 gezeigt. Schema 12
    Figure 00240001
    • a) p-TolCl, Pyridin; b) (CF3SO2)2O, Pyridin, DCM; c) NaN3, DMF; d) 75% HCOOH; e) Ac2O, Pyridin; f) TMSOTf, Et3SiH; g) K2CO3, MeOH; h) H2, 10% Pd/C, MeOH, Boc2O; i) TsCl, Pyridin; j) LiAlH4, Et2O
  • Eine alternative Synthese von Methyl-furanonen ist in Schema 12 gezeigt. 1,2-Isopropyliden-D-xylofuranosid 1-Schema-12 wird zuerst zu dem p-Toluoyl Ester 2-Schema-12 mit p-Toluoyl Chlorid und Pyridin umgesetzt. Der Sekundäralkohol 2-Schema-12 kann zu dem Triflat 3-Schema-12 umgesetzt werden. Das Triflat 3-Schema-12 kann durch Natriumazid umgesetzt werden, um das korrespondierende Azid 4-Schema-12 zur Verfügung zu stellen. Entschützung von 1,2-Isopropyliden von 4-Schema-12 und nachfolgende Acetylierung des Restes stellen das Diacetat 5-Schema-12 zur Verfügung. Reduktion des anomerischen Zentrums von 5-Schema-12 durch Trimethylsilyl-triflat und Triethylsilan stellt das Monoacetat 6-Schema-12 zur Verfügung.
  • Entfernung von zwei Estergruppen von 6-Schema-12 durch Kaliumcarbonat bringt Alkohol 7-Schema-12 hervor. Reduktion des Azids 7-Schema-12 in der Gegenwart von Boc Anhydrid bringt das Schlüsselintermediat Furanol 8-Schema-12 hervor. Furanol 8-Schema-12 kann in das Methyl-furanol 10-Schema-12 umgewandelt werden, indem der Primäralkohol funktionell von 8-Schema-12 in das Tosylat 9-Schema-12 umgewandelt wird, das wiederum durch Lithiumaluminium Hydrid reduziert werden kann, um das Methyl-furanol 10-Schema-12 zur Verfügung zu stellen. Wie hierin beschrieben wird, kann Furanol 10-Schema-12 verwendet werden, um Inhibitoren der Erfindung in Lösung oder auf einer festen Phase aufzubauen. Die Festphasenchemie würde typischerweise die Umsetzung des Boc Schutzes zur Fmoc Chemie voraussetzen. Der letzte Syntheseschritt beinhaltet die Oxidation der Furanolfunktion durch Verwendung eines Oxidationsmittels, wie das Dess-Martin-Periodinan, zu dem korrespondierenden Furanon. Alternativ kann die Oxidation vor oder nach den Modifikationen an dem N-Terminus durchgeführt werden. Es ist wichtig, dass Furanol 8-Schema-12 auch eine Möglichkeit für die Einführung diverser Funktion am C-5 zur Verfügung stellt, so kann das Hydroxmethylen für darauffolgende Umwandlungen verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Schema 13
    Figure 00250001
    • a) TsCl, Pyridin; b) Me2CuLi, Et2O, THF; c) (CF3SO2)2O, Pyridin, DCM; d) NaN3, DMF; e) TMSOTf, Et3SiH; f) H2, 10% Pd/C, MeOH; g) Boc2O
  • Eine alternative Synthese von Ethyl-furanonen ist in Schema 13 gezeigt. 1,2-Isopropyliden-L-xylofuranosid 1-Schema-13 wird als Startmaterial verwendet und wird als erstes zu Tosylat 2-Schema-13 umgesetzt. Das Tosylat 2-Schema-13 wird leicht umgesetzt, indem Cuprat Chemie verwendet wird, um das Ethyl-furanosid 3-Schema-13 zur Verfügung zu stellen. Der sekundäre Alkohol 3-Schema-13 kann in das Triflat 4-Schema-13 umgesetzt werden, indem Trifluormethansulfonsäure Anhydrid und Pyridin verwendet werden. Das Triflat 4-Schema-13 kann durch Natriumazid umgesetzt werden, um das korrespondierende Azid 5-Schema-13 zur Verfügung zu stellen. Reduktion des anomerischen Zentrums von 5-Schema-13 mit Trimethylsilyl-tiflat und Triethylsilan stellt Alkohol 6-Schema-13 zur Verfügung. Reduktion von Azid 6-Schema-13 mit Wasserstoff in der Gegenwart von 10% Palladium auf Kohlenstoff stellt Amin 7-Schema-13 zur Verfügung. Schutz des Amins 7-Schema-13 durch Boc Anhydrid stellt das Ethyl-furanol 8-Schema-13 zur Verfügung. Wie bereits vorhergehend beschrieben wurde, kann Furanol 8-Schema-13 verwendet werden, um potentielle Inhibitoren in Lösung oder auf Festphase aufzubauen. Festphasenchemie würde die Umsetzung des Boc Schutzes zur Fmoc Chemie voraussetzen. Der letzte Syntheseschritt beinhaltet die Oxidation der Furanolfunktion durch Verwendung eines Oxidationsmittels, wie das Dess-Martin-Periodinan, zu dem korrespondierenden Furanon. Alternativ kann die Oxidation vor oder nach den Modifikationen an dem N-Terminus durchgeführt werden.
  • Viele R3 Gruppen sind auf kommerziell erhältliche Aminosäureresten, wie L-Leucin, L-Norleucin, L-Phenylalanin etc., zurückzuführen. Andere verzweigte und ungesättigte Aminosäurebausteine sind in Medivir Großbritanniens PCT/GB01/02162 gezeigt, das die Priorität der britischen Patentanmeldung GB 00025386-4, die am 17. Mai 2000 eingereicht wurde, beansprucht, deren Inhalt hiermit auch offenbart ist.
  • Zugriff auf Sulphonyl tragende C1-C7 Alkyl oder ArC1-C7Alkyl R3 Gruppen, zum Beispiel ArylalkylC0-2sulphonylmethyl Funktionen können von der geeignet geschützten Aminosäure Cystein kommen. Mitsunobu Kopplung des Cysteinylthiols mit Aryl Alkoholen, wie Phenol, bringt die geschützte Aminosäure hervor, die die Phenylthiomethyl R3 Seitenkette enthält, die durch die Verwendung von m-Chlorperbenzolsäure leicht oxidiert wird, um die R3 Seitenkette Phenylsulphonylmethyl zur Verfügung zu stellen. Die Benzylsulphonylmethyl und Phenethylsulphonylmethyl R3 Seitenkette beinhaltenden Aminosäuren können durch nukleophile Substitution des Cysteinylthiols durch Benzylbromid bzw. Phenethylbromid zubereitet werden.
  • Oxidation der resultierenden Sulphide mit m-Chlorperbenzoesäure stellt die geeignet geschützten Aminosäuren mit der Benzylsulphonylmethyl und Phenethylsulphonylmethyl R3 Seitenkette zur Verfügung.
  • Detaillierte Beschreibung der Ausführungsformen Lösliche Phasenchemie Beispiel 1 Folgendes allgemeines Chemieschema 14:
    Figure 00270001
  • (a) Allgemeines Verfahren für die Synthese von N-Boc geschützten Diazoketonen, beispielhaft erläutert anhand von (2S,3S)-N-Boc-O-t-butyl-L-threonyldiazomethan (1)
  • (2S,3S)-N-Boc-O-t-butyl-L-threonin (1,2 g, 4,2 mmol) wurde in trockenem DCM (20 mL) gelöst und N-Methylmorpholin (1 mL, 2,2 Äq) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf –15°C gekühlt und in einer Argonatmosphäre gerührt. Isobutyl Chlorformat (0,56 mL, 4,3 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch für 10 min bei –15°C gerührt. Eine Lösung von Diazomethan in Diethylether (45 mL, ca. 40 mmol) wurde zugegeben, und der Reaktion wurde es erlaubt, sich länger als 1 Stunde auf Raumtemperatur aufzuwärmen, dann wurde Essigsäure tropfenweise zugegeben, bis das Sprudeln aufhört. Das Reaktionsgemisch wurde mit DCM verdünnt (100 mL) und nacheinander mit gesättigtem, wässrigem Natriumbicarbonat (2 × 75 mL), Wasser (75 mL) und Lauge (Kochsalzlösung) (75 mL) gewaschen und mit Natriumsulphat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um das rohe (2S,3S)-N-Boc-O-t-butyl-L-threonyldiazomethan (1,2 g, ~100%) als ein hellgelbes Öl zu erhalten. Die oben beschriebene Synthese wurde 9 mal wiederholt, und das gesamte Rohprodukt wurde vereinigt (12 g) und wurde für die nächste Stufe ohne Aufreinigung verwendet.
  • (b) Allgemeines Verfahren für die Synthese von Boc-3(2H)-Furanonen, beispielhaft erläutert anhand von Dihydro-(4S-amino-[N-Boc])-5S-methyl-3(2H)-furanon (2)
  • Eine Lösung von Lithiumchlorid (13,6 g, 320 mmol) in 80% wässriger Essigsäure (400 mL) wurde auf 5°C gekühlt und zu rohem (2S,3S)-N-Boc-O-t-butyl-L-threonyldiazomethan (1) (9,6 g) unter Rühren zugegeben. Das Öl wurde für 10 min gelöst, und das Rühren für eine weitere Stunde fortgesetzt, wobei es langsam auf Raumtemperatur aufgewärmt wurde, mit der Entwicklung von Gas. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in EtOAc (250 mL) gegeben und nacheinander mit Wasser (250 mL), gesättigtem wässrigen Natrium Bicarbonat (2 × 100 mL) und Lauge (75 mL) gewaschen, dann mit Natriumsulphat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rohextrakt durch flash Chromatographie über ein Silikagel (150 g) mit EtOAc/Heptan (1:2, v/v) eluiert. Zwei Fraktionen wurden vereinigt, und die schnellere eluierende Fraktion wurde im Vakuum auf ca. 50 mL Heptan reduziert und zur Kristallisierung zurück gelassen, um Dihydro-(4S-amino-[N-Boc])-5S-methyl-3(2H)-Furanon (2) als einen weißen Feststoff zu erhalten, ergab 4,05 g, 18,8 mmol, 58%. Elektrospray-MS m/z 216 (MH+), 160 (MH+-56), Elementenanalyse C10H17O4N (berechnet) %C 55,80, %H 7,96, %N 6,51, (gefunden) %C 55,82, %H 7,86, %N 6,44.
    δH (500 MHz; CDCl3); 1,41 (9H, s, C(CH 3)3), 1,49 (3H, d, J 6, 5S-CH 3), 3,72 (1H, bm, Furanon CHα), 3,90–4,02 (2H, 5S-H + 1 × Furanon COCH 2O), 4,22 (1H, d, J 17,4, 1 × Furanon COCH 2O), 4,85 (1H, bs, Furanon, NH).
    δC (125 MHz; CDCl3); 19,34 (5S-CH3), 28,45 C(CH3)3), 62,79 (Furanon CHα), 71,06 (Furanon COCH2O), 77,96 (5S-CHCH3), 80,88 C(CH3)3), 155,6 ((CH3)3CO-CO), 212,6 Furanon CO).
  • (c) Allgemeines Verfahren für eine N-terminale Verlängerung, beispielhaft erläutert anhand von Dihydro-(4S-amino-[N-Boc-L-tert-butylalanyl])-5S-methyl-3(2H)-Furanon (3)
  • Dihydro-(4S-amino-[N-Boc])-5S-methyl-3(2H)-Furanon (2) (1,0 g, 4,6 mmol) wurde mit einer Lösung aus 4,0 M HCl in Dioxan (25 mL) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit 2 × Toluol azeotropiert, um das Hydrochloridsalz als einen weißen Feststoff zu erhalten.
  • Boc-L-tert-butylalanin Pentafluorphenylester (2,0 g, 1,05 Äq) und 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (0,735 g, 1,05 Äq) wurden in DMF (20 mL) gelöst, und nach 5 min zu dem oben benannten Salz zugegeben. Die klare Lösung wurde dann mit N-methylmorpholin (0,51 g, 0,56 mL, 1,1 Äq) behandelt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden belassen. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und das Rohprodukt durch flash Chromatographie über ein Silikagel (50 g) aufgereinigt und mit EtOAc/Heptan (1:3, v/v) eluiert, dann mit EtOAc/Heptan (1:2, v/v). Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum reduziert, um Dihydro-(4S-amino-[N-Boc-L-tert-butylalanyl])-5S-methyl-3(2H)-Furanon (3) als einen weißen Feststoff zu erhalten, ergab 1,31 g, 3,82 mmol, 83%. Elektrospray-MS m/z 343 (MH+), 287 (MH+-56).
  • Diese Verfahrenstechnik ist leicht für das korrespondierende N-Boc-geschützte Pyranon oder (1,5-Anhydro-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3,4-dideoxy-4-ethyl-D-xylitol anzuwenden.
  • (d) Allgemeines Verfahren für die Addition einer Abdeckungsgruppe, beispielhaft erläutert anhand von Benzofuran-2-Carbonsäure[3,3-dimethyl-1S-(2S-methyl-4-oxo-tetrahydrofuran-3S-ylcarbamoyl)butyl]amid (4)
  • Dihydro-(4S-amino-(N-Boc-L-tert-butylalanyl])-5S-methyl-3(2H)-Furanon (3) (1,03 g, 3,0 mmol) wurde mit einer Lösung von 4,0 M HCl in Dioxan (25 mL) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde ungerichtet mit 2 × Toluol gesiedet, um das Hydrochloridsalz als einen weißen Feststoff zu erhalten.
  • Benzofuran-2-carboxypentafluorphenylester (1,05 Äq) und 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (1,05 Äq) werden in DMF (15 mL) gelöst, und nach 5 min zu dem oben benannten Salz zugegeben. Die klare Lösung wurde dann mit N-methylmorpholin (1,1 Äq) behandelt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden belassen. Die Lösungsmittel werden im Vakuum entfernt, und das Rohprodukt durch flash Chromatographie über ein Silikagel (50 g) aufgereinigt und mit EtOAc/Heptan (3:2, v/v) eluiert. Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum reduziert, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Beispiel 2. 4,4-Dimethyl-2S-(benzofuran-2-sulfonylamino)pentansäure(2S-methyl-4-oxo-tetrahydrofuran-3S-yl)amid (5)
  • (a) Allgemeines Verfahren für das Anhängen einer Sulphonyl Abdeckungsgruppe, beispielhaft erläutert anhand von 4,4-Dimethyl-2S-(benzofuran-2-sulfonylamino)pentansäure(2S-methyl-4-oxo-tetrahydrofuran-3S-yl)amid (5)
  • Dihydro-(4S-amino-(N-Boc-L-tert-butylalanyl])-5S-methyl-3(2H)-Furanon (3) (34 mg, 0,1 mmol) wurde mit einer Lösung von 4,0 M HCl in Dioxan (5 mL) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und der Rest wurde ungerichtet mit 2 × Toluol gesiedet, um das Hydrochloridsalz als einen weißen Feststoff zu erhalten.
  • Hydrochloridsalz wurde in trockenem DCM (2 mL) gelöst und Benzofuran-2-sulphonylchlorid zugegeben, gefolgt von Diisopropylethylamin (3 Äq) und katalytischem N,N-Dimethylaminopyridin (2 mg). Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit DCM (15 mL) verdünnt und nacheinander mit 0,1 N HCl (25 mL), Wasser (2 × 25 mL) und Lauge (25 mL) gewaschen, dann über Natriumsulphat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und das Rohprodukt durch flash Chromatographie über ein Silikagel (15 g) aufgereinigt und mit EtOAc/Heptan (1:1, v/v) eluiert. Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum reduziert, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Allgemeine Synthese von Chiralen β-Alkylserin Aminosäuren
  • Angepasst an Blaskovich, M. A., Evinder, G., Rose, N. G. W., Wilkinson, S., Luo, Y. und Lajoie, G. A. J. Org. Chem, 63, 3631–3646, 1998. (Nach Schema 2).
  • Beispiel 5. (2S,3S)-β-Hydroxynorvalin (15)
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-serin 3-methyl-3-(hydroxymethyl)oxetanester (8)
  • N-Cbz-L-serin (10 g, 41,8 mmol) wurde in DCM (450 mL) und DMF (14 mL) gelöst und tropfenweise über 2,5 Stunden zu einer rührenden Lösung von WSC zugegeben. HCl (12 g, 62,7 mmol), N'N-Dimethylaminopyridin (260 mg, 2,1 mmol) und 3-Methyl-3-oxetan Methanol (84 mL, 0,84 mmol) wurden auf 0°C herunter gekühlt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmt, und es wurde ihr erlaubt, über Nacht zu rühren. Das Gemisch wurde mit 0,1 M HCl (200 mL), Wasser (200 mL), 10% Na2CO3 (200 mL × 2) und Wasser (200 mL × 2) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, um ein hellgelbes Öl hervor zubringen. Aufreinigung durch eine Säulen-Chromatographie (4:1, EtOAc:Heptan) und anschließende Rekristallisierung (1:1, EtOAc:Heptan), ergab das Zielintermediat als weißen kristallinen Feststoff, 8,07 g, 60%; DC (4:1, EtOAc:Heptan), Rf = 0,28, Elektrospray-MS m/z 324,1 (MH+).
    δ (400 MHz; CDCl3) 1.28 (3H, s, CH 3), 3.04 (1H, t, J 6.2, CHNH), 3.90–3.91 (1H, br m, OH), 4.10–4.13 (2H, m, CH 2OH), 4.41–4.55 (6H, m, 3 × CH 2), 5.13 (2H, s, OCH 2), 5.82 (1H, d, J 7.7, NH), 7.35–7.36 (5H, m, C6 H 5).
