DE60107556T2

DE60107556T2 - Gene für denitrifizierende enzyme

Info

Publication number: DE60107556T2
Application number: DE60107556T
Authority: DE
Inventors: Martin J. ODOM; Christine Kelley NORTON; J. Andreas SCHENZLE; W. Rick YE
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-22
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2021-02-23
Also published as: ATE283923T1; EP1272639A2; US7049115B2; DE60107556D1; AU2001243259A1; US20050084945A1; WO2001064898A2; EP1272639B1; CA2401484A1; WO2001064898A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der mikrobiellen Denitrifikation. Genauer gesagt betrifft diese Erfindung Nucleinsäurefragmente, die Enzyme codieren, die für mikrobielle Denitrifikation verwendbar sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der vollständige Weg für mikrobielle Denitrifikation ist ermittelt worden NO₃ ^– → NO₂ ^– → NO → N₂O → N₂ (Ye et al., Appl. Environ. Microbiol. 60:1053–1058 (1994); Zumft et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61:533-616 (1997)). Bei der bakteriellen Denitrifikation wird in zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen, katalysiert durch die zwei Metalloenzyme Nitratreduktase und Nitritreduktase, NO aus NO₃ ^– erzeugt und wird dann durch Stickstoffoxidreduktase zu N₂O abgebaut. Diese typischen Enzyme katalysieren die Umwandlung einer mineralischen Form von Stickstoff zu einer gasförmigen Form. Es wird erkannt, daß gasförmige Formen von Stickstoffverbindungen für Assimilation durch die Biomasse nicht länger leicht verfügbar sind.
Viele aerobe Organismen haben die Fähigkeit, in Abwesenheit von Sauerstoff Nitrat oder Nitrit als terminalen Elektronenakzeptor zu nutzen und so durch einen Prozeß, der als Nitratatmung bekannt ist, anaerob zu wachsen. Die Nitratatmung liefert Energie, welche für Zellwachstum und/oder Erzeugung von Zellprodukten verwendet werden kann (Gottschalk, G., Bacterial Metabolism (Bakterieller Stoffwechsel), S. 122–126, Springer-Verlag (1985)).
Mikrobielle Denitrifikation wird durch eine Reihe von enzymkatalysierten Reaktionen katalysiert, welche zusammen Nitrat reduktiv in gasförmigen Distickstoff umwandeln. In der natürlichen Umgebung spielt Denitrifikation durch Umwandlung von Nitrat oder Nitrit in Stickstoffgas eine Hauptrolle bei dem Abschluß des Stickstoffkreislaufs. In dem Denitrifikationsprozeß verwenden die Bakterien Nitrat statt Sauerstoff als letztlichen Elektronenakzeptor in der Reihe von Reaktionen zur Erzeugung einen Transmembranprotonengradienten, die zur Synthese von ATP verwendet wird. Diese stickstoffhaltigen Reaktanten und Produkte definieren chemisch den Umfang des betrachteten Prozesses (Gottschalk, G., Bacterial Metabolism (Bakterieller Stoffwechsel), S. 122–126, Springer-Verlag (1985); Zumft, W. G., Microbiology and Molecular Biology Reviews (Übersichten zu Mikrobiologie und Molekularbiologie), 61:533–616 (1997); Zumft, W. G., The Prokaryotes (Die Prokaryonten) Bd. 1, S. 554–582, Springer-Verlag (1992)). Ökologisch ist das Ergebnis dieser Prozesse die Entfernung von Stickstoff aus Böden (Zumft, W. G., The Denitrifying Prokaryotes (Die denitrifizierenden Prokaryonten). In: The Prokaryotes (Die Prokaryonten) Bd. 1, S. 554–582, Springer-Verlag (1992)).
In praktischen Anwendungen ist mikrobielle Denitrifikation in weitem Umfang für Wasserreinigung verwendet worden (Mateju et al., Enzyme Microb. Technol. 14:172–183 (1992)). Jedoch ist gezeigt worden, daß Distickstoffmonoxid (N₂O) eine schädliche Wirkung auf die stratosphärische Ozonschicht hat (de Boer et al., Eur. J. Biochem. 242:592–600 (1996)). NO_x kann zusammen mit Kohlenmonoxid und Kohlenwasserstoffen zu einer Zunahme in der Menge von stratosphärischem Ozon führen. So ist die Erzeugung von N₂O und Stickstoffoxid (NO) aufgrund unvollständiger Denitrifikation von Bedeutung. Es wird daher nützlich sein, neue und bessere Methoden zur Denitrifikation von industriellen Abfallströmen zu ersinnen, um vollständige Denitrifikation zu bewirken. Die Identifizierung von Genen, die Proteine codieren, die für Schlüsseldenitrifikationsreaktionen verantwortlich sind, wird wesentlich für die Entwicklung verbesserter Denitrifikationsmethoden sein.
Gene, die Enzyme codieren, die in der Denitrifikation verwendbar sind, sind bekannt. Zum Beispiel lehren Palmedo et al. [Eur. J. Biochem. 232 (3), 737–746 (1995)] und Kawasaki et al. [J. Bacteriol. 179 (1), 235–242 (1997)] die Isolierung von nir-Genen aus Pseudomonas, die Nitritreduktase codieren. Ähnlich berichten Lin et al. [J. Bacteriol. 175:2370–2378 (1993)] die Klonierung von nasA- und nasB-Genen aus Klebsiella, welche Enzyme codieren, die an der Atmung mit assimilatorischer Nitrat- und Nitritreduktase beteiligt sind. Außerdem lehren Zumft et al. [Eur. J. Biochem. 219:481–490 (1994)] und Glockner et al. [Biochim. Biophys. Acta 1277 (1–2), 6–12 (1996)] die Isolierung der strukturellen Gene für den Stickstoffoxidreduktasekomplex, norC und norB, aus Pseudomonas stutzeri, und Cramm et al. [J. Bacteriol. 179 (21), 6769–6777 (1997)] diskutieren die Isolierung des norZ-Gens.
Obwohl an Denitrifikation beteiligte Gene gut charakterisiert sind, sind alle aus einer eng fokussierten Gruppe von Gattungen, zum Beispiel Pseudomonas, Klebsiella, Rhodobacter, Rhodococcus, Paracoccus und andere Bakterien, isoliert worden, die typischerweise mit Detoxifikationsprozessen von Boden und Grundwasser verbunden sind. Die Anwesenheit von Genen, die an Denitrifikation in anderen Spezies beteiligt sind, ist selten. Dessenungeachtet haben die Anmelder eine Anzahl von einzigartigen offenen Leserahmen, codierend denitrifizierende Enzyme, aus einer Methylomonas sp. isoliert. Die Literatur vermutet, daß obligate methanotrophe Bakterien einschließlich Methylomonas 16a zu der Gruppe von nitrifizierenden Bakterien gehören (Hanson und Hanson, The Methanotrophic Bacteria (Die methanotrophen Bakterien), Microbiol. Rev. 60:439–471 (1996)). Dies ist auf die Fähigkeit dieser Organismen zurückzuführen, Ammoniak zu oxygenieren, wobei Hydroxylamin erzeugt wird (Ammoniak-Monooxygenase-Reaktion), was der Methan-Monooxygenase-Reaktion analog ist, wobei Methanol erzeugt wird. Das Hydroxylamin wird dann weiter zu Nitrit oxidiert. Die Nitritoxidation zu Nitrat kann enzymatisch oder spontan in Luft über chemische Oxidation erfolgen. Das Wachstum von Methanotrophen auf Nitrat als der einzigen Stickstoffquelle für die Biosynthese an Stelle von Ammoniak ist ebenfalls bekannt (Lidstrom, L.E., The aerobic methylotrophic bacteria (Die aeroben methylotrophen Bakterien). The Prokaryotes (Die Prokaryonten), Springer-Verlag, S. 431–445 (1992)). Jedoch sind Denitrifikationsprozesse bei Methanotrophen nicht berichtet worden. Die Literatur gibt weiter an, daß methanotrophe Bakterien zu Reaktionen wie beispielsweise Nitratassimilation und Nitrifikation imstande sind, aber der Vorgang der Nitratatmung (Denitrifikation) ist in den obligaten Methanotrophen in einem großen oder bedeutendem Maßstab nicht gefunden worden.
Das zu lösende Problem besteht daher in der Bereitstellung neuer Gene und Enzyme, die für die Durchführung von Denitrifikationsreaktionen verwendbar sind.
Die Anmelder haben das festgestellte Problem durch Isolierung eines Genclusters gelöst, der 11 offene Leserahmen (ORFs) enthält, die Enzyme codieren, die an mikrobieller Denitrifikation beteiligt sind. Diese Gene wurden aus einem obligaten Methanotroph isoliert, von dem bisher nicht bekannt war, einen denitrifizierenden Weg aufzuweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäurefragment bereit, codierend eine bakterielle Nitritreduktase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem isolierten Nucleinsäurefragment, codierend die Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 22; (b) einem isolierten Nucleinsäurefragment, codierend ein Polypeptid aus mindestens 147 Aminosäuren mit mindestens 49% Identität, basierend auf der Smith-Watermann-Methode des Alignments mit der Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 22; (c) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das mit (a) unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS); und (d) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das zu (a), (b) oder (c) komplementär ist.
In einer alternativen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nucleinsäurefragment bereit, codierend eine bakterielle Stickstoffoxidreduktase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem isolierten Nucleinsäurefragment, codierend die Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 16, 18 und 20; (b) einem isolierten Nucleinsäurefragment, codierend ein Polypeptid aus mindestens 214 Aminosäuren mit mindestens 39% Identität, basierend auf der Smith-Watermann-Methode des Alignments mit der Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 16, 18 und 20; (c) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das mit (a) unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS); und (d) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das zu (a), (b) oder (c) komplementär ist.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nucleinsäurefragment bereit, codierend eine bakterielle Nitratreduktase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem isolierten Nucleinsäurefragment, codierend die Aminosäuresequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 14; (b) einem isolierten Nucleinsäurefragment, codierend ein Polypeptid aus mindestens 920 Aminosäuren mit mindestens 51% Identität, basierend auf der Smith-Watermann-Methode des Alignments mit der Aminosäuresequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 14; (c) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das mit (a) unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS); und (d) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das zu (a), (b) oder (c) komplementär ist.
Die Erfindung stellt weiterhin Polypeptide, codiert durch die vorliegenden bakteriellen denitrifizierenden Sequenzen, bereit.
Außerdem stellt die Erfindung chimäre Gene, umfassend die vorliegenden Gene, operabel verknüpft mit geeigneten Regulierungssequenzen, bereit.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine transformierte Wirtszelle, umfassend die vorliegenden Chimären, bereit. Bevorzugte Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefe und Fadenpilze.
In einer alternativen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines Nucleinsäurefragments bereit, codierend alle oder einen wesentlichen Anteil der vorliegenden bakteriellen denitrifizierenden Sequenzen, umfassend: (a) Sondieren einer Genbank mit dem Nucleinsäurefragment, codierend die vorliegenden denitrifizierenden Enzyme; (b) Identifizieren eines DNA-Klons, der mit dem Nucleinsäurefragment von Schritt (a) hybridisiert; (c) Sequenzieren des genomischen Fragments, das den in Schritt (b) identifizierten Klon umfaßt, wobei das sequenzierte genomische Fragment alles oder im wesentlichen alles von der Aminosäuresequenz, codierend die vorliegenden bakteriellen denitrifizierenden Enzyme, umfaßt.
In ähnlicher Weise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines Nucleinsäurefragments bereit, codierend alle oder einen wesentlichen Anteil der vorliegenden bakteriellen denitrifizierenden Enzyme, umfassend: (a) Synthetisieren mindestens eines Oligonucleotid-Primers entsprechend einem Anteil der Sequenzen, codierend die vorliegenden bakteriellen denitrifizierenden Enzyme, und (b) Amplifizieren eines Inserts, vorhanden in einem Klonierungsvektor, unter Verwendung des Oligonucleotid-Primers von Schritt (a); wobei das amplifizierte Insert einen Anteil einer Aminosäuresequenz, codierend die vorliegenden bakteriellen denitrifizierenden Enzyme, codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Produkte, erzeugt durch die vorstehenden Verfahren, bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Reduktion von Nitrit, Nitrat oder Stickstoffoxid bereit, umfassend: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit einem chimären Gen, umfassend ein Nucleinsäurefragment, codierend die vorliegenden bakteriellen denitrifizierenden Enzyme, wobei das chimäre Gen operabel mit mindestens einer geeigneten Regulierungssequenz verknüpft ist; (b) Züchten der transformierten Wirtszelle von Schritt (a) in Anwesenheit einer wirksamen Menge von Nitrit und unter Bedingungen, wobei das chimäre Gen exprimiert wird und wo das Nitrit, Nitrat oder Stickstoffoxid reduziert wird.
