DE60027407T2

DE60027407T2 - 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphat reductoisomerasen und verfahren der anwendung

Info

Publication number: DE60027407T2
Application number: DE60027407T
Authority: DE
Inventors: B. Rodney Pullman CROTEAU; M. Bernd Pullman LANGE
Original assignee: University of Washington; Washington State University Research Foundation
Current assignee: University of Washington; Washington State University Research Foundation
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: CA2360758C; EP1151079A1; DE60027407D1; JP2002541771A; NZ513902A; JP2010104384A; ATE323754T1; EP1151079B1; WO2000046346A1; US20010046694A1; AU2975200A; CA2360758A1; EP1151079A4; US6420159B2; DK1151079T3; JP4495858B2; AU772346B2; US6281017B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase kodiert.
STAND DER TECHNIK
Isoprenoide sind eine große und strukturell diverse Gruppe von Verbindungen, die eine wesentliche Rolle in Pflanzen als Hormone, photosynthetische Pigmente, Elektronenträger, und Membranverbindungen spielen, und die ebenfalls der Kommunikation und Abwehr dienen (Harborne, J. B. (1991) in Ecological Chemistry and Biochemistry of Plant Terpenoids (Harborne, J. B., and Tomas-Barberan, R. A., Eds), pp. 399–426, Clarendon Press, Oxford). Es wurde bis vor kurzem angenommen, dass alle Isoprenoide über den Acetat/Mevalonat-Weg synthetisiert werden (Spurgeon, S. L., and Porter, J. W. (1983) in Biosynthesis of Isoprenoid Compounds (Porter, J. W., and Spurgeon, S. L. Eds.), Vol. 1, pp. 1–46, John Wiley, New York).
Es sind jedoch über die letzten paar Jahre Beweise aufgetaucht, dass Isopentenyldiphosphat, das zentrale Zwischenprodukt der Isoprenoid-Biosynthese, aus Pyruvat und D-Glyceraldehyd-3-phosphat über einen neuen Mevalonat-unabhängigen Weg in einigen Eubacteria (Rohmer, M., et al., Biochem. J. 295, 517–524 (1993); Broers, S. T. J. (1994) Ph. D. Thesis, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich, Schweiz; Rohmer, M., et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2564–2566 (1996)), Algen (Schwender, J. et al., Biochem. J., 316, 73–80 (1996)) und Pflanzenplastiden (Schwarz, M. K. (1994) Ph. D. Thesis, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich, Schweiz; Lichtenthaler, H. K., et al., FEBS Lett. 400, 271–274 (1997)) entstehen. Der erste Schritt in diesem neuen Weg beinhalten eine Transketolase-artige Kondensationsreaktion des Pyruvats und Glyceraldehyd-3-Phosphats, um 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat (1) zu ergeben. Gene, die das Enzym kodieren, welche diese Reaktion katalysieren, Deoxyxylulose Phosphatsynthase, wurden von E. coli (Sprenger, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12857–12862 (1997); Lois L. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2105–2110 (1998)), Pfefferminze (Mentha × peperita) (Lange, B. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2100–2104 (1998)) und Pfeffer (Bouvier, F. et al., Plant Physiol. 117, 1423–1431 (1998)) kloniert.
Im zweiten Schritt des Mevalonat-unabhängigen Wegs wird in Betracht gezogen, dass eine intramolekulare Umordnung und nachfolgende Reduktion von Deoxysylulosephosphat beteiligt ist, um 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-phosphat zu ergeben (Duvold, T. et al., Tetrahedron Lett. 38, 4769–4772 (1997); Duvold, T. et al., Tetrahedron Lett. 38, 6181–6184 (1997); Sagner, S. et al., Tetrahedron Lett. 39, 2091–2094 (1998)) (1). Seto und Mitarbeiter (Takahashi S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 9879–9884 (1998)) haben kürzlich die Isolation und Charakterisierung eines Reduktoisomerase-Gens aus E. coli berichtet. Die gegenwärtige Erfindung stellt ein aus Pfefferminze isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, welches eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit dem vorangehenden, wurde eine cDNA, die eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase aus Pfefferminze (Mentha piperita) kodiert, isoliert und sequenziert, und die entsprechende Aminosäuresequenz abgeleitet. Dementsprechend betrifft die gegenwärtige Erfindung isolierte DNA-Sequenzen, welche für die Expression von Pflanzen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodieren, wie z. B. isolierte DNA Sequenzen, welche für die Expression von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase von essentiellen Ölpflanzen, einschließlich Pflanzen der Gattung Mentha, kodieren. Ein typisches Beispiel einer isolierten Mentha DNA-Sequenz, welche für die Expression von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodiert, ist in SEQ ID Nr. 1 wiedergegeben, welche ein 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Protein (SEQ ID Nr. 2) aus Pfefferminze (Mentha piperita) kodiert. Zusätzlich betrifft die gegenwärtige Erfindung isolierte pflanzliche 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Proteine (einschließlich isolierter 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Proteine aus essentiellen Ölpflanzen, wie z. B. Pflanzen der Gattung Mentha), einschließlich des Pfefferminz (Mentha piperita) 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Protein mit der in SEQ ID Nr. 2 dargelegten Aminosäuresequenz.
In einem anderen Aspekt, betrifft die gegenwärtige Erfindung Nukleinsäuremoleküle, welche unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Sequenz hybridisiert, oder mit seinem Komplement, d. h. mit einem Antisense-Molekül, welches in der Sequenz zu der in SEQ ID Nr. dargelegten Sequenz komplementär ist. In anderen Aspekten, ist die gegenwärtige Erfindung auf replizierbare rekombinante Klonierungsvehikel gerichtet, welche eine Nukleinsäuresequenz, z. B., eine DNA Sequenz aufweist, welche für eine pflanzliche 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodiert, oder für eine Nukleotidsequenz, die ausreichend komplementär zu zumindest einem Bereich der DNA oder RNA ist, die ein pflanzliches 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodiert, um eine Hybridisierung damit zu ermöglichen (z. B. Antisense RNA oder DNA-Fragmente, die komplementär zu einem Bereich der DNA oder RNA Moleküle sind, die eine pflanzliches 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodieren, welche als Polymerase Kettenreaktionsprimer oder als Sonden für pflanzliche 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase Gene oder verwandte Gene nützlich sind). In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung, werden modifizierte Wirtszellen bereitgestellt, die mit einem rekombinanten Klonierungsvehikel und/oder einer DNA Sequenz der Erfindung transformiert, transfiziert, infiziert und/oder injiziert wurden.
Somit stellt die gegenwärtige Erfindung die rekombinante Expression von pflanzlicher 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase bereit, und die erfindungsgemäßen Konzepte können verwendet werden, um die Produktion, Isolation und Reinigung von signifikanten Mengen an rekombinanter 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase (oder ihrer primären Enzymprodukte) für die nachfolgende Verwendung zu erleichtern, um die Expression oder verstärkte Expression der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren zu erzielen, oder können anderenfalls in einer Umgebung verwendet werden, wo die Regulation oder Expression von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase für die Produktion dieses Enzyms, oder seiner Enzymprodukte, oder Derivate davon, gewünscht ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorangehenden Aspekte und viele der begleitenden Vorteile dieser Erfindung werden, durch die Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung, wenn Sie zusammen mit den beigelegten Zeichnungen betrachtet wird, leichter erkennbar sowie besser verständlich, wobei:
1: einen Überblick des Pyruvat/Glyceraldehyd-3-phosphat Weges für die Biosynthese von Isopentenyldiphosphat, und den vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in der Umwandlung von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat in 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-phosphat zeigt. Das eingekreiste P bezeichnet den Phosphat-Anteil. Die unterbrochenen Pfeile weisen auf noch nicht identifizierte Schritte hin.