    δC (100 MHz; CDCl3) 20.75 (CH3), 39.67 (CH2OH), 56.39 (CHNH), 63.37 (CH2), 67.19 (CH2), 68.94 (CH2), 79.50 (OCH2), 128.16 (C 6H5), 128.27 (C 6H5), 128.58 (C 6H5), 136.14 (C 6H5), 156.25 (CO2NH), 170.74 (CO2).
  • (b) 1-[N-Benzyloxycarbonyl-(1S)-1-amino-2-hydroxyethyl]-4-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]oxetan (9).
  • Verbindung (8) (10,23 g, 28,6 mmol) wurde in wasserfreiem DCM (150 mL) gelöst und auf 0°C unter N2 heruntergekühlt. Eine Lösung von Bortrifluorid-Etherat (0,10 mL, 0,77 mmol) in wasserfreiem DCM (10 mL) wurde zugegeben, und das Gemisch rührte für 30 Minuten bei 0°C, dann bei Raumtemperatur über Nacht. Triethylamin (1,2 mL, 8,30 mmol) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch für 30 Minuten gerührt, bevor es zu einem dicken, farblosen Öl ankonzentriert wurde. Aufreinigung durch Säulenchromatographie (4:1, EtOAc:Heptan) und anschließende Rekristallisierung (1:1, EtOAc:Heptan) ergab (9) als weißen kristallinen Feststoff, 8,06 g, 80%; DC (4:1, EtOAc:Heptan) Rf = 0,27, Elektrospray-MS m/z 324,1 (MH+).
    δ (400 MHz; CDCl3) 0.78 (3H, s, CH 3), 2.67 (1H, m, CHNH), 3.64–3.69 (1H, m, CH 2OH), 3.80–3.83 (1H, m, CH 2OH), 3.88 (6H, s, CH 2 × 3), 5.09 (2H, dd, J 18.9, 12.3, OCH 2), 5.38 (1H, d, J 8.7, NH), 7.26–7.34 (5H, m, C6 H 5).
    δC (100 MHz; CDCl3) 14.11 (CH3), 30.39 (CCH3), 55.26 (CHNH), 61.75 (CH2OH), 66.76 (CH2O), 72.53 (CH2 × 3), 108.29 (CO3), 127.98 (C 6H5), 128.32 (C 6H5), 136.31 (C 6H5), 156.31 (CO2NH).
  • (c) 1-[N-Benzyloxycarbonyl-(1S)-1-amino-2-oxoethyl]-4-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]oxetan (10).
  • Verbindung (9) (6,45 g, 20,0 mmol) wurde in wasserfreiem DCM (55 mL) unter N2 gelöst und in Flasche 1 auf –78°C gekühlt. Oxalylchlorid (2,8 mL, 31,9 mmol) wurde zu wasserfreiem DCM (85 mL) in einer separaten Flasche (Flasche 2) unter N2 zugegeben und auf –78°C gekühlt. Wasserfreies Dimethylsulphoxid (4,7 mL, 65,8 mmol) wurde zu der Oxalylchloridlösung zugegeben, und das Gemisch wurde bei –78°C für 15 Minuten gerührt. Die Alkohollösung wurde über 20 Minuten durch eine Kanüle in die Flasche 2 transferiert und mit wasserfreiem DCM (35 mL) gespült. Das resultierende trübe, weiße Gemisch wurde für 1,5 Stunden bei –78°C gerührt.
  • Diisopropylethylamin (17,4 mL, 99,7 mmol) wurde zugegeben, und die Lösung für 30 Minuten bei –78°C und 10 Minuten bei 0°C gerührt. Eiskaltes DCM (140 mL) wurde zugegeben, und die Lösung wurde mit eiskaltem NH4Cl (20% gesättigter Lösung; 3 × 140 mL) und gesättigtem NaCl (140 mL) gewaschen, getrocknet (MgSO4), und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, um einen gelben Feststoff hervor zubringen (10), 5,08 g, 79%; DC (3:1, EtOAc:Heptan), Rf = 0,56, Elektrospray-MS m/z 322,1 (40%) (MH+), 340,2 (100%) (MH+ + H2O).
    δH (400 MHz; CDCl3); 0.82 (3H, s, CH 3), 3.93 (6H, s, CH 2 × 3), 4.60 (1H, d, J 8.8, CHNH), 5.12 (2H, dd, J 14.9, 12.4, OCH 2), 5.35 (1H, br d, J 8.0, NH), 7.30–7.36 (5H, m, C6 H 5), 9.68 (1H, s, HCO).
    δC (100 MHz; CDCl3) 14.25 (CH3), 30.86 (CCH3), 63.25 (CHNH), 67.22 (CH2O), 72.88 (CH2 × 3), 107.16 (CO3), 128.13 (C 6H5), 128.46 (C 6H5), 136.13 (C 6H5), 156.17 (CO2NH), 195.66 (CHO).
  • (d) 1-[N-(Benzyloxycarbonyl)-(1S,2R)-1-amino-2-hydroxybutyl]-4-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]oxetan (11).
  • Verbindung (10) (2 g, 5,73 mmol) wurde in wasserfreiem DCM:Et2O (1:1) unter N2 gelöst. Eine Lösung von EtMgBr (3 M Lösung in Et2O; 7,6 mL, 22,9 mmol) wurde schnell bei –78°C zugegeben und stark gerührt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion durch das Gießen in 5% NH4Cl (500 mL) gequencht. DCM (500 mL) wurde zugegeben, die organische Phase wurde abgetrennt und mit 3% NH4Cl (500 mL) und Lauge (500 mL) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, so dass ein gelbes Öl erhalten wird. Aufreinigung durch eine Säulenchromatographie (1:10, EtOAc:DCM) und anschließende Umkristallisierung (EtOAc:Heptan) ergab einen weißen kristallinen Feststoff (11), 1,32 g, 60%; DC (1:10, EtOAc:DCM) Rf = 0,25, Elektrospray-MS m/z 352,2 (20%) (MH+), 370,3 (100%) (MH+ + H2O).
    δ (400 MHz; CDCl3) 0.82 (3H, s, CH 3), 0.94 (3H, t, J 7.4, CH2CH 3), 1.36–1.53 (2H, m, CH 2CH3), 3.85 (1H, d, J 10.3, CH), 3.93 (6H, s, CH 2 × 3), 4.05 (1H, t, J 6.8, CH), 5.13–5.14 (2H, dd, J 16.4, 12.7, OCH 2), 5.32 (1H, d, J 10.2, NH), 7.30–7.36 (5H, m, C6 H 5).
    δC (100 MHz; CDCl3), 10.11 (CH2 CH3), 14.34 (CH3), 25.98 (CH2CH3), 30.65 (CCH3), 56.05 (CHOH), 66.83 (CH2O), 70.81 (CHNH), 72.76 (CH2 × 3), 108.93 (CO3), 127.65 (C 6H5), 128.45 (C 6H5), 136.65 (C 6H5), 156.83 (CO2NH).
  • (e) 1-[N-Benzyloxycarbonyl-(1S)-1-amino-2-oxobutyl]-4-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]oxetan (12).
  • Verbindung (11) (1,32 g, 3,8 mmol) wurde in wasserfreiem DCM (10 mL) unter N2 gelöst und in Kolben 1 auf –78°C gekühlt. Oxalylchlorid (2 M Lösung in DCM; 3 mL, 6,0 mmol) wurde mit wasserfreiem DCM (10 mL) in einem separaten Kolben (Kolben 2) unter N2 verdünnt und auf –78°C gekühlt. Wasserfreies Dimethylsulphoxid (0,88 mL, 12,4 mmol) wurde zu der Oxalylchloridlösung zugegeben, und das Gemisch wurde bei –78°C für 15 Minuten gerührt. Die Alkohollösung wurde über 20 Minuten durch eine Kanüle in den Kolben 2 transferiert und mit wasserfreiem DCM (10 mL) gespült. Das resultierende trübe, weiße Gemisch wurde für 2 Stunden 15 Minuten bei –78°C gerührt. DIPEA (3,3 mL, 18,8 mmol) wurde zugegeben, und die Lösung 30 Minuten bei –78°C und 10 Minuten bei 0°C gerührt. Eiskaltes DCM (25 mL) wurde zugegeben, und die Lösung wurde mit eiskaltem NH4Cl (5% gesättigter Lösung; 3 × 25 mL) und gesättigtem NaCl (25 mL) gewaschen, getrocknet (NA2SO4), und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, so dass ein orangenes Öl erhalten wurde. Aufreinigung durch eine Säulenchromatographie (2:3, EtOAc:Heptan) ergab ein farbloses Öl (12), 556 mg, 45%; DC (2:3, EtOAc:Heptan) Rf = 0,25, Elektrospray-MS m/z 350,2 (60%) (MH+), 368,2 (100%) (MH+ + H2O).
    δ (400 MHz; CDCl3) 0.80 (3H, s, CH 3), 1.06 (3H, t, J 7.2, CH2CH 3), 2.48–2.56 (1H, m, CHCH3), 2.80–2.88 (1H, m, CHCH3), 3.90 (6H, s, CH 2 × 3), 4.60 (1H, d, J 8.8, CHNH), 5.09 (2H, s, OCH 2), 5.66 (1H, d, J 8.5, NH), 7.30–7.35 (5H, m, C6 H 5).
    δC (100 MHz; CDCl3) 7.53 (CH2 CH3), 14.25 (CH3), 30.57 (CCH3), 35.74 (CH2CH3), 62.33 (CHNH), 67.05 (CH2O), 72.94 (CH2 × 3), 106.98 (CO3), 128.10 (C 6H5), 128.46 (C 6H5), 136.31 (C 6H5), 155.99 (CO2NH).
  • (f) 1-[N-(Benzyloxycarbonyl)-(1S,2S)-1-amino-2-hydroxybutyl]-4-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]oxetan (13).
  • Verbindung (12) (2,77 g, 7,9 mmol) und LiBH4 (1,73 g, 79 mmol) wurden unter N2 auf –78°C gekühlt. Eine Lösung von DCM:CH3OH (1,5:1; 332 mL auf –78°C gekühlt) wurde zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht bei –78°C gerührt. Nachdem sie auf Raumtemperatur aufgewärmt wurde, wurde die Lösung in eine 5% NH4Cl Lösung (500 mL) gegossen, und DCM (300 mL) wurde zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit einer 5% NH4Cl Lösung (500 mL) und Lauge (400 mL) gewaschen, getrocknet (Na2SO4), und das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft, so dass ein weißer Feststoff erhalten wurde (13), 2,51 g, 90%; DC (1:1, EtOAc:Heptan) Rf = 0,23, Elektrospray-MS m/z 352,2 (40%) (MH+), 370,3 (100%) (MH+ + H2O).
    δ (400 MHz; CDCl3) 0.82 (3H, s, CH3), 0.97 (3H, t, J 7.4, CH2CH 3), 1.44–1.45 (1H, m, CHCH3), 1.63–1.68 (1H, m, CHCH3), 3.44 (1H, d, J 4.0, CHOH), 3.66–3.69 (1H, m, CHNH), 3.92 (6H, s, CH 2 × 3), 5.04 (1H, d, J 9.8, NH), 5.16 (2H, d, J 6.1, OCH 2), 7.36 (5H, d, J 4.3, C6H5),
    δC (100 MHz; CDCl3) 9.79 (CH2 CH3), 14.27 (CH3), 26.10 (CH2CH3), 30.56 (CCH3), 57.57 (CHOH), 66.94 (CH2O), 69.80 (CHNH), 72.66 (CH2 × 3), 108.89 (CO3), 128.06 (C 6H5), 128.47 (C 6H5), 136.51 (C 6H5), 156.49 (CO2NH).
  • (g) (1S,2S)-(1-amino-2-hydroxybutyl)-4-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]oxetan (14).
  • Verbindung (13) (2,51 g, 7,1 mmol) wurde in Ethanol (220 mL) gelöst, und 10% Pd/C (218 mg) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht in Gegenwart von H2 gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celit entfernt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft, so dass ein dickes Öl erhalten wurde. Aufreinigung durch Säulenchromatographie (20:1; DCM:MeOH) ergab ein hellgelbes Öl (14), 1,24 g, 92%, was beim Stehenlassen kristallisierte; DC (5:1, DCM:MeOH) Rf = 0,51, Elektrospray-MS m/z 218,1 (MH+).
    δ (400 MHz; CDCl3) 0.83 (3H, s, CH 3), 0.98 (3H, t, J 7.4, CH2CH 3), 1.38–1.48 (1H, m, CHCH3), 1.71–1.78 (1H, m, CHCH3), 2.77 (1H, d, J 7.1, CHNH2), 3.62–3.66 (1H, m, CHOH), 3.93 (6H, s, CH 2 × 3).
    δC (100 MHz; CDCl3) 9.57 (CH2 CH3), 14.37 (CH3), 26.01 (CH2CH3), 30.52 (CCH3), 58.52 (CHOH), 72.59 (CHNH2), 72.67 (CH2 × 3), 109.62 (CO3).
  • (h) (2S,3S)-β-Hydroxynorvalin (15)
  • Verbindung (14) (1,24 g, 5,5 mmol) wurde in DCM (68 mL) gelöst, und Trifluoressigsäure (1,58 mL), und H2O (1,13 mL) wurde zugegeben. Die resultierende trübe, weiße Lösung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft. Der farblose Rest wurde in MeOH (66 mL) und H2O (17 mL) gelöst, und 10% Cs2CO3 (9,2 g in 92 mL H2O) wurde zugegeben. Nachdem über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde die Lösung mit 2 M HCl (~35 mL) auf pH < 3 gesäuert. Die Lösung wurde auf eine Kationenaustauschersäule (Bio-Rad AG 50W-X8 100–200 mesh, Wasserstoffform, 4,5 × 20 cm) geladen, mit 0,01 M HCl (500 mL) und H2O (500 mL) gewaschen und mit 2 M NH4OH (2 L) eluiert, dann lyophilisert, so dass ein hellgelber Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde mit MeOH gewaschen, unter Erhalt eines cremefarbigen Feststoffes (15), 227 mg, 30%; DC (4:1:1, Butan-2-ol:AcOH:H2O) Rf = 0,26, Elektrospray-MS m/z 134,1 (MH+), Elementaranalyse C5H11O3N (berechnet) %C 45,10, %H 8,33, %N 10,52, (gefunden) %C 44,67, %H 8,03, %N 9,92.
    δ (400 MHz; CDCl3) 92:8 erythro (2S,3S) : threo (2S,3R), 1.00 (3H, t, J 7.4, CH 3), 1.40–1.54 (2H, m, CH 2), 3.41 (0.08H, d, J 4.2, CH), 3.61 (0.92H, d, J 4.2, CH), 3.60–3.65 (0.08H, m, CH), 3.66–3.69 (0.92H, m, CH).
    δC (100 MHz; CDCl3) 11.02 (CH2 CH3), 25.26 (CH2CH3), 61.26 (CHOH), 72.09 (CHNH2), 172.03 (CO2H).
  • Allgemeines Verfahren für die Synthese von Fmoc-3(2H)-furanonen
  • Anhand von Dihydro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5S-ethyl-3(2H)-furanon (18), das der allgemeinen Chemie folgt, wie sie in Schema 1 dargestellt ist.
  • (a) Zubereitung von Fmoc-(2S,3S)-β-ethylserin (16)
  • (2S,3S)-Hydroxynorvalin (15) (277 mg, 2,07 mmol) und Natriumcarbonat (2,1 Äq, 460 mg) wurden unter Rühren und Eiskühlung in Wasser (25 mL) und THF (10 mL) gelöst. 9-Fluorenylmethyl-chlorformiat (1,05 Äq, 560 mg) in THF (15 mL) wurde über einen Zeitraum von 45 min zugegeben, und das Gemisch wurde für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Chloroform (100 mL) und Wasser (50 mL) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde mit 0,1 N HCl auf pH 2 gesäuert. Die organische Phase wurde gesammelt, und die wässrige Phase wurde wiederum mit 2 × 100 mL Chloroform gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden durch Lauge (1 × 300 mL) nochmal gewaschen und über Magnesiumsulphat getrocknet. Das Chloroform wurde im Vakuum abgedampft, so dass ein feiner weißer Feststoff als Ausbeute erhalten wurde. Der Feststoff wurde in tert-butyl Methylether (25 mL) durch Erhitzen gelöst, und Heptan (75 mL) wurde zugegeben, so dass eine trübe Lösung erhalten wurde. Das Gemisch wurde auf –20°C gekühlt, und alle 30 min wurde Heptan (75 mL) für 4 Zyklen zugegeben. Das Präzipitat wurde heraus gefiltert und im Vakuum zu einem feinen weißen Feststoff getrocknet (16) 590 mg, 80,6%; DC (CHCl3; MeOH 3:1) Rf = 0,40, Elektrospray-MS m/z 356,2 (MH+).
  • (b) Zubereitung von (2S,3S)-N-Fmoc-β-ethylserinydiazomethan (17)
  • Dem allgemeinen Verfahren, das ausführlich in Beispiel 1 (a) für Verbindung (1) beschrieben ist, folgend, wurde Fmoc-(2S,3S)-ethylserin (16) (560 mg) zu einem gelben Feststoff (600 mg) umgesetzt (17), der ohne Aufreinigung verwendet wurde.
