DE60105596T2

DE60105596T2 - Röntgendiagnostika

Info

Publication number: DE60105596T2
Application number: DE60105596T
Authority: DE
Inventors: Hu Liu; Lili Wang; Wu Xiao
Original assignee: Genesis Group Inc
Current assignee: Genesis Group Inc
Priority date: 2000-06-08
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2021-06-09
Also published as: EP1287016B1; ATE276267T1; AU2001267193A1; WO2001093918A2; WO2001093918A3; US20030194372A1; CA2411586A1; EP1287016A2; DE60105596D1; ES2227221T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Radioimaging-Proben und insbesondere Radioimaging-Proben, die Analoga von Ester und Ethern von polyiodiertem Diacylglyceryl (IDG) sind, und deren Verwendung als radiomarkierte Diagnoseproben für das klinische Radioimaging.
HINTERGRUND
Radioimaging-Proben sind nützliche Hilfsmittel bei der Diagnose einer Reihe von klinisch relevanten Erkrankungen. Kernmedizinische Verfahren, wie z.B. Computertomographie (CT) und Radionukleotidszintigraphie, verwenden diese Proben als nichtinvasive Mittel, um wichtige funktionelle und biochemische Informationen über ein spezielles Organ oder einen zu untersuchenden Bereich zu erhalten. Der Erfolg von Nuclear-Imaging-Verfahren hängt größtenteils von der selektiven Aufnahme des Probenmoleküls vom Zielgewebe ab, was wiederum von der Entwicklung von Proben mit einem hohen Grad an Spezifität für das Zielgewebe abhängt.
Für das Radioimaging sind Probenmoleküle entwickelt worden, die bestimmte inhärente physikalische Eigenschaften besitzen, welche es ihnen ermöglichen, spezifische Zelltypen als Zielgruppe zu nehmen. Um zum Beispiel die hohen Konzentration von Phospholipidethern in den Zellmembranen von Tumorzellen, verglichen mit normalen Zellen, auszunutzen, sind radioiodierte mittel- und langkettige Phospholipidether entwickelt worden. Die Verabreichung dieser in Tween-20 löslich gemachten Ether an Ratten, die anschließend mit einer Carcinosarcoma-Zelllinie beimpft wurden, führte zur selektiven Anreicherung der Radiomarkierung in den Tumorzellen (Kanadische Patentanmeldung Nr. 2 276 284).
Ein alternatives Verfahren zur Ausrichtung von Radioimaging-Proben auf spezielle Zielbereiche oder -gewebe besteht darin, sie in ein zielgerichtetes Trägervehikel einzubauen. Beispiele für solche Vehikel sind u.a. Liposome, chemisch modifizierte Low-Density-Lipoproteine (LDL) und synthetische Emulsionen. Der Nutzen solcher Trägervehikel auf Lipidbasis beruht darauf, daß sie natürliche, im Körper vorkommende Verbindungen nachahmen. Insbesondere hat chemisch modifiziertes LDL aufgrund der Anwesenheit spezifischer Rezeptoren sowohl für natives LDL als auch für modifiziertes LDL in einer Reihe von menschlichen Geweben, einschließlich Hepatozyten, peripheren Blutlymphozyten, Glattmuskelzellen, Makrophagen und Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS), eine bedeutende Wirkung als zielgerichtetes Trägervehikel. Rezeptoren für modifiziertes LDL, die AcLDL- oder "Scavenger"-Rezeptoren, sind für die Bindung, die Internalisierung und die nachfolgende Beseitigung von durch Oxidation, Glycosylierung, Alkylierung oder Nitrierung modifizierten Lipoproteinen verantwortlich. Als solche sind Scavenger-Rezeptoren hauptsächlich an aktivierten Makrophagen, dendritischen Zellen und den Kupffer-Zellen der Leber zu finden. Die Scavenger-Rezeptor-Expression findet jedoch auch in anderen Zellen statt, einschließlich Endothelzellen, Aorta-Glattmuskelzellen, Nervenzellen und Keratinozyten. Erkrankungen, die von einer Lipoproteinoxidation begleitet werden, wie z.B. Atherosklerose, Alzheimer-Krankheit, Glomerulosklerose und Ataxie mit Vitamin-E-Mangel, können daher das gemeinsame Merkmal einer ungeregelten Expression von Scavenger-Rezeptoren besitzen [Zingg et al., IUBMB Life, 49:397–443 (2000)]. Es wurde auch gezeigt, daß die Deregulierung der LDL-Rezeptorexpression und/oder eine erhöhte LDL-Rezeptoraktivität ein Merkmal einer Reihe von Krebszelllinien ist [Ho et al., Blood 52:1099–1104 (1978); Rudling et al., Cancer Res., 50:483–487 (1990); Chen und Hughes-Fulford, Int. J. Cancer, 91:41–45 (2001)], und die Wirksamkeit von LDL als Träger für Arzneistoffe gegen Krebs wurde untersucht [Gal et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 139:877–885 (1981); Masquelier et al., Cancer Res., 46:3842-3847 (1986); Lundberg, Cancer Res., 47:4105–4108 (1987); Firestone, Bioconjug. Chem., 5:105–113 (1994)].
Mit der Verwendung von LDL als Trägervehikel gehen jedoch zwei größere Einschränkungen einher. Erstens muß modifiziertes LDL in dem Zielgewebe mit einer großen Population an nativem LDL konkurrieren. Diese Konkurrenz erfordert hohe Konzentrationen von in den Träger eingebauten Proben, um sicherzustellen, daß ausreichende Mengen den Zielzellen zugeführt werden. Zweitens bestehen Radioimaging-Proben, die entwickelt wurden, um mittels LDL-Teilchen zugeführt zu werden, üblicherweise entweder aus Oberflächenkomponenten (d.h. Apolipoprotein B-100 (apo B) oder kurzen, auf der apo-B-Sequenz basierenden Peptiden) oder aus Kernkomponenten (d.h. Cholesterinether (CE)), markiert mit einem geeigneten Radioisotop. Sowohl apo-B als auch CE reagieren extrem empfindlich auf die Hydrolyse durch Lysosomalenzyme in vivo. Der nachfolgende Transport der hydrolysierten Fragmen te aus den Zielzellen heraus führt zum Verlust des Radiosignals und zu einer schwachen Bildqualität. Da apo B für die Wechselwirkung von LDL mit seinem Zellrezeptor entscheidend ist, kann darüber hinaus die Radiomarkierung dieses Oberflächenelements die Wechselwirkung zwischen nativem LDL und Rezeptor stören. Auf apo-B-Protein basierende Proben erzielten jedoch einen gewissen Erfolg. Zum Beispiel liefert ein auf der Sequenz von apo B basierendes radiomarkiertes kurzes Peptid derzeit vielversprechende Ergebnisse in einer klinischen Multi-Center-US-Studie [Lees und Lees, Atherosclerosis X, S. 999–1000, Elsevier Scientific (1995)].
Um die Störung der LDL-Rezeptor-Bindung zu verhindern, wurden Kernkomponenten des LDL markiert. Ein weiterer möglicher Vorteil der Markierung von Kernkomponenten ist, daß bestimmte Zellen, insbesondere die der Leber, der Nebennieren und des Ovariums, in der Lage sind, eine unverhältnismäßig größere Menge an Kernlipid aufzunehmen als das Oberflächenprotein [Glass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:5435–5439 (1983); Glass et al., J. Biol. Chem., 260:744–750 (1985); Leitersdorf et al., Biochim. Biophys. Acta, 878:320–329 (1986)], was bei der Erhöhung der Spezifität von auf CE basierenden Proben hilfreich sein kann. Angesichts der leichten Hydrolyse von nativem CE richteten sich die Versuche zur Entwicklung von auf Kern-LDL-Komponenten basierenden Proben jedoch auf Analoga, die eine höhere Hydrolysebeständigkeit aufweisen.
Ein nichthydrolysierbares Analogon von CE, das entwickelt wurde, ist Cholesteriniopanoat (CI) [Seevers et al., J. Med. Chem., 25:1500–1503 (1982)]. Die Untersuchung von radiomarkiertem CI als Mittel zur Ausrichtung von Imaging-Proben auf spezifische Zielgewebe hat die Wirksamkeit von Lipoproteinen als Trägervehikel bestätigt. Voruntersuchungen zeigten, daß ¹²⁵I-markiertes CI sich vorzugsweise im Atherom anstatt in normalem Arteriengewebe anreichert [DeGalen et al., Pharmaceut. Res., 3:52–55 (1986)], und jüngere Studien berichteten über den erfolgreichen Nachweis atherosklerotischer Läsionen durch Verwendung eines radiomarkierten Konjugats aus CI und acetyliertem LDL (AcLDL) [Xiao et al., Pharm. Res., 16:420–426 (1999)]. Es wurde gezeigt, daß das radiomarkierte CI-Konjugat sich selektiv in den Bereichen der atherosklerotischen Läsion der Arterien anreichert, was die Eignung von sowohl CI als Probenmolekül als auch von chemisch modifizierten Lipoproteinen, wie z.B. AcLDL, als zielgerichtete Trägervehikel beweist.
LDL-Teilchen enthalten sowohl CE als auch Triglyceride im inneren Kern.
In einer weiteren Studie wurde eine hydrolysebeständige Probe entwickelt, die auf der Triglyceridstruktur basiert. Diese Verbindung, 1,3-Dihydroxypropan-2-on-1,3-diiopanoat (DPIP), wurde mit ¹²⁵I radiomarkiert und in das AcLDL eingebaut. Es wurde gezeigt, daß das ¹²⁵I-DPIP/AcLDL-Konjugat selektiv von Zervix-Krebszelllinien aufgenommen wird [Xiao et al., Radiat. Res., 152:250–256 (1999)].
In Mikroemulsionen dispergierte Radioimaging-Proben wurden für eine zielgerichtete Zufuhr an die Leber entwickelt. Es wird vermutet, daß die speziellen Zielausrichtungseigenschaften von Mikroemulsionen auf ihre große Ähnlichkeit mit Chylomikron-Resten zurückzuführen sind. Chylomikronen sind natürlich vorkommende Lipoproteine, die Triglyceride und Cholesterin vom Intestinaltrakt abtransportieren. Endogene Lipasen hydrolysieren die Triglyceridkomponente der Chylomikronen, und die resultierenden cholesterinreichen Reste sind als Chylomikron-Reste bekannt. Wie andere Lipoproteine, sind Chylomikron-Reste mit bestimmten Apoproteinen assoziiert; in diesem Fall apo B und apo E. Chylomikron-Reste werden durch die Leber mittels eines rezeptorvermittelten Verfahrens, das apo B und apo E erkennt, rasch aus dem Kreislauf entfernt.
Eine der vielversprechenderen Radioproben auf Emulsionsbasis, eine Emulsion von iodiertem Mohnsamenöl in Salzlösung, als EOE-13 bekannt, wurde in den USA ausgiebig an Tieren und Menschen untersucht. Obwohl diese Probe eine gute zielgerichtete Zufuhr an die Leberzellen und eine annehmbare diagnostische Effizienz ergab, wurde über ein starkes Auftreten von schädlichen Nebenwirkungen berichtet [Miller et al., Am. J. Radiol., 143:235–243 (1984)].
Andere auf Mikroemulsion basierende Radioimaging-Proben sind u.a. iodierte Triglyceride in synthetischen Lipidemulsionen, die auf Leberzellen als Ziel ausgerichtet sind. Diese Triglyceride, deren Struktur auf 2-Oleoylglycerin-1,3-bis[ω-(3-amino-2,4,6-triiodphenyl)alkanoaten] basiert, zeigten hohe Einbaumengen in die Emulsionen und eine gute Hepatozytenselektivität [US-Patent Nr. 5 654 452; Weichert et al., J. Med. Chem., 17:636–646 (1995); Weichert et al., J. Pharm. Sci., 85:908-914 (1996)].
Kürzlich ist ein neues Verfahren zur Verwendung von Mikroemulsionen zur Verbesserung des Einbaus eines Radiopharmazeutikums in LDL entwickelt worden. Dieses Verfahren verwendet eine Mikroemulsion als Donorteilchen, um die Radioimaging-Probe DPIP an AcLDL-Teilchen mit hoher Effizienz zu übertragen [Xiao et al., Lipids, 34:503–509 (1999)]. Mehrere Kernlipide wurden in den Donor-Mikroemulsionen getestet, einschließlich Triolein, Canolaöl, Squalen und Robbenöl, wobei sich Robbenöl als am wirksamsten erwies.