2: die GC-MS Analyse von (A) dem Trimethylsilylether Derivat des dephosphorylierten biosynthetischen Produktes (R _t = 7,1 ± 0,1 min), welches durch die rekombinante Pfefferminz 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase (SEQ ID Nr. 2) erzeugt wurde, und (B) dem Trimethylsilylether Derivat des authentischen 2-C-Methyl-D,L-Erythritols (R _t = 7,1 ± 0,1 min), welches identisch zubereitet wurde.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Wie hierin verwendet, betreffen die Ausdrücke „Aminosäure" oder „Aminosäuren" alle natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren oder deren Reste. Die Aminosäuren werden entweder durch die Einbuchstaben- oder die Dreibuchstaben-Bezeichnung identifiziert:
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Nukleotid" eine monomere DNA- oder RNA Einheit, welche einen Zuckerrest (Pentose), ein Phosphat und eine stickstoffhältige heterozyklische Base enthält. Die Base ist mit dem Zuckerrest über den glykosidischen Kohlenstoff (1' Kohlenstoff der Pentose) verbunden, und diese Kombination aus Base und Zucker wir Nukleotid bezeichnet. Die Base charakterisiert das Nukleotid, wobei die vier Basen der DNA Adenin („A"), Guanin („G"), Cytosin („C") und Thymin („T") sind. Inosin („I") ist eine synthetische Base, die verwendet werden kann, um eine beliebige der vier, natürlich vorkommenden Basen (A, C, G oder T) zu substituieren. Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil („U"). Die hierin beschriebenen Nukleotidsequenzen weisen eine lineare Anordnung von Nukleotiden, die durch Phosphodiesterbindungen zwischen dem 3' und dem 5' Kohlenstoffatom benachbarter Pentosen verbunden sind, auf.
„Oligonukleotide" betrifft kurze einzel- oder doppelsträngige Deoxyribonukleotidsequenzen, die durch Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Die Oligonukleotide werden durch bekannte Verfahren chemisch synthetisiert und zum Beispiel mittels Polyacrylamidgelen gereinigt.
Der hierin verwendete Ausdruck „1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase" bedeutet ein Enzym, das in der Lage ist, aus 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-phosphat zu bilden.
Der Ausdruck „Hybridisieren unter stringenten Bedingungen", und grammatikalisch Äquivalente davon bedeutet, dass ein Nukleinsäuremolekül, welches mit einem auf einem DNA oder RNA-Blot (wie etwa einem Northern Blot oder einem Southern Blot) immobilisierten Ziel-Nukleinsäuremolekül hybridisiert wurde, während dem Waschen des Blots unter stringenten Bedingungen mit dem immobilisierten Zielmolekül auf dem Blot hybridisiert bleibt. In diesem Zusammenhang sind beispielhafte Hybridisierungsbedingungen: Hybridisierung in 5 × SSC bei 65°C für 16 Stunden. Beispielhafte hoch-stringente Waschbedingungen sind zwei Waschungen in 2 × SSC bei 23°C für 20 Minuten pro Waschung, gefolgt von einer Waschung in 2.0 × SSC bei 50°C für 30 Minuten. Beispielhafte sehr hoch-stringente Waschbedingungen sind zwei Waschungen in 2 × SSC bei 23°C für 15 Minuten pro Waschung, gefolgt von zwei Waschungen in 1.0 × SSC bei 60°C für 20 Minuten.
Die Abkürzung „SSC" betrifft einen Puffer, der in Nukleinsäure-Hybridisierungslösungen verwendet wird. Ein Liter einer 20 fach (zwanzig-fach konzentriert) Stamm SSC Pufferlösung (pH 7,0) enthält 175,3 g Natriumchlorid und 88,2 g Natriumcitrat.
Der Ausdruck „essentielle Ölpflanze" oder „essentielle Ölpflanzen" betrifft eine Gruppe von Pflanzenspezies, die hohe Konzentrationen an Monoterpenoid- und/oder Sesquiterpenoid- und/oder Diterpenoid-Ölen, und/oder hohe Konzentrationen an Monoterpenoid- und/oder Sesquiterpenoid- und/oder Diterpenoid-Harze produzieren. Die vorangehenden Öle und/oder Harze belaufen sich auf mehr als 0,005% des Frischgewichtes einer essentiellen Ölpflanze, welche sie produziert. Die essentiellen Öle und/oder Harze sind detaillierter, zum Beispiel, in E. Guenther, The Essential Oils, Vols. I–VI, R. E. Krieger Publishing co., Huntington N. Y., 1975, welche hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wurden, beschrieben. Die essentiellen Ölpflanzen beinhalten, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein:
Lamiaceae, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der folgenden Spezies: Ocimum (Basilikum); Lavandula (Lavendel), Origanum (Oregano), Mentha (Minze), Salvia (Salbei), Rosmarinus (Rosmarin), Thymus (Thymian), Satureja (Bohnenkraut), Monarda (Melisse) und Melissa.
Umbelliferae, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der folgenden Spezies: Carum (Kümmel), Anethum (Dille), Foeniculum (Fenchel) und Daucus (Karotte).
Asteraceae (Korbblütler), einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der folgenden Spezies: Artemisia (Estragon, Wüstenbeifuß), Tanacetum (Rainfarn).
Rutaceae (z. B.: Citruspflanzen); Rosaceae (z. B., Rosen), Myrtaceae (z. B., Eucalyptus, Teebaum); die Gramineae (z. B. Cymbopogon (Zitronengras)); Geraniaceae (Geranium) und bestimmte Koniferen einschließlich Abies (z. B., Kanadabalsam), Cedrus (Zeder); Thuja, Juniperus, Pinus (Föhren) und Picea (Fichten).
Der Bereich der essentiellen Ölpflanzen ist vollständiger dargelegt in E. Guenther, The Essential Oils, Vols. I–VI, R. E. Krieger Publishing co., Huntington N. Y., 1975, welche durch Bezugsnahme hierin eingeschlossen sind.
Die Ausdrücke „Änderung", „Aminosäurensequenz-Änderung", „Variante" und „Aminosäurensequenz-Variante" betrifft 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Moleküle, die in ihrer Aminosäuresequenz einige Unterschiede im Vergleich zu den entsprechenden nativen, d. h., natürlich vorkommenden, 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerasen aufweisen. Für gewöhnlich werden die Varianten zumindest 70% Homologie mit den entsprechenden nativen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerasen besitzen, und vorzugsweise, werden sie zumindest etwa 80% homolog mit den entsprechenden nativen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerasen sein. Die in diese Erfindung fallende Aminosäuresequenz Varianten der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerasen besitzen Substitutionen, Deletionen, und/oder Insertionen an bestimmten Positionen. Sequenzvarianten der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerasen können verwendet werden, um gewünschte verstärkte oder reduzierte Enzymaktivitäten, veränderte Regiochemie oder Stereochemie, oder veränderte Substratausnutzung oder Produktverteilung zu erhalten.
Substituierte 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase Varianten sind jene, die zumindest einen Aminosäurerest in der nativen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase entfernt und eine unterschiedliche Aminosäure an der gleichen Position an Stelle dieser entfernten Aminosäure eingefügt haben. Die Substitutionen können Einzel-, wobei nur eine Aminosäure in dem Molekül substituiert worden ist, oder Mehrfachsubstitutionen sein, wobei zwei oder mehrere Aminosäuren in demselben Molekül substituiert worden sind. Wesentliche Veränderungen in der Aktivität der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Moleküle der gegenwärtigen Erfindung können durch Substituieren einer Aminosäure mit einer Seitenkette, die erheblich verschieden in Ladung und/oder Struktur zu jener in der nativen Aminosäure ist, erreicht werden. Es würde erwartet werden, dass diese Art von Substitution die Struktur des Polypeptid-Rückgrats und/oder die Ladung oder Hydrophobizität der Moleküle im Bereich der Substitution beeinflusst.
Mäßige Veränderung in der Aktivität der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Moleküle der gegenwärtigen Erfindung würden durch Substituieren einer Aminosäure mit einer Seitenkette erwartet werden, die in der Ladung und/oder Struktur zu jener in dem nativen Molekül ähnlich ist. Von dieser Art von Substitution, auch als konservative Substitution bezeichnet, würde nicht angenommen werden, dass sie entweder die Struktur des Polypeptid-Rückgrats oder die Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls im Bereich der Substitution ändert.
1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Varianten mit Insertionen sind jene, die eine oder mehrere Aminosäuren unmittelbar angrenzend an eine Aminosäure an einer bestimmten Position in dem nativen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Molekül eingefügt haben. Unmittelbar benachbart zu einer Aminosäure bedeutet, dass sie entweder mit der α-Carboxy oder der α-Amino funktionellen Gruppe der Aminosäure verbunden ist. Die Einfügung kann eine oder mehrere Aminosäuren sein. Für gewöhnlich, besteht die Einfügung aus einer oder zwei konservativen Aminosäuren. Aminosäuren die in Ladung und/oder Struktur ähnlich zu den Aminosäuren, die zu der Stelle der Einfügung angrenzend sind, werden als konservativ bezeichnet. Alternativ, beinhaltet diese Erfindung Einfügungen einer Aminosäure deren Ladung und/oder Struktur zu den Aminosäuren, die zu der Stelle der Einfügung benachbart sind, im Wesentlichen verschieden ist.
