ES2261341T3 - Inhibidor de cisteina proteasa. - Google Patents
Inhibidor de cisteina proteasa.Info
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Abstract
Un compuesto de fórmula (IVa): en la que R1 = R¿C(O), R¿SO2, R¿ = un sistema de anillo de 8 a 12 miembros bicíclico, saturado o no saturado que contiene 0 a 4 heteroátomos seleccionados de S, O y N, estando dicho sistema de anillo opcionalmente sustituido con hasta cuatro sustituyentes seleccionados independientemente de los grupos a), b) y c) siguientes; o R¿ = un anillo de 5 a 7 miembros monocíclico, saturado o no saturado que contiene 0 a 3 heteroátomos seleccionados de S, O y N, teniendo dicho anillo monocíclico al menos un sustituyente seleccionado del grupo a) y c) siguientes y pudiendo tener opcionalmente uno o dos sustituyentes adicionales seleccionados del grupo b) siguiente; a) un grupo cíclico que puede estar unido directamente al anillo R¿ o a través de un enlazador alquilo, alquiléter, alquiltioéter, alquilamina, alquilamida, alquilsulfonamida, alquilsulfona, alquilurea, alquilcetona o alquiléster que comprende hasta 6 átomos de C; o b) H, alquilo C1-C7, cicloalquilo C3-C6,OH, SH, NH2, NH-alquilo C1-C3, N(alquilo C1-C3)2, halógeno; o c) O-alquilo C1-C4, S-alquilo C1-C4, SO-alquilo C1- C4, SO2-alquilo C1-C4, CO2-alquilo C0-C4, NHCO- alquilo C0-C4, CONH-alquilo C0-C4, CO-alquilo C0- C4, NHC(=NH)NH2; R3 = alquilo C1-C7, alquenilo C2-C7, cicloalquilo C3-C7, Ar- alquilo C1-C7; Ar; R5 = alquilo C1-C7, Ar-alquilo C1-C7, alquil C0-C3-CONR3R4 o Riv; Riv = en la que n = 1 - 3 m = 1 - 3 Rv, Vvi = H, alquilo C1-C7; A = N, CH; B = N, O, S, CH; Rvii = no está presente cuando B = O, S; o Rvii = H, alquilo C1-C7 cuando B = N, CH Rviii = O, alquilo C1-C7; y sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que alquilo C1-C7 se refiere a cadenas de carbono alifáticas de cadena lineal y ramificada, opcionalmente sustituidas con uno o dos halógenos y/o un heteroátomo S, O, NH, en el que el heteroátomo en un extremo de cadena puede estar sustituido con 1 ó 2 átomos de hidrógeno o un azufre oxidado a la sulfona; cicloalquilo C3-6 o C3-7 se refiere a cualquier variación de alquilo C1-C7 que contiene además un anillo carbocíclico C3-6 o C3-7 o el cicloalquilo está unido en posición espiro al carbono adyacente sin un alquilo C1-C7 intermedio; Ar se refiere a un anillo aromático fenilo, pirazolilo, piridilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazinolilo, isotiazinonilo, tiazolilo, oxadiazolilo, 1, 2, 3-triazolilo, 1, 2, 4-triazolilo, furanilo o tienilo, opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C1-3, OH, O-alquilo C1-3, SH, S-alquilo C1-3, amina; Ar-alquilo C1-C7 se refiere a Ar unido al átomo de carbono respectivo a través de un alquilo C1-C7.
Description
Inhibidores de cisteína proteasa.
Esta invención se refiere a inhibidores de
cisteína proteasas, en especial a las de la superfamilia de papaína.
La invención proporciona nuevos compuestos útiles en la profilaxis o
tratamiento de trastornos que se originan de un desequilibrio de
proteasas fisiológicas tales como catepsina K o proteasas patógenas
tales como falcipaína de malaria.
La superfamilia de papaína de cisteína proteasa
está distribuida extensamente en diversas especies que incluyen los
mamíferos, invertebrados, protozoos, plantas y bacterias. Se han
incluido en esta superfamilia una serie de enzimas catepsina de
mamífero, incluyendo catepsinas B, F, H, K, L, N y S, y la
regulación inapropiada de su actividad se ha implicado en una serie
de trastornos metabólicos que incluyen artritis, distrofia muscular,
inflamación, glomerulonefritis e invasión tumoral. Las enzimas del
tipo catepsina patógenas incluyen las gingipaínas bacterianas, las
malarialfalcipaínas I, II, II y siguientes y cisteína proteasas de
Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzei y brucei,
Crithidia fusiculata, Schistosoma spp.
La regulación inapropiada de catepsina K se ha
relacionado en una serie de trastornos que incluyen osteoporosis,
enfermedades gingivales tales como gingivitis y periodontitis,
enfermedad de Paget, hipercalcemia, enfermedad ósea metastásica y
metabólica. A la vista de sus niveles elevados en condroclastos de
sinovio osteoartrítico, la catepsina K está implicada en
enfermedades caracterizadas por una excesiva degradación del
cartílago o la matriz, tal como osteoartritis y artritis reumatoide.
Las células metastásicas neoplásicas expresan de forma típica altos
niveles de enzimas proteolíticas que degradan la matriz circundante
y la inhibición de catepsina K puede ayudar de este modo a tratar
neoplasias.
El documento WO 98/50533 describe el uso de
compuestos de acuerdo con la fórmula (I).
Se sugiere que los compuestos de esta fórmula
son útiles como inhibidores de proteasas, en particular de la
superfamilia de papaína; de forma específica las de la familia
Catepsina; y en particular Catepsina K. La estructura anular que
soporta la cetona en estos compuestos tiene una tendencia a
racemizarse de forma espontánea, limitando su utilidad clínica.
Otras solicitudes de SKB que describen inhibidores de catpesina con
cetona incluyen los documentos WO 98 46582, W09964399, W00029408,
W00038687 y W00049011. No obstante, ninguna de estas solicitudes
describe sustituyentes con anillo \alpha, adyacentes a la unión
con la cadena peptidomimética.
Shenai et al, J. Biol. Chem. 275 37
29000-29010 describe el aislamiento de una cisteína
proteasa principal, denominada falcipaína 2 de trofozoitos de
Plasmodium falciparium. La enzima parece, entre otras cosas,
hidrolizar la hemoglobina de eritrocitos en vacuolas de sangre
ácidas. Esta publicación también describe el aislamiento del gen
correspondiente usando un marcador en el terminal N, que se retira
de forma autocatalítica durante el repliegue.
El documento de SmithKline Beecham WO99/53039
describe la actividad inhibidora de cisteína proteasa de una amplia
gama de peptidomiméticos en una preparación de trofozoitos de
Plasmodium falciparium. No se proporcionan indicaciones
referidas a la cisteína proteasa que es inhibida. Aunque la mayoría
de los peptidomiméticos son estructuras lineales, un compuesto
(R,S)-3-[N-(3-benciloxibenzoil)-L-leucinilamino]
tetrahidrofuran-4-ona pertenece a
las furanonas de fórmula I representadas antes. Como sería de
esperar de dichas estructuras, el anillo que tiene la cetona es
racémico.
La solicitud PCT WO00/69855, en trámite junto
con la presente y del mismo solicitante y publicada después de la
presente fecha de prioridad, describe inhibidores de catepsina S que
comprenden un grupo de relleno P3 monocíclico.
Un primer aspecto de la invención proporciona
compuestos de fórmula (IVa) como se identifica en la reivindicación
1 adjunta.
Los compuestos de la invención tienen utilidad
en el tratamiento o profilaxis de diversos trastornos caracterizados
por la presencia o actividad inapropiada de cisteína proteasas de la
superfamilia de papaína, tales como catepsinas B, F, L, S y, en
especial catepsina K o falcipaína.
"Alquilo C_{1}-C_{7}"
tal como se aplica en la presente memoria se pretende que incluya
cadenas de carbono alifáticas de cadena lineal o ramificada tales
como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
n-butilo, isobutilo, t-butilo,
pentilo, isopentilo, hexilo, heptilo y cualquiera de sus isómeros
sencillos. Además, cualquier alquilo C_{1}-C_{7}
puede estar opcionalmente sustituido con uno o dos halógenos y/o un
heteroátomos S, O, NH. Si el heteroátomo está situado en un terminal
de cadena entonces está apropiadamente sustituido con uno o dos
átomos de hidrógeno, por ejemplo, hidroximetilo. Los heteroátomos
azufre pueden estar oxidados además a sulfonas.
"Alquilo C_{1}-C_{3}"
tal como se aplica en la presente memoria incluye metilo, etilo,
propilo, isopropilo, ciclopropilo, cualquiera de los cuales puede
estar opcionalmente sustituido como se describe en el párrafo
anterior.
"Amina" incluye NH_{2}, NH(alquilo
C_{1-3}) o N(alquilo
C_{1-3})_{2}.
"Halógeno" tal como se aplica en la
presente memoria incluye F, Cl, Br, I, en particular cloro y
preferiblemente fluoro.
"Cicloalquilo
C_{3}-C_{6}" o cicloalquilo
C_{3}-C_{7} tal como se aplica en la presente
memoria se refiere a cualquier variación de alquilo
C_{1}-C_{7} que contiene además un anillo
carbocíclico C_{3-6} (o C_{3-7})
tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo. Como
alternativa, el ciclopropilo C_{3-6} o
C_{3-7} puede estar unido por espiro al carbono
adyacente sin un alquilo C_{1}-C_{7} que esté
presente.
"Ar-(alquilo
C_{1}-C_{7})" aplicado en la presente memoria
se refiere a un anillo fenilo, pirazolilo, piridilo, imidazolilo,
oxazolilo, isoxazolilo, tiazinolilo, isotiazinolilo, tiazolilo,
oxadiazolilo, 1,2,3-triazolilo,
1,2,4-triazolilo, furanilo o tienilo aromático (Ar)
unido a través de un "alquilo C_{1}-C_{7}"
(definido antes) al sistema de anillo
dihidro-(3H)-furanona o, en el caso de R2, R3 o R4
unido directamente a la estructura principal de la molécula. De
forma opcional, el anillo aromático Ar puede estar sustituido con
halógeno, alquilo C_{1}-C_{3}, OH,
O-alquilo C_{1}-C_{3}, SH,
S-alquilo C_{1}-C_{3}, amina y
similares.
El sustituyente cíclico a) a R' puede ser
saturado, insaturado o aromático y tener de 0 a 4 heteroátomos que
incluyen anillos monocíclicos tales como fenilo, cicloalquenilo, tal
como ciclohexenilo o ciclopentenilo, furilo, tienilo, piranilo,
pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo,
pirazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo,
piridilo, piperidinilo, pirazinilo, piperazinilo, pirimidinilo,
piridazinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, isoxazolilo,
isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo,
isotiazolilo, isotiazolidinilo y similares, o anillos bicíclicos
tales como naftilo y, en especial, cualquiera de los condensados
anteriores con un anillo fenilo tales como indolilo, quinolinilo,
isoquinolinilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo,
benzotienilo y similares. El anillo carbo o heterocíclico
sustituyente puede estar unido a través de un carbono o a través de
un heteroátomo, de forma típica un átomo de nitrógeno, tal como
N-piperidilo, N-morfolinilo y
similares. El anillo sustituyente a) puede estar sustituido por si
mismo con sustituyentes como para Ar anterior. El sustituyente
anillo a) excluye cicloalquilo como se define en el subgrupo
b).
La unión alquilo, alquiléter, alquiltioéter,
alquilamina, alquilamida, alquilsulfonamida, alquilsulfona,
alquilurea, alquilcetona o alquiléster opcional entre R' y el
sustituyente anillo a) puede comprender hasta 6 átomos de carbono,
de forma típica hasta cuatro átomos de carbono, por ejemplo, 1 ó 2.
Si está presente, el componente éter, tioéter, amina, amida,
sulfonamida, sulfona, urea, cetona o éster puede estar situado
adyacente al anillo R', (por ejemplo un sustituyente morfolinoetoxi)
adyacente al anillo sustituyente (por ejemplo, un sustituyente
fenilsulfonoetilo) o intermedio de dos grupos alquilo (por ejemplo,
un sustituyente benzoiloximetilo).
"alquil
C_{1-3}-CONR''', R^{iV}" tal
como se aplica en la presente memoria se refiere a cadena de
carbonos lineal o ramificada sustituida con 1, 2 ó 3 carboxamida, en
el que R''', R^{iv} incluye H y Me.
"alquil
C_{1-3}-SO_{2}-R^{ix}",
tal como se aplica en la presente memoria se refiere a una cadena de
carbonos lineal o ramificada sustituida con una sulfona, en la que
R^{ix} incluye "alquilo C_{1-7}",
"Ar-alquilo C_{1-7}",
"cicloalquilo C_{3-6}".
"alquil
C_{1-3}-C(O)-NHR^{ix}",
tal como se aplica en la presente memoria se refiere a una cadena de
carbonos lineal o ramificada sustituida con una carboxamida
secundaria en la que R'' incluye "alquilo
C_{1-7}", "Ar-alquilo
C_{1-7}", "cicloalquilo
C_{3-6}".
Grupos R' preferidos incluyen anillos bicíclicos
tales como naftilo, quinoloilo, benzofuranilo, benzotienilo,
indolilo e indolinilo, en particular cuando la unión está en la
posición 2 del anillo R'.
Otros bicíclicos incluyen naftalenilo, en
especial naftilen-2-ilo; benzo [1,3]
dioxolilo, en especial
benzo[1,3]dioxol-5-ilo,
benzofuranilo, en especial
benzofuran-2-ilo, y en especial
benzofuranilo sustituido con alcoxi C_{1-6}, más
especialmente 5-(éster terc-butílico del ácido
2-piperazin-4-carboxílico-etoxi)
benzofuran-2-ilo,
5-(2-morfolin-4-il-etoxi)-benzofuran-2-ilo,
5-(2-piperazin-1-il-etoxi)benzofuran-2-ilo,
5-(2-ciclohexil-etoxi)-benzofuran-2-ilo;
7-metoxi-benzofuran-2-ilo,
5-metoxi-benzofuran-2-ilo,
5,6-dimetoxi-benzofuran-2-ilo,
en especial benzofuranilo sustituido con halógenos, más
especialmente
5-fluoro-benzofuran-2-ilo,
5,6-difluoro-benzofuran-2-ilo,
en especial benzofuranilo sustituido con alquilo
C_{1-6}, más especialmente
3-metil-benzofuran-2-ilo;
benzo [b]tiofenilo, en especial
benzo[b]tiofen-2-ilo;
en especial benzo[b]tiofenilo sustituido con alcoxi
C_{1-6}, más especialmente
5,6-dimetoxibenzo[b]tiofen-2-ilo,
quinolinilo, en especial
quinolin-2-ilo,
quinolin-3-ilo,
quinolin-4-ilo,
quinolin-6-ilo y
quinolin-S-ilo; quinoxalinilo, en
especial quinoxalin-2-ilo;
1,8-naftiridinilo, en especial
1,8-naftiridin-2-ilo;
indolilo, en especial indol-2-ilo,
en especial indol-6-ilo,
indol-5-ilo, en especial indolilo
sustituido con alquilo C_{1-6}, más especialmente
N-metilindol-2-ilo;
furo [3,2-b] piridinilo, en especial furo
[3,2-b]
piridin-2-ilo y furo
[3,2-b] piridinilo sustituido con alquilo
C_{1-6}, en especial
3-metil-furo
[3,2-bipiridin-2-il;
tieno [3,2-b] tiofeno, en especial tieno
[3,2-b]
tiofen-2-ilo, más especialmente
tieno [3,2-b]
tiofen-2-ilo sustituido con alquilo
C_{1-6}, más especialmente
5-terc-butil-3-metiltieno
[3,2-b]
tiofen-2-ilo.
Grupos R' monocíclicos incluyen piridilo
sustituido, pirimidilo sustituido, fenilo sustituido, en particular
fenilo sustituido con un grupo cíclico tal como
pirrolidin-1-ilo,
piperidin-1-ilo,
morfolin-4-ilo,
4-metilpiperazin-1-ilo,
2-morfolin-4-il-etilamino
y piperazin-1-ilo. Un R' fenilo está
sustituido convenientemente en la posición 3 ó 4 con un grupo
cíclico.
Si está presente un centro quiral, todas las
formas isoméricas están cubiertas por la invención. Tanto las
estereoquímicas (R) y (S) en la posición correspondiente a la
posición 5 furano (es decir, R5 adyacente a la unión con la cadena
peptidomimética) están incluidas por la invención, siendo (R)
conveniente en algunos casos, por ejemplo, en inhibidores de
catepsina K o falcipaína, en particular, en combinación con
estereoquímica R en el enlace pirano 4. Como alternativa, R5 y el
enlace furanona/piranona en C4 tienen convenientemente la
estereoquímica S.
Los compuestos de la invención son inhibidores
de cisteína proteasa, notablemente contra catepsinas o proteasas del
tipo catepsina de la superfamilia de papaína. De forma ideal, el
compuesto presenta inhibición selectiva de una única proteasa en la
mezcla compleja de enzimas proteolíticas que caracterizan el entorno
fisiológico, por ejemplo, una selectividad mayor que diez veces, con
preferencia mayor que 100 veces. Lo más preferible, la especificidad
inhibidora se muestra sobre otros miembros de la misma clase o
familia de enzimas, tales como la familia de Catepsina, que tienen
un alto grado de homología, como la regulación incorrecta de la
actividad proteolítica puede conducir a estados patológicos
indeseados tales como hipertensión, coagulación sanguíneo o
empeoramiento. Esto es especialmente deseable para trastornos tales
como trastornos autoinmunes en los que la administración del fármaco
es posible que se prolongue.
Sin embargo, los compuestos pueden ser útiles a
pesar de que éstos presentan un grado de libertad en relación con la
inhibición de proteasas fisiológicas. Por ejemplo, las funciones
fisiológicas de muchas catepsinas son redundantes, es decir, la
inhibición de una cisteína proteasa particular se puede compensar
por la presencia o sobrerregulación de otras proteasas no inhibidas
o rutas metabólicas alternativas. De forma alternativa, los
tratamientos de corta duración pueden dar lugar solo a una toxicidad
transitoria u otros efectos secundarios.
La especificidad cruzada de cisteína proteasas
para un inhibidor posible dado (es decir, la selectividad del
inhibidor) se determina fácilmente con ensayos enzimáticos y de
cultivos celulares convencionales llevados a cabo en paralelo con
las enzimas respectivas.
La invención proporciona el uso de los
compuestos de fórmula (IVa) en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento o profilaxis de enfermedades o estados patológicos
aliviados o moderados por inhibición de catepsina K.
Otro aspecto de la invención proporciona el uso
de los compuestos de fórmula (IVa) en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección
parásita tal como infección protozoaria o bacteriana.
Convenientemente, el parásito protozoario o
bacteriano es una especie de Plasmodium, Leishmania, Schistosoma,
Giardia, Entamoeba, Trypansoma, Crithidia, Pneumocystis o
Porphyromonas.
De forma adecuada, el tratamiento o profilaxis
de Plasmodium falciparium comprende la inhibición de una
enzima falcipaína II.
Grupos R3 preferidos para el tratamiento y la
profilaxis de parásitos incluyen
metilpropen-1-ilo; o isobutilo o
bencilo, en especial con la estereoquímica correspondiendo a la
cadena lateral de L-leucina y
L-fenilalanina.
Grupos R3 preferidos para la inhibición de
catepsina K incluyen la cadena lateral que corresponde a
L-leucina.
El sustituyente R5 confiere muchas cualidades
beneficiosas a moléculas de fórmula general (IVa) que incluyen
mejoras en la potencia y ofrece la posibilidad de unir moléculas de
inhibidor con una funcionalidad básica para mejorar la solubilidad y
propiedades farmacocinéticas. Se recordará que muchas catepsinas
tales como catepsina K y falcipaína son activas en vacuolas ácidas o
microentornos fisiológicos que pueden favorecer la funcionalidad
básica en esta posición. Además, las moléculas de (IVa) en las que
R5 es alquilo u otro sustituyente y no simplemente hidrógeno tienden
a mostrar buena estabilidad quiral en el
\alpha-carbono de furanona (o el correspondiente
para la piranona) (denotado posición 4 o C4 del anillo en la
presente memoria), a no ser que se indique de otro modo). Por
quiralidad estable se refiere a que los compuestos de la invención
existen como un estereoisómero predominante en lugar de una mezcla
igual de estereoisómeros que se diferencian en la estereoquímica en
C4. Con preferencia, los compuestos de la invención tienen al menos
una pureza diastereoisomérica del 90%.
Se aprecia particularmente la presencia del
sustituyente R5 en la fórmula (IVa) en comparación con la ausencia
de cualquier sustituyente en la misma posición de la fórmula (I) de
acuerdo con los documentos WO 98/50533, WO98/46582, W099/64399,
WO00/29408, WO00/38687 y WO00/49011.
