DE60038161T2

DE60038161T2 - Verfahren zum Quantifizieren von Triglyczeriden im Lipoprotein

Info

Publication number: DE60038161T2
Application number: DE60038161T
Authority: DE
Inventors: Kazuhito Sunto-gun Miyauchi; Shizuyo Sunto-gun TAKADA; Tomomi Sunto-gun MURAKAMI; Akira Sunto-gun Miike
Original assignee: Kyowa Medex Co Ltd
Current assignee: Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co Ltd
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 2000-01-20
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2020-01-21
Also published as: CA2360679A1; ATE387505T1; DE60038161D1; WO2000043537A1; US6811994B1; US20050042703A1; EP1148142B1; EP1148142A1; AU3074400A; EP1148142A4

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Quantifizieren von Triglyceriden (TG) in Lipiden, die auf dem Gebiet der klinischen Labortests, insbesondere als Risikofaktor für Arteriosklerose bedeutend sind.
Hintergrund der Erfindung
Derzeit wird im Bereich der klinischen Labortests Cholesterin in Lipoproteinen mit hoher Dichte (HDL) häufig als Risikofaktor angesehen, d. h. als negativer Faktor für Arteriosklerose, während Cholesterin in Lipoproteinen mit niedriger Dichte (LDL) auch als positiver Faktor angesehen wird. Andererseits wurde durch viele epidemologische Recherchen gezeigt, dass Hyperlipämie der Hauptfaktor bei der Entwicklung einer arteriosklerotischen Erkrankung ist, die mit einer ischämischen Herzerkrankung als Hauptsymptom einhergeht. Außerdem wird unter den Apoproteinen E der Lipoproteine mit sehr geringer Dichte (VLDL) E1 in den Rezeptor eingebaut, aber E2, das mit der Hyperlipämie Typ III im Zusammenhang steht, wird nicht eingebaut [Arteriosclerosis, 25 (11/12), 415–420 (1998); Journal of Clinical and Experimental Medicine, 172 (5), 276–280 (1995)]. Daher wurden bisher die Lipoproteine in verschiedener Hinsicht als Risikofaktoren für Arteriosklerose erwähnt.
In den letzten Jahren wurde verlautbart, dass der Unterschied in der Art und der Menge der Lipide, die in Lipoproteinen enthalten sind, mit verschiedenen Erkrankungen einhergeht. Es wurde auch berichtet, dass darunter LDL, insbesondere LDL mit geringer Dichte ein positiver Faktor für die eng damit im Zusammenhang stehende Arteriosklerose bei familiärer Hyperlipämie ist. LDL mit geringer Dichte wird aus VLDL durch die Wirkung eines katabolischen Enzyms auf TG produziert. Das Verhältnis des TG-Gehalts zum Cholesterin-Gehalt ist in dem LDL mit geringer Dichte im Vergleich zu normalem LDL verändert, und der TG-Gehalt ist erhöht [Journal of Clinical and Experimental Medicine, 164 (12), 833–836 (1993)]. Man zog demnach in Betracht, dass die hohe TG-Konzentration in LDL (ein Index für LDL mit geringer Dichte) das Risiko für Arteriosklerose erhöht.
Als Verfahren zur spezifischen Quantifizierung von TG in jedem Lipoprotein kann beispielsweise ein Kolorimetrieverfahren oder ein anderes derartiges Verfahren in Betracht gezogen werden. Bei der Kolorimetrie wird jedes Lipoprotein durch Ultrazentrifugation fraktioniert, und dann wird das in der Fraktion enthaltene TG beispielsweise mit einem Enzymsystem behandelt, das Lipoproteinlipase (LPL), Glycerinkinase (GK) und Glycerin-3-phosphat-oxidase umfasst, um Wasserstoffperoxid zu erzeugen, mit dem ein Chromogen zusammen mit einer Peroxidase (POD) entwickelt wird. Dieses Verfahren ist jedoch sehr mühsam, da es viel Zeit und Mühe für die Ultrazentrifugation erfordert.
JP-A 57 137 858 betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen Quantifizierung von Triglyceriden, wobei freies Glycerin, das mit Triglycerid und reduzierenden Substanzen gemeinsam vorliegt, vor dem Quantifizierungsschritt des Triglycerids durch Perjodsäure abgebaut wird. JP-A 59 011 197 betrifft die Bestimmung eines Substrats oder einer enzymatischen Aktivität durch zu Nutze machen von Oxidase, Peroxidase und einem spezifischen Phenolderivat, um ein Wasserstoffperoxid zu bilden, das kolorimetrisch nachgewiesen wird. JP-A 58 047 499 betrifft eine Messung einer Komponente von Lösungen des lebenden Körpers, wobei die gewünschte Komponente kolorimetrisch quantifiziert wird und eine störende Substanz zuvor entfernt wird, indem man sich Peroxidase und N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin (ESPT) zu Nutze macht. JP-A 09 121 895 beschreibt ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von HDL-Cholesterin unter Verwendung von Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase, um ein Wasserstoffperoxid zu bilden, das kolorimetrisch nachgewiesen wird. Das beschriebene Verfahren macht sich Carageenan, ein Copolymer der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Laurylacrylat und/oder Octylthioglucosid zu Nutze, um die spezifische Quantifizierung von HDL-Cholesterin ohne einen vorherigen Zentrifugierarbeitsgang der zu testenden Probe zu ermöglichen. Okazaki [Journal of Chromatography B, 709, 179–187 (1998)] beschreibt die Trennung der verschiedenen Lipoproteinfraktionen (Chylomikronen, VLDL, LDL und HDL) und freiem Glycerin durch Hochleistungsgeschwindigkeitschromatographie (HPLC). Der beschriebenen Trennung schließt sich ein kolorimetrischer Nachweis der entsprechenden Triglyceride an, die an die verschiedenen Lipoproteinfraktionen und das freie Glycerin gebunden sind.
Offenbarung der Erfindung
Der Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur praktischen Quantifizierung von Triglyceriden (TG) bereitzustellen, die in verschiedenen Lipoproteinen enthalten sind.
In Serum- oder Plasmaproben gibt es freies Glycerin und TG in verschiedenen Lipoproteinen. In der Erfindung soll TG, das in einem bestimmten Lipoprotein unter diesen verschiedenen Lipoproteinen enthalten ist, spezifisch quantifiziert werden, ohne das anvisierte Lipoprotein zu isolieren. Für diesen Zweck muss freies Glycerin, das einen Einfluss auf die Quantifizierung hat, irgendwie in eine inerte Form überführt werden, und TGs, die in anderen Lipoproteinen als das Bestimmte enthalten sind, müssen vorab verändert oder gehemmt werden, so dass sie nicht in die Reaktion einbezogen werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Quantifizieren von TGs in einem bestimmten Lipoprotein, das das Entfernen von freiem Glycerin aus einer Probe, die freies Glycerin und TG in dem bestimmten Lipoprotein enthält, dann das Umsetzen lassen der sich ergebenden Probe mit Lipoproteinlipase (LPL) und einem Enzymsystem, das Wasserstoffperoxid aus Glycerin erzeugt, das in der Reaktion produziert wird, und das Quantifizieren des erzeugten Wasserstoffperoxids umfasst.