LDL und Mikroemulsionen bewiesen somit einen guten praktischen Nutzen zur zielgerichteten Zufuhr diagnostischer und therapeutischer Verbindungen. Um jedoch die Wirksamkeit dieser Trägervehikel auf dem Gebiet des klinischen Radioimagings zu erhöhen, müssen die Einbaumengen der radiomarkierten Probe in das Trägervehikel maximiert werden. Verbesserte Probenmoleküle, die hohe Einbaumengen in LDL-Teilchen und Mikroemulsionen zur zielgerichteten Zufuhr aufweisen, würden auf dem Gebiet der Radioimaging-Diagnostik einen bedeutenden Fortschritt darstellen.
Diese Hintergrundinformation wird zum Zwecke der Bekanntgabe von Information, von der die Anmelder glauben, daß sie für die vorliegende Erfindung möglicherweise von Interesse ist, zur Verfügung gestellt. Es ist notwendigerweise kein Zugeständnis beabsichtigt, noch sollte es als solches ausgelegt werden, daß irgendeine der vorherigen Informationen Stand der Technik gegenüber der vorliegenden Erfindung darstellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel dieser Erfindung ist es, neue Radioimaging-Proben zur Verfügung zu stellen. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung der Formel (I) zur Verfügung gestellt:
wobei:
n eine Zahl zwischen 1 und 16 ist,
jede R-Gruppe unabhängig H oder I ist, wobei zwischen 2 und 6 R-Gruppen I sein müssen,
R' und R" unabhängig H, (C₁-C₄)-Alkyl oder eine Aminschutzgruppe sind,
R1 H oder (C₁-C₆)-Alkyl ist, wobei das genannte Alkyl gegebenenfalls substituiert ist mit Alkyl, Aryl oder Cycloalkyl,
R2 H ist,
R3 H ist, oder R2 und R3 zusammengefaßt =O bedeuten, und
R4 ist:
wobei:
die Bindung --- eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet,
R5 H, OR''' oder R''' ist, wobei R''' (C₁-C₆)-Alkyl ist,
R6 H ist oder fehlt,
R7 H ist oder fehlt,
R8 H, (C₁-C₆)-Alkyl oder (C₂-C₆)-Alkenyl ist,
R9 H ist oder fehlt,
R10 H ist oder fehlt,
R11 und R12 unabhängig H, R''' oder OR''' sind, oder R11 und R12 zusammengefaßt =O sind,
mit der Maßgabe, daß, wenn R9 und R10 fehlen und die Bindung --- zwischen den R9 und R10 tragenden Kohlenstoffatomen eine Doppelbindung ist, R8 dann H oder (C₁-C₆)-Alkyl ist, und daß zwei benachbarte Bindungen, die als --- bezeichnet sind, nicht gleichzeitig Doppelbindungen sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die ein oder mehrere Verbindungen der Formel (I) und ein geeignetes Trägervehikel umfaßt. Beispiele für geeignete Trägervehikel sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Liposome, Low-Density-Lipoprotein (LDL), modifiziertes LDL und synthetische Mikroemulsionen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung von Verbindungen der Formel (I) und Zusammensetzungen, die diese Verbindungen umfassen, für das diagnostische Radioimaging zur Verfügung. Die Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Gewebe und Organe in einem Säugetier, die hohe Konzentrationen an LDL-Rezeptoren enthalten, wie z.B. atherosklerotische Läsionen, Leberzellen, Nervenzellen und Tumorzellen, sichtbar zu machen. Es ist vorgesehen, daß die Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für diagnostische Zwecke eingesetzt werden können, um das Auftreten und/oder das Ausmaß einer Erkrankung zu ermitteln, welche den/die Zielbereich (e) betrifft, sowie das Fortschreiten der Erkrankung und/oder die Wirksamkeit einer Behandlung, die man dem betroffenen Säugetier zukommen läßt, zu überwachen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Diagnosekit zur Verfügung gestellt, umfassend die Verbindung der Formel (I), ein geeignetes Trägervehikel, Reagenzien, die für die Radiomarkierung der Verbindung mit einem geeigneten Radioisotop von Iod notwendig sind, und eine Bedienungsanleitung. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Kits zur Herstellung einer radiomarkierten Diagnoseverbindung zur Verwendung beim Radioimaging zur Verfügung, umfassend die Verbindung der Formel (I) und zur Radiomarkierung der Verbindung mit einem geeigneten Radioisotop von Iod geeignete Reagenzien. Die Kits können ferner Emulgatoren und Kernlipide enthalten, die zur Herstellung einer Mikroemulsion notwendig sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Lipidfärbung (linkes Feld) und das Autoradiogramm (rechtes Feld) einer Probenaorta aus einer Gruppe von Kaninchen, die cholesterinreiches Futter erhielt.
2 zeigt die Lipidfärbung (linkes Feld) und das Autoradiogramm (rechtes Feld) einer Probenaorta aus einer Gruppe von Kaninchen, die cholesterinreiches Futter mit einer Behandlung mit antiatherogenem Arzneistoff erhielt.
3 zeigt die Lipidfärbung (oberes Feld) und Autoradiogramme (unteres Feld) von Aorten von ApoE/LDL-Rezeptor-Doppel-Knockout-Mäusen, die ein normales Futter erhielten.
4 liefert eine graphische Darstellung der relativen biologischen Verteilung von ¹²⁵I-C2I in ApoE/LDL-Rezeptor-Doppel-Knockout-Mäusen und Kontrollmäusen nach der intravenösen Injektion von ¹²⁵I-C2I/AcLDL.
5 liefert eine graphische Darstellung der relativen biologischen Verteilung von ¹²⁵I-C2I in ApoE/LDL-Rezeptor-Doppel-Knockout-Mäusen und Kontrollmäusen nach der intravenösen Injektion von ¹²⁵I-C2I/Mikroemulsion.
Die 6 und 7 zeigen die Lipidfärbung (linkes Feld) und Phosphorbilder (rechtes Feld) von Aorten von ApoE/LDL-Rezeptor-Doppel-Knockout-Mäusen, denen ¹²⁵I-C2I/AcLDL injiziert wurde.
Die 8 und 9 zeigen die Lipidfärbung (linkes Feld) und Phosphorbilder (rechtes Feld) von Aorten von ApoE/LDL-Rezeptor-Doppel-Knockout-Mäusen, denen ¹²⁵I-C2I/Mikroemulsion injiziert wurde.
Die 10 und 11 zeigen die Lipidfärbung (linkes Feld) und Phosphorbilder (rechtes Feld) von Aorten von Kontrollmäusen.
12 zeigt die rezeptorvermittelte Aufnahme von ¹²⁵I-DPIP/LDL durch die Zervix-Krebszelllinie HeLa.
13 zeigt die rezeptorvermittelte Aufnahme von ¹²⁵I-DPIP/LDL durch die Zervix-Krebszelllinie SiHa.
14 zeigt die rezeptorvermittelte Aufnahme von ¹²⁵I-DPIP/LDL durch die Zervix-Krebszelllinie C-33A.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das hochqualitative Radioimaging hängt von der maximalen Anreicherung einer radiomarkierten Probe mit einer hochspezifischen Radioaktivität in dem darzustellenden Gewebe ab. Diese Erfindung stellt hydrolysebeständige Analoga von Estern von polyiodiertem Diacylglyceryl(IDG) zur Verwendung als radiomarkierte Proben für das diagnostische Radioimaging zur Verfügung. Ähnlich wie Cholesteriniopanoat (CI), basieren diese IDG-Analoga auf der Struktur von nativem Cholesterinester (CE), der in LDL-Teilchen vorkommt, sie sind jedoch entweder vollkommen resistent gegen die Lysosomalenzymhydrolyse oder werden nur langsam hydrolysiert. Als solche werden diese Verbindungen im Inneren der Zielzellen eingeschlossen, und die Strahlung, die sie aussenden, wird daher im Zielgewebe lokalisiert. Ein weiterer Vorteil der IDG-Analoga der vorliegenden Erfindung ist der Einbau von zwei bis sechs Iodatomen in jedes Molekül, wobei die spezifische Radioaktivität erhöht wird und Bilder mit besserer Qualität erzeugt werden können, wenn diese Probenmoleküle verwendet werden. Zusätzlich wird die hochspezifische Aktivität der Verbindungen dabei behilflich sein, die Auswirkung der unvermeidlichen Verdünnung des Radioisotops im Kreislauf zu minimieren.
Definitionen
Der Ausdruck "LDL-Rezeptor" (LDLR), so wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Rezeptor, der in der Lage ist, LDL oder modifiziertes LDL zu binden und zu internalisieren, und er umfaßt sowohl native LDL-Rezeptoren als auch die Familie von Scavenger-Rezeptoren, die bei Säugetieren vorkommt.
Der Ausdruck "Trägervehikel", so wie er hier verwendet wird, bedeutet einen biologisch verträglichen Träger, der in der Lage ist, eine synthetische Verbindung, wie z.B. die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung, im Blutstrom eines Säugetiers zu transportieren. Beispiele sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Liposome, antikörpergebundene Konjugate, Kohlenwasserstoffderivate der zielgerichteten Mikroemulsionen der Verbindung, LDL oder chemisch modifiziertes LDL (wie z.B. acetyliertes LDL oder oxidiertes LDL).
Sofern nichts anderes angegeben ist, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die gleiche Bedeutung, wie sie vom Fachmann, für den diese Erfindung bestimmt ist, üblicherweise verstanden werden.
Die Probenmoleküle der vorliegenden Erfindung sind Analoga von IDG-Estern und haben die folgende Formel (I):
wobei:
n eine Zahl zwischen 1 und 16 ist,
jede R-Gruppe unabhängig H oder I ist, wobei zwischen 2 und 6 R-Gruppen I sein müssen,
R' und R" unabhängig H, (C₁-C₄)-Alkyl oder eine Aminschutzgruppe sind,
R1 H oder (C₁-C₆)-Alkyl ist, wobei das genannte Alkyl gegebenenfalls substituiert ist mit Alkyl, Aryl oder Cycloalkyl,
R2 H ist,
R3 H ist, oder R2 und R3 zusammengefaßt =O bedeuten, und
R4 ist:
wobei:
die Bindung --- eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet,
R5 H, OR''' oder R''' ist, wobei R''' (C₁-C₆)-Alkyl ist,
R6 H ist oder fehlt,
R7 H ist oder fehlt,
R8 H, (C₁-C₆)-Alkyl oder (C₂-C₆)-Alkenyl ist,
R9 H ist oder fehlt,
R10 H ist oder fehlt,
R11 und R12 unabhängig H, R''' oder OR''' sind, oder R11 und R12 zusammengefaßt =O sind,
mit der Maßgabe, daß, wenn R9 und R10 fehlen und die Bindung --- zwischen den R9 und R10 tragenden Kohlenstoffatomen eine Doppelbindung ist, R8 dann H oder (C₁-C₆)-Alkyl ist, und daß zwei benachbarte Bindungen, die als --- bezeichnet sind, nicht gleichzeitig Doppelbindungen sind.
Herstellung und Radiomarkierung der Probenmoleküle
I. Herstellung von Verbindungen der Formel (I)
Die Verbindungen der Formel (I) können wie in Schema I gezeigt durch Verwendung einer Kombination aus herkömmlichen präparativen Schritten und Gewinnungsverfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet der organischen Synthese bekannt sind, hergestellt werden. Die Ausgangsverbindung (1) wird mit Dihydroxyaceton oder dessen Alkalimetallsalz in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels gekuppelt, um Verbindung (2) zu erhalten. Verbindung (2) wird anschließend durch Verwendung eines Alkalimetallborhydrids, wie z.B. Natriumborhydrid, reduziert, um eine Verbindung der Strukturformel (3) zu erhalten. Verbindung (3) wird weiter mit einem Halogensterylderivat (5) in Gegenwart einer geeigneten Base, wie z.B. Natriumhydrid, und einem geeigneten Lösungsmittel gekuppelt, um die Verbindung (I) zu ergeben. Halogensterylderivate der Strukturformel (5) können leicht aus im Handel erhältlichen Cholesterin- und Sterolderivaten der Strukturformel (4) durch Anwendung von Standardreaktionen, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden, wobei eine Hydroxygruppe in eine Halogengruppe umgewandelt wird, zum Beispiel durch Reaktion entweder mit Thionylchlorid oder mit Thionylbromid.