In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung ein mutiertes bakterielles denitrifizierendes Gen bereit, codierend ein Protein mit einer geänderten biologischen Aktivität, erzeugt durch ein Verfahren, umfassend die Schritte:

(i) Digerieren eines Gemisches von Nucleotidsequenzen mit Restriktionsendonucleasen, wobei das Gemisch: a) eine native bakterielle denitrifizierende Sequenz; b) eine erste Population von Nucleotidfragmenten, welche mit der nativen bakteriellen Sequenz hybridisieren werden; c) eine zweite Population von Nucleotidfragmenten, welche nicht mit der nativen bakteriellen Sequenz hybridisieren werden; umfaßt, wobei ein Gemisch von Restriktionsfragmenten erzeugt wird;
(ii) Denaturieren des Gemisches von Restriktionsfragmenten;
(iii) Inkubieren des denaturierten Gemisches von Restriktionsfragmenten von Schritt (ii) mit einer Polymerase;
(iv) Wiederholen der Schritte (ii) und (iii), wobei eine mutierte bakterielle denitrifizierende Sequenz erzeugt wird, die ein Protein mit einer geänderten biologischen Aktivität codiert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND SEQUENZBESCHREIBUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, die die Reduktion von NO2 und NO3 durch Methylomonas 16a zeigt.
2 zeigt das Nir-Gencluster, enthaltend nirS, nirF, nirD, nirL, nirG, nirH und nirJ, wobei überlappende Gene (Gen nirF, nirD, nirL und nirG; und die Gene nirH und nirJ) in einer unterschiedlichen Ebene gezeigt werden.
3 zeigt das Nor-Gencluster, enthaltend norC und norB.
Die Erfindung kann vollständiger aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den begleitenden Sequenzbeschreibungen verstanden werden, welche einen Teil dieser Anmeldung bilden.
Die folgenden Sequenzen erfüllen die 37 C.F.R 1.821–1.825 („Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures – the Sequence Rules" („Anforderungen für Patentanmeldungen, die Offenbarungen von Nucleotidsequenzen und/oder einer Aminosäuresequenz enthalten") und sind im Einklang mit dem Standard ST.25 (1998) der World Intellectual Property Organization (WIPO) und den Sequenzlistenanforderungen der EPO und PCT (Regeln 5.2 und 49.5(a-bis) und Abschnitt 208 und Anhang C der Administrative Instructions (Verwaltungsvorschriften)). Die Symbole und das Format, die für Nucleotid- und Aminosäuresequenzdaten verwendet werden, erfüllen die Regeln, die in 37 C:F:R: §1.822 angegeben sind.

SEQ ID NO:1 ist die Nucleotidsequenz von ORF1, codierend das nirF-Gen.
SEQ ID NO:2 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von nirF, codiert durch ORF1.
SEQ ID NO:3 ist die Nucleotidsequenz von ORF2, codierend das nirD-Gen.
SEQ ID NO:4 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von nirD, codiert durch ORF2.
SEQ ID NO:5 ist die Nucleotidsequenz von ORF3, codierend das nirL-Gen.
SEQ ID NO:6 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von nirL, codiert durch ORF3.
SEQ ID NO:7 ist die Nucleotidsequenz von ORF4, codierend das nirG-Gen.
SEQ ID NO:8 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von nirG, codiert durch ORF4.
SEQ ID NO:9 ist die Nucleotidsequenz von ORF5, codierend das nirH-Gen.
SEQ ID NO:10 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von nirH, codiert durch ORF5.
SEQ ID NO:11 ist die Nucleotidsequenz von ORF6, codierend das nirJ-Gen.
SEQ ID NO:12 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von nirJ, codiert durch ORF6.
SEQ ID NO:13 ist die Nucleotidsequenz von ORF7, codierend das nasA-Gen.
SEQ ID NO:14 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz des nasA-Gens, codiert durch ORF7.
SEQ ID NO:15 ist die Nucleotidsequenz von ORF8, codierend das norC-Gen.
SEQ ID NO:16 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von norC, codiert durch ORF8.
SEQ ID NO:17 ist die Nucleotidsequenz von ORF9, codierend das norB-Gen.
SEQ ID NO:18 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von norB, codiert durch ORF9.
SEQ ID NO:19 ist die Nucleotidsequenz von ORF10, codierend das norZ-Gen.
SEQ ID NO:20 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von norZ, codiert durch ORF10.
SEQ ID NO:21 ist die Nucleotidsequenz von ORF11, codierend das nirS-Gen.
SEQ ID NO:22 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von nirS, codiert durch ORF11.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Gene und ihre Expressionsprodukte sind für die Erschaffung von rekombinanten Organismen verwendbar, die die Fähigkeit haben, für die Identifizierung neuer denitrifizierender Spezies von Bakterien und für Fermentierungsverfahren in Abwesenheit oder Anwesenheit von Sauerstoff toxische Abfallsubstanzen zu denitrifizieren. Nucleinsäurefragmente, codierend zumindest einen Teil einiger der vorstehend erwähnten Enzyme, sind aus einem Stamm von Methylomas 16a isoliert und durchVergleich mit öffentlichen Datenbanken, enthaltend Nucleotid- und Proteinsequenzen, unter Verwendung der dem Fachmann bekannten BLAST- und FASTA-Algorithmen identifiziert worden.
Die Gene und Genprodukte der vorliegenden Erfindung können auf einer Vielfalt von Wegen für die weitere Reduktion von Nitrit zu Distickstoffoxid verwendet werden. Die Aktivität der vorliegenden Gene und Genprodukte ist durchUntersuchungen bestätigt worden, die die denitrifizierende Aktivität des Ausgangsstammes, Methylomas 16a, zeigen.
Die Gene für Denitrifikation können verwendet werden, um lösliche Nitrate aus Wässern oder Prozessen zu entfernen, wo Nitrate oder andere oxygenierte Stickstoffderivate problematisch sind. Mikrobielle Denitrifikation entfernt über die Bildung von Distickstoffoxid oder Distickstoff Nitrate aus Böden. Dies ist ein normaler Teil des globalen Stickstoffkeislaufs. Wo in Grund- oder Abwasser Nitrite in toxischen oder problematischen Niveaus vorkommen, ist dies oftmals auf die Aktivität von nitrifizierenden Bakterien (einschließlich vieler Methanotrophe) zurückzuführen, die das Ammoniak, freigesetzt durch Abbau von proteinhaltigem Abfall, zu Nitrit umwandeln. Zugabe von billigen Kohlenstoffsubstraten wie beispielsweise Methan oder Methanol und methanotrophen Bakterien, enthaltend die vorliegenden Gene für Denitrifikation, erlaubt die kostengünstige Entfernung des Nitrits zu Distickstoffoxid.
In dieser Offenbarung wird eine Anzahl von Begriffen und Abkürzungen verwendet. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt.
„Offener Leserahmen" ist abgekürzt ORF.
„Polymerasekettenreaktion" ist abgekürzt PCR.
Wie hier verwendet ist ein „isoliertes Nucleinsäurefragment" ein Polymer von RNA oder DNA, das einzel- oder doppelsträngig ist, wobei es gegebenenfalls synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nucleotidbasen enthält. Ein isoliertes Nucleinsäurefragment in der Form eines Polymers von DNA kann aus einem oder mehreren Segmenten von cDNA, genomischer DNA oder synthetischer DNA bestehen.
Der Begriff „bakterielles denitrifizierendes Gen" oder „bakterielle denitrifizierende Sequenz" bezeichnet die Sequenzen der vorliegenden Anmeldung, isoliert aus Methylomas 16a und codierend Enzyme mit der Fähigkeit, Nitrit, Nitrat oder Stickstoffoxid zu reduzieren. Bakterielle denitrifizierende Sequenzen umfassen die ORFs 1–11, wie sie in der vorliegenden Anmeldung diskutiert werden.
Der Begriff „bakterielles denitrifizierendes Enzym" bezeichnet die Enzyme, codiert durch Sequenzen der vorliegenden Anmeldung, isoliert aus Methylomonas 16a, welche die Fähigkeit haben, Nitrit, Nitrat oder Stickstoffoxid zu reduzieren. Bakterielle denitrifizierende Enzyme umfassen diejenigen Enzyme, codiert durchdie ORFs 1–11, wie sie in der vorliegenden Anmeldung diskutiert werden.
Der Begriff „Denitrifikation" oder „Nitratatmung" bezeichnet den mikrobiellen Prozeß der Reduktion von Nitrat oder Nitrit zu gasförmigen Endprodukten wie Distickstoffoxid, Stickstoffoxid oder Distickstoff. In dem Prozeß der Ausführung dieser Reduktionen erhalten die Zellen verwendbare biologische Energie, daher der Begriff Nitratatmung.
Der Begriff „nir" bezeichnet Nitritreduktase-Enzym, codiert durch ORF1, 2, 3, 4, 5, 6 und 11. Die Nitritreduktase katalysiert die Reduktion von Nitrit (NO₂) zu Stickstoffoxid (NO). Es gibt verschiedene Enzyme in der Nitritreduktase-Familie. Sie werden weiter als nirD, nirF, nirG, nirH, nirJ, nirL, nirS identifiziert.
Der Begriff „nasA" bezeichnet Nitratreduktase-Enzym, codiert durch ORF7, und katalysiert die Reduktion von Nitrat (NO₃) zu Nitrit (NO₂).
Der Begriff „nor" bezeichnet Stickstoffoxidreduktase-Enzym, codiert durch ORF8, 9 und 10. Die Stickstoffoxidreduktase katalysiert die Reduktion von Stickstoffoxid (NO) zu Distickstoffoxid (N₂O). Es gibt verschiedene Enzyme in der Stickstoffoxidreduktase-Familie. Sie werden weiter als norB, norC oder norZ identifiziert.
Wie hier verwendet bezeichnet „im wesentlichen ähnlich" Nucleinsäurefragmente, bei denen Veränderungen in einer oder mehreren Nucleotidbasen zu Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren führen, aber die funktionellen Eigenschaften des Proteins, codiert durchdie DNA-Frequenz, nicht beeinflussen. „Im wesentlichen ähnlich" bezeichnet auch Nucleinsäurefragmente, wobei Veränderungen in einer oder mehreren Nucleotidbasen nicht die Fähigkeit des Nucleinsäurefragments beeinflussen, Veränderung der Genexpression durch Antisense- oder Co-Suppressions-Technologie zu vermitteln. „Im wesentlichen ähnlich" bezeichnet auch Modifizierungen der Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung wie beispielsweise Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Nucleotidbasen, die die funktionellen Eigenschaften des resultierenden Transkripts nicht wesentlich beeinflussen. Es ist daher selbstverständlich, daß die Erfindung mehr als die speziellen exemplarischen Sequenzen einschließt.
Zum Beispiel ist auf dem Fachgebiet bekannt, daß Veränderungen in einem Gen, welche zu der Erzeugung einer chemisch äquivalenten Aminosäure an einer gegebenen Stelle führen, aber nicht die funktionellen Eigenschaften des codierten Proteins beeinflussen, häufig sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Substitutionen als Austausche innerhalb der folgenden fünf Gruppen definiert:

1. Kleine aliphatische, nichtpolare oder schwach polare Reste: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);
2. Polare, negativ geladene Reste und ihre Amide: Asp, Asn, Glu, Gln;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg, Lys;
4. Große aliphatische, nichtpolare Reste: Met, Leu, Ile, Val(Cys); und
5. Große aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp.

So kann ein Codon für die Aminosäure Alanin, eine hydrophobe Aminosäure, durchein Codon, codierend einen anderen weniger hydrophoben Rest (wie beispielsweise Glycin) oder einen stärker hydrophoben Rest (wie beispielsweise Valin, Leucin oder Isoleucin) substituiert werden. Ähnlich kann von Änderungen, welche zu Substitution eines negativ geladenen Restes für einen anderen (wie beispielsweise Aspartinsäure für Glutaminsäure) oder eines positiv geladenen Restes für einen anderen (wie beispielsweise Lysin für Arginin) führen, ebenfalls erwartet werden, daß ein funktionell gleichwertiges Produkt erzeugt wird.
