DE60115192T2

DE60115192T2 - Bioverträglicher Verbundschaum

Info

Publication number: DE60115192T2
Application number: DE60115192T
Authority: DE
Inventors: Murty N. Vyakarnam; Mark C. Zimmerman; Angelo George Scopelianos; Mora C. Melican; Clairene A. Bazilio; Mark B. Roller; David V. Gorky; Iksoo Chun
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 2001-02-26
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2021-02-27
Also published as: EP1234587A1; DE60115192D1; EP1234587B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf das Gebiet der Gewebereparatur und -regeneration. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf poröse biokompatible bioabsorbierbare Schaumstoffe, die einen Gradienten in der Zusammensetzung und/oder Mikrostruktur aufweisen und die als eine Matrize für die Geweberegeneration, -reparatur oder -vermehrung dienen.
Hintergrund der Erfindung
Von offenen Zell-, porösen biokompatiblen Schaumstoffen hat man erkannt, daß sie ein signifikantes Potential zur Verwendung bei der Reparatur und Regeneration von Gewebe aufweisen. Frühe Anstrengungen auf dem Gebiet der Gewebereparatur konzentrierten sich auf die Verwendung von amorphen biokompatiblen Schaumstoffen als poröse Stopfen, um Lücken im Knochen zu füllen. Brekke, et al. (U.S. Patent Nr. 4,186,448) beschrieben die Verwendung von porösen Netz-Stopfen, die aus Polyhydroxysäurepolymeren, wie z.B. Polylactiden, zusammengesetzt sind, für die Heilung von Knochenlücken. In der jüngeren Vergangenheit wurden verschiedene Versuche unternommen, um TE-Gerüste unter der Verwendung von verschiedenen Verfahren herzustellen. Zum Beispiel U.S. Patente 5,522,895 (Mikos) und 5,514,378 (Mikos, et al.) unter der Verwendung von Laugemitteln („leachables"); U.S. Patente 5,755,792 (Brekke) und 5,133,755 (Brekke) unter der Verwendung von Vakuumschaum-Techniken; U.S. Patente 5,716,413 (Walter, et al.) und 5,607,474 (Athanasiou, et al.) unter der Verwendung von präzipitierten Polymer-Gel-Massen; U.S. Patente 5,686,091 (Leong, et al.) und 5,677,355 (Shalaby, et al.) unter der Verwendung von Polymerschmelzen mit flüchtigen Verbindungen, die bei Temperaturen größer als Raumtemperatur sublimieren, und U.S. Patente 5,770,193 (Vacanti, et al.), 5,769,899 (Schwartz, et al.) und 5,711,960 (Shikinami) unter der Verwendung von Textil-basierenden fibrösen Gerüsten. Hinsch et al. ( EP A 274 898 ) beschrieben einen porösen offenen Zell-Schaum aus Polyhydroxysäuren mit Porengrößen von ungefähr 10 bis ungefähr 200 μm für das Einwachsen („in-growth") von Blutgefäßen und Zellen. Der Schaumstoff, der von Hinsch beschrieben wird, könnte auch mit Fasern, Garnen, Schnuren, Maschenwaren, Baumwollstoffen und ähnlichem verstärkt werden. Hinschs Arbeit beschrieb auch die Verwendung einer Vielfalt von Polyhydroxysäure-Polymeren und Copolymeren, wie z.B. Poly-L-Lactid, Poly-DL-Lactid, Polyglycolid und Polydioxanon. Die Hinsch-Schaumstoffe haben den Vorteil, daß sie reguläre Porengrößen und -formen aufweisen, die durch die Verarbeitungsbedingungen, die ausgewählten Lösungsmittel und die Additiva kontrolliert werden könnten.
Jedoch haben die oben genannten Techniken Limitationen bei der Herstellung eines Gerüsts mit einer Gradienten-Struktur. Die meisten der Gerüste sind isotropisch in Form und Funktion und ermangeln die anisotropischen Eigenschaften von natürlichen Geweben. Weiterhin ist es eine Limitation des Standes der Technik, 3D-Gerüste herzustellen, die die Fähigkeit haben, die räumliche Verteilung von verschiedenen Porenformen zu kontrollieren. Das Verfahren, das beschrieben wird, um die Mikrostruktur-kontrollierten Schaumstoffe herzustellen, ist ein Niedrig-Temperatur-Prozeß, der viele Vorteile gegenüber anderen konventionellen Techniken bietet. Zum Beispiel erlaubt das Verfahren das Einschließen von thermisch sensitiven Verbindungen, wie z.B. Proteinen, Wirkstoffen und anderen Additiva, mit den thermisch und hydrolytisch unstabilen absorbierbaren Polymeren.
Athanasiou et al. (U.S. Patent Nr. 5,607,474) haben kürzlich die Verwendung einer Zwei-Schicht-Schaumstoff-Vorrichtung für die Reparatur von osteochondralen Defekten an einer Stelle, wo zwei unähnliche Typen von Gewebe anwesend sind, vorgeschlagen. Die Athanasiou-Vorrichtung besteht aus einer ersten und einer zweiten Schicht, die teilweise separat hergestellt werden und bei einem nachfolgenden Schritt zusammengefügt werden. Jede der Gerüst-Schichten ist so ausgeführt, daß sie Steifheit und Kompressibilität aufweist, die zu dem entsprechenden Knorpel- und Knochen-Gewebe korrespondiert. Weil Knorpel und Knochen oftmals benachbarte Schichten im Körper bilden, ist dieser Ansatz ein Versuch, die Struktur des menschlichen Körpers deutlicher nachzuahmen. Jedoch ist die Grenzfläche zwischen dem Knorpel und Knochen im menschlichen Körper keine diskrete Grenzzone von zwei unähnlichen Materialien mit einem abrupten Wechsel in den anatomischen Merkmalen und/oder den mechanischen Eigenschaften. Die Knorpelzellen haben eine deutlich verschiedene Zellmorphologie und -Orientierung in Abhängigkeit von der Lage der Knorpelzelle in Beziehung zu der unterliegenden Knochenstruktur. Der Unterschied in der Knorpelzell-Morpohologie und -Orientierung sorgt für einen kontinuierlichen Übergang von der äußeren Oberfläche des Knorpels zu der unterliegenden Knochen-Knorpel-Grenzfläche. Obwohl es eine schrittweise Verbesserung darstellt, ahmt das Zwei-Schicht-System von Athanasiou daher nicht die Gewebe-Grenzflächen nach, die im menschlichen Körper vorhanden sind.
Ein weiterer Ansatz, dreidimensional laminierte Schaumstoffe herzustellen, wird von Mikos et al. vorgestellt (U.S. Patent Nr. 5,514,78). In dieser Technik, welche recht beschwerlich ist, wird zuerst poröse Membran durch Trocknen einer Polymerlösung hergestellt, welche Laugmittel („leachable")-Salzkristalle enthält. Eine dreidimensionale Struktur wird dann durch Laminieren verschiedener Membranen zusammen erhalten, welche dann gemäß einer Konturzeichnung der gewünschten Form geschnitten wird.
Eine der hauptsächlichen Schwächen des Standes der Technik in Bezug auf dreidimensionale poröse Gerüste, die für die Regeneration von biologischen Geweben, wie z.B. Knorpel, verwendet werden, ist, daß deren Mikrostruktur zufälliger Natur ist. Diese Gerüste variieren nicht in der Morphologie oder der Struktur, wie es die natürlichen Gewebe tun. Weiterhin stellen die derzeitigen Gerüste keinen adäquaten Nährstoff- und Flüssigkeits-Transport für viele Applikationen zur Verfügung. Letztendlich werden die laminierten Strukturen nicht vollständig integriert und werden der Laminierung nicht unter in vivo Bedingungen unterzogen.
Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen biokompatiblen, bioabsorbieren Schaumstoff zur Verfügung zu stellen, der einen kontinuierlichen transitionalen Gradienten morphologischer Natur, struktureller Natur und/oder aus Materialien zur Verfügung stellt. Weiterhin ist bevorzugt, daß Schaumstoffe, die in der Gewebetechnik verwendet werden, eine Struktur aufweisen, die die Organisation auf der Mikrostruktur-Ebene zur Verfügung stellt, was eine Matrize zur Verfügung stellt, die zelluläre Invasion, Proliferation und Differentiation fördert und die letztendlich zu der Regeneration von funktionalem Gewebe führen wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Komposite zur Verfügung, die eine erste Schicht, die eine biokompatible filamentöse Schicht ist, und eine zweite Schicht aus biokompatiblem Schaumstoff umfaßt. Diese Kompositen-Struktur erlaubt die Kreation von Strukturen mit einzigartigen mechanischen Eigenschaften. Die fibröse Schicht erlaubt der Komposite, variable mechanische Festigkeit in Abhängigkeit von der Ausgestaltung, ein verschiedenes Bioabsorptions-Profil und eine verschiedene Mikroumgebung für Zellinvasion und -säen aufzuweisen, welche vorteilhaft in einer Vielfalt von medizinischen Applikationen sind. Die fibröse Schicht kann aus einer Vielfalt von biokompatiblen Polymeren und Mischungen von biokompatiblen Polymeren hergestellt werden, welche bevorzugterweise bioabsorbierbar sind. Der biokompatible Schaumstoff kann entweder ein Gradienten-Schaumstoff oder ein kanalisierter Schaumstoff sein. Der Gradienten-Schaumstoff hat einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in mindestens einer Eigenschaft, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Zusammensetzung, Steifheit, Flexibilität, Bioabsorptions-Rate, Poren- Architektur und/oder Mikrostruktur. Der Gradienten-Schaumstoff kann aus einer Mischung von absorbieren Polymeren hergestellt werden, die Zusammensetzungs-Gradienten-Übergänge von einem polymeren Material zu einem zweiten polymeren Material bilden. In Situationen, wo eine einzelne chemische Zusammensetzung ausreichend für die Applikation ist, stellt die Erfindung eine Komposite zur Verfügung, welche mikrostrukturelle Variationen in der Struktur über eine oder mehrere Dimensionen aufweisen kann, die die anatomischen Merkmale des Gewebes nachahmen können (z.B. Knorpel, Haut, Knochen etc.). Der kanalisierte Schaumstoff stellt Kanäle zur Verfügung, die sich durch den Schaumstoff ausbreiten, um Zell-Migration und Nährstoff-Fluß durch den kanalisierten Schaumstoff zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Reparatur oder Regeneration von Gewebe zur Verfügung, wobei ein erstes Gewebe mit der oben beschriebenen Komposite an einer Stelle auf der Komposite in Kontakt gebracht wird, die geeignete Eigenschaften aufweist, um das Wachstum des besagten Gewebes zu fördern. Diese Kompositen-Strukturen sind insbesondere nützlich für die Regeneration von Gewebe zwischen zwei oder mehreren verschiedenen Gewebetypen. Im einfachsten Falle könnte für ein multi-zelluläres System ein Zelltyp an einer Seite des Gerüsts vorhanden sein und ein zweiter Zelltyp an der anderen Seite des Gerüsts vorhanden sein. Beispiele für solch eine Regeneration können sein: (a) vaskuläres Gewebe: mit glatter Muskulatur an der Außenseite und endothelialen Zellen an der Innenseite, um vaskuläre Strukturen zu regenerieren; (b) Meniskus-Gewebe: durch Implantieren mit Chondrocyten in dem Schaumstoff der Komposite und Orientieren der fibrösen Oberfläche zu der Außenseite.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine Rasterelektronen-mikroskopische Aufnahme des Querschnitts eines Zufalls-Mikrostruktur-Schaumstoffs, der aus einer 5%igen Lösung von 35/65 ε-Caprolactonco-Glycolid-Copolymer hergestellt wurde.
2 ist eine Rasterelektronen-mikroskopische Aufnahme des Querschnitts eines Schaumstoffes mit vertikalen offenen Kanälen, der aus einer 10%igen Lösung von 35/65 ε-Caprolacton-co-Glycolid-Copolymer hergestellt wurde.
3 ist eine Rasterelektronen-mikroskopische Aufnahme des Querschnitts eines Schaumstoffs mit architektonischem Gradienten, der aus einer 10%igen Lösung von 35/65 ε-Caprolacton-co-Glycolid-Copolymer hergestellt wurde.
4 ist eine Rasterelektronen-mikroskopische Aufnahme des Querschnitts eines Gradienten-Schaumstoffs, der aus einer 50:50-Mischung von 40/60 ε-Caprolacton-co-(L)-Lactid-Copolymer und 35/65 ε-Caprolacton-co-Glycolid-Copolymer hergestellt wurde.
5 ist eine Rasterelektronen-mikroskopische Aufnahme des Querschnitts des oberen Teils eines Gradienten-Schaumstoffs, der aus einer 50:50-Mischung von 40/60 ε-Caprolacton-co-(L)-Lactid-Copolymer und 35/65 ε-Caprolacton-co-Glycolid-Copolymer hergestellt wurde.
6 ist eine Rasterelektronen-mikroskopische Aufnahme des Querschnitts des unteren Teils eines Gradienten-Schaumstoffs, der aus einer 50:50-Mischung von 40/60 ε-Caprolacton-co-(L)-Lactid-Copolymer und 35/65 ε-Caprolacton-co-Glycolid-Copolymer hergestellt wurde.
7 ist eine graphische Darstellung der Zellkultur-Daten, 7A, 7B und 7C.
8 ist eine anatomische Skizze von Knorpelgewebe.
9A, 9B und 9C sind Rasterelektronen-mikroskopische Aufnahmen eines 0,5 mm Schaumstoffs, der aus einer 50:50-Mischung eines 35/65 ε-Caprolacton-co-Glycolid-Copolymers und eines 40/60 ε-Caprolacton-Co-(L)-Lactid-Copolymers hergestellt wurde und eine Architektur aufweist, die zur Verwendung als ein Haut-Gerüst geeignet ist. 9A zeigt die Porosität der Oberfläche des Gerüsts, das bevorzugterweise dem Wundbett gegenüber liegen würde. 9B zeigt die Porosität der Oberfläche des Gerüsts, das bevorzugterweise von dem Wundbett weg zeigen würde. 9C zeigt einen Querschnitt des Gerüsts mit Kanälen, die durch die Dicke des Schaumstoffs laufen.
10 ist eine Dunkelfeld-40X-Mikroaufnahme einer Trichrom-gefärbten Probe, die die zelluläre Invasion des Schaumstoffs, der in 9 gezeigt ist, illustriert, und zwar 8 Tage nach der Implantation in ein Schweine-Modell.
11 ist eine 100X-Komposite-Mikroaufnahme einer Trichrom-gefärbten Probe, die die zelluläre Invasion des Schaumstoffs, der in 9 gezeigt ist und welcher auch PDGF enthielt, illustriert, und zwar 8 Tage nach der Implantation in eine Schweine-Modell.
12 ist eine Mikroaufnahme eines Querschnitts einer elektrostatisch gesponnenen fibrösen Schicht, die an ein Schaumstoff-Substrat fusioniert ist (beide Materialien sind 60/40 Copolymere von (L)-Lactid und ε-Caprolacton).
13 ist eine Mikroaufnahme der Oberflächen-Porosität der elektrostatisch gesponnenen Schicht, die in 12 gezeigt ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung beschreibt poröse bioabsorbierbare Polymer-Schaumstoffe, welche neuartige Mikrostrukturen aufweisen. Die Merkmale solcher Schaumstoffe können kontrolliert werden, damit sie sich für eine gewünschte Anwendung eignen, und zwar durch Auswahl der geeigneten Bedingungen für die Bildung des Schaumstoffs während der Lyophilisation. Diese Merkmale in absorbierbaren Polymeren haben ausgeprägte Merkmale gegenüber dem Stand der Technik, wo die Gerüste typischerweise isotropische oder zufällige Strukturen sind. Jedoch wird bevorzugt, daß Schaumstoffe, die in der Gewebetechnik (d.h. Reparatur oder Regeneration) verwendet werden, eine Struktur aufweisen, die eine Organisation auf der mikrostrukturellen Ebene zur Verfügung stellt, was eine Matrize zur Verfügung stellt, die zelluläre Organisation und Regeneration des Gewebes ermöglicht, das die anatomischen, biomechanischen und biochemischen Merkmale von normalen Geweben aufweist. Diese Schaumstoffe können zur Reparatur oder Regeneration von Gewebe (einschließlich Organen) in Tieren, wie z.B. Haustieren, Primaten und Menschen, verwendet werden.
Die Merkmale solcher Schaumstoffe können kontrolliert werden, damit sie sich für die gewünschte Applikation eignen, durch Auswählen der geeigneten Eigenschaften für die Lyophilisation, um eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften zu erhalten: (1) zusammenbindende Poren mit Größen im Bereich von 10 bis 200 μm (oder größer), die Bahnen für zelluläres Einwachsen und Nährstoff-Diffusion zur Verfügung stellen; (2) eine Vielfalt von Porositäten im Bereich von 20% bis 98% und bevorzugterweise im Bereich von 80% bis 95%; (3) ein Gradient in der Porengröße entlang einer Richtung für bevorzugtes Zell-Kultivieren; (4) Kanäle, die durch den Schaumstoff für verbesserte Zellinvasion, Vaskularisierung und Nährstoff-Diffusion laufen; (5) Mikro-Musterbildung von Poren auf der Oberfläche für zellu läre Organisation; (6) Zuschneidbarkeit der Porenform und/oder -orientierung (z.B. im wesentlichen sphärisch, ellipsoid, säulenartig); (7) anisotrope mechanische Eigenschaften; (8) Kompositen-Schaumstoffe mit einem Polymer-Zusammensetzungs-Gradienten, um eine unterschiedliche Zell-Antwort auf verschiedene Materialien auszulösen oder auszunutzen; (9) Mischungen von verschiedenen Polymer-Zusammensetzungen, um Strukturen zu schaffen, die Teile haben, die mit verschiedenen Raten zerfallen werden; (10) Schaumstoffe, die mit pharmazeutisch aktiven Verbindungen, einschließlich, aber nicht limitiert auf, biologische Faktoren, wie z.B. RGDs Wachstumsfaktoren (PDGF, TGF-β, VEGF, BMP, FGF etc.) und ähnlichem co-lyophilisiert oder beschichtet sind; (11) die Fähigkeit, dreidimensionale Formen und Vorrichtungen mit bevorzugten Mikrostrukturen herzustellen, und (12) Lyophilisierung mit anderen Teilen oder medizinischen Vorrichtungen, um eine Kompositen-Struktur zur Verfügung zu stellen. Diese kontrollierten Merkmale in absorbierbaren Polymeren haben deutliche Vorteile gegenüber dem Stand der Technik, wo die Gerüste typischerweise isotrope oder zufällige Strukturen ohne eine bevorzugte Morphologie auf der Porenebene aufweisen. Jedoch wird bevorzugt, daß Schaumstoffe, die in Gewebe-Gerüsten verwendet werden, eine Struktur aufweisen, die eine Organisation auf der Mikrostruktur-Ebene zur Verfügung stellt und eine Matrize zur Verfügung stellt, die zelluläre Organisation ermöglicht, was natürliches Gewebe nachahmen kann. Die Zellen werden entlang und durch die Konturen der Struktur anwachsen, proliferieren und differenzieren. Dies wird letztendlich zu einem kultivierten Gewebe führen, das die anatomischen Merkmale des wirklichen Gewebes in einem großen Ausmaß nachahmen kann.
Wie z.B. in 3 gezeigt, kann sich die Orientierung der Hauptachsen der Poren sich dahingehend ändern, daß sie sich in derselben Ebene wie der Schaumstoff befinden, bis dahingehend, daß sie senkrecht zu der Ebene des Schaumstoffs orientiert sind. Wie in 3 gesehen werden kann, kann die Porengröße von einer kleinen Porengröße, im allgemeinen zwischen 30 μm und 50 μm, bis zu einer größeren Größe von 100 μm bis 200 μm in porösen Gradienten-Schaumstoffen variieren. Idealerweise könnte die Schaumstoff-Struktur erschaffen werden, um die Reparatur oder Regeneration von menschlichen Gewebe-Grenzzonen zu ermöglichen, wie z.B. Grenzzone vom Knorpel zum Knochen, die in Gelenken vorhanden ist. Dieser Schaumstoff würde von kleinen (d.h. 30 μm bis 150 μm im Durchmesser) runden Poren zu größeren säulenartigen (d.h. 30 μm bis 400 μm im Durchmesser, bevorzugterweise 100 μm bis 400 μm im Durchmesser, in den meisten Fällen mit einem Verhältnis von Länge zu Durchmesser von mindestens 2) verlaufen. Schaumstoffe mit Kanälen werden in 2 und 3 illustriert. Die Kanäle, die durch dieses Verfahren gebildet werden, beginnen im all gemeinen auf einer Oberfläche des Schaumstoffs und können die Dicke des Schaumstoffs durchqueren. Die Länge des Kanals ist im allgemeinen mindestens zweimal der durchschnittliche Porendurchmesser und bevorzugterweise mindestens viermal der durchschnittliche Porendurchmesser und am meisten bevorzugt mindestens achtmal der durchschnittliche Porendurchmesser. Die Kanäle für die meistern Applikationen werden mindestens 200 Mikrons lang sein und können durch die Dicke des Schaumstoffes verlaufen. Der Durchmesser des Kanals wird mindestens einmal die Größe des durchschnittlichen Porendurchmessers haben und bevorzugt mindestens zwei- bis dreimal die Größe des durchschnittlichen Porendurchmessern haben. Die Kanalgröße und der Kanaldurchmesser wird natürlich aufgrund der gewünschten Funktionalität des Kanals, wie z.B. zelluläre Invasion, Nährstoff-Diffusion oder als ein Zugang für Vaskularisation, ausgewählt werden.
Es gibt eine Reihe von biologischen Geweben, die Gradienten-Architekturen aufweisen. Beispiele für Gewebe, wo ein Gradienten-Gerüst verwendet werden könnte, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf: Knochen, Bandscheibe, Gelenkknorpel, Meniskus, Faserknorpel, Sehnen, Bänder, Hirnhaut, Haut, vaskuläre Transplantate, Nerven, Leber und Pankreas. Die Beispiele unten heben einige Gewebe hervor, wo Gradienten-Gerüste verwendet werden könnten. Die Ausgestaltung von Gewebe-Technik-Gerüsten, um die Entwicklung dieser Organstrukturen zu ermöglichen, würde im starken Maße von der Fähigkeit profitieren, eine Gradienten-Architektur in der Struktur auszuführen oder zu schaffen.
Knorpel
Gelenkknorpel bedeckt die Enden aller Knochen, die Gelenk-bildende Gelenke in Menschen und Tieren bilden. Der Knorpel agiert in dem Gelenk als ein Mechanismus zur Kraftverteilung und als eine tragende Oberfläche zwischen verschiedenen Knochen. Ohne Gelenkknorpel würde Streßkonzentration und Reibung in einem Maß auftreten, was dem Gelenk keine Leichtigkeit bei der Bewegung erlauben würde. Ein Verlust des Gelenkknorpels führt gewöhnlicherweise zu schmerzvoller Arthritis und verringerter Gelenkbewegung. Eine schematische Abbildung der morphologischen Merkmale eines gesunden Knorpels sind in 8 gezeigt.
Der Gelenkknorpel ist ein exzellentes Beispiel für eine natürlich vorkommende Gradient-Struktur. Gelenkknorpel setzt sich aus vier verschiedenen Zonen zusammen, welche die oberflächliche oder tangentiale Zone innerhalb der ersten 10 bis 20% der Struktur (diese schließt die Gelenkoberfläche ein), die mittlere Zone, welche 40 bis 60% der mittleren Struktur ist, und die tiefe Zone, die sich benachbart zu der Last-tragenden Knochenschicht („tide mark") befindet, und eine Übergangszone zwischen dem Knochen und dem Knorpel, die aus kalzifiziertem Knorpel zusammengesetzt ist, einschließen. Subchondraler Knochen befindet sich benachbart zu der Last-tragenden Knochenschicht („tide mark") und diese geht über in die Spongiosa. In der oberflächlichen oder tangentialen Zone verlaufen die Kollagen-Fibrillen parallel zu der Oberfläche. Die Fasern sind so orientiert, daß sie Scherkräften, die durch die normale Gelenkverbindung generiert werden, widerstehen. Die mittlere Zone hat eine zufällig angeordnete Organisation von Kollagenfasern mit viel größerem Durchmesser. Letztendlich befinden sich in der tiefen Zone große Kollagen-Faserbündel, welche senkrecht zu der Oberfläche verlaufen, und diese führen in den kalzifizierten Knorpel. Die Zellen sind kugelig und tendieren dazu, sich selbst in einer säulenartigen Weise anzuordnen. Die kalzifizierte Knorpel-Zone hat kleinere Zellen mit relativ wenig Cytoplasma.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung würde dazu da sein, eine Gradienten-Schaumstoff-Struktur zu generieren, die als eine Matrize für multiple verschiedene Zonen dienen könnte. Diese Schaumstoff-Strukturen könnten in einer Vielfalt von Formen hergestellt werden, um osteochondriale Defekte und Knorpel zu regenerieren oder zu reparieren. Eine potentielle Schaumstoff-Struktur würde eine zylindrische Form mit den ungefähren Dimensionen von 10 mm Durchmesser und 10 mm Tiefe aufweisen. Die obere Oberfläche würde ungefähr 1 mm dick sein und würde eine niedrig poröse Schicht sein, um die Flüssigkeits-Permeabilität zu kontrollieren. Durch den Einsatz einer geeigneten Verarbeitungsmethode könnte die Oberflächen-Porosität des Schaumstoffes kontrolliert werden. Die Porosität dieser Haut-ähnlichen Oberfläche kann von vollständig undurchlässig bis zu vollständig porös variiert werden. Die Flüssigkeits-Permeabilität würde durch die Oberflächen-Porosität kontrolliert werden. Unter solch einer Haut würde die Struktur aus drei Zonen bestehen: einer oberen porösen Zone, welche benachbart zum Knorpelgewebe liegt, einer unteren porösen Zone, welche benachbart zum Knochengewebe liegt, und einer Übergangszone zwischen der oberen und der unteren porösen Zone. Für Gelenkknorpel wird es derzeit bevorzugt, daß die Steifheit (Modul) der oberen und unteren porösen Schichten zum Zeitpunkt der Implantation mindestens so steif ist wie das korrespondierende benachbarte Gewebe. In solch einem Fall werden die porösen Schichten in der Lage sein, die umgebende Belastung zu unterstützen und dadurch die eindringenden Zellen zu schützen, bis diese differenziert sind und in Gewebe verfestigt sind, das zur kräftigenden Belastbarkeit in der Lage ist. Zum Beispiel könnte die poröse Struktur, die für die oberflächliche tangentiale Zone verwendet wird, verlängerte Poren aufweisen und die Orientierung der Struktur könnte parallel zu der Oberfläche des Wirtsknorpels sein. Jedoch kann die tiefe Zone eine Porosität von 80 bis 95% mit Poren haben, die in der Größenordnung von 100 μm (80 μm bis 120 μm) sind. Es wird erwartet, daß Chondrocyten in diese Zone eindringen werden. Darunter würde eine Zone mit größeren Poren (100 μm bis 200 μm) liegen, und zwar mit einer Porosität im Bereich von 50 bis 80%. Ein solcher 100 μm bis 200 μm poröser Schaumstoff würde eine Struktur haben, so daß die Streben („struts") oder Wände der Poren größer sind und vertikal zu der Belastung sind, ähnlich wie die natürlich vorkommende Struktur, und die Belastung aushalten. Letztendlich gibt es einen Bedarf für größere Poren (150 μm bis 300 μm) mit höherer Steifheit am Grund dieser Struktur, um strukturell kompatibel mit der Spongiosa zu sein. Der Schaumstoff in dieser Sektion könnte mit keramischen Partikeln oder Fasern, die aus Kalciumphosphaten oder ähnlichem gemacht sind, verstärkt sein.
