DE60034363T2

DE60034363T2 - Verfahren und kompositionen für opsonophagozyttests

Info

Publication number: DE60034363T2
Application number: DE60034363T
Authority: DE
Inventors: Joseph E. Stockbridge MARTINEZ; George M. Stone Mountain CARLONE; Michael H. Oakdale HICKEY; Sandra Atlanta Steiner
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Flow Applications Inc
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Flow Applications Inc
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 2000-06-09
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2020-06-10
Also published as: DE60034363D1; ATE359520T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den immunologischen Nachweis funktioneller Antikörper.
Hintergrund der Erfindung
Im Laufe des letzten Jahrzehnts führte das Auftreten multiresistenter Krankheitserreger zu einer häufigeren Anwendung von Impfstoffen als eine Methode zur Behandlung von Infektionen. Die Entwicklung von Impfstoffen und Immunisierungen rückte in den Vordergrund internationalen und staatlichen Interesses, wie auch die kürzliche Gründung von Organisationen z.B. des International Vaccine Institute (gegründet 1996) und der Vaccine and Immunization Division der Pan American Health Organization (gegründet 1999) zeigt. In den Vereinigten Staaten gibt es derzeit über zwanzig verschiedene staatliche Behörden, die eine Rolle bei der Entwicklung von Impfstoffen spielen.
Diese zunehmende Bedeutung führt zur schnellen Entwicklung von neuen Impfstoffen sowie von Assays zur Bestimmung der In-vivo-Wirkung derselben. Mehrere Assays wurden zur Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen durch den Nachweis impfstoffspezifischer, nach Verabreichung des Impfstoffes in vivo gebildeter Antikörper entwickelt. Zu diesen Assays gehören radioantigenbindende Assays und Enzyme-Linked Immunosorbant Assays (ELISAs) (Schiffmann et al., 1980; Nahm et al., 1996); Quataert et al., 1995). Ein beachtenswertes Problem dieser Assays liegt darin, dass sie die Gesamtmenge der Antikörper messen, die als Reaktion auf die Verabreichung des Impfstoffes gebildet werden, ohne dabei zu berücksichtigen, ob die Antikörper tatsächlich zu einer Schutzreaktion bei der immunisierten Person führen. Daher geben traditionelle Assays keine genaue Auskunft über die In-vivo-Wirkung eines Impfstoffes.
Ob ein Impfstoff Schutz und Immunität bietet oder nur eine Antikörperbildung hervorruft hängt von der Art der Infektion ab, die mit dem Impfstoff verhindert werden soll, und von der Art der Antikörper, die als Reaktion auf die Verabreichung des Impfstoffes gebildet werden. Zum Beispiel erfordert eine schützende Immunantwort auf Streptococcus pneumoniae und Neisseria meningitidis eine Opsonophagozytose der Erreger. Unter Opsonophagozytose versteht man die Bindung (Opsonisierung) von Antikörpern und Komplement oder Komplementkomponenten – an den Erreger und einen darauf folgenden Uptake des Erregers von Effektorzellen durch Bindung dieser Zellen an den Antikörper-Antigen-Komplex. Daher erfordert eine schützende Immunantwort mehr als die bloße Bildung von Antikörpern, die sich an Erreger binden. Eine schützende Immunantwort erfordert die Bildung „funktioneller" Antikörper, die an den Erreger gebunden werden, und bietet die Möglichkeit der Aufnahme und Beseitigung des Erregers durch Effektorzellen. Ein weiterer Aspekt der Funktionalität ist die Fähigkeit, in Komplementreaktionen einzugreifen, die u.U. auch für die Opsonophagozytose erforderlich sind.
Da funktionelle Antikörper eine wichtige Rolle bei der Entstehung eines Schutzes gegen eine durch bestimmte Erreger hervorgerufene Infektion spielen, müssen Impfstoffe die Bildung funktioneller Antikörper gegen diese Erreger induzieren, um einen Schutz gegen die Infektion zu bieten. Assays, die die Wirksamkeit von Impfstoffen dieser Art bestimmen, sollten auch die Produktion funktioneller Antikörper untersuchen. Es ist erwähnenswert, dass die Federal Drug Administration diese Meinung betreffend alle zukünftigen Pneumokokken-Impfstoffe vertritt und die Messung von Antikörperspiegeln mit funktionellen Assays fordert, die die biologische Funktion des Wirtes genauer bestimmen.
Ein solches funktionelles Assay, das zur Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen entwickelt wurde, ist das Opsonophagozytose-Assay. Diese Assays sind attraktiver als andere Methoden zur Bestimmung der schützenden In-vitro-Immunität, da sie Tiermodellen ähnlicher sind und anscheinend besser mit der Wirksamkeit von Impfstoffen mit spezifischen Serotypen korrelieren als andere Assays, die nach dem Stand der Technik bekannt sind wie beispielsweise ELISAs (Wenger et al., 1996). Opsonophagozytosen-Assays wurden mit peripheren Leukozyten als Effektorzellen durchgeführt, wobei verschiedene Methoden angewandt wurden, wie Radioisotopenmarkierung, Flusszytometrie, mikroskopische Beurteilung und Viabilitätsassays (Esposito et al., 1990; Guckian et al., 1980; Kaniuk et al., 1992; Lortan et al., 1993; Obaro et al., 1996; Sveum et al., 1986; Vioarsson et al., 1994; Winkelstein et al., 1975). Differenzierte HL-60-Zellen wurden als Alternative zu peripheren Leukozyten als Effektor-Zellen verwendet, wodurch der Bedarf nach Humanspendern eliminiert, und die Variabilität zwischen Assays, die bei den weißen Blutkörperchen von willkürlich gewählten Spendern auftritt, verringert wird (Romero-Steiner et al., 1997).
Obwohl Funktionsanalysen zur Messung der Wirksamkeit von Impfstoffen entwickelt wurden, erlaubt keine der Methoden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, den gleichzeitigen Nachweis funktioneller Antiköper, die durch mehrere Serotypen eines Erregers hervorgerufen sind. Der Nachweis funktioneller Antikörper gegen mehrere Serotypen ist entscheidend für die Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen, die Antigene mehrer Serotypen enthalten. Zum Beispiel gibt es mehrere Serotypen von Streptococcus pneumoniae. S. pneumoniae ist der wichtigste Erreger einer Meningitis, Septikämie, Pneumonie und akuten Otitis media bei Kleinkindern sowie eine wichtige Krankheits- und Todesursache bei älteren Personen und Personen mit bestimmten begünstigenden Krankheiten. Der Schutz des Wirtes gegen eine invasive Pneumokokken-Infektion wird vorwiegend durch antikapsuläre Antikörper und eine komplementvermittelte Phagozytose ermöglicht. Von Neisseria meningitidis gibt es ebenfalls mehrere Serotypen, und Schutz gegen eine durch Neisseria meningitidis der Serogruppe A oder C verursachte Erkrankung hängt entscheidend von Antikörpern gegen kapsuläre Polysaccharide ab. Immunisierung mit Meningokokken-Polysaccharid-Impfstoffen induziert komplementabhängige, bakterizide und opsonische Serumantikörper. Beide Mechanismen laufen gleichzeitig ab und beseitigen Meningokokken. Es gibt allerdings Personen, die unfähig sind, eine komplementabhängige bakterizide Reaktion im Serum zu produzieren. Für diese Personen sind opsonische Antikörper der einzige Schutz gegen eine Meningokokken-Infektion. Da die funktionelle opsonophagozytische Aktivität mit dem Schutz gegen die erwähnten Pneumokokken- und Meningokokken-Infektionen zu korrelieren scheint, bestimmen funktionelle Assays am besten die Wirksamkeit von Impfstoffen gegen diese Infektionen.
Die Bestimmung der Wirksamkeit eines Impfstoffes, der zum Schutz gegen eine Infektion mit verschiedenen Serotypen von S. pneumoniae und N. meningitidis entwickelt wurde, würde also die Bestimmung mehrerer funktioneller Antikörper gegen jeden der verschiedenen Serotypen erfordern. Die erwähnten funktionellen Assays können zwar für jeden Serotyp im Impfstoff separat durchgeführt werden, die Durchführung wäre jedoch beschwerlich und teuer. Auf diesem Gebiet wird daher ein schneller, automatischer funktioneller Assay benötigt, der gleichzeitig Antikörper gegen mehrere Serotypen von Erregern messen kann, insbesondere von S. pneumoniae und N. meningitidis.
Die vorliegende Erfindung sieht demnach eine Methode zum gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl verschiedener funktioneller Antikörper gegen mehrere bakterielle Serotypen vor, die Folgendes umfasst:

(a) Kombination einer Probe mit einer ersten Pluralität von verschiedenen Antigenen, Komplement- und Effektorzellen, wobei die Antigene unterschiedlich markiert sind.
(b) Inkubation der Probe, um die Internalisierung der Antigene durch Effektorzellen zu ermöglichen und
(c) Nachweis internalisierter Antigene, wobei ein Anstieg der nachweisbaren Markierung im Vergleich mit einer Kontrollprobe das Vorhandensein von internalisierten Antigenen und funktionellen Antikörpern gegen mehrere bakterielle Serotypen anzeigt.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Methoden und Zusammensetzungen für die Messung einer funktionellen Antikörperantwort. Diese Methoden und Zusammensetzungen richten sich an den anhaltenden Bedarf, den Schutz von Impfstoffen gegen Erreger zu bestimmen und dabei die Möglichkeit, mehrere Serotypen zu berücksichtigen.
Die vorliegende Erfindung umfasst Methoden und Zusammensetzungen für Opsonophagozytose-Assays, um das Vorhandensein funktioneller Antikörper zu bestimmen. Die Methoden der vorliegenden Erfindung umfassen die Zugabe einer biologischen Probe zu Zusammensetzungen, die mit Antigenen beschichtete fluoreszierende Beads enthalten. Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Methoden zur Bestimmung des Vorhandenseins funktioneller Antikörper, wobei eine biologische Probe Zusammensetzungen mit fluoreszenzmarkierten Bakterien zugesetzt wird. Die Zusammensetzungen aus Antikörpern der Probe und fluoreszierenden Beads oder markierten Bakterien werden dann phagozytierenden Zellen zur Opsonisierung beigefügt. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ferner die Zugabe von Komplement, um die Opsonisierung der Zusammensetzungen durch phagozytierende Zellen zu vervollständigen oder zu verbessern.
Demnach ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Methoden und Zusammensetzungen für die Bestimmung des Vorhandenseins von Antikörpern gegen Krankheitserreger zu erstellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Methoden und Zusammensetzungen zum Nachweis des Vorhandenseins von Antikörpern zu erstellen, die bei Mensch und Tier Schutz gegen Erreger, die die Antikörperbildung induzieren, bieten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Methoden und Zusammensetzungen zu erstellen, die zum Nachweis der Wirksamkeit eines Impfstoffs benutzt werden können.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Methoden und Zusammensetzungen für Opsonophagozytose-Assays zu erstellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Methoden und Zusammensetzungen für Opsonophagozytose-Assays zu erstellen, die auf leichte Art und Weise unter Anwendung von flusszytometrischen Methoden bestimmt werden können.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Methoden und Zusammensetzungen zur Bestimmung funktioneller Antikörper unter Verwendung verschieden markierter fluoreszierender, an Antigene angelagerter Beads zu erstellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Methoden und Zusammensetzungen zur Bestimmung von funktionellen Antikörpern unter Verwendung verschieden markierter Bakterien als Antigene zu erstellen.
Diese und andere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Überprüfung der folgenden detaillierten Beschreibung der bekannt gegebenen Ausführungsformen und der beigefügten Ansprüche offensichtlich.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 ist eine Tabelle, die die geometrischen Mittel der Titer (geometric mean titers, GMTs) gegen Neisseria meningitidis in Seren vor und nach der Impfung darstellt, gemessen anhand eines Assays zur Bestimmung der bakteriziden Wirkung im Serum (serum bactericidal assay, SBA) und des Opsonophagozytose-Assays.
2 ist eine Tabelle, die die kompetitive Hemmung der opsonophagozytischen Aktivität von Referenzseren nach Absorption von spezifischem Polysaccharid von Neisseria meningitidis der Serogruppe A und C zeigt.
3 ist eine Tabelle, die die Korrelation zwischen SBA, Opsonophagozytose-Assay und ELISA für Neisseria meningitidis der Serogruppe A und C zeigt.
4 ist eine Serie von Histogrammen, die die flusszytometrische Analyse von Serum mit funktionellen Antikörpern darstellen.
5 ist ein Diagramm, das eine Verdünnungskurve mit der jeweiligen funktionellen opsonophagozytischen Aktivität im Serum nach Impfung zeigt.
6 ist eine Tabelle, die die kompetitive Hemmung der opsonophagozytischen Aktivität mit typenspezifischem Polysaccharid zeigt.
7 ist eine Tabelle, die eine Korrelation zwischen einem flusszytometrischen und einem manuellen Viabilitäts-Opsonophagozytose-Assay zeigt.
8 ist eine Tabelle, die einen Vergleich zwischen kumulativen Prozentsätzen von Serumproben, die mit zwei Methoden analysiert wurden, zeigt.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung umfasst Methoden und Zusammensetzungen, die für die Messung von funktionellen Antikörpern nützlich sind. Die vorliegende Erfindung umfasst Methoden und Zusammensetzungen für Immunoassays, die sich zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer antigenspezifischer funktioneller Antikörper in biologischen Proben eignen, wobei ein jeder derselben spezifisch ist für ein verschiedenes Antigen in einer biologischen Probe. „Funktionelle Antikörper" werden als Antikörper definiert, die sich an spezifische Antigene binden und eine Wirkung auf Effektorzellen haben, wobei die Interaktion zwischen Antikörper und Effektorzelle zu einer Internalisierung bzw. Anlagerung des Antikörpers an die Effektorzelle führt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Immunoassay ein Opsonophagozytose-Assay, wobei der Assay Schritte zur Verbindung einer Probe mit einer Vielzahl verschiedener Antigene, Komplement und Effektorzellen, sowie die Inkubation der Probe mit den Antikörpern umfasst, um die Internalisierung der Antigene durch Effektorzellen und die Analyse der Probe zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe in einem Flusszytometer analysiert; es muss jedoch verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung ist nicht auf eine Analyse in einem Flusszytometer beschränkt ist und dass auch andere Nachweismethoden angewendet werden können. Mit einer bevorzugteren Methode werden markierte Bakterien verwendet, wobei die Bakterien vorzugsweise mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert werden. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Antigene markierte Bakterien, wobei vorzugsweise fluoreszierende Farbstoffe verwendet werden. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Antigene Peptide, Lipide, Polysaccharide, Nukleinsäuren oder deren Antigenfragmente, die an fluoreszierende Beads angelagert sind. An jedes der unterschiedlich markierten fluoreszierenden ist ein Antigen angelagert, so dass die Messung der verschiedenen fluoreszierenden Beads einer Messung der verschiedenen Antigene entspricht. Das Vorhandensein funktioneller Antikörper wird durch einen Anstieg der Fluoreszenz in der Effektorzelle im Vergleich mit der Kontrollprobe angezeigt. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird die Messung der Fluoreszenz mithilfe eines Flusszytometers durchgeführt. Ein überraschendes Ergebnis der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass eine Vielzahl fluoreszierender Markierungen gleichzeitig in einem Flusszytometer ohne wesentliche Interferenz zwischen den Markierungen verwendet werden kann.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Antigene Peptide, die von verschiedenen Serotypen oder Stämmen einer einzelnen Erregerspezies stammen. In einer anderen Ausführung umfassen die Antigene Peptide, die von mehrfachen Erregerspezies stammen. Bei der pathogenen Spezies kann es sich um Bakterien, Viren, Pilze oder Parasiten handeln; vorzugsweise sollte es sich jedoch um Bakterien handeln. Die pathogene Spezies kann, muss aber nicht wachstumsfähig sein. Es ist bemerkenswert, dass die vorliegende Erfindung im Gegensatz zu Assays nach dem früheren Stand der Technik, bei denen nur wachstumsfähige Bakterien verwendet wurden, die Verwendung nicht wachstumsfähiger Bakterien ermöglicht und damit das Risiko einer Infektion der das Assay en Assaydurchführenden Person reduziert wird. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsart stammen die bakteriellen Antigene von Streptococcus pneumoniae oder Neisseria meningitidis. Der Begriff „Antigen" bezieht sich auf eine Entität oder ein Fragment davon, die eine Immunantwort bei einem Säugetier induzieren kann. Der Begriff umfasst unter anderem Peptide, Lipide, Polysaccharide und Nukleinsäuren, die von Antikörpern oder Immunzellen erkannte Antigendeterminanten enthalten. Der Begriff „Antigen" umfasst auch Objekte wie Beads, die mit Antigenen beschichtet oder an diese angelagert sind.
Folgende andere wichtige Begriffe werden hier verwendet: Die Begriffe „ein"/"eine" und „der", „die", „das" wie hier verwendet bedeuten ein oder mehrere und schließen den Plural ein, außer wenn dies im Zusammenhang nicht möglich ist. Der hier verwendete Begriff „Antikörper" umfasst monoklonale, polyklonale, chimärische, einkettige, bispezifische, simianisierte und humanisierte Antikörper, einschließlich der Produkte von Immunoglobulin-Expressionsbibliotheken. Die Wendungen „bindet sich spezifisch an ein Peptid" oder „hybridisiert sich spezifisch mit" oder „spezifisch immunreaktiv mit" im Zusammenhang mit einem Antikörper beziehen sich auf eine Bindungsreaktion, die das Vorhandensein von Peptiden in Gegenwart einer heterogenen Proteinpopulation oder anderer biologischer Substanzen anzeigt. Somit binden sich spezifizierte Antikörper unter bestimmten Immunoassay-Bedingungen vorzugsweise an ein bestimmtes Peptid und nur geringfügig an andere Proteine in der Probe. Eine spezifische Bindung an ein Peptid unter derartigen Bedingungen erfordert einen Antikörper, der aufgrund seiner Spezifität für ein spezielles Protein gewählt wurde. Siehe Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, wo sich eine Beschreibung von Ausführungen und Bedingungen von Immunoassays findet, die zur Bestimmung einer spezifischen Immunreaktivität benutzt werden können.
Die Effektorzellen der vorliegenden Erfindung können sich an Antikörper-Antigen-Komplexe binden und die Komplexe internalisieren. Vorzugsweise exprimieren die Effektorzellen Fc-Rezeptoren wie FcRI, FcRII und FcIII, die sich an Antikörper-Antigen-Komplexe binden und eine Internalisierung ermöglichen. Beispiele für Fc-Rezeptoren exprimierende Effektorzellen sind Makrophagen, mononukleäre Phagozyten, natürliche Killerzellen und Granulozyten (neutrophile und eosinophile). Die Effektorzellen der vorliegenden Erfindung können vom Serum einer Person oder einer In-vitro-Kultur stammen. In einer bevorzugten Ausführungsart sind die Effektorzellen differenzierte humane Promyelozytenleukämie-Zellen (HL-60-Zellen).
In einer Ausführungsart der vorliegenden Erfindung bestehen die fluoreszenzmarkierten Antigene aus intakten Bakterien, die direkt an die fluoreszierenden Moleküle angelagert sind. Zu den fluoreszierenden Molekülen gehören unter anderem Fluorescein und seine Derivate wie z.B. 5,6,-Carboxyfluoreszein-Succinimidylester, Ethidiummonoazid (EMA), Phycoerythrin, Allophycocyanin, Phycocyanin, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Texasrot, EDANS- und BODIPY-Farbstoff, Cy3 und Cy5. Die vorliegende Erfindung bietet Methoden für einen Opsonophagozytose-Assay, bei dem ein oder mehrere fluoreszierende Moleküle für Markierungen und damit zur Unterscheidung zwischen Stereotypen einer pathogenen Spezies benutzt werden. Die Bindung funktioneller Antikörper in einer biologischen Probe an unterschiedlich markierte Antigene führt zu einer Anhaftung verschiedener Markierungen an die verschiedenen funktionellen, jeweils für ein Serotypenantigen spezifischen Antikörper. Die markierenden Substanzen können durch Unterschiede im Emissionsspektrum und/oder der Fluoreszenzintensität voneinander unterschieden werden. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsart der vorliegenden Erfindung funktionelle Antikörper, die für vier verschiedene Serotypen eines bestimmten Erregers spezifisch sind, gleichzeitig durch Markierung der an diese Antiköper gebundenen Antigene mit verschiedenen fluoreszierenden Farben nachgewiesen und voneinander unterschieden, vorzugsweise mit einem Flusszytometer. Alternativ werden die Antigene mit derselben fluoreszierenden Farbe markiert und durch eine unterschiedliche Fluoreszenzintensität voneinander unterschieden, vorzugsweise mit einem Flusszytometer. Als eine dritte alternative Ausführungsart werden die vier Antigene mit zwei fluoreszierenden Farben markiert, und die zwei Antigene, die mit derselben Farbe markiert werden, durch unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten voneinander unterschieden. Als vierte Alternative kann das berechnete Verhältnis der Emissionen von zwei oder mehr fluoreszierenden Farbstoffen zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Bakterien oder Bead-Populationen verwendet werden.
Nach erfolgter Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes in Gegenwart von Komplement und Effektorzellen werden die fluoreszierenden Komplexe von den Effektorzellen internalisiert. Komplement kann durch direkten Zusatz der Komplementkomponente C3 oder anderer Komponenten der Komplementkaskade, aus denen C3 produziert wird, zur Verfügung gestellt werden. Ein Beispiel für ein geeignetes Komplement wird in Beispiel 9 beschrieben. Nach Internalisierung des Antigen-Antikörper-Komplexes werden die Effektorzellen analysiert, vorzugsweise in einem Flusszytometer, wobei eine Zunahme der Fluoreszenz die Gegenwart funktioneller Antikörper anzeigt. Die Titer funktioneller Antikörper werden als die reziproken Werte der höchsten Serumverdünnung, die > 50% der maximalen Phagozytose ergibt, angegeben; Proben mit einer maximalen Phagozytose unter 20% werden als negativ angesehen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Bestimmung des Vorhandenseins von Antikörpern mit anderen Markierungen, die die Funktion der hier beschriebenen fluoreszierenden Markierungen und fluoreszierenden Beads ausüben. Personen mit entsprechendem Wissen, die mit dem Stand der Technik vertraut sind, können zum Nachweis funktioneller Antikörper mit den Methoden und Zusammensetzungen dieser Erfindung auch alternative Markierungen verwenden und zwar fluoreszierende, radioaktive, biolumineszente, chemilumineszierende, chemische, enzymatische bzw. andere Markierungen. Alternative Markierungen erfordern u.U. ein spezielles Nachweisgerät. Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem den Nachweis der Markierung mit Methoden, mit denen in dieser Technik erfahrene Personen vertraut sind; die bevorzugten Nachweismethoden umfassen allerdings die Anwendung eines Flusszytometers. Die vorliegende Erfindung umfasst zum Beispiel, wie in Beispiel 7 genauer beschrieben, den Nachweis einer fluoreszierenden Markierung mit einem Immunofluoreszenz-Analysiergerät für Partikelkonzentrationen wie z.B. die kommerziell erhältliche IDEXX Screen Machine 2000 (Idexx Laboratories, Inc. Westbrook, Maine, USA). Einige der Vorteile der Immunofluoreszenz-Analysiergerät-Plattform für Partikelkonzentrationen bestehen darin, dass diese gewöhnlich einfacher zu handhaben und billiger als eine konventionelle Flusszytometrie sind. Überdies können mit dieser Plattform mehr Serotypen pro Testlauf untersucht werden als mit der konventionellen Flusszytometrie. Zusätzlich umfasst die vorliegende Erfindung den Nachweis einer fluoreszierenden Markierung mit Standard-Hämatologieeinheiten wie z.B. das Beckman-Coulter-Hämatologie-Analysiergerät, das in Beispiel 10 beschrieben wird.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die fluoreszenzmarkierten Antigene fluoreszierende Beads, die an Polysaccharidantigene angelagert oder mit diesen beschichtet sind. Die fluoreszierenden Beads können u.a. Fluorescein oder seine Derivate wie 5,6,-Carboxyfluorescein, Ethidiummonoazid (EMA), Phycoerythrin, Allophycocyanin, Phycocyanin, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Texasrot, EDANS- und BODIPY-Farbstoffe, Cy3 oder Cy5 enthalten In einer bevorzugten Ausführungsform sind die fluoreszierenden. Beads mit Antigenen beschichtet, was durch Modifizierung der Polysaccharidantigene durch Beifügen einer Aldehydgruppe und Modifizierung der Beads durch Beifügen von Carboxy-Oberflächengruppen erreicht wird, wie weiter unten genauer beschrieben wird. Zu betonen ist, dass die vorliegende Erfindung nicht auf eine Art von Beads beschränkt ist, da Beads, die sich zur Anlagerung von Antigenen eignen, Personen mit Erfahrung in dieser Technik bekannt sind; jede Struktur, die Antikörper binden kann und sich wie die beschriebenen Beads verhält, ist in der vorliegenden Erfindung einbegriffen. Als fluoreszierende Beads können unter anderem Latexbeads, Polystyrolbeads oder magnetische Beads verwendet werden, wobei Polystyrolbeads bevorzugt sind. Ein Beispiel für Beads, die sich für die vorliegende Erfindung eignen, ist in Beispiel 8 beschrieben, obwohl sich die Erfindung nicht darauf beschränkt.
Die am meisten bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Messung funktioneller Antikörper gegen Antigene von S. pneumoniae nach Impfung einer Person mit einem bestimmten Serotyp oder mehreren Serotypen von S. pneumoniae. Mithilfe der vorliegenden Erfindung kann bestimmt werden, ob der Impfstoff Schutz bietet. Die Antigenzusammensetzung von S. pneumoniae besteht entweder aus abgetöteten Bakterien oder Antigenen, die an markierte Beads angelagert sind. Eine Probe der Person wird mit der Antigenzusammensetzung gemischt, Komplement wird beigefügt, und diese Mischung wird phagozytierenden Zellen beigefügt. Der Uptake der Markierung durch die phagozytierenden Zellen wird gemessen. Ausschließlich das Vorhandensein funktioneller Antikörper, die sich an spezifische Antigene binden können und mit den phagozytierenden Zellen und dem Komplement reagieren, führt zu einem Uptake der Markierung durch phagozytierende Zellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung zur Bestimmung des Vorhandenseins funktioneller Antikörper gegen bestimmte Serotypen von Neisserie meningitidis nach Infektion oder Impfung benutzt. Die Methoden sind ähnlich wie die oben beschriebenen, und die Antigenzusammensetzung besteht aus N.-meningitidis-Antigenen. Auch hier wird der Uptake der Markierung durch phagozytierende Zellen zur Bestimmung des Vorhandenseins funktioneller Antikörper benutzt.
Die vorliegende Erfindung beschränkt sich nicht auf die hier beschriebenen, spezifischen pathogenen Erreger. Die vorliegende Erfindung schließt die Bestimmung funktioneller Antikörper gegen alle Antigene ein, die mit den Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können. Alle Antigene, die sich wie die hier beschriebenen Antigene verhalten, also durch Markierung des gesamten Organismus oder durch Anlagerung an spezifische Antigendeterminanten an Beads zur Opsonisierung durch Effektorzellen, nachgewiesen werden können, sind in der vorliegende Erfindung einbegriffen.
Die vorliegende Erfindung eignet sich zum Nachweis von funktionellen Antikörpern in biologischen Proben und zwar biologischen Flüssigkeiten oder Geweben. Zu dem Begriff „biologische Flüssigkeit" gehören u.a. Speichel, Zahnfleischsekrete, Liquor, gastrointestinale Flüssigkeit, Schleim, Sekrete des Urogenitaltrakts, Synovialflüssigkeit, Blut, Serum, Plasma, Urin, Zystenflüssigkeit, Lymphe, Aszitesflüssigkeit, Pleuraerguss, intestinale Flüssigkeit, intrazelluläre Flüssigkeit, okuläre Flüssigkeiten, Samenflüssigkeit, Brustdrüsensekrete, Glaskörperflüssigkeit und Nasensekrete. Die Probe kann vor dem Immunoassay verdünnt, gereinigt, konzentriert, filtriert, aufgelöst, suspendiert oder andersartig manipuliert werden, um die Ergebnisse des Assays zu optimieren.
Die vorliegende Erfindung eignet sich zur Analyse der Wirksamkeit von Impfstoffen und der Untersuchung der Immunantwort. Die Wirksamkeit eines Impfstoffes kann mithilfe der vorliegenden Erfindung nach Verabreichung des Impfstoffes an ein Individuum bestimmt werden. Nach Verabreichung des Impfstoffes an das Individuum und nach erfolgter Immunantwort kann eine von der geimpften Person entnommene Probe, in der funktionelle Antikörper vermutet werden, mit den Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung analysiert werden. Die nachgewiesene Anzahl funktioneller Antikörper kann dann mit der normalen Anzahl funktioneller Antikörper verglichen, und die Wirksamkeit des Impfstoffes anhand des nachgewiesenen Anstieges der Anzahl funktioneller Antikörper nach erfolgter Immunisierung bestimmt werden. Die vorliegende Erfindung kann auch zum Nachweis einer Immunantwort und zur Bestimmung, ob funktionelle Antikörper als Reaktion auf eine Infektion mit spezifischen Erregern gebildet werden, benutzt werden. Zum Beispiel kann die vorliegende Erfindung zur Bestimmung des Vorhandenseins von funktionellen Antikörpern benutzt werden, um Informationen über eine Immunantwort der betreffenden Person zu erhalten. Wenn es zum Beispiel bei einer Person aufgrund einer fehlenden oder reduzierten Immunfunktion nicht zu einer spezifischen Immunantwort kommt, kann das Vorhandensein funktioneller Antikörper einen Immunschutz bieten. Die vorliegende Erfindung bietet ein schnelles und ökonomisches Mittel zum Nachweis funktioneller Antikörper und damit zur Bestimmung der Immunfunktion.
Beispiel 1
Vorbereitung von HL-60-Zellen
Die HL-60-Zellen (humane Promyelozytenleukämie-Zellen), die als Effektorzellen in Opsonophagozytose-Assays verwendet werden, wurden wie folgt vorbereitet. Gefrorene Stamm-HL-60-Zellen wurden schnell aufgetaut und zweimal mit RPMI bei Raumtemperatur gewaschen, um rückständiges DMSO zu beseitigen. Die gewaschenen Zellen wurden dann in ein Gewebekultur-Fläschchen (75 cm²) übertragen, und 20 ml RPMI + 20% FBS und 5 ml 100 × Penstrep wurden beigefügt. Die Zellen wurden dann bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Nach 3 Tagen wurde die Kultur auf Wachstum und Viabilität untersucht, und 20 ml frisches RPMI mit 20% fetalem Kälberserum und Antibiotika wurden beigefügt. Undifferenzierte Zellen wurden bis zu einer Dichte von 4–7 × 10⁵ Zellen/ml bei einer Viabilität von über 90% gezüchtet. Die Zelldichte wurde unter 1 × 10⁶ Zellen/ml aufrecht gehalten. Die hohe Viabilität wurde durch meist tägliche Zugaben von Nährstoffen oder Teilung der Zellen erreicht.
Danach wurde eine Differenzierung der HL-60-Zellen in Monozyten vorgenommen. Die HL-60-Zellen wurden durch vorsichtiges Schütteln des Gewebekulturfläschchens im Kulturmedium resuspendiert. Die prozentuale Zellviabilität wurde dann mit Trypanblau wie folgt bestimmt. 10 μl der Suspension wurden zu 10 μl von 0,4% Trypanblau und 10 μl Opsonopuffer in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen hinzugefügt und vorsichtig gemischt. In jede der Kammern des Hämazytometers wurden jeweils 10 μl der Mischung übertragen, und die Zählung der Zellen erfolgte in vier äußeren Quadraten. Die Zellzahl pro Milliliter wurde wie folgt berechnet:

a) (N × D) × 10³/S × 0,1, wobei N die Anzahl Zellen in 4 großen äußeren Quadraten, D der Verdünnungsfaktor und S die Zellzahl in den äußeren Quadraten ist.
b) Bestimmung der % Zellviabilität wie folgt: N/Gesamtzahl der gezählten Zellen × 100, wobei N = Gesamtzahl der mit Trypanblau gefärbten Zellen ist.

Danach wurde das Volumen der nichtinduzierten Zellen (V), das zur Induzierung von 200 ml Zellen bei 2 × 10⁵ Zellen/ml benötigt wird, wie folgt berechnet: 2 × 105/N × 200 = V,wobei N die in Schritt (a) berechnete Zellzahl ist.
Eine Menge an Medium, die 200 – V Millimeter entspricht, wurde in das Gewebskulturfläschchen übertragen, und 1 ml des Natriumsalzes der N-Buttersäure (endgültige Konzentration 100 mM) wurde dem Fläschchen mit dem Medium beigefügt. Die Lösung wurde durch vorsichtiges Schütteln gemischt. Ein Volumen der Zellsuspension, das V entsprach, wurde beigefügt, die Zellsuspension wurde nochmals durch Schütteln gemischt und dann 4 Tage bei 37°C in 5% CO₂ in schräger Position (5–10°) inkubiert, um den Zellen eine größere Oberfläche zur Differenzierung zu geben. 90–95% der HL-60-Zellen waren am 4. Tag zu Monozyten differenziert und konnten als Phagozyten verwendet werden. Differenzierte Zellen wurden in einem Verhältnis von 1:1 (Ziel-/Effektorzellen-Verhältnis) im Opsonophagozytose-Assay mit dem Flusszytometer verwendet.
Beispiel 2
Opsonophagozytose-Assay
Humanserum von immunisierten Personen wurde in entsprechend beschriftete Fläschchen mit Schraubverschluss übertragen. Die Serumproben wurden bei 56°C 30 Minuten lang hitzeinaktiviert. Jeweils 10 μl Opsonopuffer wurden in die Kavitäten einer Platte mit 96 Kavitäten (mit Ausnahme der Kavitäten in Reihe A) gefüllt. 10 μl Opsonopuffer wurden außerdem in die Komplementkontrollen-Kavitäten und 20 μl Puffer in die Zellkontrollen-Kavitäten gefüllt. In die Kavitäten der Reihe A wurde verdünntes oder unverdünntes Testserum (20 μl) gefüllt. Testserum (Reihe B–H) wurde serienmäßig verdünnt (zweifach), was zweifache Verdünnungen von 1:8 (Reihe A) bis 1:1024 (Reihe H) ergab. Die Reihen A9 bis A12 wurden für Kontrollen benutzt.
Folgende Kontrollen wurden verwendet:

(1) Positivkontrolle (Qualitätskontrollserum, Beads, Komplement und HL-60-Zellen) – in jeder Platte
(2) Komplementkontrollen (Komplement, HL-60-Zellen und Beads ohne Testserum) – in jeder Reihe
(3) HL-60-Zellkontrollen (ausschließlich HL-60-Zellen und Beads) – in jeder Reihe.