In vielen Fällen würde ebenfalls nicht erwartet werden, daß Nucleotidänderungen, welche zu Veränderung der N-terminalen und C-terminalen Anteile des Proteinmoleküls führen, die Aktivität des Proteins verändern.
Jede der vorgeschlagenen Modifizierungen liegt innerhalb der routinemäßigen Fertigkeiten auf dem Fachgebiet, wie es die Bestimmung der Retention der biologischen Aktivität der codierten Produkte ist. Darüber hinaus erkennt der Fachmann, daß durchdiese Erfindung eingeschlossene, im wesentlichen ähnliche Sequenzen auch durchihre Fähigkeit definiert sind, unter stringenten Bedingungen (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS) mit den hier veranschaulichten Sequenzen zu hybridisieren. Bevorzugte im wesentlichen ähnliche Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung sind diejenigen Nucleinsäurefragmente, deren DNA-Sequenzen zu mindestens 80% identisch mit der DNA-Sequenz der hier angegebenen Nucleinsäurefragmente sind. Stärker bevorzugte Nucleinsäurefragmente sind zu mindestens 90% mit der DNA-Sequenz der hier angegebenen Nucleinsäurefragmente identisch. Am meisten bevorzugt sind Nucleinsäurefragmente, die zu mindestens 95% identisch mit der DNA-Sequenz der hier angegebenen Nucleinsäurefragmente sind.
Ein Nucleinsäurefragment ist mit einem anderen Nucleinsäurefragment, wie beispielsweise eine cDNA, genomische DNA oder RNA, „hybridisierbar", wenn eine einsträngige Form des Nucleinsäurefragments mit dem anderen Nucleinsäurefragment unter den passenden Bedingungen von Temperatur und Ionenstärke der Lösung annelieren kann. Bedingungen von Hybridisierung und Waschen sind bekannt und beispielhaft in Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonen: Ein Handbuch für das Laboratorium), Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), insbesondere Kapitel 11 und Tabelle 11.1 darin (in Gänze durchBezugnahme einbezogen), veranschaulicht. Die Bedingungen von Temperatur und Ionenstärke bestimmen die „Stringenz" der Hybridisierung. Für vorbereitendes Screening für homologe Nucleinsäuren können Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz, entsprechend einer Tm von 55°, verwendet werden, z.B. 5X SSC, 0,1% SDS, 0,25% Milch und kein Formamid; oder 30% Formamid, 5X SSC, 0,5% SDS. Hybridisierungsbedingungen moderater Stringenz entsprechen einer höheren Tm, z.B. 40% Formamid mit 5X oder 6X SSC. Hybridisierung erfordert, daß die zwei Nucleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl, abhängig von der Stringenz der Hybridisierung, fehlerhafte Paarungen zwischen Basen möglich sind. Die geeignete Stringenz für hybridisierende Nucleinsäuren hängt von der Länge der Nucleinsäuren und dem Grad der Komplementation, auf dem Fachgebiet bekannten Variablen, ab. Je größer der Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen zwei Nucleotidsequenzen ist, desto größer ist der Wert von Tm für Hybride von Nucleinsäuren mit diesen Sequenzen. Die relative Stabilität (entsprechend höherer Tm) der Nucleinsäurehybridisierung nimmt in der folgenden Reihenfolge ab: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Für Hybride mit einer Länge von mehr als 100 Nucleotiden sind Gleichungen zum Berechnen der Tm abgeleitet worden (siehe Sambrook et al., vorstehend, 9.50–9.51). Für Hybridisierung mit kürzeren Nucleinsäuren, d.h. Oligonucleotiden, wird die Position von fehlerhaften Paarungen wichtiger und die Länge des Oligonucleotids bestimmt seine Spezifität (siehe Sambrook et al., vorstehend, 11.7–11.8). In einer Ausführungsform beträgt die Länge für eine hybridisierbare Nucleinsäure mindestens etwa 10 Nucleotide. Vorzugsweise beträgt eine minimale Länge für eine hybridisierbare Nucleinsäure mindestens etwa 15 Nucleotide; stärker bevorzugt mindestens etwa 20 Nucleotide, und am meisten bevorzugt beträgt die Länge mindestens 30 Nucleotide. Weiterhin erkennt der Fachmann, daß die Temperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung entsprechend Faktoren wie beispielsweise Lange der Sonde wie notwendig angepaßt werden können.
Ein „wesentlicher Anteil" einer Aminosäure- oder Nucleotidsequenz, umfassend genügend von der Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder der Nucleotidsequenz eines Gens, um dieses Polypeptid oder Gen mutmaßlich zu identifizieren, entweder durchmanuelle Auswertung der Sequenz durchden Fachmann oder durch Computer-automatisierten Sequenzvergleich und Identifizierung unter Verwendung von Algorithmen wie beispielsweise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (Basissuchwerkzeug für lokales Alignment); Altschul, S. F., et al. (1993), J. Mol. Biol. 215:403-410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Im allgemeinen ist eine Sequenz von zehn oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren oder dreißig oder mehr Nucleotiden notwendig, um ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz mutmaßlich als homolog zu einem bekannten Protein oder Gen zu identifizieren. Darüber hinaus können im Hinblick auf Nucleotidsequenzen 20–30 zusammenhängende Nucleotide umfassende genspezifische Oligonucleotidsonden in sequenzabhängigen Verfahren der Genidentifizierung (z.B. Southern-Hybridisierung) und Isolierung (z.B. in-situ-Hybridisierung von Bakterienkolonien oder Bakteriophagen-Plaquen) verwendet werden. Außerdem können kurze Oligonucleotide von 12–15 Basen als Amplifikations-Primer in PCR verwendet werden, um ein die Primer umfassendes spezielles Nucleinsäurefragment zu erhalten. Dementsprechend umfaßt ein „wesentlicher Anteil" einer Nucleotidsequenz genügend von der Sequenz, um ein die Sequenz umfassendes Nucleinsäurefragment speziell zu identifizieren und/oder zu isolieren. Die vorliegende Beschreibung lehrt teilweise oder vollständige Aminosäure- und Nucleotidsequenzen, die ein oder mehrere spezielle mikrobielle Proteine codieren. Der Fachmann, der den Nutzen von den wie hier angegebenen Sequenzen hat, kann jetzt alle oder einen wesentlichen Anteil der offenbarten Sequenzen für dem Fachmann bekannte Zwecke verwenden. Dementsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung die vollständigen Sequenzen, wie sie in der begleitenden Sequenzauflistung angegeben sind, ebenso wie wesentliche Anteile dieser Sequenzen, wie sie vorstehend definiert sind.
Der Begriff „komplementär" wird verwendet, um die Beziehung zwischen Nucleotidbasen zu beschreiben, die imstande sind, miteinander zu hybridisieren. Zum Beispiel ist im Hinblick auf DNA Adenosin komplementär zu Thymin, und Cytosin ist komplementär zu Guanin. Dementsprechend schließt die vorliegende Erfindung auch isolierte Nucleinsäurefragmente ein, die komplementär zu den vollständigen Sequenzen sind, wie sie in der begleitenden Sequenzauflistung angegeben sind, ebenso wie diejenigen, die im wesentlichen ähnliche Nucleinsäuresequenzen sind.
Der Begriff „Prozent Identität" ist, wie auf dem Fachgebiet bekannt, eine Beziehung zwischen zwei oder mehreren Polypeptidsequenzen, wie sie durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt wird. Auf dem Fachgebiet bedeutet „Identität" auch den Grad der Sequenzverwandtschaftlichkeit zwischen Polypeptid- oder Polynucleotidsequenzen, je nachdem, wie er durch die Übereinstimmung zwischen Strings derartiger Sequenzen bestimmt wird. „Identität" und „Ähnlichkeit" können durch bekannte Methoden leicht berechnet werden, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, derjenigen, die in: Computational Molecular Biology (Computergestützte Molekularbiologie) (Lesk, A. M., Hrsg.), Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Biocomputing: Informatik und Genom-Projekte) (Smith, D. W., Hrsg.), Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Computeranalyse von Sequenzdaten, Teil I) (Griffin, A. M., und Griffin, H. G., Hrsg.), Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Sequenzanalyse in der Molekularbiologie) (von Heinje, G., Hrsg.) Academic Press (1987); und Sequence Analysis Primer (Primer in der Sequenzanalyse) (Gribskov, M., und Devereux, J., Hrsg.), Stockton Press, New York (1991) beschrieben sind. Bevorzugte Methoden zur Bestimmung der Identität sind darauf angelegt, die beste Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen zu ergeben. Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit sind in öffentlich zugänglichen Computerprogrammen kodifiziert. Zu bevorzugten Computerprogrammen als Methoden zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, das Programm GCG Pileup, gefunden in dem GCG-Programmpaket, wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wobei der Algorithmus von Needleman und Wunsch mit ihren standardmäßigen Default-Werten der Strafe für Lückenerzeugung = 12 und der Strafe für Lückenerweiterung = 4 verwendet wird (Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12:387–395 (1984)), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990)) und FASTA, Version 3.2, Dez. 1998, (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444–2448 (1988), und Pearson, Meth. in Molecular Biology 132:185–219 (1999)). In dem FASTA-Paket werden die finalen paarweisen Alignments unter Verwendung von ssearch3, einer Ausführung des Smith-Waterman-Algorithmus (Smith, Waterman, J. Mol. Biol. 147:195–197 (1981)), erzeugt. Die BLAST-Programme sind öffentlich von NCBI und anderen Quellen (BLAST Manual (BLAST-Handbuch), Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl. Library Med. (NCBI NLM) NIH, Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990)) zugänglich. Ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Prozent Identität geschieht durch das Verfahren des DNASTAR-Proteinalignment-Protokolls unter Verwendung des Jotun-Hein-Algorithmus (Hein et al., Methods Enzymol. 183:626–645 (1990)). Default-Parameter für das Jotun-Hein-Verfahren für Alignments sind: für mehrfache Alignments Lückenstrafe = 11, Lückenlängenstrafe = 3; für paarweise Alignments ktuple = 6. Als Veranschaulichung ist mit einem Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz mit mindestens zum Beispiel 95% „Identität" mit einer Referenznucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 beabsichtigt, daß die Nucleotidsequenz des Polynucleotids identisch mit der Referenzsequenz ist, außer daß die Polynucleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro jeweils 100 Nucleotide der Referenznucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 einschließen kann. Mit anderen Worten können, um ein Polynucleotid mit einer zu mindestens 95% mit einer Referenznucleotidsequenz identischen Nucleotidsequenz zu erhalten, bis zu 5% der Nucleotide in der Referenzsequenz deletiert oder mit einem anderen Nucleotid substituiert sein, oder eine Anzahl von Nucleotiden, bis zu 5% der gesamten Nucleotide in der Referenzsequenz, kann in die Referenzsequenz insertiert sein. Diese Mutationen der Referenzsequenz können an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenznucleotidsequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen vorkommen, eingestreut entweder einzeln zwischen Nucleotide in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Analog ist mit einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens, zum Beispiel, 95% Identität mit einer Referenzaminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 vorgesehen, daß die Aminosäuresequenz des Polypeptids identisch mit der Referenzsequenz ist, außer daß die Polypeptidsequenz bis zu fünf Aminosäureveränderungen pro jeweils 100 Aminosäuren der Referenzaminosäure von SEQ ID NO:2 einschließen kann. Mit anderen Worten können, um ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz zu erhalten, die zu mindestens 95% identisch mit einer Referenzaminosäuresequenz ist, bis zu 5% der Aminosäurereste in der Referenzsequenz deletiert oder mit einer anderen Aminosäure substituiert sein, oder eine Anzahl von Aminosäuren, bis zu 5% der gesamten Aminosäurereste in der Referenzsequenz, können in die Referenzsequenz insertiert sein. Diese Veränderungen der Referenzsequenz können an den amino- oder carboxyterminalen Positionen der Referenzaminosäuresequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen, eingestreut entweder einzeln zwischen den Resten in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz vorkommen.