Ein Sterolderivat kann eines der im Handel erhältlichen Sterole sein, oder es kann ein Derivat von einem jener Sterole sein, die leicht durch Standardsyntheseverfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt werden können. Im Handel erhältliche Sterole sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, β-Sitosterol, Dihydrocholesterin, 7-Dehydrocholesterin, 22-Hydroxycholesterin, 25-Hydroxycholesterin, 3-Cholesten-3β-ol-7-on, 5α-Cholestan-3β-ol, 5α-Cholest-7-en-3β-ol, 7β-Hydroxycholesterin, Campesterol, Desmosterol, Ergosterol, Fucosterol, Lanosterol und Stigmasterol.
Schema I
Die zur Herstellung von Probenmolekülen der Strukturformel (I) verwendeten Ausgangsverbindungen der Formel (1) sind entweder im Handel erhältlich oder können aus anderen im Handel erhältlichen Ausgangsmaterialien unter Verwendung von Standardreaktionen, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Beispiele für einige der allgemeinen Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1) sind in den nachstehenden Schemata II-V (Verfahren A-D) angegeben. Diese Verfahren dienen lediglich der Veranschaulichung und können von den Fachleuten modifiziert werden, um Verbindungen der Formel (I) gemäß der Erfindung herzustellen [Weichert et al., J. Med. Chem., 29:1675–1682 (1986); Weichert et al., J. Med. Chem., 38:636–646 (1995)].
II. Herstellung von Verbindungen der Formel (1)
Verfahren A
Ein Beispiel für ein Verfahren zur Synthese von Verbindungen der Formel (1), bei denen R2 und R3 zusammengefaßt =O sind, ist in Schema I skizziert. Bromethylester (6) wird mit Triphenylphosphin umgesetzt, um ein Triphenylphosphoniumsalz (7) zu bilden, das bei der Kondensation mit m-Nitrobenzaldehyd in Gegenwart einer geeigneten Base zur Bildung von Verbindung (8) führt. Verbindung (8) wird unter katalytischen Hydrierungsbedingungen reduziert, um Verbindung (9) zu ergeben, die anschließend mit Iodmonochlorid in Gegenwart von Säure behandelt wird, um Verbindung (10) zu erhalten. Verbindung (10) wird anschließend hydrolysiert, um Verbindung (1) zu ergeben, worin R1 H ist und Z OH ist. Alternativ kann Verbindung (8) zunächst mit Hydroxylaminsulfat in Gegenwart von Hydroxylamin-O-sulfonsäure behandelt werden, um Verbindung (11) zu erhalten, welche dann Standard-α-Alkylierungsbedingungen unterworfen wird, gefolgt von der Reduktion unter katalytischen Bedingungen, um Verbindung (12) zu ergeben. Verbindung (12) wird mit ICl in Gegenwart von Säure behandelt, gefolgt von der Hydrolyse der Estergruppe, um Verbindung (1) zu ergeben, wobei R1 anders als H ist und Z OH ist. Die Bromethylester der Strukturformel (6) sind entweder im Handel erhältlich oder können durch Standardreaktionen, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.
Verbindung (9) oder Verbindung (12) kann alternativ Teiliodierungsbedingungen unterworfen werden, um Verbindungen der Formel (1) zu erhalten, die mono- oder diiodsubstituiert sind.
Ein weiteres alternatives Verfahren, um monoiodierte Verbindungen der Formel (1) zu erhalten, wäre, Verbindung (11) der α-Alkylierung zu unterwerfen, gefolgt von der Iodierung, Hydrierung und Hydrolyse.
Schema II
Verfahren B
Ein weiteres Verfahren zur Synthese von Verbindungen der Formel (1), bei denen R2 und R3 zusammengefaßt =O sind, ist in Schema III skizziert und umfaßt die Reaktion eines Kupferreagenzes (das leicht aus Iodethylester (13) durch Umsetzung mit Zink und dem Dilithiosalz von CuCN hergestellt werden kann) mit m-Nitrobenzylbromid, um die Verbindung der Formel (14) zu ergeben. Verbindung (14) kann, wie in Schema II gezeigt, durch Verwendung von Standardreaktionsbedingungen in Verbindung (1) umgewandelt werden, bei der R1 H ist und Z OH ist. Alternativ kann Verbindung (14) katalytischen Hydrierungsbedingungen unterworfen werden, um Verbindung (15) zu ergeben, die dann in Verbindung (1) umgewandelt werden kann, wobei R1 anders als H ist und Z OH ist, wie es in Schema II beschrieben ist. Iodethylester der Strukturformel (13) sind entweder im Handel erhältlich oder können aus anderen im Handel erhältlichen Ausgangsmaterialien durch Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.
Schema III
Verfahren C
Schema IV skizziert ein weiteres mögliches Verfahren zur Synthese von Verbindungen der Formel (1), bei denen R2 und R3 zusammengefaßt =O sind. m-Nitrobenzylbromid wird mit Triphenylphosphin umgesetzt, um das Triphenylphosphoniumsalz (16) zu ergeben, das bei der Kondensation mit Aldehyd (17) in Gegenwart einer geeigneten Base und eines geeigneten Lösungsmittels zur Bildung von Verbindung (18) führt. Verbindung (18) kann dann der katalytischen Hydrierung, Iodierung und Hydrolyse unterworfen werden, wie es in Schema II skizziert ist, um Verbindung (1) zu ergeben, bei der R1 H ist, Z OH ist und n 2–16 ist. Alternativ kann Verbindung (18) zunächst mit Hydroxylaminsulfat in Gegenwart von Hydroxylamin-O-sulfonsäure umgesetzt werden, um Verbindung (21) zu ergeben, die dann Standard-α-Alkylierungsbedingungen, der katalytischen Hydrierung, der Iodierung und der Hydrolyse unterworfen werden kann, wie es in Schema II skizziert ist, um Verbindung (1) zu ergeben, bei der R1 anders als H ist, Z OH ist und n 2–16 ist. Aldehyd (17) ist entweder im Handel erhältlich oder kann durch Standardreaktionen, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.
Schema IV
Verfahren D
Verbindungen der Formel (1), bei denen n = 1 ist und R1 anders als H ist, können auch durch das in US-Patent Nr. 2 705 726 beschriebene und in Schema V skizzierte Verfahren hergestellt werden. Gemäß diesem Verfahren wird m-Nitrobenzaldehyd mit Säureanhydrid (23) in Gegenwart einer geeigneten Base umgesetzt, um Verbindung (24) zu ergeben. Verbindung (24) wird unter katalytischen Hydrierungsbedingungen reduziert, um Verbindung (25) zu ergeben, die mit Iodmonochlorid in Gegenwart von Säure behandelt wird, um Verbindung (1) zu ergeben, bei der n = 1 ist, R1 anders als x ist und Z OH ist. Säureanhydride der Formel (23) sind entweder im Handel erhältlich oder können durch Standardreaktionen, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.
Schema V
Falls notwendig, können Verbindungen der Formel (1), bei denen R2 und R3 zusammengefaßt =O sind und Z OH ist, mit einem Alkalimetallhydrid, wie z.B. Lithiumaluminiumhydrid, wie in Schema VI gezeigt reduziert werden, um Verbindungen der Formel (1) zu ergeben, bei denen R2 und R3 H sind und Z OH ist.
Schema VI
Alle Verbindungen der Formel (1), bei denen Z OH ist, können durch Standardreaktionen, wie z.B. durch Umsetzung mit Thionylhalogenid oder Phosphorhalogenid, welche den Fachleuten bekannt sind, in eine Verbindung der Formel (1), bei der Z Halogen ist, umgewandelt werden. Ein Fachmann wird auch erkennen, daß Verbindungen der Formel (1), bei denen R' und R" anders als H sind, aus Verbindungen der Formel (1), bei denen R' und R" H sind, durch Umsetzung mit einer Aminschutzgruppe oder einem Alkylhalogenid unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden können.
Es ist zu verstehen, daß die vorliegende Erfindung Stereoisomere sowie optische Isomere, z.B. Mischungen aus Enantiomeren sowie einzelne Enantiomere und Diastereoisomere, die als Folge der strukturellen Asymmetrie bei ausgewählten Verbindungen der vorliegenden Erfindung entstehen, umfaßt.
Ohne die vorliegende Erfindung auf einen speziellen Wirkmechanismus einzuschränken, nehmen die Erfinder an, daß die Wirksamkeit der Probenmoleküle der vorliegenden Erfindung die Folge der erhöhten Hydrophobizität ist, die sich durch die Sterylethersubstituenten an der 2-Stellung am Glycerylrest (R4 in Formel (I)) ergibt. Die Fachleute werden erkennen, daß viele chemische Modifizierungen an diesem Sterylrest durchgeführt werden können. Es ist daher beabsichtigt, daß der Umfang der vorliegenden Erfindung Analoga des Sterylrestes umfaßt, welche die Gesamthydrophobizität des Moleküls erhalten.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Probenmolekül Cholesterin-1,3-diiopanoatglycerylether (C2I, Verbindung II), bei dem der Sterolrest von Cholesterin stammt.
III. Radiomarkierung der Probenmoleküle
Die IDG-Analoga der vorliegenden Erfindung können leicht mit einem der klinisch verwendeten Radioisotope von Iod, ¹²²I, ¹²³I, ¹²⁵I oder ¹³¹I radiomarkiert werden. Die lange Halbwertszeit von ¹²⁵I (60 Tage) macht es zu einem außergewöhnlich nützlichen Isotop sowohl für die In-vivo-Untersuchung als auch für chemische oder biologische Voruntersuchungen bei Tieren. Beim klinischen Radioimaging wird das ¹²⁵I üblicherweise durch ¹²³I oder ¹³¹I ersetzt, die beide eine sehr gute Bilderzeugungsenergie und kürzere Halbwertszeiten besitzen. ¹³¹I ist leicht erhältlich und wirtschaftlich, und es ist das am häufigsten für die Organdarstellung bei Menschen eingesetzte Radioisotop von Iod.
Die IDG-Analoga der vorliegenden Erfindung können durch Isotopenaustauschverfahren, welche den Fachleuten gut bekannt sind, radiomarkiert werden. Im allgemeinen umfaßt ein Isotopenaustausch die Umsetzung des Substrats in einer "Schmelze" mit Radioiod unter Verwendung eines geeigneten Reaktionsmediums und erhöhten Temperaturen. Die Dielektrizitätskonstante des geschmolzenen Reaktionsmediums ist ausreichend hoch, um beide Reaktanden löslich zu machen. Für diesen Zweck kann das Reaktionsmedium zum Beispiel Benzoesäure, Acetamid oder Pivalinsäure (Trimethylessigsäure) sein [siehe zum Beispiel Weichert et al., Appl. Radiat. Isot., 37:907–913 (1986)]. Sobald die Austauschreaktion beendet ist, kann die radiomarkierte Verbindung durch ein geeignetes Verfahren, welches leicht von den Fachleuten ermittelt werden kann, gereinigt werden.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird C2I durch Radioiodaustausch in Pivalinsäure mit ¹²⁵I radiomarkiert. Bei diesem Verfahren wird C2I in ein verschlossenes Röhrchen gegeben, zu dem frisch destilliertes Tetrahydrofuran (THF) und wäßriges Na¹²⁵I der Reihe nach zugegeben werden. Anschließend wird ein leichter Stickstoffstrom angelegt, um die Lösungsmittel abzudampfen, und die feste Pivalinsäure wird zu dem trockenen Rückstand hinzugegeben. Das Röhrchen wird zum Teil in ein Ölbad eingetaucht, welches auf 155–160°C vorgeheizt wurde. Die Isotopenaustauschreaktion ist bei dieser Temperatur nach 1–2 Stunden im wesentlichen beendet, worauf man das Reaktionsröhrchen abkühlen läßt und die Inhalte in trockenem THF löst. Die Reaktion kann durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer kleinen Probe, die an diesem Punkt entnommen und unter Ultraviolettlicht und durch Autoradiographie sichtbar gemacht wird, überwacht werden. Das radiomarkierte C2I wird anschließend auf einer Kieselgel-60-Säule gereinigt, und die Reinheit wird durch HPLC-Analyse ermittelt. Durch dieses Verfahren liegt die radiochemische Reinheit des Endprodukts üblicherweise über 95%.
