CN108939162B - 一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法 - Google Patents

一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种介孔生物玻璃/海藻酸钠‑海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，包括一个制备海藻酸钠墨水的步骤；一个制备介孔生物玻璃/海藻酸钠复合墨水的步骤；一个设计介孔生物玻璃/海藻酸钠‑海藻酸钠分层骨组织工程支架的外观和内部结构的步骤；一个采用三维打印技术制备介孔生物玻璃/海藻酸钠‑海藻酸钠分层骨组织工程支架的步骤。细胞实验结果表明，采用本发明的方法制备的介孔生物玻璃/海藻酸钠‑海藻酸钠分层支架具有优异的促进人体骨髓间充质干细胞hBMSCs增殖及分化的能力，表现出优异的生物活性。

Description

一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架 的制备方法
技术领域
本发明属于材料学领域，涉及一种骨组织工程支架，具体来说是一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法。
背景技术
目前，由于肿瘤切除，先天性疾病，感染和外伤等造成的骨组织缺损是临床常见病症。应用骨组织工程支架对缺损部位进行修复治疗被认为是解决相关问题的有效方法之一。由于骨移植手术后易引起一系列感染、炎症及疼痛问题，因此单纯的支架材料难以满足理想骨修复材料的要求。如能在植入体材料中直接装载药物，并在植入后进行原位局部释放，不仅可以通过药物的原位释放抵御病变细胞的转移和扩散，也可以针对相关病症加以治疗。因此，寻找适宜的生物材料，制备成所需的骨修复植入支架并装载特定的药物是研究的热点与难点。海藻酸钠是一种常用的天然高分子材料，它具备良好的生物相容性与降解能力，在温和条件下(室温或生理温度)能够与二价阳离子(如钙离子、钡离子等)交联形成凝胶态，可作为组织工程的载体材料装载药物、蛋白质和大量的细胞或生长因子。介孔生物活性玻璃作为新型的生物医用活性陶瓷材料，具有优良的矿化成骨性能，而且其独特的介孔结构可以作为药物载体实现药物缓释，从而进一步发挥其骨修复应用潜力。研究表明添加介孔生物玻璃的海藻酸钠的机械强度、生物活性和成骨能力都有明显提高，并且在体液中具有较强的稳定性。更为重要的是，海藻酸钠水凝胶可以装载消炎类药物或抗免疫排斥药物，并因在生理环境中可快速降解儿实现药物快速释放，发挥药效；而添加介孔生物玻璃的海藻酸钠可以在介孔生物玻璃的孔道中装载止痛或抗菌药物，由于介孔生物玻璃的药物缓释能力使其能在生理环境中持续缓慢释放药物，保证长期药效。因此，结合介孔生物玻璃和海藻酸钠制备出兼顾结构力学、生物活性和载药的多孔分层支架，有望应用于骨缺损修复治疗领域。
三维打印快速成型技术由于其便捷、快速、可操控性强的突出优点及构建复杂形状和结构的能力，在组织工程支架制备领域表现出无可比拟的优势。
在现有技术背景下，采用三维打印技术制备介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架，其中介孔生物活性玻璃/海藻酸钠层装载止痛或抗菌药物，海藻酸钠层装载消炎类或抗免疫排斥药物，这种分层支架有望为骨缺损修复治疗及克服骨发炎、骨感染，实现骨功能重建开辟新的途径。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供了一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，所述的这种分层支架的制备方法要解决现有技术中制备单纯海藻酸钠支架具有机械强度低，骨传导性差、药物释放快等问题。
本发明提供了一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
1)一个制备介孔生物玻璃粉体的步骤，将介孔生物玻璃球磨粉碎，并过200～800目筛子，使介孔生物玻璃粉体的颗粒直径范围为22～70微米，干燥保存备用；
2)一个制备海藻酸钠墨水的步骤，将海藻酸钠溶于去离子水，37℃磁力搅拌1～6小时，配制成质量分数为5～10％或者20％～30％的溶液，密封保存备用；
3)一个制备介孔生物玻璃/海藻酸钠复合墨水的步骤，将步骤1)得到的介孔生物玻璃粉体加入到质量百分比浓度为5～10％的海藻酸钠溶液中，介孔生物玻璃粉体和海藻酸钠溶液的质量比为1.0～5.0，搅拌均匀配制成打印墨水，密封保存备用；
4)设计介孔生物活性玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的外观和内部结构的步骤；