„Codon-Degeneriertheit" bezeichnet die Beschaffenheit in dem genetischen Code, die Variation der Nucleotidsequenz gestattet, ohne die Aminosäuresequenz eines codierten Polypeptids zu beeinflussen. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäurefragment, das alles oder einen wesentlichen Anteil der Aminosäuresequenz, codierend die vorliegenden mikrobiellen Polypeptide, wie angegeben in den SEQ ID Nos., codiert. Der Fachmann ist sich des „Codon-Bias" bewußt, der von einer speziellen Wirtszelle beim Gebrauch von Nucleotidcodons zur Spezifizierung einer gegebenen Aminosäure gezeigt wird. Daher ist es, wenn ein Gen für verbesserte Expression in einer Wirtszelle synthetisiert wird, wünschenswert, das Gen derart zu gestalten, daß seine Frequenz des Codongebrauchs sich der Frequenz des bevorzugten Codongebrauchs der Wirtszelle annähert.
„Synthetische Gene" können aus Oligonucleotid-Bausteinen angeordnet werden, die chemisch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahrensweisen synthetisiert werden. Diese Bausteine werden ligiert und anneliert, wobei Gensegmente gebildet werden, welche dann enzymatisch angeordnet werden, wobei das gesamte Gen aufgebaut wird. „Chemisch synthetisiert" bedeutet in bezug auf eine Sequenz von DNA, daß die Komponentennucleotide in vitro angeordnet wurden. Manuelle chemische Synthese von DNA kann unter Verwendung gut eingeführter Verfahrensweisen bewerkstelligt werden, oder automatisierte chemische Synthese kann unter Verwendung einer von einer Anzahl im Handel erhältlicher Maschinen durchgeführt werden. Dementsprechend können die Gene, basierend auf der Optimierung der Nucleotidsequenz, für optimale Genexpression maßgeschneidert werden, um den Codon-Bias der Wirtszelle zu reflektieren. Der Fachmann würdigt die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Genexpression, wenn der Codongebrauch gegenüber denjenigen Codons abweicht, die durchden Wirt begünstigt werden. Die Bestimmung bevorzugter Codons kann auf eine Übersicht von Genen, abgeleitet von der Wirtszelle, wo Sequenzinformation verfügbar ist, bezogen werden.
„Gen" bezeichnet ein Nucleinsäurefragment, das ein spezielles Protein exprimiert, das Regulierungssequenzen vorausgehend (5' nicht codierende Sequenzen) und folgend (3' nicht codierende Sequenzen) der codierenden Sequenz einschließt. „Natives Gen" bezeichnet ein Gen, wie es in der Natur mit seinen eigenen Regulierungssequenzen gefunden wird. „Chimäres Gen" bezeichnet ein beliebiges Gen, das nicht ein natives Gen ist, wobei es regulierende und codierende Sequenzen umfaßt, die in der Natur nicht zusammen gefunden werden. Dementsprechend kann ein chimäres Gen Regulierungssequenzen und Codierungssequenzen umfassen, die aus verschiedenen Quellen erhalten werden, oder Regulierungssequenzen und Codierungssequenzen, die aus der gleichen Quelle erhalten werden, aber in einer Weise angeordnet sind, die unterschiedlich zu der in der Natur gefundenen ist. „Endogenes Gen" bezeichnet ein natives Gen an seinem natürlichen Standort in dem Genom eines Organismus. Ein „fremdes" Gen bezeichnet ein Gen, das normalerweise in dem Wirtsorganismus nicht gefunden wird, aber das durch Gentransfer in den Wirtsorganismus eingeführt wird. Fremde Gene können native Gene, insertiert in einen nicht nativen Organismus, oder chimäre Gene umfassen. Ein „Transgen" ist ein Gen, das durch ein Transformationsverfahren in das Genom eingeführt worden ist.
„Codierende Sequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die für eine spezielle Aminosäuresequenz codiert. „Geeignete regulierende Sequenzen" bezeichnen Nucleotidsequenzen, die sich stromaufwärts (5' nicht codierende Sequenzen), innerhalb oder stromabwärts (3' nicht codierende Sequenzen) einer codierenden Sequenz befinden und welche die Transkription, RNA-Verarbeitung oder -Stabilität oder Translation der assoziierten codierenden Sequenz beeinflussen. Zu regulierenden Sequenzen können Promotoren, Translations-Leader-Sequenzen, Introne, Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen, RNA-Verarbeitungsstelle, Effektor-Bindungsstelle und Stamm-Schleifen-Struktur gehören.
„Promotor" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die imstande ist, die Expression einer codierenden Sequenz oder funktionellen RNA zu steuern. Im allgemeinen befindet sich eine codierende Sequenz 3' zu einer Promotorsequenz. Promotoren können in ihrer Gesamtheit aus einem nativen Gen abgeleitet sein oder aus verschiedenen Elementen, abgeleitet von verschiedenen in der Natur gefundenen Promotoren, zusammengesetzt sein oder sogar synthetische DNA-Segmente umfassen. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß in verschiedenen Geweben oder Zelltypen oder in verschiedenen Stadien der Entwicklung oder in Reaktion auf verschiedene Umwelt- oder physiologische Bedingungen verschiedene Promotoren die Expression eines Gens richten können. Promotoren, welche verursachen, daß ein Gen in den meisten Zelltypen zu den meisten Zeiten exprimiert wird, werden gewöhnlich als „konstitutive Promotoren" bezeichnet. Es wird weiterhin anerkannt, daß, da in den meisten Fällen die exakten Grenzen von Regulierungssequenzen nicht vollständig definiert worden sind, DNA-Fragmente verschiedener Längen identische Promotoraktivität haben können.
Die „3' nicht kodierenden Sequenzen" bezeichnen DNA-Sequenzen, die sich stromabwärts einer codierenden Sequenz befinden, und schließen Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen und andere Sequenzen ein, die Regulierungssignale codieren, die imstande sind, mRNA-Verarbeitung oder Genexpression zu beeinflussen. Das Polyadenylierungssignal ist gewöhnlich dadurch gekennzeichnet, daß die Addition von Polyadenylsäuresträngen an das 3'-Ende des mRNA-Vorprodukts beeinflußt wird.
„RNA-Transkript" bezeichnet das aus einer RNA-Polymerase-katalysierten Transkription einer DNA-Sequenz resultierende Produkt. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte komplementäre Kopie der DNA-Sequenz ist, wird es als primäres Transkript bezeichnet, oder es kann eine von einer posttranskriptionellen Verarbeitung des primären Transkripts abgeleitete RNA-Sequenz sein und wird als reife RNA bezeichnet. „Messenger-RNA (mRNA)" bezeichnet die RNA, die ohne Introne ist und die durch die Zelle in Protein translatiert werden kann. „cDNA" bezeichnet eine doppelsträngige DNA, die komplementär zu und abgeleitet von mRNA ist. „Sense"-RNA bezeichnet RNA-Transkript, das die mRNA einschließt und so durchdie Zelle in Protein translatiert werden kann. „Antisense"-RNA bezeichnet ein RNA-Transkript, das komplementär zu allem oder einem Teil eines primären Transkripts oder einer mRNA des Ziels ist und das die Expression eines Zielgens (US-Patentschrift 5107065; WO 9928508) blockiert. Die Komplementarität einer Antisense-RNA kann mit einem beliebigen Teil des speziellen Gentranskripts sein, d.h. an der 5' nicht codierenden Sequenz, 3' nicht codierenden Sequenz oder der codierenden Sequenz. „Funktionelle RNA" bezeichnet Antisense-RNA, Ribozym-RNA oder andere RNA, die nicht translatiert wird, jedoch eine Wirkung auf zelluläre Prozesse hat.
Der Begriff „operabel verknüpft" bezeichnet die Assoziation von Nucleinsäuresequenzen auf einem einzelnen Nucleinsäurefragment, so daß die Funktion von einer durchdie andere beeinflußt wird. Zum Beispiel ist ein Promotor operabel mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn er imstande ist, die Expression dieser codierenden Sequenz zu beeinflussen (d.h., daß die codierende Sequenz unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors ist). Codierende Sequenzen können in Sense- oder Antisense-Orientierung operabel mit regulierenden Sequenzen verknüpft sein.
Der Begriff „Expression", wie er hier verwendet wird, bezeichnet die Transkription und stabile Akkumulation von Sense-(mRNA) oder Anti-Sense-RNA, abgeleitet von dem Nucleinsäurefragment der Erfindung. Expression kann auch die Translation von mRNA in ein Polypeptid bezeichnen.
„Transformation" bezeichnet die Überführung eines Nucleinsäurefragments in das Genom eines Wirtsorganismus, die zu genetisch stabiler Vererbung führt. Wirtsorganismen, die die transformierten Nucleinsäurefragmente enthalten, werden als „transgene" oder „rekombinante" oder „transformierte" Organismen bezeichnet.
Die Begriffe „Plasmid", „Vektor" und „Kassette" bezeichnen ein extra chromosomales Element, das oft Gene trägt, welche nicht Teil des zentralen Metabolismus der Zelle sind und gewöhnlich die Form zirkulärer doppelsträngiger DNA-Fragmente haben. Derartige Elemente können autonom replizierende Sequenzen, Genom integrierende Sequenzen, Phagen- oder Nucleotidsequenzen, linear oder zirkulär, von einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, abgeleitet von einer beliebigen Quelle, sein, in welchen eine Anzahl von Nucleotidsequenzen zu einer einzigartigen Konstruktion verbunden oder rekombiniert worden ist, welche imstande ist, ein Promotor-Fragment und eine DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt zusammen mit einer passenden 3'-untranslatierten Sequenz in eine Zelle einzuführen. „Transformationskassette" bezeichnet einen speziellen Vektor, der ein fremdes Gen enthält und Elemente zusätzlich zu dem fremden Gen aufweist, die die Transformation einer bestimmten Wirtszelle erleichtern. „Expressionskassette" bezeichnet einen speziellen Vektor, der ein fremdes Gen enthält und Elemente zusätzlich zu dem fremden Gen aufweist, die verstärkte Expression dieses Gens in einem fremden Wirt erlauben.
Der Begriff „veränderte biologische Aktivität" bezeichnet eine Aktivität, verbunden mit einem durcheine mikrobielle Nucleotidsequenz codierten Protein, die durchein Assay-Verfahren gemessen werden kann, wo diese Aktivität entweder größer als oder kleiner als die Aktivität ist, die mit der nativen mikrobiellen Sequenz verbunden ist. „Verstärkte biologische Aktivität" bezeichnet eine veränderte Aktivität, die größer ist als die, die mit der nativen Sequenz verbunden ist. „Verminderte biologische Aktivität" ist eine veränderte Aktivität, die geringer ist als die, die mit der nativen Sequenz verbunden ist.
Der Begriff „Sequenzanalyse-Software" bezeichnet einen Computer-Algorithmus oder ein Softwareprogramm, das für die Analyse von Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen verwendbar ist. „Sequenzanalyse-Software" kann im Handel erhältlich oder unabhängig entwickelt sein. Zu typischer Sequenzanalyse-Software gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, die GCG-Suite von Programmen (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990) und DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA) und das FASTA-Programm, das den Smith-Waterman-Algorithmus einbezieht (W. R Pearson, Comput. Methods Genome Res. [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111–20. Herausgeber: Suhai, Sandor. Verleger: Plenum, New York, NY). Innerhalb des Zusammenhangs dieser Anmeldung ist es selbstverständlich, daß, wo Sequenzanalyse-Software zur Analyse verwendet wird, die Ergebnisse der Analyse, wenn nicht anderweitig festgelegt, auf den „Default-Werten" des in Bezug genommenen Programms basieren. Wie hier verwendet bedeuten „Default-Werte" eine Gruppe von Werten oder Parametern, welche ursprünglich mit der Software geladen werden, wenn sie zum ersten Mal initialisiert wird.
Standardmäßige rekombinante DNA und molekulare Klonierungstechniken, die hier verwendet werden, sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A. Laboratory Manual (Molekulares Klonen: Ein Handbuch für das Laboratorium), Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (nachstehend „Maniatis"); und von Silhavy, T. J., Bennan, M. L., und Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions (Experimente mit Genfusionen), Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press, Spring Harbor, NY (1984); und von Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology (Aktuelle Protokolle in der Molekularbiologie), veröffentlicht von Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1987), beschrieben.
Eine Vielfalt von Nucleotidsequenzen ist aus Methylomonas 16a isoliert worden, die Genprodukte codieren, die an Denitrifikationsreaktionen beteiligt sind. Die ORFs1–6 und 11 zum Beispiel codieren Nitritreduktase-(Nir)-Enzyme, ORF7 codiert eine Nitratreduktase (Nas) und die ORFs8–10 codieren Stickstoffoxidreduktase-Enzyme (Nor).