Was Proben anbelangt, die TGs in Lipoproteinen enthalten, werden Testproben wie Serum, Plasma und dergleichen beispielhaft genannt.
LPL bedeutet ein Enzym (EC.3.1.1.34), das die Funktion besitzt, die TGs in Lipoproteinen zu Glycerin und Fettsäuren abzubauen.
Das Enzymsystem, das Wasserstoffperoxid aus Glycerin erzeugt, schließt ein System ein, das Glycerinkinase (GK) (EC.2.7.1.30) enthält, die die Funktion besitzt, Glycerin in Glycerin-3-phosphat in Gegenwart von ATP und Glycerin-3-phosphat-Oxidase (GPO) (EC.1.1.3) umzuwandeln, die Wasserstoffperoxid aus Glycerin-3-phosphat erzeugen, sowie ein System, das Glycerinoxidase (GO) (EC.1.1.3.21) enthält, die Wasserstoffperoxid aus Glycerin als Substrat erzeugt.
In einer Ausführungsform der vorlegenden Erfindung umfasst das Verfahren zum Entfernen von freiem Glycerin das Abbauen von Glycerin mit einem Enzymsystem, das Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin erzeugt, so dass sich Wasserstoffperoxid ergibt, und dann das Entfernen des erzeugten Wasserstoffperoxids.
Nach der Entfernung von Glycerin durch ein derartiges Verfahren kann TG in einem bestimmten Lipoprotein wie folgt quantifiziert werden. Die sich ergebende Probe lässt man in Gegenwart eines Reagenzes, das die Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein hemmt, mit LPL und einem Enzymsystem umsetzen, das Wasserstoffperoxid aus Glycerin erzeugt, das in dieser Reaktion erzeugt wurde, und das erzeugte Wasserstoffperoxid wird quantifiziert.
Das Reagenz, das die Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein hemmt, schließt Tenside, die die Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein hemmen, und/oder ein aggregierendes Mittel oder dergleichen für andere Lipoproteine als das bestimmte Lipoprotein ein.
Um die Erzeugung von Glycerin aus TG in einem bestimmten Lipoprotein durch LPL zu erleichtern, ist es auch möglich, ein Tensid und/oder ein Enzym zu verwenden, das die Reaktion eines bestimmten Lipoproteins im Verlauf der Quantifizierung nach dem Entfernen des freien Glycerins erlaubt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es ebenfalls möglich beim Entfernen des freien Glycerins ein Verfahren zum Entfernen von freiem Glycerin zu wählen, wobei das Verfahren das gleichzeitige Umwandeln von TGs in andere Lipoproteine als das bestimmte Lipoprotein in freies Glycerin umfasst.
Beispielsweise wird Wasserstoffperoxid in Gegenwart eines Reagenzes erzeugt, das die Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein unter Verwendung von LPL und eines Enzymsystems erlaubt, das Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin erzeugt, und dann wird das sich ergebende Wasserstoffperoxid entfernt. Daher können alle TGs, die nicht das TG in einem bestimmten Lipoprotein sind, entfernt werden.
Nach der Eliminierungsreaktion lässt man die Probe mit LPL und einem Enzymsystem reagieren, das Wasserstoffperoxid aus Glycerin erzeugt, und das sich ergebende Wasserstoffperoxid wird quantifiziert. Daher kann das in einem bestimmten Lipoprotein enthaltene TG quantifiziert werden.
Das Reagenz, das die Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein erlaubt, schließt Tenside, die die Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein hemmen und/oder aggregierende Mittel für bestimmte Lipoproteine ein.
Um die Erzeugung von Glycerin aus TG in einem bestimmten Lipoprotein durch LPL zu erleichtern, ist es auch möglich, ein Tensid und/oder ein Enzym hinzuzufügen, das die Reaktion eines bestimmten Lipoproteins nach dem Entfernen des freien Glycerins und TG in anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein erlaubt.
Nach der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Reagenzien bereitgestellt: Reagenzien zum Quantifizieren von TG in einem bestimmten Lipoprotein, das ein Reagenz zum Hemmen der Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein enthält, oder ein Reagenz zum Zulassen der Reaktionen von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein, LPL, GK, GPO und Peroxidase; oder Reagenzien zum Quantifizieren von TG in einem bestimmten Lipoprotein, das ein Reagenz zum Hemmen der Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein enthält, oder ein Reagenz zum Zulassen der Reaktionen von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein, LPL, GO und Peroxidase. Es ist möglich, zusätzlich zu einem Reagenz zum Zulassen der Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein ein Tensid und/oder ein Enzym hinzuzufügen, das die Reaktion eines bestimmten Lipoproteins erlaubt.
Außerdem werden nach der vorliegenden Erfindung die folgenden Reagenzien bereitgestellt: Reagenzien zum Quantifizieren von TG in einem bestimmten Lipoprotein, das ein Reagenz zum Hemmen der Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein enthält, oder ein Reagenz zum Zulassen der Reaktionen von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein im Reaktionsendgemisch, LPL, GK, GPO und Peroxidase; oder Reagenzien zum Quantifizieren von TG in einem bestimmten Lipoprotein, das ein Reagenz zum Hemmen der Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein enthält, oder ein Reagenz zum Zulassen der Reaktionen von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein im Reaktionsendgemisch, LPL, GO und Peroxidase.
Die vorstehend erwähnten jeweiligen Reagenzien zur quantitativen Analyse schließen eine Art von Kit ein, bei dem die Reagenzien in zwei oder mehrere Teile aufgeteilt sind, abhängig von ihrer Komponente.
Die Formulierung „Hemmung der Reaktion von anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein" bedeutet, dass eine Enzymreaktion, die den Abbau von TGs in anderen Lipoproteinen als das bestimmte Lipoprotein zu Glycerin durch LPL einschließt, direkt oder indirekt gehemmt wird, so dass TG in dem bestimmten Lipoprotein selektiv in einen Zustand versetzt wird, der eine selektive Enzymreaktion erlaubt. Die Formulierung „Zulassen der Reaktion eines bestimmten Lipoproteins" bedeutet, dass die Reaktion, die TG als Substrat in einem bestimmten Lipoprotein zu Glycerin durch LPL abbaut, durch direkte oder indirekte Wirkung auf das bestimmte Lipoprotein zugelassen wird.