5)一个采用三维打印技术制备介孔生物活性玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的步骤，将步骤2)所得质量分数为20％～30％的海藻酸钠墨水与步骤3)得到的介孔生物玻璃/海藻酸钠复合墨水装进三维打印机的料筒中，针头直径为100～1000微米；启动三维打印程序，调节气压为0.6～3.2bar，打印速度为2.0～8.0mm/s，墨水相邻两层走向夹角为0°～180°，孔径为50～1200微米，将墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中；先打印介孔生物玻璃/海藻酸钠复合层，再打印海藻酸钠水凝胶层，接着再打印介孔生物玻璃/海藻酸钠复合层，依次沉积得到介孔生物活性玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层结构；
6)冻干后处理步骤，将步骤5)得到的分层支架置于零下70摄氏度的超低温冰箱中，冷冻5-10小时，再将其置于冷冻干燥机中冻干24小时；
7)一个采用氯化钙溶液进行交联的步骤，将步骤6)得到的分层支架置于5wt％～10wt％的氯化钙溶液中，交联30分钟后，取出采用去离子水洗涤，再置于零下70摄氏度的超低温冰箱中，冷冻5-10小时，再将其置于冷冻干燥机中冻干24小时，得到所需的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架。
进一步的，所述的海藻酸钠溶液中的溶剂为去离子水。
进一步的，在所述的海藻酸钠墨水中含有药物。
进一步的，在所述的介孔生物玻璃/海藻酸钠层复合墨水中含有药物。
进一步的，在所述的海藻酸钠层墨水中含有消炎类或抗免疫排斥药物，具体为牛血清白蛋白等。
进一步的，在所述的介孔生物玻璃/海藻酸钠层复合墨水中含有止痛或抗菌药物，具体为布洛芬等。
进一步的，在设计介孔生物活性玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的外观和内部结构的步骤中，利用CAD和CAM软件设计支架为圆柱体或者长方体外观结构，内部具有多孔结构，圆柱体支架外观最大尺寸为
Figure BDA0001725700790000031
h＝10cm，其直径和高度在最大尺寸范围内可根据需要调节；长方体支架外观最大尺寸为10cm×10cm×10cm，其长、宽和高在最大尺寸范围可根据需要调节，支架内部相邻两层的墨水走向夹角可为0°～180°之间任意角度，孔径为50～1200微米。
本发明的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架，采用三维打印快速成型技术，将介孔生物玻璃的优异的成骨性能和海藻酸钠优异的生物学性能相结合，制备出三维多孔复合支架。对所述分层支架的理化性能和生物学性能测试结果表明，支架具有三维连通且可控的大孔结构，孔隙率在40％至80％可调，具有优异的力学性能，在模拟体液中能够诱导羟基磷灰石形成，且对人体骨髓间质干细胞的增殖、分化和成骨起促进作用。
采用本发明的方法制备的支架具有分层的结构，孔隙三维连通且可控，孔隙率在40％至80％可调。分层支架的主体材料和粘结剂均为海藻酸钠，通过钙离子一体化交联可以获得层间结合力。其中海藻酸钠水凝胶层可装载消炎类药物或抗免疫排斥药物并快速释放；介孔生物玻璃/海藻酸钠复合层装载抗菌止痛类药物，呈现缓慢释放能力。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。细胞实验结果表明，介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层支架具有优异的促进人体骨髓间充质干细胞hBMSCs增殖及分化的能力，表现出优异的生物活性。通过本发明的方法制备得到的分层骨组织工程支架有望为临床上骨缺损的修复治疗带来新的契机。
附图说明
图1是实施例1所制备的海藻酸钠、介孔生物玻璃/海藻酸钠、介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠的分层支架干湿态侧面图。A1，B1，C1为打印后海藻酸钠支架、介孔生物玻璃/海藻酸钠支架、介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层支架侧面图；A2，B2，C2为交联冻干后海藻酸钠支架、介孔生物玻璃/海藻酸钠支架、介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层支架侧面图
图2是实施例1所制备的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架培养人体骨髓间充质干细胞后的荧光染色照片。A1，B1，C1为培养1天；A2，B2，C2为培养4天；C1，C2，C3为培养7天。
图3是实施例2所制备的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的药物释放情况。(A)为药物在支架中的分布情况示意图；(B)为BSA和IBU两种药物在模拟体液中的释放曲线。
具体实施方式
为了使相关领域研究人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，制备介孔生物玻璃粉体：采用挥发诱导自组装方法制备具有良好介孔孔道的生物活性玻璃块体(摩尔比SiO2:CaO:P2O5＝80:15:5)，然后将介孔生物玻璃块球磨粉碎，并过400目筛子，其颗粒尺寸小于37微米，干燥保存备用。