Neuere Daten, die in unseren Laboratorien generiert wurden, unterstützen die Hypothese, daß Zellinvasion durch die Porengröße kontrolliert werden kann. In diesen Studien hatte ein Gerüst, das aus 95/5 mol-% Poly-(L)-Lactid-co-ε-Caprolacton hergestellt wurde und eine durchschnittliche Porengröße von ungefähr 80 μm aufwies, Chondrocyten-Einwanderung von ungefähr 30 Zellen/qm² des Gerüsts (unter statischen Bedingungen). Gerüste, die aus 40/60 mol-% Poly(ε-Caprolacton-co-(L)-Lactid) hergestellt wurden und eine größere durchschnittliche Porengröße von ungefähr 100 μm aufwiesen, hatten eine statistisch signifikant größere zelluläre Invasion von 50 Zellen/mm² (unter statischen Bedingungen). In beiden Fällen waren die Zellen bovine Chondrocyten. Eine sehr einfache Gradienten-Struktur mit einer Variation der Porengrößen von 80 μm bis 150 μm würde eine Struktur zur Verfügung stellen, wo Chondrocyten einfacher in das Gebiet mit größeren Poren einwandern würden. Das Gebiet mit kleineren Poren würde keine Chondrocyten enthalten und würde mit einem zweiten Zelltyp (Fibroblasten) gefüllt sein.
In einem Zusammensetzungs-Gradienten-Schaumstoff kann eine Mischung aus zwei oder mehreren elastomeren Copolymeren oder in Kombination mit semi-kristallinen Polymeren mit hohem Modul, zusammen mit Additiva wie z.B. Wachstumsfaktoren oder Partikeln ausgewählt werden, so daß zuerst ein gewünschter Porengradient mit einer bevorzugten räumlichen Organisation der Additiva gebildet wird. Durch Verwenden einer Vielfalt der Ansätze, auf die sich in den bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Gradienten-Schaumstoffen bezogen wird, kann ein Zusammensetzungs-Gradient aufgebracht werden, und zwar primär aufgrund der Unterschiede im Polymer-Lösungsmittel-Phasenseparations-Verhalten jedes Systems. Solch eine Gradienten-Schaumstoff-Struktur würde eine günstige Antwort auf Chondrocyten oder Osteoblasten in Abhängigkeit von der räumlichen Lokalisierung auslösen.
Weiterhin ist der Zweck eines funktionellen Gradienten, die Spannungen entlang einer Region, in welchee mechanische und/oder physikalische Eigenschaften variieren, einheitlich zu verteilen und dadurch die Streßkonzentrierungs-Effekte einer plötzlichen Grenzfläche zu erleichtern. Dies ist den tatsächlichen biologischen Geweben und Strukturen viel ähnlicher, wo strukturelle Übergänge zwischen sich unterscheidenden Geweben, wie z.B. Knorpel und Knochen, graduell sind. Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Implantat mit einem funktionellen Gradienten zwischen materiellen Phasen zur Verfügung zu stellen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Multi-Phasen-, funktionell abgestuftes bioabsrobierbares Implantat mit Anknüpfungsmitteln zur Verwendung in der chirurgischen Reparatur von osteochondralen Defekten oder Stellen von Osteoarthritits zur Verfügung. Verschiedene Patente wurden für Systeme zur Reparatur von Knorpel vorgeschlagen, welche mit den vorliegenden erfinderischen porösen Gerüsten verwendet werden könnten. Zum Beispiel beschreibt U.S. Patent 5,769,899 eine Vorrichtung zur Reparatur von Knorpel-Defekten und U.S. Patent 5,713,374 beschreibt sichernde Knorpel-Reparatur-Vorrichtungen mit Knochenankern.
Knochen
Gradienten-Strukturen kommen natürlicherweise an der Knochen/Knorpel-Grenzfläche vor. In einer Studie in unseren Laboratorien haben wir demonstriert, daß materielle Differenzen die Zellfunktion signifikant beeinflussen. Die anfänglichen und Langzeit-Antworten von primären Osteoblasten auf Polymerfilme (95/5 L-Lactid-co-Glycolid-Copolymer, 90/10 Glycolid-co-(L)-Lactid-Copolymer, 95/5 L-Lactid-co-ε-Caporlacton-Copolymer, 75/25 Glycolid-co-(L)-Lactid-Copolymer und 40/60 ε-Caprolacton-co-(L)-Lactid-Copolymer) und auf gestrickte Netze (95/5 (L)-Lactid-co-Glycolid und 90/10 Glycolid-co-(L)-Lactid-Copolymere) wurden in vitro untersucht. Die Ergebnisse demonstrieren, daß Osteoblasten gut an alle der biodegradierbaren Polymerfilme und -netze nach sechstägiger Inkubation anwuchsen und proliferierten. Keiner der getesteten Polymerfilme, außer ein 40/60 ε-Caprolacton-co-(L)-Lactid-Copolymer-Film, demonstrierte signifikante Verbesserung in der Differenzierung von primären Ratten-Osteoblasten im Vergleich zu Gewebe-Kultur-Polystyrol (Kontrolle). Filme, die aus 40/60 Caprolacton-co-(L)-Lactid hergestellt waren, verstärkten die Differenzierung von kultivierten Osteoblasten, wie durch eine erhöhte alkalische Phosphatase-Aktivität und Osteocalcin-mRNA-Expression im Vergleich zu den anderen Filmen und TCPS demonstriert werden konnte. Demzufolge ist es klar, daß verschiedene absorbierbare Materialien signifikant Zellfunktion und -differenzierung modifizieren können. Durch das Identifizieren der optimalen Materialien für Zellwachstum und -differenzierung könnte ein Kompositen-Material mit einer Gradienten-Zusammensetzung verwendet werden, um Gewebe-Regeneration mit verschiedenen Zelltypen in dem selben Gerüst zu optimieren.
Daher wird für Knochenreparatur- oder -Regenerations-Vorrichtungen oder -Gerüste eine Vorrichtung besonders bevorzugt, die aus einem Homopolymer, Copolymer (Zufalls-, Block, segmentierter Block, kegelförmige Blöcke, Transplantat, Triblock etc.), der eine lineare, verzweigte oder sternförmige Struktur aufweist und ε-Caprolacton enthält, hergestellt werden. Derzeit bevorzugt werden aliphatische Polyester-Copolymere, die in einem Bereich von 30 Gew.-% bis 99 Gew.-% ε-Caprolacton enthalten. Geeignete Wiederholungseinheiten, die mit ε-Caprolacton copolymerisiert werden können, sind im Stand der Technik bekannt. Geeignete Comonomere, die mit ε-Caprolacton copolymerisiert werden können, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Milchsäure, Lactid (einschließlich L-, D-, meso- und D,L-Mischungen), Glycolsäure, Glycolid, p-Dioxanon (1,4-Dioxan-2-on), Trimethylencarbonat (1,3-Dioxan-2-on), δ-Valerolacton, β-Butyrolacton, ε-Decalacton, 2,5-Diketomorpholin, Pivalolacton, α,α-Diethylpropiolacton, Ethylencarbonat, Ethylenoxalat, 3-Methyl-1,4-Dioxan-2,5-dion, 3,3-Diethyl-1,4-dioxan-2,5-dion, γ-Butyrolacton, 1,4-Dioxepan-2-on, 1,5-Dioxepan-2-on, 6,6-Dimethyl-dioxepan-2-on, 6,8-Dioxabicycloctan-7-on und Kombinationen davon.
Bevorzugte medizinische Vorrichtungen oder Gewebe-Gerüste für Knochengewebe-Reparatur und/oder -Regeneration, die bioabsorbierbare Polymere enthalten und aus ε-Caprolacton hergestellt sind, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, die porösen Schaumstoff-Gerüste (wie in dieser Anmeldung beschrieben), fibröse dreidimensionale, gesponnene Vliesstoff-, gewebte, gestrickte oder umsponnene Gewebe-Gerüste, Kompositen-enthaltende verstärkende Fasern, Matrizen und Kombinationen davon.
Haut
Ein anderes Beispiel eines Gewebes, das eine Gradienten-Struktur aufweist, ist die Haut. Die Grundstruktur der Haut hat zwei verschiedene, aber gut integrierte Schichten, wobei die Dicke jeder Schicht an den verschiedenen Stellen des Körpers variiert. Die äußere Schicht oder Epidermis ist avaskular und besteht hauptsächlich aus Keratinocyten mit kleineren Zahlen von Immunzellen (Langerhans-Zellen) und pigmentierten Zellen (Melanocyten). Die Keratinocyten produzieren Keratin-Fasern und Corneozyten-Hüllen, welche der Epidermis ihre Beständigkeit und schützende Fähigkeiten verleihen. Die Entwicklung dieser Strukturen hängt vollständig von dem Differenzierungsstatus der Epidermis ab. Die Epidermis bildet ein geschichtetes Epithelium mit verschiedenen Protein-Expressions-Mustern sowie die Zellen sich weiter von der Basalmembran weg bewegen. Diese geschichtete Schicht aus un terschiedlich exprimierenden Zellen muß für die Aufrecherhaltung der Epidermis-Funktion gebildet werden. Unter der Epidermis befindet sich die Dermis, welche ein dichtes irreguläres verbindendes Gewebe ist, das hoch vaskular ist. Diese Schicht ist stark mit Collagenen und elastischen Fasern bevölkert, welche ihre außergewöhnliche Elastizität und Stärke verleihen. Fibroblasten sind die Hauptzell-Typen in dieser Schicht. Zwischen diesen beiden Schichten befindet sich die Basalmembran, welche als Stelle der Anknüpfung von epidermalen Zellen dient und auch zur Regulation von deren Funktion und Differenzierung dient. Die Schicht von Keratinocyten, welche direkt an die Basalmembran anhaften; sind von kubischer Form und stark ausgerichtet. Dieses Anhaften und die Architektur sind kritische Vorraussetzungen, die die letztliche Produktion der höheren schuppenartigen Strukturen in der Epidermis voran treiben. Die basale Schicht stellt eine Quelle für Vorläufer-Zellen zur Reparatur und zum Ersatz der Epidermis zur Verfügung. Die schuppenartigen Schichten stellen Stärke und Resistenz gegenüber Insult und Infektion zur Verfügung.
Jedes Material, das zur Erneuerung von Haut verwendet wird, muß in der Lage sein, die Einwanderung von Fibroblasten und anderen Zellen anzulocken, die zur Produktion der dermalen Komponenten des geheilten Gewebes notwendig sind. Zusätzlich darf das Material die Rate der Re-Epithelialisierung in einer solchen Weise nicht inhibieren und bevorzugterweise verstärken, so daß eine diskrete epidermale basale Schicht gebildet wird. Materialien, die die Invasion in das Gerüst von migrierenden Keratinocyten. erlauben, können teilweise differenzierte Zellen produzieren. Konsequenterweise kann die Kontrolle des Zutritts von bestimmten Zelltypen und eine poröse Ausgestaltung, die die Regeneration des natürlichen Gewebes fördert, funktionelle Vorteile haben. Jetzt wird sich auf die 9A, 9B und 9C bezogen, welche die Mikrostruktur dieses Schaumstoff-Gerüsts illustrieren. 10 (100-fache Vergrößerung) und 11 (40-fache Vergrößerung, Kompositen-Bild) stellen photomikrographischen Beweis für die Invasion von Fibroblasten, Marcrophagen, Macrophagen-Riesenzellen und Endothel-ähnlichen Zellen in einen 0,5 mm Schaumstoff zur Verfügung. Das Schaumstoff-Gewebe-Gerüst 101, das in beiden Abbildungen gezeigt ist, war ein 50:50-Mischung von ε-Caprolacton-co-Glycolid-Copolymer und ε-Caprolacton-co-Lactid-Copolymer (hergestellt wie in Beispiel 7 beschrieben). Die Bilder wurden 8 Tage nach der Implantation in ein 1,5 cm × 1,5 cm × 0,2 cm Entfernungs-Wundmodell in ein Yorkshire Schweinemodell aufgenommen. Eine vollständige Einfügung der Matrix in das Granulations-Gewebebett ist in beiden Bildern evident. Das dichte fibröse Gewebe oberhalb des Schaumstoff-Gewebe-Gerüsts scheint ein geeignetes Substrat für das Überwachsen der Epidermis zur Verfügung zu stellen. PDGF wurde in das Schaumstoff-Gewebe-Gerüst, das in 11 ge zeigt ist, eingefügt. In Vergleichs-Wundheilungs-Modellen kann die Addition eines Wachstumsfaktors, wie z.B. PDGF, tatsächlich notwendig sein.
In unseren anfänglichen Studien zeigt sich, daß es wünschenswert ist, ein Schaumstoff-Gewebe-Gerüst, das eine Dicke von 150 μm bis 3 mm aufweist; bevorzugt kann die Dicke des Schaumstoffs in dem Bereich von 300 μm bis 1500 μm und weiter bevorzugt 500 bis 1000 μm sein, als ein Haut-Gerüst zu verwenden. Offensichtlich werden verschiedene Haut-Verletzungen (d.h. diabetische Geschwüre, Venostase-Geschwüre, Dekubitis, Verbrennungen etc.) verschiedene Schaumstoff-Dicken benötigen. Zusätzlich kann der Zustand des Patienten das Einfügen von Wachstumsfaktoren, Antibiotika und anti-mykotischen Verbindungen erforderlich machen, um die Wundheilung zu fördern.
Vaskuläre Transplantate
Die Schaffung tubulärer Strukturen mit Gradienten kann ebenso von Interesse sein. Vaskuläre Transplantaten, die eine Röhre mit Poren im äußeren Durchmesser mit Übergängen zu kleineren Poren an der inneren Oberfläche oder umgekehrt aufweisen, können in der Kultivierung von endothelialen Zellen und Zellen der glatten Muskulatur für die Gewebekultivierung von Blutgefäßen nützlich sein.
Röhrenförmige Multi-Schicht-Strukturen erlauben die Regeneration von Gewebe, das die mechanischen und/oder biologischen Eigenschaften von Blutgefäßen nachahmt, werden Nützlichkeit als vaskuläre Transplantate aufweisen. Konzentrische Schichten, die aus verschiedenen Zusammensetzungen unter verschiedenen Verarbeitungsbedingungen hergestellt werden, könnten zugeschnittene mechanische Eigenschaften, Bioabsorptions-Eigenschaften und Gewebeeinwuchs-Raten haben. Die innerste oder luminale Schicht würde für Endothelialisierung durch Kontrolle der Porosität der Oberfläche und die mögliche Addition einer Oberflächenbehandlung optimiert werden. Die äußerste oder Adventitia-Schicht des vaskulären Transplantats würde zugeschnitten sein, um Gewebe-Einwachsen zu induzieren, wiederum durch Optimisieren der Porosität (% Porosität, Porengröße, Porenform und Porengrößen-Verteilung) und durch Einfügen bioaktiver Faktoren, pharmazeutischer Mittel oder Zellen. Zwischen diesen zwei porösen Schichten kann sich eine oder kann sich keine Barriereschicht mit geringer Porosität befinden, um die Stärke zu erhöhen und Auslaufen zu verringern.
Zusammensetzung der Schaumstoffe
Eine Vielfalt von absorbierbaren Polymeren kann verwendet werden, um Schaumstoffe herzustellen. Beispiele für geeignete biokompatible, bioabsorbierbare Polymere, die ver wendet werden könnten, schließen Polymere ein, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus: aliphatischen Polyestern, Poly(aminosäuren), Copoly(ether-estern), Polyalkylene Oxalaten, Polyamiden, Poly(iminocarbonaten), Polyorthoestern, Polyoxaestern, Polyamidoestern, Polyoxaestern, enthaltend Aminogruppen, Poly(anhydriden), Polyphosphazenen, Biomolekülen (d.h. Biopolymere, wie z.B. Collagen, Elastin, bioabsorbierbare Stärken, etc.) und Mischungen davon. Für den Zweck dieser Erfindung schließen aliphatische Polyester ein, sind aber nicht beschränkt auf, Homopolymere und Copolymere von Lactid (welches Milchsäure, D-, L- und meso-Lactid einschließt), Glycolid (einschließlich Glycolsäure), ε-Caprolacton, p-Dioxanon (1,4-Dioxan-2-on), Trimethylencarbonat (1,3-Dioxan-2-on), Alkylderivate von Trimethylencarbonat, δ-Valerolacton, β-Butyrolacton, γ-Butyrolacton, ε-Decalacton, Hydroxybutyrat (wiederholende Einheiten), Hydroxyvalerat (wiederholende Einheiten), 1,4-Dioxepan-2-on (einschließlich seines Dimers 1,5,8,12-Tetraoxacyclotetradecan-7,14-dion), 1,5-Dioxepan-2-on, 6,6-Dimethyl-1,4-doxan-2-on 2,5-Diketomorpholin, Pivalolacton, alpha, alpha-Diethylpropiolacton, Ethylencarbonat, Ethylenoxalat, 3-Methyl-1,4-Dioxan-2,5-dion, 3,3-Diethyl-1,4-dioxan-2,5-dion, 6,8-Dioxabicycloctan-7-on und Polymer-Mischungen davon. Poly(iminocarbonat) schließt für den Zweck dieser Erfindung ein, wie beschrieben von Kemnitzer und Kohn in „Handbook of Biodegradable Polymers", herausgegeben von Domb, Kost und Wisemen, Hardwood Academic Press, 1997, Seiten 251–272. Copoly(ether-ester) für den Zweck dieser Erfindung schließen diejenigen Copolyester-ether ein, die in „Journal of Biomaterials Research", Vol. 22, Seiten 993–1009, 1988 von Cohn und Younes und Cohn, Polymer Preprints (ACS Division of Polymer Chemistry) Vol. 30 (1), S. 498, 1989 (z.B. PEO/PLA) beschrieben werden. Polyalkylenoxalate schließen für den Zweck dieser Erfindung Patent Nrn. 4,208,511; 4,141,087; 4,130,639; 4,140,678; 4,105,034 und 4,205,399 ein. Polyphosphazene, co-, ter- und höhere Ordnung, gemischte Monomerbasierende Polymere, die aus L-Lactid, D,L-Lactid, Milchsäure, Glycolid, Glycolsäure, para-Dioxanon, Trimethylencarbonat und ε-Caprolacton hergestellt sind, sind z.B. diejenigen, die beschrieben werden von Allcock in „The Encyclopedia of Polymer Science", Vol. 13, S. 31–41, Wiley Intersciences, John Wiley & Sons, 1988 und von Vandorpe, Schacht, Dejardin und Lemmouchi in dem „Handbook of Biodegradable Polymers", herausgegeben von Domb, Kost und Wisemen, Hardwood Academic Press, 1997, S. 161–182. Polyanhydride von Disäuren der Form HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_m-O-C₆H₄-COOH, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis 8 ist, und Copolymere davon mit aliphatischen alpha-omega-Disäuren von bis zu 12 Kohlenstoffatomen.
Polyoxaester, Polyoxaamide und Polyoxaester, die Amine und/oder Amidogruppen enthalten, werden in einem oder mehreren der folgenden U.S. Patent Nrn. 5,464,929; 5,595,751; 5,597,579; 5,607,687; 5,618,552; 5,620,698; 5,645,850; 5,648,088; 5,698,213; 5,700,583 und 5,859,150 beschrieben. Polyorthoester, wie diejenigen, die von Heller im „Handbook of Biodegradable Polymers", herausgegeben von Domb, Kost und Wisemen, Hardwood Academic Press, 1997, S. 99–118, beschrieben werden.
Gegenwärtig sind aliphatische Polyester die absorbierbaren Polymere, die zur Herstellung von Gradienten-Schaumstoffen bevorzugt werden. Aliphatische Polyester können sein Homopolymere, Copolymere (Zufalls-, Block, segmentierte, kegelförmige Blöcke, Transplantat, Triblock, etc.), die eine lineare, verzweigte oder Stern-Struktur aufweisen. Bevorzugt werden lineare Copolymere. Geeignete Monomere zur Herstellung aliphatischer Homopolymere und Copolymere können ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus, sind aber nicht beschränkt auf, Milchsäure, Lactid (einschließlich L-, D-, meso- und D,L-Mischungen); Glycolsäure, Glycolid, ε-Caprolacton, p-Dioxanon (1,4-Dioxan-2-on), Trimethylencarbonat (1,3-Dioxan-2-on), delta-Valerolacton, beta-Butyrolacton, epsilon-Decalacton, 2,5-Diketomorpholin, Pivalolacton, alpha, alpha-Diethylpropiolacton, Ethylencarbonat, Ethylenoxalat, 3-Methyl-1,4-dioxan-2,5-dion, 3,3-Diethyl-1,4-dioxan-2,5-dion, gamma-Butyrolacton, 1,4-Dioxepan-2-on, 1,5-Dioxepan-2-on, 6,6-Dimethyl-dioxepan-2-on, 6,8-Dioxabicycloctan-7-on und Kombinationen davon.
Elastomere Copolymere sind auch insbesondere nützlich in der vorliegenden Erfindung. Geeignete bioabsorbierbare biokompatible Elastomere schließen ein, sind aber nicht limitiert auf diejenigen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus elastomeren Copolymeren von ε-Caprolacton und Glycolid (bevorzugterweise mit einem Mol-Verhältnis von ε-Caprolacton zu Glycolid von 35:65 bis 65:35, weiter bevorzugt von 45:55 bis 35:65), elastomeren Copolymeren von ε-Caprolacton und Lactid, einschließlich L-Lactid, D-Lactid, Mischungen davon oder Milchsäure-Copolymere (bevorzugt mit einem Mol-Verhältnis von ε-Caprolacton zu Lactid von 35:65 bis 65:35 und weiter bevorzugt von 45:55 bis 30:70 oder von 95:5 bis 85:15), elastomeren Copolymeren von p-Dioxanon (1,4-Dioxan-2-on) und Lactid, einschließlich L-Lactid, D-Lactid und Milchsäure (bevorzugt mit einem Mol-Verhältnis von p-Dioxanon zu Lactid von 40:60 bis 60:40), elastomeren Copolymeren von ε-Caprolacton und p-Dioxanon (bevorzugt mit einem Mol-Verhältnis von ε-Caprolacton zu p-Dioxanon von ungefähr 30:70 bis 70:30), elastomeren Copolymeren von p-Dioxanon und Trimethylencarbonat (bevorzugt mit einem Mol-Verhältnis von p-Dioxanon zu Trimethylencarbonat von 30:70 bis 70:30), elastomeren Copolymeren von Trimethylencarbonat und Glycolid (bevor zugt mit einem Mol-Verhältnis von Trimethylencarbonat zu Glycolid von 30:70 bis 70:30), elastomerem Copolymer von Trimethylencarbonat und Lactid, einschließlich L-Lactid, D-Lactid, Mischungen davon oder Milchsäure-Copolymere (bevorzugt mit einem Mol-Verhältnis von Trimethylencarbonat zu Lactid von 30:70 bis 70:30) und Mischungen davon. Beispiele für geeignete bioabsorbierbare Elastomere sind beschrieben in U.S. Patent Nrn. 4,045,418; 4,057,537 und 5,468,253. Diese elastomeren Polymere werden eine inherente Viskosität von 1,2 dl/g bis 4 dl/g, bevorzugt eine inherente Viskosität von 1,2 dl/g bis 2 dl/g und weiter bevorzugt eine inherente Viskosität von 1,4 dl/g bis 2 dl/g aufweisen, wie bei 25°C in einer 0,1 Gramm pro Deziliter (g/dl)-Lösung des Polymers in Hexafluoroisopropanol (HFIP) bestimmt.
Bevorzugterweise werden die Elastomere eine hohe Prozent Elongation und ein niedriges Modul zeigen, während sie gute Zerreißfestigkeit und gute Erholungs-(„recovery") Eigenschaften besitzen. In den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird das Elastomer, aus welchem die Schaumstoffe gebildet werden, eine prozentuale Elongation von größer als 200% und bevorzugt größer als 500% zeigen. Diese Eigenschaften, welche den Grad der Elastizität des bioabsorbierbaren Elastomers messen, werden erreicht, während eine Zugfestigkeit größer als 500 psi (3447 kPa), bevorzugt größer als 1000 psi (6894 kPa) und eine Reißfestigkeit von größer als 50 lbs/inch (892,9 kg/m), bevorzugt größer als 80 lbs/inch (1428,6 kg/m) aufrecht erhalten werden.
Der Polymer oder Copolymer, der zur Bildung eines Gradienten-Schaumstoffs für die Gewebe-Regeneration geeignet ist, hängt von verschiedenen Faktoren ab. Die chemische Zusammensetzung, die räumliche Verteilung der Bestandteile, das Molekulargewicht des Polymers und der Grad der Kristallinität diktieren alle in einem gewissen Ausmaß das in vitro und in vivo Verhalten des Polymers. Jedoch hängt die Auswahl des Polymers, um die Gradienten-Schaumstoffe zur Gewebe-Regeneration herzustellen, in großem Maße von (ist aber nicht limitiert auf) den folgenden Faktoren ab: (a) Bioabsorptions-(oder Bio-Degradations-) Kinetiken; (b) in vivo mechanische Leistung und (c) Zellantwort auf das Material in Bezug auf Zell-Anhaftung, Proliferation, Migration und Differenzierung und (d) Biokompatibilität.
Die Fähigkeit des Material-Substrates, auf eine zeitliche Weise in der Körper-Umgebung zu resorbieren, ist kritisch. Aber die Differenzen in der Absorbtionszeit unter in vivo Bedingungen kann auch die Basis für die Kombination von zwei verschiedenen Copolymeren sein. Zum Beispiel wird ein Copolymer von 35:65 ε-Caprolacton und Glycolid (ein relativ schnell absorbierender Polymer) mit 40:60 ε-Caprolacton und (L)-Lactid-Copolymer (einem relativ langsam absorbierenden Polymer) gemischt, um einen Schaumstoff zu bilden.