Verfahren zur Zufuhr radiomarkierter Proben
Die zielgerichtete Zufuhr der radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung kann durch eine Reihe von Verfahren erfolgen. Solche Verfahren umfassen im allgemeinen den Einbau in ein geeignetes Trägervehikel und umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, den Einbau in Liposome, Mikroemulsionen, LDL oder chemisch modifiziertes LDL (wie z.B. acetyliertes LDL oder oxidiertes LDL).
Wenn sie radiomarkiert sind, sind die IDG-Analoga der vorliegenden Erfindung so konstruiert, daß sie als Radioimaging-Proben fungieren, die auf Bereiche des Körpers abzielen, bei denen hohe Konzentrationen an LDL-Rezeptoren auftreten. Diese Bereiche sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, atherosklerotische Läsionen, Hepatozyten, Tumorzellen, Nervenzellen und Bereiche mit Makrophagenanreicherung. Die Fachleute werden wissen, daß die Rolle von LDL-Rezeptoren nicht vollständig verstanden wird und daß sich das Wissen über diese Rolle noch entwickelt. Die weitere Forschung entdeckt möglicherweise neue Gewebe, gesund oder erkrankt, bei denen hohen Konzentrationen an LDL-Rezeptoren auftreten und die daher neue Bereiche darstellen können, bei denen die Proben der vorliegenden Erfindung für diagnostische Zwecke angewandt werden können.
Es ist vorgesehen, daß andere verträgliche bioaktive Mittel für therapeutische und/oder diagnostische Zwecke mit den radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung in die Trägervehikel zur zielgerichteten Zufuhr an Bereiche des Körpers, an denen hohe Konzentrationen an LDL-Rezeptoren auftreten, eingebaut werden.
Trägersysteme auf Mikroemulsionsbasis
Die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung können in synthetische Mikroemulsionen zur zielgerichteten Zufuhr eingebaut werden.
Um synthetische Mikroemulsionen herzustellen, werden ein oder mehrere Emulgatoren mit ein oder mehreren Kernlipidkomponenten, in denen die radiomarkierte Probe dispergiert ist, vermischt. Die Emulgatoren für diesen Zweck sind im allgemeinen Phospholipide natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Ursprungs. Beispiele für Emulgatoren, die zur Herstellung geeigneter Mikroemulsionen verwendet werden können, sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, L-α-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), DL-α-Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC), Cholesterin, Sojalecithin, Eiphosphatidylcholin und Eilecithin. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden DPPC und DPPE als Emulgatoren bei der Bildung der Mikroemulsion verwendet.
Die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung werden typischerweise in einer Kernlipidkomponente zum Einbau in die Mikroemulsionen dispergiert. Im allgemeinen sind die Kernkomponenten Öle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs oder synthetische oder halbsynthetische Öle. Beispiele für diese Öle sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Triolein, Squalen, Fischöle, Robbenöl, Sojabohnenöl, Canolaöl, Baumwollsamenöl, Sonnenblumenöl und Maisöl. Faktoren, die berücksichtigt werden müssen, wenn die Eignung eines Kernlipids zur Verwendung bei der Mikroemulsionsbildung ermittelt wird, sind u.a. die Einbaumenge der hydrophoben radiomarkierten Probe in die Mikroemulsion und die biologische Verträglichkeit des Öls.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Sattelrobbenöl als Kernlipid verwendet, was zu hohen Einbaumengen der radiomarkierten Probe in synthetische Mikroemulsionen führt. Robbenöl hat stark fluide Eigenschaften, und es wurde entdeckt, daß es bedeutende Mengen an stark ungesättigten Triglyceriden enthält, die eine höhere Solvatisierung der hydrophoben Verbindungen der vorliegenden Erfindung ermöglichen können als es bei anderen Ölen der Fall ist.
Es wurde gezeigt, daß Emulsionen synthetischer Lipide mit einer mittleren Teilchengröße im Bereich von 50 – 200 nm ähnlichen metabolischen Wegen folgen wie menschliche Chylomikron-Reste, vermutlich aufgrund ihrer ähnlichen Teilchengröße [Weichert et al., J. Med. Chem., 38:636–646 (1995)]. Da Chylomikron-Reste von LDL-Rezeptoren erkannt werden, stellt die Verwendung von Mikroemulsionen als Trägervehikel ein Mittel zur selektiven Zielausrichtung radiomarkierter Proben auf Bereiche, die hohe Konzentrationen an LDL-Rezeptoren besitzen, zur Verfügung. Mikroemulsionen mit einer geeigneten mittleren Teilchengröße (d.h. 50–200 nm im Durchmesser) können durch eine Reihe von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel durch Homogenisie rung, Ultraschallbehandlung oder Mikrofluidisation. Eine Reihe von geeigneten mechanischen Vorrichtungen zur Herstellung von Mikroemulsionen sind im Handel erhältlich.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die radiomarkierte Probe ¹²⁵I-C2I in Mikroemulsionen mit einer mittleren Teilchengröße von 50–70 nm im Durchmesser eingebaut. Die Mikroemulsionen werden durch Auflösen von DPPC, DPPE, Robbenöl und ¹²⁵I-C2I in Chloroform, Trocknen der Mischung unter Stickstoff und anschließendes erneutes Suspendieren des Rückstandes in Kochsalzlösung hergestellt. Die resuspendierte Mischung wird 2 Stunden lang unter Kühlung unter einem Stickstoffstrom mit Ultraschall behandelt, dann zwanzig Stunden lang der Ultrazentrifugation mit 40000 Umdrehungen pro Minute (U/Minute) unterworfen. Die obere Schicht des Zentrifugats, welche die Mikroemulsion enthält, wird entfernt und durch einen Miniextruder geleitet, um den richtigen mittleren Teilchendurchmesser auszuwählen.
Synthetische Mikroemulsionen können auch durch Mikrofluidisationsverfahren hergestellt werden [siehe zum Beispiel Weichert et al., J. Med. Chem., 38:636–646 (1995)]. In diesem Fall wird die Mikroemulsion als zwei Wirbelströme (die Kernlipide, Emulgatoren und Probenmoleküle enthalten) gebildet, welche bei hohen Geschwindigkeiten in einer Wechselwirkungskammer miteinander wechselwirken und/oder kollidieren. Im Handel erhältlich sind Mikrofluidisationsanlagen, die durch Luft oder Stickstoff angetrieben werden und bei Innendrücken von 20000 psi mit einem Durchsatz von 300–500 μl pro Minute arbeiten. Innerhalb des Mikrofluidisators kann die Mikroemulsion kontinuierlich durch ein Endlosschleifensystem recycelt werden, wobei einheitliche Teilchengrößen erzeugt werden.
Zur Herstellung roher Mikroemulsionen können auch Homogenisierungsverfahren angewandt werden, wobei ein zusätzlicher Hochenergie-Mikrofluidisations- oder Ultraschallbehandlungsschritt durchgeführt wird, um die fertige Mikroemulsion herzustellen [siehe zum Beispiel das US-Patent Nr. 6 126 946].
Zufuhrsysteme auf LDL-Basis.
Zur Verwendung als Trägervehikel geeignetes LDL kann aus menschlichem Plasma hergestellt werden. Die Abtrennung von LDL von den anderen im Plasma vorliegenden Lipoproteinen kann durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren erfolgen, zum Beispiel durch Sequenzdichteultrazen trifugation [siehe Methods in Enzymology, 128:150–209]. Zur Verwendung als Trägervehikel kann das LDL weiter modifiziert werden, zum Beispiel durch Acetylierung oder Oxidation. Standardverfahren zur Modifizierung von Lipoproteinen sind den Fachleuten gut bekannt, siehe zum Beispiel Basu und Goldstein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73:3178–3182 (1976).
Die LDL-Teilchen können durch eines von mehreren im Stand der Technik bekannten Verfahren mit den radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung beladen werden. Beispiele für Beladungsverfahren sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die direkte Diffusion, die Wiederauflösung, die Detergentienlöslichmachung, die Verwendung organischer Lösungsmittel, die Verwendung von Donorteilchen, wie z.B. Mikroemulsionen, und die Verwendung von Transferproteinen, wie z.B. Insektenlipidtransferprotein (iLTP).
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Mikroemulsion als Donorteilchen verwendet, um LDL mit den radiomarkierten Proben zu beladen. Synthetische Mikroemulsionen, wie z.B. diejenigen, die oben beschrieben sind, können verwendet werden, um große Mengen der radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung in LDL einzubauen. Diese Verwendung von Mikroemulsionen kann helfen, einige der mit der direkten Diffusion und der Detergentienlöslichmachung verbundenen Nachteile, wie z.B. niedrige Einbaumengen oder Denaturierung der Apo-B-Komponente des LDL, zu umgehen. Die radiomarkierten Proben werden durch Inkubation bei physiologischer Temperatur leicht von der Mikroemulsion in das LDL überführt, wobei anschließend das beladene LDL durch Ultrazentrifugation von nichtbeladenem LDL getrennt wird.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird LDL durch Katalyse unter Verwendung eines Lipidtransferproteins mit den radiomarkierten Proben beladen. Die für diese Verwendung geeigneten Transferproteine sind, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, menschliches CI-Transferprotein (CETP) und Tabakschwärmer(Manduca sexta)-Lipidtransferprotein (iLTP). Transferproteine vermitteln üblicherweise die Bewegung hydrophober Materialien, die mit Lipoproteinen assoziiert sind, im Kreislaufsystem. Andere Substrate können ebenfalls durch diese Proteine übertragen werden, zum Beispiel wurde gezeigt, daß iLTP Diacylglycerin (DG), Triacylglycerin, Phospholipide, Cholesterin, CE und Kohlenwasserstoffwachs überträgt [Ryan et al., J. Biol. Chem., 265:10551-10555 (1990); Liu und Ryan, Biochim. Biophys. Acta, 1085:112–118 (1991)].
Verfahren zur Isolierung und Reinigung von iLTP sind veröffentlicht worden [Ryan, J. Lipid Res., 31:1725–1739 (1990); Liu und Ryan, Biochim. Biophys. Acta, 1085:112–118 (1991)].
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird LDL durch iLTP-Katalyse mit der radiomarkierten Probe beladen. LDL kann durch Verwendung von iLTP beladen werden, indem die radiomarkierte Probe in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, das Lösungsmittel unter Stickstoff entfernt und der Rückstand in einer kleinen Menge Benetzungsmittel erneut suspendiert wird. Anschließend wird LDL zugegeben und die Mischung eine geeignete Zeit lang, typischerweise etwa 4 Stunden lang, bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die Mischung bei einer geeigneten Dichte zentrifugiert, damit der LDL/Proben-Komplex oben auf dem Zentrifugenröhrchen schwimmt und somit von dem nichtgebundenen Arzneistoff und dem iLTP abgetrennt werden kann. Die LDL/Proben-Komplexfraktionen werden anschließend gesammelt und dialysiert, um sämtliche verbliebenen nichtgebundenen Probenmoleküle zu entfernen. Die mit dem LDL verbundenen Mengen an radiomarkierter Probe können durch Standardverfahren, wie z.B. durch Verwendung eines Gammazählers, ermittelt werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination aus der Verwendung von Mikroemulsionen als Donorteilchen und der Verwendung von iLTP als Katalysator verwendet, um das LDL oder das modifizierte LDL mit der radiomarkierten Probe zu beladen.
In-Vitro-Test der radiomarkierten Proben
Wenn die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung in ein geeignetes Trägervehikel eingebaut worden sind, kann die Einbaumenge ermittelt werden, indem die mit dem beladenen Trägervehikel verbundene Radioaktivitätsmenge durch Standardverfahren, zum Beispiel durch einen Gammazähler oder einen Szintillationszähler, gemessen wird.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird AcLDL mit ¹²⁵I-C2I beladen und die Radioaktivität und der Proteingehalt des Komplexes durch Standardverfahren ermittelt. Die Integrität des apo-B-100-Proteins wird dann durch Analyse von Proben durch Natriumdodecylpolyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Elektronenmikroskopie wie früher beschrieben [Deforge et al., Nucl. Med. Biol., 19:775–782 (1992)] ermittelt.