  • (c) Zubereitung von Dihydro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5S-ethyl-3(2H)-furanon (18)
  • Eine Lösung von Lithiumchlorid (1,0 g, 23,5 mmol) in 80% wässriger Essigsäure (10 mL) wurde auf 5°C gekühlt und zu rohem (2S,3S)-N-Fmoc-β-ethylserinydiazomethan (17) (0,6 g) unter Rühren zugegeben. Das Öl löste sich über einen Zeitraum von 10 min, und Rühren setzte sich für eine weitere Stunde fort, wobei es langsam auf Raumtemperatur erwärmt wurde, unter Entwicklung von Gas. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in EtOAc (50 mL) gegeben und nacheinander mit Wasser (50 mL), gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat (2 × 100 mL) und Lauge (75 mL) gewaschen, dann über Natriumsulphat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Rohprodukt durch flash Chromatographie über ein Silikagel (25 g) aufgereinigt und mit EtOAc/Heptan (1:3, v/v) eluiert. Gewünschte Fraktionen wurden vereinigt, und im Vakuum getrocknet, so dass Dihydro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5S-ethyl-3(2H)-furanon (18) als weißer Feststoff erhalten wurde und ergab 320 mg, 0,91 mmol, 58%. Elektrospray-MS m/z 352 (MH+), HRMS C21H21O4NNa entspricht M, 374,1368, gefunden wurde: MNa+, 374,1368 (–1,49 ppm), analytische HPLC Rt = 13,61 min (98,4%), Elementenanalyse C21H21O4N (berechnet) %C 71,78, %H 6,02, %N 3,99, (gefunden) %C 70,95, %H 6,22, %N 3,81.
    δ (500 MHz; CDCl3); 1,05 (3H, m, CH2CH 3), 1,76, 1,94 (2H, bm, CH 2CH3), 3,83 (1H, bm, Furanon CHβ), 3,88 (1H, bm, Furanon CHα), 4,02 (1H, d, J 17,3, 1 × Furanon COCH 2O), 4,23 (2H, m, 1 × Furanon COCH 2O + Fmoc CHCH2O), 4,42 (2H, b, Fmoc CHCH 2O), 5,05 (1H, b, Furanon, NH), 7,35 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromatisch), 7,42 (2H, t, J 7,3, Fmoc aromatisch), 7,58 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromatisch), 7,77 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromatisch).
    δC (125 MHz; CDCl3); 8,90 (5S-CH2 CH3), 26,14 (5S-CH2CH3), 46,90 (Fmoc CHCH2O), 60,50 (Furanon CHα), 66,99 (Fmoc CHCH2O), 70,43 (Furanon COCH2O), 81,65 (Furanon CHβ), 119,76 (Fmoc aromatisch), 124,72 (Fmoc aromatisch), 126,85 (Fmoc aromatisch), 127,53 (Fmoc aromatisch), 141,09 (Fmoc aromatisch), 143,37 (Fmoc aromatisch), 155,76 (OCONH), 211,72 (Furanon CO).
  • (d) Zubereitung von (2S,3R)-N-Fmoc-O-t-butyl-L-threonyldiazomethan (19)
  • Dem allgemeinen Verfahren, das ausführlich in Beispiel 1 (a) für Verbindung (1) beschrieben ist, folgend, wurde Fmoc-(2S,3R)-O-t-butyl-L-threonin (1,99 g, 5 mmol) in (2S,3R)-N-Fmoc-O-t-butyl-L-threonyldiazomethan (19) (2,11 g, 100%) als ein hellgelbes unbewegliches Öl umgesetzt. Diese Verbindung wurde für die nächste Stufe ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Elektrospray-MS m/z 444 (MNa+, 20%), 394 (MH+-N2, 70%) und 338 (MH+-tbutyl-N2, 100%).
  • (e) Zubereitung von (2R,3S)-N-Fmoc-O-t-butyl-D-Threonyldiazomethan (20)
  • Dem allgemeinen Verfahren, das ausführlich in Beispiel 1 (a) für Verbindung (1) beschrieben ist, folgend, wurde Fmoc-(2R,3S)-O-t-butyl-D-Threonin (0,4 g, 1 mmol) in (2S,3R)-N-Fmoc-O-t-butyl-L-Threonyldiazomethan (20) (0,48 g, 111%) als ein hellgelbes unbewegliches Öl umgesetzt. Diese Verbindung wurde für die nächste Stufe ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Elektrospray-MS m/z 394 (MH+-N2, 60%) und 338 (MH+-tbutyl-N2, 100%).
  • (f) Zubereitung von (2S,3S)-N-Fmoc-O-t-butyl-L-allo-Threonyldiazomethan (21) dem allgemeinen Verfahren, das ausführlich in Beispiel 1 (a) für Verbindung (1) beschrieben ist, folgend, wurde Fmoc-(2S,3S)-O-t-butyl-L-allo-Threonin (0,4 g, 1 mmol) in (2S,3S)-N-Fmoc-O-t-butyl-L-allo-Threonyldiazomethan (21) (0,53 g, 123%) als ein hellgelbes unbewegliches Öl umgesetzt. Elektrospray-MS m/z 394 (MH+-N2, 90%) und 338 (MH+-tbutyl-N2, 60%).
  • (i) Zubereitung von Dihydro-(4R-amino-[N-Fmoc])-5R-methyl-3(2H)-furanon (22)
  • Dem allgemeinen Verfahren, das ausführlich für die Zyclisierung von (17) zu (18) beschrieben ist, folgend, wurde Diazoketon (19) zyclisiert, um Dihydro-(4R-amino-[N-Fmoc])-5R-methyl-3(2H)-furanon (22) zu erhalten, als weißer Feststoff isoliert, ergab 69%, Elektrospray-MS m/z 338 (MH+, 100%), analytische HPLC Rt = 14,59 Minuten (97,7%).
    δ (500 MHz; CDCl3); 1,50 (3H, brd, CH3), 3,80 (1H, brt, Furanon CHα), 3,97 (1H, brm, Furanon CH), 3,99 (1H, d, J 17,7, 1 × Furanon COCH 2O), 4,22 (1H, t, J 6,7, Fmoc CHCH2O), 4,25 (1H, d, J 17,7, 1 × Furanon COCH 2O), 4,44 (2H, b, Fmoc CHCH 2O), 5,11 (1H, b, NH), 7,32 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromatisch), 7,41 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromatisch), 7,58 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromatisch), 7,76 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromatisch).
    δC (125 MHz; CDCl3); 19,1 (CH3), 47,2 (Fmoc CHCH2O), 62,7 (Furanon CHα), 67,3 (Fmoc CHCH2O), 70,8 (Furanon COCH2O), 77,4 (Furanon CHβ), 120,1 (Fmoc aromatisch), 125,0 (Fmoc aromatisch), 127,1 (Fmoc aromatisch), 127,8 (Fmoc aromatisch), 141,4 (Fmoc aromatisch), 143,7 (Fmoc aromatisch), 156,1 (OCONH), 211,8 (Furanon CO).
  • (j) Zubereitung von Dihydro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5S-methyl-3(2H)-furanon (23)
  • Dem allgemeinen Verfahren, das ausführlich für die Zyclisierung von (17) zu (18) beschrieben ist, folgend, wurde Diazoketon (20) zyclisiert, um Dihydro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5S-methyl-3(2H)-furanon (23) zu erhalten, als weißer Feststoff isoliert, ergab 70%, Elektrospray-MS m/z 338 (MH+, 75%), analytische HPLC Rt = 14,62 Minuten (98,9%).
  • (k) Zubereitung von Dihydro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5S-methyl-3(2H)-furanon (23)
  • Dem allgemeinen Verfahren, das ausführlich für die Zyclisierung von (17) zu (18) beschrieben ist, folgend, wurde Diazoketon (21) zyclisiert, um Dihydro-(4R-amino-[N-Fmoc])-5R-methyl-3(2H)-furanon (23) zu erhalten, als weißer Feststoff isoliert, ergab 64%, Elektrospray-MS m/z 338 (MH+, 100%), analytische HPLC Rt = 14,68 Minuten (97,5%).
  • Alternativer Weg für chirale β-Alkylserine
  • Der Chemie folgend, die ausführlich in Schema 3 beschrieben ist, beispielhaft dargestellt durch die Synthese von (2S,3S)-β-hydroxynorvalin (15) (auch benannt als (2S,3S)-β-ethylserin).
  • (a) Tri-aceton-D-mannitol
    Figure 00380001
  • D-Mannitol (49,5 g, 0,27 mol) wurde in Aceton (600 mL, 99,9% Reinheit) aufgenommen. Zu der Suspension wurde H2SO4 (4,95 mL) zugegeben, und das Gemisch wurde bei 21°C über Nacht geschüttelt. Die Lösung wurde dann gefiltert, und die klare Lösung mit einer gesättigten Lösung von NaHCO3 bis pH 6 neutralisiert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft, wodurch Tri-aceton-D-mannitol als weißer Feststoff erhalten wurde, ergab 78 g, 96%. Elektrospray-MS m/z 303 (MH+).
  • (b) 3,4-Isopropylidin-D-mannitol
    Figure 00390001
  • Tri-aceton-D-mannitol (78 g, 0,26 mol) wurde in der minimalen Menge von 70% Essigsäure (400 mL) gelöst und in einem Wasserbad bei 42,7°C für 1,5 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde schnell im Vakuum abgedampft, um 3,4-Isopropylidin-D-mannitol als farbloses Öl zu erhalten, ergab 57,6 g, 99,8%. Elektrospray-MS m/z 223 (MH+).
  • (c) 1,2,5,6-tetra-O-benzyl-3,4-O-isopropylidin-D-mannitol (35)
    Figure 00390002
  • 3,4-Isopropylidin-D-mannitol (57,64 g, 0,26 mol) wurde in Benzylchlorid (543 mL) gelöst. Zu der gerührten Lösung wurde gepulvertes KOH (500 g) gegeben, und die Lösung wurde in einem Ölbad bei 133°C für 2 Stunden erhitzt. Dem Gemisch wurde erlaubt, sich auf Raumtemperatur abzukühlen, und es wurde in ein 3000 mL-Becherglas gefüllt. Eis und Wasser (1400 mL) wurden vorsichtig zugegeben, das Gemisch wurde mit DCM (800 mL) extrahiert, und die wässrige Phase wurde noch mal mit DCM (300 mL) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, und die gefilterte Lösung im Vakuum ankonzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt, und mit EtOAc/Heptan (1:15 bis 1:10, v/v) eluiert, um Verbindung (35) als ein farbloses Öl zu erhalten, ergab 77 g, 51%. Elektrospray-MS m/z 583 (MH+). Analytische HPLC Rt = 29,16 Minuten (91,8%).
    δH (500 MHz, CDCl3) 1,35 (6H, s, C(CH 3)2), 3,62 (2H, dd, J 6, 10, 2 × CHOC), 3,75 (4H, m, 2 × CH 2OBn), 4,15–4,20 (1H, m, CHOBn), 4,46 (1H, dd, J 12,5, 14,5, CHOBn), 4,77 (4H, d, J 11,5, 4 × CH 2AC6H5), 4,73 (4H, d, J 11,5 4 × CH 2BC6H5) und 7,25–7,34 (20H, m, 4 × C6H5).
  • (d) 1,2,5,6-Tera-O-benzyl-D-mannitol (36)
    Figure 00400001
  • In einer 200 mL-Flasche, die mit einem Kondensator ausgestattet ist, wurde Verbindung (35) (41,11 g, 0,071 mol) in 70% Essigsäure (700 mL) gelöst, und die Lösung wurde bei 100°C in einem Ölbad für 1,5 Stunden gerührt. Nachdem diese im Vakuum ankonzentriert wurde, wurde der Rückstand durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt, und mit EtOAc/Heptan (3:7, v/v) eluiert, um Verbindung (36) als ein hellgelbes Öl zu erhalten, ergab 21,8 g, 57%. Elektrospray-MS m/z 543 (MH+). Analytische HPLC Rt = 25,8 (100%).
    δH (500 MHz, CDCl3) 3,01 (2H, d, J 6,0, 2 × OH), 3,65–3,70 (2H, m, 2 × CHOBn), 3,72–3,78 (4H, m, 2 × CH 2OBn), 3,93–3,97 (2H, m, 2 × CHOH), 4,55 (4H, s, 2 × CH 2C6H5), 4,73 (2H, d, J 11,5, 2 × CH 2AC6H5), 4,77 (2H, d, J 11,5, 2 × CH 2BC6H5) und 7,25–7,34 (20H, m, 4 × C6H5).
  • (e) (2R)-2,3-Di-O-benzylglyceraldehyd (37)
    Figure 00400002
  • Verbindung (36) (10,78 g, 0,02 mol) wurde in wasserfreiem Toluol (150 mL) gelöst. Unter starkem Rühren wurde Tetraacetat (9,83 g, 0,023 mol, 1,1 Äq) als Feststoff zugegeben, und das Gemisch wurde über 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde dann gefiltert und das Gefilterte wurde im Vakuum ankonzentriert, um Verbindung (37) als farbloses Öl zu erhalten, ergab 10,2 g, 95%.
    δH (500 MHz, CDCl3) 3,75–3,83 (2H, m, CH 2OBn), 3,97 (1H, t, J 4, CHOBn), 4,55 (2H, d, J 5,5, 2 × CH 2AC6H5), 4,70 (2H, d, J 12, 2 × CH 2BC6H5), 7,20–7,40 (10H, m, 2 × C6H5) und 9,70 (1H, s, CHO).
  • (f) (2S)-N-(2,3-Dibenzyloxypropyliden)benzylamin (38)
    Figure 00410001
  • Benzylamin (4,06 mL, 0,037 mol, 1 Äq) wurde in wasserfreiem Diethylether (150 mL) gelöst, und die Lösung wurde bei 0°C gekühlt. Zu einer Lösung von Verbindung (37) (9,9 g, 0,037 mol, 1 Äq) in wasserfreiem Diethylether (100 mL) bei 0°C wurde wasserfreies Magnesiumsulfat (7,3 g) zugegeben, und die Lösung wurde durch eine Kanüle unter Argon zu der Aminlösung transferiert. Nachdem für 3 Stunden gerührt wurde, wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum ankonzentriert, um Verbindung (38) als ein rohes farbloses Öl zu erhalten, ergab 12,2 g, 96%.
    δH (500 MHz, CDCl3) 3,75–3,83 (2H, m, CH2OBn), 4,17–4,25 (1H, m, CHOBn), 4,57 (2H, s, NCH 2C6H5), 4,62 (2H, m, 2 × CH 2AC6H5), 4,70 (2H, m, CH 2BC6H5), 7,20–7,40 (15H, m, 3 × C6 H 5) und 7,70 (1H, m, CHN).
  • (g) (1R,2S)-N-Benzyl-2,3-dibenzyloxy-1-phenyl-1-propylamin (39)
    Figure 00410002
  • Phenylmagnesiumbromid (29,17 mL, 0,087 mol, 3.0 M, 2,5 Äq) wurde in wasserfreiem Diethylether (124 mL) gelöst, und die Lösung wurde auf 0°C unter Argon gekühlt. Eine Lösung von Verbindung (38) (12,5 g, 0,035 mol), in wasserfreiem Diethylether (140 mL) wurde durch eine Kanüle zu der Phenylmagnesiumbromidlösung tranferiert, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Die Lösung wurde in eine wässrige Lösung von NH4Cl (200 mL) gegossen und mit tert-Butylmethylether (2 × 100 mL) extrahiert. Die vereinigten Extrakte, die über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet wurden, wurden im Vakuum ankonzentriert. Das rohe Öl, das erhalten wurde, wurde durch Flash-Chromatograhie über ein Silicagel aufgereinigt und mit EtOAc/Heptan (1:4, v/v) eluiert, um Verbindung (39) als ein hellgelbes Öl zu erhalten, ergab 8,5 g, 56%. Elektrospray-MS m/z 438 (MH+). Analytische HPLC Rt = 24,0 Minuten (98%).
    δH (500 MHz, CDCl3) 2,45 (1H, br s, NH), 3,32 (1H, dd, J 10, 4,5, CH 2AOBn), 3,43 (1H, d, J 13, C6H5CH 2ANH) 3,50–3,54 (1H, dd, J 10, 3, CH 2BOBn), 3,55–3,61 (1H, d, J 13, C6H5CH 2BNH), 3,65–3,78 (1H, m, CHOBn), 3,90 (1H, d, J 7, C6H5CHNH), 4,40 (2H, s, OCH 2C6H5), 4,62 (1H, d, J 11, OCH 2AC6H5), 4,70 (1H, d, J 11, OCH 2BC6H5) und 7,18–7,40 (20H, m, 4 × C6H5).
  • (h) (1R,2S)-N-Benzyl-tert-butoxycarbonyl-2,3-dibenzyloxy-1-phenyl-1-propylamin (40)
    Figure 00420001
  • Verbindung (39) (9,26 g, 0,02 mol) wurde in Dioxan (66 mL) gelöst, und Diisopropylamin (0,37 mL, 0,0021 mol, 0,11 Äq) wurde zugegeben. Zu der gerührten Lösung wurde Di-tert-butyl dicarbonat (11,25 g, 0,0516 mol, 2,6 Äq als Feststoff zugegeben, und die Lösung wurde bei 50°C in einem Ölbad über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde mit tert-Butyl-methylether (300 mL) behandelt, mit wässriger 1,0 M KHSO4-Lösung (60 mL) gewaschen und die organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum ankonzentriert. Das rohe Öl wurde durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt und mit EtOAc/Heptan (1:9, v/v) eluiert, um Verbindung (40) als ein farbloses Öl zu erhalten, ergab 7,7 g, 71%. Elektrospray-MS m/z 538 (MH+). Analytische HPLC Rt = 30,0 Minuten (95%).
    δH (500 MHz, CDCl3) 1,30 (9H, s, C(CH3)3), 3,44 (1H, dd, J 10, 4,5, CH 2AOBn), 3,61 (1H, dd, J 10, 2, CH 2BOBn), 4,30 (1H, m, CH2AN) 4,37 (2H, d, J 12, OCH 2AC6H5), 4,43 (2H, d, J 12, OCH 2BC6H5), 4,50–4,63 (1H, m, CH2BN), 4,85 (1H, m, CHOBn) 5,25 (1H, d, J 9, C6H5CHN) und 7,00–7,45 (20H, m, 4 × C6H5).