Compuestos interesantes de fórmula (IVa), en
particular en el contexto de inhibición de catepsina K incluyen:
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-2-fenetil-benzamida
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-pentil]-amida
del ácido
benzofuran-2-carboxílico
[1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-ciclohexil]-amida
del ácido
benzofuran-2-carboxílico
[1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-ciclopentil]-amida
del ácido
benzofuran-2-carboxílico
[1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-ciclohexil-amida
del ácido
naftalen-2-carboxílico
[2-ciclopropil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-etil]-amida
del ácido
benzofuran-2-carboxí-
lico
lico
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-4-pirrol-1-il-benzamida
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-4-piperidin-1-il-benzamida
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-4-morfolin-4-il-benzamida
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-4-piperazin-1-il-benzamida
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbarnoil)-butil]-4-(4-metil-piperazin-1-il)-benzamida
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-4-pirrolidin-1-il-benzamida
4-(3,3-Dimetil-piperazin-1-il)-N-[3-metil-S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3-S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
4-(2,2-Dimetil-piperazin-1-il)-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
4-(4-Alil-piperazin-1-il)-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
4-(4-Ciclopropilmetil-piperazin-1-il)-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
1,2,3,4-tetrahidro-quinolin-6-carboxílico
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
benzotiazol-5-carboxílico
4-Azepan-1-il-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
4-[1,4]Diazepan-1-il-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
4-(2-Metilamino-etilamino)-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido naftalen-1-carboxílico
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
benzofuran-2-carboxílico
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxotetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
benzo[b]tiofen-2-carboxílico
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxotetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
5-metoxi-benzofuran-2-carboxílico
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxotetrahidro-furan-3-ilcarbamoil)-but-3S-enil]-amida
del ácido
5-metoxi-benzofuran-2-carboxílico
4-Acetilamino-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-4-morfolin-4-ilmetil-benzamida
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-4-piperidin-1-ilmetil-benzamida
{4-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butilcarbamoil]-fenil}-amida
del ácido
piperidin-1-carboxílico
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-but-3-enil]-N'-fenil-tereftalamida
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-N-fenil-tereftalamida
N-Etil-N'-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-but-3-enil]-tereftalamida
N-Etil-N'-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-tereftalamida
4-Hidroxi-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-3-morfolin-4-ilmetil-benzamida
4-Hidroxi-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-but-3-enil]-3-morfolin-4-ilmetil-benzamida
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido bifenil-4-carboxílico
4-terc-butil-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
4-terc-butil-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-but-3-enil]-benzamida
4-Guanidino-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
4-Guanidino-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-but-3-enil]-benzamida
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-il-carbamoil)-butil]-amida
del ácido
5-(2-morfolin-4-il-etoxi)-benzofuran-2-carboxílico
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-il-carbamoil)-but-3-enil]-amida
del ácido
5-(2-morfolin-4-il-etoxi)-benzofuran-2-carboxílico
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
naftalen-2-carboxílico
4-bencenosulfonilamino-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-il-carbamoil)-butil]-amida
del ácido
3,4,5,6-tetrahidro-2H-[1,4']
bipiridinil-4-carboxílico
bipiridinil-4-carboxílico
4-(1-Metil-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il)-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
4-(Bencil-metil-amino)-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
N-[3-Metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-4-fenilamino-benzamida
4-Bencilamino-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-quinolin-6-carboxílico
y los compuestos hidroximetilados R5
correspondientes;
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos de la invención pueden formar
sales que constituyen un aspecto adicional de la invención. Sales
farmacéuticamente aceptables apropiadas de los compuestos de Fórmula
(IVa) incluyen sales de ácidos orgánicos, en especial ácidos
carboxílicos, que incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos
acetato, trifluoroacetato, lactato, gluconato, citrato, tartrato,
maleato, malato, pantotenato, isetionato, adipato, alginato,
aspartato, benzoato, butirato, digluconato, ciclopentanato,
glucoheptanato, glicerofosfato, oxalato, heptanoato, hexanoato,
fumarato, nicotinato, palmoato, pectinato,
3-fenilpropionato, picrato, pivalato, proprionato,
tartrato, lactobionato, pivolato, canforato, undecanoato y
succinato, ácidos sulfónicos orgánicos tales como metanosulfonato,
etanosulfonato, 2-hidroxietano sulfonato,
canfosulfonato, 2-naptalenosulfonato,
bencenosulfonato, p-clorobencenosulfonato y
p-toluenosulfonato; y ácidos inorgánicos tales como
clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, bisulfato,
hemisulfato, tiocianato, persulfato, ácidos fosfórico y sulfónico.
Los compuestos de Fórmula (IVa) pueden en algunos casos aislarse
como hidrato.
Se apreciará que la invención se extiende a
profármacos, solvatos, complejos y otras formas que liberan un
compuesto de fórmula (IVa) in vivo.
Aunque es posible para el agente activo
administrarse solo, se prefiere presentar el mismo como parte de una
formulación farmacéutica. Dicha formulación comprenderá el agente
activo definido antes junto con uno o más vehículos/excipientes
aceptables y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El
vehículo(s) deberá ser aceptable en el sentido de que sea
compatible con el resto de ingredientes de la formulación y no sea
perjudicial para el receptor.
Las formulaciones incluyen las adecuadas para
administración rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y
sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea,
intramuscular, intravenosa e intradérmica), aunque con preferencia,
la formulación es una formulación administrada por vía oral. Las
formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosis
unitaria, por ejemplo, comprimidos y cápsulas de liberación
sostenida y se pueden preparar por cualquier procedimiento bien
conocido en la técnica farmacéutica.
Tales procedimientos incluyen la etapa de poner
en contacto el agente activo definido antes con el vehículo. En
general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación
uniformemente e íntimamente el agente activo con vehículos líquidos
o vehículos sólidos finamente divididos o ambos; y luego si fuera
necesario conformar el producto. La invención se extiende a
procedimientos para preparar una composición farmacéutica que
comprende poner un compuesto de fórmula (IVa) o su sal
farmacéuticamente aceptable en asociación con un vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable. Si la fabricación de las
formulaciones farmacéuticas conlleva mezclar íntimamente los
excipientes farmacéuticos y el ingrediente activo en forma de sal,
entonces se prefiere con frecuencia el uso de excipientes que son de
naturaleza no básica, es decir, bien ácidos o neutros.
Las formulaciones para administración oral en la
presente invención pueden estar presentes como unidades discretas
tales como cápsulas, sellos o comprimidos, conteniendo cada uno una
cantidad predeterminada del agente activo; como un polvo o gránulos;
como una solución o una suspensión del agente activo en un líquido
acuoso o en un líquido no acuoso; o como una emulsión aceite en agua
o una emulsión agua en aceite y como una inyección de gran tamaño, y
similares.
Con respecto a composición para administración
oral (por ejemplo, comprimidos y cápsulas), el término vehículo
adecuado incluye vehículos tales como excipientes comunes, por
ejemplo, agentes ligantes, por ejemplo, jarabe, goma arábiga,
gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidona (Povidona),
metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio,
hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa y almidón; cargas y vehículos,
por ejemplo, almidón de maíz, gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa
microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico, cloruro sódico
y ácido algínico; y lubricantes tales como estearato de magnesio,
estearato de sodio y otros estearatos metálicos, glicerol estearato,
ácido esteárico, fluido de silicona, talco, ceras, aceites y sílice
coloidal. Se pueden usar también agentes aromatizantes tales como
menta, aceite de gualtería, aroma de cereza o similares. Puede ser
deseable añadir un agente colorante para hacer la forma de
dosificación fácilmente identificable. Los comprimidos se pueden
recubrir también por procedimientos bien conocidos en la
técnica.
Se puede preparar un comprimido por compresión o
moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Los
comprimidos preparados por compresión se pueden preparar
comprimiendo en una máquina adecuada el agente activo en una forma
fluida tal como un polvo o granulado, opcionalmente mezclado con un
ligante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o
dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando
en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humectado
con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir
opcionalmente o ranurarse y se pueden formular para que proporcionen
una liberación lenta o controlada del agente activo.
Otras formulaciones adecuadas para
administración oral incluyen tabletas que comprenden el agente
activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga
o tragacanto; pastillas que comprenden el agente activo en una base
inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa o goma arábiga; y
colutorios que comprenden el agente activo en un vehículo líquido
adecuado.
La dosis apropiada para los compuestos o
formulaciones de la invención dependerá de la indicación y del
paciente y se determina fácilmente por ensayos convencionales en
animales. Las dosis que proporcionan concentraciones intracelulares
(para inhibición de proteasas fisiológicas de la superfamilia de
papaína) del orden de 0,01-100 \muM, más
preferiblemente 0,01-10 \muM, tal como
0,1-25 \muM son más deseables y fáciles de
conseguir de forma típica. La administración ex vivo o tópica
frente a parásitos implicará normalmente concentraciones
mayores.
El término "grupo protector de N" o "N
protegido" y similares tal como se usan en la presente memoria se
refiere a aquellos grupos destinados a proteger el terminal N de un
aminoácido o péptido o a proteger un grupo amino contra reacciones
indeseables durante los procedimientos de síntesis. Grupos
protectores de N usados corrientemente se describen en Greene,
"Protective Groups in Organic Synthesis" (John Wiley &
Sons, New York, 1981), que se incorpora en la presente memoria como
referencia. Grupos protectores de N incluyen grupos acilo tales
formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo,
t-butilacetilo, 2-cloroacetilo,
2-bromoacetilo, trifluoracetilo, tricloroacetilo,
ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo,
\alpha-clorobutirilo, benzoilo,
4-clorobenzoilo, 4-bromobenzoilo,
4-nitrobenzoilo y similares; grupos sulfonilo tales
como bencenosulfonilo, p-toluenosulfonilo y
similares, grupos formadores de carbamato tales como
benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo,
p-metoxibenciloxicarbonilo,
p-nitrobenciloxicarbonilo,
2-nitrobenciloxicarbonilo,
p-bromobenciloxicarbonilo,
3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo,
4-metoxibenciloxicarbonilo,
2-nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo,
3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo,
1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo,
\alpha,\alpha-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo,
benzhidriloxicarbonilo, t-butoxicarbonilo,
diisopropilmetoxicarbonilo, isopro-piloxicarbonilo,
etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo,
2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, fenoxicarbonilo,
4-nitrofenoxicarbonilo,
fluorenil-9-metoxicarbonilo,
ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo,
ciclohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo y similares; grupos
alquilo tales como bencilo, trifenilmetilo, benciloximetilo y
similares; y grupos sililo tales como trimetilsililo y similares.
Grupos protectores de N favorables incluyen formilo, acetilo, alilo,
Fmoc, benzoilo, pivaloilo, t-butilacetilo,
fenilsulfonilo, bencilo, t-butoxicarbonilo (Boc) y
benciloxicarbonilo (Cbz).
Grupos protectores de hidroxi y/o carboxi
también se revisan extensamente en Green ibid e incluyen
éteres tales como éteres metílicos, metílicos sustituidos tales como
metoximetilo, metiltiometilo, benciloximetilo,
t-butoximetilo, 2-metoxietoximetilo
y similares, éteres de sililo tales como trimetisililo (TMS),
1-butildimetilsililo (TBDMS) tribencilsililo,
trifenilsililo, t-butildifenilsililo (TBDPS),
triisopropil sililo y similares, éteres etílicos sustituidos tales
como 1-etoximetilo,
1-metil-1-metoxietilo,
t-butilo, alilo, bencilo,
p-metoxibencilo, difenilmetilo, trifenilmetilo y
similares, grupos aralquilo tales como tritilo y derivados de pixilo
(9-hidroxi-9-fenilxanteno,
en especial el cloruro). Grupos protectores de hidroxi éster
incluyen ésteres tales como formiato, bencilformiato, cloroacetato,
metoxiacetato, fenoxiacetato, pivaloato, adamantoato, mesitoato,
benzoato y similares. Grupos protectores de hidroxi carbonato
incluyen metilvinilo, alilo, cinnamilo, bencilo y similares.
Los compuestos de la invención se sintetizan por
una combinación de químicas, llevadas a cabo bien en solución o en
fase sólida. La metodología de síntesis descrita en los esquemas 1 a
9 de nuestro documento PCT/GB00/01894, en trámite junto con la
presente, pero empleando el grupo de bloqueo R' apropiado es
conveniente para los compuestos de la invención.
Esquema
1
Preparación del sistema de
anillo de
dihidro-2(3H)-5-alquil
furanona
a) Fmoc-Cl,
Na_{2}CO_{3} o Boc_{2}O, b) ^{i}BuOCOCl, NMM, THF; c)
CH_{2}N_{2} en Et_{2}O; d) AcOH; e) LiCl en AcOH al
80%.
Esquema
2
Preparación de aminoácidos
\beta-alquilserina quirales, ejemplificados por
(2S,3S)-\beta-etilserina
(15)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esquema
3
Ruta del azúcar para la
preparación de aminoácidos \beta-alquilserina
quirales, ejemplificados por
(2S,3S)-\beta-etilserina
(15)
\newpage
Esquema
4
Nuevos híbridos P2 por el
acoplamiento cruzado catalizado por CuCn de
\beta-yodoalanina activada con Zn con bromuros de
alilo (con permiso de Dexter & Jackson,
ibid)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esquema
5
Síntesis en fase sólida de
inhibidores
dihidro-2(3H)-5-alquil
furanona de catepsina (también aplicable a las piranonas
correspondientes)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
6
Preparación en fase sólida de
inhibidores
3(2H)-furanona
\newpage
Rutas adicionales para construir bloques
incluyen:
Esquema
7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a) ^{i}BuOCOCCl, NMM; b)
diazometano en Et_{2}O; c) LiCl (10 eq) en ácido acético al 80%;
d) HCl 4M en dioxano; e)
Boc-Leu-Opfp, HOBt, NMM, DMF; HCl 4M
en dioxano; g) ácido 2-naftoico, HBTU, HOBt, NMM,
DMF.
Los compuestos de fórmula general (IVa), en la
que q = 0, se preparan por procedimientos mostrados en el Esquema 7.
La activación del Boc-aminoácido conocido
1-Esquema 7 con cloroformiato de isobutilo y
4-metilmorfolina proporciona la diazocetona
2-Esquema-7. El posterior
tratamiento de 2-Esquema-7 con
diazometano proporciona la diazocetona
3-Esquema-7. La ciclación de la
diazocetona 3-Esquema-7 se puede
efectuar por cloruro de litio/ácido acético acuoso dando la
dihidro-3(2H)furanona
4-Esquema-7. El grupo
terc-butoxicarbonilo se puede retirar de
4-Esquema-7, por tratamiento con
ácido, y proporciona la sal de amina
5-Esquema-7. La sal de amina
5-Esquema-7 se puede acoplar con un
ácido carboxílico por procedimientos que son conocidos en la
técnica, tales como acoplamiento con un derivado de pentafluorofenol
en presencia de HOBT y NMM, proporcionando la amida
6-Esquema-7. El grupo
terc-butoxicarbonilo se puede retirar de
6-Esquema-7 por tratamiento con un
ácido, tal como cloruro de hidrógeno en dioxano, proporcionando la
sal de amina 7-Esquema-7. La sal de
amina 7-Esquema-7 se puede acoplar
con un ácido carboxílico por procedimientos que son conocidos en la
técnica, tales como acoplamiento con un ácido en presencia de HBTU y
HOBT, proporcionando la amida
8-Esquema-7.
En los Esquemas 12 y 13 se muestran otras rutas
para las 5-metil y etil furanonas como bloques de
construcción hacia inhibidores o como intermedios para acceder a
otras funcionalidades R5.
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siguiente)
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Esquema
12
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a) p-TolCl,
piridina; b) (CF_{3}SO_{2})_{2}O, piridina, DCM; c)
NaN_{3}, DMF; d) HCOOH al 75%; e) Ac_{2}O, piridina; f) TMSOTf,
Et_{3}SiH; g) K_{2}CO_{3}, MeOH; h) H_{2}, Pd/C al 10%,
MeOH, Boc_{2}O; i) TsCl, piridina; j) LiAlH_{4},
Et_{2}O
Una síntesis alternativa de metil furanonas se
muestra en el Esquema 12. Se convierte primero el
1,2-isopropiliden-D-xilofuranosido
1-Esquema-12 en el éster
p-toluilo
2-Esquema-12 con cloruro de
p-toluoilo y piridina. El alcohol secundario
2-Esquema-12 se puede convertir en
el triflato 3-Esquema-12. El
triflato 3-Esquema-12 se puede
desplazar con azida de sodio proporcionando la azida correspondiente
4-Esquema-12. La desprotección de
1,2-isopropilideno de
4-Esquema-12 y posterior acetilación
del residuo proporciona el diacetato
5-Esquema-12. La reducción del
centro anomérico de 5-Esquema-12 con
triflato de trimetilsililo y trietilsilano proporciona el
monoacetato 6-Esquema-12. La
retirada de los dos grupos éster de 6-Esquema 12 con
carbonato potásico proporciona el alcohol
7-Esquema-12. La reducción de la
azida 7-Esquema-12 en presencia de
Boc anhídrido proporciona el intermedio clave furanol
8-Esquema-12. El furanol
8-Esquema-12 se puede transformar al
metilfuranol 10-Esquema 12 convirtiendo la
funcionalidad alcohol primario de
8-Esquema-12 al toxilato
9-Esquema-12, que a su vez se puede
reducir con hidruro de litio y aluminio proporcionando el metil
furanol 10-Esquema-12. Como se
describe en la presente memoria, el furanol
10-Esquema-12 se puede usar para
construir inhibidores de la invención en solución o en fase sólida.
La química de fase sólida requerirá de forma típica conversión de la
protección Boc a química de Fmoc. La etapa de síntesis definitiva
implica la oxidación de la funcionalidad furanol a la furanona
correspondiente usando un oxidante tal como peryodinano de
Dess-Martin. Como alternativa, la oxidación se puede
llevar a cabo antes de las posteriores modificaciones en el terminal
N. Es importante que el furanol
8-Esquema-12 también proporcione la
oportunidad de introducir diversas funcionalidades en
C-5 puesto que el hidroximetileno se puede usar para
posteriores transformaciones conocidas por los expertos en la
técnica.
\newpage
Esquema
13
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a) TsCl, piridina; b) Me_{2}CuLi,
Et_{2}O, THF; c) (CF_{3}SO_{2})_{2}O, piridina, DCM;
d) NaN_{3}, DMF; e) TMSOTf, Et_{3}SiH; f) H_{2}, Pd/C al 10%,
MeOH; g)
Boc_{2}O
Una síntesis alternativa de etil furanonas se
muestra en el Esquema 13. Se usa
1,2-isopropiliden-L-xilofuranosido
1-Esquema-13 como material de
partida y se convierte en primer lugar al tosilato
2-Esquema-13. El tosilato
2-Esquema-13 se desplaza fácilmente
usando química del cuprato proporcionando el etil furanosido
3-Esquema-13. El alcohol secundario
3-Esquema-13 se puede convertir en
el triflato 4-Esquema-13 usando
anhídrido tríflico y piridina. El triflato
4-Esquema-13 se puede desplazar con
azida de sodio proporcionando la azida correspondiente
5-Esquema-13. La reducción del
centro anomérico de 5-Esquema-13 con
triflato de trimetilsililo y trietilsilano proporciona el alcohol
6-Esquema-13. La reducción de la
azida 6-Esquema-13 con hidrógeno en
presencia de paladio al 10% sobre carbón proporciona la amina
7-Esquema-13. La protección de la
amina 7-Esquema-13 con Boc anhídrido
proporciona el etilfuranol
8-Esquema-13. Como se ha descrito
antes, el furanol 8-Esquema-13 se
puede usar para construir inhibidores potenciales en solución o en
fase sólida. La química en fase sólida requerirá la conversión de la
protección Boc a la química Fmoc. La etapa de síntesis definitiva
implica la oxidación de la funcionalidad furanol a la furanona
correspondiente usando un oxidante tal como peryodinano de
Dess-Martin. Como alternativa, la oxidación se puede
llevar a cabo antes de las posteriores modificaciones en el terminal
N.
Muchos grupos R3 están accesibles de residuos
aminoacídicos disponibles de forma comercial tales como
L-leucina, L-norleucina,
L-fenilalanina y similares. Otros bloques de
construcción de aminoácidos ramificados y no saturados son como se
muestran en el documento del Reino Unido PCT/GB01/02162 de Medivir,
que reivindica prioridad de la solicitud de patente británica GB
00025386-4 presentada el 17 de mayo de 2000, cuyo
contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.
El acceso a grupos R3 alquilo
C_{1}-C_{7} o Ar-alquilo
C_{1}-C_{7} que tienen sulfonilo, por ejemplo,
funcionalidades arilalquil
C_{0-2}-sulfonilmetilo puede venir
de aminoácido cisteína protegido de forma adecuada. El acoplamiento
de Mitsunobu de cisteinil tiol con aril alcoholes tales como fenol
proporciona el aminoácido protegido que contiene la cadena lateral
R3 de feniltiometilo que se oxida fácilmente usando ácido
m-cloroperbenzoico para proporcionar la cadena
lateral R3 fenilsulfonilmetilo. La cadena lateral R3
bencilsulfonilmetilo y fenetilsulfonilmetilo que contiene
aminoácidos se puede preparar por sustitución nucleófila del
cisteinil tiol con bromuro de bencilo y bromuro de fenetilo
respectivamente.