Varianten mit Deletionen sind jene, wo eine oder mehrere Aminosäuren aus den nativen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Molekülen entfernt wurden. Für gewöhnlich, werden Varianten mit Deletionen eine oder zwei entfernte Aminosäuren in einer bestimmten Region des 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Moleküls aufweisen. Varianten mit Deletionen beinhalten jene, aus denen die gesamte oder der größte Teil der Transit-Sequenz entfernt wurde.
Die Ausdrücke „biologische Aktivität", „biologisch aktiv", „Aktivität" und „aktiv" beziehen sich auf die Fähigkeit der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerasen der gegenwärtigen Erfindung die Bildung von 2-C-Methyl-D-Erythritiol-4-phosphat durch Reduktion und Umordnung von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat zu katalysieren. Die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Aktivität wird in einer Enzymaktivitätsuntersuchung gemessen, so wie die hierin in Beispiel 3 beschriebene. Aminosäuresequenz-Varianten der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase der gegenwärtigen Erfindung können eine gewünschte veränderte biologische Aktivität aufweisen, einschließlich, zum Beispiel, veränderter Reaktionskinetiken, Substratausnutzung, Produktverteilung oder anderer Charakteristika, wie z. B. Regiochemie und Stereochemie.
Die Ausdrücke „DNA Sequenz kodierend" „DNA kodierend" „Nukleinsäure-Molekül kodierend" und „Nukleinsäure kodierend" bezieht sich auf die Reihenfolge oder Sequenz der Deoxyribonukleotide entlang eines Strangs der Desoxyribonukleinsäure. Die Reihenfolge dieser Deoxyribonukleotide bestimmt die Reihenfolge der Aminosäuren entlang der translatierten Polypeptidkette. Die DNA Sequenz kodiert folglich die Aminosäure Sequenz.
Die Ausdrücke „replizierbarer Vektor", „replizierbarer Expressionsvektor" und „Expressionsvektor" beziehen sich auf DNA Stücke, üblicherweise doppelsträngig, welche ein anderes DNA Stück in sich eingefügt haben können (Insert-DNA) wie z. B., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, ein cDNA Molekül. Der Vektor wird verwendet, um die Insert-DNA in eine geeignete Wirtszelle zu transportieren. Die Insert-DNA kann von der Wirtszelle abgeleitet sein, oder kann von einer unterschiedlichen Zelle oder Organismus abgeleitet sein. Wenn einmal die Insert-DNA in der Wirtszelle ist, kann der Vektor unabhängig von oder gleichzeitig mit der chromosomalen Wirts-DNA replizieren, und etliche Kopien des Vektors und seiner eingefügten DNA können erzeugt werden. Die Ausdrücke „replizierbarer Expressionsvektor" und „Expressionsvektor" beziehen sich auf replizierbare Vektoren, die die notwendigen Elemente enthalten, die die Transkription und Translation der eingefügten DNA in ein Polypeptid erlauben. Viele Moleküle des Polypeptids, das durch die eingefügte DNA kodiert ist, können somit schnell synthetisiert werden.
Die Ausdrücke „transformierte Wirtszelle", „transformiert" und „Transformation" beziehen sich auf die Einleitung von DNA in eine Zelle. Die Zelle wird als „Wirtszelle" bezeichnet, und es kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Zu typischen prokaryotischen Wirtszellen zählen verschiedene Stämme von E. coli. Zu typischen eukaryotischen Wirtszellen zählen Pflanzenzellen, Hefezellen, Insektenzellen oder tierische Zellen. Die eingeleitete DNA ist üblicherweise in der Form eines Vektors, der ein eingefügtes DNA Stück enthält. Die eingeleitete DNA Sequenz kann von der gleichen Spezies wie die Wirtszelle oder von einer zu der Wirtszelle verschiedenen Spezies, oder es kann eine Hybrid-DNA-Sequenz sein, die etwas fremde DNA und etwas von der Wirtsspezies abgeleitete DNA enthält.
Andere verwendetet Abkürzungen sind: bp, Basenpaar; GC, Gaschromatographie; HPLC, Hochdruckflüssigkeitschromatographie; IPTG, Isopropyl-1-thios-β-D-Galactoyranosid; kb, Kilobasenpaar; MS, Massenspektroskopie; Tris, Tris-(hydroxymethyl)aminoethan.
In Übereinstimmung mit der gegenwärtigen Erfindung, wurden cDNAs, die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase aus Pfefferminze (Menta × piperita) kodieren, isoliert und in der folgenden Art und Weise sequenziert. Eine cDNA Bibliothek wurde aus mRNA konstruiert, welche aus Pfefferminz-Öldrüsen-sekretierenden Zellen, einer für die essentielle Öl-Biosynthese hoch spezialisierten Zellart, isoliert wurde. PCR Primer wurden konstruiert (P1, 5'-CGAGATTATGCCAGGAGAGC-3' (SEQ ID Nr. 3); P2, 5'-GGCTTCAGGCAAACCCTTG-3') und mit Pfefferminz-Öldrüsen-Bibliothek cDNA als Matrize verwendet, um ein, als pMPDXR1 bezeichnetes, 223 bp Fragment (SEQ ID Nr. 5), welches eine gewisse Ähnlichkeit (~50%) zu dem E. coli Reduktoisomerase-Gen hat, zu amplifizieren. Es wurden fünf Klone voller Länge durch Durchsuchen der Pfefferminz-Öldrüsen-cDNA-Bibliothek (2,5 × 10⁴ Plaques) mit einer markierten Sonde, die vom pMPDXR1 (SEQ ID Nr. 5) abgeleitet ist, erhalten, einschließlich der cDNA mit der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz.
Zusätzlich wurden cDNA Moleküle, die die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodieren, in der folgenden Art und Weise aus Arabidopsis thaliana isoliert. 2 × 10⁴ Plaques der A. thaliana Blütenknospen cDNA Bibliothek (CD4-6 von der Arabidopsis Biological Resouce Center (http://aims.cps.msu.edu/aims/)) wurden mit pMPDXR1 (SEQ ID Nr. 5) durchsucht und ergaben 20 positive Klone, einschließlich des Klons mit der in SEQ ID Nr. 6 dargelegten Sequenz, welche das 5' verkürzte Protein mit der in SEQ ID Nr. 7 dargelegten Aminosäuresequenz, kodiert.
Die Pfefferminz 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase cDNA voller Länge (mit der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Sequenz) exprimierte ein funktionsfähiges 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Protein (SEQ ID Nr. 2) in E. coli, wie hierin in Beispiel 3 beschrieben ist.
Die Isolation der cDNAs, die die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase aus Pfefferminze kodieren, erlaubt die Entwicklung eines effizienten Expressionssystems für dieses funktionelle Enzym; stellt nützliche Werkzeuge für das Untersuchen der entwicklungsgemäßen Regulierung der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase bereit; erlaubt die Untersuchung des(r) Reaktionsmechanismus(en) dieses Enzyms, und erlaubt die Isolierung anderer 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerasen, wie etwa andere pflanzliche 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerasen. Die Isolierung der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase cDNAs erlaubt auch die Transformation einer Vielzahl von Organismen, um die Isoprenoid Synthese und Metabolismus zu verstärken oder anderenfalls zu verändern.
Gemäß einem Aspekt, zum Beispiel, stellt die gegenwärtige Erfindung Verfahren zum Erhöhen des Expressionsniveaus der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in einer Wirtszelle (wie z. B. eine Pflanzenzelle) bereit, einschließlich des Schrittes des Einleitens eines replizierbaren Expressionsvektors in eine Wirtszelle, welcher ein Nukleinsäuremolekül, das ein 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Protein kodiert, unter Bedingungen, die die Expression der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in der Wirtzelle ermöglichen. Als ein charakteristisches Beispiel, sind zusätzlich zu dem Nukleinsäuremolekül mit der hierin in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Sequenz, auch Nukleinsäuremoleküle, die das in Schwender et al., FEBS Letters 455(1–2): 140–144 (1999), welche Veröffentlichung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist, berichtete 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Protein kodieren, gemäß diesem Aspekt der Erfindung nützlich. Das Schwender et al. Protein ist in der Genbank-Datenbank unter der Genbank Zugangsnummer CAB43344 hinterlegt. In einer Ausführungsform gemäß diesem Aspekt der Erfindung, hybridisieren Nukleinsäuresequenzen, die die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodieren, unter stringenten Bedingungen mit dem Antisense-Kompliment der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz.