  • (i) (1R,2S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2,3-hydroxy-1-phenyl-1-propylamin (41)
    Figure 00420002
  • Verbindung (40) (7,67 g, 0,014 mol) wurde in wasserfreiem Methanol (80 mL) gelöst. Nachdem die Flasche mit Argon geflutet wurde, wurden 20% Pd (OH)2/C (10,00 g, Degussa-Typ, E101 NE/W, nass) vorsichtig zugegeben, und das Gemisch wurde für 48 Stunden unter H2 gerührt.
  • Das Gemisch wurde vorsichtig durch ein Celitpolster gefiltert und der Katalysator wurde mit einer Lösung von wässrigem Methanol (10:100 H2O:CH3OH, v/v) gewaschen. Die gefilterte Lösung wurde im Vakuum ankonzentriert, und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt und mit EtOAc/Heptan (3:1, v/v) eluiert, um Verbindung (41) als ein farbloses Öl zu erhalten, ergab 2,7 g, 72%. Elektrospray-MS m/z 268 (MH+). Analytische HPLC Rt = 15,3 Minuten (100%).
    δH (500 MHz, CDCl3) 1,44 (9H, s, C(CH3)3), 2,6 (2H, br s, OH), 3,56 (2H, d, J 5,5, CH 2OH), 3,97 (1H, s, C6H5CHNH), 4,83 (1H, s, C6H5CHCHOH), 5,28 (1H, d, J 8, NH) und 7,20–7,45 (5H, m, C6 H 5).
  • (j) (1R,2S)-N-tert-Butoxycarbonyl-3-tert-butyldimethylsilyloxy-2-hydroxy-1-phenyl-1-propylamin (42)
    Figure 00430001
  • Verbindung (41) (2,67 g, 0,01 mol) wurde in wasserfreiem DMF (60 mL) gelöst und unter Argon gerührt. Imidazol (1,5 g, 0,022 mol, 2,2 Äq) wurde zugegeben, gefolgt von der Zugabe von TBDMSCl (1,66 g, 0,011 mol, 1,1 Äq). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Ether (240 mL) verdünnt, mit gesättigtem NH4Cl (120 mL) und H2O (40 mL) gewaschen, und die wässrige Phase wurde mit Ether (4 × 100 mL) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und im Vakuum ankonzentriert. Aufreinigung des Rückstandes durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel und Elution mit EtOAc/Heptan (3:1, v/v) ergab Verbindung (42) als ein farbloses Öl, ergab 3,31 g, 87%. Elektrospray-MS m/z 382 (MH+).
    δH (500 MHz, CDCl3) 0,05 (3H, s, CH 3ASiCH3), 0,06 (3H, s, CH3SiCH 3B), 0,89 (9H, s, Si(CH3)3), 1,39 (9H, br s, C(CH 3)3), 2,45 (1H, br s, OH), 3,51 (1H, dd, J 10, 7, TBDMSOCH 2A), 3,65 (1H, dd, J 10, 4,5, TBDMSOCH 2B), 3,85 (1H, m, CHOH), 4,66 (1H, m, C6H5CHNH), 5,45 (1H, br s, NH) und 7,23–7,35 (5H, m, C6 H 5).
  • (k) (1R,2S)-N-tert-butoxycarbonyl-3-tert-butyldimethylsilyloxy-2-mesyloxy-1-phenyl-1-propylamin (43)
    Figure 00440001
  • Verbindung (42) (1,30 g, 3,40 mmol, 1,0 Äq) wurde in wasserfreiem DCM (30 mL) gelöst. Zu der Lösung wurde TEA (0,57 mL, 4,09 mmol, 1,2 Äq) zugegeben, und das Gemisch wurde auf 0°C in einem Eiswasserbad gekühlt. Bei dieser Temperatur und unter Argon wurde eine Lösung von MsCl (0,32 mL, 4,09 mmol, 1,2 Äq) in wasserfreiem DCM (3 mL) zugegeben. Das Gemisch wurde für 1,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (20 mL) behandelt und mit DCM (20 mL) extrahiert. Die wässrige Phase wurde noch mal mit DCM (4 × 60 mL) extrahiert, und die kombinierten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum ankonzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt und mit EtOAc/Heptan (1:3, v/v) eluiert, um Verbindung (43) als ein farbloses Öl zu erhalten, ergab 1,30 g, 83%. Elektrospray-MS m/z 460 (MH+). Analytische HPLC Rt: 27,1 Minuten (98%).
    δH (500 MHz, CDCl3) 0,06 (3H, s, CH 3ASiCHO3), 0,07 (3H, s, CH3SiCH 3B), 0,91 (9H, s, Si(CH3)3), 1,42 (9H, br s, C(CH 3)3), 2,54 (3H, s, SO2CH3), 3,77 (2H, d, J 6,0, TBDMSOCH 2), 4,7 (1H, m, CHOH), 5,1 (1H, m, C6H5CHNH), 5,4 (1H, br s, NH) und 7,26–7,38 (5H, C6H5).
  • (l) (1R,2R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2,3-epoxy-1-propylamin (44)
    Figure 00440002
  • Verbindung (43) (3,79 g, 8,26 mmol, 1,0 Äq) wurde in wasserfreiem THF (78 mL) gelöst, und die Lösung wurde auf 0°C in einem Eiswasserbad gekühlt. TBAF (16,52 mL, 1,0 M-Lösung in THF, 16,52 mmol, 2 Äq) wurde tropfenweise durch eine Spritze zugegeben, und sobald die Zugabe abgeschlossen war, wurde das Eisbad entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, und dann mit Wasser (40 mL) behandelt, mit Diethylether (40 mL) extrahiert, und die wässrige Phase wurde noch mal mit Diethylether (3 × 75 mL) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und im Vakuum ankonzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt und mit TBME/Heptan (1:6 bis 2:1, v/v) eluiert, so dass Verbindung (44) als weißer Feststoff erhalten wurde, ergab 1,0 g, 48%. Elektrospray-MS m/z 250 (MH+).
    δH (500 MHz, CDCl3) 1,42 (9H, s, C(CH3)3), 2,50 (1H, dd, J 5, 2,2, CHCH 2AO), 2,76 (1H, dd, J 5, 4, CHCH 2BO), 3,20–3,30 (1H, m, CHCH2O), 4,72 (1H, br s, C6H5CHCHO), 5,00 (1H, br s, HN) und 7,27–7,38 (5H, m, C6H5).
  • (m) (1R,2S)-N-tert-butoxycarbonyl-2-hydroxy-1-phenyl-1-butylamin (45)
    Figure 00450001
  • Kupfer(I)iodid (0,574 g, 3,01 mmol, 5 Äq) wurde in wasserfreiem Diethylether (17 mL) verteilt. Nachdem die Suspension auf –35°C unter Argon gekühlt wurde, wurde CH3Li in Diethylether (3,76 mL, 1,6 M, 6,02 mmol, 10 Äq) tropfenweise zugegeben. Nachdem für 30 Minuten bei –35°C gerührt wurde, wurde eine Lösung von Verbindung (44) (0,15 g, 0,60 mmol, 1,0 Äq) in Diethylether (1,5 mL) gelöst und tropfenweise zu der Lösung des Organocuprats zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde bei –35°C für 1,5 Stunden gerührt. Ethylacetat (12,5 mL) wurde zugegeben, gefolgt durch die vorsichtige Zugabe einer gesättigten Lösung von NH4Cl (10 mL) und Wasser (3 mL). Dem Gemisch wurde es gestattet, auf Raumtemperatur aufzuwärmen, und die organische Phase wurde extrahiert. Die wässrige Phase wurde noch mal mit Ethylacetat (3 × 15 mL) extrahiert, und die vereinten Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und im Vakuum ankonzentriert. Das rohe Öl wurde über Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt und mit TBME/Heptan (2:3, v/v) eluiert, um Verbindung (45) als weißen Feststoff zu erhalten, ergab 0,14 g, 88%. Elektrospray-MS m/z 266 (MH+). Analytische HPLC Rt = 17,6 Minuten (100%).
    δH (500 MHz, CDCl3) 0,97 (3H, t, J 7,5, CH 3CH2), 1,10–1,25 (1H, m, CH3CH 2A), 1,25–1,50 (1H, m, CH3CH 2B), 1,50 (9H, s, C(CH3)3), 3,78 (1H, br s, CHOH), 4,73 (1H, br s, C6H5CHNH), 5,28 (1H, br s, NH) und 7,25–7,38 (5H, m, C6H5).
  • (n) (1R,2S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-tert-butoxy-1-phenyl-1-butylamin (46)
    Figure 00450002
  • In einem abgedichteten Röhrchen wurde Verbindung (45) (0,114 g, 0,43 mmol) in wasserfreiem DCM (11 mL) gelöst. Während das Rühren fortgesetzt wurde, wurde das Röhrchen in einem Trockeneis-Aceton-Bad eingetaucht und auf –60°C gekühlt. Isobutylen (11 mL) wurde in das Röhrchen kondensiert, und Methyltriflat (55 L) wurde vorsichtig zugegeben. Das Röhrchen wurde fest verschlossen, und das Bad entfernt, um der Reaktion zu gestatten, bei Raumtemperatur für 4 Tage stattzufinden. Das Röhrchen wurde auf –60°C gekühlt, der Deckel entfernt und dann das Wasserbad entfernt, um dem überschüssigen Isobutylen zu gestatten, langsam abzudampfen, während es sich auf Raumtemperatur erwärmt. Bei etwa 10°C wurde TEA (0,7 mL) zugegeben, um die überschüssige Säure zu neutralisieren. Der Rückstand, der nach der Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum erhalten wurde, wurde durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt und mit EtOAc/Heptan (2:8, v/v) eluiert, um Verbindung (46) als weißen Feststoff zu erhalten, ergab 0,02 g, 14%. Elektrospray-MS m/z 322 (MH+). Analytische HPLC Rt = 24,1 Minuten (90%).
    δH (500 MHz, CDCl3) 0,84 (3H, t, J 7,5, CH 3CH2), 1,15–1,30 (1H, m, CH3CH 2A) 1,24 (9H, s, CHOC(CH 3)3), 1,35–1,40 (1H, m, CH3CH 2B), 1,41, (9H, s, CO2C(CH 3)3), 3,72 (1H, m, CHO(CH3)3), 4,78 (1H, m, C6H5CHNH), 5,15 (1H, br s, NH) und 7,22–7,38 (5H, m, C6H5).
  • (o) (2S,3S)-N-tert-Butoxycarbonyl-tert-butoxy-norvalin (47)
    Figure 00460001
  • Verbindung (46) (0,024 g, 0,074 mmol, 1 Äq) wurde in einer Mischung von CCl4/CH3CN/H2O (1:1:2, v/v/v, 2,4 mL) gelöst. Zu der gerührten biphasischen Lösung wurde NaHCO3 (0,104 g, 1,25 mmol, 16,9 Äq) als Feststoff zugegeben, gefolgt von der vorsichtigen Zugabe von NaIO4 (0,284 g, 1,33 mmol, 18 Äq). Nach 10 Minuten wurde RuCl3·3H2O (1,5 mg, 7,23 mol, 0,1 Äq) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde für 48 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit EtOAc (15 mL) behandelt und durch die tropfenweise Zugabe von Zitronensäure (10%) auf pH = 3 angesäuert. Die organische Phase wurde noch mal mit EtOAc (3 × 15 mL) extrahiert und die vereinigten Extrakte wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und im Vakuum ankonzentriert. Der rohe Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt und mit einem Gradienten von MeOH/CH3Cl (0,1:10 zu 1,0:10, v/v) eluiert, um Verbindung (47) als einen weißen Feststoff zu erhalten, ergab 0,009 g, 42%. Elektrospray-MS m/z 290 (MH+).
  • (p) (2S,3S)-β-Hydroxy-norvalin (15)
    Figure 00470001
  • Verbindung (47) (9 mg, 0,03 mmol) wurde in einer Lösung von HCl in Dioxan (1 mL, 4,0 M) gelöst. Nachdem für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde unter Verwendung von CH3CN/H2O (4:1, v/v) lyophylisiert, um (2S,3S)-Hydroxynorvalin (15) als weißen Feststoff zu erhalten, 3,0 mg, 75%. Elektrospray-MS m/z 134 (MH+).
    δH (500 MHz; CD3OD) 1,00 (3H, t, J 7,5, CH 3CH2), 1,50–1,65 (2H, m, CH3CH 2), 3,88–3,95 (1H, m, CHOH) und 3,98 (1H, d, J 3, C6H5CHNH2).
  • Chemie für P2-Hybrid-Aminosäuren
  • Die allgemeine Chemie, die in Schema 4 beschrieben ist, wird in Kürze in voller Länge in der akademischen Literatur durch seine Erfinder CS Dexter und RFW Jackson an der Universität von New Castle, England, veröffentlicht werden.
  • (a) Allgemeine Prozedur für die Zink-Kopplungsreaktionen
  • (b) Zinkaktivierung
  • Zinkstaub (150 mg, 2,3 mmol, 3,0 Äq, Aldrich) wurde in einen 25 mL Rundbodenkolben gewogen, der einen Seitenarm besitzt und mit einem 3-Wegehahn ausgestattet ist. Der Zinkpulver wurde mit einem Fön unter Vakuum erhitzt, und der Kolben wurde mit Stickstoff gespült und evakuiert, und für 3 weitere Male gespült. Zu dem mit Stickstoff gefüllten Kolben wurde trockenes DMF (1 mL) zugegeben. Trimethylsilylchlorid (30 μL, 0,23 mmol, 0,3 Äq) wurde zugegeben, und der Zinkbrei wurde stark für weitere 30 Minuten gerührt.
  • (c) Zinkinsertion; N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-iodzinc-L-alanin-methylester (61)
  • In trockenem DMF (0,5 mL) gelöster N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-iod-L-alanin-methylester (247 mg, 0,75 mmol, 1,0 Äq) wurde tropfenweise durch eine Kanüle zu dem aktivierten Zinkbrei, der bei 0°C zubereitet wurde, wie oben beschrieben, zugegeben. Dem Reaktionsgemisch wurde es dann gestattet, sich auf Raumtemperatur zu erwärmen und für 1 Stunde zu rühren, um das organische Zinkreagenz zu erhalten.
  • (d) CuBr·SMe2-Zubereitung
  • Während die Zinkinsertionsreaktion ablief, wurde CuBr·SMe2 (20 mg, 0,1 mmol, 0,13 Äq) in einen 25 mL Rundbodenkolben gewogen, der mit einem 3-Wegehahn ausgestattet ist, und vorsichtig mit einem Fön unter Vakuum getrocknet, bis CuBr·SMe2 sein Erscheinungsbild von einem braunen Pulver veränderte, und ein hellgrünes Pulver erhalten wurde. Trockenes DMF (0,5 mL) wurde dann zugegeben, gefolgt von der Zugabe der elektrophilen Substanz (entweder 1-Brom-2-methylbut-2-en, Toluol-4-sulfonsäure-(E)-2-methyl-but-2-enylester oder 1-Brom-2,3-dimethylbut-2-en) (1,0 mmol, 1,3 Äq). Das Reaktionsgemisch wurde dann auf –15°C gekühlt.
  • (e) Kopplungsreaktion
  • Rühren der organischen Zinkreagenzlösung wurde dadurch gestoppt, dass es dem Zinkpulver gestattet wurde, sich abzusetzen, und der Überstand wurde vorsichtig durch eine Kanüle entfernt (wobei beachtet wurde, nicht zuviel Zinkpulver zu transferrieren) und wurde tropfenweise zu der Lösung der elektrophilen Substanz und dem Kupferkatalysator zugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Ethylacetat (20 mL) wurde zugegeben, und das Rühren wurde für weitere 15 Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in einen Trenn-Trichter transferriert, und ein weiteres Aliquot von EtOAc (30 mL) wurde zugegeben. Die organische Phase wurde nacheinander mit 1 M Na2S2O3 (20 mL), Wasser (2 × 20 mL), Lauge (40 mL) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und gefiltert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das rohe Produkt wurde durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel wie beschrieben aufgereinigt.
  • (f) Hydrierung von Alken
  • Das Alken (1,0 mmol) wurde in Ethanol (10 mL) gelöst, 10% Palladium auf Kohlenstoff (80 mg) zugegeben, und Wasserstoff wurde eingeführt. Wenn für die Reaktion erachtet wird, dass sie ihren Abschluss erreicht hat, wurde der Wasserstoff entfernt, die Reaktion durch Celite gefiltert, und der Katalysator wurde mit Ethanol (30 mL) gewaschen. Die kombinierten organischen Filtrate wurden im Vakuum ankonzentriert, und das Alkan wurde direkt in der nachfolgenden Reaktion verwendet.
  • (g) Verseifung von Methylester
  • Das Methylester (1,0 mmol) wurde in THF (6 mL) gelöst, und während es gerührt wurde, wurde eine Lösung von LiOH (1,2 mmol, 1,2 Äq) in Wasser (6 mL) tropfenweise zugegeben. Sobald die Reaktion als beendet erachtet wurde, wurde das THF im Vakuum entfernt, und Diethylether (10 mL) wurde zu dem Rückstand zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 1,0 M HCl bis pH = 3 angesäuert. Die organische Phase wurde dann entfernt, und die wässrige Schicht wurde mit Diethylether (2 × 10 mL) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Carbonsäure zu erhalten, die direkt in der nachfolgenden Reaktion verwendet wird.
  • (h) Entfernung der N-Boc-schützenden Gruppe
  • Das N-Boc-geschützte Material (1,0 mmol) wurde in DCM (2 mL) gelöst und auf 0°C gekühlt. Trifluoressigsäure (2 mL) wurde tropfenweise zugegeben, und wenn die Reaktion als beendet erachtet wurde, wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um das Amin zu erhalten, das direkt in der nachfolgenden Reaktion eingesetzt wird.