La oxidación de los sulfuros resultantes con
ácido m-cloroperbenzoico proporciona los aminoácidos
protegidos adecuadamente con la cadena lateral R3
bencilsulfonilmetilo y fenetilsulfonilmetilo.
Siguiendo el esquema 14 de química general:
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Se disolvió
(2S,3S)-N-Boc-O-t-butil-L-treonina
(1,2 g, 4,2 mmol) en DCM seco (20 ml) y se añadió
N-metil-morfolina (1 ml, 2,2 eq). Se
enfrió la mezcla de reacción a -15ºC y se agitó bajo una atmósfera
de argón. Se añadió cloroformiato de isobutilo (0,56 ml, 4,3 mmol) y
se agitó la mezcla durante 10 min a -15ºC. Se añadió una disolución
de diazometano en éter dietílico (45 ml, aprox. 40 mmol) y se dejó
calentar la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora, a
continuación se añadió gota a gota ácido acético hasta que cesó la
efervescencia. Se diluyó la mezcla de reacción con DCM (100 ml) y se
lavó sucesivamente con bicarbonato de sodio acuoso saturado (2
\times 75 ml), agua (75 ml) y salmuera (75 ml) y se secó sobre
sulfato de sodio. Se eliminó el disolvente al vacío para dar
(2S-3S)-N-Boc-O-t-butil-L-treonildiazometano
en bruto (1,2 g, \sim100%) como un aceite amarillo pálido. Se
repitió la síntesis anterior 9 veces y se agrupó el producto total
en bruto (12 g) y se utilizó sin purificación para la etapa
siguiente.
Se enfrió una disolución de cloruro de litio
(13,6 g, 320 mmol) en ácido acético acuoso al 80% (400 ml) a 5ºC y
se añadió a
(2S,3S)-N-Boc-O-t-butil-L-treonildiazometano
en bruto (1) (9,6 g) con agitación. Se disolvió el aceite durante 10
minutos y se continuó la agitación durante 1 hora más calentando
lentamente a temperatura ambiente, con desarrollo de gas. Se
eliminaron los disolventes al vacío y el residuo se recogió en EtOAc
(250 ml) y se lavó sucesivamente con agua (250 ml), bicarbonato de
sodio acuoso saturado (2 x 100 ml) y salmuera (75 ml), se secó a
continuación sobre sulfato de sodio. Se eliminó el disolvente al
vacío y se purificó el producto en bruto mediante cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (150 g) eluyendo con EtOAc/heptano
(1:2, v/v) y se dejó cristalizar para dar
dihidro-(4S-amino-[N-Boc])-5S-metil-3(2H)-furanona
(2) como un sólido blanco, produjo 4,05 g, 18,8 mmol, 58%.
Electronebulización-EM m/z 216 (MH^{+}), 160
(MH^{+} -56), análisis elemental C_{10}H_{17}O_{4}N (req) %C
55,80, %H 7,96, %N 6,51, (obtenido) %C 55,82, %H 7,86, %N 6,44.
\delta_{H} (500 MHz; CDCl_{3}): 1,41 (9H,
s, C(CH_{3})_{3}), 1,49 (3H, d, J 6,
5S-CH_{3}), 3,72 (1H, m ancho, furanona
CH\alpha), 3,90-4,02 (2H, 5S-H + 1 x
furanona COCH_{2}O), 4,22 (1H, d, J 17,4 1 x furanona
COCH_{2}O), 4,85 (1H, s ancho, furanona, NH).
\delta_{C} (125 MHz; CDCl_{3}); 19,34
(5S-CH_{3}), 28,45 (C(CH_{3})_{3}), 62,79
(furanona CH\alpha), 71,06 (furanona COCH_{2}O),
77,96 (5S-CHCH_{3}), 80,88
(C(CH_{3})_{3}) 155,6 ((CH_{3})_{3}
CO-CO), 212,6 (furanona CO).
Dihidro-(4S-amino-[N-Boc])-5S-metil-3(2H)-furanona
(2) (1,0 g, 4,6 mmol) se trató con una disolución de HCl 4,0M
dioxano (25 ml) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminaron
los disolventes al vacío y se preparó un azeótropo del residuo con
tolueno 2 x para dar la sal clorhidrato como un sólido blanco. Éster
pentafluorofenílico de
Boc-L-terc-butilalanina (2,0 g, 1,05 eq) e
hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (0,735 g, 1,05 eq)
se disolvieron en DMF (20 ml) y después de 5 min se añadieron a la
sal anterior. La disolución transparente se trató a continuación con
N-metilmorfolina (0,51 g, 0,56 ml, 1,1 eq) y se dejó
a temperatura ambiente durante 2 horas. Se eliminaron los
disolventes al vacío y el producto en bruto se purificó por
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (60 g), eluyendo con
EtOAc/heptano (1:3, v/v), a continuación con EtOAc/heptano (1:2,
v/v). Se agruparon las fracciones y se redujeron al vacío para dar
dihidro-(4S-amino-[N-Boc-L-terc-butilalanil])-5S-metil-3(2H)-furanona
(3) como un sólido blanco, rendimiento 1,31 g, 3,82 mmol, 83%.
Electronebulización-EM m/z 343 (MH^{+}), 287
(MH^{+} -56).
Esta metodología es fácilmente aplicable a la
piranona N-Boc protegida correspondiente o
(1,5-anhidro-3-[(terc-butoxicarbonil)amino]-3,4-didesoxi-4-etil-D-xilitol.
Se trató
dihidro-(4S-amino-[N-Boc-L-terc-butilalanil])-5S-metil-3(2H)-furanona
(3) (1,03 g, 3,0 mmol) con una disolución de HCl 4,0 M en dioxano
(25 ml) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminaron los
disolventes al vacío y se preparó un azeótropo del residuo con
tolueno 2 x para dar la sal clorhidrato como sólido blanco.
Se disolvieron el éster
furano-3-carboxipentafluorofenílico
(0,88 g, 1,05 eq) y el hidrato de
1-hidroxibenzotriazol (1,05 eq) en DMF (15 ml) y
después de 5 minutos se añadió a la sal anterior. Se trató a
continuación la disolución transparente con
N-metilmorfolina (1,1 eq) y se dejó a temperatura
ambiente durante 2 horas. Se eliminaron los disolventes al vacío y
se purificó el producto en bruto por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (50 g) eluyendo con EtOAc/heptano (3:2, v/v). Se
agruparon las fracciones y se redujeron al vacío para dar el
compuesto del título.
Se trató
dihidro-(4S-amino-[N-Boc-L-terc-butilalanil])-5S-metil-3(2H)-furanona
(3) (34 g, 0,1 mmol) con una disolución de HCl 4,0 M en dioxano (5
ml) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminaron los
disolventes al vacío y se preparó un azeótropo del residuo con
tolueno 2 x para dar la sal clorhidrato como un sólido blanco.
Se disolvió la sal clorhidrato en DCM seco (2
ml) y se añadió
benzofurano-2-sulfonilcloruro
seguido de diisopropiletilamina (3 eq) y
N,N-dimetilaminopiridina catalítica (2 mg). Después
de 2 horas a temperatura ambiente, se diluyó con DCM (15 ml) y se
lavó sucesivamente con HCl 0,1 N (25 ml), agua (2 x 25 ml) y
salmuera (25 ml), a continuación se secó sobre sulfato de sodio. Se
eliminó el disolvente al vacío y el producto en bruto se purificó
por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (15 g) eluyendo
con EtOAc/heptano (1:1, v/v). Se agruparon las fracciones y se
redujeron al vacío para dar el compuesto del título.
Adaptado de Blaskovich, M. A., Evinder. G.,
Rose, N. G. W., Wilkinson, S., Luo, Y. y Lajoie, G, A, J. Org.
Chem. 63, 3631-3646, 1998. (Siguiendo el esquema
2).
Se disolvió
N-Cbz-L-serina (10
g, 41,8 mmol) en DCM (450 ml) y DMF (14 ml) y se añadió gota a gota
durante 2,5 horas a una disolución agitada de WSC. HCl (12 g, 62,7
mmol), N'N-dimetilaminopiridina (260 mg, 2,1 mmol)
y 3-metil-3-oxetano
metanol (84 ml, 0,84 mmol) se enfriaron a 0ºC. Se calentó la
reacción a temperatura ambiente y se dejó agitar durante toda una
noche. Se lavó la mezcla con HCl 0,1 M (200 ml), agua (200 ml),
Na_{2}CO_{3} al 10% (200 ml x 2) y agua (200 ml x 2), se secó
(Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se evaporó al vacío para dar un
aceite amarillo pálido. La purificación por cromatografía en columna
(4:1, EtOAc:heptano) y la posterior recristalización (1:1,
EtOAc:heptano) produjo el producto intermedio diana como un sólido
cristalino blanco, 8,07 g, 60%; TLC (4:1, EtOAc:heptano), R_{f} =
0,28, electronebulización-EM m/z 324,1
(MH^{+}).
\delta (400 MHz; CDCl_{3}) 1,28 (3H, s,
CH_{3}), 3,04 (1H, t, J 6,2, CHNH),
3,90-3,91 (1H, m ancho, OH),
4,10-4,13 (2H, m, CH_{2}OH),
4,41-4,55 (6H, m, 3 \times CH_{2}), 5,13
(2H, s, OCH_{2}), 5,82 (1H, d, J 7,7, NH),
7,35-7,36 (5H, m, C_{6}H_{5}).
\delta_{C} (100 MHz; CDCl_{3}) 20,75
(CH_{3}), 39,67 (CH_{2}OH), 56,39 (CHNH),
63,37 (CH_{2}), 67,19 (CH_{2}), 68,94
(CH_{2}), 79,50 (OCH_{2}), 128,16
(C_{6}H_{5}), 128,27 (C_{6}H_{5}), 128,58
(C_{6}H_{5}), 136,14 (C_{6}H_{5}), 156,25
(CO_{2}NH), 170,74 (CO_{2}).
Se disolvió el compuesto (8) (10,23 g, 28,6
mmol) en DCM anhidro (150 ml) y se enfrió a 0ºC bajo N_{2}. Se
añadió una disolución de trifluoruro de boro eterato (0,10 ml, 0,77
mmol) en DCM anhidro (10 ml) y la mezcla se agitó durante 30 minutos
a 0ºC, a continuación a temperatura ambiente durante toda una noche.
Se añadió trietilamina (1,2 ml, 8,30 mmol) y se agitó la mezcla de
reacción durante 30 minutos antes de que se concentrase hasta un
aceite espeso incoloro. La purificación por cromatografía en columna
(4:1, EtOAc:heptano) y la posterior recristalización (1:1,
EtOAc:heptano) produjo (9) como un sólido cristalino blanco, 8,06 g,
80%; TLC (4:1, EtOAc:heptano), R_{f} = 0,27,
electronebulización-EM m/z 324,1 (MH^{+}).
\delta (400 MHz; CDCl_{3}); 0,78 (3H, s,
CH_{3}), 2,67 (1H, m, CHNH),
3,64-3,69 (1H, m, CH_{2}OH),
3,80-3,83 (1H, m, CH_{2}OH), 3,88 (6H, s,
CH_{2} \times 3), 5,09 (2H, dd, J 18,9, 12,3,
OCH_{2}), 5,38 (1H, d, J 8,7, NH),
7,26-7,34 (5H, m, C_{6}H_{5}),
\delta_{C} (100 MHz; CDCl_{3}); 14,11
(CH_{3}), 30,39 (CCH_{3}), 55,26 (CHNH),
61,75 (CH_{2}OH), 66,76 (CH_{2}O), 72,53
(CH_{2} \times 3), 108,29 (CO_{3}), 127,98
(C_{6}H_{5}), 128,32 (C_{6}H_{5}), 136,31
(C_{6}H_{5}), 156,31 (CO_{2}NH).
Se disolvió el compuesto (9) (6,45 g, 20,0 mmol)
en DCM anhidro (55 ml) bajo N_{2} y se enfrió a -78ºC en el matraz
1. Se añadió cloruro de oxalilo (2,8 ml, 31,9 mmol) a DCM anhidro
(85 ml) en un matraz separado (matraz 2) bajo N_{2} y se enfrió a
-78ºC. Se añadió dimetilsulfoxido anhidro (4,7 ml, 65,8 mmol) a la
disolución de cloruro de oxalilo y se agitó la mezcla a -78ºC
durante 15 minutos. La disolución de alcohol se transfirió durante
20 minutos mediante cánula al matraz 2 y se enjuagó con DCM anhidro
(35 ml). La mezcla blanca, turbia resultante se agitó durante 1,5
horas a -78ºC. Se añadió diisopropiletilamina (17,4 ml, 99,7 mmol) y
la disolución se agitó durante 30 minutos a -78ºC y 10 minutos a
0ºC. Se añadió DCM (140 ml) enfriado en hielo y la disolución se
lavó con NH_{4}Cl (disolución saturada al 20%; 3 \times 140 ml)
enfriado en hielo y NaCl saturado (140 ml), se secó (MgSO_{4}) y
se evaporó el disolvente al vacío para proporcionar un sólido
amarillo (10), 5,08 g, 79%; TLC (3:1, EtOAc:heptano), Rf =
0,56, electronebulización-EM m/z 322,1 (40%)
(MH^{+}), 340,2 (100%) (MH^{+} + H_{2}O).
\delta_{H} (400 MHz; CDCl_{3}); 0,82 (3H,
s, CH_{3}), 3,93 (6H, s, CH_{2} x 3), 4,60 (1H, d,
J 8,8, CHNH), 5,12 (2H, d, J 14,9, 12,4,
OCH_{2}), 5,35 (1H, d ancho, J 8,0, NH),
7,30-7,36 (5H, m, C_{6}H_{5}), 9,68 (1H,
s, HCO).
\delta_{C} (100 MHz; CDCl_{3}) 14,25
(CH_{3}), 30,86 (CCH_{3}), 53,25 (CHNH),
67,22 (CH_{2}O), 72,88 (CH_{2} \times 3), 107,16
(CO_{3}), 128,13 (C_{6}H_{5}), 126,46
(C_{6}H_{5}), 136,13 (C_{6}H_{5}), 156,17
(CO_{2}NH), 195,66 (CHO).
Se disolvió el compuesto (10) (2 g, 5,73 mmol)
en DCM anhidro:Et_{2}O (1:1) bajo N_{2}. Una disolución de
EtMgBr (disolución 3M en Et_{2}O; 7,6 ml, 22,9 mmol) se añadió
rápidamente a -78ºC y se agitó vigorosamente. Después de 30 minutos
se desactivó bruscamente la reacción vertiéndola en NH_{4}Cl al 5%
(550 ml). Se añadió DCM (550 ml), se separó la fase orgánica y se
lavó con NH_{4}Cl al 3% (500 ml) y salmuera (500 ml), se secó
(Na_{2}SO_{4}) y se evaporó el disolvente al vacío para
proporcionar un aceite amarillo. La purificación por cromatografía
en columna (1:10, EtOAc:DCM) y la posterior recristalización
(EtOAc:heptano) produjo un sólido cristalino blanco (11), 1,32 g,
60%; TLC (1:10, EtOAc:DCM), Rf = 0,25,
electronebulización-EM m/z 352,2 (20%) (MH^{+}),
370,3 (100%) (MH^{+} + H_{2}O).
\delta_{H} (400 MHz; CDCl_{3}); 0,82 (3H,
s, CH_{3}), 0,94 (3H, t, J 7,4,
CH_{2}CH_{3}), 1,36-1,53 (2H, m,
CH_{2}CH_{3}) 3,85 (1H, d, J 10,3, CH),
3,93 (6H, s, CH_{2} \times 3), 4,05 (1H, d, J 6,8,
CH), 5,13-5,14 (2H, dd, J 16,4, 12,7,
OCH_{2}), 5,32 (1H, d, J 10,2, NH),
7,30-7,36 (5H, m, C_{6}H_{5}).
\delta_{C} (100 MHz; CDCl_{3}); 10,11
(CH_{2}CH_{3}), 14,34 (CH_{3}), 25,98
(CH_{2} CH_{3}), 30,65 (CCH_{3}), 56,05
(CHOH), 66,83 (CH_{2}O), 70,81 (CHNH), 72,76
(CH_{2} \times 3), 108,93 (CO_{3}), 127,65
(C_{6}H_{5}), 128,45 (C_{6}H_{5}), 136,65
(C_{6}H_{5}), 156,83 (CO_{2}NH).
Se disolvió el compuesto (11) (1,32 g, 3,8 mmol)
en DCM anhidro (10 ml) bajo N_{2} y se enfrió a -78ºC en el matraz
1. Se diluyó cloruro de oxalilo (disolución 2 M en DCM; 3 ml, 6,0
mmol) con DCM anhidro (10 ml) en un matraz independiente (matraz 2)
bajo N_{2} y se enfrió a -78ºC. Se añadió dimetilsulfoxido anhidro
(0,88 ml, 12,4 mmol) a la disolución de cloruro de oxalilo y se
agitó la mezcla a -78ºC durante 15 minutos. Se transfirió la
disolución de alcohol durante 20 minutos mediante cánula al matraz 2
y se enjuagó con DCM anhidro (10 ml). La mezcla blanca, turbia
resultante se agitó durante 2 horas 15 minutos a -78ºC. Se añadió
DIPEA (3,3 ml, 18,8 mmol) y la disolución se agitó durante 30
minutos a -78ºC y 10 minutos a 0ºC. Se añadió DCM (25 ml) enfriado
en hielo y la disolución se lavó con NH_{4}Cl enfriado en hielo
(disolución saturada al 5%; 3 x 25 ml) y NaCl saturado (25 ml), se
secó (NaSO_{4}) y se evaporó el disolvente al vacío para
proporcionar un aceite naranja. La purificación por cromatografía en
columna (2:3, EtOAc:heptano) produjo un aceite incoloro (12), 556
mg, 45%; TLC (2:3, EtOAc:heptano), Rf = 0,25;
electronebulización-EM m/z 350,2 (60%) (MH^{+}),
368,2 (100%) (MH^{+} + H_{2}O).
\delta (400 MHz; CDCl_{3}); 0,80 (3H, s,
CH_{3}), 1,06 (3H, t, J 7,2,
CH_{2}CH_{3}), 2,48-2,56 (1H, m,
CHCH_{3}), 2,80-2,88 (1H, m,
CHCH_{3}), 3,90 (6H, s, CH_{2} x 3), 4,60 (1H, d,
J 8,8, CHNH), 5,09 (2H, s, OCH_{2}), 5,66
(1H, d, J 8,5, NH), 7,30-7,35 (5H, m,
C_{6}H_{5}).
\delta_{C} (100 MHz; CDCl_{3}); 7,53
(CH_{2}CH_{3}), 14,25 (CH_{3}), 30,57
(CCH_{3}), 35,74 (CH_{2}CH_{3}), 62,33
(CHNH), 67,05 (CH_{2}O), 72,94 (CH_{2} x
3), 106,98 (CO_{3}), 128,10 (C_{6}H_{5}), 128,46
(C_{6}H_{5}), 136,31 (C_{6}H_{5}), 155,99
(CO_{2}NH).
Se enfriaron el compuesto (12) (2,77 g, 7,9
mmol) y LiBH_{4} (1,73 g, 79 mmol) a -78ºC bajo N_{2}. Se
añadió una disolución de DCM:CH_{3}OH (1,5:1; 332 ml enfriada a
-78ºC) y se agitó la disolución a -78ºC durante toda una noche.
Después de calentarse a temperatura ambiente, se vertió la
disolución en disolución de NH_{4}Cl al 5% (500 ml) y se añadió
DCM (300 ml). Se separó la fase orgánica, se lavó con disolución
NH_{4}Cl al 5% (500 ml) y salmuera (400 ml), se secó
(Na_{2}SO_{4}) y se evaporó el disolvente al vacío para dar un
sólido blanco (13), 2,51 g, 90%; TLC (1:1, EtOAc:heptano) Rf
= 0,23, electronebulización-EM m/z 352,2 (40%)
(MH^{+}), 370,3 (100%) (MH^{+} + H_{2}O).
\delta (400 MHz; CDCl_{3}); 0,82 (3H, s,
CH_{3}), 0,97 (3H, t, J 7,4, CH_{2}CH_{3}),
1,44-1,45 (1H, m, CHCH_{3}),
1,63-1,68 (1H, m, CHCH_{3}), 3,44 (1H, d,
J 4,0, CHOH), 3,66-3,69 (1H, m,
CHNH), 3,92 (6H, s, CH_{2} x 3), 5,04 (1H, d,
J 9,8, NH), 5,18 (2H, d, J 6,1,
OCH_{2}), 7,36 (5H, d, J 4,3, C_{6}H_{5}).
\delta_{C} (100 MHz; CDCl_{3}); 9,79
(CH_{2}CH_{3}), 14,27 (CH_{3}), 26,10
(CH_{2}CH_{3}), 30,56 (CCH_{3}), 57,57
(CHOH), 66,94 (CH_{2}O), 69,80 (CHNH), 72,66
(CH_{2} x 3), 108,89 (CO_{3}), 128,06
(C_{6}H_{5}), 128,47 (C_{6}H_{5}), 136,51
(C_{6}H_{5}), 156,49 (CO_{2}NH).