Wieder als ein nicht limitierendes Beispiel, stellt ein anderer Aspekt der gegenwärtigen Erfindung Verfahren bereit, um das Expressionsniveau der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in einer Wirtszelle (wie z. B. ein Pflanzenzelle) zu reduzieren, einschließlich des Schrittes des Einleitens eines replizierbaren Expressionsvektors in eine Wirtszelle, der eine Nukleinsäuremolekül enthält, welches unter stringenten Bedingungen mit der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz hybridisiert. Somit beinhalten, zum Beispiel, zusätzlich zu dem Antisense-Kompliment der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz, in diesem Aspekt der Erfindung nützliche repräsentative Nukleinsäuremoleküle die Antisense- Komplimente der folgenden Nukleinsäuremoleküle (identifiziert durch ihre Genbank-Datenbank Zugangsnummern): AI781096, AW256284, AW065057, AW286486, AI727207, AI901056.
Obwohl das durch die Pfefferminz cDNA kodierte 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Protein, hierin offenbart, das Enzym zu Plastiden lenkt, können Substitutionen der vermutlichen auf das Ziel gerichtete Sequenzen dieses Enzyms mit anderen Transportsequenzen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe z. B. die folgenden Veröffentlichungen, wobei die daraus zitierten Bereiche hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind: von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 180: 535–545, 1989; Stryer, Biochemistry, W. H. Freeman and Company, New York, NY, p. 769 [1988]) verwendet werden, um die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase zu anderen zellulären oder extrazellulären Orten zu richten.
Zusätzlich zu nativen, pflanzlichen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Aminosäuresequenzen, sind Sequenzvarianten, die durch Deletionen, Substitutionen, Mutationen und/oder Insertionen und Verkürzungen erzeugt wurden, vorgesehen innerhalb Schutzumfanges der Erfindung zu fallen, insofern sie nicht durch den Stand der Technik beschränkt sind. Die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Aminosäuresequenz-Varianten der Erfindung können durch Mutieren der DNA Sequenzen, die das Wildtyp-Enzym kodieren, wie durch Techniken die allgemein als ortsspezifische Mutagense bezeichnet werden, erzeugt werden. Nukleinsäuremoleküle die die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerasen der gegenwärtigen Erfindung kodieren, können durch eine Vielzahl der PCR Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, mutiert werden (siehe z. B., die folgenden Veröffentlichungen, wobei die daraus zitierten Abschnitte durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden: „PCR Strategies", M. A. Innis, D. H. Gelfand and J. J. Sninsky, eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA (Kapitel 14); „PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White, eds., Academic Press, NY, (1990)).
Als nicht limitierendes Beispiel, kann das in dem Transformer Site-Directed Mutagenesis-Satz von Clontech benutzte zwei Primersystem, verwendet werden um ortsspezifische Mutanten in die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Gene der gegenwärtigen Erfindung einzuführen. Nachfolgend an die Denaturierung des Zielplasmids in diesem System, werden die zwei Primer gleichzeitig an das Plasmid angelagert, wobei einer dieser Primer die gewünschte ortsspezifische Mutation enthält, und der andere Primer enthält eine Mutation an einem anderen Punkt des Plasmids, die zur Entfernung einer Restriktionsstelle führt. Die Synthese des zweiten Strangs wird dann durchgeführt, diese zwei Mutationen werden fest verbunden, und das resultierende Plasmid wird in einen mutS Stamm von E. coli transformiert. Die Plasmid DNA wird aus den transformierten Bakterien isoliert, mit den relevanten Restriktionsenzymen beschränkt (dadurch wird das nicht mutierte Plasmid linearisiert), und dann erneut in E. coli transformiert. Dieses System ermöglicht die Herstellung von Mutationen direkt in einem Expressionsplasmid, ohne die Notwendigkeit des Subklonierens oder Herstellung von einzelsträngigen Phagemiden. Die feste Verbindung der zwei Mutationen und die nachfolgende Linearisierung der nicht mutierten Plasmide resultiert in hohen Mutationswirksamkeiten und ermöglicht ein minimales Durchsuchen (Screening). Nachfolgend an die Synthese der anfänglichen Restriktionsstellen-Primer, erfordert dieses Verfahren nur die Verwendung von einer neuen Primer-Art pro Mutationsstelle. Anstatt jede positionelle Mutante getrennt herzustellen, kann eher ein Satz von „konstruierten degenerativen" Oligonukleotid Primern hergestellt werden, um alle gewünschte Mutationen an einer bestimmte Stelle gleichzeitig einzuführen. Transformanten können durch Sequenzieren der Plasmid DNA durch den mutagenisierten Bereich durchsucht werden, um mutierte Klone zu identifizieren und zu sortieren. Jede Mutanten DNA kann dann vollständig sequenziert oder restriktiert werden und durch Elektrophorese auf einem Mutation Detection Enhancement Gel (J. T. Baker) analysiert werden, um zu bestätigen, dass keine anderen Veränderungen in der Sequenz aufgetreten sind (durch Bandenverschiebungsvergleich zur nicht mutagenisierten Kontrolle).
Wieder als nicht limitierendes Beispiel, kann das in dem QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Satz von Stratagene (LaJolla, Kalifornien) benutzte zwei Primer System verwendet werden, um ortsspezifische Mutanten in die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Gene der gegenwärtigen Erfindung einzuführen. Doppelsträngige Plasmid DNA, die die Zielmutationsstelle tragende Einfügung enthält, wird denaturiert und mit zwei Oligonukleotiden vermischt, wobei die Oligonukleotide zu jedem der Stränge der Plasmid DNA an der Zielmutationsstelle komplementär sind. Die angelagerten Oligonukleotid-Primer werden mittels Pfu DNA Polymerase verlängert, wodurch versetzte Schnittstellen enthaltende mutierte Plasmide hergestellt werden. Nach dem Temperatur-Zyklus, wird die nicht mutierte, parentale DNA Matrize mit dem Restriktionsenzym DpnI verdaut, welches methylierte oder hemimethylierte DNA spaltet, nicht jedoch unmethylierte DNA. Die parentale Matrizen DNA ist fast immer methyliert oder hemimethyliert, da die meisten Stämme von E. coli, von denen die Matrizen DNA erhalten wurde, die notwendige Methylase Aktivität aufweisen. Die restliche, angelagerte Vektor DNA, welche die gewünschte(n) Mutation(en) aufweisen, wird in E. coli transformiert.
Das mutierte 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Gen kann in einen pET (oder anderen) Überexpressionsvektor kloniert werden, der verwendet werden kann, um E. coli, wie z. B. der Stamm E. coli BL21(DE3)pLysS, zu transformieren, für die Produktion auf hohem Niveau des mutierten Proteins und Reinigung durch Standardverfahren. Beispiele von Plasmidvektoren und E. coli Stämme die verwendet werden können, um hohe Konzentrationen an 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Proteinen der gegenwärtigen Erfindung zu exprimieren sind in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Chapter 17, welches durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist, dargelegt. Die FAB-MS-Kartierung kann verwendet werden, um die Genauigkeit der Mutantenexpression rasch zu überprüfen. Diese Technik sorgt für die Sequenzierung der Segmente über das ganze Protein und stellt das notwendige Vertrauen in der Sequenzzuweisung bereit. In einem Kartierungsexperiment dieser Art, wird das Protein mit einer Protease verdaut (die Wahl hängt von der spezifischen zu modifizierenden Region ab, da dieses Segment von primärem Interesse ist und die restliche Karte sollte mit der Karte des nicht mutagenisierten Protein identisch sein). Der Satz an Spaltfragmente wird durch Microbore-HPLC (Umkehrphase oder Ionenaustausch, hängt wieder von der zu modifizierenden spezifischen Region ab) fraktioniert, um etliche Peptide in jeder Fraktion bereitzustellen, und die Molekulargewichte der Peptide werden durch FAB-MS bestimmt. Die Massen werden dann mit den Molekulargewichten der Peptide, die von dem Verdau der vorhergesagten Sequenz erwartet werden, verglichen und die Richtigkeit der Sequenz schnell bestimmt. Da die beispielhafte hierin dargelegte Mutagenese Technik ortsspezifische Mutationen erzeugt, sollte die Sequenzierung des veränderten Peptids nicht notwendig sein, wenn der Massenspektrograph mit der Vorhersage übereinstimmt. Falls es notwendig ist, einen veränderten Rest zu überprüfen, kann die CAD-Tandem MS/MS verwendet werden, um das Peptid in der fraglichen Mischung zu sequenzieren, oder das Zielpeptid kann für einen subtraktiven Edman-Abbau oder Carboxypeptidase Y Verdau, abhängig von der Lage der Modifikation gereinigt werden.