Das Messverfahren der vorliegenden Erfindung wird spezifisch beschrieben wie folgt.
Wenn ein bestimmtes Lipoprotein HDL ist:
Bei der Messung von TG in HDL wird vorzugsweise ein Reagenz zum Hemmen der Reaktion von anderen Lipoproteinen als HDL, wie ein aggregierendes Mittel für andere Lipoproteine als HDL, ein Tensid zum Hemmen der Reaktion von anderen Lipoproteinen als HDL und dergleichen hinzugefügt, die den Abbau von TG zu LDL und VLDL durch LPL verhindert, um das Auftreten von Fehlern in den Ergebnissen der Messung des TG-Gehalts in HDL zu verhindern, wobei Fehler durch das gemeinsame Vorliegen von TGs in anderen Lipoproteinen als HDL (insbesondere LDL und VLDL) verursacht werden.
Beispielsweise erzeugt das Hinzufügen einer Probe, von GK und GPO oder GO zu einer wässrigen Lösung, die ein Puffermittel enthält, Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin in der Probe. Dann werden ein Enzym z. B. Katalase, das das erzeugte Wasserstoffperoxid entfernt, oder ein Teil eines Kopplungstyp-Chromogens und Peroxidase dem Reaktionsgemisch gleichzeitig zugegeben, und man lässt es bei 10 bis 50°C, vorzugsweise bei 25 bis 40°C 3 bis 10 Minuten, vorzugsweise 4 bis 5 Minuten reagieren.
In dieser Reaktion wird das freie Glycerin, das in der Probe enthalten ist, vollständig entfernt.
Anschließend werden LPL oder LPL und ein Tensid zum Hemmen der Reaktion von anderen Lipoproteinen als HDL dem Reaktionsgemisch zugegeben, um Glycerin aus TG in HDL zu erzeugen. Daher wird Wasserstoffperoxid aus dem sich ergebenden Glycerin mit GK und GPO oder GO in dem Reaktionsgemisch erzeugt.
Unter diesen Umständen, wenn ein Teil des Kopplungstyp-Chromogens und Peroxidase dem Reaktionsgemisch vorab zugegeben wurden, wird der andere Teil eines Kupplungstyp-Chromogens dem Reaktionsgemisch hinzugefügt oder alternativ wenn die Katalase hinzugefügt wurde, werden ein Chromogen und Peroxidase zugegeben. Dann lässt man das Gemisch bei 10 bis 50°C, vorzugsweise bei 25 bis 40°C 2 Minuten oder länger vorzugsweise 3 bis 10 Minuten reagieren.
Daher kann die Quantifizierung von TG in HDL durch Quantifizieren des Farbstoffs erreicht werden, die in der vorstehend erwähnten Reaktion erzeugt wird.
In diesem Zusammenhang ist es möglich, das Reagenz zum Hemmen der Reaktion von anderen Lipoproteinen als HDL zum Zeitpunkt der Eliminierungsreaktion des freien Glycerins hinzuzufügen. Falls notwendig, ist es auch möglich, einen Puffer als Cofaktor, der für eine Enzymreaktion, z. B. ATP für die GK-Reaktion benötigt wird, oder ein Mittel zum Entfernen von Inhibitoren in Seren z. B. Ascorbat-Oxidase hinzuzufügen.
Was die aggregierenden Mittel für andere Lipoproteine als HDL anbelangt, werden die Kombination eines Polyanions und eines bivalenten Metallsalzes, Antikörper, die andere Lipoproteine als HDL aggregieren, Polyoxyethylenglycol (PEG) und dergleichen beispielhaft genannt. Das Polyanion schließt Heparin oder Salze davon, Phosphorwolframsäure oder Salze davon, Dextransulfat oder Salze davon, sulfatiertes Cyclodextrin oder Salze davon, sulfatiertes Oligosaccharid oder Salze davon und dergleichen ein; das Cyclodextrin schließt α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin, γ-Cyclodextrin etc. ein; das Oligosaccharid schließt Maltotriose, Maltotetrose, Maltopentose, Maltohexose, Maltoheptose etc. ein; das Salz schließt Natriumsalze, Kaliumsalze, Lithiumsalze, Ammoniumsalze, Magnesiumsalze etc. ein. Das bivalente Metallsalz schließt Magnesiumsalze, Calciumsalze, Mangansalze, Nickelsalze, Cobaltsalze und dergleichen ein, und die Magnesiumsalze werden besonders bevorzugt.
Das Polyanion kann vorzugsweise in einer Menge von 0,1 g/l bis 50 g/l verwendet werden. Beispielsweise werden 0,02 bis 10 mM Heparin mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 20000 oder Salze davon, 0,1 bis 10 mM Phosphowolframsäure mit einem Molekulargewicht von 4000 bis 8000 oder Salze davon, 0,01 bis 5 mM Dextransulfat mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 500000 oder Salze davon, 0,1 bis 20 mM Dextransulfat mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10000 oder Salze davon, 0,1 bis 50 mM sulfatiertes Cyclodextrin mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 3000 oder Salze davon, 0,1 bis 50 mM sulfatiertes Oligosaccharid mit einem Molekulargewicht von 400 bis 3000 oder Salze davon, oder deren Gemisch und dergleichen bevorzugt verwendet. Stärker bevorzugt werden 0,03 bis 1 mM Heparin mit einem Molekulargewicht von 14000 bis 16000 oder Salze davon, 0,1 bis 3 mM Phosphowolframsäure mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 7000 oder Salze davon, 0,01 bis 5 mM Dextransulfat mit einem Molekulargewicht von 150000 bis 250000 oder Salze davon, 0,1 bis 10 mM Dextransulfat mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 5000 oder Salze davon, 0,1 bis 10 mM sulfatiertes Cyclodextrin mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 2000 oder Salze davon, 0,1 bis 10 mM sulfatiertes Oligosaccharid mit einem Molekulargewicht von 400 bis 2000 oder Salze davon, oder deren Gemisch und dergleichen verwendet.
Was das bivalente Metallsalz anbelangt, können 0,1 bis 50 mM Magnesiumsalze, Calciumsalze, Mangansalze, Nickelsalze, Cobaltsalze und dergleichen verwendet werden, und vorzugsweise werden 0,1 bis 50 mM Magnesiumsalze verwendet.
Was die Antikörper anbelangt, die andere Lipoproteine als HDL aggregieren werden der Anti-apo-B-Antikörper, Anti-apo-C-Antikörper und dergleichen beispielhaft genannt. Der Anti-apo-B-Antikörper oder der Anti-apo-C-Antikörper schließt IgG-Fraktionen des Anti-apo-B-Antiserums bzw. Anti-apo-C-Antiserums ein, die durch Immunisieren von Kaninchen mit Apoprotein B oder Apoprotein C, gereinigt aus menschlichem Serum, hergestellt werden, wobei dann das sich ergebende Anti-apo-B-Antiserum oder Anti-apo-C-Antiserum einer Ammoniumsulfatpräzipitation mit anschließendem Aussalzen unterzogen wird, oder alternativ können sie monclonale Anti-apo-B-Antikörper oder monclonale Anti-apo-C-Antikörper sein, die durch Immunisieren von Mäusen mit dem Apoprotein B oder Apoprotein C hergestellt werden (Monoclonal Antibody; Introduction of Experimental Procedure, Tamie Ando, Kodansha Scientific, S. 21, 1991).