Se disolvió el compuesto (13) (2,51 g, 7,1 mmol)
en etanol (220 ml) y se añadió Pd al 10%/C (218 mg). Se agitó la
mezcla de reacción toda la noche en presencia de H_{2}. Se eliminó
el catalizador por filtración a través de Celite y se evaporó el
disolvente al vacío para dar un aceite espeso. La purificación por
cromatografía en columna (20:1, DCM; MeOH) dio un aceite amarillo
pálido (14), 1,24 g, 92%, que cristalizó en reposo; TLC (5:1, DCM:
MeOH), Rf = 0,51, electronebulización-EM m/z
218,1 (MH^{+}).
\delta (400 MHz; CDCl_{3}); 0,83 (3H, s,
CH_{3}), 0,98 (3H, t, J 7,4,
CH_{2}CH_{3}), 1,38-1,48 (1H, m,
CHCH_{3}), 1,71-1,78 (1H, m,
CHCH_{3}), 2,77 (1H, d, J 7,1, CHNH_{2}),
3,62-3,66 (1H, m, CHOH), 3,93 (6H, s,
CH_{2} x 3).
\delta_{C} (100 MHz; CDCl_{3}); 9,57
(CH_{2}CH_{3}), 14,37 (CH_{3}), 26,01
(CH_{2}CH_{3}), 30,52 (CCH_{3}), 58,52
(CHOH), 72,59 (CHNH_{2}), 72,67 (CH_{2} x
3), 109,62 (CO_{3}).
Se disolvió el compuesto (14) (1,24 g, 5,5 mmol)
en DCM (68 ml) y ácido trifluoracético (1,58 ml) y se añadió
H_{2}O (1,13 ml). Se agitó la disolución turbia, blanca resultante
a temperatura ambiente durante 30 minutos y se evaporó el disolvente
al vacío. Se disolvió el residuo incoloro en MeOH (66 ml) y H_{2}O
(17 ml) y se añadió Cs_{2}CO_{3} al 10% (9,2 g en 92 ml de
H_{2}O). Después de agitar durante toda una noche a temperatura
ambiente, la disolución se acidificó con HCl 2M (\sim 35 ml) a pH
< 3. Se cargó la disolución en una columna de intercambio
catiónico (Bio-Rad AG 50W-XB malla
100-200, forma de hidrógeno, 4,5 x 20 cm) se lavó
con HCl 0,01 M (500 ml) y H_{2}O (500 ml) y se eluyó con
NH_{4}OH 2 M (2 l) a continuación se liofilizó para proporcionar
un sólido amarillo pálido. Se lavó el sólido con MeOH para dar un
sólido blanquecino (15), 227 mg, 30%; TLC (4:1:1,
butan-2-ol:AcOH:H_{2}O) Rf
= 0,26, electronebulización-EM m/z 134,1 (MH^{+}),
análisis elemental C_{5}H_{11}O_{3}N (req) %C 45,10, %H 8,33,
%N 10,52, (obtenido) %C 44,67, %H 8,03, %N 9,92.
\delta (400 MHz; CDCl_{3}); 92:8
eritro (2S, 3S): treo (2S,-3R), 1,00 (3H, t, J
7,4, CH_{3}), 1,40-1,54 (2H, m,
CH_{2}), 3,41 (0,08H, d, J 4,2, CH), 3,61 (0,92H, d,
J 4,2, CH), 3,60-3,65 (0,08H, m,
CH), 3,66-3,69 (0,92H, m, CH).
\delta_{C} (100 MHz; CDCl_{3}); 11,02
(CH_{2}CH_{3}), 25,26 (CH_{2}CH_{3}), 61,26
(CHOH), 72,09 (CHNH_{2}), 172,03
(CO_{2}H).
Ejemplificado por
dihidro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5S-etil-3-(2H)-furanona
(18), siguiendo la química general detallada en el esquema 1.
Se disolvieron con agitación
(2S,3S)-hidroxinorvalina (15) (277 mg, 2,07 mmol) y
carbonato sódico (2,1 eq, 460 mg) y enfriando con hielo en agua (25
ml) y THF (10 ml). Se añadió cloroformiato de
9-fluorenilmetilo (1,05 eq, 560 mg) en THF (15 ml)
durante 45 minutos y se agitó la mezcla durante 1 hora adicional a
temperatura ambiente. Se añadieron cloroformo (100 ml) y agua (50
ml) y la mezcla se acidificó a pH 2 con HCl 0,1 N. Se recogió la
fase orgánica y se lavó la acuosa con cloroformo adicional 2 x 100
ml. Los compuestos orgánicos combinados se lavaron a contracorriente
con salmuera (1 x 300 ml) y se secaron sobre sulfato de magnesio. Se
redujo al vacío el cloroformo para dar un sólido blanco fino. Se
disolvió el sólido en éter metil terc-butílico (25 ml)
calentando y se añadió heptano (75 ml) para dar una disolución
turbia. Se enfrió la mezcla a -20ºC y cada 30 minutos se añadió
heptano adicional (75 ml) durante 4 ciclos. Se filtró el precipitado
y se secó al vacío hasta un sólido blanco fino (16) 590 mg, 80,6%;
TLC (CHCl_{3}: MeOH 3:1) Rf = 0,40,
electronebulización-EM m/z 356,2 (MH^{+}).
Siguiendo el procedimiento general detallado en
el ejemplo 1. (a) para el compuesto (1), Fmoc-(2S, 3S)- -etilserina
(16) (560 mg) se transformó en un sólido amarillo (600 mg) (17)
utilizado sin purificación.
Se enfrió a 5ºC una disolución de cloruro de
litio (1,0 g, 23,5 mmol) en ácido acético acuoso al 80% (10 ml) y se
añadió a
(2S,3S)-N-Fmoc-p-etilserinidiazometano
(17) (0,6 g) en bruto con agitación. Se disolvió el aceite durante
10 minutos y se continuó la agitación durante 1 hora adicional
calentando lentamente a temperatura ambiente, con desarrollo de gas.
Se eliminaron los disolventes al vacío y se recogió el residuo en
EtOAc (50 ml) y se lavó sucesivamente con agua (50 ml), bicarbonato
de sodio acuoso saturado (2 x 100 ml) y salmuera (75 ml), a
continuación se secó sobre sulfato de sodio. Se eliminó el
disolvente al vacío y se purificó el producto en bruto por
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (25 g) eluyendo con
EtOAc/heptano (1:3, v/v). Se agruparon las fracciones deseadas y se
redujeron al vacío para dar
dihidro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5S-etil-3(2H)-furanona
(18) como un sólido blanco, rendimiento 320 mg, 0,91 mmol, 58%.
Electronebulización-EM m/z 352 (MH^{+}),
C_{21}H_{21}O_{4}NNa por HRMS requiere M, 374,1368,
obtenido: MNa^{+}, 374,1368. (-1,49 ppm), R_{t} de HPLC
analítica = 13,61 minutos (98,4%), análisis elemental
C_{21}H_{21}O_{4}N (req) %C 71,78, %H 6,02, %N 3,99,
(obtenido) %C 70,95, %H 6,22, %N 3,81.
\delta (500 MHz; CDCl_{3}); 1,05 (3H, m,
CH_{2}CH_{3}), 1,76, 1,94 (2H, m ancho,
CH_{2}CH_{3}), 3,83 (1H, m ancho, furanona
CH\beta), 3,88 (1H, m ancho, furanona CH\alpha),
4,02 (1H, d, J 17,3, 1 x furanona COCH_{2}O), 4,23
(2H, m, 1 x furanona COCH_{2}O + Fmoc CHCH_{2}O),
4,42 (2H, b, Fmoc CHCH_{2}O), 5,05 (1H, b, furanona,
NH), 7,35 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromático), 7,42 (2H, t,
J 7,3, Fmoc aromático), 7,58 (2H, t, J 7,4, Fmoc
aromático), 7,77 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromático).
\delta_{C} (125 MHz; CDCl_{3});
8,90 (5S-CH_{2}CH_{3}), 26,14
(5S-CH_{2}CH_{3}), 46,90 (Fmoc CHCH_{2}O), 60,50
(furanona CH\alpha), 66,99 (Fmoc CHCH_{2}O),
70,43 (furanona COCH_{2}O), 81,65 (furanona
CH\beta), 119,76 (Fmoc aromático), 124,72 (Fmoc aromático),
126,85 (Fmoc aromático), 127,53 (Fmoc aromático), 141,09 (Fmoc
aromático), 143,37 (Fmoc aromático), 155,76 (OCONH), 211,72
(furanona CO).
Siguiendo el procedimiento general detallado en
el ejemplo 1. (a) para el compuesto (1),
Fmoc-(2S,3S)-O-t-butil-L-treonina
(1,99 g, 5 mmol) en
(2S,3R))-O-t-butil-L-treonildiazometano
(19) (2,11 g, 100%) como un aceite amarillo pálido inmóvil. Este
compuesto se realizó mediante la siguiente etapa sin purificación
adicional. Electronebulización-EM m/z 444
(MNa^{+}, 20%), 394 (MH^{+}-N_{2}, 70%) y 338
(MH^{+}-tbutil-N_{2} 100%).
Siguiendo el procedimiento general detallado en
el ejemplo 1. (a) para el compuesto (1),
Fmoc-(2R,3S)-O-t-butil-D-treonina (0,4
g, 1 mmol) se transformó en
(2S,3R))-N-Fmoc-O-t-butil-L-treonildiazometano
(20) (0,48 g, 111%) como un aceite amarillo pálido inmóvil. Este
compuesto se realizó mediante la siguiente etapa sin purificación
adicional. Electronebulización-EM m/z 394
(MH^{+}-N_{2}, 60%) y 338
(MH^{+}-tbutil-N_{2} 100%).
Siguiendo el procedimiento general detallado en
el ejemplo 1. (a) para el compuesto (1),
Fmoc-(2S,3S)-O-t-butil-L-alo-treonina
(0,4 g, 1 mmol) en
(2S,3S))-N-Fmoc-O-t-butil-L-alo-treonildiazometano
(21) (0,53 g, 123%) como un aceite amarillo pálido inmóvil.
Electronebulización-EM m/z 394
(MH^{+}-N_{2}, 90%) y 338
(MH^{+}-tbutil-N_{2} 60%).
Siguiendo el procedimiento general detallado
para la ciclación de (17) a (18) se cicló diazocetona (19) para dar
dihidro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5R-metil-3(2H)-furanona
(24) aislada como un sólido blanco, rendimiento 69%,
elec-troatomización-MS m/z 338
(MH^{+}, 100%), R_{t} de HPCL analítica = 14,59 minutos
(97,7%).
\delta (500 MHz; CDCl_{3}); 1,50 (3H, d
ancho, CH_{3}), 3,80 (1H, t ancho, furanona CH\alpha),
3,97 (1H, m ancho, furanona CH), 3,99 (1H, d, J 17,7,
1 x furanona COCH_{2}O), 4,22 (1H, t, J 6,7, Fmoc
CHCH_{2}O), 4,25 (1H, d, J 17,7, 1 x furanona
COCH_{2}O), 4,44 (2H, b, Fmoc CHCH_{2}O), 5,11
(1H, b, NH), 7,32 (2H, t, J 7,4, Fmoc aromático), 7,41
(2H, t, J 7,4, Fmoc aromático), 7,58 (2H, t, J 7,4,
Fmoc aromático), 7,76 (2H, t, J 7,4,Fmoc aromático).
\delta_{C} (125 MHz; CDCl_{3}); 19,1
(CH_{3}), 47,2 (Fmoc CHCH_{2}O), 62,7 (furanona
CH\alpha), 67,3 (Fmoc CHCH_{2}O), 70,8 (furanona
COCH_{2}O), 77,4 (furanona CH\beta), 120,1 (Fmoc
aromático), 125,0 (Fmoc aromático), 127,1 (Fmoc aromático), 127,8
(Fmoc aromático), 141,4 (Fmoc aromático), 143,7 (Fmoc aromático),
156,1 (OCONH), 211,8 (furanona CO).
Siguiendo el procedimiento general detallado
para la ciclación de (17) a (18) se cicló diazocetona (20) para dar
dihidro-(4R-amino-[N-Fmoc])-5S-metil-3(2H)-furanona
(23) aislada como un sólido blanco. Rendimiento 70%,
elec-troatomización-MS m/z 338
(MH^{+}, 75%), Rt de HPCL analítica = 14,52 min (98,9%).
Siguiendo el procedimiento general detallado
para la ciclación de (17) a (18) se cicló diazocetona (21) para dar
dihidro-(4S-amino-[N-Fmoc])-5S-metil-3(2H)-furanona
(23) aislada como un sólido blanco. Rendimiento 64%,
elec-troatomización-MS m/z 338
(MH^{+}, 100%), Rt de HPCL analítica = 14,68 min (97,5%).
Siguiendo la química detallada en el esquema 3.
Ejemplificada por la síntesis de
(2S,3S)-\beta-hidroxinorvalina
(15) (también denominada (2S,
3S)-\beta-etilserina)
Se disolvió D-manitol (49,5 g,
0,27 mol) en acetona (600 ml, 99,9%). Se añadió a la suspensión
H_{2}SO_{4} (4,95 ml) y se agitó la mezcla a 21ºC toda la noche.
Se filtró a continuación la disolución y se neutralizó la disolución
transparente con una disolución saturada de NaHCO_{3} hasta pH =
6. Se concentró al vacío el disolvente, proporcionando
tri-acetona-D-manitol como un sólido blanco,
rendimiento 78 g, 96%. Electronebulización-EM m/z
303 (MH^{+}).
Se disolvió
tri-acetona-D-manitol
(78 g, 0,26 mol) en la cantidad mínima de ácido acético al 70% (400
ml) y se agitó en baño de agua a 42,7ºC durante 1,5 horas. Se
evaporó el disolvente al vacío rápidamente para dar
3,4-isopropiledina-D-manitol
como un aceite incoloro, rendimiento 57,6 g, 99,8%.
Electronebulización-EM m/z 223 (MH^{+}).
Se disolvió
3,4-isopropilidina-D-manitol
(57,64 g, 0,26 mol) en cloruro de bencilo (543 ml). Se añadió KOH
(500 g) a la disolución agitada potenciada y se calentó la
disolución en un baño de aceite a 133ºC por 2 h. Se dejó enfriar la
mezcla a temperatura ambiente y se vertió en un vaso de precipitados
de 3000 ml. Se añadieron con cuidado hielo y agua (1400 ml), se
extrajo la mezcla con DCM (800 ml) y se extrajo más la fase acuosa
con DCM (300 ml). Se secaron los extractos orgánicos sobre sulfato
de sodio y se concentró la disolución filtrada al vacío. Se purificó
el residuo por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice
eluyendo con EtOAc/heptano (1:15 a 1:10 v/v) para dar el compuesto
(35) como un aceite incoloro, rendimiento 77 g, 51%.
Electronebulización-EM m/z 583 (MH^{+}). R_{t}
de HPLC analítica = 29,16 minutos (91,8%).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 1,35 (6H,
s, C(CH_{3})_{2}), 3,62 (2H, dd, J 6, 10, 2
\times CHOC), 3,75 (4H, m, 2 \times CH_{2}OBn),
4,15-4,20 (1H, m, CHOBn), 4,46 (1H, dd, J
12,5, 14,5, CHOHn), 4,77 (4H, d, J 11,5, 4 \times
CH_{2A}C_{6}H_{5}), 4,73 (4H, d, J 11,5, 4
\times CH_{2B}C_{6}H_{5}) y 7,25-7,34
(20H, m, 4 \times C_{6}H_{5}).
En un matraz de 2000 ml equipado con un
condensador se disolvió el compuesto (35) (41,11 g, 0,071 mol) en
ácido acético al 70% (700 ml) y se agitó la disolución a 100% en un
baño de aceite durante 1,5 horas. Después de concentración al vacío,
se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida sobre gel de
sílice eluyendo con EtOAc/heptano (3:7, v/v) para dar el compuesto
(36) como un aceite amarillo pálido, rendimiento 21,8 g, 57%.
Electronebulización-EM m/z 543
(MH^{+}). HPLC analítica R_{t} = 25,8 minutos (100%).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 3,01 (2H,
d, J 6,0 2 \times = H), 3,65-3,70 (2H, m, 2
\times CHOBn), 3,72-3,78 (4H, m, 2 \times
CH_{2}OBn), 3,93-3,97 (2H, m, 2 \times
CHOH), 4,55 (4H, s, 2 \times
CH_{2}C_{6}H_{5}), 4,73 (2H, d, J 11,5, 2 \times
CH_{2A}C_{6}H_{5}), 4,77 (2H, d, J 11,5 2 \times
CH_{2B}C_{6}H_{5}) y 7,25-7,34 (20H,
m, 4 \times C_{6}H_{5}).
Se disolvió el compuesto (36) (10,78 g, 0,02
mol) en tolueno anhidro (150 ml). Mientras se agitaba fuertemente se
añadió tetraacetato de plomo (9,83 g, 0,023 mol, 1,1 eq) como sólido
y se agitó la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente. Se
filtró a continuación la mezcla y se concentró el filtrado al vacío
para dar el compuesto (37) como un aceite incoloro, rendimiento 10,2
g, 95%.
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}),
3,75-3,83 (2H, m, CH_{2}OBn), 3,97 (1H, t,
J 4, CHOBn), 4,55 (2H, d, J 5,5, 2 \times
CH_{2A}C_{6}H_{5}), 4,70 (2H, d, J 12, 2
\times CH_{2B}C_{6}H_{5}), 7,20-7,40
(10H, m, C_{6}H_{5} 2 \times) y 9,70 (1H, s,
CHO).
Se disolvió bencilamina (4,06 ml, 0,037 mol, 1
eq) en éter dietílico anhidro (150 ml) y se enfrió la disolución a
0ºC. A una disolución del compuesto (37) (9,9 g, 0,037 mol, 1 eq) en
éter dietílico anhidro (100 ml) a 0ºC, se añadió sulfato de magnesio
anhidro (7,3 g) y se transfirió la disolución mediante cánula bajo
argón a la disolución de la amina. Después de agitar durante 3 horas
se concentró al vacío la mezcla de reacción para dar el compuesto
(38) como un aceite incoloro en bruto, rendimiento 12,2 g, 96%.
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}),
3,75-3,83 (2H, m, CH_{2}OBn),
4,17-4,25 (1H, m, CHOBn), 4,57 (2H, s,
NCH_{2}C_{6}H_{5}), 4,62 (2H, m, 2 \times
CH_{2A}C_{6}H_{5}), 4,70 (2H, m,
CH_{2B}C_{6}H_{5}), 7,20-7,40 (15H, m,
3 \times C_{6}H_{5}) y 7,70 (1H, m, CHN).
Se disolvió bromuro de fenilmagnesio (29,17 ml,
0,087 mol, 3,0 M, 2,5 eq) en éter dietílico anhidro (124 ml) y se
enfrió la disolución a 0ºC bajo argón. Se transfirió una disolución
del compuesto (38) (12,5 g, 0,035 mol) en éter dietílico anhidro
(140 ml) mediante cánula en la disolución del bromuro de
fenilmagnesio y se agitó la mezcla de reacción a temperatura
ambiente durante 2 horas. La disolución se vertió en una disolución
acuosa de NH_{4}Cl (200 ml) y se extrajo con éter
metilterc-butílico (100 ml 2 \times). Los extractos
combinados, secados sobre sulfato de sodio anhidro, se concentraron
al vacío. El aceite en bruto obtenido se purificó por cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc/heptano (1:4
v/v) para proporcionar el compuesto (39) como un aceite amarillo
pálido, rendimiento 8,5 g, 56%.
Electronebulización-EM m/z 438 (MH^{+}). Rt de
HPLC analítica = 24,0 min (98%).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 2,45 (1H,
s ancho, NH), 3,32 (1H, dd, J 10, 4,5, CH_{2A}OBn), 3,43
(1H, d, J 13, C_{5}H_{5}CH_{2A}
NH), 3,50-3,54 (1H, dd, J 10, 3, CH_{2B}OBn), 3,55-3,61 (1H, d, J 13, C_{6}H_{5}CH_{2B}NH), 3,65-3,78 (1H, m, CHOBn), 3,90 (1H, d, J 7, C_{6}H_{5}CHNH), 4,40 (2H, s, OCH_{2}C_{6}H_{5}), 4,62 (1H, d, J 11, OCH_{2A}C_{6}H_{5}), 4,70 (1H, d, J 11, OCH_{2B}C_{6}H_{5}) y 7,18-7,40 (20H, m, C_{6}H_{5} 4 \times).