In der Entwicklung eines bestimmten ortsspezifischen Mutagenese Experiments, ist es im Allgemeinen wünschenswert, zuerst eine nicht konservative Substitution (z. B., Ala für Cys, His oder Glu) durchzuführen und zu bestimmen, ob die Aktivität als Konsequenz stark beeinträchtigt ist. Die Eigenschaften des mutagenisierten Proteins werden dann unter besonderer Berücksichtigung der kinetischen Parameter K_m und k_cat als sensitive Indikatoren einer veränderten Funktion untersucht, von welchen, Veränderungen in der Bindung und/oder Katalyse per se durch Vergleich mit dem nativen Enzym abgeleitet werden können. Wenn durch diese Mittel dieser Rest aufgrund von Aktivitätsbeeinträchtigung oder Ausschaltung wichtig zu sein erscheint, dann können konservative Substitutionen durchgeführt werden, wie z. B. Asp für Glu um die Seitenkettenlänge zu ändern, Ser für Cys oder Arg für His. Für hydrophobe Segmente, wird größtenteils die Größe brauchbar verändert, obwohl aromatische gegen Alkyl-Seitenketten substituiert werden können. Veränderungen in der normalen Produktverteilung können darauf hinweisen, welcher Schritt(e) der Reaktionssequenz durch die Mutation verändert wurden. Modifikationen der hydrophoben Tasche können verwendet werden, um die Bindungskonformationen für Substrate zu verändern und können zu einer veränderten Regiochemie und/oder Stereochemie führen.
Es können auch andere ortsspezifische Mutagenese – Techniken mit den Nukleotidsequenzen der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel, kann der Restriktion Endonuklease-Verdau der DNA gefolgt von Ligation verwendet werden, um Deletionsvarianten der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase zu erzeugen, wie in Abschnitt 15.3 von Sambrook et al. Molekular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY [1989], hierin durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben ist. Eine ähnliche Strategie kann verwendet werden, um Insertionsvarianten, wie in Abschnitt 15.3 von Sambrook et al., supra, beschrieben ist, zu erzeugen.
Oligonukleotid gerichtete Mutagenese kann ebenfalls verwendet werden, um Substitutionsvarianten dieser Erfindung, sowie Verkürzungen, herzustellen. Die Oligonukleotid gerichtete Mutagenese kann ebenfalls verwendet werden, um bequem die Deletions- und Insertionsvarianten der Erfindung herzustellen. Diese Technik ist im Fachgebiet bekannt, wie in Adelmann et al. (DNA 2: 183 [1983]); Sambrook et al., supra; „Current Protocols in Molecular Biology", 1991, Wiley (NY), F. T. Ausubel, R. Brent. R. E. Kingston. D. D. Moore, J. D. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl, eds, hierin durch Bezugnahme aufgenommen beschrieben ist.
Im Allgemeinen, werden Oligonukleotide mit einer Länge von zumindest 25 Nukleotiden verwendet, um zwei oder mehrere Nukleotide in dem 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Molekül einzufügen, zu deletieren oder zu substituieren. Ein optimales Oligonukleotid weist 12 bis 15 perfekt übereinstimmende Nukleotide auf beiden Seiten der Nukleotide auf, welche die Mutation kodieren. Um die Wildtyp 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase zu mutagenisieren, wird das Oligonukleotid an das einzelsträngige DNA Matrizenmolekül unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen angelagert. Eine DNA polymerisierendes Enzym, im Allgemeinen, das Klenow Fragment der E. coli DNA Polymerase I, wird dann hinzugefügt. Dieses Enzym verwendet das Oligonukleotid als Primer, um die Synthese des Mutationstragenden DNA-Strangs zu vervollständigen. Es wird somit ein Heteroduplexmolekül gebildet, sodass ein DNA Strang das in den Vektor eingeführte Wildtyp-Enzym kodiert, und der zweite DNA Strang, die in denselben Vektor eingeführte mutierte Form des Enzyms kodiert. Dieses Heteroduplexmolekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle transformiert.
Mutanten, die mehr als eine substituierte Aminosäure aufweisen, können mit einer Vielzahl von Wegen hergestellt werden. Wenn die Aminosäuren in der Polypeptidkette eng beieinander liegen, können sie gleichzeitig durch ein Oligonukleotid, welches alle der gewünschten Aminosäurensubstitutionen kodiert, mutiert werden. Wenn jedoch die Aminosäuren weiter voneinander entfernt liegen (getrennt z. B. durch mehr als zehn Aminosäuren), ist es schwieriger ein einzelnes Oligonukleotid zu erzeugen, welches alle der gewünschten Veränderungen kodiert. Es kann stattdessen ein von zwei alternativen Verfahren benutzt werden. Bei dem ersten Verfahren, wird ein getrenntes Oligonukleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonukleotide werden dann gleichzeitig an die einzelsträngige Ziel DNA angelagert, und der zweite DNA Strang, welcher dann von der Matrize synthetisiert wird, kodiert alle gewünschten Aminosäurensubstitutionen. Ein alternatives Verfahren weist zwei oder mehrere Mutagenesis-Runden auf, um die gewünschte Mutante herzustellen. Die erste Runde ist, wie für eine Einzelmutante beschrieben: Wildtyp 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase DNA wird als Matrize verwendet, ein Oligonukleotid, welches die erste(n) Aminosäurensubstitution(en) kodiert, wird and diese Matrize angelagert, und das heteroduplex DNA Molekül wird dann erzeugt. Die zweite Mutagenesis-Runde nutzt die in der ersten Mutagenese-Runde hergestellte mutierte DNA als Matrize. Somit enthält diese Matrize bereits eine oder mehrere Mutanten. Das Oligonukleotid, welches die zusätzliche(n) gewünschte(n) Aminosäurensubstitution(en) kodiert, wird dann an diese Matrize angelagert, und der resultierende DNA Strang kodiert nun Mutationen von sowohl der ersten als auch der zweiten Mutagenese-Runde. Diese resultierende DNA kann als Matrize in der dritten Mutagenese-Runde, u.s.w. verwendet werden.
Ein Gen (oder andere Nukleinsäuremoleküle), welches die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodiert, kann in jeden Organismus eingebaut werden (intakte Pflanzen, Tiere, Mikroben, etc.), oder davon abgeleitete Zellkulturen. Das Enzym 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase katalysiert die erste Schlüsselreaktion in der Umwandlung von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat zu Isopentenyldiphosphat, welches wiederum in eine Vielzahl von Molekülen, einschließlich, z. B. der Karotenoide, und der Prenyl-Seitenketten des Chlorophylls, des Plastochinon und des Tocopherole umgewandelt wird. Folglich kann ein 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Gen (oder anderes Nukleinsäuremolekül) in jeden Organismus für eine Reihe von Zwecken eingeführt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der Herstellung von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat- Reduktoisomerase, oder ihres Produkts 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-phosphat, Erhöhung der Chlorophyllproduktion durch Erhöhung der Synthese der Phytol Seitenkette; Erhöhung der Herstellung von Terpenoiden, Phytoalexinen, Toxinen, und abschreckender Verbindungen, um die Abwehr gegen Pathogene, Insekten, und anderen Pflanzenfressern zu verbessern; des Erhöhens der Produktion von Monoterpen Geschmack und Aroma Verbindungen in essentiellen Ölpflanzen, Früchten und Gemüse, um die Geschmacks- und Aromaprofile zu verbessern, oder um die Ausbeute an Geschmacks- und Aromaverbindungen, welche aus Pflanzen extrahiert werden, zu erhöhen; um synthetische Zwischenprodukte in Pflanzen und Mikroben für industrielle Verwendungen herzustellen, wie z. B. die Synthese von Klebstoffen, Tinten und Polymeren; um die Herstellung von natürlichen Pigmenten, wie z. B. Karotenoiden, in Pflanzen, zu erhöhen, und die Ausbeute an aus Pflanzen extrahierten natürlichen Pigmenten für medizinische und kulinarische Anwendungen zu erhöhen; um die Ausbeute in Pflanzen an Verbindungen mit Antikrebs oder anderen Nutriceutical-Eigenschaften, wie z. B. Vitamin A und Vitamin E zu erhöhen; und um 2C-Methyl-D-Erythritol phosphat als ein enzymatisches oder chemisches Zwischenprodukt herzustellen. Obwohl die Nukleinsäuremoleküle der gegenwärtigen Erfindung in jeden Organismus eingeführt werden können, werden die Nukleinsäuremoleküle der gegenwärtigen bevorzugt in eine Pflanzenart eingeführt.