  • Alternativ wurde das N-Boc-geschützte Material (1,0 mmol) auf 0°C gekühlt, und 4 M HCl in Dioxan (5 mL) wurde tropfenweise zugegeben, und wenn die Reaktion als beendet erachtet wurde, wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um das Amin zu erhalten, das direkt in der nachfolgenden Reaktion verwendet wird.
  • (i) Fmoc-Schutz des Amins
  • Das Amin (1,0 mmol) in 1,4-Dioxan (2 mL) wurde auf 0°C gekühlt, und 10% Natriumcarbonat (2,2 mmol, 2,2 Äq, 2 mL) wurde zugegeben. Das biphasische Reaktionsgemisch wurde stark gerührt, und Fmoc-Cl (1,1 mmol, 1,1 Äq) wurde zugegeben. Wenn die Reaktion als beendet erachtet wurde, wurde Diethylether (10 mL) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde auf pH = 3 mit 1 M HCl angesäuert. Die organische Phase wurde entfernt, und die wässrige Schicht wurde mit Diethylether (2 × 10 mL) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, gefiltert, das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über Silicagel aufgereinigt.
  • Synthese-Beispiel 1
  • Zubereitung von 2S-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4,4-dimethylhexansäure (68) Das folgende Schema erklärt, wie optisch reines (S)-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,4-dimethyl-hex-5-ensäure-methylester (62) zubereitet und isoliert wurde.
  • Figure 00500001
  • (a) 2S-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,4-dimethyl-hex-5-ensäure-methylester (62), 2S-2-tert-butoxycarbonylamino-4-(25-3,3-dimethyl-oxiranyl)-buttersäuremethylester (63) und 2S-2-tert-butoxycarbonylamino-4-(2R-3,3-dimethyloxiranyl)-buttersäuremethylester (64)
  • Der allgemeinen Prozedur für Zinkkopplungsreaktionen folgend, wurde 1-Brom-3-methylbut-2-en (115 μL, 1,0 mmol) an Verbindung (61) (247 mg, 0,75 mmol) in Gegenwart von CuBr·SMe2 (20 mg, 0,1 mmol) gekoppelt, um einen Rückstand zu erhalten, der durch Flash-Säulen-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt wurde und mit EtOAc/40:60 Petroleumether (1:9, v/v) eluiert wurde. Die Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum reduziert, um eine Mischung von Regioisomeren (2:1 formal SN2' gegen SN2), das durch Säulenchromatographie nicht trennbar ist, als ein farbloses Öl zu erhalten, ergab 190 mg, 93%.
  • Zu einer Mischung von Regioisomeren (190 mg, 0,7 mmol) in Chloroform (3 mL) wurde tropfenweise über 5 Minuten 3-Chlorperbenzolsäure (156 mg, 85% Reinheit, 0,8 mmol, 1,1 Äq in Chloroform (2 mL) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für weitere 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann nacheinander mit 1 M Na2S2O5 (5 mL), einer gesättigten Natrium-Dicarbonat-Lösung (5 mL) und Lauge (10 mL) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, gefiltert, das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt und mit EtOAc/40:60 Petroleumether (2:8, v/v) eluiert. Drei Produkte wurden erhalten; Verbindung (62) wurde als erstes eluiert, und weitere Elution ergab eine nicht trennbare Mischung von Verbindung (63) und Verbindung (64). Fraktionen der Eingangsverbindung wurden vereinigt und im Vakuum reduziert, um 2S-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,4-dimethyl-hex-5-ensäuremethylester (62) als ein klares Öl zu erhalten, ergab 93 mg, 49%. Elektrospray-MS m/z 272 (MH+). Analytische HPLC Rt = 21,45 Minuten (95%), HRMS C10H17O4N benötigt M, 215,1158, gefunden: M+-C4H8 215,1152 (–2,8 ppm); IR (cap.film)/cm–1 3369 (s), 3084 (m), 2965 (s), 1748 (s), 1715 (s), 1517 (s), 1167 (s), 1007 (s), 914 (s)
    δH (500 MHz; CDCl3) 1,06 (6H, s, CH2=CHC(CH 3)2), 1,42 (9H, s, C(CH 3)3) 1,55 (1H, dd, J 14, 9, CH2=CHC(CH3)2CH 2A), 1,82 (1H, dd, J 14, 3, CH2=CHC(CH3)2CH 2B), 3,69 (3H, s, OCH3), 4,30 (1H, m, NHCHCO2CH3), 4,83 (1H, br d, J 7, NH), 4,97 (2H, m, CH 2=CH) und 5,78 (1H, dd, Jtrans 17,5, Jcis 11, CH2=CH)
    δC (125 MHz; CDCl3) 26,93 (CH2=CHC(CH3)2), 28,34 (C(CH3)3), 36,33 (CH2=CHC(CH3)2 CH2), 45,06 (CH2=CHC(CH3)2), 51,25 (NHCHCO2CH3), 52,15 (OCH3), 79,77 (C(CH3)3), 111,39 (CH2=CH), 146,87 (CH2=CH), 154,97 (NHCO2But) und 174,04 (CO2CH3).
  • (b) 2S-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,4-dimethyl-hexansäure-methylester (65)
  • Der allgemeinen Prozedur für Alken-Hydrierung folgend, führte Verbindung (62) (93 mg, 0,3 mmol) zu Verbindung (65) als ein farbloses Öl, ergab 90 mg, 96% und wurde direkt für die nachfolgende Reaktion eingesetzt. Elektrospray-MS m/z 274 (MH+). Analytische HPLC Rt = 22,55 Minuten (100%).
  • (c) 2S-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,4-dimethyl-hexansäure (66)
  • Der allgemeinen Prozedur für die Verseifung von Methylester folgend, ergab Verbindung (65) (90 mg, 0,3 mmol) Verbindung (66) als Kristalle, ergab 79 mg, 92% und wurde direkt in die nachfolgende Reaktion eingesetzt. Elektrospray-MS m/z 260 (MH+). Analytische HPLC Rt = 20,90 Minuten (100%).
  • (d) 2S-2-Amino-4,4-dimethyl-hexansäure-trifluoressigsäuresalz (67)
  • Der allgemeinen Prozedur unter Verwendung von TFA für die Entfernung von N-Boc folgend, ergab Verbindung (66) (79 mg, 0,3 mmol) Verbindung (67) als Feststoff, ergab 80 mg, 96% und wurde direkt für die nachfolgende Reaktion eingesetzt. Elektrospray-MS m/z 274 (MH+).
  • (e) 2S-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4,4-dimethyl-hexansäure (68)
  • Der allgemeinen Prozedur für den Fmoc-Schutz eines Amins folgend, ergab Verbindung (67) (80 mg, 0,3 mmol) nach Aufreinigung durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel und Elution mit CHCl3/CH3OH (100:0 zu 96:4, v/v) 2S-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4,4-dimethyl-hexansäure (68) als Feststoff, ergab 60 mg, 54%. Elektrospray-MS m/z 382 (MH+). Analytische HPLC Rt = 23,63 Minuten (100%); [α]D 17 –18,4 (c 0,25 in EtOH)
    δH (500 MHZ, CDCl3) 0,88 (3H, t, J 7, CH 3CH,), 0,95 (6H, s, CH3CH2C(CH 3)2), 1,31 (2H, m, CH3CH 2), 1,46 (1H, dd, J 14,5, 10, CH3CH2C(CH3)2CH 2A), 1,85 (1H, br d, J 14,5, CH3CH2C(CH3)2CH 2B), 4,21 (1H, t, J 6,5, CH-Fmoc), 4,41 (3H, m, NHCHCO2H und CH2O), 5,02 (1H, br d, J 8, NH-Fmoc), 7,29 (2H, m, H-2' und H-7'), 7,38 (2H, m, H-3' und H-6'), 7,58 (2H, m, H-1' und H-8') und 7,74 (2H, d, J7, H-4' und H-5').
  • Synthese-Beispiel 2
  • Zubereitung von 2S,4RS-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4,5-dimethyl-hexansäure (74)
  • Optisch reines 2S-4S-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,5-dimethyl-hex-5-ensäure-methylester (69) und 2S,4R-2-tert-Butoxy-carbonylamino-4,5-dimethyl-hex-5-ensäure-methylester (70) wurden direkt nach der Zinkkopplungsreaktion durch Flash-Chromatographie erhalten.
  • Figure 00520001
  • (a) 2S,4S-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,5-dimethyl-hex-5-ensäure-methylester (69) und 2S, 4R-2-tert-butoxy-carbonylamino-4,5-dimethyl-hex-5-ensäure-methylester (70)
  • Der allgemeinen Prozedur für Zinkkopplungsreaktionen folgend, wurde Toluol-4-sulfonsäure (E)-2-methyl-but-2-enylester (1,45 mL, 1,0 mmol) an Verbindung (61) (247 mg, 0,75 mmol) in Gegenwart von CuBr·SMe2 (20 mg, 0,10 mmol) gekoppelt, um einen Rückstand zu erhalten, der durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel aufgereinigt wird und mit EtOAc/40:60 Petroleumether (1:9, v/v) eluiert wurde, um zwei Diastereoisomere zu erhalten. Analytische HPLC Rt = 22,49 Minuten (60%) und Rt = 22,52 Minuten (40%). Fraktionen der zuerst eluierten Verbindung wurden vereinigt, um eines der Diastereisomere zu ergeben, das als ein farbloses Öl erhalten wurde, ergab 36 mg, 18%. Als nächstes wurde einer Mischung der Diastereomere als ein farbloses Öl erhalten, ergab 75 mg, 37%. Pure Fraktionen, die die später eluierte Verbindung enthielten, wurden vereinigt, so dass das andere Diastereoisomer als ein farbloses Öl erhalten wurde, ergab 19 mg, 9%. (Die Stereochemie an der Position 4 wurde nicht untersucht). Spektraldaten, die für die schnelllaufenden Diastereomere erhalten wurden: Elektrospray-MS m/z 272 (MH+); [α]D 20 +12,3 (c 1,06 in CHCl3); IR (cap.film)/cm–1 3382 (s), 3070 (m), 2966 (s), 1746 (s), 1716 (s), 1616 (w), 1507 (s), 886 (m)
    δH (500 MHz, CDCl3) 1,06 (3H, d, J 7, CH 3CH), 1,45 (9H, s, C(CH 3)3), 1,58 (1H, m, CH3CH), 1,68 (3H, s, CH 3C=CH2), 1,85 (1H, m, CH 2ACH), 1,97 (1H, m, CH 2BCH), 3,73 (3H, s, OCH3), 4,29 (1H, m, NHCHCO2CH3), 4,72 (1H, s, CH 2A=CH), 4,95 (1H, d, J 1,5, CH 2B=CH) und 5,04 (1H, d, J 7, NH)
    δC (125 MHz, CDCl3) 18,61 (CH3C=CH2), 21,64 (CH3CH), 28,32 (C(CH3)3), 30,79 (CH3 CHCH2), 38,06 (CH2CHNH), 52,00 (NHCHCO2CH3), 52,22 (OCH3), 79,53 (C(CH3)3), 110,19 (CH2=(CH3)), 144,62 (CH2=C(CH3)), 155,18 (OCONH) und 173,30 (CO2CH3).
  • Spektrale Daten, die für die langsam-laufenden Diastereoisomere erhalten wurden: Elektrospray-MS m/z 272 (MH+); [α]D 20 +16,0 (c 0,60 in CHCl3); IR (cap.film)/cm–1 3369 (s), 3073 (m), 2969 (s), 1747 (s), 1717 (s), 1617 (w), 1517 (s), 893 (m)
    δH (500 MHz, CDCl3) 1,04 (3H, d, J 7, CH 3CH), 1,44 (9H, s, C(CH 3)3), 1,55 (1H, m, CH3CH), 1,67 (3H, s, CH 3C=CH2), 1,91 (1H, m, CH 2ACH), 2,37 (1H, m, CH 2BCH), 3,73 (3H, s, OCH3), 4,26 (1H, m, NHCHCO2CH3), 4,75 (1H, d, J 1,5, CH 2A=CH), 4,79 (1H, d, J 1,5, CH 2B=CH) und 5,46 (1H, d, J 6,1, NH)
    δC (125 MHz, CDCl3) 18,51 (CH3C=CH2), 20,14 (CH3CH), 28,31 (C(CH3)3), 30,55 (CH3 CHCH2), 37,64 (CH2CHNH), 52,17 (NHCHCO2CH3), 52,22 (OCH3), 79,74 (C(CH3)3), 111,27 (CH2=C(CH3)), 147,94 (CH2=C(CH3)), 155,36 (OCONH) und 173,83 (CO2CH3).
  • Diese Diastereoisomere wurden nicht routinemäßig getrennt und wurden als eine Mischung in den nachfolgenden Reaktionen verwendet.
  • (b) 2S,4RS-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,5-dimethyl-hexansäure-methylester (71)
  • Der allegemeinen Prozedur für Alkenhydrierung folgend, ergaben Verbindungen (69) und Verbindung (70) (130 mg, 0,48 mmol) eine Mischung von zwei Diastereoisomeren (71), welche nicht getrennt wurden, als ein farbloses Öl erhalten wurden, ergab 128 mg, 98%. Analytische HPLC Rt = 22,49 Minuten, Elektrospray-MS m/z 274 (MH+).
  • (c) 2S,4RS-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,5-dimethyl-hexansäure (72)
  • Der allgemeinen Prozedur für die Verseifung von Methylester folgend, ergaben Verbindungen (71) (128 mg, 0,47 mmol) eine nicht zu trennende Mischung von Verbindungen (72) als ein farbloses Öl, ergab 106 mg, 87%. Elektrospray-MS m/z 260 (MH+). Analytische HPLC Rt = 20,65 Minuten (100%).
  • (d) 2S,4RS-2-Amino-4,5-dimethyl-hexansäure Trifluoressigsäuresalz (73)
  • Der allgemeinen Prozedur unter Verwendung von TFA für die Entfernung von N-Boc folgend, ergaben Verbindungen (72) (106 mg, 0,41 mmol) eine nicht zu trennende Mischung von Verbindungen (73) als Feststoff, ergab 107 mg, 96% und wurde direkt für die nachfolgende Reaktion eingesetzt. Elektrospray-MS m/z 160 (MH+).
  • (e) 2S,4RS-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4,5-dimethyl-hexansäure (74)
  • Der allgemeinen Prozedur für den Fmoc-Schutz eines Amins folgend, ergaben Verbindungen (73) (107 mg, 0,39 mmol) nach Aufreinigung durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel und nach der Elution mit CHCl3/CH3OH (100:0 zu 95:5, v/v) 2S,4RS-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4,5-dimethyl-hexansäure (74) als einen Feststoff, ergab 60 mg, 40% als eine Mischung von zwei Diastereoisomeren. Analytische HPLC Rt = 23,83 Minuten (40%) und Rt = 24,06 Minuten (60%). Für das zuerst eluierte Diastereomer: Elektrospray-MS m/z 382 (MH+). Für das zuletzt eluierte Diastereomer: Elektrospray-MS m/z 382 (MH+).
  • Synthese-Beispiel 3
  • Zubereitung von 2S,5RS-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5,6-dimethyl-heptansäure (80) und 2S-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4,4,5-timethyl-hexansäure (84)
  • (S)-2-tert-butyloxycarbonylamino-5,6-dimethyl-hept-5-ensäure-methylester (75) und (S)-2-tert-butyloxycarbonylamino-4,4,5-timethyl-hex-5-ensäure-methylester (76) wurden direkt nach der Zinkkopplungsreaktion durch Flash-Chromatographie erhalten.
  • Figure 00540001
  • (a) 2S-2-tert-Butyloxycarbonylamino-5,6-dimethyl-hept-5-ensäure-methylester (75) und 2S-2-tert-butyloxycarbonylamino-4,4,5-timethyl-hex-5-ensäure-methylester (76)
  • Der allgemeinen Prozedur für Zinkkopplungsreaktion folgend, wurde 1-Brom-2,3-dimethylbut-2-en (163 mg, 1,0 mmol) an Verbindung (61) (274 mg, 0,75 mmol) in Gegenwart von CuBr·SMe2 (20 mg, 0,10 mmol) gekoppelt, so dass ein Rückstand erhalten wurde, der nach Aufreinigung durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel und nach Elution mit EtOAc/40:60 Petroleumether (1:9) zwei Regioisomere ergab. Der zuerst eluierte Bestandteil war Verbindung (75) als ein farbloses Öl, ergab 60 mg, 28%, und der zweite eluierte Bestandteil war Verbindung (76) als ein farbloses Öl, ergab 51 mg, 24%.
  • Spektraldaten, die für Verbindung (75) erhalten wurden; Elektrospray-MS m/z 285 (MH+). Analytische HPLC Rt = 22,85 Minuten (100%); für HRMS C15H27NO4 berechnete M 285,1940, gefunden: M+ 285,1954 (–4,9 ppm); [α]D 22 +26,1 (c 1,01 in CH2Cl2); Elementenanalyse C15H27NO4 (berechnet) %C 63,1, %H 9,5, %N 4,9, (gefunden) %C 62,4, %H 9,6, %N 5,3, IR (cap.film)/cm–1 3366 (s), 3154 (m), 2978 (s), 1744 (s), 1718 (s), 1506 (s), 1366 (s), 1164 (s)
    δH (500 MHz, CDCl3) 1,45 (9H, s, C(CH 3)3), 1,62 (9H, m, (CH 3)2=C(CH 3)), 1,87 (1H, m, CH 2ACH2CH), 2,03 (1H, m, CH 2BCH2CH), 2,09 (1H, dd, J 6, 10,5, CH2CH 2ACH), 2,12 (1H, dd, J 6,5, 10,5, CH2CH 2BCH), 3,74 (3H, s, OCH3), 4,29 (1H, m, NHCHCO2CH3) und 5,02 (1H, d, J 7, NH)
    δC (125 MHz, CDCl3) 18,19 ((CH3)2C=C(CH3)), 20,00 ((CH3)2cis(C=C(CH3)), 20,61 ((CH3)2transC=C(CH3)), 28,33 (C(CH3)3), 30,07 (CH2 CH2CH), 30,92 (CH2CH2CH), 52,20 (NHCHCO2CH3), 53,47 (OCH3), 80,00 (C(CH3)3), 95,90 ((CH3)2 C=C(CH3)), 96,49 ((CH3)2C=C(CH3), 155,33 (OCONH) und 173,42 (CO2CH3).