Der Vergleich der Nir-Base und abgeleiteter Aminosäuresequenzen mit öffentlichen Datenbanken enthüllt, daß die ähnlichsten bekannten Sequenzen von einer entfernten wie bei dem Aminosäureniveau über eine Länge von 527 Aminosäuren (ORF11, NirS) zu etwa 28% identisch bis zu etwa 59% identisch über eine Länge von 390 Aminosäuren (ORF1, NirF) reichen, wobei ein Smith-Waterman-Alignment-Algorithmus verwendet wird (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res. [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 11–20. Herausgeber: Suhai, Sandor. Verleger: Plenum, New York, NY). Dementsprechend sind bevorzugte Polypeptide der vorliegenden Erfindung diejenigen aktiven Proteine, welche über eine Länge von 147 Aminosäuren zu mindestens 49% identisch mit der Aminosäuresequenz von hier angegebenen sind. Stärker bevorzugte Aminosäurefragmente sind zu mindestens etwa 80%–90% identisch mit den Sequenzen hier. Am meisten bevorzugt sind Nucleinsäurefragmente, die zu mindestens 95% identisch mit den hier angegebenen Aminosäurefragmenten sind. Ähnlich sind bevorzugte Nir codierende Nucleinsäuresequenzen entsprechend den vorliegenden ORFs diejenigen, die aktive Proteine codieren und welche zu mindestens 80% identisch mit den Nucleinsäuresequenzen von hier angegebenen sind. Stärker bevorzugte Nir-Nucleinsäurefragmente sind zu mindestens 90% identisch mit den Sequenzen hier. Am meisten bevorzugt sind Nir-Nucleinsäurefragmente, die zu mindestens 95% identisch mit den hier angegebenen Nucleinsäurefragmenten sind.
Der Vergleich einer Nitratreduktase-(Nas)-Base und der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit öffentlichen Datenbanken enthüllt, daß die ähnlichste bekannte Sequenz bei dem Aminosäureniveau über eine Länge von 920 Aminosäuren (ORF7; NasA) zu 51% identisch ist, wobei ein Smith-Waterman-Alignment-Algorithmus (W.R Pearson, vorstehend) verwendet wird. Stärker bevorzugte Aminosäurefragmente sind zu mindestens etwa 80%–90% mit den Sequenzen hier identisch. Am meisten bevorzugt sind Nucleinsärefragmente, die zu mindestens 95% identisch mit den hier angegebenen Aminosäurefragmenten sind. Ähnlich sind bevorzugte NasA codierende Nucleinsäuresequenzen entsprechend den vorliegenden ORFs diejenigen, die aktive Proteine codieren und welche zu mindestens 80% identisch mit den Nucleinsäuresequenzen von hier angegebenen sind. Stärker bevorzugte NasA-Nucleinsäurefragmente sind zu mindestens 90% identisch mit den Sequenzen hier. Am meisten bevorzugt sind NasA-Nucleinsäurefragmente, die zu mindestens 95% identisch mit den hier angegebenen Nucleinsäurefragmenten sind.
Ähnlich enthüllt der Vergleich der Nor-Base und abgeleiteter Aminosäuresequenzen mit öffentlichen Datenbanken, daß die ähnlichsten bekannten Sequenzen von einer entfernten, wie bei dem Aminosäureniveau über eine Länge von 214 Aminosäuren zu etwa 32% identisch (ORF8; NorC) bis über eine Länge von 751 Aminosäuren zu etwa 39% identisch (ORF10; NorZ) reichen, wobei ein Smith-Waterman-Alignment-Algorithmus verwendet wird (W. R. Pearson, vorstehend). Dementsprechend sind bevorzugte Polypeptide der vorliegenden Erfindung diejenigen aktiven Proteine, welche über eine Länge von 214 Aminosäuren zu mindestens 39% identisch mit der Aminosäruesequenz von hier angegebenen sind. Stärker bevorzugte Aminosäurefragmente sind zu mindestens etwa 80%–90% identisch mit den Sequenzen hier. Am meisten bevorzugt sind Nucleinsäurefragmente, die zu mindestens 95% identisch mit den hier angegebenen Aminosäurefragmenten sind. Ähnlich sind bevorzugte Nor codierende Nucleinsäuresequenzen entsprechend den vorliegenden ORFs diejenigen, die aktive Proteine codieren und welche zu mindestens 80% identisch mit den Nucleinsäuresequenzen von hier angegebenen sind. Stärker bevorzugte Nor-Nucleinsäurefragmente sind zu mindestens 90% identisch mit den Sequenzen hier. Am meisten bevorzugt sind Nor-Nucleinsäurefragmente, die zu mindestens 95% identisch mit den hier angegebenen Nucleinsäurefragmenten sind.
Die Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Gene zu isolieren, die homologe Proteine von der gleichen oder einer anderen mikrobiellen Spezies codieren. Isolierung von homologen Genen unter Verwendung von sequenzabhängigen Protokollen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Zu Beispielen von sequenzabhängigen Protokollen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Methoden der Nucleinsäurehybridisierung und Methoden der DNA- und RNA-Amplifikation wie beispielhaft veranschaulicht durchverschiedene Verwendungen von Technologien der Nucleinsäure-Amplifikation (z.B. Polymerasekettenreaktion (PCR), Mullis et al., US-Patentschrift 4683202), Ligasekettenreaktion (LCR), Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. USA 82, 1074 (1985)) und Strangverdrängungsamplifikation (SDA, Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 392 (1992)).
Typischerweise haben in Amplifikationstechniken vom PCR-Typ die Primer unterschiedliche Sequenzen und sind nicht miteinander komplementär. Abhängig von den gewünschten Testbedingungen sollten die Sequenzen der Primer darauf angelegt sein, sowohl wirksame als auch getreue Replikation der Zielnucleinsäure bereitzustellen. Methoden der PCR-Primer-Gestaltung sind allgemein gebräuchlich und auf dem Fachgebiet bekannt. (Thein und Wallace „The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders" („Die Verwendung von Oligonucleotid als spezifische Hybridisierungssonden in der Diagnose von genetischen Störungen") in Human Genetic Diseases: A Practical Approach (Genetische Erkrankungen beim Menschen: Eine praktische Herangehensweise), K. E. Davis, Hrsg., (1986), S. 33–50 IRL Press, Herndon, Virginia); Rychlik, W., (1993) in White, B. A. (Hrsg.), Methods in Molecular Biology (Methoden in der Molekularbiologie), Bd. 15, Seiten 31–39, PCR Protocols: Current Methods and Applications (PCR-Protokolle: Gegenwärtige Methoden und Anwendungen), Humania Press, Inc., Totowa, NJ).
Im allgemeinen können zwei kurze Segmente der vorliegenden Sequenzen in Protokollen der Polymerasekettenreaktion verwendet werden, um längere Nucleinsäurefragmente, codierend homologe Gene aus DNA oder RNA, zu amplifizieren. Die Polymerasekettenreaktion kann auch an einer Genbank von klonierten Nucleinsäurefragmenten durchgeführt werden, wobei die Sequenz eines Primers von den vorliegenden Nucleinsäurefragmenten abgeleitet ist und die Sequenz des anderen Primers die Anwesenheit der Polyadenylsäurestränge an dem 3'-Ende des mRNA-Vorprodukts, codierend mikrobielle Gene, ausnutzt.
Alternativ kann die zweite Primersequenz auf Sequenzen basieren, die von dem Klonierungsvektor abgeleitet sind. Zum Beispiel kann der Fachmann dem RACE-Protokoll (Frohman et al., PNAS USA 85:8998 (1998)) folgen, um cDNAs zu erzeugen, indem PCR verwendet wird, um Kopien der Region zwischen einem einzelnen Punkt in dem Transkript und dem 3'- oder 5'-Ende zu amplifizieren. Primer, die in den 3'- und 5'-Richtungen orientiert sind, können aus den vorliegenden Sequenzen gestaltet werden. Unter Verwendung von im Handel erhältlichen 3'-RACE- oder 5'-RACE-Systemen (BRL) können spezifische 3'- oder 5'-cDNA-Fragmente isoliert werden (Ohara et al., PNAS USA 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989)).
Alternativ können die vorliegenden Sequenzen als Hybridisierungsreagenzien für die Identifizierung von Homologen angewendet werden. Die grundlegenden Komponenten eines Nucleinsäurehybridisierungstests schließen eine Sonde, eine Probe, von der vermutet wird, daß sie das interessierende Gen oder Genfragment enthält, und ein spezielles Hybridisierungsverfahren ein. Sonden der vorliegenden Erfindung sind typischerweise einsträngige Nucleinsäuresequenzen, welche komplementär zu den nachzuweisenden Nucleinsäuresequenzen sind. Sonden sind mit der nachzuweisenden Nucleinsäuresequenz „hybridisierbar". Die Sondenlänge kann von 5 Basen bis zu Zehntausenden von Basen variieren und hängt von dem speziellen Test, der gemacht werden soll, ab. Typischerweise ist eine Sondenlänge von etwa 15 Basen bis etwa 30 Basen geeignet. Nur ein Teil des Sondenmoleküls braucht zu der nachzuweisenden Nucleinsäuresequenz komplementär zu sein. Außerdem braucht die Komplementarität zwischen der Sonde und der Zielsequenz nicht perfekt zu sein. Hybridisierung erfolgt zwischen nicht perfekt komplementären Molekülen mit dem Ergebnis, daß eine bestimmte Fraktion der Basen in der hybridisierten Region nicht mit der richtigen komplementären Base gepaart ist.
Hybridisierungsverfahren sind definiert. Typischerweise müssen die Sonde und die Probe unter Bedingungen gemischt werden, welche Nucleinsäurehybridisierung gestatten. Dies beinhaltet Inkontaktbringen der Sonde und Probe in Anwesenheit eines anorganischen oder organischen Salzes unter den richtigen Konzentrations- und Temperaturbedingungen. Die Nucleinsäuren von Sonde und Probe müssen für eine Zeit in Kontakt sein, die lang genug ist, daß eine mögliche Hybridisierung zwischen der Nucleinsäure von Sonde und Probe erfolgen kann. Die Konzentration von Sonde oder Ziel in dem Gemisch bestimmt die Zeit, die notwendig ist, damit die Hybridisierung erfolgt. Je höher die Konzentration von Sonde oder Ziel ist, desto kürzer ist die Zeit, die für die Inkubation der Hybridisierung benötigt wird. Gegebenenfalls kann ein chaotropes Mittel hinzugegeben werden. Das chaotrope Mittel stabilisiert Nucleinsäuren durchHemmen der Nucleaseaktivität. Weiterhin erlaubt das chaotrope Mittel sensitive und stringente Hybridisierung kurzer Oligonucleotidsonden bei Raumtemperatur [Van Ness und Chen (1991) Nucl. Acids Res. 19:5143–5151]. Zu geeigneten chaotropen Mitteln gehören unter anderen Guanidiniumchlorid, Guanidiniumthiocyanat, Natriumthiocyanat, Lithiumtetrachloracetat, Natriumperchlorat, Rubidiumtetrachloracetat, Kaliumiodid und Cäsiumtrifluoracetat. Typischerweise wird das chaotrope Mittel mit einer Endkonzentration von etwa 3M vorhanden sein. Wenn gewünscht kann man Formamid zu dem Hybridisierungsgemisch hinzugeben, typischerweise 30–50% (Vol./Vol.).
Verschiedenartige Hybridisierungslösungen können angewendet werden. Typischerweise umfassen diese von etwa 20 bis 60 Vol.-%, vorzugsweise 30 Vol.-%, von einem polaren organischen Lösungsmittel. Eine gebräuchliche Hybridisierungslösung wendet etwa 30–50 Vol.-% Formamid, etwa 0,15 bis 1 M Natriumchlorid, etwa 0,05 bis 0,1 M Puffer, wie beispielsweise Natriumcitrat, Tris-HCl, PIPES oder HEPES (pH-Bereich etwa 6–9), etwa 0,05 bis 0,2% Detergens, wie beispielsweise Natriumdodecylsulfat, oder zwischen 0,5–20 mM EDTA, FICOLL (Pharmacia Inc.) (etwa 300–500 Kilodalton), Polyvinylpyrrolidon (etwa 250–500 kdal) und Serumalbumin an. Ebenfalls eingeschlossen in die typische Hybridisierungslösung sind unmarkierte Trägernucleinsäuren von etwa 0,1 bis 5 mg/ml, fragmentierte Nuclein-DNA, z.B. Kalbsthymus- oder Lachsspermien-DNA oder Hefe-RNA, und gegebenenfalls von etwa 0,5 bis 2% Gew./Vol. Glycin. Andere Zusatzstoffe können ebenfalls eingeschlossen werden, wie beispielsweise Volumenausschlußmittel, welche eine Vielfalt von polaren wasserlöslichen oder quellbaren Mitteln, wie beispielsweise Polyethylenglycol, anionische Polymere, wie beispielsweise Polyacrylat oder Polymethylacrylat, und anionische saccharidische Polymere, wie beispielsweise Dextransulfat, einschließen.