Die Komplementkontrolle (C') wurde wie folgt zubereitet: Drei Kavitäten (A12–C12) in jeder der Mikrotiterplatten wurden für diese Kontrolle benutzt. Der Beadsuspension (20 μl) wurden 10 μl Opsonopuffer (Ersatz für das Testserum) beigefügt. 10 μl Komplement und HL-60-Monozyten (40 μl) wurden ebenfalls beigefügt. Der durchschnittliche Fluoreszenz-Uptake dieser drei C'-Kavitäten wurde gemessen. Akzeptable Ergebnisse befanden sich im Bereich von 1–10%. Diese Kontrolle wurde in der Platte zubereitet und gleichzeitig mit den Proben analysiert. Bei Verwendung mehrerer Platten für diesen Assay wurde die C'-Kontrolle mit der durchschnittlichen Fluoreszenz in allen Platten benutzt. Diese Kontrolle wurde mit allen Serotypen analysiert. Zusätzlich wurden Qualitätskontrollsera mit bekannten Titern verwendet. Qualitätskontrollsera mit bekannten niedrigen, mittleren und hohen Titern (analysiert, um das Ausmaß der Phagozytose sowie gruppierte Beads innerhalb der eingeschlossenen Zellpopulation unabhängig vom Komplement für ein bestimmtes Polysaccharid zu ermitteln. 20 μl der Kavitäten A10 bis A11) wurden mit jedem Assay mitgeführt. Die HL-60-Zellkontrolle wurde Beadsuspension wurden 20 μl Opsonopuffer (Ersatz für Probe und Komplement) beigefügt; danach wurden HL-60-Monozyten (40 μl) beigefügt, und die Suspension wurde 15 Minuten lang bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Das Ausmaß der Phagozytose wurde dann mit dem Flusszytometer bestimmt und betrug meist weniger als 5%.
Nach Zugabe der Serumproben und Kontrollen in die Kavitäten wurden jeder Kavität 20 μl polysaccharidmarkierte fluoreszierende Beadsuspension beigefügt. Die Beadsuspension bestand aus einer Stammsuspension (in Opsonopuffer), verdünnt mit Opsonopuffer (1,0 × 10⁵ Beads in 20 μl). Diese Beadsuspension wurde in einem dunklen Raum bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Bead- und Serumproben wurden 90 Minuten lang bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Komplement (10 μl) wurde allen Kavitäten, die eine verdünnte Probe enthielten, und den Komplementkontrollen-Kavitäten (alle Kavitäten mit Ausnahme der Zellkontrollen-Kavitäten) beigefügt. Komplement stammte aus Serum von neugeborenen Kaninchen (Pel-Freez, Brown Deer, Wisconsin, USA) und wurde gefroren bei 70°C in aliquoten Teilen von je 1 ml bis zum Gebrauch aufbewahrt. Nach Zugabe von Komplement wurden die Proben 15 Minuten lang bei 37°C unter Schütteln inkubiert.
HL-60-Zellen wurden zweimal in Opsonowaschpuffer (HBSS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, mit 0,2% Rinderserumalbumin) vorgewaschen und in Opsonopuffer (HBSS mit Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ und 0,2% Rinderserumalbumin) resuspendiert. Beim 2. Waschschritt blieben die HL-60-Zellen mindestens 20 Minuten im Opsonowaschpuffer. Die Zellen wurden dann 10 Minuten bei 1000 UPM zentrifugiert, der Überstand wurde vorsichtig entfernt, und die Zellen wurden in bis zu 4 ml Opsonopuffer resuspendiert (das Gesamtvolumen hängt von der Konzentration und der Anzahl der für die Analysen des Tages benötigten Zellen ab). Die Gesamtzellzahl und Viabilität wurden bestimmt, und die Zellsuspension wurde auf eine Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/40 μl verdünnt. Differenzierte HL-60-Zellen (40 μl) wurden dann jeder Kavität beigefügt (1 × 10⁵ Zellen/Kavität) und 30 Minuten lang bei 37°C unter horizontalem Schütteln (200 UPM) inkubiert.
Nach dem Schütteln wurden jeder Kavität 80 μl Mantelflüssigkeit beigefügt. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde 0,5% Paraformaldehyd beigefügt, um die Zellen vor Zugabe der Mantelflüssigkeit zu fixieren. Die Proben wurden vorsichtig mit einer 200-μl-Pipette gemischt und auf entsprechend beschriftete Titerspitzen transferiert. Die Titerspitzen wurden dann in entsprechend beschriftete Plastikproberöhrchen (12 × 75) transferiert und die Proben in einem dunklen Raum bis zum Assay mit dem Flusszytometer aufbewahrt.
Beispiel 3
Flusszytometrischer Assay
HL-60-Zellen konnten unter Verwendung der CELLQuest-Software (Becton Dickinson, Version 1,2 für Apple-System 7,1) auf einem FACSCalibur-Flusszytometer (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien, USA) im Vorwärtsstreulicht (forward angle light scatter, FALS) oder Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC)-Punktgraph (dot plot) betrachtet werden. Folgende Instrumenteneinstellungen wurden benutzt:

(a) FALS = Spannung E-1, Verstärkung 7,50, Linearmodus
(b) SSC = Spannung 300, Verstärkung 3,00, Linearmodus
(c) FLI = 530 nm, Spannung 600, logarithmischer Modus