Als PEG wird vorzugsweise 0,3 bis 100 mM PEG mit einem Molekulargewicht von 4000 bis 25000 und stärker bevorzugt 1,0 bis 50 mM PEG mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 22000 verwendet.
Was das Tensid anbelangt, das die Reaktion von anderen Lipoproteinen als HDL hemmt, werden Polyoxyethylenglycolalkylether, Polyoxyethylenglycolalkylphenylether, Polyoxyethylenglycol-Polyoxypropylenglycol-Kondensat [Pluronic F-68, Pluronic F-88 (Asahi Denka Kogyo KK), etc.], Polyoxyethylenglycolalkylethersulfat, Tenside wie Alkylbenzolsulfonat, offenbart in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 8-201393 ; Tenside, die als schwach schäumendes Benetzungseindringmittel bezeichnet werden, einschließlich Polyoxyethylenglycolderivate wie Emulgen 220, Emulgen 913, Emul 20C, Emulgen B-66 etc., anionische Tenside wie Dodecylbenzolsulfonate etc. und Tenside vom Gallensäure-Typ wie Cholsäure, Desoxycholsäure etc. beispielhaft genannt. Vorzugsweise werden Pluronic F-68, Pluronic F-88 (Asahi Denka Kogyo KK), etc., Emulgen 220, Emulgen 913, Emul 20C, Emulgen B-66, Dodecylbenzolsulfonate, u. ä. beispielhaft genannt. Die Konzentration des Tensids liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 5%.
(2) Wenn das bestimmte Lipoprotein LDL ist:
Bei einem TG-Messverfahren in LDL werden TGs in anderen Lipoproteinen als LDL (insbesondere HDL und VLDL) in freies Glycerin umgewandelt, das dann zusammen mit freiem Glycerin in der Probe vollständig entfernt wird. Daher kann TG in LDL spezifisch quantifiziert werden. Bei der Durchführung der Quantifizierung von TG in LDL, lässt man TGs in anderen Lipoproteinen als LDL mit LPL in Gegenwart eines Reagenzes umsetzen, das die Reaktion der Umwandlung in freies Glycerin von anderen Lipoproteinen als LDL erlaubt, beispielsweise ein Tensid, das die Reaktion von anderen Lipoproteinen als LDL erlaubt, wie Polyoxyethylenglycolalkylphenylether [HLB (Index des Hydrophil-Lipophil-Gleichgewichts in der Struktur des Tensids) ist 15 oder höher], ein Tensid, das als schwach schäumendes Benetzungseindringmittel bezeichnet wird, einschließlich Polyoxyethylenglycolderivate, oder eine Kombination des Tensids und eines LDL-aggregierenden Mittels [Polyanion (manchmal einschließlich bivalenter Metallsalze), Antikörperaggregierendes LDL oder dergleichen]. Dies wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt.
Einer wässrigen Lösung, die einen Puffer enthält, wird eine Probe, ein Reagenz, das die Reaktion von anderen Lipoproteinen als LPL erlaubt, LPL, eine Kombination aus GK und GPO oder GO zugegeben. TGs in anderen Lipoproteinen als LPL in der Probe werden durch LPL abgebaut, so dass sich freies Glycerin ergibt, das zusammen mit freiem Glycerin, das ursprünglich in der Probe mit einem GK- und GPO- oder GO-Enzymsystem vorliegt, weiter abgebaut wird, so dass sich Wasserstoffperoxid ergibt. Um das sich ergebende Wasserstoffperoxid zu entfernen, werden die vorstehend erwähnte Katalase oder ein Teil des Kopplungstyp-Chromogens und Peroxidase mit dem vorstehend erwähnten LPL dem Puffer gleichzeitig zugegeben, und man lässt das Gemisch bei 10 bis 50°C, vorzugsweise bei 25 bis 40°C 3 bis 10 Minuten, vorzugsweise 4 bis 5 Minuten reagieren.
In dieser Reaktion werden die TGs mit Ausnahme derjenigen im LDL vollständig entfernt.
Anschließend werden ein Tensid, das die Reaktion von LDL erlaubt, und der andere Teil des Kopplungstyp-Chromogens oder das Tensid und LPL dem Reaktionsgemisch zugegeben. Daher wird TG zu LDL abgebaut, so dass sich Glycerin ergibt, das mit einem Enzymsystem aus GK und GPO oder GO die im Reaktionsgemisch enthalten sind, weiter abgebaut wird, um Wasserstoffperoxid zu erzeugen. Um das erzeugte Wasserstoffperoxid zu quantifizieren, wenn ein Teil des Kopplungstyp-Chromogens und die Peroxidase vorab zugegeben wurden, wird dem Reaktionsgemisch der andere Teil eines Kopplungstyp-Chromogens zugegeben, oder alternativ, wenn Katalase zugegeben wurde, werden ein Chromogen und Peroxidase zugegeben. Dann lässt man das Gemisch bei 10 bis 50°C, vorzugsweise bei 25 bis 40°C 2 Minuten oder länger, vorzugsweise 3 bis 10 Minuten reagieren.
Nach dem vorstehend erwähnten Verfahren kann TG in LDL spezifisch quantifiziert werden.
Um die Durchführung der Enzymreaktion zu erleichtern, kann ein Cofaktor wie ATP, der für die GK-Reaktion erforderlich ist, dem Puffer hinzugefügt werden.
Das Tensid, das bei der Entfernung von TGs in anderen Lipoproteinen als LDL verwendet wird, das die Reaktion von anderen Lipoproteinen als HDL erlaubt, schließt diejenigen ein, wie im Beispiel der vorstehend erwähnten Quantifizierung von HDL beschrieben, sowie andere Agenzien mit relativ hohem HLB wie Emulgen A-60 oder dergleichen. Genauer gesagt werden zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Tensiden Polyoxyethylenglycolalkylphenylether wie Nonion NS-220. NS-230, NS-240, HS-220, HS-240 etc. beispielhaft genannt. Diese sind Emulgatoren für Gummi oder Plastik und die meisten davon weisen einen HLB von 15 oder höher auf.
Diese können als Gemisch verwendet werden. Im Allgemeinen weist der HLB eine Additivität auf, und es ist allgemein bekannt, dass das ein Mittel mit hohem HLB-Wert in Kombination mit einem Mittel mit niedrigem HLB-Wert verwendet werden kann, um einen HLB-Wert richtig anzupassen. Die Konzentration des Tensids liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 5%.
Was die Polyanionen, bivalenten Metallsalze und LDL-aggregierenden Antikörper anbelangt, die bei der Entfernung von TGs in anderen Lipoproteinen als LDL verwendet werden, werden die Polyanionen, bivalenten Metallsalze und andere Lipoproteine als LDL aggregierende Antikörper, wie in dem Beispiel der vorstehend beschriebenen HDL-Quantifizierung und dergleichen, beispielhaft genannt.
Was das Tensid anbelangt, das die Reaktion von LDL erlaubt, werden nicht ionische Tenside, in denen LDL löslich ist, beispielsweise Emulgen 709, Triton X-100, Triton DF-16, Triton LO-5 etc. allein oder in Kombination verwendet. Genauer gesagt, ein Tensid mit hohem Solubilisierungsvermögen wie Trition DF-16 (Sigma), Emulgen 709 (Kao Corporation) etc. werden beispielhaft genannt. Die Konzentration des Tensids liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 von 5%.