Nucleinsäurehybridisierung ist an eine Vielfalt von Assay-Formaten anpaßbar. Eines der am meisten geeigneten ist das Sandwich-Assay-Format. Der Sandwich-Assay ist besonders an Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen anpaßbar. Eine primäre Komponente eines Assay vom Sandwich-Typ ist ein fester Träger. Auf dem festen Träger ist immobilisierte Nucleinsäuresonde, die unmarkiert und komplementär zu einem Teil der Sequenz ist, adsorbiert oder kovalent mit ihm gekoppelt.
Verfügbarkeit des vorliegenden Nucleotids und abgeleiteter Aminosäuresequenzen erleichtert immunologisches Screening von Genbanken der DNA-Expression. Synthetische Peptide, die Teile der vorliegenden Aminosäuresequenzen darstellen, können synthetisiert werden. Diese Peptide können verwendet werden, um Lebewesen zu immunisieren, um polyklonale oder monoklonale Antikörper mit Spezifität für Peptide oder Proteine, umfassend die Aminosäuresequenzen, zu erzeugen. Diese Antikörper können dann verwendet werden, um Genbanken der DNA-Expression zu screenen, um interessierende DNA-Klone voller Länge zu isolieren (Lerner, R A., Adv. Immunol. 36:1 (1984); Maniatis).
Die Gene und Genprodukte der vorliegenden Sequenzen können in heterologen Wirtszellen, insbesondere in den Zellen mikrobieller Wirte, erzeugt werden. Expression in rekombinanten mikrobiellen Wirten kann für die Expression verschiedener Zwischenverbindungen auf dem Weg; für die Modulierung von Wegen, die bereits in dem Wirt existieren, für die Synthese von neuen Produkten, die bisher unter Verwendung des Wirts nicht möglich waren, nützlich sein. Außerdem können die Genprodukte für die Übertragung höherer Wachstumsausbeuten auf den Wirt oder für die Ermöglichung eines auszunutzenden alternativen Wachstumsmodus verwendbar sein.
Bevorzugte heterologe Wirtszellen für die Expression der vorliegenden Gene und Nucleinsäurefragmente sind mikrobielle Wirte, die in breitem Maße innerhalb der Pilz- und Bakterienfamilien gefunden werden können und welche über einen weiten Bereich von Temperatur, pH-Werten und Lösungsmitteltoleranzen wachsen. Zum Beispiel wird erwartet, daß alle von Bakterien, Hefe und Fadenpilzen geeignete Wirte für die Expression der vorliegenden Nucleinsäurefragmente sein werden. Weil Transkription, Translation und die Proteinbiosyntheseapparatur unabhängig von dem zellulären Ausgangsmaterial die gleichen sind, werden funktionelle Gene unabhängig von dem verwendeten Kohlenstoffausgangsmaterial exprimiert, wobei zelluläre Biomasse erzeugt wird. Mikrobielles Wachstum in großem Maßstab und Expression funktioneller Gene können einen weiten Bereich von einfachen oder komplexen Kohlenhydraten, organischen Säuren und Alkoholen, gesättigten Kohlenwasserstoffen wie beispielsweise Methan oder Kohlendioxid in dem Fall von photosynthetischen oder chemoautotrophen Wirten ausnutzen. Jedoch können die funktionellen Gene durch spezielle Wachstumsbedingungen, wozu die Form und Menge von Stickstoff Phosphor, Schwefel, Sauerstoff, Kohlenstoff oder irgendeiner Spur Mikronährstoff einschließlich kleiner anorganischer Ionen gehören können, reguliert, reprimiert oder geschwächt werden. Außerdem kann die Regulierung funktioneller Gene durch die Anwesenheit oder Abwesenheit spezieller Regulierungsmoleküle erreicht werden, die zu der Kultur hinzugegeben werden und nicht typischerweise als Nährstoff oder Energiequellen angesehen werden. Die Wachstumsgeschwindigkeit kann auch ein wichtiger regulierender Faktor in der Genexpression sein. Zu Beispielen von Wirtsstämmen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Pilz- oder Hefespezies wie beispielsweise Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula oder bakterielle Spezies wie Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylomicrobium, Methylocystis, Alcaligenes, Synechocystis, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium und Klebsiella.
Mikrobielle Expressionssysteme und Expressionsvektoren, die Regulierungssequenzen enthalten, die Expression mit hohem Niveau auf fremde Proteine richten, sind dem Fachmann bekannt. Alle von diesen könnten verwendet werden, um chimäre Gene zur Erzeugung eines der Genprodukte der vorliegenden Sequenzen aufzubauen. Diese chimären Gene könnten dann über Transformation in passende Mikroorganismen eingeführt werden, um Expression der Enzyme mit hohem Niveau bereitzustellen und den Metabolismus des Wirts zu verändern.
Zum Beispiel werden denitrifizierende Gene in mindestens zwei verschiedenen Prozessen in der Natur, Nitratatmung und Nitratassimilation, verwendet. Nitratatmung ist der Denitrifikationsprozeß, durch welchen Bakterien Nitrat im Gegensatz zu Sauerstoff als finalen Elektronenakzeptor verwenden, um ATP zu synthetisieren. Die Wege und Zwischenverbindungen sind unten in Tabelle 1 zusammen mit den Enzymnamen und Genbezeichnungen auf dem Denitrifikationsweg angegeben.
Bei der Nitratassimilation dient das Nitration an Stelle des Ammoniumions als Stickstoffquelle für die Erzeugung von stickstoffhaltigen Zellbestandteilen wie beispielsweise Aminosäuren und Protein (Tabelle 2) (Zumft, W. G., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 61:533–616 (1997)). Nitratassimilation verwendet mit NADPH (Pyridin-Cofaktor) verknüpfte Reduktasen, während der Atmungsprozeß Cytochrom als Elektronendonore verwendet. Nitratassimilation führt zu Ammoniumbildung, während die Atmung Distickstoff als Endprodukt erzeugt (Gottschalk, G., Bacterial Metabolism (Bakterieller Stoffwechsel), S. 122–126, Springer-Verlag (1985)).
Dementsprechend wird zum Beispiel erwartet, daß die Einführung von chimärem Gen, codierend die vorliegenden bakteriellen Reduktaseenzyme unter der Kontrolle der passenden Promotoren, vergrößerte denitrifizierende Aktivität demonstriert. Es wird überlegt, daß es nützlich sein wird, die vorliegenden Gene in sowohl Wirtszellen mit vorher existierenden Denitrifikationswegen ebenso wie in denjenigen Wirten, denen derartige Wege fehlen, zu exprimieren. Einführung der vorliegenden Reduktasegene in denitrifizierende Bakterien (wie beispielsweise Paracoccus denitrificans, Rhodobacter sphaeroides, Thiosphaera pantotropha und verschiedene Pseudomonas sp.) führt zu erhöhten Niveaus von Reduktaseaktivität, wobei die Geschwindigkeit der Denitrifikation verbessert wird. Außerdem können die vorliegenden Gene auch in nicht denitrifizierende Bakterien eingeführt werden, wo sie von Vorteil sind, um denitrifizierende Eigenschaften in einen nicht denitrifizierenden Organismus zu befördern. Zu nicht denitrifizierenden Bakterien, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Rhodococcus, Streptomyces und Escherichia. Es wird zum Beispiel auch erwartet, daß die Einführung von chimären Genen, die eine oder mehrere von den vorliegenden Sequenzen codieren, die Überwindung oder teilweise Überwindung der Sauerstoffanforderung durch Substituieren von Nitrat, Nitrit, Stickstoffoxid oder Distickstoffoxid an Stelle von Sauerstoff als Elektronenakzeptor in einem obligaten aeroben Erzeugungssystem unterstützen kann.
Vektoren oder Kassetten, die für die Transformation geeigneter Wirtszellen verwendbar sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Typischerweise enthält der Vektor oder die Kassette Sequenzen, die die Transkription und Translation des relevanten Gens richten, einen auswählbaren Marker und Sequenzen, die autonome Replikation oder chromosomale Integration erlauben. Geeignete Vektoren umfassen eine Region 5' von dem Gen, welche Kontrollen transkriptionaler Initiation beherbergt, und eine Region 3' von dem DNA-Fragment, welche transkriptionale Termination kontrolliert. Es wird am meisten bevorzugt, wenn beide Kontrollregionen von Genen abgeleitet sind, die homolog zu der transformierten Wirtszelle sind, obwohl es selbstverständlich ist, daß derartige Kontrollregionen nicht von den Genen abgeleitet sein müssen, die nativ für die als Erzeugungswirt ausgewählten speziellen Spezies sind.
Kontrollregionen der Initiation oder Promotoren, welche verwendbar sind, um die Expression der vorliegenden ORFs in die gewünschte Wirtszelle zu lenken, sind zahlreich und dem Fachmann bekannt. Praktisch jeder Promotor, der imstande ist, diese Gene zu lenken, ist für die vorliegende Erfindung geeignet, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (verwendbar für Expression in Saccharomyces); AOX1 (verwendbar für Expression in Pichia); und lac, ara, tet, trp, lP_L, lP_R, T7, tac und trc (verwendbar für Expression in Escherichia coli) ebenso wie die amy-, apr-, npr-Promotoren und verschiedene Phagen-Promotoren, verwendbar für Expression in Bacillus.
Kontrollregionen der Termination können ebenfalls von verschiedenen Genen abgeleitet werden, die nativ für die bevorzugten Wirte sind. Gegebenenfalls kann eine Terminationsstelle unnötig sein, jedoch wird am meisten bevorzugt, wenn sie eingeschlossen ist.
Es wird erwartet, daß die vorliegenden Nucleotide verwendet werden können, um Genprodukte mit erhöhter oder veränderter Aktivität zu erzeugen. Verschiedenartige Verfahren zum Mutieren einer nativen Gensequenz, um ein Genprodukt mit veränderter oder erhöhter Aktivität zu erzeugen, sind bekannt, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, der fehleranfälligen PCR (Melnikov et al., Nucleic Acids Research (Februar 15, 1999) Bd. 27, Nr. 4, S. 1056–1062); der stellengerichteten Mutagenese (Coombs et al., Proteins (1998), 259–311, 1 Tafel. Herausgeber: Angeletti, Ruth Hogue. Verleger: Academic, San Diego, CA) und des „Gen-Shuffling" (US-Patentschrift 5605793; US-Patentschrift 5811238; US-Patentschrift 5830721 und US-Patentschrift 5837458, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen).
Das Verfahren des Gen-Shuffling ist aufgrund seiner leichten Implementierung und hohen Geschwindigkeit der Mutagenese und Leichtigkeit des Screening besonders attraktiv. Das Verfahren des Gen-Shuffling beinhaltet die Spaltung eines interessierenden Gens mit Restriktionsendonuclease in Fragmente spezifischer Größe in Anwesenheit zusätzlicher Populationen von DNA-Regionen von sowohl Ähnlichkeit mit als auch Unterschied zu dem interessierenden Gen. Dieser Pool von Fragmenten wird dann denaturiert und reanneliert, wobei ein mutiertes Gen erzeugt wird. Das mutierte Gen wird dann auf veränderte Aktivität gescreent.