NH), 3,50-3,54 (1H, dd, J 10, 3, CH_{2B}OBn), 3,55-3,61 (1H, d, J 13, C_{6}H_{5}CH_{2B}NH), 3,65-3,78 (1H, m, CHOBn), 3,90 (1H, d, J 7, C_{6}H_{5}CHNH), 4,40 (2H, s, OCH_{2}C_{6}H_{5}), 4,62 (1H, d, J 11, OCH_{2A}C_{6}H_{5}), 4,70 (1H, d, J 11, OCH_{2B}C_{6}H_{5}) y 7,18-7,40 (20H, m, C_{6}H_{5} 4 \times).
Se disolvió el compuesto (39) (9,26 g, 0,02 mol)
en dioxano (66 ml) y se añadió diisopropilamina (0,37 ml, 0,0021
mol, 0,11 eq). A la disolución agitada se añadió en forma sólida
dicarbonato de di-terc-butilo (11,25 g, 0,0516 mol, 2,6 eq) y
se agitó la disolución a 50ºC en un baño de aceite durante toda una
noche. Se trató la mezcla con éter metiltercbutílico (300
ml), se lavó con disolución acuosa de KHSO_{4} 1,0 M (600 ml) y
los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y
se concentraron al vacío. Se purificó el aceite en bruto por
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con
EtOAc/heptano (1:9 v/v) para dar el compuesto (40) como un aceite
incoloro, rendimiento 7,7 g, 71%.
Electronebulización-EM m/z 538 (MH^{+}). HPLC
analítica Rt = 30,0 minutos (95%).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 1,30 (9H,
s, C(CH_{3})_{2}), 3,44 (1H, dd, J 10, 4,5
CH_{2A}OBn), 3,61 (1H, dd, J 10, 2,
CH_{2B}OBn), 4,30 (1H, m, CH_{2A}N), 4,37 (2H, d,
J 12 OCH_{2A}C_{6}H_{5}), 4,43 (2H, d, J
12 OCH_{2B}C_{6}H_{5}), 4,50-4,63 (1H,
m, CH_{2B}N), 4,85 (1H, m, CHOBn), 5,25 (1H, d, J 9,
C_{6}H_{5}CHN) y 7,00-7,45 (20H, m,
C_{6}H_{5} 4 \times).
Se disolvió el compuesto (40) (7,67 g, 0,014
mol) en metanol anhidro (80 ml). Después de calentar a reflujo el
matraz en argón, se añadió con cuidado, Pd(OH)_{2}
al 20%/C (10,00 g, tipo E101 NE/W húmedo de Degussa) y se agitó la
mezcla bajo H_{2} durante 48 horas. Se filtró la mezcla con
cuidado a través de un lecho de Celite y se lavó el catalizador con
una disolución de metanol acuoso (10:100 H_{2}O:CH_{3}OH, v/v).
Se concentró la disolución filtrada al vacío y se purificó el
residuo por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo
con EtOAc/heptano (3:1, v/v) para dar el compuesto (41) como un
aceite incoloro, rendimiento 2,7 g, 72%.
Electronebulización-EM m/z 268 (MH^{+}). Rt de
HPLC analítica = 15,3 minutos (100%).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 1,44 (9H,
s, C(CH_{3})_{2}), 2,6 (2H, s ancho, OH), 3,56
(2H, d, J 5,5 CH_{2}OH), 3,97 (1H, s,
C_{6}H_{5}CHNH), 4,83 (1H, s,
C_{6}H_{5}CHCHOH), 5,28 (1H, d, J 8, NH) y
7,20-7,45 (5H, m, C_{6}H_{5}).
Se disolvió el compuesto (41) (2,67 g, 0,01 mol)
en DMF anhidro (60 ml) y se agitó bajo argón. Se añadió imidazol
(1,5 g, 0,022 mol, 2,2 eq) seguido de la adición de TBDMSCl (1,66 g,
0,011 mol, 1,1 eq). Se agitó la mezcla de reacción durante toda una
noche a temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla con éter (240 ml),
se lavó con NH_{4}Cl saturado (120 ml) y H_{2}O (40 ml) y se
extrajo la fase acuosa con éter (4 \times 100 ml). Se secaron los
extractos combinados sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y
se concentraron al vacío. La purificación del residuo sobre gel de
sílice eluyendo con EtOAc/heptano (3:1 v/v) proporcionó el compuesto
(42) como un aceite incoloro, rendimiento 3,31 g, 87%.
Electronebulización-EM m/z 382 (MH^{+}).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 0,05 (3H,
s, CH_{3A}SiCH_{3}), 0,06 (3H, s, CH_{3}
SiCH_{3B}), 0,89 (9H, s, Si(CH_{3})_{3}),
1,39 (9H, s ancho, C(CH_{3})_{3}), 2,45
(1H, s ancho, OH), 3,51 (1H, dd, J 10,7,
TBDMSOCH_{2A}), 3,65 (1H, dd, J 10, 4,5
TBDMSOCH_{2B}), 3,85 (1H, m, CHOH), 4,66 (1H, m,
C_{6}H_{5}CHNH), 5,45 (1H, s ancho, NH) y
7,23-7,35 (5H, m, C_{6}H_{5}).
Se disolvió el compuesto (42) (1,30 g, 3,40
mmol, 1,0 eq) en DCM anhidro (30 ml). Se añadió a la disolución TEA
(0,57 ml, 4,09 mmol, 1,2 eq) y se enfrió la mezcla a 0ºC en un baño
de agua con hielo. A esta temperatura y bajo argón, se añadió una
disolución de MsCl (0,32 ml, 4,09 mmol, 1,2 eq) en DCM anhidro (3
ml). Se agitó la mezcla durante 1,5 h. Se trató la mezcla de
reacción con agua (20 ml) y se extrajo con DCM (20 ml). La fase
acuosa se extrajo adicionalmente con DCM (4 \times 60 ml) y se
secaron las fases orgánicas combinadas sobre sulfato de sodio
anhidro y se concentraron al vacío. Se purificó el residuo por
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con
EtOAc/heptano (1:3, v/v) dando el compuesto (43) como un aceite
incoloro, rendimiento 1,30 g, 83%.
Electronebulización-EM m/z 460 (MH^{+}). Rt de
HPLC analítica = 27,1 minutos (98%).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}) 0,06 (3H,
s, CH_{3A}SiCH_{3}), 0,07 (3H, s,
CH_{3}SiCH_{38}), 0,91 (9H, s ancho,
C(CH_{3})_{3}), 1,42 (9H, s ancho,
C(CH_{3})_{3}), 2,54 (3H, s,
SO_{2}CH_{3}), 3,77 (2H, d, J 6,0, TBDMSOCH_{2}), 4,7
(1H, m, CHOH), 5,1(1H, m, C_{6}H_{5}CHNH),
5,4 (1H, s a, NH) y 7,26-7,38 (5H, m,
C_{6}H_{5}).
Se disolvió el compuesto (43) (3,79 g, 8,26
mmol, 1,0 eq) en THF anhidro (78 ml) y se enfrió la disolución a 0ºC
en un baño de agua con hielo. Se añadió gota a gota TBAF (16,52 ml,
disolución 1,0 M en THF, 16,52 mmol, 2 eq) mediante una jeringuilla
y una vez completada la adición se retiró del baño de hielo. Se
agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente toda la noche y a
continuación se trató con agua (40 ml), se extrajo con éter
dietílico (40 ml) y se continuó extrayendo la fase acuosa con éter
dietílico (75 ml 3 \times). Se secaron los extractos combinados
sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron al
vacío. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida sobre
gel de sílice eluyendo con TBME/heptano (1:6 a 2:1, v/v) dando el
compuesto (44) como un sólido blanco, rendimiento 1,0 g, 48%.
Electronebulización-EM m/z 250 (MH^{+}).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 1,42 (9H,
s, C(CH_{3})_{3}), 2,50 (1H, dd, J 5, 2,2,
CHCH_{2A}O), 2,76 (1H, dd, J 5,4,
CHCH_{2B}O), 3,20-3,30 (1H, m,
CHCH_{2}O), 4,72 (1H, s ancho, C_{6}H_{5}CHCHO),
5,00 (1H, s ancho, NH) y 7,27-7,38 (5H, m,
C_{6}H_{5}).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se dispersó yoduro de cobre (I) (0,574 g, 3,01
mmol, 5 eq) en éter dietílico anhidro (17 ml). Después de enfriar la
suspensión a -35ºC bajo argón, se añadió gota a gota CH_{3}Li en
éter dietílico (3,76 ml, 1,6 M, 6,02 mmol, 10 eq). Después de agitar
a -35ºC durante 30 minutos se disolvió una disolución del compuesto
(44) (0,15 g, 0,60 mol, 1,0 eq) en éter dietílico (1,5 ml) se añadió
gota a gota a la disolución del organocuprato y se agitó la mezcla
de reacción a -35ºC durante 1,5 horas. Se añadió acetato de etilo
(12,5 ml) seguido de la adición cuidadosa de una disolución saturada
de NH_{4}Cl (10 ml) y agua (3 ml). Se dejó calentar la mezcla a
temperatura ambiente y se extrajo la fase orgánica. Se extrajo
adicionalmente la fase orgánica con acetato de etilo (15 ml 3
\times) y se secaron los extractos combinados sobre sulfato de
sodio anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El aceite en bruto
se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice
eluyendo con TBME/heptano (2:3 v/v) proporcionando el compuesto (45)
como un sólido blanco, rendimiento 0,14 g, 88%.
Electronebulización-EM m/z 266 (MH^{+}). HPLC
analítica Rt = 17,6 minutos (100%).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 0,97 (3H,
t, J 7,5, CH_{3}CH_{2}), 1,10-1,25
(1H, m, CH_{3}CH_{2A}), 1,25-1,50 (1H, m,
J 5,4, CH_{3}CH_{2B}), 1,50 (9H, s,
C(CH_{3})_{3}), 3,78 (1H, s ancho CHOH),
4,73 (1H, s ancho C_{6}H_{5}CHNH), 5,28 (1H, s ancho NH)
y 7,25-7,38 (5H, m, C_{6}H_{5}).
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\vskip1.000000\baselineskip
En un tubo sellado, se disolvió el compuesto
(45) (0,114 g, 0,43 mmol) en DCM anhidro (11 ml). Mientras se
mantenía la agitación, se sumergió el tubo en un baño de nieve
carbónica-acetona y se enfrío a -60ºC. Se condensó
el isobutileno (11 ml) en el tubo y se añadió con cuidado triftalato
de metilo (55 l). Se tapó el tubo herméticamente y se retiró el baño
para permitir que procediera la reacción a temperatura ambiente
durante 4 días. Se enfrió el tubo a -60ºC, se quitó el tapón y a
continuación se retiró del baño para permitir al exceso de
isobutileno evaporarse lentamente mientras se calentaba a
temperatura ambiente. Se añadió TEA (0,7 ml) a aproximadamente
10ºC, para neutralizar el exceso de ácido. Se purificó el residuo
obtenido después de la eliminación de los disolventes al vacío
mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con
EtOAc/heptano (2:8, v/v) dando el compuesto (46) como un sólido
blanco, rendimiento 0,02 g, 14%.
Electronebulización-EM m/z 322 (MH^{+}). Rt de
HPLC analítica = 24,1 minutos (90%).
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 0,84 (3H,
t, J 7,5, CH_{3}CH_{2}), 1,15-1,30
(1H, m, CH_{3}CH_{2A}), 1,24 (9H, s,
CHOC(CH_{3})_{3}),
1,35-1,40 (1H, m, CH_{3}CH_{2B}), 1,41
(9H, s, CO_{2}C(CH_{3})_{3}), 3,72 (1H,
m, CHO(CH_{3})_{3}), 4,78 (1H, m,
C_{6}H_{5}CHNH), 5,15 (1H, s ancho, NH) y
7,22-7,38 (5H, m, C_{6}H_{5}).
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\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el compuesto (46) (0,024 g, 0,074
mmol, 1 eq), en una mezcla de CCl_{4}/CH_{3}CN/H_{2}O (1:1:2
v/v/v, 2,4 ml). A la disolución bifásica agitada se añadió
NaNO_{3} (0,104 g, 1,5 mmol, 16,9 eq) como un sólido, seguido de
la adición cuidadosa de NalO_{4} (0,284 g, 1,33 mmol, 18 eq).
Después de 10 minutos se añadió RuCl_{3}\cdot3H_{2}O (1,5 mg,
7,23 \mumol, 0,1 eq) y la mezcla de reacción se agitó durante 48
horas. Se trató la disolución con EtOAc (15 ml) y se acidificó a pH
= 3 por adición gota a gota de ácido cítrico (10%). Se continuó
extrayendo la fase orgánica con EtOAc (3 \times 15 ml) y se
secaron los extractos combinados sobre sulfato de magnesio anhidro,
se filtraron y se concentraron al vacío. Se purificó el residuo en
bruto por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo
con un gradiente de MeOH/CH_{3}Cl (0,1:10 a 1,0:10, v/v) para dar
el compuesto (47) como un sólido blanco, rendimiento 0,009 g,
42%.
Electronebulización-EM m/z 290
(MH^{+}).
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\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el compuesto (47) (9 mg, 0,03 mmol)
en una disolución de HCl en dioxano (1 ml, 4,0 M). Después de agitar
durante 3 horas a temperatura ambiente, se eliminó el disolvente al
vacío y se liofilizó el residuo utilizando CH_{3}CN/H_{2}O (4:1
v/v) para dar
(2S,3S)-hidroxi-norvalina (15) como
un sólido blanco, 3,0 mg, 75%.
Electronebulización-EM m/z 134 (MH^{+}).
\delta_{H} (500 MHz, CD_{3}OD), 1,00 (3H,
t, J 7,5, CH_{3}CH_{2}), 1,50-1,65
(2H, m, CH_{3}CH_{2}), 3,88-3,95 (1H, m,
CHOH) y 3,98 (1H, d, J 3,
C_{6}H_{5}CHNH_{2}).
La química general representada en el esquema 6
será publicada brevemente en toda la bibliografía académica, por sus
inventores CS Dexter y RFW Jackson en la Universidad de Newcastle,
Inglaterra.
Se pesó polvo de zinc (150 mg, 2,3 mmol, 3,0 eq,
Aldrich) en un matraz de fondo redondo de 25 ml con un tubo lateral
y equipado con un tapón de 3 vías. Se calentó el polvo de zinc con
un mechero al vacío y el matraz se roció con nitrógeno y se evacuó y
se roció unas tres veces más. Con el matraz relleno con nitrógeno,
se añadió DMF anhídrido (1 ml). Se añadió cloruro de trimetilsililo
(30 \mul, 0,23 mmol, 0,3 eq) y se agitó fuertemente la lechada de
zinc durante 30 minutos adicionales.
Se añadió gota a gota, mediante una cánula,
éster metílico de
N-(terc-butoxicarbonil)-3-yodo-L-alanina
(247 mg, 0,75 mmol, 1,0 eq) disuelto en DMF seco (0,5 ml), a la
lechada de zinc activado a 0ºC preparada como se describió
anteriormente. Se dejó calentar la mezcla de reacción a continuación
a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora para dar el
reactivo de organozinc.
Mientras estaba avanzando la reacción de
inserción del zinc, se pesó CuBr.SMe_{2} (20 mg, 0,1 mmol, 0,13
eq) en un matraz de fondo redondo de 25 ml provisto de un tapón de
tres vías y se secó (suavemente) con un mechero al vacío hasta que
el CuBr.SMe_{2} cambió de aspecto desde un polvo marrón para dar
un polvo verde claro. Se añadió a continuación DMF anhídrido (0,5
ml) seguido de la adición del electrófilo (bien
1-bromo-2-metilbut-2-eno,
éster tolueno-4-ácido
sulfónico-(E)-2-metil-but-2-enílico
o bien
1-bromo-2,3-dimetilbut-2-eno)
(1,0 mmol, 1,3 eq). Se enfrió a continuación la mezcla de reacción a
-15ºC.
Se interrumpió la agitación de la disolución del
reactivo de organozinc para dejar sedimentar el polvo de zinc y se
eliminó con cuidado el sobrenadante mediante una cánula (tener
cuidado de evitar transferir demasiado polvo de zinc) y se añadió
gota a gota a la disolución del electrófilo y del catalizador de
cobre. Se retiró del baño de enfriamiento y se agitó la disolución a
temperatura ambiente toda la noche. Se añadió acetato de etilo (20
ml) y se continuó la agitación durante 15 minutos adicionales. Se
transfirió la mezcla de reacción a un embudo de separación y se
añadió una alícuota adicional de EtOAc (30 ml). Se lavó la fase
orgánica sucesivamente con Na_{2}S_{2}O_{3} 1M (20 ml), agua
(2 \times 20 ml), salmuera (40 ml), se secó sobre sulfato de sodio
y se filtró. Se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el
producto en bruto por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice
tal como se describió.
Se disolvió el alqueno (1,0 mmol) en etanol (10
ml), se añadió paladio al 10% sobre carbono (80 mg) y se introdujo
hidrógeno. Una vez se había estimado que se había terminado la
reacción, se eliminó el hidrógeno, se filtró la reacción a través de
Celite y se lavó el catalizador con etanol (30 ml). Se concentró al
vacío el filtrado orgánico combinado y se utilizó directamente el
alqueno en la reacción posterior.
Se disolvió el éster metílico (1,0 mmol) en THF
(6 ml) y mientras se agitaba, se añadió gota a gota una disolución
de LiOH (1,2 mmol, 1,2 eq) en agua (6 ml). Una vez se estimó que se
había terminado la reacción se eliminó el THF al vacío y se añadió
éter dietílico (10 ml) al residuo. Se acidificó a continuación la
mezcla de reacción con HCl 1,0 M hasta pH = 3. Se eliminó a
continuación la fase orgánica y la fase acuosa se extrajo con éter
dietílico (2 \times 10 ml). Se secaron los extractos orgánicos
combinados sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se eliminó el
disolvente al vacío para dar el ácido carboxílico utilizado
directamente en la reacción posterior.
Se disolvió el material protegido
N-Boc (1,0 mmol) en DCM (2 ml) y se enfrió a 0ºC. Se
añadió ácido trifluoroacético (2 ml) gota a gota y cuando se estimó
que la reacción había terminado, se eliminaron al vacío los
disolventes para producir la amina utilizada directamente en la
reacción posterior. Alternativamente, el material protegido
N-Boc (1,0 mmol) se enfrió a 0ºC y se añadió gota a
gota HCl 4 M en dioxano (5 ml) y cuando se estimó que la reacción
había ter-
minado, se eliminaron los disolventes al vacío para producir la amina utilizada directamente en la reacción posterior.
minado, se eliminaron los disolventes al vacío para producir la amina utilizada directamente en la reacción posterior.
Se enfrió a 0ºC la amina (1,0 mmol) en
1,4-dioxano (2 ml) y se añadió carbonato de sodio al
10% (2,2 mmol, 2,2 eq, 2 ml). Se agitó fuertemente la mezcla de
reacción bifásica y se añadió Fmoc-Cl (1,1 mmol, 1,1
eq). Una vez se estimó que la reacción se había terminado, se añadió
éter dietílico (10 ml) y se acidificó la mezcla de reacción a pH = 3
con HCl 1 M. Se eliminó la fase orgánica y se extrajo la fase acuosa
con éter dietílico (2 \times 10 ml). Se secaron los extractos
orgánicos combinados sobre sulfato de sodio, se filtraron, se
eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo por
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice.
Ejemplo de Síntesis
1
El esquema siguiente explica cómo se preparó y
aisló el éster metílico del ácido
(S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4,4-dimetil-hex-5-enoico
(62) ópticamente puro.
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Siguiendo el procedimiento general para las
reacciones de aclopamiento de zinc, se acopló
1-bromo-3-metilbut-2-eno
(115 \mul, 1,0 mmol) al compuesto (61) (247 mg, 0,75 mmol) en
presencia de CuBr\cdotSMe_{2} (20 mg, 0,1 mmol) dando un residuo
que se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel
de sílice eluyendo con EtOAc/:60 éter de petróleo (1:9, v/v). Se
agruparon las fracciones y se redujeron al vacío dando una mezcla de
regioisómeros (2:1 SN2' formal frente a SN2), inseparables por
cromatografía en columna, como aceite incoloro, rendimiento 190 mg,
93%.
A una mezcla de regioisómeros (190 mg, 0,7 mmol)
en cloroformo (3 ml) se añadió gota a gota durante 5 minutos, ácido
3-cloroperbezoico (156 mg, 85% puro, 0,8 mmol, 1,1
eq) en cloroformo (2 ml). Se agitó la mezcla de reacción a
temperatura ambiente durante 2 horas adicionales. La mezcla de
reacción se lavó a continuación sucesivamente con
Na_{2}S_{2}O_{5} 1 M (5 ml), disolución saturada de
bicarbonato de sodio (5 ml) y salmuera (10 ml). Se secó la fase
orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró, se eliminó el disolvente
al vacío y se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice eluyendo con EtOAC/40:60 de éter de petróleo
(2:8, v/v). Se obtuvieron tres productos; se eluyó el compuesto (62)
en primer lugar y después de la elución dio una mezcla inseparable
del compuesto (63) y del compuesto (64). Las fracciones del
componente inicial se agruparon y se redujeron al vacío dando el
éster metílico del ácido
2S-2-terc-butoxicarbonilamino-4,4-dimetil-hex-5-enoico
(62) como un aceite transparente, rendimiento 93 mg, 49%.