Solch ein Schaumstoff könnte mehrere verschiedene physikalische Strukturen in Abhängigkeit von der verwendeten Verarbeitungstechnik aufweisen. Die zwei Bestandteile können entweder zufällig untereinander verbundene bikontinuierliche Phasen sein oder die Bestandteile können einen Gradienten durch die Dicke aufweisen oder eine Laminat-Typ-Komposite mit einer gut integrierten Grenzfläche zwischen den zwei Bestandteil-Schichten sein. Die Mikrostruktur dieser Schaumstoffe kann optimiert werden, um die gewünschten anatomischen Merkmale des Gewebes, das konstruiert wird, zu regenerieren oder zu reparieren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es, Polymer-Mischungen zu verwenden, um Strukturen zu bilden, welche von einer Zusammensetzung in eine andere Zusammensetzung in einer Gradienten-ähnlichen Architektur übergehen. Schaumstoffe, die diese Gradienten-Architektur aufweisen, sind insbesondere vorteilhaft in Gewebe-Technik-Applikationen, um die Struktur von natürlich vorkommendem Gewebe, wie z.B. Knorpel (Gelenk-, Meniskus-, Septal-, Tracheal- etc.), Ösophagus, Haut, Knochen und vaskuläres Gewebe, zu reparieren oder zu regenerieren. Zum Beispiel kann durch Mischen eines Elastomers aus ε-Caprolacton-co-Glycolid mit ε-Caprolacton-co-Lactid (d.h. mit einem Mol-Verhältnis von 5:95) ein Schaumstoff gebildet werden, der von einem weicheren schwammartigen Schaumstoff in einen steiferen festeren Schaumstoff übergeht, ähnlich des Überganges von Knorpel zu Knochen. Selbstverständlich können andere Polymer-Mischungen für ähnliche Gradienten-Effekte verwendet werden oder um verschiedene Gradienten zur Verfügung zu stellen, wie z.B. verschiedene Absorptions-Profile, Streßantwort-Profile oder verschiedene Grade an Elastizität. Zusätzlich können diese Schaumstoffe verwendet werden für Organreparatur-Ersatz oder Regenerations-Strategien, die von diesen einzigartigen Gerüsten profitieren können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Bandscheibe, Dura, Nervengewebe, Leber, Pankreas, Niere, Blase, Sehnen, Bänder und Brustgewebe.
Diese elastomeren Polymere können durch Lyophilisation, superkritisches Lösungsmittel-Schäumen (d.h. wie beschrieben in EP 464 163 B1 ), Gasinjektions-Extrusion, Gasinjektions-Formen oder Gießen mit einem ausziehbaren Material (d.h. Salze, Zucker oder irgendein anderes Mittel, das dem Fachmann bekannt ist) geschäumt werden. Derzeit wird bevorzugt, bioabsorbierbare, biokompatible elastomere Schaumstoffe durch Lyophilisation herzustellen. Geeignete Verfahren zur Lyophilisierung von elastomeren Polymeren, um Schaumstoffe zu bilden, sind in den Beispielen und der korrespondierenden Patentanmeldung, mit dem Namen „Process for Manufacturing Biomedical Foams", zugeordnet zu Ethicon, Inc., Aktenzeichen ETH-1352, angemeldet am 39. Juni 1999, beschrieben.
Die Schaumstoffe, die in dieser Erfindung hergestellt werden, werden mittels einer Polymer-Lösungsmittel-Phasenseparations-Technik mit Modifikationen zum Stand der Technik, die unerwartet Gradienten in der Schaumstoff-Struktur schaffen, hergestellt. Im allgemeinen kann eine Polymer-Lösung in zwei Phasen durch irgendeine der vier Techniken separiert werden: (a) thermisch induzierte Gelierung/Kristallisation; (b) nicht-Lösungsmittel-induzierte Separation von Lösungsmittel und Polymer-Phasen; (c) chemisch induzierte Phasenseparation und (d) thermisch induzierte spinodale Entmischung. Die Polymerlösung wird auf eine kontrollierte Weise in entweder zwei verschiedene Phasen oder zwei bikontinuierliche Phasen separiert. Die nachfolgende Entfernung der Lösungsmittelphase hinterläßt normalerweise eine poröse Struktur mit einer Dichte, die geringer ist als die des Massen-Polymers („bulk polymer"), und Poren im Mikrometer-Bereich (Referenz „Microcellular foams via phase separation" von A. T. Young, J. Vac. Sci. Technolol. A 4 (3), Mai/Juni 1986). Die Schritte, die in die Herstellung dieser Schaumstoffe involviert sind, bestehen aus der Auswahl der richtigen Lösungsmittel für die Polymere, die lyophilisiert werden müssen, und dem Herstellen einer homogenen Lösung. Als nächstes wird die Polymerlösung einem Zyklus aus Einfrieren und Vakuum-Trocknen ausgesetzt. Der Einfrierungs-Schritt separiert die Phasen der Polymerlösung und der Vakuum-Trocknungs-Schritt entfernt das Lösungsmittel durch Sublimation und/oder Trocknen und hinterläßt eine poröse Polymer-Struktur oder einen untereinander verbundenen offenen Zell-, porösen Schaumstoff.
Geeignete Lösungsmittel, die im allgemeinen geeignet sein sollten als ein Ausgangspunkt für die Auswahl eines Lösungsmittels für die bevorzugten absorbierbaren aliphatischen Polyester, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, die Lösungsmittel, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Ameisensäure, Ethylformat, Essigsäure, Hexafluoroisopropanol (HFIP), zyklische Ether (d.h. THF, DMF und PDO), Aceton, Acetate von C2- bis C5-Alkohol (wie z.B. Ethylacetat und t-Butylacetat), Glyme (d.h. Monoglyme, Ethylglyme, Diglyme, Ethyldiglyme, Triglyme, Butyldiglyme und Tetraglyme), Methylethylketone, Dipropylenglycolmethylether, Lactone (z.B. γ-Valerolacton, δ-Valerolacton, β-Butyrolacton, γ-Butyrolacton), 1,4-Dioxan, 1,3-Dioxolan, 1,3-Dioxolan-2-on (Ethylencarbonat), Dimethylcarbonat, Benzol, Toluol, Benzylalkohol, p-Xylol, Naphthalen, Tetrahydrofuran, N-Methylpyrrolidon, Dimethylformamid, Chloroform, 1,2-Dichlormethan, Morpholin, Dimethylsulfoxid, Hexafluoracetonsesquihydrat (HFAS), Anisol und Mischungen davon. Unter diesen Lösungsmitteln ist das bevorzugte Lösungsmittel 1,4-Dioxan. Eine homogene Lösung des Polymers in dem Lösungsmittel wird unter der Verwendung von Standard-Techniken hergestellt.
Demgemäß wird, wie es auch anerkannt ist, die geeignete Polymer-Konzentration oder die Menge des Lösungsmittels, welches verwendet werden kann, mit jedem System variieren. Geeignete Phasen-Diagramm-Kurven für verschiedene Systeme wurden bereits entwickelt. Wenn jedoch eine geeignete Kurve nicht erhältlich ist, kann diese leicht durch bekannte Techniken entwickelt werden. Zum Beispiel wird eine geeignete Technik in Smolders, van Aartsen und Steenbergen, Kolloid-Z. u. Z. Polymere, 243, 14 (1971) ausgeführt. Als ein allgemeiner Leitsatz kann die Menge des Polymers in der Lösung von 0,5 Gew.-% bis 90 Gew.-% und bevorzugt von 0,5 Gew.-% bis 30 Gew.-% variieren, was in starkem Ausmaß von der Solubilität des Polymers in einem gegebenen Lösungsmittel und den Endeigenschaften des erwünschten Schaumstoffes abhängt.
Zusätzlich können Feststoffe zu dem Polymer-Lösungsmittel-System addiert werden. Die Feststoffe, die zu dem Polymer-Lösungsmittel-System addiert werden, reagieren bevorzugterweise nicht mit dem Polymer oder dem Lösungsmittel. Geeignete Feststoffe schließen Materialien ein, die Gewebe-Regeneration oder -Wiederwachsen befördern, Puffer, verstärkende Materialien oder Porositäts-Modifikatoren. Geeignete Feststoffe schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Partikel von demineralisiertem Knochen, Kalziumphosphat-Partikel oder Kalziumcarbonat-Partikel für Knochenreparatur, Laugmittel-(„leachable") Feststoffe zur Porenschaffung und Partikel bioabsorbierbarer Polymere, die nicht in dem Lösungsmittel-System löslich sind, um zu verstärken oder um Poren zu schaffen, wenn sie absorbiert werden. Geeignete Laugmittel-Feststoffe schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, nichttoxische Laugmittel-Materialien, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Salzen (d.h. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Natriumtartrat, Natriumcitrat und ähnliches), biokompatiblen Mono- und Disacchariden (d.h. Glucose, Fructose, Dextrose, Maltose, Lactose und Sucrose), Polysaccariden (d.h. Stärke, Alginat), wasserlöslichen Proteinen (d.h. Gelatine und Agarose). Im allgemeinen werden alle diese Materialien einen durchschnittlichen Durchmesser von geringer als ungefähr 1 mm und bevorzugt einen durchschnittlichen Durchmesser von 50 bis 500 μm aufweisen. Die Partikel werden im allgemeinen aus 1 bis 50 Volumenprozent des Gesamtvolumens des Partikels und der Polymer-Lösungsmittel-Mischung bestehen (wobei Gesamtvolumenprozent ist gleich 100 Volumenprozent). Die Laugmittel-Materialien können durch Eintauchen des Schaumstoffs mit dem Laugmittel-Material in ein Lösungsmittel entfernt werden, in welchem der Partikel löslich ist, und zwar für eine Zeit, die ausreicht, um Auslaugen („leaching") von im wesentlichen allen Partikeln zu erlauben, die aber nicht den Schaumstoff auflöst oder nachteilig verändert. Das bevorzugte Extraktions-Lösungsmittel ist Wasser, am meisten bevorzugt destilliertes deionisiertes Was ser. Dieser Prozeß wird in U.S. Patent Nr. 5,514,378 (siehe Säule 6) beschrieben. Bevorzugterweise wird der Schaumstoff getrocknet nachdem der Auslaug-Prozeß beendet ist, und zwar bei niedriger Temperatur und/oder Vakuum, um Hydrolyse des Schaumstoffes zu minimieren, wenn nicht beschleunigte Absorption des Schaumstoffs gewünscht wird.
Nachdem die Polymer-Lösungsmittel-Mischung gebildet ist, wird die Mischung dann erstarrt. Für ein spezifisches Polymer-Lösungsmittel-System können der Erstarrungspunkt, die Schmelztemperatur und der apparente Glasübergang des Polymer-Lösungsmittel-Systems unter der Verwendung von Standard-Differential-Scanning-kalorimetrischen (DSC) Techniken bestimmt werden. Theoretisch nimmt man an, was aber in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken soll, daß, wenn ein Polymer-Lösungsmittel-System abgekühlt wird, eine anfängliche Erstarrung ungefähr bei oder unter dem Gefrierpunkt des Lösungsmittels erfolgt. Dies korrespondiert mit dem Gefrieren einer wesentlichen Menge des Lösungsmittels in dem System. Das anfängliche Einfrieren erscheint als ein erster exothermer Peak. Ein zweiter Einfrierpunkt passiert, wenn das verbleibende Lösungsmittel, das mit dem Polymer assoziiert ist, erstarrt. Der zweite Gefrierpunkt wird durch einen zweiten exothermen Peak markiert. Die apparente Tg ist die Temperatur, bei der das vollständig gefrorene System die erste endotherme Verschiebung beim Rückerhitzen zeigt.
Ein wichtiger zu kontrollierender Parameter ist die Rate des Einfrierens des Polymer-Lösungsmittel-Systems. Der Typ der Poren-Morphologie, der während des Einfrier-Schrittes eingeschlossen wird, ist eine Funktion der Lösungsmittel-Thermodynamik, Einfrierungsrate, Temperatur, auf welche es gekühlt wird, Konzentration der Lösung, homogene oder heterogene Keimbildung etc. Eine detaillierte Beschreibung dieser Phasen-Separations-Phänomene kann in den hierin zur Verfügung gestellten Referenzen gefunden werden („Microcellular foams via phase separation" von A. T. Young, J. Vac. Sci. Technol. A 4 (3), Mai/Juni 1986; und „Thermodynamics of Formation of Porous Poymeric Membrane from Solutions" von S. Matsuda, Polymer J. Vol. 23, Nr. 5, S. 435–444, 1991).
Die zuvor beschriebene Polymer-Lösung kann auf eine Vielfalt von Weisen erstarrt werden, wie z.B. Plazieren oder Injizieren der Lösung in eine Form und Kühlen der Form in einem geeigneten Bad oder auf einem gekühlten Gestell. Alternativ dazu kann die Polymer-Lösung durch einen Zerstäuber atomisiert werden und auf eine kalte Oberfläche gesprüht werden, was die Erstarrung des Sprays Schicht für Schicht verursacht. Die kalte Oberfläche kann eine medizinische Vorrichtung oder ein Teil davon oder ein Film sein. Die Form des erstarrten Sprays wird der Form der Oberfläche, auf die es gesprüht wird, ähnlich sein. Alternativ dazu kann die Mischung nach der Erstarrung geschnitten oder in Form gebracht werden, während sie gefroren ist. Unter der Verwendung dieser und anderer Prozesse können die Schaumstoffe in einer Vielfalt von Formen und Größen hergestellt oder geformt werden (z.B. röhrenförmige Formen, verzweigte röhrenförmige Formen, sphärische Formen, hemisphärische Formen, dreidimensionale polygonale Formen, ellipsoide Formen (d.h. nieren-förmig), toroidische Formen, konische Formen, abgestumpft konische Formen, pyramidale Formen, jeweils als feste und hohle Konstrukte und Kombinationen davon).
Alternativ dazu ist eine andere Methode, um geformte geschäumte Teile herzustellen, die Verwendung eines kalten Fingers (eines Metallteils, dessen Oberfläche das Innere des Teiles darstellt, das wir herstellen wollen). Der kalte Finger wird in eine Mischung des Polymers in einem geeigneten Lösungsmittel eingetaucht und entfernt. Das ist so etwas wie das Eintauchen eines Eis am Stiel in warme Schokolade, die zu einer harten kalten Haut gefriert, oder das Eintauchen einer Form in ein Latex aus Gummi, um Handschuhe oder Kondome zu bilden. Die Dicke und Morphologie des hergestellten Schaumstoffs sind eine Funktion der Temperatur, der Verweilzeit und der Entnahmerate des kalten Fingers in bzw. aus der Mischung. Ein längeres Verweilen, ein kälterer Finger und eine langsamere Entnahme werden eine dickere Beschichtung produzieren. Nach der Entnahme wird der kalte Finger auf eine Spannvorrichtung einer großen thermischen Masse gegeben, die in Kontakt mit der gekühlten Ablage des Lyophilisators ist. Ab diesem Punkt erfolgen die primären und sekundären Trocknungsprozesse so, wie oben beschrieben. Dieses Verfahren ist insbesondere gut geeignet zur Herstellung von Röhren, verzweigten röhrenförmigen Strukturen oder Hülsen, die so geformt werden, daß sie an Vorrichtungen oder Teile einer Tier-Anatomie passen (zur Reparatur, Regeneration oder Vermehrung des Gewebes).
Zusätzlich kann die Polymer-Lösung mit verschiedenen Einsätzen erstarrt werden, die in der Lösung enthalten sind, wie z.B. Filme, Baumwollstoffe, gewebte, nicht-gewebte, gestrickte oder umsponnene textile Strukturen. Zusätzlich kann die Lösung in Assoziation mit einer anderen Struktur präpariert werden, wie z.B. einem orthopädischen Implantat (z.B. Schrauben, Nägel, Stifte und Platten) oder vaskulären oder verzweigten röhrenförmigen Konstrukten (wie z.B. ein Gerüst für ein vaskularisiertes oder Gänge-enthaltendes („ducted") Organ). Diese Einsätze werden aus mindestens einem biokompatiblem Material hergestellt werden und können nicht-absorbierbar, absorbierbar oder eine Kombination davon sein.
Die Polymer-Lösung in einer Form durchläuft direktionales Abkühlen durch die Wand der Form, die in Kontakt mit dem Gefriertrockner-Gestell steht, welches einem thermalen Zyklus ausgesetzt wird. Die Form und ihre Oberfläche können aus eigentlich jedem Material hergestellt sein, das nicht mit dem Polymer-Lösungsmittel-System interferiert, obwohl es be vorzugt ist, daß es ein sehr leitfähiges Material ist. Die Hitze-Transfer-Front bewegt sich aufwärts von dem Lyophilisator-Gestell durch die Wand der Form in die Polymer-Lösung. In dem Moment, in dem die Temperatur der Mischung unter den Gelierungs- und/oder Gefrierpunkt der Mischung fällt, werden die Phasen der Mischung auch separiert.
Die Morphologie dieses Phasen-separierten Systems wird während des Gefrierungs-Schrittes in dem Lyophilisierungsprozeß eingerastet und die Schaffung der offenen Poren wird durch den Beginn des Vakuum-Trocknens, das zur Sublimation des Lösungsmittels führt, initiiert. Jedoch wird die Mischung in einem Behälter oder einer Form, welche von einer Wärmesenke gekühlt wird, vor dem vollständigen Gefrieren erstarren. Auch wenn die Mischung fest erscheint, tritt anfänglich einiges verbleibendes Lösungsmittel, das mit dem Polymer, der nicht kristallisiert hat, assoziiert ist, auf. Es wird theoretisch angenommen, was in keiner Weise die vorliegende Erfindung limitieren soll, daß sich eine Gefrier-Front durch die Mischung von der Wärmesenke aus bewegt, um die Erstarrung zu vervollständigen, nachdem die Mischung augenscheinlich erstarrt ist. Das Material vor der Gefrier-Front zu einer bestimmten Zeit wird nicht so kalt sein wie das Material hinter der Front und wird nicht in einem vollständig gefrorenem Zustand sein.
Wir haben herausgefunden, daß, wenn ein Vakuum zu der augenscheinlich festen Polymer-Lösungsmittel-Mischung unmittelbar nach dem sie zu erstarren erscheint, angewendet wird, ein Schaumstoff mit einer Gradienten-Struktur geschaffen werden kann, der eine variable Porengröße und -struktur sowie Kanäle aufweist. Daher ist die Zeitsteuerung des Beginns des Sublimationsprozesses (durch Druck-Reduktion, d.h. Vakuum-Trocknen) ein kritischer Schritt in dem Prozeß, um Übergänge in der Struktur zu schaffen. Die Zeitsteuerung des Beginns der Sublimation wird durch die Dicke des herzustellenden Schaumstoffs, die Konzentration der Lösung, die Rate der Hitzeübertragung und die Bündelungen des Hitzetransfers beeinflußt. Die Fachleute werden abschätzen, daß dieser Prozeß für spezifische Polymer-Lösungsmittel-Systeme unter der Verwendung von Thermoelementen und Überwachen der Hitzeübertragungs-Raten des Schaumstoffs bei verschiedenen Tiefen und Stellen in der Vorrichtung, die geschäumt wird, überwacht und charakterisiert werden kann. Durch Kontrolle des Sublimations-Prozesses, werden Strukturen mit einem Gradienten in der Porenmorphologie und Anisotropie geschaffen. Dieser Prozeß kann zur Schaffung von Mikrostrukturen führen, die Gewebe nachahmen, wie z.B. Knorpel, Knochen und Haut. Zum Beispiel werden im allgemeinen Kanäle geformt, wenn ein Vakuum unmittelbar nachdem die Lösung augenscheinlich erstarrt angelegt wird („vacuum is pulled"). Wenn jedoch der selben Lösung erlaubt wird, weiter zu erstarren, wird der Schaumstoff größere Poren näher an der Oberfläche haben, wo das Vakuum gesaugt wird (gegenüber der Wärmesenke) und näher an der Wärmesenke kleinere Poren aufweisen.
Dieser Prozeß ist die Antithese zu dem Verfahren aus dem Stand der Technik, welches sich auf die Schaffung von Schaumstoffen mit einer einheitlichen Mikrostruktur (zufällig untereinander verbundene Poren) richtete, wobei die gesamte Lösung vollständig gefroren wird. Eine Vakuum-Trocknung wird nur angewendet, nachdem der Beendigung einer gewünschten Phasen-Separation eine erhebliche Menge an Zeit gegeben wird (U.S. Patente 5,755,792 (Brekke); 5,133,755 (Brekke); 5,716,413 (Walter et al.); 5,607,474 (Athanasiou, et al.); 5,686,091 (Leong, et al.); 5,677,355 (Shalaby, et al.) und europäische Offenbarungen E 0 274 898 (Hinsch) und EP A 594 148 (Totakura)).
Schaumstoffe mit verschiedenen Strukturen werden in den 2, 3 und 4 gezeigt. Wie z.B. in 3 gezeigt wird, kann die Orientierung der Hauptachse der Poren verändert werden, und zwar von einer Orientierung in der selben Ebene wie der Schaumstoff zu einer Orientierung, die senkrecht zu der Ebene des Schaumstoffs verläuft. Theoretisch wird angenommen, was aber in keiner Weise den Umfang dieser Umfang beschränken soll, daß, wenn in einer konventiellen Schaumstoff-Bearbeitung das Lösungsmittel kristallisiert, sich eine Gefrier-Front durch die Lösung bewegt und die Lösung in kristallinen Schichten parallel zu der Gefrier-Front erstarrt. Wenn jedoch ein Vakuum angelegt wird, ehe die Lösung vollständig gefriert, resultiert die Morphologie des Schaumstoffes in Poren, die im allgemeinen parallel zu der Vakuumquelle ausgerichtet sind, wie in 3 illustriert.
Wie aus 3 gesehen werden kann, kann die Porengröße von einer kleinen Porengröße, im allgemeinen zwischen 10 μm und 60 μm, zu einer größeren Größe von 60 μm bis 200 μm in einem porösen Gradienten-Schaumstoff variiert werden. Um es noch einmal zu sagen, dies resultiert von dem Anlegen eines Vakuums an der augenscheinlich erstarrten Lösung, ehe diese vollständig erstarrt. Die Polymer-Konzentration in der Lösung und die Abkühlungsraten sind ebenso bedeutsame Parameter in der Kontrolle der Zellengröße. Idealerweise könnte die Schaumstoff-Struktur geschaffen werden, um als eine Matrize zu dienen, um humane Gewebe-Grenzzonen, wie die Grenzzone von Knorpel zu Knochen, die in Gelenken vorhanden ist, wieder herzustellen. Dieser Schaumstoff würde von kleineren runden Poren zu größeren säulenartigen (d.h. mit einem Verhältnis von Durchmesser zu Länge von mindestens 2 bis 1) Poren fortschreiten. Zusätzlich kann die Steifheit des Schaumstoffs durch die Struktur des Schaumstoffs oder das Mischen von zwei verschiedenen Polymeren mit verschiedenen Young's Moduli kontrolliert werden.
Schaumstoffe können auch Kanäle aufweisen, wie es in 2 illustriert wird. Die Kanäle, die durch diesen Prozeß gebildet werden, können die Dicke des Schaumstoffs durchlaufen und haben im allgemeinen einen Durchmesser im Bereich von 30 bis 200 μm. Die Kanäle haben im allgemeinen mindestens zweimal des Kanals durchschnittlichen Durchmesser und bevorzugt mindestens viermal des Kanals durchschnittlichen Durchmesser und am meisten bevorzugt mindestens achtmal des Kanals durchschnittlichen Durchmesser. Die Kanalgröße und der Durchmesser werden natürlich auf der Basis der gewünschten Funktionalität des Kanals ausgewählt, wie z.B. Zellinvasion, Nährstoff-Diffusion oder als ein Zugang für die Vaskularisation.
Der Fachmann kann sich leicht vorstellen, daß solch eine Direktionalität in jede der drei Dimensionen durch Ausgestaltung einer geeigneten Form und Aussetzen der Wände einer solchen Form gegenüber verschiedenen Temperaturen, wenn benötigt, geschaffen werden kann. Die folgenden Typen von Gradienten-Strukturen können durch die Variation in der Porengröße und/oder -form durch die Dicke aus einer einheitlichen Zusammensetzung hergestellt werden: Poren eines Typs und einer Größe für eine bestimmte Dicke gefolgt durch einen anderen Typ und eine andere Größe von Poren, etc.; Zusammensetzungs-Gradient mit vorwiegend einer Zusammensetzung auf einer Seite und einer anderen auf einer anderen Seite mit einem Übergang von einer Einheit zu einer anderen; eine dicke Haut, umfassend niedrige Porosität einer Schicht mit geringer Porengröße gefolgt von einer Region mit großer Porengröße; Schaumstoffe mit vertikalen Poren mit einer räumlichen Organisation, wobei diese vertikalen Poren als Kanäle für Nährstoff-Diffusion fungieren können, die Herstellung dieser 3D-Formen, um 3D-Schaumstoffe mit den gewünschten Mikrostruktur-Kombinationen von Zusammensetzungs- und architektonischem Gradienten zu schaffen. Im allgemeinen werden die Schaumstoffe, die in Behältnissen oder Formen gebildet werden, eine Dicke im Bereich von 0,25 mm bis 100 mm aufweisen und werden bevorzugt eine Dicke von 0,5 mm bis 50 mm aufweisen. Dickere Schaumstoffe können hergestellt werden, aber die Lyophilisierungs-Zyklus-Zeiten können sehr lang sein, die endgültigen Schaumstoff-Strukturen können schwieriger zu kontrollieren sein und der restliche Lösungsmittel-Gehalt kann größer sein.
Wie zuvor beschrieben, wird der erfinderische Prozeßzyklus zur Herstellung von biokompatiblem Schaumstoff signifikant reduziert durch die Durchführung des Sublimations-Schrittes oberhalb der apparenten Glasübergangs-Temperatur und unterhalb der Erstarrungstemperatur der Mischung (bevorzugt gerade unterhalb der Erstarrungstemperatur). Der kombinierte Zyklus aus (Einfrieren + primärem Trocknen + sekundärem Trocknen) ist wesentlich schneller im Vergleich zu der im Stand der Technik beschriebenen Zeit. Zum Beispiel dauert der kombinierte Zyklus für aliphatische Polyester unter der Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln im allgemeinen weniger als 72 Stunden, bevorzugt weniger als 48 Stunden, weiter bevorzugt weniger als 24 Stunden und am meisten weniger als 10 Stunden. Tatsächlich kann der kombinierte Zyklus mit einigen aliphatischen Polyestern in weniger als 3 Stunden für Schaumstoffe mit einer Dicke von 1 mm oder weniger; in weniger als 6 Stunden für Schaumstoffe mit einer Dicke von ungefähr 2 mm, und in weniger als 9 Stunden für Schaumstoffe mit einer Dicke von ungefähr 3 mm durchgeführt werden. Im Vergleich dazu beträgt die Zeit im Stand der Technik typischerweise 72 Stunden oder mehr. Die restlichen Lösungsmittel-Konzentrationen in diesen Schaumstoffen, die durch diesen Prozeß hergestellt werden, werden sehr gering sein. Wie es für aliphatische Polyester-Schaumstoffe beschrieben wurde, die unter der Verwendung von 1,4-Dioxan als ein Lösungsmittel hergestellt wurden, beträgt die restliche Konzentration von 1,4-Dioxan weniger als 10 ppm (Teile pro Million), weiter bevorzugt weniger als 1 ppm und am meisten bevorzugt weniger als 100 ppb (Teile pro Milliarde).
Der Fachmann kann sich leicht vorstellen, daß solche eine Direktionalität in allen drei Dimensionen durch die Ausgestaltung einer geeigneten Form und dem Aussetzen der Wände einer solchen Form gegenüber verschiedenen Temperaturen, wenn benötigt, geschaffen werden kann. Die folgenden Typen von Gradienten-Strukturen können mittels dieser Erfindung hergestellt werden:

1. Variation in der Porengröße und/oder -form durch die Dicke mit einer einheitlichen Zusammensetzung,
2. Poren eines Typs und einer Größe für eine bestimmte Dicke, gefolgt durch einen anderen Typ und eine andere Größe an Poren, etc.
3. Zusammensetzungs-Gradient mit vorwiegend einer Zusammensetzung auf einer Seite und einer anderen Zusammensetzung auf der anderen Seite mit einem Übergang von einer Einheit zu der anderen,
4. eine dicke Haut, umfassend geringe Porosität einer Schicht mit geringer Porengröße, gefolgt von einer Region mit großer Porengröße,
5. Schaumstoffe mit vertikalen Poren mit einer räumlichen Organisation, diese vertikalen Poren können als Kanäle für Nährstoff-Diffusion fungieren,
6. das Herstellen dieser in dreidimensionalen Formen, um dreidimensionale Schaumstoffe mit der gewünschten Mikrostruktur zu schaffen,
7. Kombinationen von Zusammensetzungs- und architektonischem Gradienten.

Zusätzlich können verschiedene Proteine (einschließlich kurzkettige Peptide), Wachstumsmittel, chemotaktische und therapeutische Mittel (Antibiotika, Analgetika, antiinflammatorische Mittel, Anti-Abstoßungs- (z.B. Immunosuppressiva) und Antikrebs-Wirkstoffe) oder keramische Partikel zu den Schaumstoffen während der Bearbeitung addiert werden, und zwar adsorbiert an die Oberfläche oder verfüllt in die Schaumstoffe, nachdem die Schaumstoffe hergestellt sind. Zum Beispiel können die Poren des Schaumstoffs teilweise oder vollständig mit biokompatiblen resorbierbaren synthetischen Polymeren oder Biopolymeren (wie z.B. Collagen oder Elastin) oder biokompatiblen keramischen Materialien (wie z.B. Hydroxyapatit) und Kombinationen davon (welche Materialien enthalten oder nicht enthalten können, die Gewebewachstum durch die Vorrichtung fördern) gefüllt sein. Geeignete Materialien schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Autoplastik, Allotransplantat oder Xenotransplantat-Knochen, Knochenmark, morphogene Proteine (BMPs), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FgF), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Insulin-abgeleiteter Wachstumsfaktor (IGF-I und IGF-II), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-β) oder andere osteoinduktive oder osteokonduktive Materialien, die im Stand der Technik bekannt sind. Biopolymere könnten auch als konduktive oder chemotaktische Materialien oder als Zuführungs-Vehikel für Wachstumsfaktoren verwendet werden. Beispiele könnten rekombinantes oder Tier-abgeleitetes Collagen oder Elastin oder Hyaluronsäure sein. Bioaktive Beschichtungen oder Oberflächenbehandlungen könnten auch an die Oberfläche der Materialien angehaftet sein. Zum Beispiel könnten bioaktive Peptidsequenzen (RGDs) angehaftet sein, um Proteinabsorption und nachfolgend Zellgewebe-Anhaftung zu fördern. Therapeutische Mittel könnten auch mittels dieser Schaumstoffe zugeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Polymere und Mischungen, die zur Bildung des Schaumstoffs verwendet werden, therapeutische Mittel enthalten. Um diese Schaumstoffe zu bilden, würde der zuvor beschriebene Polymer mit einem therapeutischen Mittel vor der Bildung des Schaumstoffs gemischt werden oder das therapeutische Mittel würde in den Schaumstoff geladen werden, nachdem dieser gebildet ist. Die Vielfalt der verschiedenen therapeutischen Mitteln, die in Zusammenhang mit den Schaumstoffen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ist enorm. Im allgemeinen schließen therapeutische Mittel, welche über die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung verabreicht werden können, ohne Limitation ein: Antiinfektiva, wie z.B. Antibiotika und antivirale Mittel; chemotherapeutische Mittel (z.B. Antikrebs-Mittel); Anti-Abstoßungs-Mittel; Analgetika und analgetische Kombinationen; anti-inflammatorische Mit tel; Hormone, wie z.B. Steroide; Wachstumsfaktoren (Knochen-morphogenetische Proteine (d.h. BMPs 1–7), Knochen-morphogenetische-ähnliche Proteine (d.h. GFD-5, GFD-7 und GFD-8), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (d.h. FGF 1–9), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF-I und IGF-II), transformierende Wachstumfaktoren (d.h. TGF-β I–III), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF)) und andere natürlich abgeleitete oder genetisch manipulierte Proteine, Polysaccaride, Glycoproteine oder Lipoproteine. Diese Wachstumsfaktoren werden in „The Cellular and Molecular Basis of Bone Formation and Repair" von Vicki Rosen und R. Scott Thies, veröffentlicht von R. G. Landes Company, beschrieben.
Schaumstoffe, die bioaktive Materialien enthalten, können durch Mischen von einem oder mehreren therapeutischen Mitteln mit dem Polymer, das zur Herstellung des Schaumstoffs verwendet wird, oder mit dem Lösungsmittel oder mit der Polymer-Lösungsmittel-Mischung formuliert werden und geschäumt werden. Alternativ dazu könnte ein therapeutisches Mittel auf den Schaumstoff beschichtet werden, bevorzugt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Jeder pharmazeutische Träger kann verwendet werden, der den Schaumstoff nicht auflöst. Die therapeutischen Mittel können als eine Flüssigkeit, ein fein geteilter Feststoff oder als jede andere geeignete physikalische Form anwesend sein. Typischerweise, aber optional, wird die Matrix eine oder mehrere Additiva einschließen, wie z.B. Verdünnungsmittel, Träger, Hilfsstoffe, Stabilisatoren oder ähnliches.
Die Menge des therapeutischen Mittels wird von dem bestimmten verwendeten Wirkstoff und der medizinischen Bedingung, die behandelt wird, abhängen. Typischerweise stellt die Menge des Wirkstoffs 0,001 Gew.-% bis 70 Gew.-%, weiter typisch 0,001 Gew.-% bis 50 Gew.-%, am typischsten 0,001 Gew.-% bis 70% Gew.-% der Matrix dar. Die Quantität und der Typ des Polymers, der in die Wirkstoff-Zulieferungsmatrix eingeschlossen wird, wird in Abhängigkeit von dem gewünschten Freisetzungsprofil und der Menge des verwendeten Wirkstoffs variieren.
Nach Kontakt mit den Körperflüssigkeiten wird der Wirkstoff freigesetzt. Wenn der Wirkstoff in den Schaumstoff eingeschlossen ist, dann wird der Wirkstoff freigesetzt werden, wenn der Schaumstoff graduelle Degradation (hauptsächlich durch Hydrolyse) durchläuft. Dies kann zur verlängerten Freisetzung (über z.B. 1 bis 5000 Stunden, bevorzugt 2 bis 800 Stunden) der effektiven Mengen (z.B. 0,0001 mg/kg/Std. bis 10 mg/kg/Std.) des Wirkstoffs führen. Diese Dosierungsform kann verabreicht werden, so wie es notwendig ist in Abhängigkeit von dem Subjekt, das behandelt wird, der Schwere der Krankheit, der Beurteilung des verschreibenden Arztes und ähnlichem. Wenn der Fachmann diesen oder ähnlichen Prozeduren folgt, wird er in der Lage sein, eine Vielfalt von Formulierungen zu präparieren.
Der Schaumstoff kann auch als ein Gerüst für die Konstruktion von Gewebe dienen. Die poröse Gradienten-Struktur würde für das Wachstum von Zellen förderlich sein. Wie in vorhergehenden Patenten (Vacanti, US 5,770,417 ) ausgeführt ist, können Zellen von einem Patienten geerntet werden (vor oder während der Operation, um das Gewebe zu reparieren) und die Zellen können unter sterilen Bedingungen behandelt werden, um einen spezifischen Zelltyp (d.h. pluripotente Zellen, Stammzellen oder Vorläuferzellen, wie z.B. die Mesenchym-Stammzellen, beschrieben in Caplan, US 5,486,359 ) zur Verfügung zu stellen. Geeignete Zellen, die mit den Schaumstoff-Gerüsten in Kontakt gebracht werden oder in die Schaumstoff-Gerüste gesät werden, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Myocyten, Adipocyten, Fibromyoblasten, ectodermale Zellen, Muskelzellen, Osteoblasten (d.h. Knochenzellen), Chondrocyten (d.h. Knorpelzellen), endotheliale Zellen, Fibroblast, pankreatische Zellen, Hepatocyten, Gallengang-Zellen, Knochenmark-Zellen, neurale Zellen, Genitourinäre Zellen (einschließlich nephritische Zellen) und Kombinationen davon. Verschiedene zelluläre Strategien könnten mit diesen Gerüsten verwendet werden (d.h. autogene, allogene, xenogene Zellen etc.). Die Zellen könnten auch eingeführte Gene enthalten, die für ein Protein kodieren, das die Anhaftung, Proliferation oder Differentiation des Gewebes stimuliert. Der Schaumstoff würde in die Zellkultur gebracht werden und die Zellen würden auf oder in die Struktur gesät werden. Der Schaumstoff würde in einer sterilen Umgebung aufrecht erhalten werden und dann in den Donorpatienten implantiert werden, wenn die Zellen in die Mikrostruktur der Vorrichtung eingewandert sind. Das in vitro Säen von Zellen könnte eine schnellere Entwicklung und Differenzierungsprozeß für das Gewebe zur Verfügung stellen. Es ist klar, daß die zelluläre Differenzierung und die Schaffung von Gewebe-spezifischer extrazellulärer Matrix für die Gewebetechnik eines funktionsfähigen Implantats kritisch ist.
Die Möglichkeit, verschiedene Zelltypen in die verschiedenen Porenstrukturen säen zu können, würde für Forscher verfügbar sein. Schaufer et al. haben demonstriert, daß verschiedene Zelltypen (d.h. stromale Zellen und Chondrocyten) auf verschiedenen Strukturen kultiviert werden können. Die Strukturen können nach einer kurzen Zeitspanne kombiniert werden und die gesamte Struktur kann zurück in Zellkultur gegeben werden, so daß eine biphasische Gewebestruktur für die Implantation generiert werden kann. Eine Gradientenstruktur würde ebenso erlauben, co-kultivierte Gewebe-Gerüste zu generieren. (Schaefer, D. et al.). Zusätzlich können Röntgenstrahlen-undurchlässige Marker zu den Schaumstoffen addiert werden, um „Imaging" nach der Implantation zu erlauben. Nach einer definierten Zeitspanne der in vitro Entwicklung (z.B. 3 Wochen) würde das Gewebe-konstruierte Implantat geerntet werden und in den Patienten implantiert werden. Wenn eine azelluläre Strategie verfolgt wird, dann würden die sterilen azellulären Gerüste verwendet werden, um geschädigtes oder traumatisiertes Gewebe zu ersetzen.
Die Schaumstoff-Gerüste der vorliegenden Erfindung können unter der Verwendung eines konventiellen Sterilisations-Prozesses, wie z.B. Strahlungs-basierender Sterilisation (d.h. Gamma-Strahlen), chemisch-basierender Sterilisation (Ethylenoxid) oder anderen geeigneten Prozeduren sterilisiert werden. Bevorzugterweise wird der Sterilisations-Prozeß mit Ethylenoxid bei einer Temperatur zwischen 52 bis 55°C über eine Zeit von 8 Stunden oder weniger durchgeführt. Nach der Sterilisation können die Schaumstoff-Gerüste in eine geeignete sterilisierte Feuchtigkeits-resistente Verpackung zum Transport und zur Verwendung in Krankenhäusern und anderen Gesundheitseinrichtungen verpackt werden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Schaumstoff ein fibröses Gewebe aufweisen, das an die obere oder untere Oberfläche fusioniert ist. Auf diese Weise können die Oberflächeneigenschaften der Struktur kontrolliert werden, wie z.B. Porosität, Permeabilität, Degradationsrate und mechanische Eigenschaften. Das fibröse Gewebe kann über einen elektrostatischen Spinn-Prozeß hergestellt werden, in welchem eine fibröse Schicht auf einer lyophilisierten Schaumstoff-Oberfläche aufgebaut werden kann. Der elektrostatische Spinn-Prozeß ist ein Verfahren, das verwendet wurde, um Fasern herzustellen. Elektrostatisches Spinnen von vielen polymeren Materialien wurde in den folgenden Patenten und Artikeln beschrieben: U.S. Patent Nr. 4,522,709; U.S. Patent Nr. 5,024,789; U.S. Patent Nr. 5,311,884; U.S. Patent Nr. 5,522,879; „Nanometre diameter fibers of polymer, produced by electrospinning", Nanotechnology 1 (1996) 216–233; „Structure and morphology of small diameter electrospun aramid fibres", Polymer Inter., 36 (1995) 195–201, „Carbon nanofiber from polyacrylonitrile and mesophase pitch", Journal of Advanced Materials, Vol. 3, Nr. 1, (1999) 36–41. Dieses Verfahren kann auch mit den aliphatischen Polyestern, die zuvor in dieser Anmeldung beschrieben wurden, unter der Verwendung geeigneter Lösungsmittel angewendet werden. Die Lösungsmittel, die in dem Schäumungsprozeß verwendet werden, können auch für das elektrostatische Spinnen verwendet werden.
In diesem Prozeß wird eine elektrische Kraft auf die polymerische Lösung ausgeübt, was die Oberflächen-Spannung der Lösung überwindet, wobei ein geladener Strahl gebildet wird. Dieser Strahl der Lösung wird ausgestoßen, getrocknet und auf einem grundierten Substrat erstarrt. Durch Kontrolle der Spinn-Bedingungen können die resultierenden Fasern von 0,1 μm bis 20 μm und bevorzugt von 0,3 μm bis 5,0 μm reichen. Die Substrat-Oberfläche in diesem Fall würde ein lyophilisierter Schaumstoff sein. Zwei Beispiele für ein solches Konstrukt mit einer fibrösen Schicht auf einer Schaumstoff-Schicht sind in 12 und 13 gezeigt. Diese geschichteten Strukturen können aus mindestens einem biokompatiblen Material hergestellt sein und können nicht absorbierbar, absorbierbar oder eine Kombination davon sein.
Die Zusammensetzung, Dicke und Porosität der fibrösen Schicht kann kontrolliert werden, um die gewünschten mechanischen und biologischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel kann die Bioabsorptions-Rate der fibrösen Schicht ausgewählt werden, um ein längeres oder kürzeres Bioabsorptions-Profil im Vergleich zu der unterliegenden Schaumstoff-Schicht zur Verfügung zu stellen. Zusätzlich kann die fibröse Schicht der Komposite größere strukturelle Integrität zur Verfügung stellen, so daß mechanische Kraft auf die fibröse Seite der Struktur ausgeübt werden kann. Zum Beispiel könnte die fibröse Schicht die Verwendung von Wundnähten, Ösen oder verschiedenen Fixierungsvorrichtungen erlauben, um die Komposite an Ort und Stelle zu halten. Als eine allgemeine Richtschnur, was aber in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken soll, wird derzeit bevorzugt, daß die fibröse Schicht von 1 Mikron bis 1000 Mikron Dicke umfaßt.
Eine mögliche Anwendung einer Schaumstoff-Struktur mit einer fibrösen Oberflächen-Schicht ist ein vaskuläres Transplantat. Die Schichten in einer solchen Struktur würden konzentrische Zylinder bilden und die fibröse Schicht würde eine verringerte Permeabilität zur Verfügung stellen. Die lyophilisierte Schaumstoff-Struktur könnte für Zellinfiltration optimisiert werden, entweder auf der adventitiellen Oberfläche durch glatte Muskulaturzellen oder Fibroblasten oder auf der luminalen Oberfläche durch endotheliale Zellen. Die fibröse Gewebe-Schicht würde als eine Barriere gegenüber Blut-Auslaufen dienen und würde die mechanischen Eigenschaften der Struktur verstärken. Zusätzlich würde die fibröse Schicht als eine Barriere gegenüber vervielfältigenden platten Muskelzellen dienen und würde in der Verhinderung von intimaler Hyperplasie assistieren.
Eine andere mögliche Applikation einer solchen hybriden Schaumstoff/Gewebe-Struktur ist als ein Gerüst für die Brustregeneration. Die fibröse Schicht würde verstärkte mechanische Integrität zur Verfügung stellen und würde die originale Form des Gerüsts aufrecht erhalten. Wenn eine Biopsie entnommen wird oder wenn ein Tumor entfernt wird, könnte der Hohlraum mit solch einem fibrösen beschichteten Schaumstoff-Gerüst gefüllt werden, welches mit Zellen oder bioaktiven Mitteln injiziert sein kann oder nicht.
Eine andere mögliche Anwendung einer solchen Schaumstoff-Gewebe-Struktur ist ein Gerüst für Meniskus-Gewebetechnik. In diesem Fall könnte ein Keil-förmiges Implantat her gestellt werden, bestehend aus einer fibrösen Beschichtung, die ein lyophilisiertes Schaumstoff-Zentrum einkapselt. Die Zellen könnten in das Zentrum des Implantats durch die fibröse Schicht injiziert werden. Diese Gewebe-Oberflächen-Schicht würde die Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten erlauben, während die Migration der Zellen aus dem Gerüst limitiert würde.
Die folgenden Beispiele dienen zur Illustration der Prinzipien und des Gebrauchs dieser Erfindung.
Beispiele
In den folgenden Beispielen wurden die Polymere und Monomere charakterisiert hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung und Reinheit (NMR, FT-IR), thermischen Analyse (DSC), Molekulargewicht (inhärente Viskosität) und Grundlinien- und in vitro mechanischen Eigenschaften (Instron Streß/Belastung).
¹H NMR wurde an einem 300 MHz NMR unter der Verwendung von CDCl₃ oder HFAD (Hexafluoroaceton-sesquadeuteriumoxid) als ein Lösungsmittel durchgeführt. Thermische Analyse von segmentierten Polymeren und Monomeren wurde an einem Dupont 912 Differential-Scanning-Kalorimeter (DSC) durchgeführt. Inhärente Viskositäten (I. V., dl/g) der Polymere und Copolymere wurden unter der Verwendung eines 50 Bohrung („bore")-Cannon-Ubbelhode-Verdünnungs-Viskometers, das in ein thermostatisch kontrolliertes Wasserbad bei 25°C eingetaucht ist, unter der Verwendung von Chloroform oder Hexafluoroisopropanol (HFIP) als das Lösungsmittel bei einer Konzentration von 0,1 g/dl gemessen.
In diesen Beispielen werden bestimmte Abkürzungen verwendet, wie z.B. PCL, um polymerisiertes ε-Caprolacton anzuzeigen, PGA, um polymerisiertes Glycolid anzuzeigen, PLA, um polymerisiertes (L)-Lactid anzuzeigen. Zusätzlich zeigen die Prozente vor dem Copolymer die entsprechenden Mol-Prozente jedes Bestandteiles an.
Beispiel 1
Herstellung eines Schaumstoffes mit zufälliger Mikrostruktur (ohne bevorzugte Architektur)
Schritt A. Herstellung von 5% (wt/wt) homogener Lösung von 35/65 PCL/PGA in 1,4-Dioxan
Eine 5% (wt/wt) Polymer-Lösung wird hergestellt durch Lösen von einem Teil von 35/65 PCL/PGA mit 19 Teilen des Lösungsmittels 1,4-Dioxan. Der 35/65 PCL/PGA- Copolymer wurde im wesentlichen, wie in Beispiel 8 beschrieben, hergestellt. Die Lösung wird in einem Kolben mit einem Rührfisch hergestellt. Um den Copolymer vollständig zu lösen, wird empfohlen, daß die Mischung vorsichtig auf 65 ± 5°C erhitzt wird und für ein Minimum von 4 Stunden, aber nicht über 8 Stunden kontinuierlich gerührt wird. Eine klare homogene Lösung wird dann durch Filtrieren der Lösung durch einen besonders groben Porositäts-Filter (Extraktions-Kausche mit Fritten-Scheibe der Firma Pyrex) unter der Verwendung von trockenem Stickstoff, um bei der Filtration dieser viskosen Lösung zu helfen, erhalten.
Schritt B. Lyophilisation
Ein Lyophilisator im Labor-Maßstab, und zwar Freezemobile 6 von VIRTIS, wurde in diesem Experiment verwendet. Der Gefriertrockner wird eingeschaltet und die Gestellkammer wird bei 20°C unter trockenem Stickstoff für ungefähr 30 Minuten gehalten. Thermoelemente werden zur Überwachung angebracht, um die Gestelltemperatur zu überwachen. Vorsichtig wird die Polymer-Lösung, die in Schritt A. hergestellt wurde, in die Formen gerade vor dem tatsächlichen Beginn des Zyklus eingefüllt. Eine Glasform wurde in diesem Beispiel verwendet, aber eine Form, die aus irgendeinem Material hergestellt wird, das gegenüber 1,4-Dioxan inert ist, gute Hitze-Transfer-Eigenschaften aufweist und eine Oberfläche aufweist, die ein leichtes Entfernen des Schaumstoffs ermöglicht, kann verwendet werden. Die Glasform oder -gefäß, das in diesem Beispiel verwendet wurde, wog 620 g, war optisch gläsern 5,5 mm dick und zylindrisch mit einem äußeren Durchmesser von 21 cm und einem inneren Durchmesser von 19,5 cm. Die Randhöhe betrug 2,5 cm. Als nächstes wurden die folgenden Schritte in einer Sequenz befolgt, um einen 2 mm dicken Schaumstoff herzustellen:

(i). Das Glasgefäß mit der Lösung wird vorsichtig (ohne zu kippen) auf das Gestell des Lyophilisators gegeben, welches bei 20°C gehalten wird. Der Zyklus wird gestartet und die Gestell-Temperatur wird bei 20°C für 30 Minuten zum thermischen Konditionieren gehalten.
(ii). Die Lösung wird dann auf –5°C durch Kühlen des Gestells auf –5°C gekühlt.
(iii). Nach 60 Minuten des Gefrierens bei –5°C wird ein Vakuum angelegt, um primäres Trocknen des Dioxans durch Sublimation zu initiieren. Eine Stunde primäres Trock nen unter Vakuum bei –5°C wird benötigt, um das meiste des Lösungsmittels zu entfernen. Am Ende dieser Trocknungs-Stufe erreicht der Vakuumspiegel typischerweise ungefähr 50 mTorr (6,65 Pa) oder weniger.
(iv). Als nächstes wurde ein sekundäres Trocknen unter einem Vakuum von 50 mTorr (6,65 Pa) oder weniger in zwei Stufen durchgeführt, um das adsorbierte Dioxan zu entfernen. In der ersten Stufe wurde die Gestell-Temperatur auf 5°C erhöht und bei dieser Temperatur für 1 Stunde gehalten. Am Ende der ersten Stufe wurde die zweite Stufe des Trocknens begonnen. In der zweiten Stufe des Trocknens wurde die Gestell-Temperatur auf 20°C erhöht und bei dieser Temperatur für 1 Stunde gehalten.
(v). Am Ende der zweiten Stufe wurde der Lyophilisator auf Raumtemperatur gebracht und das Vakuum mittels Stickstoff unterbrochen. Die Kammer wurde mit trockenen Stickstoff für ungefähr 30 Minuten vor dem Öffnen der Tür gespült.