Die Zellaufnahme der radiomarkierten Proben kann in vitro in einer geeigneten Zelllinie getestet werden. Zum Beispiel können Leberzelllinien oder an Scavenger-Rezeptor reiche Zelllinien, wie z.B. J774A1, verwendet werden. Alternativ kann eine Krebszelllinie verwendet werden, da gezeigt wurde, daß Tumorzellen eine erhöhte Expression von LDL-Rezeptoren besitzen [siehe zum Beispiel Ho et al., Blood, 52:1099–1104 (1978), Chen und Hughes-Fulford, Int. J. Cancer, 91:41–45 (2001), Xiao et al., Radiat. Res., 152:250–256 (1999)]. Die gewählte Zelllinie wird durch Standardverfahren kultiviert, und die radiomarkierte Probe wird in dem gewählten Trägervehikel zu dem Kulturmedium zugegeben. Die Zellen werden eine geeignete Zeit lang inkubiert, typischerweise etwa 4 Stunden lang, dann wird das Medium entfernt und die Zellen ausgiebig gewaschen, um die externe Radioprobe zu entfernen. Die Zellen werden lysiert, und die von den Zellen aufgenommene Menge an radiomarkierter Probe kann durch Messung der mit den lysierten Zellen verbundenen Radioaktivität ermittelt werden.
In-vivo-Test der radiomarkierten Proben
Die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung können zur Sichtbarmachung der Zielgewebe in vivo mit einem geeigneten Tiermodel getestet werden. Die radiomarkierte Probe kann durch Injektion in das Tier eingebracht und die Bioverteilung der Probe durch Standardverfahren ermittelt werden [siehe zum Beispiel Xiao et al., Pharm. Res., 16:420–426 (1999)]. Die radiomarkierten Proben können in die Testtiere in einem der oben beschriebenen Trägervehikel injiziert werden. Die Tiere können zu geeigneten Zeiten nach der Injektion getötet und die zu untersuchenden Gewebe und/oder Organe entnommen werden. Die Analyse der mit dem Gewebe/Organ verbundenen Radioaktivitätsmenge kann anschließend durch Standardverfahren, zum Beispiel durch einen Gammazähler oder durch Autoradiographie, durchgeführt und verwendet werde, um den Anreicherungsgrad der radiomarkierten Probe zu ermitteln. Kinetische Untersuchungen können durchgeführt werden, um den optimalen Zeitpunkt zur Aufnahme von Radiobildern nach der Injektion zu ermitteln.
Zum Beispiel können die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um atherosklerotische Läsionen bei Tiermodellen sichtbar zu machen. Geeignete Atherosklerose-Tiermodelle sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, B6, 129 ApoE^tm1UncLdlr^tm1Her (ApoE/LDLR) transgene Mäuse, cholesteringefütterte Kaninchen oder Miniaturschweine. Falls notwendig, können atherosklerotische Plaques durch das Futter, durch chemische und/oder durch operative Behandlung eingeführt werden.
Alternativ können die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Tumore in Tiermodellen sichtbar zu machen. Tumore können durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren hervorgerufen werden, zum Beispiel indem die Tiere karzinogenen Chemikalien ausgesetzt werden oder gezüchtete Tumorzellen in die geeigneten Stellen/Organe eingepflanzt werden. Die relative Verteilung der injizierten radiomarkierten Proben in dem Tumorgewebe und dem umgebenden gesunden Gewebe wird ein Indiz für die Spezifität der Probe liefern.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Wirksamkeit der radiomarkierten Probe zur Sichtbarmachung atherosklerotischer Läsionen in einem Mäusemodell getestet. Die radiomarkierte Probe wird in die Schwanzvene von B6, 129 ApoE^tm1UncLdlr^tm1Her (ApoE/LDLR) transgenen Mäusen injiziert, die ein anerkanntes Atherosklerosemodell darstellen. Die Mäuse werden 24 Stunden nach der Injektion getötet und ein Fixierungsmittel in das Herz infundiert. Die Bioverteilung der Probe wird durch Testen verschiedener Organe mit einem Gammazähler ermittelt. Die Probenanreicherung in den Blutgefäßen wird anschließend durch Entfernung der Aorta, Färben mit einem entsprechenden Farbstoff, wie z.B. Sudan IV, um die lädierten Bereich sichtbar zu machen, und anschließendes Einwirkenlassen auf einen Phosphorschirm sichtbar gemacht.
Anwendungen
Die vorliegende Erfindung stellt hydrophobe radiomarkierte Proben zur Verfügung, die zur Sichtbarmachung durch Radioimaging-Verfahren von Geweben oder Bereichen in einem Säugetier verwendet werden können, in denen hohe Konzentrationen an LDL-Rezeptoren vorliegen. Es ist beabsichtigt, daß die Probe für diagnostische Zwecke verwendet werden kann, um die Gegenwart und/oder das Ausmaß einer Erkrankung zu ermittelt, welche den/die Zielbereich(e) beeinflußt, sowie zur Beobachtung des Fortschreitens der Erkrankung und/oder der Wirksamkeit einer dem betroffenen Säugetier verabreichten Behandlung. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Säugetier ein Mensch.
Die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung können einem Säugetier in ein oder mehreren der oben beschriebenen zielgerichteten Trägervehikel verabreicht werden. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die radiomarkierte Probe, die entweder in AcLDL oder in einer Mikroemulsion eingebaut ist, in einer einzigen injizierbaren Einheitsdosis verabreicht. Die zu verabreichende Einheitsdosis wird von der Anwendung und dem einzelnen Säugetier, welches die Verabreichung erhält, abhängen. Dosisbereiche für das klinische Radioimaging können leicht von den Fachleuten ermittelt werden. Im allgemeinen hat die zu verabreichende Einheitsdosis eine Radioaktivität von etwa 0,01 mCi bis etwa 100 mCi, vorzugsweise 1 mCi bis 20 mCi. Die in einer Einheitsdosis zu injizierende Lösung umfaßt etwa 0,01 ml bis etwa 10 ml.
Nach der intravenösen Verabreichung der radiomarkierten Probe an einen Patienten kann das Radioimaging in vivo zu einem Zeitpunkt innerhalb des Bereichs von wenigen Minuten bis wenigen Stunden nach der Injektion stattfinden. Die Lokalisierung der radiomarkierten Probe erfolgt durch herkömmliche klinische Radioimaging-Verfahren.
Die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung sind so konstruiert, daß sie auf LDL-Rezeptor enthaltende Körperbereiche abzielen und ein Mittel zur Sichtbarmachung der Körperbereiche zur Verfügung stellen, wie z.B. von Leberzellen, Nervenzellen und Tumorzellen. Bei einer Ausführungsform sind die Proben so konstruiert, daß sie Körperbereiche sichtbar machen, die erhöhte Mengen an LDL-Rezeptoren enthalten, wie z.B. atherosklerotische Läsionen. Es ist daher beabsichtigt, daß die Proben als Diagnosemittel verwendet werden können. Bei einer Ausführungsform werden die Proben als Diagnosemittel für Erkrankungen und Zustände wie Atherosklerose, Apoplexie, Zirrhose, Hepatitis, Alzheimer-Krankheit, Glomerulosklerose, Ataxie mit Vitamin-E-Mangel, Lebertumore und Krebs verwendet. Es ist ferner beabsichtigt, daß die Proben der vorliegenden Erfindung für Überwachungszwecke eingesetzt werden können, zum Beispiel um das Fortschreiten eines Erkrankungszustandes bei einem Patienten, die Remission eines Erkrankungszustandes nach einer Operation und/oder Arzneistofftherapie oder die Leberfunktion nach einer Lebertransplantation zu überwachen.
Diagnosekits
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Diagnosekits zur Verfügung, welche die radiomarkierten Proben der vorliegenden Erfindung enthalten. Einzelne Komponenten des Kits würden in separaten Behältern verpackt, und zusammen mit solchen Behältern könnte eine Mitteilung in der von einer Regierungsbehörde, welche die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten reguliert, vorgeschriebenen Form vorliegen, wobei die Mitteilung die Zulassung durch die Herstellungs-, Verwendungs- oder Verkaufsbehörde für die Anwendung am Menschen wiedergibt. Der Kit würde ferner Instruktionen enthalten, welche das geeignete Anwendungsverfahren der Komponenten beschreiben. Um die Lagerzeit der Kits zu maximieren, können die Proben unmarkiert bereitgestellt werden, und der Kit kann ferner die notwendigen Reagenzien und Vorschriften zur Radiomarkierung der Probenmoleküle mit dem geeigneten Radioisotop enthalten.
Folgende Beispiele sind zum besseren Verständnis der hierin beschriebenen Erfindung angegeben. Es sollte verstanden werden, daß diese Beispiele lediglich Veranschaulichungszwecken dienen. Daher sollen sie in keiner Weise den Umfang dieser Erfindung einschränken. Insbesondere sind die Synthese- und Radiomarkierungsverfahren lediglich veranschaulichend und können von den Fachleuten modifiziert werden, um funktionelle Analoga der nachstehend beschriebenen radiomarkierten Proben herzustellen.
BEISPIELE
Allgemein
Die Dünnschichtchromatographie (DC) wurde auf Kieselgel-60-Platten mit F-254-Polyethylen-Rücken (Fischer Scientific) durchgeführt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die Säulenchromatographie wurde auf Kieselgel 60 (230–400 Mesh) (Aldrich) durchgeführt. Die Radioaktivität wurde mit einem automatischen CKB-C-Wallac-1277-Gammamaster-Gammazähler gemessen. Die Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde an einer Mini-PROTEIN^®-II-Elektrophoresezelle durchgeführt. Die Bildanalyse wurde an einem BIOQUAN^TM-System IV durchgeführt. Trägerfreies wäßriges Na¹²⁵I wurde von NEN Life Science (Boston, MA) erworben. Pivalinsäure wurde von Aldrich erworben. Bio-Rad-Protein-Assaystandards wurden von Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) erworben. L-α-Dipalmitoylphosphatidylcholin (1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, DPPC) und DL-α-Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (1,2-Dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphoethanolamin, DPPE) wurden von Sigma Chemical Co. (Oakville, ON, Kanada) erworben. Robbenöl wurde von Terra Nova Fishery, Neufundland, Kanada, erhalten.
BEISPIEL 1: Herstellung von 1,3-Dihydroxypropan-2-on-1,3-diiopanoat (DPIP), Glycerin-1,3-diiopanoat(GIP) und Cholesterin-1,3-diiopanoatglycerinether (C2I) [Schema VII]
1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 9,8 g, 47,5 mmol) wurde zu einer kräftig gerührten Suspension von Dihydroxyaceton-Dimer (1,97 g, 21,9 mmol), Iopansäure (25,0 g, 43,2 mmol) und einer katalytischen Menge 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 500 mg) in trockenem CH₂Cl₂ (200 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung ließ man unter N₂ 66 Stunden lang rühren, wonach sie mit CH₂Cl₂ verdünnt und anschließend filtriert wurde, um ausgefallenen 1,3-Dicyclohexylharnstoff (DCU) zu entfernen. Das Filtrat wurde mit 0,5N HCl (2mal), gesättigtem wäßrigem NaHCO₃ (2mal), H₂O und Salzlösung gewaschen, dann mit wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand mit wasserfreiem Ether verrieben, um sämtliche verbliebenen Spuren von DCU auszufällen. Der resultierende Rückstand wurde aus Aceton umkristallisiert, um DPIP als ein nicht ganz weißes Pulver zu ergeben. Ausbeute 85%.
Eine gerührte Suspension von DPIP (4,3 g, 3,6 mmol) in einer Mischung aus Tetrahydrofuran (THF, 30 ml), Benzol (8 ml) und Wasser (2 ml) wurde in einem Eisbad auf 5°C abgekühlt und mit neutralem NaBH₄ (204 mg, 5,4 mmol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde weitere 30 Minuten bei 5°C gerührt, dann mit Eisessig (0,3 ml) behandelt, um überschüssiges Borhydrid zu zerstören. Die resultierende Lösung wurde mit CH₂Cl₂ (250 ml) verdünnt und mit gesättigtem wäßrigem NH₄Cl (2mal), H₂O und Salzlösung extrahiert und mit wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum ergab halbreines Produkt, das auf einer Kieselgelsäule, die mit CHCl₃/Hexan/Ethylacetat (5:3:2) eluiert wurde, weiter gereinigt wurde. Durch Kombination der entsprechenden Fraktionen und Entfernen der Lösungsmittel wurde GIP als ein gelber Feststoff erhalten. Ausbeute 75%.