Die analysierten Regionen wurden so eingestellt, dass nur die lebensfähige HL-60-Zellpopulation benutzt wurde. Nicht lebensfähige HL-60-Granulozyten erschienen als eine Population mit intermediärem FALS und niedrigem bis mäßigem FALS.
Der prozentuale Uptake der Beads wurde durch Berechnung der positiven und Spitzen-Kanalfluoreszenz für jede Probe bestimmt. Die obere Grenze der negativen Population (kein Bead-Uptake) wurde so eingestellt, dass weniger als 2% der Kontrollzellen eine Fluoreszenz über dem oberen Markerkanal zeigten. Der mittlere Spitzenkanal der negativen Zellpopulation (ohne Phagozytose) war von der FL1-Detektorspannung (grüne Fluoreszenz) abhängig. Die Spannungseinstellung wurde empirisch gewählt. Die Spannung für FL1 wurde so eingestellt, dass sich die negative Population in der ersten logarithmischen Dekade befand, mit der oberen Grenze der negativen Population nahe dem Übergang zur zweiten logarithmischen Dekade. Die Spannungseinstellung blieb über mehrere Monate gleich und wurde mit standardisierten fluoreszierenden FITC-Beads (Becton-Dickinson) kontrolliert, um Abweichungen aufgrund von Instrumentenänderungen zu erfassen.
Die Ergebnisse wurden als prozentuale Anteile der Zellen mit einer Fluoreszenz über dem Schwellenwert in Tabellen zusammengestellt, wobei der Schwellenwert wie oben erwähnt eingestellt wurde. Die Ergebnisse zeigten den prozentualen Anteil der HL-60-Zellen mit Bead-Uptake. Die Ergebnisse wurden in Diagrammen dargestellt und als reziproker Titer angegeben; sie zeigten einen Uptake von mindestens 50% des maximalen Uptake in jeder Serumprobe. Der Phagozytosetiter wurde also als eine 50% Abnahme der Fluoreszenz im Vergleich mit dem höchsten Prozentanteil an Zellen mit Fluoreszenz der entsprechenden Kontrollenprobe ermittelt. Serumproben mit Phagozytosetitern unter 8 wurden zum Zweck der Datenanalyse als Titer von 4 angegeben.
Beispiel 4
Flusszytometrisch bestimmte Opsonophagozytose von Latexbeads gekoppelt an Polysaccharid von Neisseria meningitidis der Serogruppe A oder C korreliert mit bakterizider Aktivität im Serum
Für die Zubereitung von Beads, beschichtet mit Polysaccharid von Neisseria meningitidis, wurde Natriumperiodat (Molekulargewicht 213,91) zuerst in Typ-I-Wasser aufgelöst (Konzentration: 10 mg/ml [0,046 M]) und in Folie eingepackt, um die Lösung vor Licht zu schützen. Danach wurden 218 μl der Stamm-Periodatlösung jedem Milliliter der Polysaccharidlösung beigefügt (1 mg/ml) (zubereitet nach Methoden, die dem Stand der Technik entsprechen). Die Reaktion vollzog sich 30 Minuten lang in einem dunklen Raum bei einem pH von 7,0, unter Rotation, entweder bei Raumtemperatur oder 4°C. Nachdem die Beads mit Gruppe-A-Neisseria-meningitidis-Polysaccharid beschichtet waren, fand die Reaktion bei Raumtemperatur statt; nachdem die Beads wenn die Beads mit Gruppe-C-Neisseria-meningitidis-Polysaccharid beschichtet waren, fand die Reaktion bei 4°C statt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,1 ml Glycerol pro Milliliter Reaktionslösung gestoppt. Die Polysaccharidlösung wurde dann über Nacht gegen 0,1 M Natriumbikarbonatpuffer (pH 8,0) dialysiert (MWCO 3500).
Mit der oben beschriebenen Methode wurde ein modifiziertes Polysaccharid mit einer Aldehydgruppe erhalten. Die Aldehydgruppe war nötig, um die Bindung des Polysaccharides an die Beads zu ermöglichen; eine Modifizierung der Beads war ebenfalls nötig. Die Modifizierung der Beads durch Hinzufügen von Carboxy-Oberflächengruppen, um eine reaktive terminale Hydrazingruppe zu erhalten, wurde wie folgt durchgeführt. 100 μl der Bead-Stammlösung (FluoSphere-Beads) wurden zweimal in 0,1 M Natriumphosphat und 0,15 M Natriumchloridpuffer 15 Minuten lang bei 3000 UPM gewaschen. Der Überstand wurde beseitigt und verworfen. Adipinsäure-Dihydrazid (32 mg/ml) wurde in Natriumphosphat und Natriumchloridpuffer aufgelöst, und jeweils 1 ml Adipinsäurepuffers wurde pro 100 μl Beadlösung beigefügt. Danach wurde wasserlösliches Carboiimid EDC (16 mg) beigefügt, und die Reaktion vollzog sich 4 Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach dieser Reaktion wurden die Beads dreimal gewaschen und in 0,1 M Bikarbonatpuffer (pH 8,0) resuspendiert.
Die Polysaccharide wurden dann kovalent an die aktivierten Beads wie folgt gebunden: Die Beads wurden zentrifugiert, und der Überstand verworfen. 1 ml der durch Periodat oxidierten Polysaccharidlösung wurde den Beads beigefügt, die dann über Nacht in einem dunklen Raum bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert wurden. Danach wurden 10 μl einer 5 M Natrium-Cyanoborohydrid-Lösung in 1 n NaOH beigefügt, wonach die Reaktion 2 Stunden lang bei Raumtemperatur ablief. Die Beads wurden dann 4 Mal mit HBSS⁺ gewaschen und schließlich in 1 ml HBSS⁺ mit 0,2% BSA und Antibiotika resuspendiert. Die Beads wurden in einem dunklen Raum bei 4°C aufbewahrt.
35 gepaarte Seren wurden mit dem flusszytometrischen Opsonophagozytose-Assay unter Verwendung von Beads, die mit Polysacchariden der Serogruppe A oder C beschichtet waren, wie oben beschrieben, sowie mit standardisierten Assays zur Bestimmung der Bakterizidität im Serum (SBAs) untersucht. Wie in 1 zu sehen ist, ergaben die zwei funktionellen Assays ähnliche geometrische Mittelwerte der Titer (GMTs) der funktionellen Antikörper. Der geometrische Mittelwert der Titer mit SBA betrug jeweils 612 vor der Impfung und 10.023 nach der Impfung für Serogruppe A; diese Werte waren 46 und 2.649 für Serogruppe C. Die GMTs mit dem flusszytometrischen Opsonophagozytose-Assay betrugen vor bzw. nach der Impfung 412 und 16.712 für Serogruppe A und 86 bzw. 4.993 für Serogruppe C.
Die Spezifität des Opsonophagozytose-Assays wurde durch kompetitive Hemmung der opsonophagozytischen Aktivität von Referenzseren mit Polysacchariden von Neisseria meningitidis der Serogruppe A und C (200 μg/ml) bestimmt. Die Absorption dieser Seren durch serogruppenspezifische Polysaccharide führte zu einer Abnahme des Titers um durchschnittlich 99,2% (Serogruppe A) bzw. durchschnittlich 98,4% (Serogruppe C). Diese Daten werden in 2 zusammengefasst.
Korrelationen zwischen dem SBA, dem flusszytometrischen Opsonophagozytose-Assay und einem standardisierten ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay) wurden ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Alle drei Assays korrelierten signifikant miteinander. Obwohl es sich bei dem SBA und dem Opsonophagozytose-Assay um verschiedene funktionelle Assays handelt, unterschieden sich die berechneten Titer im gepaarten t-Test für Serogruppe A (P = 0,44) und Serogruppe C (P = 0,19) nicht signifikant. Der Opsonophagozytose-Assay zeigte auch eine gute Präzision der Titer (96% für Serogruppe A und 83% für Serogruppe B) bei drei Verdünnungen des medianen SBA-Titers.
Beispiel 6
Korrelation zwischen dem flusszytometrischen Mehrfarben-Opsonophagozytose-Assay und dem manuellen Assay zur Bestimmung der Viabilität von Bakterien
Alle Serumproben (28 Proben vor der Impfung und 36 Proben nach der Impfung) stammten von gesunden, erwachsenen, freiwilligen Probanden nach Erhalt einer Einverständniserklärung. 16 Serumproben wurden von Emory University Donor Services (Atlanta, Georgia, USA) abgenommen, und 234 gepaarte Serumproben, die zuvor in einer Multilabor-ELISA-Studie (18) verwendet wurden, wurden vom National Blood Service (Oxford Centre, Oxford, England) abgenommen. Die Proben zur Beurteilung nach der Impfung wurden 4–6 Wochen nach der Impfung mit 23-valentem Pneumokokken-Polysaccharid-Impfstoff (Lederle Laboratories, Praxis-American Cyanamid Co., J. Pearl River, New York USA) abgenommen. Alle Proben wurden bei –70°C aufbewahrt und 30 Minuten lang unmittelbar vor der Untersuchung auf 56°C aufgewärmt, um die endogene Komplementaktivität zu inaktivieren.
Bei allen S.-pneumoniae-Stämmen, handelte es sich um frische klinische Isolate, die im standardisierten Opsonophagozytose-Assay benutzt wurden; sie wurden bei –76°C aufbewahrt. Kurz zusammengefasst wurden die Bakterien über Nacht auf Blutagar-Platten (Life Technologies, Grand Island, New York, USA) bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Danach wurde Todd-Hewitt-Bouillon mit 0,5% Hefeextrakt mit den isolierten Kolonien beimpft und 3 bis 4 Stunden lang bei 37°C in 5% CO₂ ohne Schütteln inkubiert. Bakterien wurden durch Zentrifugieren (800 × g, 10 Minuten bei Raumtemperatur) geerntet und in 5 ml Bikarbonatpuffer (0,1 M NaHCO₃, pH 8,0) suspendiert. 50 μl 5,6-Carboxyfluorescein-Succinimidylester (FAM-SE) (Molecular Probes, Eugene Oregon, USA) als Lösung (10 mg/l in Dimethylsulfoxid) (Fisher Scientific Co Fair Lawn, New Jersey, USA) wurden beigefügt und die Mischung 1 Stunde ohne Schütteln bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Schließlich wurde 1 ml 2% Paraformaldehyd (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) beigefügt, und die Fixierung vollzog sich über Nacht bei 37°C ohne Schütteln. Um zu bestätigen, dass die markierten Bakterien nicht lebensfähig waren, wurden 0,1 ml der Bakteriensuspension auf einer Blutagarplatte kultiviert, und die Platte wurde über Nacht wie oben erwähnt inkubiert. Die markierten Bakterien wurden durch 6-maliges Zentrifugieren in 20 ml Opsonophagozytose-Puffer (Hanks balanzierte Salzlösung mit Ca² und Mg² [Life Technologies], 0,2% Rinderserumalbumin [Sigma] und 1 × Penicillin-Streptomycin [Life Technologies]) gewaschen, bis kein freier Farbstoff im Überstand zu sehen war. Mit FAM-SE markierte Bakterien wurden mit dem BacCount-Kit (Molecular Probes) gezählt. Die mit FAM-SE markierten Bakterien wurden bei 4°C lichtgeschützt aufbewahrt und waren mindestens 3 Monate stabil. Vor Gebrauch wurde die Bakterienkonzentration auf eine Konzentration von 4 × 10⁵ Bakterien in 40 μl angeglichen. Das Vorhandensein einer Kapsel wurde durch die Quellungsreaktion vor und nach FAM-SE-Markierung bestätigt, wobei keine signifikanten Unterschiede gefunden wurden.
HL-60-Zellen (humane Promyelozytenleukämie-Zellen: CCL240, American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden bis zu einer Dichte von 4 × 10⁵ bis 6 × 10⁵ Zellen/ml gezüchtet. Als Nährmedium wurde 80% RPMI 1640 verwendet, das 1% 1-Glutamin (Life Technologies) jedoch kein Phenolrot enthielt und mit 20% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (HyClone Laboratories, Logan, Utah, USA) und 1 × Penicillin-Streptomycin angereichert war. Diese Zellen wurden durch eine 5 Tage lange Inkubation im selben Medium, das mit 100 mM N,N Dimethylformamid (99,8% rein; Fischer Scientific) angereichert war, zu Granulozyten differenziert. Das flusszytometrische Opsonophagozytose-Assay erforderte differenzierte H-60-Granulozyten mit einem hohen Grad an Viabilität (≥ 90%, wie mittels 0,4% Trypanblau-Ausschlussfärbung beurteilt). Ein derartig hohes Grad an Zellviabilität wurde durch tägliche Zugaben von Nährstoffen oder Teilung der undifferenzierten Zellen der HL-60-Stammzelllinie erreicht. In den differenzierten HL-60-Zellen wurde eine ausreichende Phagozytose in mindestes 230 Passagen beobachtet.
Differenzierte HL-60-Zellen wurden durch Zentrifugieren (160 × g, 10 Minuten) geerntet und zweimal mit 15 ml Waschpuffer, der Hanks balanzierte Salzlösung ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, 0,2% Rinderserumalbumin und 1 × Penicillin-Streptomycin enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden dann in Opsonophagozytose-Puffer gewaschen, in 4 ml Opsonophagozytose-Puffer resuspendiert und in einem Hämazytometer gezählt. Die Zellkonzentration wurde auf 1 × 10⁵ Zellen pro 80 μl Volumen gebracht, woraus sich ein Effektorzelle-Zielzelle-Verhältnis von 1:4 ergab.
Aus 20 μl Testserum wurden 8 zweifache Serumverdünnungen mit Opsonophagozytose-Puffer hergestellt. Ein aliquoter Teil von 40 μl der Bakteriensuspension, die 4 × 10⁵ Bakterien enthielt, wurde in jede Kavität gefüllt, und die Platte wurde 30 Minuten lang bei 37°C in Raumluft unter horizontalem Schütteln (200 UPM) inkubiert. Danach wurden jeder Kavität (mit Ausnahme der HL-60-Zellkontrollen) 20 μl steriles Serum von 3–4 Wochen alten Kaninchen (Pel-Frez Brown Deer, Wisconsin, USA) beigefügt; in die HL-60-Zellkontrollkavitäten wurden jeweils 20 μl Opsonophagozytose-Puffer gefüllt. Nach 15 Minuten langer Inkubation bei 37°C in Raumluft unter Schütteln, wurden jeder Kavität 80 μl gewaschene differenzierte HL-60-Zellen (1 × 10⁵ Zellen) zugefügt, und die Platten wurden 15 Minuten lang unter Schütteln bei 37°C in Raumluft inkubiert. Das endgültige Volumen betrug 160 μl. Zusätzlich wurden jeder Kavität 80 μl Opsonophagozytose-Buffer beigefügt, um ein ausreichendes Volumen für den flusszytometrischen Assay zu erhalten; der Kavitäteninhalt wurde resuspendiert und in Titerröhrchen (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, USA) transferiert. Die Titerröhrchen wurden für den flusszytometrischen Assay in Polystyrol-Einwegröhrchen (12 × 75 mm) gestellt. Die Proben wurden in einem dunklen Raum auf Eis bis zum Assay gelagert. Die Proben wurden meist innerhalb von 3–4 Stunden analysiert, was keinen Einfluss auf die Ergebnisse hatte, und konnten bis zu 6 Stunden aufbewahrt werden ohne dass der beobachtete Titer beeinflusst wurde. Die Röhrchen wurden vor der Flusszytometrie 3 Sekunden lang gevortext.
Drei Kontrollen pro Assay wurden für jeden Serotyp analysiert und zwar (1) eine HL-60-Zellkontrolle, die ausschließliche Zellen und Bakterien enthielt, (2) 3 Komplementkontrollen, die alle Testreagenzien mit Ausnahme von Antikörpern enthielten und (3) eine positive Qualitätskontrollserumprobe, bei der es sich um eine Serumprobe nach Impfung mit bekanntem Opsonophagozytose-Titer handelte. Die positive Qualitätskontrollserumprobe wurde in allen Mikrotiterplatten mitgeführt. Manuelle Opsonophagozytose-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt (Romer-Steiner et al., 1997). Mit dem manuellen Assay wurden bei Verwendung von Humanserum und Serum von 3–4 Wochen alten Kaninchen als Komplement keine Unterschiede beobachtet; für die Entwicklung und Standardisierung des flusszytometrischen Assays wurde jedoch nur Kaninchenkomplement benutzt.
Die Proben wurden mit einem FACSCalibur-Immunozytometrie-System (Becton Dickinson and Co., Paramus, New Jersey, USA) untersucht und mit CELLQuest-Software (Version 1,2 für Apple-System 7,1, Becton Dickinson) analysiert. Mindestens 3.000 eingeschlossene HL-60-Granulozyten wurden pro Röhrchen analysiert. FAM-SE wurde bei einer Wellenlänge von 488 nm erregt, und die FAM-SE-Fluoreszenzsignale der eingeschlossenen, lebensfähigen HL-60-Zellen wurden bei 530 nm gemessen. Die obere Grenze der Hintergrundfluoreszenz wurde in HL-60-Kontrollzellen gemessen und bestand aus Autofluoreszenz der HL-60-Zellen, von unspezifischen adhärenten Bakterien und Bakterienklumpen. Eine Markerregion (M1) überlagerte den Fluoreszenzgipfel der Zellkontrolle und umfasste 98% der Population. Eine zweite Markerregion (M2) wurde benutzt, um den prozentualen Anteil differenzierter HL-60-Zellen mit einer Fluoreszenz, die bei jeder Serumverdünnung stärker als die Fluoreszenz von M1 war, zu bestimmen. Die Zellen in dieser Region hatten S. pneumoniae phagozytiert. Die Titer wurden als der reziproke Wert der höchsten Serumdiffusion, die ≥ 50% des maximalen phagozytischen Uptake lieferte, angegeben. Proben mit einem maximalen phagozytischen Uptake von < 30% wurden als negativ angesehen, und ein Titer von 4 wurde angegeben.
Ein Panel von vor der Impfung erhaltenen Serumproben (n = 5), nach der Impfung erhaltenen Serumproben (n = 5) und Sandoglobulin, einem Präparat aus gepooltem Immunoglobulin G (IgG) (Sandoz Pharmaceuticals Co., East Hanover, New Jersey, USA) in einer Konzentration von 6%, wurde nach einer 30 Minuten langen Vorabsorption bei Raumtemperatur von gleichen Volumina homologer oder heterologer Polysaccharide (American Type Culture Collection), verdünnt auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml, auf opsonische Antikörper gegen sieben Pneumokokken-Serotypen (Serotyp 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F und 23F) untersucht. Eine kompetitive Hemmung durch ein homologes Polysaccharid wurde nur mit den nach der Impfung abgenommenen Seren durchgeführt. Die Seren wurden kompetitiv gehemmt und dreifach untersucht. Die Ergebnisse wurden mit dem Wilcoxon-Rangsummentest auf statistische Unterschiede wie unten beschrieben analysiert.
Zur Bestimmung des Pearson-Korrelationskoeffizienten (Produkt-Moment-Korrelation) für normal verteilte Daten und Durchführung des Wilcoxon-Rangsummentests für nichtparametrische Daten wurde das SigmaStat-Softwareprogramm, Version 2,0 (Jandel Scientific, San Rafael, Kalifornien, USA) verwendet. Ein P-Wert von < 0,05 entsprach dem Signifikanzniveau. Unterschiede zwischen gepaarten Daten wurden mit dem gepaarten t-Test bestimmt. Das 95% geometrische Vertrauensintervall (GCI) wurde als das geometrische Mittel des Titers (GMT) ± (geometrischer Standardirrtum × 1,96) geschätzt.
Im flusszytometrischen Opsonophagozytose-Assay wurden FAM-SE-markierte Pneumokokken durch typenspezifische antikapsuläre Antikörper in Abhängigkeit von der Antikörperkonzentration und dem Kompliment opsonisiert. Die Aktivität funktioneller Antikörper gegen sieben Pneumokokken-Serotypen (Serotyp 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19C und 23F) wurde in vor und nach Impfung erhaltenen Serumproben durch Zunahme der Fluoreszenz von HL-60-PMNs, die phagozytierte FAM-SE-markierte Pneumokokken enthielten, bestimmt (4). Die Opsonophagozytose (und damit die Fluoreszenz) war von der Menge funktioneller Antikörper in den Proben abhängig und zeigte ein antikörperkonzentrationsabhängiges Verhalten, wie in 4 gezeigt wird. Der prozentuale Anteil an HL-60-PMNs, die fluoreszierende Pneumokokken enthielten, nahm mit der Menge funktioneller Antikörper durch Verdünnung ab. Der prozentuale Anteil an HL-60-PMNs, die fluoreszierende Pneumokokken enthielten, wurde für jede Probenverdünnung eingetragen, um den Opsonophagozytose-Titer für jede Probe zu bestimmen.
4 zeigt insbesondere einen flusszytometrischen Assay von Serum mit funktioneller Antikörperaktivität von differenzierten HL-60-Granulozyten. Panel a zeigt ein Streudiagramm des Vorwärtsstreulichtes im Vergleich mit dem Seitwärtsstreulicht. Eingeschlossene Zellen (dunkelgrau) repräsentieren die lebensfähige Singulettpopulation differenzierter HL-60-Zellen. Panel b ist ein Histogramm der eingeschlossenen HL-60 Zellen mit verschiedenen Fluoreszenzgraden, die durch Uptake von 5,6-FAM-SE-markierten Pneumokokken in HL-60-Kontrollen zustande kommen. M 1 wurde so angeglichen, dass es 98% der eingeschlossenen HL-60-Zellen umfasst, und M2 definiert die fluoreszierende, eingeschlossene HL-60-Population. Der prozentuale Anteil an Zellen in M2 wird gezeigt. Panel c ist ein Histogramm des Uptake in der Komplementkontrolle. Panel d ist ein Histogramm eines vor der Impfung erhaltenen Serums, das 1:8 verdünnt ist (Serotyp 6B). Ähnliche Profile wurden bei stärkeren Verdünnungen von vor der Impfung abgenommenem Serum erhalten. Die Panele e, f g, h, I, j, k und l sind Fluoreszenzprofile von HL-60-Granulozyten (n = 3.000) in Gegenwart von nach der Impfung abgenommenem Serum in Verdünnungen von 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512 und 1:1024.
5 zeigt die Unterschiede im prozentualen Uptake zwischen einer vor und einer nach der Impfung erhaltenen Serumprobe. 5 zeigt außerdem den Opsonophagozytose-Titer für die nach der Impfung erhaltene Serumprobe. Der Opsonophagozytose-Titer entsprach dem reziproken Wert der Verdünnung mit > 50% des maximalen Uptake im Serum, in diesem Fall einem Titer von 128 (Pfeil). Eine Verdünnungskurve der Opsonophagozytose-Aktivität im entsprechenden vor der Impfung abgenommenen Serum (Panel d in 4) wird zum Vergleich gezeigt. Der Titer für dieses nichtimmune Serum betrug < 8. Kompetitive Hemmungen mit einem homologen Polysaccharid und mit einem Panel aus Qualitätskontrollserumproben ergab eine ≥ 97% Hemmung für alle sieben getesteten Serotypen (6).
Der maximale prozentuale Uptake von FAM-SE-markierten Pneumokokken durch differenzierte HL-60-Zellen in nach der Impfung abgenommenem Serum zeigte keinen wesentlichen Unterschied zwischen den getesteten Serumtypen; die mittlere ±1 Uptake-Standardabweichung für alle Serumtypen betrug 40% ± 10,6%. Der maximale prozentuale Uptake war serumabhängig. Im Bereich des prozentualen Uptake in den Komplementkontrollen fanden sich nur geringfügige Unterschiede zwischen den verschiedenen Serotypen mit einem Mittel von 9% ± 1,2%. Ähnliche prozentuale Uptakes wurden für PMNs von verschiedenen Spendern beobachtet. Zum Beispiel betrugen maximale Uptakes (berichtete Titer) für Serotyp 14 49,6% (256) und 48,7% (512) in einem repräsentativen Experiment bei Verwendung von aus Vollblut isolierten PMNs und HL-60-PMNs. Die Bestimmung aufgenommener Bakterien im Gegensatz zu adhärenten Bakterien wurde durch Trypanblau-Quenching des fluoreszierenden FAM-SE-Signals bestätigt. Eine wesentliche Reduktion des fluoreszierenden FAM-SE-Signals wurde durch Zugabe von 0,4% Trypanblau nicht beobachtet. Wir untersuchten verschiedene HL-60/Bakterien-Verhältnisse und zwar von 4:1 bis 1:100. HL-60/Bakterien-Verhältnisse zwischen 1:2 und 1:10 führten zu einer maximalen prozentualen Phagozytose in nach der Impfung erhaltenem Serum mit einem maximalen Anstieg (≥ 10% Uptake) der Phagozytose in der Komplement enthaltenden Kontrolle (Daten nicht gezeigt).
Die Serotypenspezifität des flusszytometrischen Opsonophagozytose-Assays für Typ 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F und 23F wurde in 5 nach der Impfung entnommenen Serumproben bestimmt, wobei die Proben mit dem heterologen Polysaccharid schachbrettmusterartig angelegt vorinkubiert wurden. Von 42 Kombinationen der Vorabsorption durch das heterologe Polysaccharid produzierte nur eine eine signifikante Reduktion des mittleren Titers im Vergleich mit dem der nichtabsorbierten Serumprobe. Vorabsorption von Serum durch Typ-9V-Polysaccharid verursachte eine mittlere Titerhemmung von 17,4% im Serotyp-4-Assay (P < 0,001).
Wenn dagegen ein gepooltes Antikörperpräparat (Sandoglobulin) von dem heterologen Polysacharid kreuzabsorbiert wurde, kam es zu einer signifikanten Reduktion der flusszytometrischen Opsonophagozytose-Titer, wie im Wilcoxon-Rangsummentest für Antikörper gegen Serotyp 4 (24% Abnahme, P = 0,02), 9V (58% Abnahme, P = 0,03) und 14 (22% Abnahme, P = 0,02) bestimmt wurde. Die Reduktion der Sandoglobulin-Titers nach Absorption durch heterologes Polysaccharid war nicht signifikant für Serotyp 6B (22% Abnahme, P = 0,08), 18C (38% Abnahme, P = 0,06) und 23F (25% Abnahme, P = 0,06).
Die Reproduzierbarkeit des Opsonophagozytose-Assays wurde mit 68 Replikaten (alle Serotypen) einer einzigen Qualitätskontrollprobe beurteilt; bei 65% entsprach der Titer dem Medianwert, bei 87% der Assays lagen die Titer innerhalb einer ±1 Verdünnung des medianen Titers und bei 97% der Assays innerhalb von ±2 Verdünnungen des medianen Titers. Die geometrischen 95% Vertrauensintervalle (G95% Cis) für ein Panel mit Qualitätskontrollserumproben (n = 4) wurde durch eine 3- bis 6-malige Untersuchung aller Serenproben in Gegenwart aller Serotypen ermittelt. Die GMTs und G95% Cis für alle Serotypen waren wie folgt: Serotyp 4: 675 und 406 bis 1.063; Serotyp 6B: 260 und 169 bis 388; Serotyp 9V: 2.474 und 1.783 bis 3.326; Serotyp 14: 664 und 388 bis 1.176; Serotyp 18C: 546 und 388 bis 891; Serotyp 19 F: 276 und 194 bis 388; Serotyp 23F: 659 and 416 bis 1.024. Diese G95% Cis entsprechen weniger als einer Verdünnung des GMT für alle untersuchten Serotypen.
Insgesamt gesehen korrelierten die Ergebnisse des flusszytometrischen Assays für alle sieben Serotypen gut mit denen des manuellen Viabilitätsassays (r = 0,89 and P ≤ 0,001). Die Korrelationen werden in 7 nach Serotyp dargestellt. Bei Untersuchung von Serum nach der Impfung waren die mit dem flusszytometrischen Assay erhaltenen GMTs für die Serotypen 9V, 14 und 18C höher und die GMTs für Serotyp 4 niedriger als die mit dem manuellen Viabilitätsassay ermittelten Werte. Im gepaarten Test waren diese Unterschiede für Serotyp 4 (P = 0,117), Serotyp 14 (P = 0,05) und Serotyp 18C (P = 0,114) nicht signifikant. Ein signifikanter Unterschied wurde nur für Serotyp 9V gefunden (P < 0,001). Für vor der Impfung bestimmte GMTs unterschieden sich die Ergebnisse mit den beiden Methoden nicht wesentlich voneinander. In einem weiteren Experiment wurden zusätzlich r-Werte von 0,96, 0,90 und 0,81 für die Serotypen 1, 6B und 9V von S. pneumoniae ermittelt.
Die Untersuchung von 52% der Serumproben, die mit dem flusszytometrischen Assay auf alle Serotypen getestet wurden, ergab dieselben Titer wie die Untersuchung mit dem manuellen Viabilitätsassay; bei 73% lagen die Titer innerhalb von ±1 Verdünnung der Titer mit dem manuellen Viabilitätsassays. Bei 85% lagen die Titer innerhalb von ±2 Verdünnungen derjeniger des manuellen Viabilitätsassays und bei 93% innerhalb von ±3 Verdünnungen. Tendenziell waren die Titer mit dem flusszytometrischen Assay gleich oder um eine Verdünnung höher als diejenigen mit dem manuellen Viabilitätsassay (8). Für alle Serotypen waren die Werte des flusszytometrischen Opsonophagozytose-Assays um den Medianwert des manuellen Opsonophagozytose-Assays normal verteilt. Der flusszytometrische Assay ermöglichte eine Analyse einer größeren Anzahl täglicher Serumproben und zwar ca. 50 Serumproben in 8 Stunden. Mit dem manuellen Opsonophagozytose-Viabilitätsassay konnten dagegen nur ca. 25 Serumproben in 18 bis 24 Stunden analysiert werden. Der flusszytometrische Assay wurde nicht durch Penicillin (0, 100 oder 1.000 Einheiten/ml) im Assaypuffer beeinflusst, da keine signifikanten Unterschiede der Opsonophagozytose-Titer in einem Panel mit 6 Serumproben, die auf Antikörper gegen Serotyp B (P = 0,49) und 18C (P = 0.57) getestet wurden, ermittelt wurden.
Beispiel 7
Nachweis einer intrazellulären Fluoreszenz mit dem Latexpartikelkonzentrations-Fluoreszenz-Immunoassay auf einer IDEXX Screen Machine 2000.
Das Verfahren zum Nachweis einer intrazellulären Fluoreszenz mit dem Latexpartikelkonzentrations-Fluoreszenzimmunoassay auf einem Partikelkonzentrations-Immunofluoreszenz-Analysiergerät, wie der IDEXX Screen Maschine (Idexx Laboratories, Inc., Westbrook, Maine, USA) wird nachstehend beschrieben.
Partikelkonzentrations-Fluoreszenzimmunoassays werden für den Nachweis von funktionellen opsonischen Antikörpern durch Anwendung von Submikron-Latexpartikeln adaptiert. Mit Bakterienantigen beschichtete Partikel wurden in der Solidphase zum Nachweis mehrer fluoreszierender Ganzzellantigene verwendet. Aufgrund derzeitiger Untersuchungen von Konjugat- und Kombinationsimpfstoffen ist es wünschenswert, 7, 9 und 11 serotypenspezifische opsonische Antikörper mit einem einzigen Assay nachweisen zu können. Mit dem Partikelkonzentrations-Fluoreszenzimmunoassay ist dies möglich.
Partikel wurden mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen in verschiedenen Konzentrationen behandelt, um eine Matrix gleich großer Partikel zu produzieren, die sich aufgrund der Farbe und Intensität der Anfärbung unterschieden. Aufgrund der verschiedenen Eigenschaften wurden unterschiedliche Populationen gefärbter Partikel produziert. Jede der Populationen wurde mit einem bestimmten zu prüfenden Antigen oder einem bestimmten Antigenserotyp beschichtet. Die Beschichtung erfolgte mithilfe eines patentrechtlich geschützten Solidphase-Amino-Polysaccharid-Kupplungsprozesses. Beschichtete Partikel wurden gemischt, um eine zu prüfende Matrixlösung, die bis zu 12 Antigene oder Serotypen enthielt zuzubereiten. Alle Serotypen und die zugehörige Mischung von Serotypen wurden speziell für den zu prüfenden Impfstoff mit Partikeln vermischt.
Die gemischten Partikel wurden den Serumproben immunisierter Personen der Studienpopulation zugesetzt und reagierten mit dem Serum. Die Reaktion erfolgte in 96 Kavitäten von Fluoricon-Glasfasermembran-Vakuumflitrationsassay-Platten. Nach einer Inkubation wurde lyophilisiertes Serum von 3–4 Wochen alten Kaninchen als Komplement beigefügt. Die Mischung wurde inkubiert. Nach der Inkubation wurden differenzierte HL-60-Zellen (oder andere geeignete Zellen) als Effektorzellen beigefügt, um die Opsonophagozytose ablaufen zu lassen.
Nach Ablauf der Reaktion wurden die phagozytierten Partikel von freien Partikeln mittels Vakuumfiltration getrennt. Die Zellen wurden dann gewaschen, und die gesamte intrazelluläre Fluoreszenz wurde auf der ISEXX Screen Machine 2000 gemessen. Bei dieser Nachweismethode handelt es sich um eine Front-Surface-Fluorimetrie mit einem Photomultiplier und fluorophorspezifischen Interferenzfilterpackungen. Nachweis der Konzentration eines speziellen fluoreszierenden Farbstoffes oder eines Differenzierungsfarbstoffes wird als Nachweis eines aufgenommenen Antigen-Bead-Antikörper-Opsonins angesehen und zeigt das Vorhandensein von opsonischen Antikörpern an, die Spezifität für ein bestimmtes zu prüfendes Antigen ausdrücken.
Der Nachweis mit der Screen Machine 2000 erfolgt mithilfe von 4 Fluoreszenzkanälen, von denen jeder mit spezifischen Kombinationen von Erregungs- und Emissions-Bandpass-Filtern und einem diachronischen Longpass-Spiegel ausgestattet ist. Fluoreszenzkanäle können zur Gänze vom Benutzer ausgewählt werden, und jeder Kanal wird separat angegeben. Acht verschiedene Kanalverstärkungen können separat für jeden Fluoreszenzkanal programmiert werden, was Konfigurationen ermöglicht, welche die Kombinationen optimieren. Sämtliche Kombinationen dieser 4 Kanäle können zum Ablesen einer bestimmten Platte benutzt werden. Ein mehrfacher Antigennachweis von über 12 Populationen ist daher möglich.
Eine Datenreduktion ist mit IDEXX Windows basierend auf der Winplate-Software zur Datenerfassung und -analyse oder einer anderen speziell für die IDEXX-Screen Machine hergestellten Software möglich.
Beispiel 8
Bead-Spezifikationen für einen Mehrfarben-Mehrfachnachweis pathogener Antigene einschließlich S. pneumoniae mittels Opsonophagozytose
Die oben beschriebene Methode eines Mehrfarben-Opsonophagozytose-Assays mit intakten Bakterien kann durch einen anderen Assay ersetzt werden, wobei Vorteile wie beispielsweise eine bessere Standardisierung und Automatisierung des Flusszytometers, des IDEXX-Apparates und üblicher Hämatologie-Einheiten durch Anwendung von Latex-Beads, die antigenspezifisch für den zu untersuchenden Serotyp beschichtet sind und die die intakten Bakterien ersetzen, erzielt werden. Die Beads werden wie folgt beschrieben:

1. Beadgröße nominal 1 Mikron für flusszytometrischen Assay.
2. Beadgröße nominal 0,8 Mikron oder kleiner für Partikelkonzentration-Fluoreszenzimmunoassay (PCFIA).
3. Beadgröße zwischen 0,5 Mikron und 8 Mikron für Anwendung von Volumen/Leitfähigkeit/Laserlichtstreuung (Coulter VCS)
4. Alle Bead-Populationen müssen dieselbe Größe haben (VK 20% oder weniger), minimale Aggregation der Beads im Endprodukt.
5. Für Flusszytometrie: Beadpopulationen müssen anhand von Konzentrationen drei verschiedener Farbstoffe (bestimmt durch zytometrische Untersuchung) unterschieden werden können:
a) Farbstoffe müssen mit einer BD-Standardfiltereinrichtung für 3-Farben-Caliburs nachweisbar sein; die Farben sollten so gewählt werden, dass Nebensignaleffekte minimiert werden.
1. Müssen bei 488 nm erregt werden
2. Farbstoff 1 nachgewiesen auf FL1 bei 525 nm
3. Farbstoff 2 nachgewiesen auf FL2 bei 575 nm
4. Farbstoff 3 nachgewiesen auf FL3 bei > 600 nm
b) Individuelle Farbstoffkonzentrationen in einer Beadpopulation müssen so zunehmen, dass sich eine Zunahme um eine logarithmische Dekade in der Spitzenkanalfluoreszenz für diese Beadpopulation ergibt, verglichen mit der früheren flusszytometrisch nachgewiesenen Beadpopulation.