步骤二，配制海藻酸钠层墨水：将将海藻酸钠溶于去离子水中(质量分数为25％)，磁力搅拌得到混合均匀的海藻酸钠墨水用于后续三维打印。
步骤三，配制介孔生物玻璃/海藻酸钠层复合墨水：将海藻酸钠溶于去离子水中，得到质量分数为10％的溶液，将步骤一得到的介孔生物玻璃粉体加入到10％的海藻酸钠溶液中混合均匀(介孔生物玻璃与海藻酸钠的质量比为2：1)。将混合好的打印墨水过400目的筛网，得到混合均匀的介孔生物玻璃/海藻酸钠复合墨水用于后续三维打印。
步骤四，设计介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的外观和内部结构：利用CAD/CAM相关软件设计长方体型多孔结构的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层支架，其外观尺寸为10cm×10cm×10cm，内部相邻层墨水走向夹角为90°。
步骤五，三维打印介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架：利用三维打印机(EnvisionTEC，Germany)按设定的模型进行打印，启动三维打印程序，调节气压为2.0bar，打印速度为5mm/s，孔径为200微米，将墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中，其中先打印介孔生物玻璃/海藻酸钠墨水，再打印海藻酸钠墨水，按此顺序重复打印得到介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠(MBG/SA-SA)分层支架。
步骤六，后处理：将步骤五打印得到的支架置于超低温冰箱中(-70℃)，随后冷冻干燥12小时。将冻干后的支架置于2wt％的CaCl2溶液中交联30分钟，随后采用去离子水轻轻洗涤数次，将交联后的支架再次置于超低温冰箱中(-70℃)冷冻，随后冷冻干燥12小时，得到介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠(MBG/SA-SA)分层支架。
结果如图1和图2所示，实施例1所制备的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架具有规则有序的三维大孔结构，分层支架的主体材料和粘结剂均为海藻酸钠，通过钙离子一体化交联可以获得层间结合力。将人体骨髓间充质干细胞放置于支架上进行体外培养后发现，细胞能在支架表面粘附及生长，表明分层支架具有良好的生物相容性。
实施例2药物装载及释放实例
一种装载药物的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，配制装载牛血清白蛋白(BSA)的海藻酸钠层墨水：将BSA溶于去离子水中形成均匀的溶液，再将海藻酸钠溶解于其中，得到装载BSA的海藻酸钠层墨水，海藻酸钠的质量分数为25％，BSA的质量分数为2％。
步骤二，配制装载布洛芬药物(IBU)的介孔生物玻璃/海藻酸钠层复合墨水：将IBU溶解于少量无水乙醇中，再加入去离子水，使其浓度为50毫克/毫升。接着将2.0克介孔生物玻璃粉体加入到100毫升的IBU溶液中室温搅拌24小时，然后离心分离，取上层液测试其吸光度，根据比尔-朗伯定律计算介孔生物玻璃的药物装载量。将离心得到的粉体放在37℃的真空干燥箱中真空干燥24小时，最后得到载药的介孔生物玻璃粉体。将载药的介孔生物玻璃粉体与10％的海藻酸钠溶液混合均匀(介孔生物玻璃与海藻酸钠的质量比为2：1)后得到装载药物的介孔生物玻璃/海藻酸钠复合墨水。
步骤三，设计载药介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的外观和内部结构：利用CAD/CAM相关软件设计长方体型多孔结构的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层支架，其外观尺寸为10cm×10cm×10cm，内部相邻层墨水走向夹角为90°。
步骤四，三维打印装载两种不同药物的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠层骨组织工程支架：利用三维打印机(EnvisionTEC，Germany)按设定的模型进行打印，启动三维打印程序，调节气压为2.0bar，打印速度为5mm/s，孔径为200微米，将墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中，其中先打印载药介孔生物玻璃/海藻酸钠墨水，再打印载药海藻酸钠墨水，按此顺序重复打印得到载药介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠(MBG/SA-SA)分层支架。
步骤五，后处理：将打印得到的载药分层支架置于超低温冰箱中(-70℃)，随后冷冻干燥12小时。将冻干后的支架置于2wt％的CaCl2溶液中交联30分钟。随后去离子水轻轻洗涤数次，将交联后的支架再次置于超低温冰箱中冷冻(-70℃)，随后冷冻干燥12小时，得到载药介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层支架。