Was das Enzym anbelangt, werden gewöhnlich im Handel erhältliche LPL, GK, GPO, GO, Peroxidase und dergleichen beispielhaft genannt. Um die Spezifität und Stabilität dieser Enzyme weiter zu erhöhen, werden Enzyme, die chemisch mit einer Gruppe modifiziert sind, die Polyoxyethylenglycol als Hauptanteil enthält, eine Gruppe, die Polypropylenglycol als Hauptanteil enthält, eine Gruppe, die eine Zuckereinheit in ihrer Struktur wie wasserlösliches Oligosaccharidreste, eine Sulfopropylgruppe, eine Polyurethangruppe und dergleichen enthält, verwendet. Alternativ kann vorzugsweise ein Enzym, das hergestellt wird, indem das Gen des Enzyms durch genetische Manipulation entfernt wird und in einen anderen Mikroorganismus zur Expression eingeführt wird, oder ein chemisch modifiziertes Derivat davon, oder ein Enzym, das hergestellt wird, indem das Gen zur Modifizierung und Expression eingesetzt wird, oder ein chemisch modifiziertes Derivat davon oder dergleichen verwendet werden.
Als Beispiel für Reagenzien zum Modifizieren des Enzyms (chemische Modifizierer) werden genannt: eine Verbindung, in der Polyoxyethylenglycol an eine Gruppe gebunden ist, an die eine Aminogruppe gebunden werden kann [z. B. Sunbright VFM4101 (hergestellt von NOF Corporation), in der Polyoxyethylenglycol an eine Gruppe gebunden ist, an die eine Aminogruppe gebunden werden kann, z. B. N-Hydroxysuccinimidogruppe]; Sunbright AKM-Reihe, ADM-Reihe und ACM-Reihe [diese werden von NOF Corporation; Journal of Chemical Engineering of Japan, Bd. 20 Nr. 3, 459 (1994)] hergestellt, die eine Polyalkylenglycolstruktur und eine Säureanhydridstruktur aufweisen; eine Verbindung umfasst Polyethylenglycol und Polypropylenglycol, das an eine Gruppe gebunden ist, an die eine Aminogruppe gebunden werden kann; ein Copolymer aus Polyoxyethylenglycolmonomethacrylmonomethylether und Maleinanhydrid und dergleichen. Außerdem kann ein chemischer Modifizierer für Polyurethan d. h. aktiviertes Polyurethan P4000 (hergestellt von Boehringer Mannheim GmbH; Beipackzettel für Enzymmodifizierungsset), ein chemischer Modifizierer für Dextran, d. h., Dextran T40, TCT-aktiviert (derselbe wie vorstehend), 1,3-Propansulton und dergleichen verwendet werden. Unter Verwendung dieser chemischen Modifizierer können die Enzyme mit einer Gruppe modifiziert werden, die Polyoxyethylenglycol als Hauptanteil enthält, eine Gruppe, die Polyoxypropylenglycol als Hauptanteil enthält, eine Gruppe, die ein Copolymer von Polyoxypropylenglycol und Polyoxyethylenglycol enthält, eine Gruppe, die eine Zuckereinheit in ihrer Struktur, eine Sulfopropylgruppe, Polyurethangruppe und dergleichen enthält.
Das Folgende ist ein Beispiel eines Verfahrens zum Umsetzen eines Enzyms mit den vorstehend erwähnten chemischen Modifizierern, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt. Zuerst wird ein Enzym in einem Puffer mit einem pH-Wert von 8 oder höher, wie HEPES-Puffer, gelöst, dem beispielsweise eine äquimolare Menge von 0,01 bis 500 von Sunbright bei 0 bis 50°C zugegeben wird, und das Gemisch wird 5 bis 60 Minuten gerührt. Dieses Reaktionsgemisch wird direkt verwendet oder, falls erforderlich, nach der Entfernung von niedermolekularem Material über eine Ultrafiltrationsmembran.
Die notwendige in der vorliegenden Erfindung verwendete Enzymmenge beträgt vorzugsweise 0,1 bis 20 Einheiten (E)/ml für LPL, 0,2 bis 30 E/ml für GK, 1 bis 50 E/ml für GPO, 1 bis 100 E/ml für Peroxidase, und 2 bis 200 E/ml für GO. Die ATP-Menge, die zur Verwendung von GK notwendig ist, beträgt 0,05 mg/ml bis 5 mg/ml.
Das beim Nachweis von Wasserstoffperoxid vorzugsweise verwendete Chromogen schließt eine Kombination von 4-Aminoantipyrin mit einem Phenol, wie Phenol, 4-Chlorphenol, m-Cresol, 3-Hydroxy-2,4,6-trijodbenzoesäure (HTIB) etc.; eine Kombination von 4-Aminoantipyrin mit einem Anilin, bekannt als Trinder-Reagenz (Dojindo Laborstories, Allgemeiner Katalog 19. Auflage, 1994) wie N-Sulfopropylanilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin (MAOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin (DAOS), N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin (TOPS), N-(2-Hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin (HDAOS), N,N-Dimethyl-m-toluidin, N,N-Disulfopropyl-3,5-dimethoxyanilin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidin, N-Ethyl-N-sulfopropylanilin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyanilin, N-Sulfopropyl-3,5-dimethoxyanilin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylanilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-anisidin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)anilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin etc., oder N-Ethyl-N-(3-methylphenyl)-N'succinylethylendiamin (EMSE), N-Ethyl-N-(3-methylphenyl)-N'-acetyl-ethylendiamin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxy-4-fluoranilin, N-Sulfopropyl-3,5-dimethoxy-4-fluoranilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxy-4-fluoranilin, N-(2-Hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxy-4-fluoranilin und dergleichen und Kopplungstyp-Chromogen ein. Außerdem ist es möglich, 10-(N-Carboxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin (MCDP), Bis[3-bis(4chlorphenyl)methyl-4-dimethylaminophenyl]amin (BCMA) oder dergleichen zu verwenden. Die Konzentration dieser Chromogene liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,02 bis 2 g/l.
In der vorliegenden Erfindung kann ein Puffermittel, mit dem eine Lösung eine puffernde Wirkung haben kann, verwendet werden. Das bevorzugte Puffermittel schließt Phosphate, Borste, Salze von organischen Säuren sowie Good- und Tris-Pufferagenzien ein. Die Konzentration des Puffers liegt vorzugsweise bei 10 bis 200 mM. Der bevorzugte pH-Bereich liegt zwischen 5 und 9.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Absorption gegen die Zeit, gemessen mit einem Reagenz zum Messen der Gesamt-TG für HDL-, LDL- und VLDL-Fraktionen.
2 zeigt die Absorption gegen die Zeit für HDL-, LDL- und VLDL-Fraktionen, gemessen mit dem Verfahren in Beispiel 1.
3 zeigt die Absorption gegen die Zeit für HDL-, LDL- und VLDL-Fraktionen, gemessen mit dem Verfahren in Beispiel 2.
Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung

Die Folgenden sind Arbeitsbeispiele. Beispiel 1

Messung von TG in LDL
Reagenz 1 (pH 6,25)	Puffer [Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure (PIPES)]	50 mM
	TOOS (Dojindo Laborstories)	0,3 g/l
	ATP 2Na-Salz (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	2,5 g/l
	Ascorbinsäureoxidase (Asahi Kasei Corporation)	3 kE/l
	GK (Toyobo Co., Ltd.)	1 kE/l
	GPO (Asahi Kasei Corporation)	8 kE/l
	Peroxidase (Toyobo Co., Ltd.)	20 kE/l
	PEG-modifiziertes LPL (Toyobo Co., Ltd.)	1,5 kE/l
	LPL III (Amano)	60 kE/l
	Nonion NS-230 (NOF Coporation)	0,1%
	Magnesiumsulfatheptahydrat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,5 g/l
Reagenz 2 (pH 6,25)	Puffer (PIPES)	50 mM
	Emulgen 709	0,6%
	Triton DF-16	0,3%
	4-Aminoantipyrin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,5 g/l

Die Spezifität wurde durch Verfolgen des Zeitverlaufs unter der Bedingung der folgenden Parameter unter Verwendung eines Hitachi Auto-Analysegeräts 7170 bestätigt. Als Probe wurden HDL-, LDL- und VLDL-Fraktionen verwendet, die aus menschlichem Serum durch Ultrazentrifugation fraktioniert worden waren. 1 zeigt den Zeitverlauf, gemessen mit einem Reagenz zum Messen der Gesamt-TGs (Kyowa Medex Co., Ltd.) für TG, das in jedem Lipoprotein enthalten ist, und 2 zeigt den Zeitverlauf, gemessen mit den vorstehend erwähnten Reagenzien. Bei der Behandlung mit dem Reagenz zur Messung von Gesamt-TG sind alle TGs, die in jedem Lipoprotein enthalten sind, an der Reaktion beteiligt. Andererseits reagieren bei der Behandlung mit den vorstehend erwähnten Reagenzien freies Glycerin und TGs in HDL und VLDL in der Probe zuerst in der ersten Reaktion, um Wasserstoffperoxid zu erzeugen, das gleichzeitig durch Katalase entfernt wird. Zu dem Zeitpunkt, wenn das Reagenz 2 hinzugefügt wird, tritt die Reaktion nur in LDL auf. Daher wurde ein System zum spezifischen Quantifizieren von TG in LDL etabliert. Außerdem wurden Serumproben von gesunden Probanden direkt als Proben ohne Fraktionierung analysiert, wobei dasselbe Hitachi 7170-Gerät verwendet wurde, in das folgende Parameter eingegeben wurden. Als Standardlösungen wurden die vorstehend erwähnten LDL-Fraktionen verwendet, von denen die Werte mit einem Determiner L TG-Gerät (hergestellt von Kyowa Medex Co., Ltd.) gemessen wurden und als Parameter in das Analysegerät eingegeben wurden.
Die sich so ergebenden analytischen Werte wurden mit denjenigen verglichen, die durch das folgende Verfahren wie ein Referenzverfahren erhalten wurden.
Der Korrelationskoeffizient war 0,918.
(Referenzverfahren)
Nach dem Standardverfahren zur Messung von HDL, bereitgestellt von US CDC, wurde jede Probe einer Ultrazentrifugation unterworfen, und die Gesamt-TGs wurden für die sich ergebenden HDL- und LDL-Fraktionen (TG(L+H)) quantifiziert. Das spezifizierte Fraktionierungsmittel (Heparinmangan) wurde dazugegeben und der Unterschied des TG(H)-Werts für das präzipitierte und abgetrennte HDL, [TG(L+H)-TG(H)], wurde verwendet.
(Parameter)