Eukaryotische Expressionssysteme können für die Herstellung von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase verwendet werden, da sie in der Lage sind, jede notwendige posttranslatorische Modifikation auszuführen und das Enzym an das richtige zelluläre Kompartiment zu leiten. Ein repräsentatives eukaryotisches Expressionssystem für diesen Zweck nutzt den rekombinanten Baculovirus, Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV; M. D. Summers and G. E. Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures [1986]; Luckow et al., Biotechnology, 6: 47–55 [1987]) für die Expression der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase der Erfindung. Die Infektion von Insektenzellen (wie z. B. Zellen der Spezies Spodoptera frugiperda) mit den rekombinanten Baculoviren ermöglicht die Herstellung von großen Mengen an 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Proteinen. Zusätzlich hat das Baculovirus-System andere für die Produktion der rekombinanten 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wichtige Vorteile. Zum Beispiel infizieren Baculoviren keine Menschen und können deshalb in größeren Mengen sicher gehandhabt werden. Im Baculovirus System wird ein DNA Konstrukt hergestellt, dass ein DNA Segment, welches 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase und einen Vektor kodiert, enthält. Der Vektor kann den Polyhedron-Gen-Promotor Bereich eines Baculovirus, die Baculovirus flankierenden Sequenzen, die für das richtige Überkreuzen während der Rekombination (die flankierenden Sequenzen weisen etwa 200–300 Basenpaare angrenzend an die Promotorsequenz auf) wichtig sind und ein bakteriellen Replikationsursprung, welcher dem Konstrukt ermöglicht in Bakterien zu replizieren, aufweisen. Der Vektor ist so konstruiert, dass (i) das DNA Segment benachbart (oder funktionsfähig verbunden oder „stromabwärts" oder „unter Kontrolle von") zu dem Polyhedron Gen Promotor platziert ist und (ii) die Promotor 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Kombination auf beiden Seiten durch 200–300 Basenpaaren von Baculovirus DNA flankiert ist (flankierende Sequenzen).
Um das 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase DNA Konstrukt herzustellen, wird ein cDNA Klon, der die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in voller Länge kodiert, erhalten mittels z. B. jenen Verfahren die hierin beschrieben sind. Das DNA Konstrukt wird in der Wirtszelle mit Baculovirus DNA eines geeigneten Baculovirus (d. h., von der selben Spezies von Baculovirus, wie der in dem Konstrukt kodierte Promotor) in Kontakt gebracht unter Bedingungen, sodass die Rekombination bewirkt wird. Die resultierenden rekombinanten Baculoviren kodieren die volle 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase. Eine Insektenwirtszelle kann, zum Beispiel, mit dem DNA Konstrukt und einem funktionellen Baculovirus co-transfiziert oder getrennt transfiziert werden. Die resultierenden rekombinanten Baculoviren können isoliert und verwendet werden, um Zellen zu infizieren, um die Herstellung der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase zu bewirken. Wirtsinsektenzellen schließen, zum Beispiel, Spodoptera frugiperda Zellen ein, die in der Lage sind, eine Baculovirus exprimierte 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase zu erzeugen. Die mit dem rekombinanten Baculovirus der gegenwärtigen Erfindung infizierten Insektenwirtszellen werden dann kultiviert, unter Bedingungen, die die Expression der Baculovirus-kodierten 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase ermöglichen. Die so produzierte 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wird dann aus den Zellen mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren extrahiert.
Andere eukaryotische Mikroben, wie zum Beispiel Hefen können ebenfalls verwendet werden, um diese Erfindung auszuführen. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, ist eine für gewöhnlich verwendete Hefe, obwohl etliche andere Stämme zur Verfügung stehen. Das plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10: 157 [1980]) wird häufig als Expressionsvektor in Saccharomyces verwendet. Diese Plasmid enthält das trp1 Gen, welches einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm der Hefe bereitstellt, welchem die Fähigkeit in Tryptophan zu wachsen, fehlt, wie z. B. die Stämme ATCC Nr. 44,076 und PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]). Das Vorhandensein der trp1 Läsion als ein Charakteristikum des Hefe Wirtszellengenoms bietet dann eine effektive Umgebung für das Ermitteln der Transformation durch Wachstum in der Abwesenheit von Tryptophan. Hefewirtszellen werden für gewöhnlich mit dem Polyethylenglykol-Verfahren transformiert, wie in Hinnen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 [1978]) beschrieben ist. Zusätzliche Hefe-Transformationsprotokolle sind in Gietz er al., N. A. R. 20(17): 1425 (1992); Reeves et al., FEMS, 99(2–3): 193–197, (1992), wobei beide Veröffentlichungen hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind, dargelegt.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren schließen die Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzemann et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 [1968]; Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 [1978]) ein, wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphate Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat Isomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase, und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide, werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor 3' der zu exprimierenden gewünschten Sequenz ligiert, um eine Polyadenylierung der mRNA und Termination bereitzustellen. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der Transkriptionskontrolle durch Wachstumsbedingungen haben, sind die Promotorregion für die Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte abbauende Enzyme, und die zuvorgenannte Glyderaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase, und Enzyme, die für die Maltose und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Jeder Plasmidvektor, der Hefe kompatibele Promotor-, Replikationsursprungs- und Terminationssequenzen enthält, ist geeignet.
Zellkulturen, die aus multizellulären Organismen, wie z. B. Pflanzen, abgeleitet sind, können als Wirte verwendet werden, um diese Erfindung auszuführen. Transgene Pflanzen können, zum Beispiel, durch Übertragen von Plasmiden, die die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase und ein selektierbares Markergen kodieren, z. B. das kan Gen, welches die Kanamycin Resistenz kodiert, in Agrobacterium tumifaciens erhalten werden, welches das Helfer Ti Plasmid enthält, wie in Hoeckema et al., Nature, 303: 179–181 [1983] beschrieben, und kultivieren der Agrobacterium Zellen mit Blattstückchen, oder anderen Gewebe oder Zellen der zu transformierenden Pflanze, wie in An et al., Plant Physiology, 81: 301–308 [1986] beschrieben ist, erhalten werden. Die Transformation der kultivierten Pflanzenwirtszellen wird normalerweise durch Agrobacterium tumifaciens erreicht. Kulturen von Säugetierwirtszellen und anderen Wirtszellen, die keine rigiden Zellmembranbarrieren aufweisen, werden normalerweise mittels des Calciumphosphat Verfahrens transformiert, wie ursprünglich von Graham und Van der Eb (Virology, 52: 546 [1978]) beschrieben und modifiziert wie in Abschnitt 16.32–16.37 in Sambrook et al., supra, beschrieben ist. Es können jedoch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie z. B. Polybren (Kawai und Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4: 1172 [1984]), Protoplastenfusion (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 2163 [1980]), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J., 1: 841 [1982]), und direkte Mikroinjektion in den Zellkern (Capecchi, Cell, 22: 479 [1980]) verwendet werden. Zusätzlich sind tierische Transformationsstrategien in Monastersky G. M. und Robl, J. M, Strategies in Transgenic Animal Science, ASM Press, Washington, D. C., 1995, durch Bezugnahme hierin aufgenommen, rezensiert. Transformierte Pflanzen Calli können durch den selektierbaren Marker durch Wachsen der Zellen in einem Medium, welches z. B. Kanamycin, und eine geeignete Menge Phytohormon, wie etwa Naphthalenessigsäure und Benzyladenin für die Callus- und Trieb-Induktion enthält, ausgewählt werden. Die Pflanzenzelle kann dann regeneriert werden und die resultierenden Pflanzen können mittels dem Fachmann bekannten Techniken in Erde transferiert werden.