Die unmittelbaren mikrobiellen Sequenzen der vorliegenden Erfindung können durchdieses Verfahren mutiert und auf veränderte oder erhöhte Aktivität gescreent werden. Die Sequenzen sollten doppelsträngig sein und können verschiedene Längen im Bereich von 50 bp bis 10 kb haben. Die Sequenzen können statistisch zu Fragmenten im Bereich von etwa 10 bp bis 1000 bp digeriert werden, wobei Restriktionsendonuclesen verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Maniatis, vorstehend). Zusätzlich zu den unmittelbaren mikrobiellen Sequenzen können Populationen von Fragmenten, die mit der gesamten oder Anteilen der mikrobiellen Sequenz hybridisierbar sind, hinzugefügt werden. Ähnlich kann eine Population von Fragmenten, welche nicht mit der unmittelbaren Sequenz hybridisierbar sind, ebenfalls hinzugefügt werden. Typischerweise werden diese zusätzlichen Fragmentpopulationen in etwa einem, bezogen auf das Gewicht, 10- bis 20-fachen Überschuß, verglichen mit der gesamten Nucleinsäure, hinzugefügt. Im allgemeinen wird, wenn diesem Prozeß gefolgt wird, die Anzahl verschiedener spezifischer Nucleinsäurefragmente in dem Gemisch etwa 100 bis etwa 1000 betragen. Die gemischte Population von statistischen Nucleinsäurefragmenten wird denaturiert, wobei einsträngige Nucleinsäurefragmente erzeugt werden, und dann reanneliert. Nur diejenigen einsträngigen Nucleinsäurefragmente, die Regionen von Homologie mit anderen einsträngigen Nucleinsäurefragmenten aufweisen, werden reannelieren. Die statistischen Nucleinsäurefragmente können durchErhitzen denaturiert werden. Der Fachmann könnte die Bedingungen bestimmen, die notwendig sind, um die doppelsträngige Nucleinsäure vollständig zu denaturieren. Vorzugsweise beträgt die Temperatur von 80°C bis 100°C. Die Nucleinsäurefragmente können durchAbkühlen reanneliert werden. Vorzugsweise beträgt die Temperatur von 20°C bis 75°C. Die Renaturierung kann durchdie Zugabe von Polyethylenglycol („PEG") oder Salz beschleunigt werden. Eine geeignete Salzkonzentration kann von 0 mM bis 200 mM reichen. Die annelierten Nucleinsäurefragmente werden dann in Anwesenheit von einer Nucleinsäure-Polymerase und dNTPs (d.h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP) inkubiert. Die Nucleinsärue-Polymerase kann das Klenow-Fragment, die Taq-Polymerase oder irgendeine andere auf dem Fachgebiet bekannte DNA-Polymerase sein. Die Polymerase kann zu den statistischen Nucleinsäurefragmenten vor dem Annelieren, gleichzeitig mit dem Annelieren oder nach dem Annelieren hinzugegeben werden. Der Zyklus von Denaturierung, Renaturierung und Inkubation in Anwesenheit von Polymerase wird für eine gewünschte Anzahl von Malen wiederholt. Vorzugsweise wird der Zyklus von 2 bis 50 Mal wiederholt, stärker bevorzugt wird die Abfolge von 10 bis 40 Mal wiederholt. Die resultierende Nucleinsäure ist ein größeres doppelsträngiges Polynucleotid im Bereich von etwa 50 bp bis etwa 100 kb und kann durchein Standardprotokoll von Klonierung und Expression auf Expression und veränderte Aktivität gescreent werden. (Manatis, vorstehend).
Weiterhin kann unter Verwendung des Verfahrens des Gen-Shuffling (Exon-Shuffling) (Nixon et al., PNAS, 94:1069–1073 (1997)) ein Hybridprotein durchFusion von funktionellen Domänen angeordnet werden. Die funktionelle Domäne des vorliegenden Gens kann mit der funktionellen Domäne von anderen Genen kombiniert werden, um neue Enzyme mit der gewünschten katalytischen Funktion hervorzubringen. Ein Hybridenzym kann unter Verwendung von PCR-Überlappungsextensionsverfahren aufgebaut und in die verschiedenartigen Expressionsvektoren kloniert werden, wobei die Techniken verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Viele externe Änderungen, wie beispielsweise Änderungen im Wachstumszustand, die Einwirkung von Chemikalien usw., können Induktion oder Repression von Genen in der Zelle verursachen. Die Induktion oder Repression eines Gens kann für ein Screening-System zur Bestimmung des besten Wachstumszustands für einen Erzeugungsorganismus oder für die Entdeckung von Arzneimitteln mit einer Verbindung mit ähnlicher Wirkungsweise verwendet werden, um einige zu erwähnen. Andererseits kann man durch amplifizierende oder disruptive Gene die Erzeugung der Menge von Zellprodukten ebenso wie die Zeitlinie manipulieren. Alle oder ein Teil der Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung können auch als Sonden für Genexpressionsüberwachung und Genexpressionsprofilierung verwendet werden. Alle nir-Gene können zur Expression und oder Regulierung der Expression durchSauerstoff überwacht werden. Es kann wünschenswert sein, diese Gene durchHerausschlagen von regulierenden Elementen oder Überexprimieren von Regulierungselementen zu deregulieren oder zu dereprimieren.
Zum Beispiel können alle oder ein Teil der vorliegenden Nucleinsäurefragmente auf einer Nylonmembran oder einem Objektträger immobilisiert werden. Ein DNA-Spotter der Generation II (Molecular Dynamics) ist eine von der verfügbaren Technologie zur Anordnung der DNA-Proben auf den beschichteten Objektträgern. Andere Methoden der Anordnung sind ebenfalls verfügbar und auf dem Fachgebiet bekannt. Nachdem die Zellen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen gewachsen oder mit potentiellen Kandidaten behandelt worden waren, wird die zelluläre RNA gereinigt. Fluoreszent oder radioaktiv markierte Ziel-cDNA kann durchreverse Transkription von mRNA hergestellt werden. Das Zielgemisch wird mit den Sonden hybridisiert und unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Bedingungen gewaschen. Die Menge der Zielgenexpression wird durchdie Intensität der Radioaktivitäts- oder Fluoreszenz-Markierung quantifiziert (z.B. konfokales Lasermikroskop: Molecular Dynamics). Die Intensitäten der Radioaktivitäts- oder Fluoreszenz-Markierung an den immobilisierten Sonden werden unter Verwendung der auf dem Fachgebiet bekannten Technologie gemessen. Das Schema des zweifarbigen Fluoreszenznachweises (z.B. Cy3 und Cy5) hat den Vorteil gegenüber radioaktiv markierten Zielen, schnelle und gleichzeitige differentielle Expressionsanalyse von unabhängigen Proben zu erlauben. Außerdem kompensiert die Verwendung von Verhältnismessungen die Variation der Intensität von Sonde zu Sonde aufgrund von DNA-Konzentration und Hybridisierungswirkungsgrad. In dem Fall von Fluoreszenzmarkierung bilden die zwei mit den passenden Anregungs- und Emissionsfiltern erhaltenen Fluoreszenzbilder die Ausgangswerte, aus denen differentielle Verhältniswerte der Genexpression berechnet werden. Die Intensität der Bilder wird unter Verwendung der verfügbaren, auf dem Fachgebiet bekannten Software (z.B. Array Vison 4.0: Imaging Research Inc.) analysiert und normiert, um die differentiellen Wirkungsgrade von Markierung und Nachweis der Markierung zu kompensieren. Es sind auf dem Fachgebiet viele verschiedene Wege bekannt, um die Signale zu normieren. Einer der Wege zur Normierung des Signals erfolgt durch Korrigieren des Signals gegenüber internen Kontrollen. Ein anderer Weg ist es, eine separate Anordnung mit markierter genomisch gelenkter DNA durchzuführen und das Signal mit mRNA-gelenkten Signalen zu vergleichen. Dieses Verfahren erlaubt auch, die Transkripthäufigkeit zu messen. Die Anordnungsdaten des individuellen Gens werden untersucht und ausgewertet, um die Induktion oder Repression des Gens unter den Testbedingungen zu bestimmen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter definiert.
ALLGEMEINE VERFAHREN
Standardmäßige rekombinante DNA und molekulare Klonierungstechniken, die in den Beispielen verwendet werden, sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonen: Ein Handbuch für das Laboratorium); Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1989) (Maniatis) und von T. J. Silhavy, M. L. Bennan und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions (Experimente mit Genfusionen), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und von Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology (Gegenwärtige Protokolle in der Molekularbiologie), veröff. von Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1987), beschrieben.
Materialien und Methoden, die für die Pflege und Vermehrung von Bakterienkulturen geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Techniken, die zur Verwendung in den folgenden Beispielen geeignet sind, können gefunden werden, wie in Manual of Methods for General Bacteriology (Handbuch von Verfahren für die allgemeine Bakteriologie) (Phillipp Gerhardt, R G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R Krieg und G. Briggs Phillips, Hrsg., American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)) oder von Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology (Biotechnologie: Ein Lehrbuch der industriellen Mikrobiologie), Zweite Auflage, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989), dargelegt. Alle Reagenzien, Restriktionsenzyme und Materialien, die für die Vermehrung und Pflege von Bakterienzellen verwendet wurden, wurden von Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) oder Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten, wenn es nicht anderweitig spezifiziert ist.
Manipulationen von genetischen Sequenzen wurden unter Verwendung der Suite von Programmen, erhältlich von der Genetics Computer Group Inc. (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI) bewerkstelligt. Wo das GCG-Programm „Pileup" verwendet wurde, wurden der Default-Wert der Lückenerzeugung von 12 und der Default-Wert der Lückenerweiterung von 4 verwendet. Wo die CGC-Programme „Gap" oder „Bestfit" verwendet wurden, wurden die Default-Strafe der Lückenerzeugung von 50 und die Default-Strafe der Lückenerweiterung von 3 verwendet. In jedem Fall wurden, wo CGC-Programmparameter in diesen oder irgendeinem anderen GCG-Programm nicht eingegeben waren, Default-Werte verwendet.
Die Bedeutung von Abkürzungen ist wie folgt: „h" bedeutet Stunde(n), „min" bedeutet Minuten(n), „s" bedeutet Sekunde(n), „d" bedeutet Tag(e), „ml" bedeutet Milliliter, „1" bedeutet Liter.
BEISPIEL 1
ISOLATION VON METHYLOMONAS 16A
Die das Isolat enthaltende originale Umweltprobe wurde aus Teichsediment erhalten. Das Teichsediment wurde mit Ammonium als Stickstoffquelle unter 25% Methan in Luft direkt in Wachstumsmedium eingeimpft. Methan war die einzige Quelle von Kohlenstoff und Energie. Das Wachstum wurde verfolgt, bis die optische Dichte bei 660 nm stabil war, wonach die Kultur in frisches Medium überführt wurde, derart, daß eine 1:100-Verdünnung erreicht wurde. Nach 3 aufeinander folgenden Überführungen mit Methan als einziger Quelle von Kohlenstoff und Energie wurde die Kultur auf Wachstumsagar mit Ammonium als Stickstoffquelle aufgebracht und unter 25% Methan in Luft inkubiert. Viele methanotrophe Bakterienspezies wurden in dieser Weise isoliert. Jedoch wurde Methylomonas 16a als der Organismus zur Untersuchung ausgewählt, zurückzuführen auf das schnelle Wachstum von Kolonien, große Koloniegröße, Fähigkeit, auf minimalen Medien zu wachsen, und rosa Pigmentierung, Anzeichen eines aktiven Biosyntheseweges für Carotinoide.
BEISPIEL 2
HERSTELLUNG VON GENOMISCHER DNA ZUR SEQUENZIERUNG UND SEQUENZERZEUGUNG
Genomische DNA wurde aus Methylomonas entsprechend Standardprotokollen isoliert.
Genomische DNA und Genbankaufbau wurden entsprechend veröffentlichten Protokollen (Friseur et al., The Minimal Gene Complement of Mycoplasma genitalium (Das minimale Genkomplement von Mycoplasma genitalium); Science 270, 1995) hergestellt. Ein Zellpellet wurde in einer Lösung, enthaltend 100 mM Na-EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM NaCl und 50 mM MgCl₂, resuspendiert.
HERSTELLUNG GENOMISCHER DNA.
Nach der Resuspendierung wurden die Zellen sanft in 10%igem SDS lysiert und für 30 min bei 55°C inkubiert. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur wurde Proteinase K zu 100 μg/ml hinzugefügt und bei 37°C inkubiert, bis die Suspension klar war. DNA wurde zweimal mit Tris-äquilibriertem Phenol und zweimal mit Chloroform extrahiert. DNA wurde in 70%igem Ethanol ausgefällt und in einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl und 1 mM Na-EDTA (TE) pH 7,5, resuspendiert. Die DNA-Lösung wurde mit einem Gemisch von von RNAasen behandelt, dann zweimal mit Tris-äquilibriertem Phenol und zweimal mit Chloroform extrahiert. Diesem folgte Ausfällung in Ethanol und Resuspendierung in TE.