Analytisches Verfahren: 2 Endpunkte
Photometrischer Punkt: 16–34, Bereich; 10 Minuten
Messwellenlänge: 546 nm; Nebenwellenlänge: 700 nm
Probenvolumen: 3,2 μl
Reagenzvolumen: R1: 240 μl; R2: 80 μl

Beispiel 2

Messung von TG in HDL
Reagenz 1 (pH 6,25)	Puffer (PIPES)	50 mM
	TOOS (Dojindo Laborstories)	0,3 g/l
	ATP 2Na-Salz (Wako Pure Chemical	2,5 g/l
	Industries, Ltd.)
	Ascorbinsäureoxidase	3 kE/l
	(Asahi Kasei Corporation)
	GK (Toyobo Co., Ltd.)	1 kE/l
	GPO (Asahi Kasei Corporation)	8 kE/l
	Katalase (Sigma)	300 kE/l
	Natriumdextransulfat	0,2 g/l
	Magnesiumsulfatheptahydrat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,5 g/l
Reagenz 2 (pH 6,25)	Puffer (PIPES)	50 mM
	Emulgen-B66 (Kao Corporation)	20 g/l
	Calciumchloriddihydrat	0,1 g/l
	4-Aminoantipyrin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	0,5 g/l
	Natriumazid	0,5 g/l
	LPL (Asahi Kasei Corporation)	1000 kE/l
	Peroxidase (Toyobo Co., Ltd.)	20 kE/l

Die Spezifität wurde durch Verfolgen des Zeitverlaufs unter der Bedingung der folgenden Parameter unter Verwendung eines Hitachi Auto-Analysegeräts 7170 bestätigt. Als Probe wurden dieselben HDL-, LDL- und VLDL-Fraktionen verwendet, die aus menschlichem Serum durch Ultrazentrifugation wie Beispiel 1 fraktioniert wurden. Wie in 3 gezeigt, reagiert in der ersten Reaktion bei der Behandlung mit dem Reagenz 1 freies Glycerin zuerst, um Wasserstoffperoxid zu erzeugen, das gleichzeitig durch Katalase entfernt wird. Zu dem Zeitpunkt, wenn das Reagenz 2 hinzugefügt wird, tritt die Reaktion nur in HDL auf. Daher wurde ein System zum spezifischen Quantifizieren von TG in HDL etabliert. Außerdem wurden Serumproben von gesunden Probanden direkt als Proben ohne Fraktionierung analysiert, wobei dasselbe Hitachi 7170-Gerät verwendet wurde. Als Standardlösungen wurden die vorstehend erwähnten HDL-Fraktionen verwendet, von denen die Werte mit einem Determiner L TG-Gerät (hergestellt von Kyowa Medex Co., Ltd.) gemessen wurden und in das Analysegerät als Parameter eingegeben wurden.
Daher wurden die sich ergebenden analytischen Werte mit denjenigen verglichen, die durch das folgende Verfahren wie ein Referenzverfahren erhalten wurden.
Der Korrelationskoeffizient war 0,911.
(Referenzverfahren)
Nach dem Standardverfahren zum Messen von HDL, bereitgestellt von US CDC, wurde jede Probe einer Ultrazentrifugation unterworfen. Das spezifizierte Fraktionierungsmittel (Heparinmangan) wurde zu den sich ergebenden HDL- und LDL-Fraktionen gegeben, und der TG-Wert des HDL-Anteils in dem durch Präzipitation und Trennung erhaltenen Überstand wurde verwendet.
(Parameter)

Analytisches Verfahren: 2 Endpunkte
Photometrischer Punkt: 16–34, Bereich; 10 Minuten
Messwellenlänge: 546 nm; Nebenwellenlänge: 700 nm
Probenvolumen: 3,2 μl
Reagenzvolumen: R1: 240 μl; R2: 80 μl
Industrielle Anwendbarkeit

Nach der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur praktischen Quantifizierung von TGs bereitgestellt, die in verschiedenen Lipoproteinen enthalten sind. Genauer gesagt bietet die Quantifizierung von TG in LDL einen Index der Ausbeute von LDL mit geringer Dichte, das im Zusammenhang mit der Vermeidung von Arteriosklerose stehen kann.