Zusätzlich kann ein Gen, welches die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase Produktion reguliert, in die Pflanze inkorporiert werden, zusammen mit einem notwendigen Promotor, der induzierbar ist. In der Praxis dieser Ausführungsform der Erfindung, ist ein Promotor, der nur auf einen spezifischen externen oder internen Stimulus reagiert mit der Ziel cDNA fusioniert. Somit wird das Gen nicht transkribiert, außer in Reaktion auf den spezifischen Stimulus. Solange das Gen nicht transkribiert wird, wird sein Genprodukt nicht erzeugt.
Ein veranschaulichendes Beispiel eines reagierenden Promotorsystems, welches in der Ausführung dieser Erfindung verwendet werden kann, ist das Glutathion-S-Transferase (GST)-System in Mais. GSTs sind eine Familie von Enzymen, die eine Vielzahl von hydrophoben, elektrophile Verbindungen, die häufig als Vorlaufherbizide verwendet werden, entgiften können (Weigand et al., Plant Molecular Biology, 7: 235–243 [1986]). Studien haben gezeigt, dass die GSTs beim Hervorrufen dieser erhöhten Herbizidtoleranz, direkt eingebunden sind. Diese Aktion wird hauptsächlich durch ein spezifisches 1.1 kb mRNA Transkriptionsprodukt vermittelt. Kurz gesagt, Mais hat bereits ein natürlich-vorkommendes ruhendes Gen vorhanden, das auf externe Stimuli antworten kann und dass induziert werden kann um ein Genprodukt zu erzeugen. Dieses Gen ist vorher identifiziert und kloniert worden. In einer Ausführungsform dieser Erfindung wurde somit der Promoter des GST reagierenden Gens entfernt und an das 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase Gen, dem vorher der native Promotor entfernt wurde, angehängt. Dieses konstruierte Gen ist die Kombination eines Promoters, der auf einen externen chemischen Stimulus reagiert, und einem Gen, das für die erfolgreiche Herstellung der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase verantwortlich ist.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Verfahren, sind im Fachgebiet mehrere Verfahren bekannt, um klonierte DNA in eine Vielzahl von Pflanzenspezies zu transferieren, einschießlich Gymnospermen, Angiospermen, Monokotyledonen, und Dikotyledonen (siehe z. B., Glick und Thompson, eds., Methods in Plant Molecular Biology, CRC Press, Boca Raton, Florida [1993], durch Bezugnahme hierin aufgenommen). Ein repräsentatives Beispiel ist unter anderem die durch Elektroporation erleichterte DNA Aufnahme durch Protoplasten, in welcher ein elektrischer Impuls vorübergehend die Zellmembran permeabilisiert, wobei die Aufnahme von einer Vielzahl von biologischen Molekülen, einschließlich rekombinanter DNA (Rhodes et al., Science, 240 (4849): 204–204 [1988]) ermöglicht wird; Behandlung von Protoplasten mit Polyethylenglykol (Lyznik et al., Plant Molecular Biology, 13: 151–161 [1989]); und Beschuss von Zellen mit DNA-beladenen Mikroprojektilen, welche durch Explosionskraft oder komprimiertes Gas angetrieben werden, um die Zellwand zu durchdringen (Klein et al., Plant Physiol. 91: 440–444 [1989] und Boynton et al., Science, 240 (4858): 1534–1538 [1988]). Die Transformation von holzigen Arten kann zu Beispiel durch die in Han et al., Plant Science, 95: 187–196 (1994), durch Bezugnahme hierin aufgenommen, dargelegten Methoden erreicht werden. Ein Verfahren, das auf Roggenpflanzen (Secale cereale) angewendet wurde, ist die direkte Injektion von Plasmid DNA, einschließlich eines selektierbaren Markergens, in entwickelnde Sprösslinge (de la Pena et al., Nature 325: 274–276 (1987)). Weiters können Pflanzenviren als Vektoren verwendet werden, um Gene auf Pflanzenzellen zu überträgen. Zu Beispielen von Pflanzenviren, die als Vektoren verwendet werden können, um Pflanzen zu transformieren zählt der Blumenkohl-Mosaik-Virus (Brisson et al., Nature 310: 511–514 (1984). Zusätzliche Pflanzentransformationsstrategien und Techniken sind in Birch, R. G., Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48: 297 (1997); Forester et al., Exp. Agric., 33: 15–33 (1997) rezensiert. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben Transformationstechniken, die erfolgreich auf Minz (Mentha)-Spezies angewendet wurden. Repräsentative Veröffentlichungen, die Minz-Transformationstechniken offenbaren sind: A. Spencer et al., Phytochemistry 32: 911–919 (1993); C. Berry et al., Plant Cell Tissue Organ Cult. 44: 177–181 (1996); J. C. Caissard et al., Plant Cell Rep. 16: 67–70 (1996); X. Niu et al., Plant Cell Rep. 17: 165–171 (1998); F. Diemer et al., Plant Sci. 138: 101–108 (1998). Die vorgenannten Veröffentlichungen, welche Pflanzen-Transformationstechniken offenbaren, sind hierin durch Bezugnahme aufgenommen, und kleinere Veränderungen machen diese Techniken für eine Vielzahl von Pflanzenarten anwendbar.
Jede dieser Techniken hat Vor- und Nachteile. Bei jeder von diesen Techniken, wird DNA von einem Plasmid genetisch konstruiert, sodass es nicht nur das interessierende Gen, sondern auch selektierbare und screenbare Markergene enthält. Ein selektierbares Markergen wird verwendet, um nur jene Zellen, die integrierte Kopien des Plasmids (die Konstruktion ist so, dass das interessierende Gen und die selektierbaren und screenbaren Gene als eine Einheit übertragen werden) aufweisen, auszuwählen. Das screenbare Gen stellt eine andere Kontrolle für die erfolgreiche Kultivierung von nur jenen Zellen bereit, die die interessierenden Gene tragen. Ein häufig verwendetes selektierbares Markergen ist Neomycin-Phosphotransferase II (NPT II). Dieses Gen vermittelt Resistenz gegenüber Kanamycin, einer Verbindung, die direkt zu dem Wachstumsmedium hinzugefügt werden kann, auf welchem die Zellen wachsen. Pflanzenzellen sind normalerweise gegenüber Kanamycin empfänglich und sterben in Folge daran. Das Vorhandensein des NPT II Gens überwindet die Auswirkungen von Kanamycin und jede Zelle mit diesem Gen bleibt lebensfähig. Ein anderes selektierbares Markergen, welches in der Ausführung dieser Erfindung verwendet werden kann, ist das Gen, welches Resistenz gegenüber dem Herbizid Glufosinat (Basta) vermittelt. Ein häufig verwendet screenbares Gen ist das β-Glucuronidasegen (GUS). Das Vorhandensein dieses Gens wird unter Verwendung einer histochemischen Reaktion charakterisiert, in welcher eine Probe an mutmaßlichen transformierten Zellen mit einer GUS-Untersuchungslösung behandelt wird. Nach einer angemessenen Inkubation, verfärben sich die GUS enthaltenden Zellen blau.
Das Plasmid, welches eines oder mehrere von diesen Genen enthält, wird entweder in Pflanzenprotoplasten oder Kallus-Zellen durch eine beliebige der vorher beschriebenen Techniken eingeführt. Wenn das Markergen ein selektierbares Gen ist, überleben nur jene Zellen die Selektion mit dem geeigneten phytotoxischen Wirkstoff, die das DNA Packet eingebaut haben. Sobald die geeigneten Zellen identifiziert und vermehrt wurden, werden die Pflanzen regeneriert. Abkömmlinge der transformierten Pflanze müssen getestet werden, um sicherzustellen, dass das DNA Packet erfolgreich in das Pflanzengenom integriert worden ist.