Natriumhydrid (10 mg, 0,4 mmol) in 5 ml wasserfreiem THF wurde zu einer gerührten Suspension von GIP (299 mg, 0,25 mmol) und Cholesterinbromid (116,6 mg, 0,26 mmol) in 3 ml wasserfreiem THF zugegeben. Die Mischung ließ man über Nacht bei Raumtemperatur ruhen. Anschließend wurden 8 ml Wasser zugegeben und die Lösung mit Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden vereint und das restliche Wasser durch Zugabe von MgSO₄ entfernt. Das nachfolgende Entfernen des Ethers im Vakuum ergab einen halbreinen Feststoff, der durch Säulenchromatographie auf Kieselgel mit CHCl₃ als Elutionsmittel gereinigt wurde. Durch Kombination der entsprechenden Fraktionen und Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde C2I als weiße Kristalle erhalten. Ausbeute 75 mg (20%).
C2I-Daten:
IR (cm^–1): 3500, 3380 (-NH₂), 2950, 2840 (-CH₃), 1480 (C=C), 1740 (-C=O), 1380 ((CH₃)₂-CH-), 1600, 920 (Ar).
1H-NMR (ppm): 8,1 (s, 2H, Ar-H), 5,4 (s, 1H, C=C-H), 4,8 (s, 4H, NH₂), 4,1 (m, 4H, CH₂), 3,7 (m, 2H, -O-CH), 3,4–3,2 (m, 4H, CH₂), 2,8 (m, 2H, CHCO₂), 2,2–1,6 (m, 22H, CH₂, CH), 1,1–1,3 (m, 10H, CH₂), 0,9 (d, 15H, CH₃), 0,7 (s, 6H, CH₃).
BEISPIEL 2: Radiomarkierung von C2I mit ¹²⁵I durch Radioiod-Austausch in Pivalinsäure
Allgemeines Verfahren
Die zu radioiodierende Verbindung (1–5 mg) wurde in ein 2-ml-Serumröhrchen gegeben, welches dann mit einem teflonbeschichteten Gummiseptum und einer Aluminiumkappe verschlossen wurde. Frisch destilliertes Tetrahydrofuran (THF, 100–200 μl) und wäßriges Na¹²⁵I (10–50 μl) wurden der Reihe nach mittels einer Mikroliterspritze zugegeben und das Röhrchen leicht geschwenkt, um die Inhalte zu lösen und die Homogenität sicherzustellen. Einlaß- und Auslaßkanülen wurden durch das Septum in das Röhrchen eingeführt, und es wurde ein leichter Stickstoffstrom angelegt, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Als der Rückstand trocken aussah, wurde der Verschluß entfernt und feste Pivalinsäure (5–20 mg, durch azeotrope Destillation mit Toluol getrocknet und unter Stickstoff destilliert), zugegeben.
Schema VII. Herstellung von Cholesterin-1,3-diiopanoatglycerinether (C2I)
Das Röhrchen wurde wieder verschlossen und zum Teil in ein auf 155–160°C vorgeheiztes Ölbad getaucht. Als die Isotopenaustauschreaktion im wesentlichen beendet war (üblicherweise nach 1–2 Stunden), ließ man das Reaktionsröhrchen abkühlen, dann wurde trockenes THF (200 μl) mit einer Glasspritze zugegeben und das Röhrchen leicht geschwenkt. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Probe (1–2 μl) mit einer 10 μl-Spritze zur Analyse durch Dünnschichtchromatographie (DC) entfernt. Die verbliebenen Inhalte wurden auf das Obere einer Kieselgel-60-Säule (1 × 10 cm) gegeben und anschließend mit dem passenden Lösungsmittelsystem eluiert. Falls notwendig, insbesondere bei der Markierung polarer Verbindungen, kann überschüssige Pivalinsäure vor der Chromatographie entfernt werden, indem eine Einwegspritze, die granulatförmige Kohle enthält, als Falle in das Reaktionsröhrchen während des Erwärmens eingeführt wird und man die Pivalinsäure in die Falle destillieren läßt. Bei der Elution der Säule wurde eine Meßsonde am Säulenauslaß angebracht, die als Radiodetektor diente. Die Fraktionen wurden gesammelt und die radiochemische Reinheit einer jeden Fraktion durch DC mit Ultraviolett(UV)- und Radioaktivitätsdetektion überwacht. Die geeigneten Fraktionen wurden vereint und das Lösungsmittel durch einen leichten Stickstoffstrom entfernt. Die HPLC-Analyse der fertigen Verbindung bestätigte sowohl die chemische (UV) als auch die radiochemische (Radioaktivität) Reinheit. Die UV- und die Radioaktivitätswerte wurden gleichzeitig durch Verwendung eines Zwei-Stifte-Streifenschreibers aufgetragen, was die Berechnung der zu ermittelnden spezifischen Wirkung der radiomarkierten Verbindung durch Vergleich der UV- und der Radioaktivitätspeakbereiche mit Standardkalibrierkurven ermöglicht. Eine weitere Radioreinigung kann auf Wunsch durchgeführt werden. In allen Fällen überstieg die radiochemische Reinheit der fertigen Verbindungen 95%.
BEISPIEL 3: Herstellung von C2I/Lipid-Mikroemulsionen
Durch Ultraschallbehandlung
I. L-α-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC, 8 mg), DL-α-Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE, 8 mg), Robbenöl (20 mg), C2I (10 mg) und ¹²⁵I–C2I (0,05 mg) wurden in Chloroform gelöst, in einem leichten Stickstoffstrom getrocknet und dann in 10 ml Salzlösung bei 25°C erneut suspendiert. Die Suspension wurde 2 Stunden lang mit einem Virosonic Cell Disrupter (Modell 16-850) bei 40–50 Watt unter einem konstanten Stickstoffstrom mit Ultraschall behandelt, während sie in einem Salz-Eiswasser-Bad auf –10°C gekühlt wurde. Anschließend wurde die Mischung 8 Stunden lang bei 45000 U/Minute bei 4°C zentrifugiert. Der obere cremige Teil der zentrifugierten Mischung wurde gesammelt und durch einen Miniextruder geleitet, der mit einer Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 0,05 µm ausgestattet war.
II. C2I-Mikroemulsionen wurden durch Verwendung von Triolein, Canolaöl, Squalen bzw. Robbenöl als Kernlipidkomponente hergestellt. DPPC (12 mg), DPPE (8 mg), Triolein, Robbenöl (20 mg) und ¹²⁵I-C2I (10 mg) wurden in Chloroform gelöst, mit einem leichten Stickstoffstrom getrocknet und in 10 ml Salzlösung bei 25°C erneut suspendiert. Die Suspension wurde 2 Stunden lang mit einem Virosonic Cell Disrupter Model 16-850 bei 40–50 Watt unter Kühlung in einem Salz-Eiswasser-Bad auf –10°C unter einem Stickstoffstrom mit Ultraschall behandelt. Die Mischung wurde anschließend bei 40000 U/Minute 20 Stunden lang bei 4°C mit einem Beckmann-SW41-Rotor und einer Beckman-L5-65-Ultrazentrifuge zentrifugiert. Die Mikroemulsion, die oben auf den Zentrifugenröhrchen schwamm, wurde gesammelt und der EM und der Bildanalyse unterworfen. Die C2I-Menge in der Mikroemulsion wurde mit einem automatischen CKB-WALLAC-1277-GAMMAMASTER-Gammazähler ermittelt.
BEISPIEL 4: Herstellung von AcLDL
Frisches menschliches Plasma wurde vom Canadian Red Cross (St. John's, Canada) erhalten und mit speziellen Konservierungsmitteln versetzt [Edelstein und Scanu, Methods in Enzymology, 128: 151–155 (1986)]. LDL wurde durch sequentielle Ultrazentrifugation von frischem menschlichem Plasma bei 40000 U/Minute 24–40 Stunden lang bei 8°C unter Verwendung einer Beckmann-L8-M-Ultrazentrifuge und eines 60Ti-Rotors wie früher beschrieben [Methods in Enzymology, 128:150–209 (1986)] isoliert. Alle LDL-Präparate wurden bei 4°C über Nacht gegen einen Puffer, der 0,3 mM EDTA, 150 mM NaCl und 50 mM Tris (pH 7,4) enthielt, dialysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden durch das Bradford-Assay mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard ermittelt und mit einem BIO-RAD Model 550 Microplate Reader gelesen. Das LDL wurde bei 2–8°C maximal zwei Wochen bis zu seiner Verwendung aufbewahrt.
Die Acetylierung des isolierten LDL wurde gemäß Basu und Goldstein [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73:3178–3182 (1976)] durchgeführt. Grundsätzlich wurde eine Mischung hergestellt, die 5 ml dialysiertes LDL, 5 ml 0,85%-iges NaCl und 10 ml gesättigte Natriumacetatlösung enthielt, und auf Eis gestellt. Essigsäureanhydrid (70 µl) wurde in 10-µl-Aliquoten unter Rühren alle 5 Minuten zugegeben. Das resultierende AcLDL wurde bei 4°C über Nacht gegen einen Puffer, der 0,3 mM EDTA, 150 mM NaCl und 50 mM Tris (pH 7,4) enthielt, dialysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden wie oben beschrieben ermittelt.
BEISPIEL 5: Beladung von AcLDL mit C2I aus Mikroemulsionen
Die ¹²⁵I-C2I-Mikroemulsionen wurden mit AcLDL bei 37°C 24 Stunden lang bei einem C2I:AcLDL-Molverhältnis von 1000:1 inkubiert. Mit ¹²⁵I-C2I beladenes AcLDL (¹²⁵I-C2I/AcLDL) wurde anschließend durch Ultrazentrifugation von der Mikroemulsion abgetrennt. Der C2I-Gehalt in den ¹²⁵I-C2I/AcLDL-Teilchen wurde mittels eines Gammazählers ermittelt.
Um die Integrität des apo-B-100-Proteins der ¹²⁵I-C2I/AcLDL-Teilchen zu untersuchen, wurden Proben durch SDS-PAGE und EM wie zuvor beschrieben [Deforge, et al., Nucl. Med. Biol., 19:775–782 (1992)] analysiert.
C2I kann auch durch Direktdiffusions- oder Detergentienlöslichmachungsverfahren in AcLDL eingebaut werden. Veröffentlichte Vorschriften für die direkte Diffusion [Shaw et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 507:252–271 (1987)] und die Detergentienlöslichmachung [Deforge et al. Nucl. Med. Biol., 19:775–782 (1992)] wurden mit geringen Modifizierungen angewandt. Kurz gesagt wurde für die direkte Diffusion C2I in Chloroform in einem Glasröhrchen gelöst, dann unter einem Stickstoffstrom getrocknet, um auf der Röhrchenwand einen dünnen Film zu erzeugen. AcLDL wurde zugegeben und das Röhrchen 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Für die Detergenzienlöslichmachung wurde C2I in Gegenwart von Tween-20 (<3%) in Kochsalzlösung gelöst, dann mit AcLDL bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert. Das verwendete Molverhältnis von C2I zu AcLDL war das gleiche wie das oben für die Mikroemulsionen angegebene Molverhältnis.