  • Spektraldaten, die für Verbindung (76) erhalten wurden; Elektrospray-MS m/z 285 (MH+). Analytische HPLC Rt = 22,91 Minuten (100%); HRMS C11H19NO4 berechnete M 229,1314, gefunden: M+-C4H8 229,1309 (–2,2 ppm); [α]D 23 +4,8 (c 1,01 in CH2Cl2); Elementenanalyse C15H27NO4 (berechnet) %C 63,1, %H 9,5, %N 4,9, (gefunden) %C 62,5, %H 9,5, %N; IR (cap.film)/cm–1 3368 (s), 3091 (m), 2934 (s), 1748 (s), 1717 (s), 1516 (s)
    δH (500 MHz, CDCl3) 1,10 (3H, s, CH3)2AC), 1,12 (3H, s, (CH3)2BC), 1,43 (9H, s, C(CH3)3), 1,60 (1H, m, CH 2ACH), 1,74 (3H, s, CH 3C=CH2), 1,92 (1H, dd, J 14,5, 4, CH 2BCH), 3,70 (3H, s, OCH3), 4,24 (1H, m, NHCHCO2CH3), 4,79 (1H, s, CH 2A=C(CH3)), 4,82 (1H, s, CH 2B=C(CH3)) und 4,83 (1H, br d, J 11, NH)
    δC (125 MHz, CDCl3) 19,38 (CH3), 27,19 (CH3), 27,61 (CH3), 28,34 (C(CH3)3), 38,50 (CH2CH), 38,95 ((CH3)2 C), 51,34 (NHCHCO2CH3), 52,13 (OCH3), 79,71 (C(CH3)3), 110,95 (CH2=C(CH3)), 150,62 (CH2=C(CH3)), 155,00 (OCONH) und 174,24 (CO2CH3).
  • (b) 2S,5RS-2-tert-Butoxycarbonylamino-5,6-dimethyl-heptansäuremethylester (77)
  • Der allgemeinen Prozedur für Alkenhydrierung folgend, führte 2S-2-tert-butyloxycarbonylamino-5,6-dimethyl-hept-5-ensäure-methylester (75) (60 mg, 0,21 mmol) zu Verbindung (77) als ein farbloses Öl, ergab 54 mg, 89%. Elektrospray-MS m/z 288 (MH+). Analytische HPLC Rt = 24,06 Minuten (100%).
  • (c) 2S,5RS-2-tert-Butoxycarbonylamino-5,6-dimethyl-heptansäure (78)
  • Der allgemeinen Prozedur für die Verseifung von Methylester folgend, führten Verbindungen (77) (54 mg, 0,19 mmol) zu Verbindungen (78) als ein farbloses Öl, ergab 54 mg, 100%. Elektrospray-MS m/z 274 (MH+). Analytische HPLC Rt = 21,44 Minuten (100%).
  • (d) 2S,5RS-2-Amino-5,6-dimethyl-heptansäure-hydrochloridsalz (79)
  • Der allgemeinen Prozedur unter Verwendung von 4 M HCl in Dioxan für N-Boc-Entfernung folgend, führten Verbindungen (78) (54 mg, 0,20 mmol) zu Verbindungen (79) als Feststoff, ergab 40 mg, 97%. Elektrospray-MS m/z 174 (MH+).
  • (e) 2S,5RS-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5,6-dimethyl-heptansäure (80)
  • Der allgemeinen Prozedur für Fmoc-Schutz eines Amins folgend, ergaben Verbindungen (79) (40 mg, 0,19 mmol) nach Aufreinigung durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel und nach Elution mit CHCl3/CH3OH (100:0 zu 95:5, v/v) 2S,5RS-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5,6-dimethyl-heptansäure (80) als Feststoff, ergab 27 mg, 36%. Elektrospray-MS m/z 395 (MH+). Analytische HPLC Rt = 24,52 Minuten (100%), für HRMS C24H29O4NNa berechnete M 418,1994, gefunden: MNa+, 418,1993. (–0,38 ppm)
    δH (500 MHz; CDCl3) 0,73 (6H, m, (CH 3)2CH), 0,82 (3H, d, J 6,5, (CH3)2CHCH(CH 3)), 1,23 (1H, m, (CH3)2CHCH(CH3)CH 2A), 1,39 (1H, m, (CH3)2CHCH(CH3)CH 2B), 1,55 (2H, m, (CH3)2CHCH(CH3) und (CH3)2CHCH(CH3)CH2CH 2A, 1,63 (1H, m, (CH3)2CHCH(CH3)), 1,90 (1H, m, (CH3)2CHCH(CH3)CH2CH 2B, 4,18 (1H, t, J 6,5, CH-Fmoc), 4,40 (3H, m, NHCHCO2H und CH2O), 5,30 (1H, br d, J 8, NH-Fmoc), 7,27 (2H, m, H-2' und H-7'), 7,37 (2H, m, H-3' und H-6'), 7,56 (2H, m, H-1' und H-8') und 7,75 (2H, d, J 7, H-4' und H-5')
    δC (125 MHz; CDCl3) 14,91 (CH3)2CHCH(CH3)), 17,49 und 17,73 ((CH3)2ACH), 19,93 und 20,05 ((CH3)2BCH), 28,08 ((CH3)2 CH), 29,26 und 29,44 ((CH3)2CHCH(CH3)CH2 CH2), 30,04 und 30,17 ((CH3)2CHCH(CH3)CH2CH2), 31,38 und 31,68 ((CH3)2CHCH(CH3)), 37,89 und 38,07 (NHCHCO2H), 46,88 (CH-1'), 66,84 (CH2O), 119, 72 (CH-5' und CH-10'), 124,80 (CH-4' und CH-11'), 126,81 (CH-6' und CH-9'), 127,46 (CH-3' und CH-12'), 141,05 (C-7' und C-8'), 143,47 (C-2' und C-13') und 155,89 (OCONH). Das quaternäre Signal für die Carbonsäure wurde nicht beobachtet.
  • (f) 2S-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,4,5-trimethyl-hexansäure-methylester (81)
  • Der allgemeinen Prozedur für Alkenhydrierung folgend, ergab 2S-2-tert-butyloxycarbonylamino-4,4,5-trimethyl-hex-5-ensäure-methylester (76) (51 mg, 0,18 mmol) Verbindung (81) als ein farbloses Öl, ergab 46 mg, 90%. Elektrospray-MS m/z 288 (MH+). Analytische HPLC Rt = 22,91 Minuten (100%).
  • (g) 2S-2-tert-Butoxycarbonylamino-4,4,5-trimethyl-hexansäure (82)
  • Der allgemeinen Prozedur für die Verseifung von Methylester folgend, ergab Verbindung (81) (46 mg, 0,16 mmol) Verbindung (82) als ein farbloses Öl, ergab 44 mg, 100%. Elektrospray-MS m/z 274 (MH+).
  • (h) 2S-2-Amino-4,4,5-trimethyl-hexansäure-hydrochloridsalz (83)
  • Der allgemeinen Prozedur unter Verwendung von 4 M HCl in Dioxan für N-Boc-Entfernung folgend, ergab Verbindung (82) (44 mg, 0,16 mmol) Verbindung (83) als Feststoff, ergab 33 mg, 99%. Elektrospray-MS m/z 174 (MH+).
  • (i) 2S-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4,4,5-trimethyl-hexansäure (84)
  • Der allgemeinen Prozedur für Fmoc-Schutz eines Amins folgend, ergab Verbindung (83) (33 mg, 0,16 mmol) nach Aufreinigung durch Flash-Chromatographie über ein Silicagel und Elution mit CHCl3/CH3OH (100:0 zu 95:5, v/v) 2S-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4,4,5-trimethyl-hexansäure (84) als Feststoff, ergab 20 mg, 32%. Elektrospray-MS m/z 396 (MH+). Analytische HPLC Rt = 24,28 Minuten (100%). Für HRMS C24H29O4NNa berechnete M 418,1994, gefunden: MNa+, 418,1993. (–0,38 ppm)
    δH (500 MHz; CDCl3) 0,93 (9H, m, (CH 3)2CHC(CH 3)2A), 0,98 (3H, s, (CH3)2CHC(CH 3)2B), 1,48 (1H, dd, J 14, 10, (CH3)2CHC(CH3)2CH 2A), 1,57 (1H, m, (CH3)2CH), 1,91 (1H, d, J 14, (CH3)2CHC(CH3)2CH 2B), 4,21 (1H, t, J 6,5, CH-Fmoc), 4,40 (3H, m, NHCHCO2H und CH2O), 5,10 (1H, br d, J 7,5, NH-Fmoc), 7,27 (2H, m, H-2' und H-7'), 7,36 (2H, m, H-3' und H-6'), 7,57 (2H, m, H-1' und H-8') und 7,74 (2H, d, J 7, H-4' und H-5')
    δC (125 MHz; CDCl3) 17,01 ((CH3)2ACH), 17,16 ((CH3)2BCH), 23,69 ((CH3)2CHC(CH3)2A), 24,27 ((CH3)2CHC(CH3)2B), 35,27 ((CH3)2CHC(CH3)2), 35,73 ((CH3)2 CH), 41,88 ((CH3)2CHC(CH3)2 CH2), 46,93 (CH-1'), 54,20 (NHCHCO2H), 66,79 (CH2O), 119,70 (CH-5' und CH-10'), 124,78 (CH-4' und CH-11'), 126,79 (CH-6' und CH-9'), 127,44 (CH-3' und CH-12'), 141,05 (C-7' und C-8'), 143,61 (C-2' und C-13') und 155,68 (OCONH). Das quaternäre Signal für die Carbonsäure wurde nicht beobachtet.
  • Allgemeine Festphasenprozeduren
  • Moleküle wurden unter Verwendung der Furanon- und Pyranonbausteine und der neu geschützten Aminosäuren, die vorher beschrieben wurden, angeordnet, durch Festphasenprozeduren auf ein vielpoliges Chiron („Chiron multipins") den Protokollen, die unten detailliert beschrieben werden, folgend.
  • Zubereitung von Baustein-Linker-Konstrukten
  • Allgemeines Verfahren für die Synthese von Dihydro-3(2H)-furanon-Linker-Konstrukten – siehe Schema 5 oben
  • Dihydro-3(2H)-furanon (18, 24–28), (1,0 Äq) wurde in einer Mischung von Ethanol/Wasser (7:1 v/v, 10 mL pro mmol Verbindung), das Natriumacetattrihydrat (1,5 Äq) enthielt, gelöst. 4-[[(hydrazinocarbonyl)amino]methyl]-cyclohexancarbonsäure-trifluoracetat (MW 329,3, 1,0 Äq) (siehe Murphy, A. M., et al, J. Am. Chem. Soc, 114, 3156–3157, 1992) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde unter Rückfluss für 2 Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde dann gekühlt, im Trichlormethan (100 mL pro mmol Verbindung) gefüllt, und Wasser (100 mL) wurde zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und wieder mit gesättigter Lauge gewaschen (100 mL). Die organische Schicht wurde getrocknet (Na2SO4), gefiltert und im Vakuum abgedampft, so dass ein weißer Feststoff erhalten wurde. Ergab 85–105% Rohgewicht. Konstrukte (29–34) wurden ohne weitere Aufreinigung verwendet.
  • Zubereitung einer Kronenanordnung
  • Die Verbindungen wurden in paralleler Herstellung synthetisiert, wobei die geeigneten beladenen Fmoc-Baustein-Linker-DA/MDA abgeleiteten Makrokronen (siehe oben) verwendet wurden, die mit etwa 3,5–9,1 mmol pro Krone beladen wurden. Vor der Synthese wurde jede Krone mit seinem entsprechenden Stamm verbunden und in den 8 × 12 Stammhalter („stem holder") gefüllt. Kopplung der Aminosäuren erfolgte nach Fmoc-Aminosäurechemie-Standard, wie er in „Solid Phase Peptide Synthesis", E. Atherton und R. C. Sheppard, IRL Press Ltd, Oxford, UK, 1989, beschrieben wurde.
  • Entfernung des Nα-Fmoc-Schutzes
  • Ein 250 mL Lösungsmittel resistentes Bad wird mit 200 mL einer 20% Piperidin/DMF-Lösung gefüllt. Die vielpolige Anordnung („multipin assembly") wird zugegeben, und Entschützung wird gestattet, für 30 Minuten stattzufinden. Die Anordnung wird dann entfernt, und überschüssiges Lösungsmittel wird durch kurzes Schütteln entfernt. Die Anordnung wird dann nacheinander mit (jeweils 200 mL), DMF (5 Minuten) und MeOH (5 Minuten, 2 Minuten, 2 Minuten) gewaschen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, damit es an der Luft trocknen kann.
  • Quantitative UV-Messung der Fmoc-Chromophor-Freisetzung
  • Eine UV-Zelle mit einer Weglänge von 1 cm wird mit 1,2 mL einer 20% Piperidin/DMF-Lösung gefüllt, und dazu verwendet, um die Absorption eines UV-Spektrometers bei einer Wellenlänge von 290 nm auf 0 zu setzen. Ein UV-Standard wurde dann zubereitet, der aus 5,0 mg Fmoc-Asp(OBut)-Pepsin KA (0,08 mmol/g) in 3,2 mL einer 20% Piperidin/DMF-Lösung besteht. Dieser Standard gibt eine Abs290 = 0,55–0,65 (bei Raumtemperatur). Ein Aliquot der vielpoligen Entschützungslösung („multipin deprotection solution") wurde dann in geeigneter Weise verdünnt, um eine theoretische Abs290 = 0,6 zu erhalten, und dieser Wert verglichen mit der aktuell experimentell gemessenen Absorption zeigt die Effizienz der vorherigen Kopplungsreaktion an.
  • Standardkopplung von Aminosäure-Rückständen
  • Kopplungsreaktionen wurden durch das Beladen von geeigneten Löchern einer Polypropylen 96 Lochplatte mit dem Muster der aktivierten Lösungen, das während einer Kopplungsrunde benötigt wird, durchgeführt. Makrokronenstandardkopplungen wurden in DMF (500 μL) durchgeführt.
  • Kopplung eines Aminosäure-Rückstandes an das dazugehörige Loch
  • Während die vielpolige Anordnung trocknet, wurden geeignete Nα-Fmoc Aminosäure pfp-Ester (10 Äquivalente berechnet nach der Beladung jeder Krone) und HOBt (10 Äquivalente), die für die einzelne Kopplungsrunde benötigt sind, akkurat in dazugehörige Behälter gewogen. Alternativ werden die dazugehörigen Nα-Fmoc Aminosäuren (10 Äquivalente berechnet nach der Beladung jeder Krone), der gewünschte Kopplungswirkstoff, wie HBTU (9,9 Äquivalente berechnet nach der Beladung jeder Krone), und die Aktivierung, wie HOBt (9,9 Äquivalente berechnet nach der Beladung jeder Krone), NMM (19,9 Äquivalente berechnet nach der Beladung jeder Krone), akkurat in dazugehörige Behälter gewogen.
  • Die geschützten und aktivierten Fmoc-Aminosäurederivate werden dann in DMF (500 μL für jede Makrokrone, zum Beispiel würden für 20 Makrokronen, 20 × 10 Äq × 7 μmol des Derivates in 10 mL DMF aufgelöst werden) gelöst. Die geeigneten Derivate werden dann in die dazugehörigen Löcher verteilt, die für den Beginn des „Kopplungszyklus" bereit sind. Als Standard wurde den Kopplungsreaktionen gestattet, für 6 Stunden stattzufinden. Die gekoppelte Anordnung wurde dann wie unten beschrieben gewaschen.
  • Waschschritte im Anschluss an die Kopplung
  • Wenn eine 20% Piperidin/DMF Entschützung unmittelbar dem Kopplungszyklus folgen soll, dann wird die vielpolige Anordnung kurz geschüttelt, um das überschüssige Lösungsmittel zu entfernen, wird nacheinander mit (jeweils 200 mL), MeOH (5 Minuten) und DMF (5 Minuten) gewaschen und entschützt. Wenn die vielpolige Anordnung länger gelagert werden soll oder länger reagieren soll, dann wird ein vollständiger Waschzyklus bestehend aus kurzem Schütteln, dann nacheinander waschen mit (jeweils 200 mL), DMF (5 Minuten) und MeOH (5 Minuten, 2 Minuten, 2 Minuten) durchgeführt.
  • Zugabe einer bedeckenden Gruppe
  • Während die vielpolige Anordnung trocknet, wird die geeignete Säure bedeckende Gruppe (10 Äquivalente berechnet nach der Beladung jeder Krone), der gewünschte Kopplungswirkstoff, wie HBTU (9,9 Äquivalente berechnet nach der Beladung jeder Krone), und die Aktivierung, wie HOBt (9,9 Äquivalente berechnet nach der Beladung jeder Krone), NMM (19,0 Äquivalente berechnet nach der Beladung jeder Krone), sorgfältig in einen geeigneten Behälter gewogen. Die Säurederivate/Kopplungswirkstoffe werden dann in DMF (500 μL für jede Makrokrone, zum Beispiel würden für 20 Makrokronen, 20 × 10 Äq des Derivates in 10 mL DMF gelöst werden) gelöst und dann für 5 Minuten zur Aktivierung stehengelassen. Die geeigneten Derivate werden dann auf die dazugehörigen Löcher verteilt und sind für den Beginn des „Bedeckungszykluses" bereit. Als Standard wird der Bedeckungsreaktion erlaubt, für 18 Stunden über Nacht stattzufinden. Die Bedeckungsanordnung wurde dann wie unten beschrieben gewaschen.