Für Flusszytometrie: Die Beadpopulationen werden als eine Matrix auf einem Punktgraph von FL1 v. FL2 oder FL1 v. FL3 oder FL2 v. FL3 dargestellt.

a) Dies ergibt eine Gesamtanzahl möglicher verschiedener Beadpopulationen von 4³ bzw. 64, wenn alle 3 Farben einbegriffen werden.
b) Die mittlere Kanalfluoreszenz muss kleine VK haben (2%).
1. Beadpopulationen haben entsprechende funktionelle Aminogruppen auf der Oberfläche, um die Anlagerung an bakterielle Kapselpolysaccharide zu optimieren.
2. Anlagerung von S. pneumoniae und Neisseria-meningitidis-Polysacchariden oder einer anderen identifizierbaren Zusammensetzung, spezifisch für den jeweiligen Serotyp, nach dem folgenden Protokoll:
a) Eine Lösung aus 1 mg Natrium-m-Periodat in 1 ml destilliertem entionisiertem Wasser zubereiten.
b) Tropfenweise und unter Rühren die in Schritt a) entstandene Lösung einer Lösung beifügen, die 10 mg eines bakteriellen Kapselpolysaccharides in 2 ml destilliertem entionisiertem Wasser enthält.
c) Die Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur rühren.
d) Der Mischung 10 μl 1-molares Ethylglycol beifügen.
e) 5 Minuten lang rühren.
f) 5 ml einer 5% (w/v) Suspension von Aminopolystyrolpartikeln durch Zentrifugieren (10 Minuten, 4000 × g) packen. Dekantieren.
g) Die Mischung aus den Schritten a) bis e) den gepackten Beads beifügen.
h) Das pH der Mischung mit 10% K₂CO₃ auf 9,0 bis 9,5 einstellen.
i) Die Mischung bei Raumtemperatur 1 Stunde lang rühren.
j) Der Mischung 6 mg Natriumcyanoborohydrid beifügen.
k) 12 Stunden lang rühren.
l) Die Partikel zweimal mit destilliertem entionisiertem Wasser waschen.
m) Die Partikel in 5 ml 0,1 mol, 100 mg Rinderserumalbumin enthaltendem PBS resuspendieren.
n) Die Mischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang rühren.
o) Die Partikel zweimal mit destilliertem entionisiertem Wasser waschen.
p) Die Partikel in 5 ml 0,1 molarem PBS resuspendieren, um 5 ml einer 5% (s/v) Suspension zu erhalten.
3. Die Beads mit angelagerten Polysacchariden sollten länger als 6 Monate haltbar sein.

Beispiel 9
Gefriertrocknen von Serum von 3–4 Wochen alten Kaninchen zum Gebrauch als Komplement in Opsonophagozytose-Assays zum Mehrfachnachweis von Antigenen
Eine Ausführungsform des Opsonophagozytose-Assay erfordert die Verwendung von Komplement um eine In-vivo-Situation zu imitieren. Üblicherweise wird Serum von 3–4 Wochen alten Kaninchen als Komplement benutzt, da es kommerziell erhältlich und mit dem beschriebenen Verfahren kompatibel ist. Andere Komplemente können verwendet werden, und die beschriebene Gefriertrocknung kann entsprechend adaptiert werden.
Das Komplement in seiner derzeit erhältlichen Form eignet sich für den Opsonophagozytose-Assay, insbesondere für die beschriebene, und – wie angenommen wird – vielfach benutzte kommerzielle Anwendung des Mehrfarben-Opsonophagozytose-Assays im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Konventionelles Komplement kann allerdings im kommerziellen Labor zu einer Reihe von Problemen führen.
Zu diesen Problemen gehören:

1. Tests müssen genau vorherbestimmt werden und haltbares Komplement muss bestellt, erhalten und kurz vor dem Test vorbereitet werden, was wertvolle Zeit für Laborpersonal in Anspruch nimmt
2. Die Haltbarkeit von Komplement in seiner derzeit für dieses Verfahren angewendeten Form ist nicht optimal für ein kommerzielles Labor mit relativ niedrigem technischen Standard.