Electronebulización MS m/z 272 (MH^{+}). Rt de HPLC analítica =
21,45 minutos (95%), C_{10}H_{17}O_{4}N por HRMS requiere
M, 215,11,58, obtenido:
M^{+}-C_{4}H_{8} 215,1152 (-2,8 ppm); IR
(película cap.)/cm^{-1} 3369 (s), 3084 (m), 2965 (s), 1748 (s),
1715 (s), 1517 (s), 1167 (s), 1007 (s), 914 (s)
\delta_{H} (500 MHz; CDCl_{3}), 1,06 (6H,
s CH_{2}=CHC(CH_{3})_{2}), 1,42 (9H, s,
C(CH_{3})_{3}), 1,55 (1H, dd, J
14,9, CH_{2}=CHC (CH_{3})_{2}CH_{2}A_{1}),
1,82 (1H, dd, J 14, 3,
CH_{2}=CHC(CH_{3})_{2}CH_{2B}), 3,69
(3H, s, OCH_{3}), 4,30 (1H, m, NHCHCO_{2}CH_{3}), 4,83
(1H, d ancho J 7, NH), 4,97 (2H, m, CH_{2}=CH) y 5,78 (1H,
dd, J_{trans} 17,5, J_{cis} 11,
CH_{2}=CH)
\delta_{C} (125 MHz; CDCl_{3}) 26,93
CH_{2}=CHC(CH_{3})_{2}), 28,34
(C(CH_{3})_{3}), 36,33
(CH_{2}=CHC(CH_{3})_{2}CH_{2}), 45,06
(CH_{2}=
CHC(CH_{3})_{2}), 51,25 (NHCHCO_{2}CH_{3}), 52,15 (OCH_{3}), 79,77 (C(CH_{3})_{3}), 111,39 (CH_{2}=CH), 146,87 (CH_{2}=CH), 154,97 (NHCO_{2}Bu^{t}) y 174,04 (CO_{2}CH_{3}).
CHC(CH_{3})_{2}), 51,25 (NHCHCO_{2}CH_{3}), 52,15 (OCH_{3}), 79,77 (C(CH_{3})_{3}), 111,39 (CH_{2}=CH), 146,87 (CH_{2}=CH), 154,97 (NHCO_{2}Bu^{t}) y 174,04 (CO_{2}CH_{3}).
Siguiendo el procedimiento general para la
hidrogenación de alquenos, el compuesto (62) (93 mg, 0,3 mmol) dio
el compuesto (65) como un aceite incoloro, rendimiento 90 mg, 96% y
se utilizó directamente en la reacción posterior.
Electronebulización-EM m/z 274 (MH^{+}). Rt de
HPLC analítica = 22,55 minutos (100%).
Siguiendo el procedimiento general para la
saponificación del éster metílico, el compuesto (65) (90 mg, 0,3
mmol) dio el compuesto (66) como cristales, rendimiento 79 mg, 92% y
se utilizó directamente en la reacción posterior.
Electronebulización-EM m/z 260 (MH^{+}). Rt de
HPLC analítica = 20,90 minutos (100%).
Siguiendo el procedimiento general de
eliminación de N-Boc que utiliza TFA, el compuesto
(66) (79 mg, 0,3 mmol) dio el compuesto (67) como un sólido,
rendimiento 80 mg, 96% y se utilizó directamente en la reacción
posterior. Electronebulización-EM m/z 274
(MH^{+}).
Siguiendo el procedimiento general para la
protección de Fmoc de una amina, el compuesto (67) (80 mg, 0,3 mmol)
dio por purificación de cromatografía ultrarrápida sobre gel de
sílice eluyendo con CHCl_{3}/CH_{3}OH (100:2 a 96:4, v/v) ácido
2S-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-4,4-dimetil-hexanoico
(68) como un sólido, rendimiento 60 mg, 54%.
Electronebulización-EM m/z 382 (MH^{+}). Rt de
HPLC analítica = 23,63 minutos (100%);
[\alpha]_{D}^{17} -18,4 (c 0,25 en EtOH).
\delta_{H} (500 MHz; CDCl_{3}), 0,88 (3H,
t, J 7, CH_{3}CH_{2}), 0,95 (6H, s,
CH_{2}CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 1,31 (2H,
m, CH_{3}CH_{2}), 1,46 (1H, dd, J 14,5, 10,
CH_{3}CH_{2}C(CH_{3})_{2}CH_{2A}),
1,85 (1H, d ancho, J 14,5
CH_{3}CH_{2}C(CH_{3})_{2}CH_{2B}),
4,21 (1H, t, J 6,5, CH-Fmoc), 4,41 (3H, m,
NHCHCO_{2}H y CH_{2}O), 5,02 (1H, d ancho, J 8,
NH-Fmoc), 7,29 (2H, m, H-2' y
H-7'), 7,38 (2H, m, H-3' y
H-6'), 7,58 (2H, m, H-1' y
H-8') y 7,74 (2H, d, J 7, H-4' y
H-5').
\newpage
Ejemplo de Síntesis
2
Se obtuvieron el éster metílico del ácido
2S,4S-2-terc-butoxicarbonilamino-4,5-dimetil-hex-5-enoico
(69) y del éster metílico del ácido
2S,4R-2-terc-butoxi-carbonilamino-4,5-dimetil-hex-5-enoico
(70) ópticamente puros después de la reacción de acoplamiento con
zinc por cromatografía ultrarrápida.
Siguiendo el procedimiento general para las
reacciones de aclopamiento con zinc, se acopló el éster
(E)-2-metil-but-2-enílico
del ácido toluen-4-sulfónico (1,45
ml, 1,0 mmol) al compuesto (61) (247 mg, 0,75 mmol) en presencia de
CuBr\cdotSMe_{2} (20 mg, 0,10 mmol) dando un residuo que se
purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo
con EtOAc/40:60 éter de petróleo (1:9 v/v) dando dos diastereómeros.
Rt de HPLC analítica = 22,49 minutos (60%) y Rt = 22,52 minutos
(40%). Las fracciones del primer componente eluido se agruparon
dando uno de los diastereómeros obtenidos como aceite incoloro,
rendimiento 36 mg, 18%. Después se obtuvo una mezcla de los
diastereómeros como aceite incoloro, rendimiento 75 mg, 37%. Las
fracciones puras que contienen el último componente eluido se
agruparon dando el otro diastereómero como aceite incoloro,
rendimiento 19 mg, 9%. (La estereoquímica en la posición 4 no se
investigó). Datos espectrales obtenidos para el diastereómero de
trayectoria rápida: Electronebulización-EM m/z 272
(MH^{+}); [\alpha]_{D}^{20} + 12,3 (c 1,06 en
CHCl_{3}); IR (película cap.)/cm^{-1} 3382 (s), 3070 (m), 2966
(s), 1746 (s), 1716 (s), 1616 (w), 1507 (s), 886 (m)
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 1,06 (3H,
d, J 7, CH_{3}CH), 1,45 (9H, s,
C(CH_{3})_{3}), 1,58 (1H, m,
CH_{3}CH), 1,68 (3H, s, CH_{3}C=CH_{2}), 1,85
(1H, m, CH_{2A}CH), 1,97 (1H, m, CH_{2B}CH), 3,73
(3H, s, OCH_{3}), 4,29 (1H, m, NHCHCO_{2}CH_{3}), 4,72
(1H, s, CH_{2A}=CH), 4,95 (1H, d, J 1,5,
CH_{2B}=CH) y 5,04 (1H, d, J 7, NH)
\delta_{C} (125 MHz; CDCl_{3}),
18,61 (CH_{3}C=CH_{2}), 21,64 (CH_{3}CH), 28,32
(C(CH_{3})_{3}), 30,79
(CH_{3}CHCH_{2}), 38,06 (CH_{2}
CHNH), 52,00 (NHCHCO_{2}CH_{3}), 52,22 (OCH_{3}), 79,53 (C(CH_{3})_{3}), 110,19 (CH_{2}=C(CH_{3})), 144,62 (CH_{2}=C(CH_{3})), 155,18 (OCONH) y 173,30 (CO_{2}CH_{3}).
CHNH), 52,00 (NHCHCO_{2}CH_{3}), 52,22 (OCH_{3}), 79,53 (C(CH_{3})_{3}), 110,19 (CH_{2}=C(CH_{3})), 144,62 (CH_{2}=C(CH_{3})), 155,18 (OCONH) y 173,30 (CO_{2}CH_{3}).
Datos espectrales obtenidos de los
diastereómeros de trayectoria lenta:
electronebulización-EM m/z 272 (MH^{+});
[\alpha]_{D}^{20} + 16,0 (c 0,06 en CHCl_{3}); IR
(película cap.)/cm^{-1} 3369 (s), 3073 (m), 2969 (s), 1747 (s),
1717 (s), 1617 (w), 1517 (s), 893 (m)
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 1,04 (3H,
d, J 7, CH_{3}CH), 1,44 (9H, s,
C(CH)_{3})_{3}, 1,55 (1H, m,
CH_{3}CH), 1,67 (3H, s, CH_{3}C=CH_{2}), 1,91
(1H, m, CH_{2A}CH), 2,37 (1H, m, CH_{2B}CH), 3,73
(3H, s, OCH_{3}), 4,26 (1H, m, NHCHCO_{2}CH_{3}), 4,75
(1H, d, J 1,5, CH_{2A}=CH), 4,79 (1H, d, J
1,5, CH_{2B}=CH) y 5,46 (1H, d, J 6,1, NH)
\delta_{C} (125 MHz; CDCl_{3}), 18,51
(CH_{3}C=CH_{2}), 20,14 (CH_{3}CH), 28,31
(C(CH_{3})_{3}), 30,55
(CH_{3}CHCH_{2}), 37,64 (CH_{2}
CHNH), 52,17 (NHCHCO_{2}CH_{3}), 52,22 (OCH_{3}), 79,74 (C(CH_{3})_{3}), 111,27 (CH_{2}= C(CH_{3})), 147,94 (CH_{2}=C(CH_{3})), 155,36 (OCONH) y 173,83 (CO_{2}CH_{3}).
CHNH), 52,17 (NHCHCO_{2}CH_{3}), 52,22 (OCH_{3}), 79,74 (C(CH_{3})_{3}), 111,27 (CH_{2}= C(CH_{3})), 147,94 (CH_{2}=C(CH_{3})), 155,36 (OCONH) y 173,83 (CO_{2}CH_{3}).
Estos diastereómeros no se separaron de forma
rutinaria y se utilizaron como una mezcla en las reacciones
posteriores.
Siguiendo el procedimiento general para la
hidrogenación de alquenos, los compuestos (69) y el compuesto (70)
(130 mg, 0,48 mmol) dieron una mezcla de dos diastereómeros (71) los
cuales no se separaron, obtenidos como un aceite incoloro,
rendimiento 128 mg, 98%. Rt de HPLC analítica = 22,49 minutos,
(100%) electronebulización-EM m/z 274
(MH^{+}).
Siguiendo el procedimiento general para la
saponificación del éster metílico, los compuestos (71) (128 mg, 0,47
mmol) dieron una mezcla inseparable de compuestos (72) como un
aceite coloreado, rendimiento 106 mg, 87%.
Electronebulización-EM m/z 260 (MH^{+}). Rt de
HPLC analítica = 20,65 minutos (100%).
Siguiendo el procedimiento general de la
eliminación del N-Boc que utiliza TFA, los
compuestos (72) (106 mg, 0,41 mmol) dieron una mezcla inseparable de
compuesto (73) como sólido, rendimiento 107 mg, 96% y se utilizaron
directamente en la reacción posterior.
Electronebulización-EM m/z 160 (MH^{+}).
Siguiendo el procedimiento general para la
protección de Fmoc de una amina, los compuestos (73) (107 mg, 0,39
mmol) dieron por purificación de cromatografía ultrarrápida sobre
gel de sílice eluyendo con CHCl_{3}/CH_{3}OH (100:0 a 95:5, v/v)
ácido
2S-4RS-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-4,5-dimetil-hexanoico
(74) como un sólido, rendimiento 60 mg, 40% como mezcla de dos
diastereómeros. Rt de HPLC analítica = 23,83 minutos (40%) y Rt =
24,06 minutos (60%). Primer diastereómero eluido:
Electronebulización-EM m/z 382 (MH^{+}). Último
diastereómero eluido: Electronebulización-EM m/z 382
(MH^{+}).
Ejemplo de Síntesis
3
El éster metílico de
(S)-2-terc-butiloxicarbonilamino-5,6-dimetil-hept-5-enoico
(75) y del éster metílico de
(S)-2-terc-butiloxicarbonilamino-4,4,5-trimetil-hex-5-enoico
(76) se obtuvieron directamente después de la reacción de
acoplamiento con zinc por cromatografía ultrarrápida.
Siguiendo el procedimiento general para las
reacciones de aclopamiento con zinc, se acopló
1-bromo-2,3-dime-tilbut-2-eno
(163 mg, 1,0 mmol) al compuesto (61) (247 mg, 0,75 mmol) en
presencia de CuBr\cdotSMe_{2} (20 mg, 0,10 mmol) dando un
residuo que se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de
sílice eluyendo con EtOAc/40:60 éter de petróleo (1:9) dio dos
regioisómeros. El primer componente eluido fue el compuesto (75)
como aceite incoloro, rendimiento 60 mg, 28% y el segundo componente
eluido fue el compuesto (76) como un aceite incoloro, rendimiento 51
mg, 24%.
Datos espectrales obtenidos para el compuesto
(75): Electronebulización-EM m/z 285 (MH^{+}). Rt
de HPLC analítica = 22,85 min (100%); C_{15}H_{27}NO_{4} por
HRMS requiere M, 286,1940, obtenido: M^{+} 285,1954 (-4,9 ppm);
[\alpha]_{D}^{22} +26,1 (c 1,01 en CH_{2}Cl_{2});
análisis elemental C_{15}H_{27}NO_{4} (requerido) %C 63,1, %H
9,5, %N 4,9, (obtenido) %C 62,4, %H 9,5, %N 5,3; IR (película
cap.)/cm^{-1} 3366 (s), 3154 (m), 2978 (s), 1744 (s), 1718 (s),
1506 (s), 1366 (s), 1164 (s).
\delta_{H} (500 MHz; CDCl_{3}) 1,45 (9H,
s, C(CH_{3})_{3}), 1,62 (9H, m,
(CH_{3})_{2}=C(CH_{3})), 1,87 (1H,
m, CH_{2A}CH_{2}CH), 2,03 (1H, m,
CH_{2B}CH_{2}CH), 2,09 (1H, dd, J 6, 10,6,
CH_{2}CH_{2A}CH), 2,12 (1H, dd, J 6,5, 10,5,
CH_{2}CH_{2B}CH), 3,74 (3H, s, OCH_{3}), 4,29 (1H, m,
NHCHCO_{2}CH_{3}) y 5,02 (1H, d, J 7, NH)
\delta_{C} (125 MHz; CDCl_{3}), 18,19
((CH_{3})_{2}=C(CH_{3})), 20,00
((CH_{3})_{2cis}C=C(CH_{3})), 20,61
((CH_{3})_{2trans}C=C(CH_{3})), 28,33
(C(CH_{3})_{3}), 30,07
(CH_{2}CH_{2}CH), 30,92 (CH_{2}CH_{2}CH),
52,20 (NHCHCO_{2}CH_{3}), 53,47 (OCH_{3}), 80,00
(C(CH_{3})_{3}), 95,90
((CH_{3})_{2}C=C(CH_{3})), 96,49
((CH_{3})_{2}C=C(CH_{3}), 165,33 (OCONH) y
173,42 (CO_{2}CH_{3}).
Datos espectrales obtenidos para el compuesto
(76); electronebulización-EM m/z 285 (MH^{+}). Rt
de HPLC analítica = 22,91 minutos, (100%); C_{11}H_{19}NO_{4}
por HRMS requiere M, 229,1314, obtenido:
M^{+}-C_{4}H_{8} 229,1309 (-2,2 ppm);
[\alpha]_{D}^{23} + 4,8 (c 1,01 en CH_{2}Cl_{2}); análisis elemental C_{15}H_{27}NO_{4} (requerido) %C 63,1, %H 9,5, %N 4,9, (obtenido) %C 62,5, %H 9,5, %N; IR (película cap.)/cm^{-1} 3368 (s), 3091 (m), 2934 (s), 1748 (s), 1717 (s), 1516 (s).
[\alpha]_{D}^{23} + 4,8 (c 1,01 en CH_{2}Cl_{2}); análisis elemental C_{15}H_{27}NO_{4} (requerido) %C 63,1, %H 9,5, %N 4,9, (obtenido) %C 62,5, %H 9,5, %N; IR (película cap.)/cm^{-1} 3368 (s), 3091 (m), 2934 (s), 1748 (s), 1717 (s), 1516 (s).
\delta_{H} (500 MHz; CDCl_{3}), 1,10 (H,
s, (CH_{3})_{2A}C), 1,12 (3H, s,
(CH_{3})_{2B}C), 1,43 (9H, s,
C(CH_{3})_{3}), 1,60 (1H, m, CH_{2A}CH),
1,74 (3H, s, CH_{3}C=CH_{2}), 1,92 (1H, dd, J 14,5, 4,
CH_{2B}CH), 3,70 (3H, s, OCH_{3}), 4,24 (1H, m,
NHCHCO_{2}
CH_{3}), 4,79 (1H, s, CH_{2A}=C(CH_{3})), 4,82 (1H, s, CH_{2B}=C(CH_{3})) y 4,83 (1H, d ancho J 11, NH)
CH_{3}), 4,79 (1H, s, CH_{2A}=C(CH_{3})), 4,82 (1H, s, CH_{2B}=C(CH_{3})) y 4,83 (1H, d ancho J 11, NH)
\delta_{C} (125 MHz; CDCl_{3}), 19,38
(CH_{3}), 27,19 (CH_{3}), 27,61 (CH_{3}), 28,34
(C(CH_{3})_{3}), 38,50 (CH_{2}CH), 38,95
((CH_{3})_{2} C), 51,34
(NHCHCO_{2}CH_{3}), 52,13 (OCH_{3}), 79,71
(C(CH_{3})_{3}), 110,95
(CH_{2}=C(CH_{3})), 150,62
(CH_{2}=C(CH_{3})), 155,00 (OCONH) y 174,24
(CO_{2}CH_{3}).
Siguiendo el procedimiento general para la
hidrogenación de alquenos, el éster metílico de
2S-2-terc-butoxicarbo-
nilamino-5,6-dimetil-hept-5-enoico (75) (60 mg, 0,21 mmol) dio el compuesto (77) como un aceite incoloro, rendimiento 54 mg, 89%. Electronebulización-EM m/z 288 (MH^{+}). Rt de HPLC analítica = 24,06 minutos (100%).
nilamino-5,6-dimetil-hept-5-enoico (75) (60 mg, 0,21 mmol) dio el compuesto (77) como un aceite incoloro, rendimiento 54 mg, 89%. Electronebulización-EM m/z 288 (MH^{+}). Rt de HPLC analítica = 24,06 minutos (100%).
Siguiendo el procedimiento general para la
saponificación del éster metílico, los compuestos (77) (54 mg, 0,19
mmol) dieron los compuestos (78) como un aceite incoloro,
rendimiento 54 mg, 100%. Electronebulización-EM m/z
274 (MH^{+}). Rt de HPLC analítica = 21,44 minutos (100%).
Siguiendo el procedimiento general de la
eliminación del N-Boc que utiliza HCl 4M en dioxano,
los compuestos (78) (54 mg, 0,20 mmol) dieron los compuestos (79)
como un sólido, rendimiento 40 mg, 97%.
Electronebulización-EM m/z 174 (MH^{+}).
Siguiendo el procedimiento general para la
protección por Fmoc de una amina, los compuestos (79) (40 mg, 0,19
mmol) dieron en la purificación por cromatografía ultrarrápida sobre
gel de sílice eluyendo con CHCl_{3}/CH_{3}OH (100:0 a 95:5,
v/v), ácido
2S,5RS-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamina)-5,6-dimetil-heptanoico
(80) como un sólido, rendimiento 27 mg, 36%.