BEISPIEL 6: Detektion atherosklerotischer Läsionen bei Kaninchen- und Maus-Atherosklerose-Modellen unter Verwendung von ¹²⁵2-C2I/AcLDL
Zwölf männliche New-Zealand-White-Kaninchen (2,5–4,7 kg) wurden von Charles River Ltd. (Montreal, PQ, Kanada) erworben und zufällig in drei Gruppen aufgeteilt. Zwölf Wochen lang wurden die Gruppen bei folgenden Futterarten gehalten: eine Gruppe bei normalem Kaninchenfutter (n=4, Kontrollgruppe), eine Gruppe bei mit 1% Cholesterin angereichertem Kaninchenfutter (n=4, Cholesteringruppe), um die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen im Frühstadium hervorzurufen, und die dritte Gruppe bei mit 1% Cholesterin plus einem antiatherogenen Mittel (10 mg/kg/Tag) angereichertem Kaninchenfutter. Nach 12 Wochen wurde das ¹²⁵I-C2I/AcLDL-Präparat in die am Rand liegende Ohrvene der Kaninchen aller drei Gruppen mit einer Dosis von 15 µCi/kg injiziert. Vierundzwanzig Stunden nach der Injektion wurden die Kaninchen getötet und die Gewebe, einschließlich der Leber, der Milz, der Lunge, der Niere, der Adrenaldrüse, des Blutes und der Aorten, gesammelt, um die Verteilung der Radioaktivität mit einem Gammazähler zu ermitteln. Die Aorten der Kaninchen wurden gewaschen, fixiert und mit Sudan-IV-Farbstoff gefärbt, um die atherosklerotischen Läsionen zu identifizieren. Die rote Sudan-IV-Lipidfärbung ist ein Indiz für die lipidbeladenen Schaumzellen, ein Kennzeichen für beginnende Atherosklerose. Die histologische Untersuchung der Aorten wurde durchgeführt, gefolgt von der Autoradiographie, wobei entweder Röntgenfilme oder ein Phosphor-Imager verwendet wurden.
Ähnliche Versuche wurden in B6, 129 ApoE^tm1UncLdlr^tm1Her (ApoE/LDLR) transgenen Mäusen durchgeführt, welche ein anerkanntes Atherosklerosemodell sind. Diese Mäuse tragen eine doppelte Mutation (in dem apoE-Apolipoproteingen und dem LDL-Rezeptorgen) und können spontan atherosklerotische Läsionen ausbilden. Der Stamm hat ein ähnliches Lipoproteinprofil wie das von Hyperlipidämiepatienten. Die B6, 129 ApoE^tm1UncLdlr^tm1Her transgenen Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, Main) erworben.
Das linke Feld in 1 zeigt die mit Sudan IV gefärbten Aorten aus der Cholesteringruppe der Kaninchen. Der Läsionsbereich in diesen Aorten entspricht etwa 5% des gesamten Gefäßes. Der schwerste Läsionsbereich war die aufsteigende Aorta am Aortenbogen. Der Blutfluß durch diesen Abschnitt der Aorta ist aufgrund der Krümmung des Aortenbogens und der drei großen Abzweigungen turbulent. Das stärkste Auftreten von menschlicher Atherosklerose findet ebenfalls in diesem Bereich der Aorta statt.
Autoradiographien der aus den cholesteringefütterten Kaninchen entfernten Aorten sind im rechten Feld von 1 gezeigt. Die Bilder zeigen die Bereiche der ¹²⁵I-C2I/AcLDL-Anreicherung. Das Überlagern der Autoradiographien mit der gefärbten Aorta zeigt, daß ¹²⁵I-C2I/AcLDL von den Läsionen aufgenommen wurde. Sowohl die Sudan-IV-Färbung als auch die Autoradiographie ergaben negative Ergebnisse, wenn die Aorten von Kontrollkaninchen verwendet wurden (die Daten sind nicht gezeigt). 2 zeigt die Ergebnisse, die mit Kaninchen erhalten wurden, die mit Cholesterin plus antiatherogenem Mittel gefüttert wurden. Die Läsionen in dieser Gruppe waren merklich schwächer als die in der nichtbehandelten Gruppe.
In beiden Fällen zeigten die durch Verwendung von C2I/AcLDL erhaltenen Radiobilder eine hervorragende Übereinstimmung sowohl mit den Lipidfär beergebnissen als auch mit der histologischen Untersuchung. Besonders anzumerken ist die Tatsache, daß die gezeigten Radiobilder nicht nur die stark lädierten Aortenbögen zeigten, sondern auch andere schwach lädierte Bereiche. Daher könnten C2I und ähnliche Radioimaging-Proben verwendet werden, um sehr frühe atherosklerotische Läsionen zu detektieren, die in einem frühen Stadium auftreten, wenn die Erkrankung im wesentlichen reversibel ist.
Ähnliche Ergebnisse wie die in den 1 und 2 dargestellten Ergebnisse wurden erhalten, wenn die doppelt transgenen Mäuse verwendet wurden (3), was zeigt, daß die Verwendung von C2I/AcLDL zur selektiven Darstellung atherosklerotischer Läsionen angewandt werden kann. Ein Fachmann würde leicht erkennen, daß diese Ergebnisse voraussagenden Charakter für die Verwendung von C2I/AcLDL zur selektiven Darstellung atherosklerotischer Läsionen bei Menschen besitzen.
BEISPIEL 7: Detektion atherosklerotischer Läsionen in einem Mäuse-Atherosklerosemodell durch Verwendung von ¹²⁵I-C2I/Lipid-Mikroemulsionen
ApoE/LDLR-Knockout-Mäuse (Alter 7–8 Wochen, mittleres Gewicht 22 g) wurden bei normalem Nagerfutter gehalten. Die Mäuse wurden zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt: ¹²⁵I-C2I/AcLDL-Gruppe (n=6) und ¹²⁵I-C2I/Mikroemulsion-Gruppe (n=6). C57-Mäuse (Alter 6–7 Wochen, n=7) wurden als Kontrollgruppe verwendet. Nach 12 Wochen wurden Blutproben aus dem Orbitalsinus entnommen, und die Plasmacholesterin- und -triglyceridwerte wurden unter Verwendung von Standard-Diagnosekits (Sigma Chemical Company) gemessen. Das ¹²⁵I-C2I/AcLDL-Präparat (50 Ci/kg) und die ¹²⁵I-C2I/Mikroemulsion (80 Ci/kg) wurden in die Schwanzvene der entsprechenden Mäusegruppe injiziert. Die Mäuse wurden 24 Stunden nach der Injektion getötet, und 2%iges Paraformaldehyd-Fixiermittel wurde in das Herz infundiert. Von verschiedenen Organe wurden Proben genommen, um die Bioverteilung eines jeden ¹²⁵I-C2I-Präparats unter Verwendung eines Gammazählers zu ermitteln. Die Bioverteilung von ¹²⁵I-C2I/AcLDL ist in 4 gezeigt, und die der ¹²⁵I-C2I/Mikroemulsion ist in 5 gezeigt. In beiden Fällen war die Anreicherung von ¹²⁵I-C2I im Blut bei den ApoE/LDLR-Mäusen größer als bei der Kontrollgruppe.
Aufgrund früherer Erfahrung nahm man an, daß frühe atherosklerotische Läsionen sich in den Aorten der ApoE/LDLR-Knockout-Mäuse bilden. Daher wurden Aortaproben dieser Mäuse entnommen und gewaschen, dann fixiert und mit Sudan-IV-Farbstoff gefärbt. Die Aortaproben ließ man anschließend 6–8 Stunden lang auf einen Phosphorschirm einwirken.
Die Phosphorbilder der Aorten der ApoE/LDLR-Mäuse zeigten eine Anreicherung von ¹²⁵I-C2I/AcLDL (6 und 7, rechte Felder) oder ¹²⁵I-C2I/Mikroemulsion (8 und 9, rechte Felder). Das Überlagern der Phosphorbilder mit den Sudan-IV-gefärbten Aorten (6, 7, 8 und 9, linke Felder) zeigte, daß eine ¹²⁵I-C2I-Anreicherung an den Läsionsstellen stattfand. Sowohl die Lipidfärbung (10 und 11, linke Felder) als auch die Phosphorbilder (10 und 11, rechte Felder) zeigten negative Ergebnisse mit den Aorten der Kontrollgruppe aus C57-Mäusen. Somit führten sowohl die ¹²⁵I-C2I/AcLDL- als auch die ¹²⁵I-C2I/Mikroemulsionspräparate wirksam das radiomarkierte C2I den Läsionsbereichen zu.
BEISPIEL 8: Verwendung von Insektenlipidtransferprotein (iLTP) zur Beladung von LDL-Teilchen
Menschliches LDL wurde unter Verwendung von iLTP mit den folgenden Mitteln beladen, um Beispiele für die Nutzen dieses Verfahrens zu liefern:
Doxorubicin (Dox), 3'-Palmitoyl-[methyl-³H]-2'-desoxythymidin (mpTdR), Cholesteriniopanoat (CI) und 3',5'-Dipalmitoyl-5-ioddesoxyuridin (dp-IUdR). Dox wurde von Adria Laboratories, Missisauga, ON erworben. CI ist ein diagnostisches Imaging-Mittel zur frühen Detektion von Atherosklerose und war ein Geschenk von Dr. Ray E. Counsell von der University of Michigan. Sowohl mp-TdR als auch dp-IudR wurden durch die Umsetzung von entweder [Methyl-³H]-2'-desoxythymidin oder 5-Iod-2'-desoxyuridin mit Palmitinsäurechlorid in Dimethylacetamid synthetisiert.
iLTP wurde durch Nacharbeiten der früher veröffentlichten Vorschrift [Ryan, J. Lipid Res., 31:1725–1739 (1990); Liu und Ryan, Biochim. Biophys. Acta, 1085:112–118 (1991)] isoliert und gereinigt.
Ein typischer Versuch umfaßte das Auflösen des Arzneistoffes in einem geeigneten Lösungsmittel. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter Stickstoff wurde eine kleine Menge Benetzungsmittel zugegeben. Anschließend wurde eine geeignete Menge LDL zugegeben, basierend auf dem optimalen Arzneistoff:LDL-Verhältnis (zum Beispiel 1:1 für Dox), um den Einschluß von Arzneistoff in LDL zu erhöhen. Die Mischungen wurden anschließend 4 Stunden lang bei 37°C in Abwesenheit oder Gegenwart von gereinigtem iLTP (typischerweise 20–30 mg iLTP-Protein/mg LDL) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mischungen bei einer Dichte zentrifugiert, bei der der LDL/Arzneistoff-Komplex im Zentrifugenröhrchen oben schwamm, während der nichtgebundene Arzneistoff und das iLTP am Boden des Röhrchens verblieben. Die LDL/Arzneistoff-Fraktionen wurden gesammelt und dialysiert, um sämtliche verbleibenden Spuren freier Arzneistoffe zu entfernen. Das Cholesterin wurde enzymatisch unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Sigma Chemical Company) analysiert. Die mit LDL assoziierte Arzneistoffmenge wurde für Dox, CI, mp-TdR, dp-IUdR durch HPLC, für das radiomarkierte ¹²⁵I-CI durch einen Gammazähler oder für ³H-mp-TdR durch Flüssigszintillationszählung ermittelt. Die Tabellen 1 und 2 fassen die HPLC-Bedingungen und die Ergebnisse der Arzneistoffbeladung von LDL zusammen.
Tabelle 1. HPLC-Bedingungen bei Verwendung einer C-18-Umkehrphasensäule
Tabelle 2. Wirkung von LTP auf die Beladung von menschlichem LDL mit Arzneistoff
Tabelle 2 zeigt, daß iLTP den Transfer von Arzneistoffmolekülen in das LDL um das 3-5fache erhöhte. Darüber hinaus wurden Voruntersuchungen möglicher Struktur- und Konformationsänderungen nach der Arzneistoffbeladung mittels verschiedener verfügbarer Verfahren durchgeführt, und sie zeigten, daß es keine bedeutenden Unterschiede zwischen nativem LDL und mit Arzneistoff beladenem LDL gab (die Daten sind nicht gezeigt).
BEISPIEL 9: Test der rezeptorvermittelten Aufnahme von ¹²⁵I-DPIP/LDL durch Zervix-Krebszelllinien
Die Zervix-Krebszelllinien HeLa, SiHa und C-33A wurden von ATCC erworben.
Bestimmung von LDL-Rezeptorzahlen auf HeLa, SiHa und C-33A.
Die LDL-Rezeptorbindung wurde durch das von Goldstein und Brown (J. Biol. Chem., 249:5153–5162 (1974)] beschriebene Verfahren mit geringen Modifizierungen getestet. Die HeLa-, SiHa- und C-33A-Zelllinien wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DEME), das mit 10% wärmeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM essentiellen Aminosäuren, 50 IU Penicillin/ml und 50 µg/ml Streptomycin angereichert war, bei 37°C in einer befeuchteten 4% Kohlendioxid/Luft-Atmosphäre in 125-cm²-Kolben (Costar) kultiviert.