Die oben beschriebenen und andere Probleme können durch Gefriertrocknung bzw. Lyophilisierung des Komplements wie unten beschrieben vermieden werden, wobei die Haltbarkeit verlängert wird und der Kunde, das Labor, Laboranten oder Benutzer das teure Komplement für den Gebrauch bereit haben, und die Vorbereitungszeit minimal ist. Diese Art von Komplement eignet sich für den Gebrauch in kommerziellen Kitts für die oben beschriebene Mehrfarben-Opsonophagozytose-Technologie.
Beschreibung des Verfahrens:

1. Serum von 3–4 Wochen alten Kaninchen oder ein anderes geeignetes Komplement bereit stellen.
2. Das gefrorene Kaninchenserum in kaltem Wasser ca. 1 Stunde lang auftauen.
3. Während das Serum auftaut, beschriftete, sterile Glasfläschchen (3 ml) bereit stellen.
4. Nach Auftauen das Serum vorsichtig mischen, um ein vollständiges Auftauen und Mischen des Serums zu garantieren. Hinweis: Eine kleine Menge Eis ist akzeptabel.
5. Aliquote Teile von jeweils 1 ml Serum unter sterilen Bedingungen in beschriftete Fläschchen füllen und mit einem sterilen Gummistöpsel verschließen. Hinweis: Der Stöpsel darf nicht vollständig in das Fläschchen gedrückt werden, damit ausreichend Raum zum Ausgleich des Vakuums und zum Entweichen des sublimierten Wassers während des Verfahrens vorhanden ist.
6. Das aliquotierte Serum rasch in einem Eis-Alkohol-Bad einfrieren.
7. Unmittelbar nach dem Einfrieren den Einsatz mit den gefrorenen aliquoten Teilen in einen bereits gekühlten Gefriertrockner stellen. Das Serum sollte sofort erhitzt und damit wieder aufgetaut werden.
8. Mit dem Gefriertrocknungszyklus beginnen. Hinweis: Am Ende des Gefriertrocknungszyklus sollte die Temperatur der getrockneten aliquoten Teile langsam ohne zusätzliche Erwärmung auf Raumtemperatur steigen. Der gesamte Prozess dauert ca. 24 bis 48 Stunden.
9. Nach Abschluss des Trocknungszyklus werden die Gummistöpsel vollständig in die Fläschchen gedrückt und der Aluminiumverschluss aufgedrückt.
10. Das gefriergetrocknete Serum wird bei 2–4°C aufbewahrt.
11. Das gefriergetrocknete Serum wird 5–10 Minuten vor Gebrauch durch Zugabe von 1 ml deionisiertem Wasser rekonstituiert,

Beispiel 10
Nachweis antigenbeschichteter opsonischer Latexpartikel durch Bestimmung von Volumen, Leitfähigkeit und Laserstreulicht auf dem Beckman-Coulter-Hämatologie-Analysiergerät
Derzeitige neue Untersuchungen von Konjugat- und Kombinationsimpfstoffen ermöglichen die Produktion von speziell gefertigten Impfstoffen bzw. eine speziell gefertigte Verabreichung von monovalenten Impfstoffen. Diese Impfstoffe können gegen mehrere Krankheitserreger wirksam sein. Empfindlichkeit auf idiotypische, serotypspezifische Antikörper können bei bestimmten Subpopulationen Probleme verursachen. Zu diesen Subpopulationen gehören zum Beispiel Patienten mit AIDS, Patienten nach Splenektomie und immungeschwächte Patienten. Zum Zwecke der Behandlung einer Krankheit und einer Impfstoffbehandlung ist es daher wünschenswert, funktionelle, spezies- oder serotypspezifische opsonische Antikörper in Flüssigkeiten und Gewebeproben nachweisen zu können. Ein qualitativer Nachweis von opsonischen Antikörpern ist in einer Klinik mit den üblichen, weit verbreiteten Blutzellanalysegeräten möglich.
Der differenzielle Nachweis von phagozytierten Partikeln mit dem Opsonophagozytose-Immunoassay wurde an Beckman-Coulter Hämatologie-Analysiergeräte der Serien GEN-S, STKS, MAXM und HEMAX angepasst. Diese Analysiergeräte verwenden die Coulter-VCS-Technologie.
Das Vorhandensein von funktionellen opsonischen Antikörpern wird mit einem Panel antigenbeschichteter Submikron-Latexpartikel verschiedener Größe und Dichte nachgewiesen. Mit bakteriellen Antigenen beschichtete Partikel dienen in der Solidphase zum Nachweis einzelner oder zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Ganzzellen-Antigene.
Partikel werden in verschiedenen Größen und Dichten aus verschiedenen Materialien, z.B. aus Polystyrol hergestellt. Außerdem werden die Partikel so hergestellt, dass sie verschiedene, an funktionelle Oberflächengruppen gebundene Moleküle enthalten. Ein Panel mit die differenzielle Oberfläche ändernden R-Gruppen-Bindungen ist daher möglich. Eine spezifische R-Gruppen-Kupplung von Oberflächenmolekülen wird erzielt, um jeder Partikelpopulation verschiedene physikalische Eigenschaften für die Messung folgender Parameter zuzuteilen: (1) Partikelvolumen, (2) Hochfrequenzleitfähigkeit und (3) Laserlichtstreuung. Durch diese unterschiedlichen Eigenschaften entstehen einzigartige Partikelpopulationen. Jede Population wird differenziell mit einem spezifischen Prüfantigen oder einem spezifischen Antigen-Serotyp beschichtet. Die Beschichtung kann in der Solidphase des Kupplungsprozesses für funktionelle Gruppenantigene mithilfe von Flow Applications Inc. (Okawville, Illinois, USA) durchgeführt werden. Die beschichteten Partikel werden als Lösung mit einem oder mehreren Serotypen verwendet.
Partikellösungen mit einem Serotyp werden Serumproben von behandelten Personen zur Reaktion beigefügt. Die Reaktion erfolgt in einer Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten oder einer anderen geeigneten Vorrichtung. In jeder Serienverdünnungsreihe findet ein Test für einen Serotyp statt. Nach einer Inkubationsperiode wird lyophilisiertes Serum von 3–4 Wochen alten Kaninchen als Komplement beigefügt. Die Mischung wird inkubiert. Nach der Inkubation werden differenzierte HL-60- oder andere Zellen als Effektorzellen einem Matrixmodell im Überschuss beigefügt. Eine Opsonophagozytose der Partikel findet während der Inkubation statt. Die Zellen werden mit üblichen Methoden gewaschen und zur Analyse resuspendiert.
Wenn die Reaktion vollständig abgelaufen ist, werden die Lösungen einzeln oder als eine Mischung auf dem „Differenzialkanal" des VCS-Analysiergerätes analysiert. Eine einzelne Zelle oder Partikelpopulation mit Messungen von Volumen, Leitfähigkeit und Streuung ist ein Nachweis eines aufgenommenen Antigen-Bead-Antikörper-Opsonins, das sich intrazellulär oder außerhalb der Zelle nach Zelllyse befinden kann. Ein Nachweis einer derartigen Zelle, Zellpopulation oder Einschlussreste davon beweist das Vorhandensein von opsonischen Antikörpern, die Spezifität und Reaktionsfähigkeit für spezielle Prüfantigene ausdrücken.
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Claims

Verfahren zum gleichzeitigen Feststellen und Unterscheiden einer Vielzahl von verschiedenen, funktionellen Antikörpern mit folgenden Schritten: (a) eine Probe wird mit einer ersten Vielzahl von verschiedenen Antigenen, Komplementär- und Effektorzellen, kombiniert, wobei die Antigene unterschiedlich gekennzeichnet sind, (b) die Probe wird bebrütet, um die Innenaufnahme des Antigens durch die Effektorzellen zu erlauben, und (c) die innen aufgenommenen Antigene werden festgestellt, wobei eine Erhöhung der feststellbaren Kennzeichen im Vergleich mit einer Kontrollprobe die Gegenwart der innen aufgenommenen Gene und funktionellen Antikörper anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Vielzahl von verschiedenen Antigenen an verschiedenen, fluoreszierend gekennzeichneten Wülsten angeheftet ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Glied der ersten Vielzahl von verschiedenen Antigenen ein bakterielles Molekül aufweist, das von einem unterschiedlichen Serumtyp einer einzelnen Bakterienart abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienart Streptococcus pneumoniae oder neisseria meningitidis ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das bakterielle Molekül ein intaktes Bakterium ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das intakte Bakterium nicht wachstumsfähig ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe eines Individuums gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Individuum, von dem die Probe genommen worden ist, mit einem Impfstoff immunisiert worden ist, der eine zweite Vielzahl von verschiedenen Antigenen aufweist, wobei die Antigene nicht fluoreszierend gekennzeichnet, sondern andererseits dieselben wie die erste Vielzahl von Antigenen sind.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennung des funktionellen Antikörpers die Wirksamkeit des Impfstoffs anzeigt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Komplement gefriergetrocknetes Babykaninchenserum ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Effektorzellen Makrophagen, Mononuklearphagozyten, natürliche Killerzellen oder Granulozyten sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Effektorzellen aus dem Serum eines Individuums oder aus einer In-vitro-Kultur gewonnen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Effektorzellen menschliche, promyelozytische Leukämiezellen sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene durch eine Vielzahl von verschieden fluoreszierenden Molekülen unterschiedlich gekennzeichnet werden und dass eine Erhöhung der Fluoreszenz im Vergleich mit einer Kontrollprobe die Gegenwart von innen aufgenommenen Antigenen und funktionellen Antikörpern gegen vielfache, bakterielle Serumarten anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass sich jedes Glied der ersten Vielzahl von fluoreszierend gekennzeichneten Antigenen von jedem anderen Glied durch seine Fluoreszenzemissionswellenlänge oder durch seine Fluoreszenzstärke unterscheidet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Flusszytometer für die Erkennung der innen aufgenommenen Antigene verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das innen aufgenommene Antigen dadurch erkannt wird, dass eine Standard-Hematologie-Einheit verwendet wird, in der ein sich änderndes Volumen, eine sich ändernde Leitfähigkeit oder Streuung im Vergleich mit einer Kontrollprobe die Gegenwart von innen aufgenommenen Antigenen und funktionellen Antikörpern anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene durch eine Vielzahl von verschieden fluoreszierenden Molekülen unterschiedlich gekennzeichnet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die innen aufgenommenen Antigene dadurch erkannt werden, dass ein immunofluoreszierender Partikelkonzentrationsanalysator verwendet wird, in dem eine Erhöhung der Fluoreszenz im Vergleich mit einer Kontrollprobe die Gegenwart von innen aufgenommenen Antigenen und funktionellen Antikörpern anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene an verschieden fluoreszierend gekennzeichnete Wülste angeheftet sind und dass eine Erhöhung der Fluoreszenz im Vergleich mit einer Kontrollprobe die Gegenwart von innen aufgenommenen Wülsten und funktionellen Antikörpern gegen vielfache bakterielle Serumarten anzeigt.
Verwendung von unterschiedlich gekennzeichneten, fluoreszierenden Wülsten, die an eine Vielzahl von verschiedenen Antigenen gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 angeheftet sind.
Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Peptid, ein Lipid, ein Polysaccharid oder eine Nukleinsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Wulst mit einem Polysaccharid-Antigen beschichtet ist.
Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Wulst Fluoreszein enthält.
Verwendung nach den Ansprüchen 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Wulst 5,6-Karboxyfluoreszein, Ethidiummonoazid, Phykoerythrin, Allophykozyanin, Phykozyanin, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Texas Red, E-DANS, BODIPY-Farbstoffe, Cy3 oder Cy5 enthält.
Verwendung nach den Ansprüchen 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Wulst mit einem Polysaccharin-Antigen beschichtet ist, das durch Zufügen einer Aldehydgruppe modifiziert worden ist, während die Wulst durch Zufügen von Karboxy-Oberflächen-Gruppen modifiziert worden sind.
Verwendung nach den Ansprüchen 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Wulst eine Latexwulst, eine Polystyrenwulst oder eine magnetische Wulst ist.
Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass sich jedes Glied der Vielzahl von verschiedenen Antigenen, die an verschieden fluoreszierend gekennzeichneten Wülsten angeheftet sind, von jedem anderen Glied der Vielzahl durch seine Fluoreszenzemissionswellenlänge unterscheidet.
Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass sich jedes Glied der Vielzahl von verschiedenen Antigenen, die an verschieden fluoreszierend gekennzeichneten Wülsten angeheftet sind, von jedem anderen Glied der Vielzahl durch seine Fluoreszenzstärke unterscheidet.
Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Glied der ersten Vielzahl von verschiedenen Antigenen ein bakterielles Molekül aufweist, das von einem unterschiedlichen Serumtyp einer einzelnen Bakterienart abgeleitet ist.
Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienart Streptococcus pneumoniae oder neisseria meningitidis ist.