Claims

Verfahren zum Quantifizieren von Triglycerid (TG) in Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) in einer Probe, die Triglyceride in einem Gemisch von Lipoproteinen und freiem Glycerin enthält, das die Schritte umfasst: (1) das Abbauen des freien Glycerins aus der Probe unter Verwendung eines Enzymsystems, das Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin erzeugt, um Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin zu produzieren, wobei das Enzymsystem Glycerinkinase (GK) und Glycerin-3-Phosphatoxidase (GPO) umfasst oder Glycerinoxidase (GO) umfasst, und dann das Entfernen des so erzeugten Wasserstoffperoxids, wobei das Entfernen das Verwenden eines Teils eines Kopplungstyp-Chromogens und von Peroxidase (POD) oder das Verwenden von Katalase umfasst; (2) das Umsetzen der Probe aus Schritt (1), die das Gemisch von Lipoproteinen enthält, mit Lipoprotein-Lipase (LPL), um Glycerin in Anwesenheit eines Reagens zu produzieren, das den Abbau von TGs in anderen Lipoproteinen als HDL zu Glycerin durch LPL hemmt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem aggregierenden Agens für andere Lipoproteine als HDL; und (ii) einem Tensid zum Hemmen des Abbaus von TGs in anderen Lipoproteinen als HDL zu Glycerin durch LPL, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyoxyethylenglycolalkylether, Polyoxyethylenglycol-Polyoxypropylenglycol-Kondensat, Polyoxy-ethylenglycolalkylethersulfat, Alkylbenzolsulfonat, einem Polyoxyethylenglycol-Derivat, das ein schwach schäumendes Benetzungseindringmittel ist, einem anionischen Tensid und einem Tensid vom Gallensäure-Typ; (3) das Umsetzen der Probe aus Schritt (2) mit einem Enzymsystem, das aus freiem Glycerin Wasserstoffperoxid erzeugt; und (4) das Quantifizieren des erzeugten Wasserstoffperoxids aus Schritt (3).
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das aggregierende Agens für andere Lipoproteine als HDL eines ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Kombination eines Polyanions und eines bivalenten Metallsalzes, einem Antikörper, der andere Lipoproteine als HDL aggregiert, und Polyoxyethylenglycol.
Verfahren zum Quantifizieren von TG in Lipoproteinen geringer Dichte (LDL) in einer Probe, die Triglyceride in einem Gemisch aus Lipoproteinen und freiem Glycerin enthält, das die Schritte umfasst: (1) das Abbauen von TGs in anderen Lipoproteinen als LDL durch LPL aus der Probe, um freies Glycerin zu erhalten, in Anwesenheit eines Reagens, das den Abbau von TGs in anderen Lipoproteinen als LDL zu Glycerin durch LPL erlaubt, das Polyoxyethylenglycolalkylphenylether mit einem Index des Hydrophil-Lipophil-Gleichgewichts (HLB) von 15 oder höher ist; (2) das Abbauen von freiem Glycerin aus der Probe aus Schritt (1) unter Verwendung eines Enzymsystems, das Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin erzeugt, um Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin zu produzieren, wobei das Enzymsystem GK und GPO umfasst oder GO umfasst, und dann das Entfernen des so erzeugten Wasserstoffperoxids, wobei das Entfernen das Verwenden eines Teils eines Kopplungstyp-Chromogens und von POD oder das Verwenden von Katalase umfasst; (3) das Umsetzen der Probe aus Schritt (2) mit LPL, um Glycerin zu produzieren, in der Anwesenheit eines Reagens, das den Abbau von TGs in LDL zu Glycerin durch LPL erlaubt, das ein nicht-ionisches Tensid, in dem LDL löslich ist, umfasst, wobei freies Glycerin aus LDL produziert wird; (4) das Umsetzen der Probe aus Schritt (3) mit einem Enzymsystem, das Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin erzeugt; und (5) das Quantifizieren von erzeugtem Wasserstoffperoxid aus Schritt (4).
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Reagens in Schritt (1) mit einem aggregierenden Agens für LDL kombiniert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das aggregierende Agens für LDL ein Polyanion oder ein LDL-aggregierender Antikörper ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Schritt des Quantifizierens von Wasserstoffperoxid umfasst, dass die Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit POD und einem Chromogen zugelassen wird, um einen Farbstoff zu erhalten, und das Quantifizieren des Farbstoffs als Absorption.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Chromogen 4-Aminoantipyrin und ein Trinder-Reagens umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Enzymsystem, das Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin erzeugt, GK und GPO umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Enzymsystem, das Wasserstoffperoxid aus freiem Glycerin erzeugt, GO umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Probe Serum oder Plasma ist.
Reaktionsgemisch zum Quantifizieren von TG in (a) HDL, wobei das Reaktionsgemisch ein Reagens zum Hemmen des Abbaus von TGs in anderen Lipoproteinen als HDL zu Glycerin durch LPL, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem aggregierenden Agens für andere Lipoproteine als HDL; und (ii) einem Tensid zum Hemmen des Abbaus von TGs in anderen Lipoproteinen als HDL zu Glycerin durch LPL, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyoxyethylenglycolalkylether, Polyoxyethylenglycol-Polyoxypropylenglycol-Kondensat, Polyoxy-ethylenglycolalkylethersulfat, Alkylbenzolsulfonat, einem Polyoxyethylenglycol-Derivat, das ein schwach schäumendes Benetzungseindringmittel ist, einem anionischen Tensid und einem Tensid vom Gallensäure-Typ; LPL, GK und GPO oder GO und einen Teil eines Kopplungstyp-Chromogens und POD umfasst; (b) HDL, wobei das Reaktionsgemisch ein Reagens zum Hemmen des Abbaus von TGs in anderen Lipoproteinen als HDL zu Glycerin durch LPL, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem aggregierenden Agens für andere Lipoproteine als HDL; und (ii) einem Tensid zum Hemmen des Abbaus von TGs in anderen Lipoproteinen als HDL zu Glycerin durch LPL, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyoxyethylenglycolalkylether, Polyoxyethylenglycol-Polyoxypropylenglycol-Kondensat, Polyoxy-ethylenglycolalkylethersulfat, Alkylbenzolsulfonat, einem Polyoxyethylenglycol-Derivat, das ein schwach schäumendes Benetzungseindringmittel ist, einem anionischen Tensid und einem Tensid vom Gallensäure-Typ; LPL, GK und GPO oder GO und Catalase umfasst; (c) LDL, wobei das Reaktionsgemisch ein Reagens, das den Abbau von TGs in anderem Lipoprotein als LDL erlaubt, das Polyoxyethylenglycolalkylphenylether mit einem HLB von 15 oder höher ist, ein Reagens, das den Abbau von TGs in LDL zu Glycerin durch LPL erlaubt, das ein nicht-ionisches Tensid, in dem LDL löslich ist, LPL, GK und GPO oder GO und einen Teil eines Kopplungstyp-Chromogens und POD umfasst; oder (d) LDL, wobei das Reaktionsgemisch ein Reagens, das den Abbau von TGs in anderen Lipoproteinen als LDL erlaubt, das Polyoxyethylenglycol-alkylphenylether mit einem HLB von 15 oder höher ist, ein Reagens, das den Abbau von TGs in LDL zu Glycerin durch LPL erlaubt, das ein nicht-ionisches Tensid, in dem LDL löslich ist, LPL, GK und GPO oder GO und Katalase umfasst.
Reaktionsgemisch gemäß Anspruch 11(a) oder (c), das ferner den anderen Teil des Kopplungstyp-Chromogens umfasst.
Reaktionsgemisch gemäß Anspruch 12, wobei der eine Teil eines Kopplungstyp-Chromogens Trinder-Reagens ist und der andere Teil eines Kopplungstyp-Chromogens 4-Aminoantipyrin ist.
Reaktionsgemisch gemäß Anspruch 11(b) oder 11(d), das ferner ein Chromogen und POD umfasst.