  • Säurelytisch vermittelte Spaltung einer Molekülpol-Anordnung
  • Säurevermittelte Spaltungsprotokolle werden strikt unter einem Abzug durchgeführt. Eine Polystyrol 96 Lochplatte (1 mL/Loch) wird markiert und so genau wie möglich auf 1 mg gewogen. Dazugehörige Löcher werden dann mit einer Trifluoressigsäure/Wasser (95:5, v/v, 600 μL) Spaltungslösung in einem Muster, das mit dem der vielpoligen Anordnung korrespondiert, beladen, um gespalten zu werden.
  • Die vielpolige Anordnung wird zugegeben, und das gesamte Konstrukt wird mit Aluminiumfolie bedeckt und für 2 Stunden stehengelassen. Die vielpolige Anordnung wird dann zu einer anderen Polystyrol 96 Lochplatte (1 mL/Loch) zugegeben, die Trifluoressigsäure/Wasser (95:5, v/v, 600 L) enthält, (wie oben) für 5 Minuten zugegeben.
  • Verarbeitung der gespaltenen Moleküle
  • Die erste Polystyrol Spaltungsplatte (2 Stunden-Spaltung) und die zweite Polystyrolplatte (5 Minuten Waschschritt) werden dann in den GeneVac-Evaporator platziert, und die Lösungsmittel für 90 Minuten entfernt (minimale Trocknungsrate). Die Inhalte der zweiten Polystyrolplatte werden dann zu ihren korrespondierenden Löchern auf der primären Platte unter Verwendung einer Acetonitril/Wasser (50:50, v/v/v)-Lösung (3 × 150 μL) transferriert, und die verbrauchte Platte wird verworfen. Aliquots (5–20 L) werden für eine Analyse abgenommen. Die Platte wurde mit Alufolie bedeckt, die Alufolie wurde über den Löchern, die die Verbindungen enthalten, angepiekst, die Platte wurde in ein Gefrierfach für 1 Stunde platziert, dann lyophilisiert.
  • Analyse und Aufreinigung der Moleküle
  • Die (5–20 L) Aliquots werden durch analytische HPLC und Elektrospray-MS analysiert. In geradezu allen Fällen betrugen die Rohreinheiten gemäß HPLC mit der gewünschten m/z über 90%. Die Proben wurden durch halbpräparative reverse Phasen HPLC unter Verwendung von Vydac C4 aufgereinigt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und in aufgewogenen 10 mL Glasfläschchen lyophylisiert und dann wieder gewogen. Moleküle wurden auf einer 15–90 μmol-Skala zubereitet, was 2,0–26,0 mg der aufgereinigten Produkte ergab. Die Reinheit von allen Produkten wurde mittels analytische HPLC mit über 95% (215 nm UV-Detektion) bestätigt und ergab bei der Elektrospray-Massen-Spektrometrie-Analyse die dazugehörige [MH]+.
  • Beladen der Makrokronen mit den Konstrukten
  • Allgemeines Verfahren für das Beladen der Vielpole („multipins") mit Dihydro-3(2H)-furanon-Linker-Konstrukten (29–34)
    Amino-funktionalisierte DA/MDA Makrokronen (ex Chiron Mimotopes, Australien, 9,1 μmol Beladung) oder Amino-funktionalisierte HEMA-Apparaturen („HEMA gears") (ex Chiron Mimotopes, Australien, 1,3 μmol Beladung) wurden für alle Beladungen und nachfolgenden Festphasensynthesen verwendet.
  • Dihydro-3(2H)-furanon-Linker-Konstrukt (29–34) (3 Äq im Vergleich zur gesamten Oberflächenfunktionalisierung der Kronen/Apparaturen) wurde durch 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (3 Äq), 1-Hydroxybenzotriazol (3 Äq) und N-methylmorpholin (6 Äq) in Dimethylformamid (5 mL) für 5 Minuten carboxylaktiviert. Diese Mischung wurde zu den Kronen/Apparaturen zugegeben, zusätzliches wurde DMF zugegeben, um die Reaktionsoberfläche zu bedecken, und das Gemisch wurde über Nacht stehengelassen.
  • Standardwaschschritte und Fmoc-Entschützungsmessungen (siehe die Verfahren oben) zeigten wirklich das quantitative Beladen auf.
  • Beispielmoleküle, die durch die Verfahren zubereitet wurden, in denen das betreffende Furanon, die R3 Aminosäure und die Bedeckungsgruppe in dem oben im Detail beschriebenen Verfahren gezeigt ist, sind in Tabelle 1 gezeigt:
    Elektrospray-MS m/z (MH+) Name
    385 Benzofuran-2-carbonsäure-[1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-cyclohexyl]-amid
    383 Benzofuran-2-carbonsäure-[1-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-cyclohexyl]-amid
    371 Benzofuran-2-carbonsäure-[2-cyclopropyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-ethyl]-amid
    398 N-[3-Methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-4-pyrrol-1-yl-benzamid
    383 Naphthalen-1-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    373 Benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    389 Benzo[b]thiophen-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    403 5-Methoxy-benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    401 5-Methoxy-benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-but-3S-enyl]-amid
    390 4-Acetylamino-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    448 4-Hydroxy-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-3-morpholin-4-ylmethyl-benzamid
    446 4-Hydroxy-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-3-morpholin-4-ylmethyl-benzamid
    409 Biphenyl-4-Carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    389 4-tert-Butyl-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    387 4-tert-Butyl-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-benzamid
    390 4-Guanidino-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    388 4-Guanidino-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-benzamid
    502 5-(2-Morpholin-4-yl-ethoxy)-benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    500 5-(2-Morpholin-4-yl-ethoxy)-benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-but-3-enyl]-amid
  • Zusätzliche Verbindungen der Erfindung wurden wie folgt zubereitet:
  • i) Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-4-pyrrolidin-1-yl-benzamid
    Figure 00640001
  • Dem Verfahren nach Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzosäure" durch die „Modell-Carbonsäure" substituiert wurde, folgend. Diese Säuren wurden durch das Durchführen zweier Reaktionen zubereitet: Die anfänglichen Ester wurden unter Verwendung von Buchwald type chemistry zubereitet, und die nachfolgende Standardhydrolyse der Ester stellte die benötigten Säuren zur Verfügung.
  • a. 4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester
  • Ein im Ofen getrocknetes Reaktionsgefäß wurde mit Cäsiumcarbonat (2,12 g, 6,51 mmol) beladen, das durch Pistill und Mörser unter einer Argonatmosphäre fein gemahlen wurde. Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (42,5 mg, 1,5 mol%) und (S)-(–)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl (43,4 mg, 1,5 mol%) wurden zugegeben und das Gefäß wurde mit Argon beladen. Pyrrolidin (0,39 g, 5,58 mmol), Methyl-4-brombenzoat (1,00 g, 4,65 mmol) und Toluol (10 mL) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde auf 100°C unter starkem Rühren erhitzt, bis das Startmaterial aufgebraucht wurde, wie durch HPLC bewertet wurde. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, mit Ether (20 mL) verdünnt, gefiltert und ankonzentriert. Aufreinigung durch Säulenchromatographie ergab die oben genannte Verbindung (0,80 g, 84%) als Feststoff. MS (M + H+): 206.
  • b. 4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäuresalz
  • 4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester (200 mg, 0,98 mmol) wurde in Methanol (4 mL) gelöst, und Natriumhydroxid (39 mg, 0,98 mmol) in Wasser (2 mL) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde auf 60°C erhitzt, bis das Startmaterial aufgebraucht wurde, wie durch HPLC bewertet wurde. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, mit Wasser (20 mL) verdünnt, gefiltert und gefriergetrocknet, um die oben genannte Verbindung (0,200 g, 97%) als Feststoff zu erhalten. MS (M + H+): 192.
  • Ein alternatives Verfahren ist unten beschrieben:
    4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester (200 mg, 0,98 mmol) wurde in konzentrierter Hydrochlorsäure:Wasser (1:1) (4 mL) gelöst. Das Gemisch wurde beim Rücklauf erhitzt, bis das Startmaterial aufgebraucht wurde, wie durch HPLC bewertet wurde. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, mit Wasser verdünnt (10 mL), gefiltert und gefriergetrocknet, um die oben genannte Verbindung (0,190 g, 97%) als Feststoff zu erhalten. MS (M + H+): 192
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-4-piperidin-1-yl-benzamid
    Figure 00650001
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt c), außer der Substitution von „4-Piperidin-1-yl-benzoesäure", folgend.
  • 4-Piperidin-1-yl-benzoesäure Methylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Pyrrolidin" durch „Piperidin" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 220.
  • a. 4-Piperidin-1-yl-benzoesäuresalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „4-Piperidin-1-yl-benzoesäure-methylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 206.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-4-morpholin-4-yl-benzamid
    Figure 00660001
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), außer der Substitution von „4-Morpholin-4-yl-benzoesäure", folgend.
  • 4-Morpholin-4-yl-benzoesäure-methylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Pyrrolidin" durch „Morpholin" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 222.
  • a. 4-Morpholin-4-yl-benzoesäuresalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „4-Morpholin-4-yl-benzoesäure-methylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 208.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-4-(4-methyl-piperazin-1-yl)-benzamid
    Figure 00660002
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme der Substitution von „4-Methyl-piperazin-1-yl-benzoesäure", folgend.
  • 4-Methyl-piperazin-1-yl-benzoesäure-methylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Pyrrolidin" durch „4-Methyl-piperazin" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 235.
  • a. 4-Methyl-piperazin-1-yl-benzoesäuresalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „4-Methyl-piperazin-1-yl-benzoesäure-methylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 221.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-yl-carbamoyl)-butyl]-4-(2-morpholin-4-yl-ethylamino)-benzamid
    Figure 00670001
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme der Substitution von „4-(2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-benzoesäure" folgend.
  • a. 4-(2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-benzoesäure-methylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Pyrrolidin" durch „2-Morpholin-4-yl-ethylamin" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 265.
  • b. 4-(2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-benzoesäuresalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „4-(2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-benzoesäure-methylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 251.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-4-piperazin-1-yl-benzamid
    Figure 00670002
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme der Substitution von „4-(4-Carboxy-phenyl)-piperazin-1-carbonsäure-tert-butyl-ester" folgend.
  • a. 4-(4-Methoxycarbonyl-phenyl)-piperazin-1-carbonsäure-tert-butyl-ester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Pyrrolidin" durch „Piperazin-1-carbonsäure-tert-butyl-ester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 321.
  • b. 4-(4-Carboxy-phenyl)-piperazin-1-carbonsäure-tert-butyl-estersalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „4-(4-Methoxycarbonyl-phenyl)-piperazin-1-carbonsäure-tert-butyl-ester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 307.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-3-pyrrolidin-1-yl-benzamid
    Figure 00680001
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme, dass „2-Benzofuran-carbonsäure" durch „ 3-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure" substituiert wurde, folgend.
  • a. 3-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Methyl-4-brombenzoat" durch „Methyl-3-brombenzoat" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 206.
  • b. 3-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäuresalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „3-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 192.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-3-piperidin-1-yl-benzamid
    Figure 00690001
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme, dass „2-Benzofuran-carbonsäure" durch „3-Piperidin-1-yl-benzoesäure" substituiert wurde, folgend.
  • a. 3-Piperidin-1-yl-benzoesäure-methylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Pyrrolidin" durch „Piperidin" und „Methyl-4-brombenzoat" durch „Methyl-3-brombenzoat" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 220.
  • b. 3-Piperidin-1-yl-benzoesäuresalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „3-Piperidin-1-yl-benzoesäure-methylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannten Verbindung: MS (M + H+): 206.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-3-morpholin-4-yl-benzamid
    Figure 00690002
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme der Substitution von „3-Morpholin-4-yl-benzoesäure" folgend.
  • a. 3-Morpholin-4-yl-benzoesäure-methylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Pyrrolidin" durch „Morpholin" und „Methyl-4-brombenzoat" durch „Methyl-3-brombenzoat" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 222.
  • b. 3-Morpholin-4-yl-benzoesäuresalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „3-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „3-Morpholin-4-yl-benzoesäure-methylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 208.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-3-(4-methyl-piperazin-1-yl)-benzamid
    Figure 00700001
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme, dass „2-Benzofuran-carbonsäure" durch „3-Methyl-piperazin-1-yl-benzoesäure" substituiert wurde, folgend.
  • a. 3-Methyl-piperazin-1-yl-benzoesäure-methylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Pyrrolidin" durch „4-Methyl-piperazin" und „Methyl-4-brombenzoat" durch „Methyl-3-brombenzoat" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 235.
  • b. 3-Methyl-piperazin-1-yl-benzoesäuresalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „3-Methyl-piperazin-1-yl-benzoesäure-methylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 221.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-3-(2-morpholin-4-yl-ethylamino)-benzamid
    Figure 00700002
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme, dass „2-Benzofuran-carbonsäure" durch „3-(2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-benzoesäure" substituiert wurde, folgend.
  • a. 3-(-2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-benzoesäure-methylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass "Pyrrolidin" durch „2-Morpholin-4-yl-ethylamin" und „Methyl-4-brombenzoat" durch „Methyl-3-brombenzoat" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 265.
  • b. 3-(2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-benzoesäuresalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „3-(2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-benzoesäure-methylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 251.
  • Zubereitung von N-[3-Methyl-1-(2-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3-ylcarbamoyl)-butyl]-3-piperazin-1-yl-benzamid
    Figure 00710001
  • Dem Verfahren von Beispiel 1 Schritt d), mit Ausnahme der Substitution von „4-(3-Carboxy-phenyl)-piperazin-1-carbonsäure-tert-butylester" folgend.
  • b. 3-(4-Methoxycarbonyl-phenyl)-piperazin-1-carbonsäure-tert-butylester
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „Pyrrolidin" durch „Piperazin-1-carbonsäure-tert-butylester" und „Methyl-4-brombenzoat" durch "Methyl-3-brombenzoat" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 321.
  • b. 4-(4-Carboxy-phenyl)-piperazin-1-carbonsäure-tert-butylestersalz
  • Dem Verfahren oben, mit Ausnahme, dass „4-Pyrrolidin-1-yl-benzoesäure-methylester" durch „4-(4-Methoxycarbonyl-phenyl)-piperazin-1-carbonsäure-tert-butylester" substituiert wurde, folgend, ergab die oben genannte Verbindung: MS (M + H+): 307.
  • Biologische Beispiele
  • Bestimmung der Cathepsin-K proteolytisch katalytischen Aktivität
  • Geeignete Assays für Kathepsin-K werden unter Verwendung eines humanen rekombinanten Enzyms durchgeführt. Standard-Assay-Bedingungen für die Bestimmung von kinetischen Konstanten verwendeten ein fluoreszierendes Peptidsubstrat, typischerweise H-D-Ala-Leu-Lys-AMC, und wurden in entweder 100 mM Mes/Tris, pH 7,0, das 1 nM EDTA und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthält, oder in 100 nM Na-Acetat, pH 5,5, das 5 nM EDTA und 20 mM Cystein enthält, bestimmt. Die verwendete Enzymkonzentration betrug 5 nM. Die Vorratssubstratlösung wurde zu 10 mM in DMSO zubereitet. Die Durchmusterungen wurden bei einer festgelegten Substratkonzentration von 60 μM durchgeführt, und detaillierte kinetische Studien mit doppelten Verdünnungen des Substrats von 250 μM. Die gesamte DMSO-Konzentration in dem Assay wurde unter 3% gehalten. Alle Assays wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Produktfluoreszenz (Anregung bei 390 nm, Emission bei 460 nm) wurde mit einem Labsystems Fluoroskan Ascent Fluoreszent Plattenleser überwacht. Produktentwicklungskurven wurden über 15 Minuten erzeugt, der Erzeugung des AMC-Produktes folgend.
  • Inhibitionsstudien
  • Potenzielle Inhibitoren wurden unter Verwendung des oben genannten Assays mit variablen Konzentrationen der Testverbindung durchmustert. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe des Enzyms zu den gepufferten Lösungen des Substrats und Inhibitors gestartet. Ki-Werte wurden gemäß Gleichung 1 berechnet
    Figure 00720001
    wobei ν0 die Geschwindigkeit der Reaktion ist, V ist die maximale Geschwindigkeit, S ist die Konzentration des Substrats mit der Michaelis-Konstante von KM, und I ist die Konzentration des Inhibitors.
  • In diesem Assay haben die Verbindungen, die in Tabelle 1 abgebildet wurden, einen Ki-Wert von pH 7 in dem Bereich von 10 nM bis 250 nM und besitzen deshalb einen Nutzen in der Behandlung oder Prophylaxe von Funktionsstörungen, in denen Kathepsin K impliziert ist, wie Osteoporose, Zahnfleischerkrankungen, wie Gingivitis und Periodentitis, Paget-Krankheit, Hypercalcämia eines bösartigen Tumors, metabolische Knochenkrankheit, Osteoarthritis, rheumatische Arthritis und Metastasen-bildende Neoplastien.