GENBANKAUFBAU.
200 bis 500 μg chromosomale DNA wurden in einer Lösung von 300 mM Natriumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Na-EDTA und 30% Glycerol resuspendiert und mit 12 psi für 60 s in einer Aeromist-Downdraft-Nebulizer-Kammer (IBI Medical Products, Chicago, IL) einer Scherbehandlung unterworfen. Die DNA wurde ausgefällt, resuspendiert und mit Bal3l-Nuclease behandelt. Nach der Größenfraktionierung wurde eine Fraktion (2,0 kb oder 5,0 kb) herausgeschnitten, gereinigt, und ein zweistufiges Ligationsverfahren wurde verwendet, um eine Genbank mit hohem Titer mit mehr als 99% einzelnen Inserts zu erzeugen.
SEQUENZIERUNG:
Eine Herangehensweise mit Schrotsequenzierungsstrategie wurde für die Sequenzierung des gesamten mikrobiellen Genoms angenommen (Fleischmann, Robert et al., Whole-Genome Random sequencing and assembly of Haemophilus influencae (Statistische Sequenzierung und Anordnung des ganzen Genoms von Haemophilus influenzae) Rd Science, 269:1995).
Die Sequenz wurde auf einem Sequenzer ABI Automatic unter Verwendung der Farbstoff Terminator-Technologie ( US 5366860 ; EP 272007 ) unter Verwendung einer Kombination von Vektor- und Insert-spezifischen Primern erzeugt. Sequenzeditierung wurde in entweder DNAStar (DNA Star Inc.) oder dem Wisconsin-GCG-Programm (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI) und dem CONSED-Paket (Version 7.0) durchgeführt. Alle Sequenzen stellen mindestens zweimal Deckung in beiden Richtungen dar.
BEISPIEL 3
IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON BAKTERIELLEN ORFs
ORFs, codierend 1, 3, 5, 7, 9 und 11, wurden zu Beginn identifiziert, indem BLAST-(Basic Local Alignment Search Tool (Basissuchwerkzeug für lokales Alignment); Altschul, S. F., et al., (1993), J. Mol. Biol. 215:403–410; siehe auch www.ncbi.nlm.nhi.gov/BLAST/)-Suchen nach Ähnlichkeit mit Sequenzen, enthalten in der BLAST-„nr"-Datenbank (umfassend alle nicht-redundanten (nr) GenBank-CDS-Translationen, Sequenzen, abgeleitet von der Brookhaven Protein Data Bank mit 3-dimensionaler Struktur, der SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank, EMBL, und den DDBJ-Datenbanken), durchgeführt wurden. Die Sequenzen, die in Beispiel 2 erhalten wurden, wurden auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich verfügbaren DNA-Sequenzen, enthalten in der „nr"-Datenbank, analysiert, wobei der BLASTN-Algorithmus, bereitgestellt durchdas National Center for Biotechnology Information (NCBI), verwendet wurde. Die DNA-Sequenzen wurden in alle Leserahmen translatiert und auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich zugänglichen Proteinsequenzen, enthalten in der „nr"-Datenbank, verglichen, wobei der BLASTP-Algorithmus (Altschul, S. F., et al., Nucleic Acid Res. 25:3389–3402) (1997), bereitgestellt durchdas NCBI, verwendet wurde.
Alle anfänglichen Vergleiche wurden unter Verwendung von entweder dem BLASTNnr- oder BLASTPnr-Algorithmus gemacht. Eine Suche nach genauer Ähnlichkeit wurde unter Verwendung von FASTA (Version 3.2) mit den Einstellungen der Default-Parameter (BLOSUM-50-Bewertungsmatrix, Wortgröße ktup = 2, Lückenstrafe = –12 für den ersten Rest und –2 für jeden zusätzlichen Rest in der Lücke) durchgeführt. Die Ergebnisse des FASTA-Vergleichs sind in Tabelle 3 angegeben, welche die Sequenzen zusammenfaßt, mit welchen sie die meiste Ähnlichkeit haben. Tabelle 3 zeigt Daten, basierend auf dem FASTA-Algorithmus mit Werten, angegeben in Erwartungswerten. Der Erwartungswert schätzt die statistische Bedeutung der Übereinstimmung ab, spezifiziert die Anzahl von Übereinstimmungen mit einer gegebenen Bewertung, die in einer Suche einer Datenbank dieser Größe absolut zufällig erwartet werden.
Gencluster von nir-Genen und dem nor-Gen werden in den 2 und 3 gezeigt.
BEISPIEL 4
DENITRIFIZIERENDE AKTIVITÄT VON METHYLOMONAS 16A

Es wurde gezeigt, daß Zellsuspensionen von Methylomonas 16a sowohl Nitrat als auch Nitrit zu Distickstoffoxid reduzieren, wie in 1 gezeigt ist. Methylomonas 16a wurde in einer Lösung von einfachen Salzen (BTZ-NaNO₃, siehe nachstehende Formulierung des Mediums) mit Nitrat als der einzigen Stickstoffquelle für Zellwachstum vorgezüchtet.

BTZ-NaNO₃	(Pro 1 l Endvolumen)
NaNO₃	0,85 g
KH₂PO₄	0,5 g
MgCl₂·6H₂O	0,2 g
CaCl₂·2H₂O	0,1 g
1M HEPES-Puffer pH 7	50 ml
Lösung 1	10 ml
Na₂SO₄	0,5 g

LÖSUNG 1

Nitrilotriessigsäure	12,8 g
FeCl₂·4H₂O	0,3 g
CuCl₂·2H₂O	0,0254 g
MnCl₂·4H₂O	0,1 g
CoCl₂·6H₂O	0,312 g
ZnCl₂	0,1 g
H₃BO₃	0,01 g
Na₂MoO₄·2H₂O	0,01 g
NiCl₂·6H₂O	0,184 g
	Mischen, Einstellen des pH auf 7 mit 1 M NaOH Endvolumen: 1 l

Zellsuspensionen wurden von den Wachstumskulturen durch Zentrifugation geerntet und in Wachstumsmedium resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in verstöpselte Serumflaschen (60 ml Volumen) unter entweder Methan (25% in Luft) oder (Methanol (100 mM)) eingefüllt und die folgenden Stickstoffquellen wurden hinzugefügt, um die Umwandlung von Nitrat (10 mM), Nitrit (1 mM) oder Ammonium (80 mM) in Distickstoffoxid zu demonstrieren:
Stickstoffquellen:
Nitrat allein
Ammoniak allein
Nitrat + Ammonium
Nitrit + Ammonium
Die Werte von Beispiel 4 zeigen, daß in Abwesenheit von Ammoniak mit entweder Methan oder Methanol Nitrat in Distickstoffoxid umgewandelt wurde. Das Ammoniumion unterdrückte die Reaktion, wie erwartet werden würde, wenn der Reaktionsablauf über die assimilatorische Nitratreduktase (nas-Gen) zu Nitrit fortschreiten würde. Nitrit wurde in Anwesenheit von Ammonium reduziert und es wurde keine Unterdrückung dieser Reaktion bemerkt. Die Daten zeigen auch, daß, obwohl das genetische Potential zur Umwandlung des Ammoniumions in gasförmiges Distickstoffoxid in Methylomonas 16a vorhanden ist, die Zellen dieses Gas aus Ammoniumion nicht erzeugten.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes Nucleinsäurefragment, codierend eine Methylomonas-Nitritreduktase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem isolierten Nucleinsäurefragment, codierend die Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 22; (b) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das mit (a) unter den folgenden Hybridisierungsbedindungen hybridisiert: (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS); und (c) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das zu (a) oder (b) komplementär ist.
Isoliertes Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 21.
Polypeptid, codiert durchdas isolierte Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1.
Polypeptid nach Anspruch 3, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 22.
Chimäres Gen, umfassend das isolierte Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1, operabel verknüpft mit geeigneten Regulierungssequenzen.
Transformierte Wirtszelle, umfassend eine Wirtszelle und das chimäre Gen nach Anspruch 5.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien, Hefe und Fadenpilzen, ausgewählt ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe, bestehend aus Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylomicrobium, Methylocystis, Alcaligenes, Synechocystis, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium, Klebsiella, Paracoccus, Rhodobacter und Thiosphaera, ausgewählt ist.
Verfahren zur Gewinnung eines Nucleinsäurefragments, codierend eine Methylomonas-Nitritreduktase, umfassend: (a) Sondieren einer Genbank mit dem Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1; (b) Identifizieren eines DNA-Klons, der mit dem Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1 hybridisiert; und (c) Sequenzieren des genomischen Fragments, das den in Schritt (b) identifizierten Klon umfaßt, wobei das sequenzierte genomische Fragment eine bakterielle Nitritreduktase codiert.
Verfahren zur Gewinnung eines Nucleinsäurefragments, codierend Methylomonas-Nitritreduktase, umfassend: (a) Synthetisieren eines mindestens einen Oligonucleotid-Primers entsprechend einem Anteil der Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 21, und (b) Amplifizieren eines Inserts, vorhanden in einem Klonierungsvektor, unter Verwendung des Oligonucleotid-Primers von Schritt (a); wobei das amplifizierte Insert einen Anteil einer Aminosäuresequenz codiert, die eine bakterielle Nitritreduktase codiert.
Verfahren zur Reduktion von Nitrit, umfassend: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit dem chimären Gen nach Anspruch 5; (b) Züchten der transformierten Wirtszelle von Schritt (a) in Anwesenheit einer wirksamen Menge von Nitrit und unter Bedingungen, wobei das chimäre Gen exprimiert wird und wo das Nitrit reduziert wird.
Isoliertes Nucleinsäurefragment, codierend eine Methylomonas-Stickoxidreduktase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem isolierten Nucleinsäurefragment, codierend die Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 16, 18 und 20; (b) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das mit (a) unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS); und (c) einem isolierten Nucleinsäurefragment, das komplementär zu (a) oder (b) ist.
Isoliertes Nucleinsäurefragment nach Anspruch 12, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 15, 17 und 19.
Polypeptid, codiert durch das isolierte Nucleinsäurefragment nach Anspruch 12.
Polypeptid nach Anspruch 14, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 16, 18 und 20.
Chimäres Gen, umfassend das isolierte Nucleinsäurefragment nach Anspruch 12, operabel verknüpft mit geeigneten Regulierungssequenzen.
Transformierte Wirtszelle, umfassend eine Wirtszelle und das chimäre Gen nach Anspruch 16.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 17, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien, Hefe und Fadenpilzen, ausgewählt ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe, bestehend aus Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylomicrobium, Methylocystis, Alcaligenes, Synechocystis, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium, Klebsiella, Paracoccus, Rhodobacter und Thiosphaera, ausgewählt ist.
Verfahren zur Gewinnung eines Nucleinsäurefragments, codierend eine Methylomonas-Stickoxidreduktase, umfassend: (a) Sondieren einer Genbank mit dem Nucleinsäurefragment nach Anspruch 12; (b) Identifizieren eines DNA-Klons, der mit dem Nucleinsäurefragment nach Anspruch 12 hybridisiert; und (c) Sequenzieren des genomischen Fragments, das den in Schritt (b) identifizierten Klon umfaßt, wobei das sequenzierte genomische Fragment eine bakterielle Stickoxidreduktase codiert.
Verfahren zur Gewinnung eines Nucleinsäurefragments, codierend eine Methylomonas-Stickoxidreduktase, umfassend: (a) Synthetisieren eines mindestens einen Oligonucleotid-Primers entsprechend einem Anteil der Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 15, 17 und 19; (b) Amplifizieren eines Inserts, vorhanden in einem Klonierungsvektor, unter Verwendung des Oligonucleotid-Primers von Schritt (a); wobei das amplifizierte Insert eine bakterielle Stickoxidreduktase codiert.
Verfahren zur Reduktion von Stickoxid, umfassend: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit dem chimären Gen nach Anspruch 16; (b) Züchten der transformierten Wirtszelle von Schritt (a) in Anwesenheit einer wirksamen Menge von Stickoxid und unter Bedingungen, wobei das chimäre Gen exprimiert wird und wo das Stickoxid reduziert wird.