Electronebulización-EM m/z 395 (MH^{+}). HPLC
analítica Rt = 24,52 minutos (100%). C_{24}H_{29}O_{4}NNa por
HRMS requiere M, 418,1994, obtenido: MNa^{+} 418,1993 (-0,38
ppm)
\delta_{H} (500 MHz; CDCl_{3}) 0,73 (6H,
m, (CH_{3})_{2}CH), 0,82 (3H, d, J 6,5,
(CH_{3})_{2}CHCH(CH_{3})), 1,23 (1H, m,
(CH_{3})_{2}
CHCH(CH_{3})CH_{2A}), 1,39 (1H, m,
(CH_{3})_{2}CHCH(CH_{3})CH_{2B}),
1,55 (2H, m, (CH_{3})_{2}CHCH(CH_{3}) y
(CH_{3})_{2}CHCH(CH_{3})
CH_{2}CH_{2A}), 1,63 (1H, m,
(CH_{3})_{2}CHCH(CH_{3})), 1,90 (1H, m,
(CH_{3})_{2}CHCH(CH_{3})CH_{2}CH_{2B}),
4,18 (1H, t, J 6,5, CH-Fmoc), 4,40 (3H, m,
NHCHCO_{2}H y CH_{2}O), 5,30 (1H, d ancho, J 8,
NH-Fmoc), 7,27 (2H, m, H-2' y
H-7'), 7,37 (2H, m, H-3' y
H-6'), 7,56 (2H, m, H-1' y
H-8') y 7,75 (2H, d, J 7, H-4' y
H-5')
\delta_{C} (125 MHz; CDCl_{3}), 14,91
(CH_{3})_{2}CHCH(CH_{3})), 17,49 y 17,73
((CH_{3})_{2A}CH), 19,93 y 20,05
((CH_{3})_{2B}CH), 28,08
((CH_{3})_{2}CH), 29,26 y 29,44
((CH_{3})CHCH(CH_{3})CH_{2}CH_{2}),
30,04 y 30,17
((CH_{3})_{2}CHCH(CH_{3})CH_{2}CH_{2}),
31,38 y 31,68 ((CH_{3})_{2}CHCH(CH_{3})),
37,89 y 38,07 (NHCHCO_{2}H), 46,88 (CH-1'),
66,84 (CH_{2}O), 119,72 (CH-5' y
CH-10'), 124,80 (CH-4' y
CH-11'), 126,81 (CH-6' y
CH-9'), 127,46 (CH-3' y
CH-12'), 141,05 (C-7' y
C-8'), 143,47 (C-2' y
C-13') y 155,89 (OCONH). No se observó la señal
cuaternaria para el ácido carboxílico.
Siguiendo el procedimiento general para la
hidrogenación de alquenos, el éster metílico de
2S-2-terc-butoxicarbo-
nilamino-4,4,5-trimetil-hex-5-enoico (76) (51 mg, 0,18 mmol) dio el compuesto (81) como un aceite incoloro, rendimiento 46 mg, 90%. Electronebulización-EM m/z 288 (MH^{+}). R_{t} de HPLC analítica = 22,91 min, (100%).
nilamino-4,4,5-trimetil-hex-5-enoico (76) (51 mg, 0,18 mmol) dio el compuesto (81) como un aceite incoloro, rendimiento 46 mg, 90%. Electronebulización-EM m/z 288 (MH^{+}). R_{t} de HPLC analítica = 22,91 min, (100%).
Siguiendo el procedimiento general para la
saponificación del éster metílico, el compuesto (81) (46 mg, 0,16
mmol) dio el compuesto (82) como un aceite incoloro, rendimiento 44
mg, 100%. Electronebulización-EM m/z 274
(MH^{+}).
(MH^{+}).
Siguiendo el procedimiento general de la
eliminación del N-Boc que utiliza HCl 4 M en
dioxano, el compuesto (82) (44 mg, 0,16 mmol) dio el compuesto (83)
como un sólido, rendimiento 33 mg, 99%.
Electronebulización-EM m/z 174 (MH^{+}).
Siguiendo el procedimiento general para la
protección por Fmoc de una amina, el compuesto (83) (33 mg, 0,16
mmol) dio por purificación de cromatografía ultrarrápida sobre gel
de sílice eluyendo con CHCl_{3}/CH_{3}OH (100:0 a 95:5, v/v) el
ácido
2S-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamina)-4,4,5-trimetil-hexanoico
(84) como un sólido, rendimiento 20 mg, 32%.
Electronebulización-EM m/z 396 (MH^{+}). HPLC
analítica R_{t} = 24,28 minutos (100%).
C_{24}H_{29}O_{4}
NNa por HRMS requiere M, 418,1994, obtenido: MNa^{+} 418,1993, (-0,38 ppm)
NNa por HRMS requiere M, 418,1994, obtenido: MNa^{+} 418,1993, (-0,38 ppm)
\delta_{H} (500 MHz, CDCl_{3}), 0,93 (9H,
m,
(CH_{3})_{2}CHC(CH_{3})_{2A}),
0,98 (3H, s, J6,5,
(CH_{3})_{2}CHC(CH_{3})_{2B}),
1,48 (1H, dd, J 14, 10,
(CH_{3})_{2}CHC(CH_{3})_{2}CH_{2A}),
1,57 (1H, m, (CH_{3})_{2}CH), 1,91 (1H, d, J 14,
(CH_{3})_{2}CHC(CH_{3})_{2}CH_{2B}),
4,21 (1H, t, J6,5, CH-Fmoc), 4,40 (3H, m,
NHCHCO_{2}H y CH_{2}O), 5,10 (1H, d ancho J 7,5,
NH-Fmoc), 7,27 (2H, m, H-2' y
H-7'), 7,36 (2H, m, H-3' y
H-6'), 7,57 (2H, m, H-1' y
H-8') y 7,74 (2H, d, J 7,
H-4' y H-5')
\deltac (125 MHz; CDCl_{3}), 17,01
((CH_{3})_{2A}CH), 17,16
((CH_{3})_{2B}CH), 23,69
((CH_{3})_{2}CHC(CH_{3})_{2A}, 24,27
((CH_{3})_{2}CHC (CH_{3})_{2B}), 35,27
((CH_{3})_{2}CHC(CH_{3})_{2}), 35,73
((CH_{3})_{2}CH), 41,88
((CH_{3})_{2}CHC(CH_{3})_{2}CH_{2}),
46,93 (CH-1'), 54,20
(NHCHCO_{2}H), 66,79 ((CH_{2}O), 119,70 (CH-5' y CH-10'), 124,78 (CH-4' y CH-11'), 126,79 (CH-6' y CH-9'), 127,44 (CH-3' y CH-12'), 141,05 (C-7' y C-8'), 143,61 (C-2' y C-13') y 155,68 (OCONH). No se observó la señal cuaternaria para el ácido carboxílico.
(NHCHCO_{2}H), 66,79 ((CH_{2}O), 119,70 (CH-5' y CH-10'), 124,78 (CH-4' y CH-11'), 126,79 (CH-6' y CH-9'), 127,44 (CH-3' y CH-12'), 141,05 (C-7' y C-8'), 143,61 (C-2' y C-13') y 155,68 (OCONH). No se observó la señal cuaternaria para el ácido carboxílico.
Se reunieron moléculas utilizando los bloques de
construcción de furanona y los recientes aminoácidos protegidos
descritos al principio, por procedimientos en fase sólida en
multisujeciones de Chiron siguiendo los protocolos detallados más
adelante.
Se disolvió
dihidro-3(2H)-furanona (18,
24-28), (1,0 eq) se disolvió en una mezcla de
etanol/agua (7:1 v/v, 10 ml por compuesto mmolar) conteniendo
trihidrato de sodio acetato (1,5 eq). Se añadió acetato de ácido
4-[[(hidrazinocar-
bonil)amino]metil]-ciclohexanocarboxílico trifluoro (masa molecular 329,3, 1,0 eq) (véase Murphy, A.M., y col., J. Am. Chem. Soc., 114, 3156-3157, 1992) y la mezcla se calentó bajo reflujo durante 2 horas. La mezcla se enfrió a continuación, se vertió en diclorometano (100 ml por mmol de compuesto) y se añadió agua (100 ml). La fase orgánica se separó, se volvió a lavar con salmuera saturada (100 ml). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío para proporcionar un sólido blanco. Rendimiento 85-105% de peso en bruto.
bonil)amino]metil]-ciclohexanocarboxílico trifluoro (masa molecular 329,3, 1,0 eq) (véase Murphy, A.M., y col., J. Am. Chem. Soc., 114, 3156-3157, 1992) y la mezcla se calentó bajo reflujo durante 2 horas. La mezcla se enfrió a continuación, se vertió en diclorometano (100 ml por mmol de compuesto) y se añadió agua (100 ml). La fase orgánica se separó, se volvió a lavar con salmuera saturada (100 ml). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío para proporcionar un sólido blanco. Rendimiento 85-105% de peso en bruto.
Las construcciones (29-34) se
usaron sin purificación adicional.
Se sintetizaron los compuestos en modo paralelo
utilizando las macrocoronas derivadas de
Fmoc-bloque de
construcción-engarce-DA/MDA cargadas
de forma apropiada (véase anteriormente) cargadas a aproximadamente
3,5 a 9,1 \mumol por corona. Antes de la síntesis cada corona se
conectó a su respectivo precursor y se encajó en el recipiente del
precursor 8 x 12. El acoplamiento de los aminoácidos empleó la
química de aminoácidos Fmoc normal descrita en "Solid Phase
Peptide Synthesis", E. Atherton y R. C. Sheppard, IRL Press Ltd.
Oxford, Reino Unido, 1989.
Se cargó un baño resistente al disolvente de 250
ml con 200 ml de una disolución de piperidina al 20%/DMF. El
conjunto multisoporte se añadió y la desprotección permitió proceder
durante 30 minutos. Se eliminó a continuación el conjunto y se
eliminó el disolvente en exceso mediante breve agitación. El
conjunto se lavó a continuación consecutivamente con (200 ml de cada
uno), DMF (5 minutos) y MeOH (5 minutos, 2 minutos, 2 minutos) y se
dejó secar al aire durante 15 minutos.
Se carga una célula UV de longitud de paso de 1
cm con 1,2 ml de una disolución de piperidina al 20%/DMF y se
utiliza a cero la absorbancia del espectrómetro UV a una longitud de
onda de 290 nm. Se prepara a continuación un patrón de UV
consistente en 5,0 mg de Fmoc-Asp
(OBut)-pepsina KA (0,08 mmol/g) en 3,2 ml de una
disolución de piperidina al 20%/DMF. Este patrón da Abs_{290} =
0,55-0,65 (a temperatura ambiente). Una alícuota de
la disolución de desprotección multisoporte se diluye a continuación
de forma apropiada para dar una Abs_{290} teórica = 0,6 y este
valor comparado con la absorbancia actual medida experimentalmente
presenta la eficacia de la reacción de acoplamiento anterior.
La reacciones de acoplamiento se realizan
cargando los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos de
polipropileno con el patrón de las disoluciones activadas requerido
durante una ronda determinada de acoplamiento. Los acoplamientos
estándar de macrocorona se realizaron en DMF (500 \mul).
Mientras se seca el conjunto de multisoporte, se
pesan con precisión en contenedores adecuados los ésteres pfp de
aminoácido N_{\alpha}-Fmoc apropiados (10
equivalentes calculados a partir de la carga de cada corona) y HOBt
(10 equivalentes) requeridos para la ronda particular de
acoplamiento. Alternativamente, se pesan exactamente en recipientes
adecuados los aminoácidos N_{\alpha}Fmoc apropiados (10
equivalentes calculados a partir de la carga de cada corona), el
agente de acoplamiento deseado por ejemplo HBTU (9,9 equivalentes
calculados a partir de la carga de cada corona) y la activación por
ejemplo HOBt (9,9 equivalentes calculados a partir de la carga de
cada corona), NMM (19,9 equivalentes calculados a partir de la carga
de cada corona).
Los derivados de aminoácidos Fmoc protegidos y
activados se disuelven a continuación en DMF (500 \mul para cada
macrocorona por ejemplo para 20 macrocoronas, 20 \times 10 eq.
\times 7 \mumol de derivado se disolverían en 10 ml de DMF). Los
derivados apropiados se distribuyen a continuación en los pocillos
apropiados preparados para el comienzo del "ciclo de
acoplamiento". Como norma, las reacciones de acoplamiento se
dejan que procedan durante 6 horas. El conjunto acoplado se lavó a
continuación como se detalla más adelante.
Si una desprotección con piperidina al 20%/DMF
sigue inmediatamente al ciclo de acoplamiento, entonces se agita
brevemente el conjunto multisoporte para eliminar el exceso de
disolvente, se lava sucesivamente con (200 ml de cada uno), MeOH (5
minutos) y DMF (5 minutos) y se desprotege. Si el conjunto
multisoporte se ha de almacenar o ha de reaccionar más, entonces se
realiza un ciclo de lavado completo consistente en agitación breve
seguida de lavados consecutivos con (200 ml de cada uno), DMF (5
minutos) y MeOH (5 minutos, 2 minutos, 2 minutos).
Mientras se seca el conjunto de multisoporte, el
grupo de bloqueo del ácido apropiado (10 equivalentes calculados a
partir de la carga de cada corona), el agente de acoplamiento
deseado, por ejemplo HBTU (9,9 equivalentes calculados a partir de
la carga de cada corona) y la activación por ejemplo HOBt (9,9
equivalentes calculados a partir de la carga de cada corona), NMM
(19,9 equivalentes calculados a partir de la carga de cada corona)
se pesaron exactamente en recipientes adecuados. Los derivados de
ácidos/agentes de acoplamiento se disuelven a continuación en DMF
(500 \mul para cada macro-corona por ejemplo para
20 macrocoronas, 20 \times 10 eq. de derivado se disolverían en 10
ml de DMF) y se dejan activar durante 5 minutos. Los derivados
apropiados se distribuyen a continuación en los pocillos apropiados
preparados para el comienzo del "ciclo de acoplamiento". Como
norma, se deja que las reacciones de protección sigan
du-
rante 18 horas durante toda una noche. El conjunto de protección se lava a continuación como se detalla anteriormente.
rante 18 horas durante toda una noche. El conjunto de protección se lava a continuación como se detalla anteriormente.
Los protocolos de escisión mediados por ácido se
realizaron estrictamente en una campana extractora. Se marca una
placa de 96 pocillos de poliestireno (1 ml/pocillo) y se pesa con
precisión de miligramos. Se cargan a continuación los pocillos
apropiados con una disolución de escisión de ácido
trifluoroacético/agua (95:5 v/v, 600 \mul), en un patrón
correspondiente a aquel del un conjunto multisoporte que se ha de
escindir.
Se añade el conjunto multisoporte, la
construcción completa revestida en papel de estaño y se deja durante
2 horas. El conjunto multisoporte se añade a continuación a otra
placa de 96 pocillos de poliestireno (1 ml/pocillo) que contiene
ácido trifluroacético/agua (95:5, v/v, 600 \mul) (como
anteriormente) durante 5 minutos.
La placa de escisión de poliestireno primaria
(escisión a las 2 horas) y la placa secundaria de poliestireno
(lavado de 5 minutos) se colocan a continuación en el evaporador
GeneVac y se eliminan los disolventes (velocidad mínima de secado)
durante 90 minutos. Los contenidos de la placa secundaria de
poliestireno se transfieren a sus correspondientes pocillos en la
placa primaria utilizando una disolución acetonitrilo/agua (50:50
v/v) (150 \mu l3 \times) y se descarta la placa secundaria
agotada. Se toman alícuotas (5-20 l) para análisis.
Se revistió la placa con papel de estaño, se realizaron agujeros
pequeños en los pocillos que contienen los compuestos, se colocó en
el refrigerador durante 1 hora, se liofilizó a continuación.
Se analizan las alícuotas (5 a 20 l) por HPLC
analítica y electronebulización-EM. En virtualmente
todos los casos, las purezas en bruto son >90% por HPLC con la
m/z deseada. Se purificaron las muestras por HPLC en fase inversa
semipreparativa, utilizando Vydac C_{4}. Se combinan las
fracciones apropiadas y se liofilizan en viales de vidrio
contrapesados de 10 ml, a continuación se vuelven a pesar. Se
prepararon moléculas a escala de 15 a 90 \mumol, produciendo 2,0 a
26,0 mg de productos purificados. La pureza de cada producto se
confirmó por HPLC analítica a >95% (detección UV a 215 nm) y dio
el apropiado [MH]^{+} mediante análisis de espectrometría
de masas por electronebulización.
Se utilizaron macrocoronas DA/MDA con grupos
funcionales amino (ex Chiron Mimotopes, Australia, 9,1 \mumol de
carga) o engranajes HEMA con grupos funcionales amino (ex Chiron
Mimotopes, Australia, 1,3 \mumol de carga) para todas las cargas y
posteriores síntesis en fase sólida.
La construcción
dihidro-3(2H)-furanona-engarce
(29 a 34) (3 eq comparadas con la funcionalización de superficie de
coronas/engranajes) fue activada por carboxilo con hexafluorofosfato
de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(3 eq), 1-hidroxi-benzotriazol (3
eq) y N-metilmorfolina (6 eq) en dimetilformamida
(5 ml) durante 5 minutos. Se añadió esta mezcla a las
coronas/engranajes, se añadió DMF adicional para revestir la
superficie de reacción y se dejó la mezcla durante toda una
noche.
El lavado estándar y las lecturas de
desprotección de Fmoc (véanse procedimientos anteriores) indicaron
virtualmente la cantidad cuantitativa.
Las moléculas ejemplares preparadas mediante los
procedimientos usando la furanona, aminoácido R3 y grupo protector
respectivos en el procedimiento descrito anteriormente se muestran
en la Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Otros compuestos de la invención se preparan
como sigue:
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) salvo porque se sustituye ácido
4-pirrolidin1-il-benzoico
por el ácido carboxílico modelo. Estos ácidos se prepararon
empleando dos reacciones: los ésteres iniciales se prepararon usando
la química de tipo Buchwald y la posterior hidrólisis convencional
de los ésteres proporcionó los ácidos requeridos.
Se cargó un tubo de reacción secado en una
estufa con carbonato de cesio (2,12 g, 6,51 mmol) que se molieron
finamente con una mano de mortero y el mortero en una atmósfera de
argon. Se añadieron tris(dibencilidenacetona) dipaladio (0)
(42,5 mg, 1,5% mol) y
(S)-(-)-2,2'-bis
(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo
(43,4 mg, 1,5% mol) y el tubo se cargó con argon. Se añadieron
pirrolidina (0,39 g, 5,58 mmol), 4-bromobenzoato de
metilo (1,00 g, 4,65 mmol) y tolueno (10 ml) y la mezcla se calentó
hasta 100ºC con agitación vigorosa hasta que el material de partida
se había consumido, lo que se juzgó por HPLC. La mezcla se enfrió
hasta temperatura ambiente, se diluyó con éter (20 ml), se filtró y
se concentró. La purificación por cromatografía en columna se obtuvo
el compuesto del epígrafe (0,80 g, 84%) como un sólido. MS (M+H+):
206.
Se disolvió éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico
(200 mg, 0,98 mmol) en metanol (4 ml) y se añadió hidróxido sódico
(39 mg, 0,98 mmol) en agua (2 ml). La mezcla se calentó hasta 60ºC
hasta que el material de partida se había consumido, lo que se juzgó
por HPLC. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente, se diluyó
con agua (20 ml), se filtró y se liofilizó dando el compuesto del
epígrafe (0,200 g, 97%) como un sólido. MS (M+H+): 192.
A continuación se describe un procedimiento
alternativo.
Se disolvió éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico
(200 mg, 0,98 mmol) en ácido clorhídrico concentrado:agua (1:1) (4
ml). La mezcla se calentó a reflujo hasta que el material de partida
se había consumido, lo que se juzgó por HPLC. La mezcla se enfrió
hasta temperatura ambiente, se diluyó con agua (10 ml), se filtró y
se liofilizó dando el compuesto del epígrafe (0,190 g, 97%) como un
sólido. MS (M+H+): 192.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "ácido
4-piperidin-1-il-benzoico"
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "piperidina" por "pirrolidina" se obtuvo el
compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 220.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster metílico del ácido
4-piperidin-1-il-benzoico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 206.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "ácido
morfolin-4-il-benzoico",
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "morfolina" por "pirrolidina" se obtuvo el
compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 222.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster metílico del ácido
4-morfolin-4-il-benzoico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 208.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "ácido
4-metiilpiperazin-1-il-benzoico"
por éster metílico del ácido
4-metil-piperazin-1-il-benzoico
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de
"4-metil-piperazina" por
"pirrolidina" se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+):
235.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster metílico del ácido
4-metil-piperazin-1-ilbenzoico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 221.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "ácido
4-(morfolin-4-il-etilamino)-benzoico"
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de
"2-morfolin-4-iletilamina"
por "pirrolidina" se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS
(M+H+): 265.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster metílico del ácido
4-(2-morfolin-4-il-etilamino)-benzoico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 251.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "éster terc-butílico
del ácido
4-(carboxifenil)-piperazin-1-carboxílico".
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster terc-butílico del ácido
piperazin-1-carboxílico" por
"pirrolidina" se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+):
321.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster terc-butílico del ácido
4-(4-metoxicarbonilfenill)-piperazin-1-carboxílico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-ilbenzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 307.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "ácido
3-pirrolidin-1-il-benzoico"
por "ácido
2-benzofuran-carboxilico."
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "3-bromobenzoato de metilo" por
"4-bromobenzoato de metilo" se obtuvo el
compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 206.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster metílico del ácido
3-pirrolidin-1-il-benzoico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 192.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "ácido
3-piperidin-1-il-benzoico"
por "ácido
2-benzofuran-carboxilico."