  • Klonierung und Expression von Falcipain II
  • Herstellung von Falcipain 2
  • Klonierung
  • Die Desoxynukleotidoligonukleotide:
    (SEQ ID NR: 1)
    5'CGCGGATCCGCCACCATGGAATTAAACAGATTTGCCGAT-3' und
    (SEQ ID NR: 2)
    5'CGCGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGTTCAATTAATGGAATGAATGCATCAGT-3' wurden basierend auf die Sequenzen, die basierend auf den Sequenzen, die am Sanger Zentrum, Cambridge, UK hinterlegt wurden, entworfen
    (http://www.sanger.ac.uk/Projects/P_falciparum/blast_server.shtml). Diese Oligonukleotide wurden entworfen, um einen Teil der cDNA-Sequenz der Cysteinyl-Proteinase zu amplifizieren, welche nun als Falcipain 2 bekannt ist, und um entsprechende terminale Klonierungsenzymstellen und eine carboxyterminale Hexahistidin-kodierende Sequenz direkt stromaufwärts des Stopkodons einzuschließen.
  • Polymerase Kettenreaktion wurde mit den oben genannten Oligonukleotiden und Plasmodium flaciparum-Phagen Bibliotheks-DNA als eine Matrize unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt; 94°C für 2 Minuten, dann 35 Zyklen bei 94°C für 10 Sekunden, 50°C für eine Minute und 60°C für 2 Minuten, dem folgte eine 5-minütige Inkubation bei 60°C. Das 880 bp PCR-Amplifikat wurde aufgereinigt und unter Verwendung einer T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert. Diese DNA wurde dann in einen mit EcoR5-geschnittenen, dephosphorylierten Bluescript II Klonierungsvektor ligiert und in DH5 alpha E. coli transformiert. Die DNA-Sequenz des Plasmidinserts in isolierten rekombinanten E. coli-Klonen wurde unter Verwendung eines Amersham Megabace Sequenzierungsinstruments bestimmt. Um einen authentischen ORF herzustellen, wurde eine 3-Wege-Ligation durchgeführt, um den N-Terminus des verkürzten Falcipain 2 (NcoI/NdeI), den C-Terminus des Falcipain 2 (NdeI/BamHI) und den Vektor pQE-60 (NcoI/BamHI) zusammenzubringen.
  • Nukleotidsequenz von TF2.10 (SED ID NR: 3):
  • Figure 00740001
  • Kode für die Proteinsequenz (SEQ ID NR: 4):
  • Figure 00740002
  • Das TF2.10-Insert wurde aus dem pQE-60-Vektor unter Verwendung der Restriktionsenzyme NcoI und BamHI rausgeschnitten, in einen NcoI/BamHI geschnittenen Expressionsvektor pET-11D ligiert und in DH5 alpha E. coli transformiert. Die Gegenwart eines rekombinanten Expressionsplasmids (pET-TF2.10) in einer isolierten E. coli-Kolonie wurde durch einen Restriktionsenzymverdau der Plasmid-DNA bestätigt. BL21(DE3) E. coli wurde mit pET-TF2.10 transformiert und für die Expression der rekombinanten Cysteinylproteinase verwendet.
  • Proteinexpression
  • pET-TF2.10-transformierte BL21(DE3) E. coli (BLTF2.10)-Zellen wurden über Nacht bei 200 rpm, 37°C in einer Luriabroth wachsen gelassen, die 100 μg/mL Ampicillin enthält. Frisches Medium wurde dann inokuliert und bis auf eine OD600nm von 0,8 wachsen gelassen, bevor die Proteinexpression unter Verwendung von 1 mM IPTG induziert wurde. Die Induktion wurde für 3 Stunden bei 200 rpm, 37°C durchgeführt, dann wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation geerntet und bei –80°C aufbewahrt, bis die Proteinaufreinigung durchgeführt wurde.
  • Proteinaufreinigug und und Rückfaltung
  • Ein E. coli-Zellpellet einer 250 mL-Kultur entsprechend wurde durch Resuspension in einem Solubilisierungspuffer (6 M Guanidin Hydrochlorid, 20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0) für 30 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Nach Zentrifugation bei 12000 g für 10 Minuten bei 4°C wurde das klare Lysat zu 1 mL Nickel-NTA-Agarose zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur bewegt.
  • Proteinrückfaltungsverfahren 1
  • Das an der Nickel-NTA gebundene Protein wurde im Batch mit 6 M Guanidin Hydrochlorid, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM NaCl dann 8 M Harnstoff, Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NaCl dann 8 M Harnstoff, Tris-HCl, pH 8,0 einschließlich 30 mM Imidazol gewaschen, und die Proteinelution wurde unter Verwendung von 8 M Harnstoff, Tris-HCl, pH 8,0 mit 1 M Imidazol durchgeführt. Das eluierte Protein wurde dann 100-fach in einem Rückfaltungspuffer (100 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 20% Glycerin, 250 mM L-Arginin, 1 mM reduziertes Glutathion, 0,1 mM oxidiertes Glutathion, pH 8,0) verdünnt und rührend über Nacht bei 4°C stehengelassen. Das Protein konnte dann entweder durch Filterzentrifugation, oder durch Rückaufreinigung unter Verwendung einer Nickel-Agarosesäule (nach der Dialyse, um das EDTA zu entfernen) ankonzentriert werden.
  • Proteinrückfaltungsverfahren 2
  • Das an die Nickel-NTA gebundene Protein wurde im Batch mit 8 M Harnstoff, Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8,0 dann 8 M Harnstoff, Tris-HCl, pH 8,0 einschließlich 20 mM Imidazol, dann 2 M Harnstoff, Tris-HCl, pH 8,0 gewaschen. Das Protein wurde dann auf einer Säule durch Zugabe von 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM L-Arginin, 1 mM reduziertes Glutathion, 0,1 mM oxidatiertes Glutathion mit einer Inkubation bei 4°C rückgefaltet, und die Proteinelution wurde unter Verwendung von 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 mit 0,5 M Imidazol durchgeführt.
  • Unter Verwendung des Proteinrückfaltungsverfahrens 1 wurde sofort aktive (reife) Proteinase erhalten, und durch Filterzentrifugation wurde das verdünnte rückgefaltete Enzym ankonzentriert. Dieses Verfahren resultierte jedoch in ein hohes Ausmaß an Enzymverlust aufgrund der Autoproteolyse. Sowohl die Ankonzentrierung des rückgefalteten Proteins unter Verwendung des Verfahrens 1 durch Nickelsäulenaufreinigung, als auch die Verwendung des Rückfaltungsverfahrens 2 resultierten in einer größeren Rückgewinnung des Enzyms in seiner stabilen inaktiven Proform. Die Proform könnte auch verwendet werden, um reifes aktives Falcipain 2, nach Inkubation bei 37°C, zu erzeugen.
  • Das C-markierte Konstrukt, wie oben unterstrichen, ermöglichte schnelle Ankonzentrierung und Rückgewinnung nach der Proteinrückfaltung und umgeht Probleme mit der Autoproteolyse. Im Gegensatz zu den N-markierten Konstrukten, die in Shenai et al J Biol Chem 275 37 29000–29010m beschrieben wurden, können die hier beschriebenen Konstrukte auf der Oberfläche einer unlöslichen Matrix rückgefaltet werden, zum Beispiel durch die Bindung an eine Aufreinigungssäule. Zusätzlich kann die Proregion als ein Enzym agieren, das analoge Sequenzen zu dem nativen Enzym inaktiviert, wodurch die Arbeit mit dem Enzym vorhersehbarer wird, das heißt das stabile inaktive Enzym kann zum Beispiel kontrolliert, wenn nötig, aktiviert werden. Eine N-terminale Markierung würde dazu tendieren, diese normale Funktion des Enzyms zu verhindern, wie es für die Proregion des Enzyms möglich sein sollte, unabhängig so zu falten, dass der Faltungsstatus der reifen Enzymdomäne erreicht wird. Die Markierung, die hierin beschrieben wurde, erlaubt eine Affinitätsaufreinigung, um die Ausbeuten zu erhöhen, und die Möglichkeiten für die Isolierung stabiler Rohformen des Enzyms zu steigern.
  • Gemäß dazu ist ein enzymatisches aktives Falcipain 2-Konstrukt beschrieben worden, das eine kovalent gebundene C-terminale Markierung umfasst. Die C-terminale Markierung könnte Polyhistidin, zum Beispiel 4–8 Reste, vorzugsweise 6 umfassen. Das oben beschriebene Konstrukt hat die Markierung an dem C-Terminus des Glutaminsäurerestes, aber andere Konstrukte können das Enzym um bis zu 10 kürzen, zum Beispiel 6–8 oder 2–4 Reste und behalten eine nützliche Durchmusterungsaktivität bei. Bevorzugte Konstrukte umfassen die oben aufgezählte Sequenz, optional, wie es hierin beschrieben wurde, an dem C-Terminus verkürzt.
  • Bestimmung der Falcipain 2 proteolytisch katalytischen Aktivität
  • Geeignete Assays für Falcipain 2 werden unter Verwendung des rekombinanten Enyzms, das wie oben zubereitet wurde, durchgeführt. Alternativ wird Falcipain, wie in Sijwali et al Prot Exp Purif 22, 128–134 (2001) beschrieben, durchgeführt. Standardassay-Bedingungen für die Bestimmung von kinetischen Konstanten verwendeten ein fluoreszierendes Peptidsubstrat, typischerweise Boc-Val-Leu-Lys-AMC, und wurden entweder in 100 mM Mes/Tris/Acetat pH 7,0, das 1 M NaCl und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthält, oder in 100 mM Na-Phosphat, pH 5,5, das 1 M NaCl und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthält, bestimmt. Die verwendete Enzymkonzentration betrug 2 nM. Die Vorratssubstratlösung wurde in DMSO zu 10 mM zubereitet. Durchmusterungen wurden bei einer festgelegten Substratkonzentration von 80 μM und detaillierte kinetische Studien mit doppelten Verdünnungen des Substrats von 250 μM durchgeführt. Die gesamte DMSO-Konzentration in dem Assay wurde unter 3% gehalten. Alle Assays wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Produktfluoreszenz (Anregung bei 390 nm, Emission bei 460 nm) wurden mit einem Labsystems Fluoroskan Ascent Fluorescent Plattenleser aufgezeichnet. Produktentwicklungskurven wurden über 15 Minuten erzeugt, der Erzeugung des AMC-Produkts folgend.
  • Inhibitionsstudien
  • Potenzielle Inhibitoren wurden, unter Verwendung des oben genannten Assays mit variablen Konzentrationen der Verbindungen in der Tabelle unten beschrieben, durchgemustert. Diese Verbindungen wurden auf Festphase unter Verwendung der oben hervorgehobenen Methodik zubereitet. Reaktionen wurden durch Zugabe des Enzyms zu gepufferten Lösungen des Substrats und Inhibitors gestartet. Ki-Werte wurden gemäß Gleichung 1 kalkuliert
    Figure 00770001
    wo ν0 die Geschwindigkeit der Reaktion ist, V die maximale Geschwindigkeit, S ist die Konzentration des Substrats mit der Michaelis-Konstante von KM, und I ist die Konzentration des Inhibitors.
  • Die Verbindungen, die in der unten gezeigten Tabelle ausgewählt wurden, zeigten die oben gezeigten Ki-Werte (bei pH 7) zwischen 0,5 μM und 2,7 μM, und sind deshalb in der Prophylaxe oder Behandlung von Parasiteninfektionen oder -befall, wie Malaria, nützlich.
    Naphthalen-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    Benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    5-Methoxy-benzofuran-2-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    4-Acetylamino-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    4-Hydroxy-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-3-morpholin-4-ylmethyl-benzamid
    Biphenyl-4-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
    4-tert-Butyl-N-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-benzamid
    Benzothiazol-5-carbonsäure-[3-methyl-1S-(2R-methyl-4-oxo-tetrahydro-furan-3S-ylcarbamoyl)-butyl]-amid
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Figure 00810001

Claims (13)

  1. Verbindung der Formel (IVa):
    Figure 00820001
    wobei R1 = R'C(O), R'SO2, R' = ein bizyklisches, gesättigtes oder ungesättigtes, 8-12-gliedriges Ringsystem, enthaltend 0–4 Heteroatome, die aus S, O und N ausgewählt sind, wobei das Ringsystem gegebenenfalls mit bis zu vier Substituenten substituiert ist, die unabhängig voneinander aus den Gruppen a), b) und c) unten ausgewählt sind; oder R' = ein monozyklischer, gesättigter oder ungesättigter, 5-7-gliedriger Ring, enthaltend 0–3 Heteroatome, die aus S, O und N ausgewählt sind, wobei der monozyklische Ring wenigstens einen Substituenten trägt, der aus Gruppe a) und c) unten ausgewählt ist und der gegebenenfalls einen oder zwei weitere Substituenten trägt, die aus der Gruppe b) unten ausgewählt sind; a) eine zyklische Gruppe, die direkt an den R'-Ring oder mittels eines Alkyl-, Alkylether-, Alkylthioether-, Alkylamin-, Alkylamid-, Alkylsulfonamid-, Alkylsulphon-, Alkylharnstoff-, Alkylketon- oder Alkylester-Linker umfassend bis zu 6 C-Atome gebunden sein kann; oder b) H, C1-7-Alkyl, C3-6-Cycloalkyl, OH, SH, NH2, NHC1-3-Alkyl, N(C1-3-Alkyl)2, Halogen; oder c) O-C1-4-Alkyl, S-C1-4-Alkyl, SOC1-4-Alkyl, SO2C1-4-Alkyl, CO2C0-4-Alkyl, NHCOC0-4-Alkyl, CONHC0-4-Alkyl, COC0-4-Alkyl, NHC(=NH)NH2; R3 = C1-4-Alkyl, C2-C7-Alkenyl, C3-7-Cycloalkyl, Ar-C1-7-Alkyl, Ar; R5 = C1-7-Alkyl, Ar-C1-7-Alkyl, C0-3-Alkyl-CONR3R4 oder Riv;
    Figure 00830001
    wobei n = 1–3, m = 1–3; Rv, Rvi = H, C1-7-alkyl; A = N, CH; B = N, O, S, CH; Rvii = fehlt wenn B = O, S; oder Rvii = H, C1-7-Alkyl wenn B = N, CH; Rviii = O, C1-7-Alkyl; und pharmazeutisch verträgliche Salze davon, wobei, C1-C7-Alkyl unverzweigte und verzweigt-kettige aliphatische Kohlenstoffketten bedeutet, gegebenenfalls substituiert mit einem oder zwei Halogenen und/oder einem Heteroatom S, O, NH, wo das Heteroatom an einem Kettenende mit 1 oder 2 Wasserstoffatomen oder einem Schwefel, der zum Sulfon oxidiert wurde, substituiert sein kann; C3-6 oder C3-7-Cycloalkyl jede Variation von C1-C7-Alkyl bedeutet; das zusätzlich einen C3-6- oder C3-C7-Carbozyklischen Ring beinhaltet, oder das Cycloalkyl ein Spirorest ist, der an das benachbarte Kohlenstoffatom ohne ein dazwischen liegendes C1-C7-Alkyl gebunden ist; Ar bedeutet Phenyl-, Pyrazolyl-, Pyridyl-, Imidazolyl-, Oxazolyl-, Isoxazolyl-, Thiazinolyl-, Isothiazinolyl-, Thiazolyl-, Oxadiazolyl-, 1,2,3-Triazolyl-, 1,2,4-Triazolyl-, Furanyl- oder Thienyl-aromatischer Ring, gegebenenfalls substituiert mit Halogen, C1-3-Alkyl, OH, OC1-3-Alkyl, SH, SC1-3-Alkyl, Amin; ArC1-7-Alkyl bedeutet, dass das Ar an das entsprechende Kohlenstoffatom durch eine C1-C7-Alkylgruppe angebracht ist.
  2. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei der bizyklische Ring R' ausgewählt wird aus Naphthyl, Quinolyl, Benzofuranyl, Benzothienyl, Indolyl, Indolinyl.
  3. Verbindung gemäß Anspruch 2, wobei die Bindung die 2-Position des R'-Rings ist.
  4. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R' durch Morpholin oder N-Methylpiperidin, das durch eine Alkyl- oder Alkylether-Bindung gebunden ist, substituiert ist.
  5. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R1 R'C(O) ist.
  6. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R3 2-Methylprop-1-enyl, Benzyl oder insbesondere i-Butyl ist.
  7. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Stereochemie an R3 einer natürlichen oder nicht-natürlichen L-Aminosäure entspricht.
  8. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R5 CH3, C2H5, CH2Ar, CH2CONH2, (CH2)2CONH2, CH2OH,
    Figure 00840001
    CH3, CH2CH3, und wobei CH2OH insbesondere bevorzugt ist.
  9. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R5 und die C4-Bindung beide (R) oder beide (S) Stereochemie aufweisen.
  10. Verbindung gemäß der Ansprüche 1 oder 5–9, wobei R' ein monozyklischer Ring ist, der mit einem zyklischen Substituenten substituiert ist, vorzugsweise einem nicht-aromatischen Substituenten, insbesondere wobei der nicht-aromatische zyklische Substituent ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Pyrrolidin-1-yl, Piperidin-1-yl, Morpholin-4-yl, 4-Methylpiperazin-1-yl, 2-Morpholin-4-yl-ethylamino und Piperazin-1-yl ausgewählt wird, wobei der monozyklische Ring vorzugsweise Pyridyl, Pyrimidinyl oder Phenyl ist, das vorzugsweise an der 3- oder 4-Position substituiert ist.
  11. Verwendung einer Verbindung wie in Anspruch 1 definiert für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, die von der Aktivität von Kathepsin K abhängig sind.
  12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei die Erkrankung eine Knochenerkrankung wie Periodontitis oder Osteoarthritis ist, eine Knorpel- oder Matrix-Degradationserkrankung wie Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, oder Neoplasie ist.
  13. Verwendung einer Verbindung wie in Anspruch 1 definiert, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe einer Parasiteninfektion.
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