Vor der Untersuchung wurden die Zellen in Kulturplatten mit 8 Vertiefungen mit einem Durchmesser von 34 mm bei Dichten von etwa 3,3×10⁵ (HeLa), 1×10⁶ (SiHa) und 5×10⁵ (C-33A) pro Vertiefung ausplattiert und mit LPDS-Medium (wobei LPDS als Ersatz für FCS in dem wie oben angegeben hergestellten Medium verwendet wurde) 1 Tag (HeLa, C-33A) oder 2 Tage (SiHa) lang inkubiert. Für den LDL-Rezeptorbindungsversuch wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von ¹²⁵I-LDL in Abwesenheit oder in Gegenwart eines 20fachen Überschusses an unmarkiertem LDL bei 4°C inkubiert. Nach 4stündiger Inkubation (8 Stunden für SiHa) wurde das Medium entfernt, und die Zellen in jeder Vertiefung wurden dreimal mit 1 ml eiskaltem Tris-Puffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 2 mg/ml BSA; pH 7,4), dann dreimal mit 1 ml eiskaltem PBS-Puffer gewaschen. Nach dem Waschen wurde 1 ml 0,1N NaOH zu jeder Vertiefung zugegeben, um die Zellen zu lösen. Eine 500-μl-Probe wurde aus jeder Vertiefung entnommen und die Menge an gebundenem ¹²⁵I-LDL durch Messung der Radioaktivität mittels eines Gammazählers und durch Bestimmung der Proteinkonzentration mittels des Bradford-Verfahrens ermittelt.
Die in Gegenwart einer Überschußmenge an unmarkiertem LDL durchgeführten Versuche ermöglichten die Messung der nichtspezifischen Bindung von ¹²⁵I-LDL an die Zellen. Die spezifische rezeptorvermittelte Bindung von ¹²⁵I-LDL konnte dann durch Subtraktion der nichtspezifischen Bindung von der Gesamtbindung ermittelt werden. Die LDL-Rezeptorzahl (B_max) und die Dissoziationskonstante (K_d) für jede Zelllinie wurden durch GraphPad-Prism^TM-Software ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3. LDL-Rezeptorzahl (B_max)^a und Dissoziationskonstante (K_d)^b der spezifischen Bindung von LDL an HeLa-, SiHa- und C-33A-Zellen
HeLa ist die am häufigsten verwendete Zervix-Tumorzelllinie für zytotoxische Untersuchungen von Antikrebs-Arnzeistoff/LDL-Komplexen. Diese Ergebnisse zeigten, daß diese Zelllinie eine hohe LDL-Rezeptorexpression (38314±9873 pro Zelle) besitzt, die mit der in früheren Untersuchungen [Lestavel-Delattre et al., Cancer Res., 52:3629–3635 (1992)] erhaltenen Zahl von 40000 Rezeptoren pro Zelle übereinstimmt. Diese Ergebnisse zeigen ferner, daß die LDL-Rezeptorzahlen von zwei anderen Zervix-Krebszelllinien, SiHa und C-33A, doppelt (etwa 70000 Rezeptoren pro Zelle) bzw. dreimal (etwa 120000 Rezeptoren pro Zelle) so hoch waren wie die für die HeLa-Zelllinie gefundene Zahl. Es wird somit gezeigt, daß die hohen Zahlen von LDL-Rezeptoren ein übliches Merkmal von Zervix-Krebszellen sind.
Test der rezeptorvermittelten Aufnahme von ¹²⁵I-DPIP/LDL durch Zellen Vor der Untersuchung wurden die Zellen wie oben für den LDL-Bindungsversuch beschrieben kultiviert. Während des Versuchs zur rezeptorvermittelten Aufnahme wurden die Zellen 4 Stunden lang bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen entweder von ¹²⁵I-DPIP/LDL, ¹²⁵I-DPIP/LDL plus 20fachem Überschuß an natürlichem LDL oder ¹²⁵I-DPIP/LDL plus 20fachem Überschuß an AcLDL inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen in jeder Vertiefung dreimal mit 1 ml eiskaltem Trispuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 2 mg/ml BSA; pH 7,4), dann dreimal mit 1 ml eiskaltem PBS-Puffer gewaschen. Nach dem Waschen wurde 1 ml 0,1N NaOH zu jeder Vertiefung zugegeben, um die Zellen zu lösen. Eine 500-μl-Probe wurde aus jeder Vertiefung entnommen und die Menge an gebundenem ¹²⁵I-LDL durch Messung der Radioaktivität mittels eines Gammazählers und durch Bestimmung der Proteinkonzentration mittels des Bradford-Verfahrens ermittelt.
Bei diesen kompetitiven Wiederaufnahmeuntersuchungen wird deutlich, daß die Aufnahme von ¹²⁵I-DPIP/LDL bei allen drei Zelllinien deutlich verringert wurde, wenn die Zellen gemeinsam mit einem 20fachen Überschuß an nativem LDL (p<0,05 bei allen drei Zelluntersuchungen, siehe die 12, 13 und 14) inkubiert wurden. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Arzneistoff/LDL-Komplex mit nativem LDL um die LDL-Rezeptoren an jeder Zelle konkurriert, was mit diesen Ergebnissen übereinstimmt (p<0,05 bei allen drei Zelluntersuchungen). Diese Ergebnisse zeigten auch, daß AcLDL nicht in bedeutendem Maße mit dem ¹²⁵I-DPIP/LDL-Komplex um die LDL-Rezeptoren konkurriert (p>0,05 bei allen drei Zelluntersuchungen, siehe die 12, 13 und 14), was mit früheren Berichten übereinstimmt, daß AcLDL nicht durch LDL-Rezeptoren identifiziert oder gebunden wird [Goldstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:333–337 (1979)]. Diese Versuche zeigen, daß der ¹²⁵I-DPIP/LDL-Komplex durch Tumorzellen durch einen LDL-rezeptorvermittelten Weg spezifisch internalisiert wird, was den Nutzen von ¹²⁵I-DPIP/LDL und verwandten Verbindungen als Tumor-Imaging-Mittel veranschaulicht.
BEISPIEL 10: Detektion atherosklerotischer Läsionen bei einem Miniaturschwein-Atherosklerosemodell durch Verwendung von ¹²⁵I-C2I/AcLDL oder ¹²⁵I-C2I/Mikroemulsion
Miniaturschweine werden 4–6 Monate lang mit einem mit Eidotter (11%)/Cholesterin (1%) angereicherten atherogenen Futter gehalten [Rolland et al., Am. J. Cardiol., 71:E22–E27 (1993); Prescott et al., Atherosclerosis X, 101–104 (1994)]. Das Futter wird mit Iod ergänzt. Unter diesen Bedingungen bilden die Tiere Läsionen aus, die menschlichen atherosklerotischen Plaques gleichen. ¹²⁵I-C2I/AcLDL oder ¹²⁵I-C2I/Mikroemulsion wird den Schweinen intravenös injiziert. In unterschiedlichen Zeit- Intervallen werden Blutproben entnommen. Die Tiere werden zu geeigneten Zeiten getötet und alle größeren Organe gesammelt und gewogen. Das Radioimaging wird wie oben für das Kaninchenmodell und das Modell der transgenen Maus durchgeführt, wobei der Größenunterschied der Tiere Änderungen erforderlich machte.
Es wird offensichtlich sein, daß die hier beschriebene Erfindung mannigfaltig variiert werden kann. Solche Variationen sollen nicht als Abweichung vom Sinn und Umfang der Erfindung aufgefaßt werden, und alle solchen Modifizierungen, die dem Fachmann in den Sinn kommen, sollen vom Umfang der folgenden Ansprüche umfaßt sein.

Claims

Verbindung der Formel (I):
wobei: n eine Zahl zwischen 1 und 16 ist, jede R-Gruppe unabhängig H oder I ist, wobei zwischen 2 und 6 R-Gruppen I sein müssen, R' und R" unabhängig H, (C₁-C₄)-Alkyl oder eine Aminschutzgruppe sind, R1 H oder (C₁-C₆)-Alkyl ist, R2 H ist, R3 H ist, oder R2 und R3 zusammengefaßt =O bedeuten, und R4 ist:
wobei: die Bindung --- eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet, R5 H, OR''' oder R''' ist, wobei R''' (C₁-C₆)-Alkyl ist, R6 H ist oder fehlt, R7 H ist oder fehlt, R8 H, (C₁-C₆)-Alkyl oder (C₂-C₆)-Alkenyl ist, R9 H ist oder fehlt, R10 H ist oder fehlt, R11 und R12 unabhängig H, R''' oder OR''' sind, oder R11 und R12 zusammengefaßt =O sind, mit der Maßgabe, daß, wenn R9 und R10 fehlen und die Bindung --- zwischen den R9 und R10 tragenden Kohlenstoffatomen eine Doppelbindung ist, R8 dann H oder (C₁-C₆)-Alkyl ist, und daß zwei benachbarte Bindungen, die als --- bezeichnet sind, nicht gleichzeitig Doppelbindungen sind.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R4 β-Sitosterol, Dihydrocholesterin, 7-Dehydrocholesterin, 22-Hydroxycholesterin, 25-Hydroxycholesterin, 3-Cholesten-3β-ol-7-on, 5α-Cholestan-3β-ol, 5α-Cholest-7-en-3β-ol, 7β-Hydroxycholesterin, Campesterol, Desmosterol, Ergosterol, Fucosterol, Lanosterol und Stigmasterol ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R4 Cholesterin ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei n = 1, R1 C₂H₅ ist und R2 und R3 zusammen =O sind.
Verbindung der Struktur:
Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5, wobei I ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus ¹²³I, ¹²⁵I und ¹³¹I.
Zusammensetzung, welche die Verbindung gemäß Anspruch 6 und ein Trägervehikel umfaßt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das genannte Trägervehikel ein Low-Density-Lipoprotein (LDL) ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei das LDL ein modifiziertes LDL ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, wobei das modifizierte LDL acetyliertes LDL ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das genannte Trägervehikel eine synthetische Mikroemulsion oder ein Liposom ist.
Verbindung gemäß Anspruch 6 zur Verwendung bei einem Radioimaging-Diagnoseverfahren.
Verbindung gemäß Anspruch 12 zur Verwendung bei der Sichtbarmachung von atherosklerotischen Läsionen, Leberzellen, Nervenzellen oder Tumorzellen.
Verbindung gemäß Anspruch 12 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Diagnose von Atherosklerose, Apoplexie, Zirrhose, Hepatitis, Alzheimer-Krankheit, Glomerulosklerose, Ataxie mit Vitamin-E-Mangel, Lebertumoren oder Krebs.
Verbindung gemäß Anspruch 12 zur Verwendung bei der Erkennung einer Lebererkrankung oder zur Erkennung und Lokalisierung von Tumoren bei einem Säugetier durch Radioimaging.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 7 bis 11 zur Verwendung bei einem Radioimaging-Diagnoseverfahren.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 16 zur Verwendung bei der Sichtbarmachung von atherosklerotischen Läsionen, Leberzellen, Nervenzellen oder Tumorzellen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 16 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Diagnose von Atherosklerose, Apoplexie, Zirrhose, Hepatitis, Alzheimer-Krankheit, Glomerulosklerose, Ataxie mit Vitamin-E-Mangel, Lebertumoren oder Krebs.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 16 zur Verwendung bei der Erkennung einer Lebererkrankung oder zur Erkennung und Lokalisierung von Tumoren bei einem Säugetier durch Radioimaging.
Verwendung einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Radioimaging-Mittels.
Diagnosekit, umfassend die Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–5, ein geeignetes Trägervehikel, Reagenzien, die zur Radiomarkierung der Verbindung mit einem geeigneten Radioisotop von Iod notwendig sind, und eine Gebrauchsanleitung.
Kit zur Herstellung radiomarkierter Proben, umfassend die Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1–5, Reagenzien, die zur Radiomarkierung der Verbindung mit einem geeigneten Radioisotop von Iod notwendig sind, und eine Gebrauchsanleitung.
Kit zur Herstellung einer radiomarkierten Diagnosezusammensetzung zur Verwendung beim Radioimaging, umfassend die Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–5, Emulgatoren und Kernlipide, die zur Herstellung einer Mikroemulsion notwendig sind, Reagenzien, die zur Radiomarkierung der Verbindung mit einem geeigneten Radioisotop von Iod notwendig sind, und eine Gebrauchsanleitung.