Die oben beschriebenen Schritte sind geeignet zur Herstellung von Schaumstoffen, die ungefähr 2 mm oder weniger dick sind. Wie der Fachmann wissen wird, sind die hierin beschriebenen Bedingungen typisch, und die Betriebsbereiche hängen von verschiedenen Faktoren ab, z.B.: Konzentration der Lösung; Polymer-Molekulargewichte und -Zusammensetzungen; Volumen der Lösung; Form-Parameter; Maschinen-Variablen, z.B. Kühlungsraten, Erhitzungsraten und ähnliches. Die 1 zeigt ein SEM (Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme) eines Querschnitts des Schaumstoffs, der unter Befolgung des Verfahrens, das in diesem Beispiel ausgeführt ist, hergestellt wurde. Man beachte die zufällige Mikrostruktur, nicht eine bevorzugte Architektur, dieses Schaumstoffs.
Beispiel 2
Herstellung eines Schaumstoffs mit vertikalen Kanälen
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines 35/65 PCL/PGA-Schaumstoffs mit vertikalen Kanälen, die Bahnen für Nährstoff-Transport und geführte Gewebe-Regeneration zur Verfügung stellen würden.
Wir verwendeten einen FTS Dura Dry Gefrier-Trockner mit Computer-Kontrolle und Daten-Überwachungs-System, um diesen Schaumstoff herzustellen. Der erste Schritt in der Präparation dieses Schaumstoffes diente der Generation einer homogenen Lösung. Eine 10% (wt/wt) homogene Lösung von 35/65 PCL/PGA wurde auf die gleiche Weise, die in Beispiel 1 beschrieben wird, hergestellt. Schritt A. Die Polymer-Lösung wurde vorsichtig in ein Gefäß gerade vor dem tatsächlichen Start des Zyklus gefüllt. Das Gefäß wog 620 g, war optisch gläsern 5,5 mm dick und zylindrisch mit einem äußeren Durchmesser von 21 cm und einem inneren Durchmesser von 19,5 cm. Die Randhöhe des Gefäßes betrug 2,5 cm. Als nächstes werden die folgenden Schritte in Sequenz befolgt, um einen 2 mm dicken Schaumstoff mit der gewünschten Architektur herzustellen:

(i). Das mit der Lösung gefüllte Gefäß wurde auf das Gefrier-Trockner-Gestell gegeben, das auf –17°C vorgekühlt war. Der Zyklus wurde begonnen und die Gestell-Temperatur bei –17°C für 15 Minuten gehalten, um die Polymer-Lösung abzuschrecken („quenching").
(ii). Nach 15 Minuten Abschrecken bei –17°C wurde ein Vakuum angelegt, um das primäre Trocknen des Dioxans durch Sublimation zu initiieren und bei 100 mTorr (13,3 Pa) für 1 Stunde gehalten.
(iii). Als nächstes wurde das sekundäre Trocknen bei 5°C für 1 Stunde und bei 20°C für 1 Stunde durchgeführt. Bei jeder Temperatur wurde der Vakuumspiegel bei 20 mTorr (2,67 Pa) gehalten.
(iv). Am Ende der zweiten Stufe wurde der Lyophilisator auf Raumtemperatur gebracht und das Vakuum mit Stickstoff unterbrochen. Die Kammer wurde mit trockenem Stickstoff für ungefähr 30 Minuten vor dem Öffnen der Tür gespült.

2 ist ein SEM-(Rasterelektronen-mikroskopisches) Bild, das einen Querschnitt des Schaumstoffs mit vertikalen Kanälen zeigt. Diese Kanäle laufen durch die Dicke des Schaumstoffs.
Beispiel 4
Schaumstoff mit architektonischem Gradienten
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Schaumstoffs, welcher einen Gradienten in der Schaumstoff-Morphologie, wie in 3 gezeigt, aufweist, unter der Verwendung einer 10% Lösung von 35/65 ε-Caprolacton-co-Glycolid. Das Verfahren, das zur Herstellung eines solchen Schaumstoffs verwendet wurde, ist zu der in Beispiel 2 gegebenen Beschreibung ähnlich, mit einem Unterschied. In Schritt (ii) des Lyophilisations-Prozesses beträgt die Zeit, für welche die Lösung im Gefrier-Schritt gehalten wird, 30 Minuten.
3 ist eine Rasterelektronen-mikroskopische Aufnahme eines Querschnittes dieses Schaumstoffes. Man beachte die Variation in der Porengröße und der Porenform durch die Dicke des Schaumstoffes.
Beispiel 4
Übergangs-Zusammensetzungs-(„transcompositional")Schaumstoff
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Schaumstoffes, welcher einen Zusammensetzungs-Gradienten und nicht notwendigerweise einen morphologischen Gradienten aufweist. Solch ein Schaumstoff wird aus Polymer-Lösungen hergestellt, welche aus physikalischen Mischungen von 2 oder mehreren Polymeren hergestellt wurden. Dieses Beispiel beschreibt einen Übergangs-Zusammensetzungs-Schaumstoff, der aus 35/65 PCL/PGA und 40/60 PCL/PLA hergestellt wurde.
Schritt A. Herstellung einer Lösungs-Mischung aus 35/65 PCL/PGA und 40/60 PCL/PLA in 1,4-Dioxan
In dem bevorzugten Verfahren werden die zwei separaten Lösungen zuerst hergestellt: (a) eine 10% (wt/wt) Polymer-Lösung von 35165 PCL/PGA und (b) eine 10% (wt/wt) 40/60 PCL/PLA. Nachdem diese Lösungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurden, werden gleiche Teile jeder Lösung in einen Misch-Kolben gegossen. Die Polymere, die verwendet wurden, um diese Lösungen herzustellen, werden in den Beispielen 8 und 9 beschrieben. Eine homogene Lösung dieser physikalischen Mischung wird durch vorsichtiges Erhitzen auf 60 ± 5°C und kontinuierliches Rühren unter der Verwendung eines Rührfisches für ungefähr 2 Stunden erhalten.
Schritt B. Lyophilisationszyklus
Wir verwendeten einen FTS Dura Dry Gefrier-Trockner mit Computer-Kontrolle und Daten-Überwachungs-System, um diesen Schaumstoff herzustellen. Der erste Schritt in der Präparation eines solchen Schaumstoffes dient dazu, eine homogene Lösung, wie in Schritt A. beschrieben, herzustellen. Die Lösung wurde vorsichtig in ein Gefäß gerade vor dem tatsächlichen Beginn des Zyklus gefüllt. Das zylindrische Glasgefäß wog 117 g, war optisch gläsern 2,5 mm dick und zylindrisch mit einem äußeren Durchmesser von 100 mm und einem inneren Durchmesser von 95 mm. Die Randhöhe des Gefäßes betrug 50 mm. Als nächstes wurden die folgenden Schritte in Sequenz befolgt, um einen 25 mm dicken Schaumstoff mit dem Übergangs-Zusammensetzungs-Gradienten herzustellen:

(i). Das mit der Lösung gefüllte Gefäß wurde auf das Gefrier-Trockner-Gestell gegeben und die Lösung bei 20°C für 30 Minuten konditioniert. Der Zyklus wurde gestartet und die Gestell-Temperatur wurde auf –5°C mit einer programmierten Kühlungsrate von 0,5°C/Min. gesetzt.
(ii). Die Lösung wurde bei der Gefrier-Bedingung (–5°C) für 5 Stunden gehalten.
(iii). Vakuum wurde angelegt, um das primäre Trocknen von Dioxan durch Sublimation zu initiieren, und bei 100 mTorr (13,3 Pa) für 5 Stunden gehalten.
(iv). Als nächstes wurde sekundäres Trocknen bei 5°C für 5 Stunden und bei 20°C für 10 Stunden durchgeführt. Bei jeder Temperatur wurde der Vakuumspiegel auf 20 mTorr (2,67 Pa) gehalten.
(v). Am Ende der zweiten Stufe wurde der Lyophilisator auf Raumtemperatur gebracht und das Vakuum mit Stickstoff unterbrochen. Die Kammer wurde mit trockenem Stickstoff für ungefähr 30 Minuten vor dem Öffnen der Tür gespült.

Der Schaumstoff wies einen Gradienten in der chemischen Zusammensetzung auf, was aus einer genauen Untersuchung der Schaumstoff-Wand-Morphologie offenkundig wird, wie dies in den 4, 5 und 6 gezeigt ist. Der Gradient in der chemischen Zusammensetzung wurde weiterhin durch NMR-Daten unterstützt, wie unten detailliert dargestellt: Eine Schaumstoff-Probe, die durch die obere Methode hergestellt wurde und welche ungefähr 25 mm dick war, wurde auf ihre Mol-Prozent-Zusammensetzung charakterisiert. Die Schaumstoff-Probe setzt sich aus einer physikalischen Mischung von PCL/PLA und PCL/PGA zusammen. Schnitte der Schaumstoff-Probe wurden präpariere und analysiert, um zu bestätigen, daß das Material einen Zusammensetzungs-Gradienten aufwies. Die Proben-Schnitte wurden identifiziert als 1) Schaumstoff IA (oberster Schnitt), 2) Schaumstoff IB (oberer mittlerer Schnitt), 3) Schaumstoff IC (unterer mittlerer Schnitt), 4) Schaumstoff ID (unterer Schnitt). Die NMR-Proben-Präparation bestand aus Lösen von 5 mg des Materials in 300 μl Hexafluoroaceton-sesquadeuteriumoxid (HFAD) und danach Verdünnen mit 300 μl C₆D₆.
1H NMR-Ergebnisse: mol%-Zusammensetzung
Die NMR-Ergebnisse zeigen an, daß die Schaumstoff-Proben einen Gradienten in Bezug auf die Zusammensetzung aufweisen. Die oberste Schicht des Schaumstoffs ist hoch in der PLA-Konzentration (47 mol-%), wohingegen die untere Schicht des Schaumstoffs hoch in der PGA-Konzentration ist (56 mol-%). Diese Ergebnisse schlagen vor, daß der PCL/PGA-Copolymer und der PCL/PLA-Copolymer Unterschiede in ihrem Phasen-Separations-Verhalten während des Gefrier-Schrittes aufweisen und einen einzigartigen Zusammensetzungs-Gradienten-Schaumstoff bildeten.
Beispiel 5
Übergangs-struktureller („transstructural") Schaumstoff
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Schaumstoffes, welcher einen Zusammensetzungs- und strukturellen Gradienten und nicht notwendigerweise einen morphologischen Gradienten aufweist. Solch ein Schaumstoff wird aus Polymer-Lösungen hergestellt, die aus physikalischen Mischungen von zwei oder mehreren Polymeren hergestellt wurden. Dieses Beispiel beschreibt einen Übergangs-Zusammensetzungs-Schaumstoff, der aus 35/65 PCL/PLA (wie in Beispiel 9 beschrieben) und 95/5 PLA/PCL (einem zufälligen Copolymer mit einer IV von 1,8 in HFIP, wie hierin beschrieben gemessen) hergestellt wurde. Man beachte, daß 35/65 PCL/PLA ein weicher elastomerer Copolymer ist, während 95/5 PLA/PCL ein relativer steifer Copolymer ist. Die Kombination dieser zwei stellt einen Zusammenset zungs- sowie strukturellen Gradienten zur Verfügung. Dieser Schaumstoff wird unter Verwendung der Schritte, die in Beispiel 4 aufgeführt werden, hergestellt, beginnend von einer homogenen 50/50 physikalischen Mischung einer 10% (wt/wt) Lösung von 35/65 PCL/PLA und 10% (wt/wt) Lösung von 95/5 PLA/PCL in 1,4-Dioxan. Solch ein Übergangs-Zusammensetzungs-Schaumstoff wird eine gute Matrize für Gewebe-Grenzzonen, wie z.B. Knochen-Knorpel-Grenzflächen, zur Verfügung stellen.
Beispiel 6
Zellkultur und Differentiations-Daten
Filme, die aus 95/5 PLA/PGA, 90/10 PGA/PLA, 95/5 PLA/PCL, 75/25 PGA/PCL und 40/60 PCL/PLA hergestellt wurden, wurden getestet. Gewebekultur-Polystyrol (TCPS) wurde als eine positive Kontrolle für alle Assays verwendet. Vor der Testung wurden Polymer-Scheiben auf den Boden eines 24-Well ultraniedrigen Kluster-Gefäßes positioniert und wurden mit Wachstums-Medium für 20 Minuten vorgefeuchtet.
Der 95/5 PLA/PGA-Copolymer, der in diesem Beispiel verwendet wurde, war ein Zufalls-Copolymer mit einer IV von 1,76, wie in HFIP bei 25°C bestimmt wurde, welcher derzeit in Panacryl^TM-Wundnaht (Ethicon, Inc., Somerville, New Jersey) verwendet wird. Der 90/10 PGA/PLA-Copolymer war ein Zufalls-Copolymer mit einer IV von 1,74, wie in HFIP bei 25°C bestimmt wurde, welcher derzeit in Vicyl^TM-Wundnaht (Ethicon, Inc., Somerville, New Jersey) verwendet wird. Der 95/5 PLA/PCL-Polymer wurde hergestellt, wie in Beispiel 10 beschrieben, mit einer IV von 2,1, wie in HFIP bei 25°C bestimmt wurde. Der 75/25 PG/PCL-Copolymer ist ein segmentierter Block-Copolymer mit einer IV von 1,85 und wird in U.S. Patent 5,133,739 beschrieben. Dieser Copolymer wird derzeit in Monocryl^TM-Wundnähten (Ethicon, Inc., Somerville, New Jersey) verwendet. Der 40/60 PCL/PLA-Copolymer, der in diesem Beispiel verwendet wird, wurde, wie in Beispiel 9 beschrieben, hergestellt und hatte eine IV von 1,44.
Zell-Anhaftung und Proliferation:
Zellen wurden bei 40.000/Well in 24-Well ultraniedrigen Kluster-Gefäßen (Corning), die die Polymere enthielten, ausgesät. Die ultraniedrigen Kluster-Gefäße werden mit einer Schicht von Hydrogel-Polymer beschichtet, was Protein- und Zell-Adhesion an die Wells hemmt. Zell-Anhaftung an die Biopolymere wurde nachfolgend 24-stündiger Inkubation bestimmt (N = 3 für jeden Polymer). Die angehafteten Zellen wurden durch Trypsinisierung freigesetzt und die Zahl der Zellen wurde unter der Verwen dung eines Heamacytometers bestimmt. Die Zell-Proliferation wurde durch Bestimmung der Zellzahlen an den Tagen 3 und 6 nachfolgend des Aussäens bestimmt.
Differentiations-Assays:
Alkalische Phosphatase-Aktivität:
Alkalische Phosphatase-Aktivität wurde durch einen kolorimetrischen Assay unter der Verwendung von p-Nitrophenolphosphat-Substrat (Sigma 104) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt, wurden Zellen auf die Filme oder Netze in einer Dichte von 40.000 Zellen/Well ausgesät und für 1, 6, 14 und 21 Tage inkubiert. Nachdem die Zellen am Tag 6 Konfluenz erreichten, wurden sie mit Mineralisations-Medium (Wachstums-Medium, supplementiert mit 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg pro ml Ascorbinsäure) gefüttert. Alkalische Phosphatase-Aktivität wurde in Zell-Homongenaten (0,05% Triton X-100) an den oben angegeben Zeitpunkten bestimmt. Die Quantität von Protein in Zellextrakten wurde unter der Verwendung von Mikro-BCA-Reagenz von Pierce bestimmt. Primäre Ratten-Osteoblasten, die auf Filmen und Netzen kultiviert wurden, wurden ebenso mit Membran-gebundener alkalischer Phosphatase unter der Verwendung eines histochemischen Färbe-Kits (Sigma) gefärbt. Für alle Filme und Netze wurden drei Proben pro Gruppe getestet.
Osteotcalcin-ELISA:
Osteocalcin, das in das Medium von Osteoblasten sekretiert wird, die auf verschiedenen Filmen kultiviert werden, wurde durch ELISA quantifiziert (Osteocalcin-ELISA-Kit, Biomedical Technologies Inc., Boston). Aliquote der Medien aus den Wells, die Polymerfilme enthalten, wurden vor der Messung dieses Proteins durch ELISA lyophilisiert. Drei Proben für jeden Polymer wurden getestet und der ELISA wurde zweimal wiederholt.
Von Kossa-Färbung
Drei Proben für jeden Polymer wurden auf mineralisiertes Gewebe gefärbt, unter der Verwendung von Von Kossa-Silbernitrat-Färbung.
Expression von mRNAs von alkalischer Phosphatase und Osteocalcin
Die Expression von mRNAs von alkalischer Phosphatase und Osteocalcin in Zellen wurde durch semi-quantitative reverse Transkriptase-Polymerse-Kettenreaktion (RT-PCR) unter der Verwendung von RNA untersucht, die aus Zellen extrahiert wurde, die für 21 Tage auf den Filmen kultiviert wurden. Sieben Tage nach dem Aussäen wurde das Kulturmedium mit Mineralisationsmedium ersetzt (3 mM β-Glycerophosphat und 50 μg/ml Ascorbinsäure wurden addiert). Die Zellen wurden für zusätzliche 2 Wochen kultiviert, d.h. für eine Gesamtzeitspanne von 3 Wochen. Gesamt-RNA wurde aus vier Proben pro Gruppe unter der Verwendung eines RNeasy Mini Kit, zur Verfügung gestellt von Qiagen, extrahiert. Die Qualität 5 und Menge der Gesamt-RNA wurde für jede Polymergruppe gemessen. Gesamt-RNA wurde revers transkribiert, um cDNA zu erhalten, unter der Verwendung einer reversen Transkriptase-Reaktion (Superscript II, Gibco). Die cDNAs für Osteocalcin, alkalische Phosphatase und Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) wurden unter der Verwendung eines PCR-Protokolls amplifiziert, wie zuvor beschrieben (Anweisungen des Herstellers Gibco 10 BRL). Die Primer-Sequenzen (Tabelle 1) für Osteocalcin, alkalische Phosphatase und GAPDH wurden unter der Verwendung des FASTA-Programmes (Genetic Computer Group, Madison, WI) erhalten. Vorbereitende Studien wurden auch unternommen, um die Zahl der PCR-Zyklen für jeden Primer zu optimieren (Tabelle 2) und um den Bereich von RNA zu bestimmen, welcher Proportionalität zur cDNA zeigt. Die PCR-Produkte wurden auf 1% 15 (Gewicht) Agarose-Gelen, die Ethidiumbromid enthalten, elektrophoretisch getrennt. Die Gele wurden unter UV-Licht photographiert und durch Densitometrie auf die Expression von mRNAs von Osteocalcin und alkalischer Phosphatase relativ zu GAPDH-mRNA evaluiert.
Statistische Analyse
Analyse der Varianz (ANOVA) mit Tukey post hoc-Vergleichen wurde verwendet, um die Signifikanz-Spiegel aller Assays zu beurteilen.
Tabelle I. Primer, die in der RT-PCR verwendet werden
Tabelle II. PCR-Optimisierungs-Zyklen
Ergebnisse
Zell-Anhaftung und Proliferation an bioresorbierbare Polymere:
Zwischen den verschiedenen Polymer-Filmen und im Vergleich zu TCPS waren keinen beobachtbaren Unterschiede in der Zell-Morphologie offensichtlich. Zell-Anhaftung an die verschiedenen Biopolymer-Filme war gleich gegenüber TCPS, nachfolgend 24 Stunden an Inkubation. Am Tag 3 proliferierten die Zellen gut auf allen Filmen, mit der Ausnahme von 40/60 PCL/PLA, wo die Proliferation 60% in Bezug auf TCPS betrug. Weiterhin unterstützten 95/5 PLA/PGA und 90/10 PGA/PLA-Filme Zell-Proliferation in einem signifikant (p < 0,05) höherem Maß im Vergleich zu TCPS und 40/60 PCL/PLA (7A).
Differentiations-Assay:
Enzymaktivität von alkalischer Phosphatase:
Das Profil für die alkalische Phosphatase-Aktivität, die von Osteoblasten exprimiert wird, welche auf 95/5 PLA/PGA, 90/10 PGA/PLA und 95/5 PLA/PCL-Filmen kultiviert wurden, war gleich dem Profil, das auf TCPS beobachtet wurde. Spezifische Aktivitäten von alkalischer Phosphatase waren signifikant (p < 0,05) erhöht für Osteoblasten, die auf 40/60 PCL/PLA und 75/25 PGA/PCL-Filmen kultiviert wurden, an den Tagen 14 bzw. 21 im Vergleich mit den anderen Filmen und TCPS (7B).
Expression von mRNA von alkalischer Phosphatase und Ostoecalcin:
Die Expression der mRNAs von alkalischer Phosphatase, Osteocalcin und GAPDH für Osteoblasten, die auf den 95/5 PLA/PGA, 40/60 PLA/PCL, 95/5 PLA/PCL-Filmen kultiviert wurden, und TCPS wurden durch Densitometrie evaluiert. Die Ergebnisse sind in 7C dargestellt. Es sollte bemerkt werden, daß die Daten in 7B bestenfalls semi-quantitativ sind. Trotzdem schlagen die Daten vor, daß 40/60 PCL/PLA-Film signifikant (p < 0,05) höhere Spiegel von Osteocalcin-Expression im Vergleich zu TCPS unterstützt. Der Rest der Polymer-Oberflächen war für sowohl die mRNA-Expression von Osteocalcin und AP äquivalent zu TCPS.
Schlußfolgerungen
Es wurden keine Unterschiede in Bezug auf Zell-Anhaftung und Proliferation zwischen den verschiedenen bioabsorbierbaren Filmen oder Netzen, die nach 6 Tagen Inkubation getestet wurden, beobachtet. Weiterhin indizieren die Ergebnisse, daß Unterschiede zwischen diesen Materialien offensichtlicher sind, in Bezug auf deren Differentiations-Eigenschaften. Zellen, die auf 40/60 PCL/PLA-Film kultiviert wurden, zeigten erhöhte Aktivität an alkalischer Phosphatase und Osteocalcin-mRNA-Expression im Vergleich zu anderen Filmen und TCPS nachfolgend 14-tätiger bzw. 21-tägiger Inkubation.
Referenzen, auf die sich für ein vollständigeres Verstehen dieser Technik bezogen werden kann, schließen ein: M. A. Aronow, L. C. Gerstenfeld, T. A. Owen, M. S. Tassinari, G. S. Stein und J. B. Lian: „Factors that promote progressive development of the osteoblast phenotype in cultured fetal rat calvaria cells: Journal of Cellular Physiology, 143: 213–221 (1990) und Stein, G. S., Lian, J. B., und Owen, T. A. „Relationship of cell growth to the regulation of tissue-specific gene expression during osteoblast differentiation" FASEB, 4, 3111–3123 (1990).
Beispiel 7
In vivo Studie von Schaumstoff-Mischung in einem dermalen Schwein-Wundheilungs-Modell
Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse der Implantation eines 1 mm, 0,5 mm dicken Schaumstoff-Gewebe-Gerüstes in ein Schwein-Gesamtdicke-Entfernungs-Wundmodell („swine null thickness excisional wound model"). Das Schaumstoff-Gewebe-Gerüst wurde aus einer Mischung von 40/60 ε-Caprolacton-co-Lactid, welches wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt wurde, und 35/65 ε-Caprolacton-co-Glycolid, wie in Beispiel 9 beschrieben, hergestellt. Diese Polymere wurden zusammen gemischt und in 1 mm und 0,5 mm Schaumstoffe gebildet, und zwar im wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben (außer daß die Abkühlungsrate 2,5°C pro Minute betrug und nur auf –5°C gekühlt wurde). Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen eines 0,5 mm Schaumstoffes werden in 9A, 9B und 9C gezeigt. Die zwei Dicken (0,5 mm und 1 mm) der Schaumstoffe wurden dann in dem Wund-Entfernungs-Modell mit und ohne zur Verfügung gestelltem PDGF getestet. Die resultierenden vier verschiedenen Proben wurden dann evaluiert.
Eine histologische Blind-Evaluierung wurde an 48 Gesamtdicke-Entfernungs-Wunden von vier Schweinen (12 Stellen pro Tier) durchgeführt, explantiert 8 Tage nachfolgend der Verwundung. Die Untersuchung wurde an H&E-gefärbten Objektträgern durchgeführt. Während der histologischen Untersuchung wurden die folgenden Parameter in der Specimen-Reihe engeschätzt/evaluiert: 1) zelluläre Einwanderung der Matrix, qualitative und quantitative Untersuchungen, 2) Infiltrierung polymorphonuklearer Leukocyten (PMNs) in die Kontaktzone (ventrale Oberfläche) der Matrix, 3) Inflammation im Granulations-Gewebebett unter (ventral zu) der Matrix, 4) Reaktion der Epidermis auf die Matrix und 5) Grad der Fragmentierung der Matrix.
Tierhaltung:
Die Schweine wurden individuell in Käfigen (mit einem minimalen Bodengebiet von 10 sq. ft. (0,93 m²)) untergebracht und identifiziert. Allen Schweinen wurde eine individuelle Tiernummer zugeordnet. Eine Marke wurde an jedem individuellen Tierkäfig angebracht, welche die Tiernummer, Spezies/Stamm, Operationsdatum, Operationstechnik und Dauer des Experiments und Datum der Euthanasie auflistet. Jedes Tier wurde deutlich mit einer Tiernummer am Halsansatz unter der Verwendung eines permanenten Markers markiert.
Die Tierräume wurden in einem Bereich von 40 bis 70% R. H. und 15 bis 24°C (59,0 bis 75,2°F) gehalten. Die Tiere wurden mit Standard-Schweine-Futter einmal pro Tag gefüttert, aber wurden über Nacht vor jeder experimentellen Prozedur, die Anästhesie benötigte, gefastet. Wasser war nach Belieben erhältlich. Ein täglicher Hell-Dunkel-Zyklus von 12–12 Stunden wurde angewendet.
Anästhesie:
Am Anfangstag der Studie, an den Tagen der Evaluierung und am Tag der Leichenschau wurden die Tiere festgehalten und entweder mit einer intramuskularen Injektion von Tiletamin HCl plus Zolazepam HCl (Telazol^®, Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa, 4 mg/ml) und Xylazin (Rompun^®, Bayer Corporation, Agriculture Division, Animal Health, Shawnee Mission, Kansas, 4 mg/ml) oder Isofluran (AErrane^® Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa) inhalatorischer Anästhesie (5% Vol.), die über einen Nasen-Konus verabreicht wurde, anästhesiert. Wenn sich das Tier im Operationsraum befand, wurde es auf Isofluran (AErrane^®) inhalatorischer Anästhestie (2% Vol.), verabreicht über einen Nasen-Konus, gehalten. Nahrung war nach der Erholung von jeder Prozedur erhältlich.
Präparation der Operationsstelle
Einen Tag vor der Operationsprozedur wurden Körpergewichte gemessen und die dorsale Region der vier Schweine wurde mit einem elektrischen Klipper, ausgestattet mit einem #40 Operations-Rasiermesser, geschoren („clipped"). Die rasierte Haut wurde dann genau mit Rasierschaum und einem Rasierer rasiert und dann gewaschen. Die rasierte Haut und das gesamte Haut (ausschließlich des Kopfes) wurden dann mit einem Operations-Scheuer-Bürsten-Schwamm mit PCMX Reinigungslösung (Pharmaseal^® Scrub Care^® Baxter Healthcare Corporation, Pharmaseal Division, Valencia, California) und danach mit HIBICLENS^® Chlorhexidingluconat (erhältlich von COE Laboratories, Incorporated, Chicago, Illinois) gescheuert. Das Tier wurde mit einem sterilen Tuch trocken gerieben. Steriler NU-GAUZE*-Verbandmull (von Johnson & Johnson Medical Incorporated, Arlington, Texas) wurde über die dorsale Oberfläche von jedem Tier gegeben und mit WATERPROOF*-Band (erhältlich von Johnson & Johnson Medical Incorporated, Arlington, Texas) gesichert. Die gesamte Torsoregion des Tieres wurde dann mit Spandage^TM elastischen Stretch-Bandagen (erhältlich von Medi-Tech International Corporation, Brooklyn, New York) abgedeckt, um eine saubere Oberfläche über Nacht aufrechtzuerhalten.
Am Tag der Operation, unmittelbar vor der Ablieferung des Tieres an der Operationsstelle, wurde die dorsale Haut erneut unter der Verwendung eines Operations-Scheuer-Bürsten-Schwammes mit PCMX Reinigungslösung (Pharmaseal^® Scrub Care^®) gescheuert, gespült und unter der Verwendung eines sterilen Tuches trocken gerieben, wie es am vorhergehenden Tag durchgeführt wurde. Die Tiere wurden hingestreckt auf den Operationstisch plaziert und mit 70% Alkohol abgerieben und mit sterilem Verbandsmull getrocknet. Unter der Verwendung eines sterilen Operations-Markers, erhältlich von Codman^®, einer Abteilung von Johnson & Johnson Professional Incorporated, Raynham, Massachusetts) und einer Acetat-Matrize wurden Markierungen auf der dorsalen Haut gemäß der gewünschten Plazierung jeder Ganzdicke-Wunde gemacht.
Operationsprozedur:
Nach der Anästhesie wurden unter sterilen Bedingungen zwölf (12) Ganzdicke-Ausschneidungen (1,5 × 1,5 cm) pro Tier durchgeführt, und zwar in zwei Reihen parallel zur Wirbelsäule an den rechten und linken dorsalen Regionen, unter der Verwendung einer Skalpell-Klinge. Ein Paar von Scheren und/oder Skalpell-Klingen wurde verwendet, um bei der Entfernung der Haut und subkutanem Gewebe zu helfen. Bluten wurde unter der Verwendung einer Schwamm-Tamponade kontrolliert. Zwischen den Wunden wurde ausreichend Platz gelassen, um Wund-zu-Wund-Interferenz zu vermeiden. Das ausgeschnittene Gewebe wurde auf Dicke unter der Verwendung eines digitalen Meßtasters gemessen.
Applikation der Behandlung und des Verbandstoffes:
Jede Wunde wurde einem vorbereiteten, kodierten Behandlungsschema unterworfen (die Studien-Teilnehmer waren gegenüber allen Behandlungen blind), der primäre Verbandsstoff bestehend aus dem sterilen individuellen Testartikel (1,5 × 1,5 cm, eingeweicht in steriler Saline für 24 Stunden), wurde in das Wundendefizit („wound deficit") in einem vorbestimmten Schema gegeben. Der sekundäre Verbandsstoff, ein nicht-adhärenter, Salinegetränkter rechteckiger Teil von RELEASE*-Verbandsstoff (hergestellt von Johnson & Johnson Medical Incorporated, Arlington, Texas) wurde oben auf den Testartikel gegeben. Die Wunde wurde mit einer Schicht von BIOCLUSIVE*-Verbandsstoff (erhältlich von Johnson & Johnson Medical Incorporated, Arlington, Texas) versiegelt, um die Wunde feucht zu halten und den Verbandsstoff an Ort und Stelle zu halten. Streifen von Reston^TM (3M Medical-Surgical Division, St. Paul, Minnesota) Polyurethan, selbst-anhaftender Schaumstoff wurden zwischen die Wunden gegeben, um Kreuz-Kontamination aufgrund von Ausbruch von Wundflüssigkeit zu vermeiden und um die Wunden vor Beschädigung und den Verbandsstoff vor Ablösung zu schützen. Eine Schicht von NU-GAUZE*-Verbandmull wurde auf den BIOCLUSIVE*-Verbandsstoff und Reston^TM-Schaumstoff gegeben und wurde mit WATERPROOF*-Band gesichert, um die Verbandsstoffe zu schützen. Die Tiere wurden dann mit Spandage^TM elastischem Netz bekleidet, um zu helfen, die Verbandsstoffe an Ort und Stelle zu halten.
Die sekundären Verbandsstoffe wurden entfernt und täglich mit einem frischen Stück an Saline-getränktem Release* sekundärem Verbandsstoff ausgetauscht. Die primären Verbandsstoffe (Testartikel) wurden nicht gestört, es sein denn die Einheit wurde abgelöst oder aus dem Wund-Defizit ausgestoßen.
Post-operative Sorge und klinische Beobachtung:
Nach der Durchführung der Prozeduren unter Anästhesie wurden die Tiere in ihre Käfige zurückgebracht und es wurde ihnen erlaubt, sich zu erholen. Den Tieren wurden Analgetika (Buprenorphinhydrochlorid [Buprenex Injectable, 0,01 mg/kg, im) verkauft von Reckitt & Colman Products, Hull, England) unmittelbar nach der Operation und am folgenden Tag gegeben. Nach der Erholung von der Anästhesie wurden die Schweine auf Verhaltensanzeichen von Beschwerden oder Schmerz beobachtet. Keine Anzeichen von Schmerz wurden beobachtet.
Jedes Schwein wurde zweimal täglich nach dem Tag der Operation beobachtet, um seinen Gesundheitsstatus auf der Basis von allgemeinem Auftreten und Erscheinen, Nah rungsaufnahme, fäkaler und Harnstoff-Exkretion und Anwesenheit von unnormalen Ausflüssen zu bestimmen.
Gewebe-Ernte:
Unmittelbar nach der Euthanasie jedes Tieres wurde jede Wunde zusammen mit dem unterliegenden Fett und einem kleinen Teil der umgebenden Haut ausgeschnitten. Das Gewebe wurde in 10% neutral-gepuffertes Formalin gegeben.
Evaluierungen:
Visuelle Wund-Beurteilung:
Allgemeine Beobachtungen wurden für die Tage 1 bis 3 aufgenommen, einschließlich Ablösung, Wundreaktion und physikalische Eigenschaften des Gerüstes. Detaillierte klinische Evaluierungen wurden an den Tagen 4 bis 8 nach der Verwundung durchgeführt. Die Bewertungen wurden bezüglich der Anwesenheit/Abwesenheit (ja = 1/nein = 0) und/oder dem Maß (eine Punktzahl wird vergeben) der folgenden Parameter aufgenommen:
Verbandsstoff-Bedingungen:

Luft-ausgesetzt, Ablösung des Testartikels, Furche („channeling"), Kommunikation und Feuchtigkeitsgehalt des Release* sekundären Verbandsstoffes (bepunktet als: 4 = feucht, 3 = feucht/trocken, 2 = trockenfeucht, 1 = trocken).

Wundbett-Bedingunen:

Feuchtigkeitsgehalt des Testartikels (bepunktet als: 4 = feucht, 3 = feucht/trocken, 2 = trocken/feucht, 1 = trocken), Inflammation (bepunktet als: 3 = ernsthaft, 2 = moderat, 1 = leicht, 0 = nicht), Wieder-Verletzung (bepunktet als: 3 = ernsthaft, 2 = moderat, 1 = leicht, 0 = nicht), Gerinnsel, Folliculitis, Infektion, Niveau des Testartikels (bepunktet als: 4 = super erhöht, 3 = erhöht, 2 = eben, 1 = vertieft), Fibrin (bepunktet als: 3 = ernsthaft, 2 = moderat, 1 = leicht, 0 = nicht) und Erythem. Die Farbe der Testartikel wurde auch beobachtet.

Gewebeverarbeitung:
Ausgeschnittene Gewebeproben wurden am Tag 8 entnommen. Die gesamte Wunde wurde geerntet und in 10% neutral-gepuffertes Formalin gegeben. Das Gewebe wurde für gefrorene Ausschnitte vorbereitet. Das Gewebe wurde auf dem Objektträger mit Tissue-Tek^® OCT-Verbindung (verkauft von Sakura Finetechnical Company, Limited, Tokio, Japan) eingepaßt und befestigt und schnell gefroren. Die Specimen wurden auf dem Cryostat bei 10 μm sektioniert und mit einem gefrorenem H&E-Färbemittel gefärbt.
Histologische Bewertung (Tag 8 nach der Verwundung):
Histologische Evaluierungen für Granulations-Gewebe (Gebiet und Länge) und Epithelialisierung wurden unter der Verwendung der H&E-gefärbten Specimen unter der Verwendung einer Vergrößerung von 20 bis 40 × bewertet. Die Granulations-Gewebe-Höhe wurde durch Teilen des Gebietes durch die Länge bestimmt.
Histopathologische Evaluierung der Gewebeproben wurde unter der Verwendung der H&E-gefärbten Specimen bewertet, sie wurden zuerst unter 100 × bis 400 × Vergrößerung bewertet.
Ergebnisse
Es gab zelluläre Invasion in die Zwischenräume der Matrix bei der Mehrheit aller Teststellen. Bei der Mehrheit der Stellen war diese Invasion wahres Gewebe-Einwachsen, umfassend variierende Populationen von Fibroblasten, Makrophagen, Makrophagen-Riesenzellen und Endothelial-ähnlichen Zellen, es gab anscheinend auch Kapillar-Bildung. Eine signifikante Bildung von dichter fibröser konnektiver Gewebe-Schicht dorsal zu den Matrizen, was im wesentlichen die Matrizen in das Gewebe einbettet, wurde bei mehreren Stellen für die 0,5 mm Schaumstoffe mit und ohne PDGF gesehen. Die 1 mm Matrizen waren entweder an der Oberfläche des Gewebebettes oder abgelöst. Makrophagen-Riesenzell-Bildung schien in den 0,5 mm gegenüber den 1 mm Schaumstoff-Gerüsten größer zu sein. An Stellen, wo der 1 mm Schaumstoff abgelöst oder teilweise von dem unterliegenden Granulations-Gewebe abgelöst war, trat Tod der einwandernden Zellen auf, was Massen von pyknotischem Zellabfall bildete.
Vollständiges Einfügen der Matrix in das Granulations-Gewebebett wurde an mehreren Stellen für die 0,5 mm Schaumstoff-Gerüste gesehen. 10 und 11 illustrieren die Einfügung dieser Matrizen in das Granulations-Gewebebett. 10 ist eien Dunkelfeld-40X-Mikroaufnahme einer Trichrom-gefärbten Gewebeprobe. 11 ist eine 100X Komposite-Mikroaufnahme einer Trichrom-gefärbten Probe, welche die zelluläre Invasion eines Schaumstoffs, der PDGF enthält, illustriert. Vollständige Einfügung der Matrizen in das Granulations-Gewebebett wird in beiden Bildern offensichtlich. Das dichte fibröse Gewebe über dem Schaumstoff-Gerüst ist in beiden Bildern offensichtlich. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die 0,5 mm Schaumstoffe ein geeignetes Substrat für das Wachstum von epidermalem Gewebe zur Verfügung stellen werden.
Beispiel 8
Synthese eines zufälligen Poly(ε-Caprolacton-co-Glycolid)
Ein Zufalls-Copolymer von ε-Caprolacton-Glycolid mit einer 35/65 molaren Zusammensetzung wurde mittels Ring-Öffnungs-Polymerisation-Reaktion synthetisiert. Das Verfahren der Synthese war im wesentlichen das Verfahren, das in U.S. Patent 5,468,253 in Beispiel 6 beschrieben ist. Die Menge an zugegebenem Diethylenglycol-Initiator wurde auf 1,15 mmol/mol Monomer eingestellt, um die folgenden Eigenschaften des getrockneten Polymers zu erhalten: die inherente Viskosität (I.V.) des Copolymers war 1,59 dl/g in Hexafluoroisopropanol bei 25°C. Das molare Verhältnis von PCL/PGA wurde mittels Protonen-NMR als 35,5/64,5 gefunden mit ungefähr 0,5% restlichem Monomer. Der Glasübergang (Tg) und die Schmelzpunkte (Tm) des Copolymers wurden als –1°C, 60°C bzw. 126°C mittels DSC gefunden.
Beispiel 9
Synthese von 40:60 Poly(ε-Caprolacton-co-L-Lactid) durch sequentielle Addition
In der Handschuhbox werden 100 μl (33 μmol) einer 0,33 M Zinnoctoat-Lösung in Toluol, 115 μl (1,2 mmol) Diethylenglycol, 24,6 g (170 mmol) L-Lactid und 45,7 g (400 mmol) ε-Caprolacton in einen silanisierten, flamm-getrockneten, 250 ml Zweihals-Rundkolben, ausgestattet mit einem mechanischen Edelstahl-Rührer und einem Stickstoff-Schutzgas, transferiert. Der Reaktionskolben wird in ein Ölbad gegeben, welches schon auf 190°C gesetzt wurde, und wird dort gehalten. In der Zwischenzeit werden in der Handschuhbox 62,0 g (430 mmol) L-Lactid in einen flamm-getrockneten, Druck-ausgleichenden Additions-Trichter transferiert. Der Trichter wurde mit Hitzeband eingewickelt und an den zweiten Hals des Reaktionskolbens angebracht. Nach 6 Stunden bei 190°C wurde geschmolzenes L-Lactid über 5 Minuten zu dem Reaktionskolben addiert. Die Reaktion wurde über Nacht für eine Gesamtreaktionszeit von 24 Stunden bei 190°C fortgesetzt. Der Reaktion wurde erlaubt, über Nacht auf Raumtemperatur abzukühlen. Der Copolymer wurde aus dem Reaktionskolben durch Gefrieren in flüssigem Stickstoff und Brechen des Glases isoliert. Jegliche verbleibenden Glasfragmente wurden aus dem Copolymer unter der Verwendung eines Tisch-Schleifers entfernt. Der Copolymer wurde erneut mit flüssigem Stickstoff gefroren und von dem mechanischen Rühr-Paddel abgebrochen. Der Copolymer wurde unter der Verwendung einer Wiley-Mühle in ein ausgewogenes Glas-Gefäß gemahlen und es wurde ihm erlaubt, sich im Vakuumofen über Nacht auf Raumtemperatur zu erwärmen. 103,13 g 40:60 Poly(ε-Caprolacton-co-L-Lactid) wurden zu einer ausgewogenen Aluminium-Pfanne addiert und dann unter Vakuum bei 110°C für 54 Stunden devolatilisiert. 98,7 g (95,7 Gew.-%) Copoly mer wurden nach der Devolatilisierung gewonnen. Die inhärente Viskosität wurde gemessen und in CHCl₃ bei 25°C (c = 0,1 g/dl) als 1,1 dl/g gefunden. FTIR (Gußfilm von CHCl₃ auf KBr-Fenster, cm^–1): 2993, 2944, 2868, 1759, 1456, 1383, 1362, 1184, 1132, 1094, 870 und 756. ¹H NMR (400 MHz, HFAD/Benzol, ppm): δ 1,25, 2 breite Linien (e); 1,35, 2 Linien (f); 1,42 3 Linien; 1,55, 2 Linien; 2,22, 3 Linien; 2,35, 4 breite Linien; 4,01, 3 Linien; 4,05, 3 Linien; 4,2, Quartett; 5,05, 3 breite Linien; 5,15, 4 Linien. Polymer-Zusammensetzung mittels ¹H NMR: 41,8% PCL, 57,5% PLA, 0,8% L-Lactid, < 0,1% ε-Caprolacton. DSC (20°C/Minute, zuerst Hitze): T_m = 154,8°C, ΔH_m = 18,3 J/g. GPC (Molekulargewichte bestimmt in THF unter der Verwendung von Poly(methylmethacrylat)-Standards, Daltons): M_w = 160.000, M_n = 101.000, PDI = 1,6.
Beispiel 10
Synthese von 95/5 PLA/PCL-Copolymer
In der Handschuhbox wurden 170 μl (1,8 mmol) Diethylenglycol, 350 μl (115 μmol) einer 0,33 M Zinnoctoat-Lösung in Toluol, 17,1 g (150 mmol) ε-Caprolacton und 410,4 g (2,85 mol) L-Lactid in einen silanisierten, flamm-getrockneten, 1000 ml Rundkolben, ausgestattet mit einem mechanischen Rührer und einem Vakuum-Abzug-Anschluß, um ein trockenes Stickstoff-Schutzgas aufrechtzuerhalten, gegeben. Der Reaktionskolben wurde in ein Ölbad gegeben, das schon auf 185°C erhitzt war, und dort für 3 Stunden gehalten. Der Kolben wurde aus dem Ölbad entfernt und es wurde ihm erlaubt, auf Raumtemperatur abzukühlen. Der Polymer wurde isoliert durch Einwickeln des Kolbens mit Aluminiumfolie, Gefrieren des Kolbens in flüssigem Stickstoff und dann Abschleifen von jedem anhaftenden Glas von dem Polymer. Der Copolymer wurde dann in einer Wiley-Mühle gemahlen. Der gemahlene Polymer wurde bei 80°C für 24 Stunden Vakuum-getrocknet. 302 g Copolymer wurden gesammelt. Die inhärente Viskosität betrug 2,1 dl/g in Chloroform (25°C, c = 0,1 g/dl). Die Copolymer-Zusammensetzung wurde durch Protonen-NMR-Spektroskopie gemessen und als 97,2 mol-% PLA und 2,8 mol% PCL gefunden. Es wurde kein restlicher Monomer detektiert.
Beispiel 11
Synthese von 60/40 PLA/PCL Hybrid-Schaumstoff/mikrofibröse Gewebe-Struktur
Schritt A. Herstellung einer 14% (wt/wt) homogenen Lösung von 60/40 PLA/PCL in Trichlorethan
Eine 14% (wt/wt) Polymer-Lösung wird durch Lösen von 14 Teilen 60/40 PLA/PCL (I.V. = 1,34 dl/g) mit 86 Teilen des Lösungsmittels Trichlorethan (TCE) präpariert. Die Lösung wird in einem Kolben mit einem Rührfisch präpariert. Um den Copolymer vollständig zu lösen, wird empfohlen, daß die Mischung über Nacht bei 60°C gerührt wird.
Schritt B. Elektrostatisches Spinnen
Der elektrostatische Spinner wurde für dieses Experiment verwendet. Spellman High Voltage DC Supply (Modell Nr. RHR30PN30, Spellman High Voltage Electronics Corporation, Hauppauge, NJ, USA) wurde als Hochspannungs-Welle verwendet. Die angelegte Spannung und die Geschwindigkeit der Spindel wurden durch die Labview-Computer-Software kontrolliert. Die Entfernung zwischen der Spinndüse wurde mechanisch kontrolliert.
Ein flaches Tuch von lyophilisiertem 60/40 PLA/PCL-Schaumstoff, der wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, wurde auf einen Zylinder gerollt. Die Enden wurden durch mehrere Tropfen Trichlorethan (TCE), das zum Spinnen verwendete Lösungsmittel, zusammen gesichert. Die Schaumstoff-Röhre wurde auf einer rotierenden leitfähigen Spindel, die geerdet war, befestigt. Die Enden der Spindel, die nicht durch das Schaumstoff-Substrat bedeckt waren, wurden mit einem isolierenden Band maskiert, um die Anziehung der Mikrophasern an die Enden zu verhindern. Die Lösung wurde in eine Spinndüse gegeben und hohe Spannung wurde an die Polymer-Lösung angelegt. Dieses Experiment wurde bei Raumtemperatur und – feuchtigkeit durchgeführt.
Die Betriebsbedingungen während des Spinnens waren wie folgt:

Spindel-Spannung 16.000 V

Spindel-Geschwindigkeit 100 U/Min

Entfernung zwischen Spinndüse und Spindel 10 cm

Temperatur Raumtemperatur

Feuchtigkeit Umgebungsfeuchtigkeit
Eine Schicht von ungefähr 200 μm Dicke wurde auf die äußere Oberfläche der Röhre aufgebracht.
Beispiel 12
Chondrocyten, die in einer eingekapselten hybriden Schaumstoff/Gewebe-Struktur kultiviert werden, demonstrieren die Limitation der Zellmigration
Schritt A. Präparation von hybriden 60/40 PLA/PCL Schaumstoff/mikrofibrösen Gewebe-Gerüsten
Lyophilisierte Schaumstoffe, die aus 60/40 PLA/PCL, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurden, wurden als Substrate während des elektrostatischen Spinnens von 60/40 PLA/PCL in Trichlorethan, wie im Detail in Beispiel 11 beschrieben, verwendet.
Schritt B. Chondrocyten-Aussäen in das hybride 60/40 PLA/PCL Schaumstoff-mikrofibröse Gewebe-Gerüst
Chondrocyten, die von bovinen Schultern isoliert wurden, wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (hohe Glucose), supplementiert mit 10% fötalem Kalbserum, 10 mM HEPES, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 20 μg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B kultiviert.
3D Transmigrations-Assay:
Dieser Assay basiert auf einem Zell-populierten, kontrahierten Collagen-Gitter mit einem bioabbaubaren Polymer-Gerüst, das in das Zentrum des Collagen-Gels implantiert ist. Die dermalen Äquivalente (Collagen-Gitter) wurden aus einer Mischung aus folgendem hergestellt: 8 ml Chondrocyten-Medien, 2 ml neutralisierendes Medium (DMEM/10% FBS, enthaltend 0,1 NaOH, vor der Verwendung hergestellt), 4 ml Rattenschwanz Typ I-Collagen (3,99 mg/ml), das von Collaborative Biomedical Products erhalten wurde, und 2 ml Chondrocyten-Suspension im Chondrocyten-Medium. Die obige Zell-/Collagen-Mischung wurde in jedes Well einer 24 Well Hydrogel-beschichteten Platte (Costar, Kat. -Nr. 3473) verteilt. Die End-Zell-Konzentration betrug 6 × 10⁶ Zellen/ml und die Collagen-Konzentration betrug 1 mg/ml. Den Collagen-Gelen wurde erlaubt, bei 37°C für 1 Stunde zu polymerisieren. Nach der Gel-Polymerisation wurde 1,5 ml Chondrocyten-Wachstumsmedium in jedes Well gegeben. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Nach 7 Tagen Kontraktion wurden Wunden mit einem Durchmesser von 5 mm durch die Dicke des Collagen-Gitters unter der Verwendung eines wegwerfbaren 5 mm Biopsie-Ausstanzers gemacht. Getestete Gerüste, ungefähr 5 mm im Durchmesser und 2 mm dick, geliefert in einer feuchten Form, wurden in ein Zentrum des verwundeten Collagen-Gitters implantiert. Um sicherzustellen, daß das Gerüst nicht aus dem Wundbett während der Kontraktion des Collagen-Gitters herausgedrückt würde, wurden 50 μl azelluläres Collagen auf jedes Konstrukt gegeben. Die Konstrukte wurden in Chondrocyten-Medium kultiviert, wobei das Medium in einem 2-Tages-Intervall gewechselt wurde. Die kontrahierten Gele, die das Gerüst enthielten, wurden entweder statisch in ultraniedrigen Kluster-Gefäßen oder in dem Bioreaktor kultiviert und nach 3 Wochen gesammelt.
Schritt C. Zell-Charakterisierung innerhalb der Gerüste
Histologie wurde an den Gerüsten, in die Zellen eingewandert waren, durchgeführt. Die Gerüste wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert und entweder in Paraffin eingebettet und sektioniert (Hybrid-Schaumstoff/mikrofibröse Gewebe-Gerüste) oder cryosektioniert (Kontroll-Schaumstoff-Gerüste). Die Sektionen wurden mit Hematoxylin/Eosin (H/E, Zellnummer und Morphologie), Safranin O (SO, sulfatierte GAGs) und Trichrom (Collagen) gefärbt. Die Quantifizierung der Zell-Einwanderung in diese Gerüste wurde durch Bildanalyse durchgeführt. Die Analyse der Varianz mit dem Tukey-post-hoc-Test wurde an den Daten durchgeführt.
Experimentelle Ergebnisse
Die quantitative Evaluierung der H/E-Sektionen der Konstrukte, die für 3 Wochen kultiviert wurden, machte deutlich, daß Chondrocyten in beide Gerüste eingewandert waren. Die Zell-Einwanderung in die hybriden Schaumstoff/mikrofibrösen Gewebe-Gerüste, die in dem Bioreaktor kultiviert wurden, war signifikant höher (P < 0,05) im Vergleich zu den 40/60 PCL/PLA-Schaumstoff-Gerüsten. Auch in den statisch gehaltenen Kulturen war die Zell-Einwanderung in die hybriden Schaumstoff/mikrofibrösen Gewebe-Gerüste signifikant höher (P < 0,05) als in die 40/60 PCL/PLA-Schaumstoff-Gerüste.
Hybride Schaumstoff/mikrofibröse Gewebe-Gerüste zeigten die größte Zelldichte. Wir stellen die Hypothese auf, daß Zell-Zell-Interaktionen, die vermutlich höher sind im Falle von hybriden Schaumstoff/mikrofibrösen Gewebe-Gerüsten im Vergleich zu dem anderen Gerüst, zu der bevorzugten Chondrocyten-Proliferation und differenzierten Funktionen von hybriden Schaumstoff/mikrofibrösen Gewebe-Gerüsten beigetragen haben können. Es wird postuliert, daß die Zell-Zell-Interaktionen eine kritische Rolle bei der Aufrechterhaltung des Chondrocyten-Phenotyps spielen.
Von Chondrocyten ist bekannt, daß sie dedifferenzieren, wenn sie in einer Zell-Monoschicht expandieren. Wenn sie in Monoschicht bei hoher Zelldichte kultiviert werden, erhalten Chondrocyten ihren Phänotyp aufrecht, wie durch Expression von Typ II-Collagen und Aggrecan indiziert.
Nach 6 Wochen zeigten 40/60 PCL/PLA-Schaumstoff-Gerüste Knorpel-ähnliche Morphologie-Eigenschaften, lokalisiert hauptsächlich innerhalb der Kapsel um das Konstrukt. Im Gegensatz dazu war die Kapsel in den hybriden Schaumstoff/mikrofibrösen Gewebe-Gerüsten sehr dünn und die Zell-Morphologie in den Konstrukten war Knorpel-ähnlich und eine einheitlichere Verteilung der Zellen wurde beobachtet.

Claims

Biokompatible Komposite, umfassend eine erste biokompatible filamentöse Schicht, die an eine zweite biokompatible Schaumstoff-Schicht angelagert ist, wobei der biokompatible Schaumstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gradienten-Schaumstoffen und kanalisierten Schaumstoffen; wobei der Gradienten-Schaumstoff einen ersten Ort und einen zweiten Ort hat, wobei der biokompatible Gradienten-Schaumstoff einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in mindestens einem Merkmal hat, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zusammensetzung, Steifheit, Flexibilität, Bioabsorptionsrate und Porenbauweise von dem ersten Ort zu dem zweiten Ort des biokompatiblen Gradienten-Schaumstoffs und der kanalisierte Schaumstoff eine erste Oberfläche und eine zweite Oberfläche mit Kanälen dazwischen hat.
Biokompatible Komposite von Anspruch 1, wobei der biokompatible Schaumstoff bioabsorbierbar ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 1, wobei die biokompatible filamentöse Schicht bioabsorbierbar ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 1, wobei die biokompatible Komposite aus einem bioabsorbierbaren Polymer hergestellt ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aliphatischen Polyestern, Poly(Aminosäuren), Copoly(Etherestern), Polyalkylenen Oxalaten, Polyamiden, Poly(Iminocarbonaten), Polyorthoestern, Polyoxaestern, Polyamidoestern, Polyoxaestern, enthaltend Aminogruppen, Poly(Anhydriden), Polyphosphazenen, Biopolymeren und Mischungen davon.
Biokompatible Komposite von Anspruch 4, wobei das bioabsorbierbare Polymer ein aliphatischer Polyester ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 5, wobei der aliphatische Polyester ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Homopolymeren und Copolymeren von Lactid, Milch säure, Glykolid, Glykolsäure, ε-Caprolacton, p-Dioxanon (1,4-Dioxan-2-on), Trimethylencarbonat (1,3-Dioxan-2-on), Alkylderivaten von Trimethylencarbonat, δ-Valerolacton, β-Butyrolacton, γ-Butyrolacton, ε-Dekalacton, Hydroxybutyrat, Hydroxyvalerat, 1,4-Dioxepan-2-on, 1,5,8,12-Tetraoxacyclotetradecan-7,14-dion, 1,5-Dioxepan-2-on, 6,6-Dimethyl-1,4-Dioxan-2-on und Polymer-Mischungen davon.
Biokompatible Komposite von Anspruch 5, wobei der aliphatische Polyester ein Elastomer ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 7, wobei das Elastomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Copolymeren von ε-Caprolacton und Glykolid; Copolymeren von ε-Caprolacton und (L)-Lactid, Copolymeren von p-Dioxanon (1,4-Dioxan-2-on) und (L)-Lactid, Copolymeren von ε-Caprolacton und p-Dioxanon, Copolymeren von p-Dioxanon und Trimethylencarbonat, Copolymeren von Trimethylencarbonat und Glykolid, Copolymer von Trimethylencarbonat und (L)-Lactid und Mischungen davon.
Biokompatible Komposite von Anspruch 5, wobei als ein Bestandteil des biokompatiblen Schaumstoffes zusätzlich ein zweiter aliphatischer Polyester vorhanden ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 5, wobei als ein Bestandteil der biokompatiblen filamentösen Schicht zusätzlich ein zweiter aliphatischer Polyester vorhanden ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 4, wobei der biokompatible Gradienten-Schaumstoff einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in der Zusammensetzung von dem ersten Ort zu dem zweiten Ort aufweist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 11, wobei der biokompatible Gradienten-Schaumstoff einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in der Zusammensetzung von einem ersten Verhältnis von mindestens zwei verschiedenen aliphatischen Polyestern zu einem zweiten Verhältnis von den mindestens zwei verschiedenen aliphatischen Polyestern von der ersten Oberfläche zu der zweiten Oberfläche hat.
Biokompatible Komposite von Anspruch 4, wobei der biokompatible Gradienten-Schaumstoff einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in der Steifheit von dem ersten Ort zu dem zweiten Ort hat.
Biokompatible Komposite von Anspruch 4, wobei der biokompatible Gradienten-Schaumstoff einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in der Bioabsorptionsrate von dem ersten Ort zu dem zweiten Ort hat.
Biokompatible Komposite von Anspruch 4, wobei der biokompatible Gradienten-Schaumstoff einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in der Flexibilität von dem ersten Ort zu dem zweiten Ort hat.
Biokompatible Komposite nach Anspruch 4, wobei der biokompatible Gradienten-Schaumstoff einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in der Bauweise von dem ersten Ort zu dem zweiten Ort hat.
Biokompatible Komposite von Anspruch 16, wobei der biokompatible Gradienten-Schaumstoff einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in der Bauweise von einer im wesentlichen sphärischen Porengestalt zu einer säulenartigen Porengestalt von dem ersten Ort zu dem zweiten Ort hat.
Biokompatible Komposite von Anspruch 16, wobei die Größe der im wesentlichen sphärischen Pore von 30 μm bis 150 μm ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 16, wobei der Durchmesser der säulenartigen Pore von 100 μm bis 400 μm mit einem Längen-zu-Durchmesser-Verhältnis von mindestens 2 ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 1, wobei in der biokompatiblen Komposite auch ein therapeutisches Mittel vorhanden ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 1, wobei zusätzlich ein Mittel vorhanden ist, das aus gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antiinfektiva, Hormonen, Analgetika, anti inflammatorischen Mitteln, Wachstumsfaktoren, chemoterapeutischen Mitteln, Anti-Abstoßungs-Mitteln, Prostaglandinen, RDG-Peptiden und Kombinationen davon.
Biokompatible Komposite von Anspruch 21, wobei der Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Knochen-morphogenetischen Proteinen, Knochenmorphogenetisch-artigen Proteinen, epidermalem Wachstumsfaktor, Fibroplasten-Wachstumsfaktoren, Plättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor, Insulin-artigem Wachstumsfakor, transformierenden Wachstumsfaktoren, vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor und Kombinationen davon.
Biokompatible Komposite von Anspruch 1, wobei der biokompatible kompatible Schaumstoff mit einem biokompatiblen Material gefüllt ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bioabsorbierbaren synthetischen Polymeren, biokompatiblen, bioabsorbierbaren Biopolymeren, biokompatiblen keramischen Materialien und Kombinationen davon.
Biokompatible Kompositen von Anspruch 1, wobei der kanalisierte Schaumstoff Kanäle mit einer durchschnittlichen Länge von mindestens 200 μm aufweist.
Biokompatible Kompositen von Anspruch 24, wobei sich die Kanäle im Wesentlichen von der ersten Oberfläche zu der zweiten Oberfläche erstrecken.
Biokompatible Komposite von Anspruch 1, wobei der biokompatible Schaumstoff verbundene Poren aufweist, die von einer Zusammensetzung gebildet werden, die im Bereich von 30 Gewichtsprozent bis 99 Gewichtsprozent wiederholende ε-Caprolacton-Einheiten enthält.
Biokompatible Komposite von Anspruch 26, wobei die wiederholenden ε-Caprolacton-Einheiten mit einem Comonomer copolymerisiert sind, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lactid, Milchsäure, Glykolid, Glykolsäure, p-Dioxanon (1,4-Dioxan-2-on), Trimethylencarbonat (1,3-Dioxan-2-on), Alkylderivaten von Trimethylencarbonat, δ-Valerolacton, β-Butyrolacton, γ-Butyrolacton, ε-Dekalacton, Hydroxybutyrat, Hydroxyvalerat, 1,4-Dioxepan-2-on, 1,5,8,12-Tetraoxacyclotetradecan-7,14-dion, 1,5-Dioxepan-2-on, 6,6-Dimethyl-1,4-dioxan-2-on und Polymer-Mischungen davon.
Biokompatible Komposite von Anspruch 26, die einen ersten Ort und einen zweiten Ort hat, wobei der biokompatible Schaumstoff einen im wesentlichen kontinuierlichen Übergang in mindestens einer Eigenschaft hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zusammensetzung, Steifheit, Flexibilität, Bioabsorptionsrate und Poren-Bauweise von dem ersten Ort zu dem zweiten Ort des biokompatiblen Schaumstoffs.
Biokompatible Komposite von Anspruch 26, wobei die verbundenen Poren eine Porengröße im Bereich von 10 μm bis 200 μm haben.
Biokompatible Komposite von Anspruch 26, wobei der biokompatible Schaumstoff eine Porosität im Bereich von 20 bis 98% hat.
Biokompatible Komposite von Anspruch 26, wobei der biokompatible Schaumstoff Kanäle hat.
Biokompatible Kompositen von Anspruch 31, wobei die Kanäle eine durchschnittliche Länge von mindestens 200 μm haben.
Biokompatible Komposite von Anspruch 26, wobei die Größe der im wesentlichen sphärischen Poren von 30 μm bis 150 μm ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 26, wobei der Durchmesser der säulenartigen Poren von 30 μm bis 400 μm mit einem Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von mindestens 2 ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 26, wobei in dem biokompatiblen Schaumstoff auch ein therapeutisches Mittel anwesend ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 1, wobei der biokompatible Schaumstoff mit einer Einfügung innerhalb des biokompatiblen Schaumstoffs gebildet ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 36, wobei die Einfügung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Filmen, Baumwollstoffen, gewebten Textilien, gestrickten Textili en, umsponnenen Textilien, orthopädischen Implantaten, Röhren und Kombinationen davon.
Biokompatible Komposite von Anspruch 1, wobei die biokompatible Komposite in eine dreidimensional geformte Struktur geformt ist.
Biokompatible Komposite von Anspruch 38, wobei die dreidimensional geformte Struktur ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus röhrenförmigen Formen, verzweigten röhrenförmigen Formen, sphärischen Formen, hemisphärischen Formen, dreidimensional polygonalen Formen, ellipsoiden Formen, toroidischen Formen, konischen Formen, abgestumpft konischen Formen, pyramidalen Formen, jeweils als feste und hohle Konstrukte und Kombinationen davon.
Ex vivo Verfahren für die Reparatur oder Regeneration von Gewebe, umfassend in Kontakt bringen von Zellen mit einer biokompatiblen Komposite gemäß einem der Ansprüche 1 bis 39.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Zellen auf die biokompatible Komposite gesät werden.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die biokompatible Komposite mit Zellen gesät wird und die biokompatible Komposite und Zellen in eine Zell-kultivierende Vorrichtung gegeben werden und den Zellen erlaubt wird, sich auf der biokompatiblen Komposite zu vervielfachen.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus pluripotenten Zellen, Stammzellen, Vorläuferzellen und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Myocyten, Adipocyten, Fibromyoblasten, ektodermalen Zellen, Muskelzellen, Osteoblasten, Chondrocyten, endothelialen Zellen, Fibroblast, pankreatischen Zellen, Hepatocyten, Gallengangzellen, Knochenmarkzellen, neuralen Zellen, Genito-urinären Zellen und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die biokompatible Komposite ein Mittel enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antiinfektiva, Hormonen, Analgetica, antiinflammatorischen Mitteln, Wachstumsfaktoren, chemotherapeutischen Mitteln, Anti-Abstoßungs-Mitteln, Prostaglandinen, RDG-Peptiden und Kombinationen davon.
Biokompatible Komposite gemäß einem der Ansprüche 1 bis 39 zur Verwendung in der Reparatur und Regeneration von Gewebe.