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "piperidina" por "pirrolidina" y
"3-bromobenzoato de metilo" por
"4-bromobenzoato de metilo" se obtuvo el
compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 220.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster metílico del ácido
3-piperidin-1-il-benzoico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 206.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "ácido
3-morfolin-4-il-benzoico".
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "morfolina" por "pirrolidina" y
"3-bromobenzoato de metilo" por
"4-bromobenzoato de metilo" se obtuvo el
compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 222.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster metílico del ácido
3-morfolin-4-il-benzoico"
por "éster metílico del ácido
3-pirrolidin-1-il-benzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 208.
\newpage
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "ácido
3-metilpiperazin-1-il-benzoico"
por "ácido
2-benzofuran-carboxilico."
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de
"4-metil-piperazina" por
"pirrolidina" y "3-bromobenzoato de
metilo" por "4-bromobenzoato de metilo" se
obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 235.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster metílico del ácido
3-metil-piperazin-1-il-benzoico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 221.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "ácido
3-(morfolin-4-il-etilamino)-benzoico"
por "ácido
2-benzofuran-carboxílico."
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de
"2-morfolin-4-il-etilamina"
por "pirrolidina" y "3-bromobenzoato de
metilo" por "4-bromobenzoato de metilo" se
obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 265.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster metílico del ácido
3-(2-morfolin-4-iletilamino)-benzoico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-il-benzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 251.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 etapa
d) pero con la sustitución de "éster terc-butílico
del ácido
4-(carboxi-fenil)-piperazin-1-carboxílico"
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster terc-butílico del ácido
piperazin-1-carboxílico" por
"pirrolidina" y "3-bromobenzoato de
metilo" por "4-bromobenzoato de metilo" se
obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 321.
Siguiendo el procedimiento anterior pero con la
sustitución de "éster terc-butílico del ácido
4-(4-metoxicarbonilfenil)-piperazin-1-carboxílico"
por "éster metílico del ácido
4-pirrolidin-1-ilbenzoico"
se obtuvo el compuesto del epígrafe: MS (M+H+): 307.
Se llevan a cabo ensayos convenientes de
catepsina K usando enzima recombinante humana. Las condiciones de
ensayo convencionales para la determinación de las constantes
cinéticas usaron un sustrato fluorogénico, de forma típica
H-D-Ala-Leu-Lys-AMC,
y se determinaron en Mes 100 mM/Tris, pH 7,0 que contenía EDTA 1 mM
y 2-mercaptoetanol 10 mM o acetato sódico 100 mM, pH
5,5 que contenía EDTA 5 mM y cisteína 20 mM. La concentración de
enzima usada fue 5 nM. La solución sustrato madre se preparó en 10
mM en DMSO. Se llevaron a cabo rastreos a una concentración fija de
sustrato de 60 \muM y estudios cinéticos detallados con diluciones
a la mitad de sustrato desde 250 \muM. La concentración total de
DMSO en el ensayo se mantuvo por debajo del 3%. Todos los ensayos se
llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se controló la fluorescencia
del producto (excitación a 390 nm, emisión a 460 nm) con un lector
de placas fluorescente Labsystems Fluoroskan Ascent. Las curvas de
progreso del producto se generaron durante 15 minutos siguiendo la
generación de AMC producto.
Los inhibidores potenciales se rastrearon usando
el ensayo anterior con concentraciones variables del compuesto de
ensayo. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de enzima a
las soluciones tamponadas de sustrato e inhibidor. Los valores de
K_{i} se calcularon de acuerdo con la ecuación 1
(1)v_{o} =
\frac{VS}{K_{M}\left(1 + \frac{I}{K_{i}}\right)+
S}
en la que v_{o} es la velocidad
de reacción, V es la velocidad máxima, S es la concentración de
sustrato con la constante de Michaelis K_{M} e I es la
concentración de
inhibidor.
En este ensayo los compuestos representados en
la Tabla I tienen valores de K_{i} a pH 7 en el intervalo de 10 nM
a 250 nM y por ello tienen utilidad en el tratamiento o profilaxis
de trastornos en los que esté implicada la catepsina K, tales como
osteoporosis, enfermedades gingivales tales como gingivitis y
periodontitis, enfermedad de Paget, hipercalcemia con metástasis,
enfermedad ósea metabólica, osteoartritis, artritis reumatoide y
neoplasias metastásicas.
Los cebadores desoxinucleotídicos:
(SEQ ID NO.: 1)
- 5'CGCGGATCCGCCACCATGGAATTAAACAGATTTGCCGAT-3' y
(SEQ ID NO.: 2)
- 5'CGCGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGTTCAATTAATGGAATGAATGCATCAGT-3'
Se diseñaron en base a secuencias depositadas en
el Sanger Centre, Cambridge, UK
(http://www.sanaer.ac.uk/
Proiects/Pfalciparum/blastserver.shtml). Estos cebadores se diseñaron para amplificar una porción de la secuencia del ADNc de la cisteinil proteasa conocida ahora como Falcipaína 2 y para incluir sitios de enzima de clonación terminal relevantes y una secuencia de codificación de hexahistidina carboxilo terminal inmediatamente cadena arriba del codon de terminación.
Proiects/Pfalciparum/blastserver.shtml). Estos cebadores se diseñaron para amplificar una porción de la secuencia del ADNc de la cisteinil proteasa conocida ahora como Falcipaína 2 y para incluir sitios de enzima de clonación terminal relevantes y una secuencia de codificación de hexahistidina carboxilo terminal inmediatamente cadena arriba del codon de terminación.
La reacción en cadena con polimerasa se llevó a
cabo con los cebadores anteriores y un ADN de genoteca de fagos de
Plasmodium falciparum como molde usando las siguientes
condiciones; 94ºC durante 2 minutos, luego 35 ciclos de 94ºC durante
10 segundos, 50ºC durante 1 minuto y 60ºC durante 2 minutos, esto se
llevó a cabo mediante una incubación a 60ºC durante 5 minutos. El
amplicón de PCR de 880 pb se purificó y se fosforiló usando
polinucleótido quinasa T4. Este ADN se ligó entonces en EcoRV
escindido, vector de clonación Bluescript II desfosforilado y se
transformó en DH5 alfa E. coli. La secuencia de ADN de los
insertos plasmídicos en clones de E. coli recombinantes
aislados se determinó usando un secuenciador Amersham Megabace. Para
crear un ORF (marco de lectura abierto) auténtico se llevó a cabo
una ligación de tres vías que une el extremo N terminal de
falcipaína 2 truncada (NcoI/NdeI), el extremo C terminal de
falcipaína 2 (NdeI/BamH1) y el vector pQE-60
(NcoI/BamHI).
Secuencia nucleotídica de TF2. 10 (SEQ ID NO.:
3):
Codificación para la secuencia de proteína (SEQ
ID NO.: 4):
El inserto TF2.10 se separó del vector
pQE-60 usando las enzimas de restricción NcoI y
BamHI, se ligó en el vector de expresión de corte de NcoI/BamHI
pET-11 D y se transformó en DH5 alf E. coli.
La presencia de un plásmido de expresión recombinante
(pET-TF2.10) en una colonia de E. coli
aislada se confirmó por digestión de enzima de restricción del ADN
plasmídico. Se transformaron BL21 (DE3) E. coli con
pET-TF2.10 y se usaron para la expresión de la
cisteinil proteinasa recombinante.
Se desarrollaron BL21 (DE3) E. coli
(BLTF2.10) transformadas con pET-TF2.10 durante la
noche a 200 rpm, 37ºC en medio Luria que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina. Se inoculó medio nuevo entonces y se desarrolló hasta
una DO_{600 nm} de 0,8 antes de que se indujera la expresión de
proteína usando IPTG 1 mM. La inducción se llevó a cabo durante 3
horas a 200 rpm, 37ºC y luego se recolectaron las células
bacterianas por centrifugación y se almacenaron a -80ºC hasta que se
llevó a cabo la purificación de proteínas.
Se lisó un sedimento celular de E. coli
equivalente a 250 ml de cultivo mediante resuspensión en tampón de
solubilización (clorhidrato de guanidina 6M,
Tris-HCl 20 mM, NaCl 250 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0)
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar a
12000 g durante 10 minutos a 4ºC se aplicó el lisado aclarado a 1 ml
de níquel-NTA agarosa y se agitó durante 1 hora a
temperatura ambiente.
La proteína unida a níquel-NTA
se lavó por lotes con clorhidrato de guanidina 6 M,
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM y luego urea 8M,
Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 500 mM y luego urea 8M,
Tris-HCl, pH 8,0 que incluía imidazol 30 mM y la
elución de la proteína se llevó a cabo usando urea 8M,
Tris-HCl, pH 8,0 con imidazol 1 M. La proteína
eluida se diluyó entonces cien veces en tampón de replegado
(Tris-HCl 100 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 20%,
L-arginina 250 mM, glutatión reducido 1 mM,
glutatión oxidado 0,1 mM, pH 8,0) y se dejó agitando durante la
noche a 4ºC. La proteína se podía concentrar bien por centrifugación
o por nueva purificación usando una columna de
níquel-agarosa (después de la diálisis para eliminar
el EDTA).
La proteína ligada a níquel-NTA
se lavó por lotes con urea 8M, Tris-HCl, NaCl 500
mM, pH 8,0 luego urea 8M, Tris-HCl, pH 8,0 que
incluía imidazol 20 mM, luego urea 2M, Tris-HCl, pH
8,0. La proteína se volvió a plegar en la columna mediante la
adición de Tris-HCl 100 mM, pH 8,0,
L-arginina 250 mM, glutatión reducido 1 mM,
glutatión oxidado 0,1 mM con incubación a 4ºC y elución de proteína
llevada a cabo usando, Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 con
imidazol 0,5 M.
La proteinasa inmediatamente activa (madura) se
obtuvo usando el procedimiento de replegado de proteína 1 y
concentrando la enzima replegada diluida por centrifugación en
filtro. Este procedimiento, sin embargo, dio como resultado un alto
grado de pérdida de enzima debido a autoproteolisis. Tanto la
concentración de la proteína replegada usando el procedimiento 1 por
purificación en columna de níquel como el uso del procedimiento de
replegado 2 dan como resultado una mayor recuperación de enzima en
su proforma inactiva estable. La proforma se podría usar para
generar falcipaína 2 activa madura, después de incubar a 37ºC.
La construcción marcada en el C descrita antes
permite la concentración rápida y la recuperación rápida después del
replegado de la proteína y soluciona los problemas con
autoproteolisis. A diferencia de las construcciones marcadas en el N
descritas en Shenai et al J Biol Chem 275
3729000-29010m, las construcciones descritas en la
presente memoria se pueden replegar sobre la superficie de una
matriz insoluble, por ejemplo, unida a una columna de purificación.
Además, la prorregión puede actuar como una secuencia inactivadora
de enzima análoga a la enzima nativa que actúa con la enzima más
predecible, es decir, la enzima inactiva estable se puede activar
de forma controlable cuando se necesite. Un marcador en el N
terminal tendería a prevenir este funcionamiento normal de la
enzima, puesto que la prorregión de la enzima debería ser capaz de
plegarse independientemente para dirigir el estado de plegado del
dominio de la enzima madura.
El marcador descrito en la presente memoria
permite la purificación por afinidad para aumentar los rendimientos
y potenciar las oportunidades de aislar proformas estables aisladas
de la enzima.
Por consiguiente, se describe una construcción
de falcipaína 2 enzimáticamente activa que comprende un marcador en
el C terminal unido covalentemente. El marcador C terminal puede
comprender polihistidina, por ejemplo, 4 a 8 residuos, con
preferencia 6. La construcción descrita antes tiene el marcador en
el C terminal del residuo de ácido glutámico, pero otras
construcciones pueden acortar la enzima en hasta 10, por ejemplo,
6-8 ó 2-4 residuos y retener una
actividad de rastreo útil. Construcciones preferidas comprenden la
secuencia enumerada antes, opcionalmente truncada en el C terminal
como se describe en la presente memoria.
Se llevan a cabo ensayos convenientes para
falcipaína 2 usando enzima recombinante preparada antes. Como
alternativa, se ensaya falcipaína como se describe en Sijwali et
al Prot Exp Purif 22, 128-134 (2001). Las
condiciones de ensayo normalizadas para la determinación de
constantes cinéticas usaron un sustrato peptídico fluorogénico, de
forma típica
Boc-Val-Leu-Lys-AMC,
y se determinaron en Mes 100 mM /Tris/acetato, pH 7,0 que contenía
NaCl 1 M y 2-mercaptoetanol 10 mM o fosfato sódico
100 mM, pH 5,5 que contenía NaCl 1 M y
2-mercaptoetanol 10 mM. La concentración de enzima
usada fue 2 nM. La solución de sustrato madre se preparó a 10 mM en
DMSO. Los rastreos se llevaron a cabo a una concentración fija de
sustrato de 80 \muM y estudios cinéticos detallados con diluciones
a la mitad de sustrato desde 250 \muM. La concentración total de
DMSO en los ensayos se mantuvo por debajo del 3%. Todos los ensayos
se llevaron a cabo a temperatura ambiente. La fluorescencia del
producto (excitación a 390 nm, emisión a 460 nm) se controló con un
lector de placas fluorescente Labsystems Fluoroskan Ascent. Las
curvas de progreso del producto se generaron durante 15 minutos
siguientes a la generación de AMC producto.
Los posibles inhibidores se rastrearon usando el
ensayo anterior con concentraciones variables de los compuestos en
la tabla siguiente. Estos compuestos se prepararon en fase sólida
usando la metodología descrita antes. Las reacciones se iniciaron
mediante la adición de enzima a soluciones tamponadas de sustrato e
inhibidor. Se calcularon los valores de K_{i} de acuerdo con la
ecuación 1
(1)v_{o} =
\frac{VS}{K_{M}\left(1 + \frac{I}{K_{i}}\right)+
S}
en la que v_{o} es la velocidad
de reacción, V es la velocidad máxima, S es la concentración de
sustrato con la constante de Michaelis K_{M} e I es la
concentración de
inhibidor.
Los compuestos representados en la tabla
siguiente mostraron valores de K_{i} (a pH 7) entre 0,5 \muM y
2,7 \muM y por tanto son útiles en la profilaxis o tratamiento de
infecciones o infestaciones por parásitos, tales como malaria.
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido naftalen-2-carboxílico
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
benzofuran-2-carboxílico
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxotetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
5-metoxi-benzofuran-2-carboxílico
4-acetilamino-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidrofuran-3S-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
4-hidroxi-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3-ilcarbamoil)-butil]-3-morfolin-4-ilmetil-benzamida
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido bifenil-4-carboxílico
4-terc-butil-N-[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3-ilcarbamoil)-butil]-benzamida
[3-metil-1S-(2R-metil-4-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilcarbamoil)-butil]-amida
del ácido
benzotiazol-5-carboxílico.
<110> Medivir AB
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Inhibidores de cisteína proteasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1718-196FPC
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 43/252.802
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-11-17
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/252.840
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-11-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador para el ADNc de cisteinil
proteinasa (Falcipaína 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccg ccaccatgga attaaacaga tttgccgat
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador para el ADNc de cisteinil
proteinasa (Falcipaína 2)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgccgact taatgatgat gatgatgatg ttcaattaat ggaatgaatg catcagt
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 886
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto de PRC de amplificación
usando cebadores para la secuencia de ADNc de cisteinil proteinasa
(Falcipaína 2)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) ... (848)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un compuesto de fórmula (IVa):
en la
que
R1 = R'C(O), R'SO_{2},
R' = un sistema de anillo de 8 a 12 miembros
bicíclico, saturado o no saturado que contiene 0 a 4 heteroátomos
seleccionados de S, O y N, estando dicho sistema de anillo
opcionalmente sustituido con hasta cuatro sustituyentes
seleccionados independientemente de los grupos a), b) y c)
siguientes; o
R' = un anillo de 5 a 7 miembros monocíclico,
saturado o no saturado que contiene 0 a 3 heteroátomos seleccionados
de S, O y N, teniendo dicho anillo monocíclico al menos un
sustituyente seleccionado del grupo a) y c) siguientes y pudiendo
tener opcionalmente uno o dos sustituyentes adicionales
seleccionados del grupo b) siguiente;
- a)
- un grupo cíclico que puede estar unido directamente al anillo R' o a través de un enlazador alquilo, alquiléter, alquiltioéter, alquilamina, alquilamida, alquilsulfonamida, alquilsulfona, alquilurea, alquilcetona o alquiléster que comprende hasta 6 átomos de C; o
- b)
- H, alquilo C_{1}-C_{7}, cicloalquilo C_{3}-C_{6}, OH, SH, NH_{2}, NH-alquilo C_{1}-C_{3}, N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2}, halógeno; o
- c)
- O-alquilo C_{1}-C_{4}, S-alquilo C_{1}-C_{4}, SO-alquilo C_{1}-C_{4}, SO_{2}-alquilo C_{1}-C_{4}, CO_{2}-alquilo C_{0}-C_{4}, NHCO-alquilo C_{0}-C_{4}, CONH-alquilo C_{0}-C_{4}, CO-alquilo C_{0}-C_{4}, NHC(=NH)NH_{2};
R3 = alquilo C_{1}-C_{7},
alquenilo C_{2}-C_{7}, cicloalquilo
C_{3}-C_{7}, Ar-alquilo
C_{1}-C_{7}; Ar;
R5 = alquilo C_{1}-C_{7},
Ar-alquilo C_{1}-C_{7}, alquil
C_{0}-C_{3}-CONR3R4 o
R^{iv};
R^{iv} =
en la
que
n = 1 - 3
m = 1 - 3
R^{v}, V^{vi} = H, alquilo
C_{1}-C_{7};
A = N, CH;
B = N, O, S, CH;
R^{vii} = no está presente cuando B = O, S;
o
R^{vii} = H, alquilo
C_{1}-C_{7} cuando B = N, CH
R^{viii} = O, alquilo
C_{1}-C_{7};
y sus sales farmacéuticamente aceptables, en la
que
alquilo C_{1}-C_{7} se
refiere a cadenas de carbono alifáticas de cadena lineal y
ramificada, opcionalmente sustituidas con uno o dos halógenos y/o un
heteroátomo S, O, NH, en el que el heteroátomo en un extremo de
cadena puede estar sustituido con 1 ó 2 átomos de hidrógeno o un
azufre oxidado a la sulfona;
cicloalquilo C_{3-6} o
C_{3-7} se refiere a cualquier variación de
alquilo C_{1}-C_{7} que contiene además un
anillo carbocíclico C_{3-6} o
C_{3-7} o el cicloalquilo está unido en posición
espiro al carbono adyacente sin un alquilo
C_{1}-C_{7} intermedio;
Ar se refiere a un anillo aromático fenilo,
pirazolilo, piridilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo,
tiazinolilo, isotiazinonilo, tiazolilo, oxadiazolilo,
1,2,3-triazolilo, 1,2,4-triazolilo,
furanilo o tienilo, opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo
C_{1-3}, OH, O-alquilo
C_{1-3}, SH, S-alquilo
C_{1-3}, amina;
Ar-alquilo
C_{1}-C_{7} se refiere a Ar unido al átomo de
carbono respectivo a través de un alquilo
C_{1}-C_{7}.
2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que el anillo bicíclico R' se selecciona de naftilo, quinolilo,
benzofuranilo, benzotienilo, indolilo, indolinilo.
3. Un compuesto según la reivindicación 2, en el
que la unión está en la posición 2 del anillo R'.
4. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que R' está sustituido con morfolina o
N-metilpiperidina unida a través de una unión
alquilo o alquiléter.
5. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que R1 es R'C(O).
6. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que R3 es
2-metilprop-1-enilo,
bencilo o especialmente i-butilo.
7. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que la estereoquímica en R3 corresponde a un
L-aminoácido natural o no natural.
8. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que R5 es CH_{3}, C_{2}H_{5}, CH_{2}Ar, CH_{2}CONH_{2},
(CH_{2})_{2}CONH_{2}, CH_{2}OH,
CH_{3}, CH_{2}CH_{3} y
CH_{2}OH siendo particularmente
preferidos.
9. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que R5 y el enlace C_{4} tienen ambos estereoquímica (R) o ambos
(S).
10. Un compuesto según la reivindicación 1 o
5-9, en el que R' es un anillo monocíclico
sustituido con un sustituyente cíclico, con preferencia un
sustituyente no aromático, en particular en el que el sustituyente
cíclico no aromático se selecciona del grupo consistente en
pirrolidin-1-ilo,
piperidin-1-ilo,
morfolin-4-ilo,
4-metilpiperazin-1-ilo,
2-morfolin-4-il-etil-amino
y piperazin-1-ilo, siendo con
preferencia el anillo monocíclico piridilo, pirimidinilo o fenilo,
que está sustituido preferiblemente en la posición 3 ó 4.
11. Uso de un compuesto según se define en la
reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o profilaxis de trastornos dependientes de la actividad
de catepsina K.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que el
trastorno es un trastorno óseo tal como periodontitis u
osteoartritis, un trastorno de degradación del cartílago o la matriz
tal como osteoartritis o artritis reumatoide, o neoplasia.
13. Uso de un compuesto según se define en la
reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o profilaxis de una infección por parásitos.
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