结果如图3所示，实施例2所制备的载药介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架，其中海藻酸钠层装载的模拟药物BSA快速释放，24小时内释放可达89％；而介孔生物玻璃/海藻酸钠层装载的模拟药物IBU呈现缓慢释放能力，180小时后释放装载药物总量的75％，这归因于介孔生物玻璃介孔孔道对药物释放的限域效应。装载不同药物且能够实现快速释放与长效缓释两种释放模式，使得介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层支架在骨组织工程领域中具有巨大的应用潜力。

Claims (7)

1.一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)一个制备介孔生物玻璃粉体的步骤，将介孔生物玻璃球磨粉碎，并过200～800目筛子，使介孔生物玻璃粉体的颗粒直径范围为22～70微米，干燥保存备用；
2)一个制备海藻酸钠墨水的步骤，将海藻酸钠溶于去离子水，37℃磁力搅拌1～6小时，配制成质量分数为5～10％或者20％～30％的溶液，密封保存备用；
3)一个制备介孔生物玻璃/海藻酸钠复合墨水的步骤，将步骤1)得到的介孔生物玻璃粉体加入到质量百分比浓度为5～10％的海藻酸钠溶液中，介孔生物玻璃粉体和海藻酸钠溶液的质量比为1.0～5.0，搅拌均匀配制成打印墨水，密封保存备用；
4)设计介孔生物活性玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的外观和内部结构的步骤；
5)一个采用三维打印技术制备介孔生物活性玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的步骤，将步骤2)所得质量分数为20％～30％的海藻酸钠墨水与步骤3)得到的介孔生物玻璃/海藻酸钠复合墨水装进三维打印机的料筒中，针头直径为100～1000微米；启动三维打印程序，调节气压为0.6～3.2bar，打印速度为2.0～8.0mm/s，墨水相邻两层走向夹角为0°～180°，孔径为50～1200微米，将墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中；先打印介孔生物玻璃/海藻酸钠复合层，再打印海藻酸钠水凝胶层，接着再打印介孔生物玻璃/海藻酸钠复合层，依次沉积得到介孔生物活性玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层结构；
6)冻干后处理步骤，将步骤5)得到的分层支架置于零下70摄氏度的超低温冰箱中，冷冻5-10小时，再将其置于冷冻干燥机中冻干24小时；
7)一个采用氯化钙溶液进行交联的步骤，将步骤6)得到的分层支架置于5wt％～10wt％的氯化钙溶液中，交联30分钟后，取出采用去离子水洗涤，再置于零下70摄氏度的超低温冰箱中，冷冻5-10小时，再将其置于冷冻干燥机中冻干24小时，得到所需的介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述的海藻酸钠溶液中的溶剂为去离子水。
3.根据权利要求1所述的一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，其特征在于：在所述的海藻酸钠墨水中含有药物。
4.根据权利要求1所述的一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，其特征在于：在所述的介孔生物玻璃/海藻酸钠层复合墨水中含有药物。
5.根据权利要求1所述的一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，其特征在于：在所述的海藻酸钠层墨水中含有消炎类或抗免疫排斥药物。
6.根据权利要求1所述的一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，其特征在于：在所述的介孔生物玻璃/海藻酸钠层复合墨水中含有止痛或抗菌药物。
7.根据权利要求1所述的一种介孔生物玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的制备方法，其特征在于：在设计介孔生物活性玻璃/海藻酸钠-海藻酸钠分层骨组织工程支架的外观和内部结构的步骤中，利用CAD和CAM软件设计支架为圆柱体或者长方体外观结构，内部具有多孔结构，圆柱体支架外观最大尺寸为
Figure FDA0001725700780000021
h＝10cm，其直径和高度在最大尺寸范围内可根据需要调节；长方体支架外观最大尺寸为10cm×10cm×10cm，其长、宽和高在最大尺寸范围可根据需要调节，支架内部相邻两层的墨水走向夹角可为0°～180°之间任意角度，孔径为50～1200微米。
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