Säugetierwirtszellen können ebenfalls in der Ausführung der Erfindung verwendet werden. Zu Beispielen geeigneter Säugetierzelllinien zählen Affennieren CV1-Linie, die durch SV40 transformiert wurde (COS-7, ATCC CRL 1651); humane embryonale Nierenlinie 293S (Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 [1977]), Baby-Hamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinesische Hamsterovarienzellen (Urlab and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 4216 [1980]); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, biol. Reprod., 23: 243 [1980]); Affennierenzellen (CV1-76, ATCC CCL 70); Afrikanische Grüne Affennierenzellen (VERO'-76, ATCC CRL-1587); humane Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Buffalo-Rat-Liver-Zellen (BRL 3A, ATTCC CRL 1442); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Brusttumorzellen (MMT 060562, ATCC CCL 51); Ratten Hepatomzellen (HTC, MI.54, Baumann et al., J. Cell Biol., 85: 1 [1980]); und TRI Zellen (Mather er al., Annals N. Y., Acad. Sci., 383: 44 [1982]). Expressionsvektoren für diese Zellen beinhalten (wenn notwendig) für gewöhnlich DNA Sequenzen für einen Replikationsursprung, einen Promotor, der vor dem zu exprimierenden Gen lokalisiert ist, eine Ribosomenbindungstelle, eine RNA Spleißstelle, eine Polyadenylierungsstelle, und eine Transkriptions-Terminationsstelle.
In Säugetierexpressionsvektoren verwendete Promotoren sind häufig viralen Ursprungs. Diese viralen Promotoren sind häufig vom Polyomavirus, Adenovirus 2, und am häufigsten vom Simian Virus 40 (SV40) abgeleitet. Das SV40 Virus enthält zwei Promotoren, die als führe und späte Promotoren bezeichnet werden. Diese Promotoren sind besonders nützlich, da sie beide einfach vom Virus als ein DNA Fragment, welches ebenfalls den viralen Replikationsursprung enthält, erhalten werden können (Fiers et al., Nature, 273: 113 [1978]). Es können auch kleinerer oder größerer SV40 DNA Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die ungefähr 250 bp große Sequenz enthält, welche sich von der HindIII Stelle in Richtung BglI-Stelle erstreckt, die sich im viralen Replikationsursprung befindet.
Alternativ können Promotoren, die natürlich mit dem fremden Gen assoziiert sind (homologe Promotoren) verwendet werden, vorausgesetzt dass sie mit der für die Transformation ausgewählten Wirtszelllinie kompatibel sind.
Ein Replikationsursprung kann aus einer exogenen Quelle, wie SV40 oder andere Viren (z. B., Polyoma, Adeno, VSV, BPV) erhalten werden, und in den Klonierungsvektor eingefügt werden. Alternativ kann der Replikationsursprung durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle zur Verfügung gestellt werden. Wenn der Vektor, der das fremde Gen enthält, in das Wirtszellenchromosom integriert wurde, ist das Letztere oft ausreichend.
Die Verwendung einer sekundären DNA Kodiersequenz kann die Produktionsniveaus der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in transformierten Zelllinien erhöhen. Die sekundäre Kodiersequenz weist typischerweise das Enzym Dihydrofolatreduktase (DHFR) auf. Die Wildtyp-Form der DHFR wird normalerweise durch die Chemikalie Methotrexat (MTX) inhibiert. Das Niveau der DHFR Expression in einer Zelle wird in Abhängigkeit von der zu den kultivierten Wirtszellen hinzugefügten MTX Menge variieren. Ein zusätzliches Merkmal der DHFR, welches DHFR als sekundäre Sequenz besonders nützlich macht, ist, dass es als Selektionsmarker verwendet werden kann, um transformierte Zellen zu identifizieren. Es sind zwei Formen von DHFR für die Verwendung als sekundäre Sequenzen verfügbar, die Wildtyp DHFR und die MTX-resistente DHFR. Die in einer bestimmten Wirtszelle verwendete DHFR-Art hängt davon ab, ob die Wirtszelle DHFR-defizient ist (sodass, sie entweder sehr niedrige Konzentrationen an DHFR endogen produziert, oder überhaupt keine funktionale DHFR produziert). DHFR-defiziente Zelllinien, wie die von Urlaub and Chasin, supra, beschriebene CHO Zelllinie, werden mit der Wildtyp-DHFR Kodiersequenz transformiert. Nach der Transformation exprimieren diese DHFR-defizienten Zelllinien funktionale DHFR und sind in der Lage, in einem Kulturmedium, welchem die Nährstoffe Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlen, zu wachsen. Nicht-transformierte Zellen werden in diesem Medium nicht überleben.
Die MTX-resistente Form von DHFR kann als Mittel zum Selektieren von transformierten Wirtszellen in jenen Wirtszellen, die endogen normale Mengen an funktionaler DHFR produzieren, die MTX sensitiv sind, verwendet werden. Die CHO-K1 Zelllinie (ATCC Nr. CL 61) besitzt diese Charakteristika, und ist somit eine nützliche Zelllinie für diesen Zweck. Der Zusatz von MTX zu dem Zellkulturmedium ermöglicht nur jenen Zellen, die mit der MTX-resistenten DHFR kodierenden DNA transformiert sind, zu wachsen. Die nicht-transformierten Zellen werden nicht in der Lage sein in diesem Medium zu überleben.
Prokaryoten können ebenfalls für die anfänglichen Klonierungsschritte dieser Erfindung verwendet werden, oder für das Exprimieren der Proteine der gegenwärtigen Erfindung. Sie sind besonders nützlich für die schnelle Erzeugung von großen Mengen and DNA, für die Erzeugung von einzelsträngigen DNA-Matrizen, die für die ortsspezifische Mutagenese verwendet werden, für das gleichzeitige Durchsuchen von vielen Mutanten, und für die DNA-Sequenzierung der erzeugten Mutanten. Zu geeigneten prokaryotischen Wirtszellen zählen E. coli K12 Stamm 94 (ATCC Nr.: 31.446), E. coli Stamm W3110 (ATCC Nr. 27.325), E. coli X1776 (ATCC NR. 31.537), und E. coli B; jedoch können viele andere Stämme von E. coli, wie HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, und viele andere Spezies und Gattungen von Prokaryoten einschließlich Bacilli, wie Bycillus subtilis, andere Enterobakteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans, und verschiedene Pseudomonas-Spezies als Wirte verwendet werden. Prokaryotische Wirtszellen oder andere Wirtszellen mit starren Zellwänden werden bevorzugt unter Verwendung des Calciumchlorid-Verfahrens wie in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., supra, beschrieben, transformiert. Alternativ kann für die Transformation dieser Zellen die Elektroporation verwendet werden. Prokaryotische Transformationstechniken sind in Dower, W. J., in Genetic Engineering, Principles and Methods, 12: 275–296, Plenum Publishing Corp., 1990; Hanahan et al., Meth. Enzymol., 204: 63 (1991) dargelegt.
Als ein repräsentatives Beispiel können 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodierende cDNA-Sequenzen auf den (von Novagen) kommerziell erhältlichen (His)₆·Tag pET Vektor für die Überexpression in E. coli als heterologer Wirt übertragen werden. Diese pET Expressionsplasmid hat etliche Vorteile in heterologen Expressionssystemen höheren Niveaus. Das gewünschte cDNA Insert wird in Rahmen mit den Plasmidvektor-Sequenzen, die sechs Histindine, gefolgt von einer hochspezifischen Protease-Erkennungsstelle (Thromin) kodieren, die an das Amino-terminale Kodon des Zielproteins gebunden sind, ligiert. Der Histidin „Block" des exprimierten Fusionproteins fördert die sehr feste Bindung an immobilisierte Metallionen und ermöglicht die schnelle Reinigung des rekombinanten Proteins durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie. Die Histidin-Leitsequenz wird dann an der speziellen Proteolyse-Stelle durch die Behandlung des gereinigten Proteins mit Thrombin abgespalten, und die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase erneut durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie gereinigt, wobei dieses Mal ein flacherer Imidazol-Gradient verwendet wird, um die rekombinante Reduktoisomerase zu eluieren, während der Histidinblock nach wie vor absorbiert bleibt. Dieses Überexpression-Reinigungssystem weist eine hohe Kapazität und ausgezeichnete Auflösung auf und ist schnell, und die Möglichkeit, dass ein kontaminierendes E. coli Protein ein ähnliches Bindungsverhalten zeigt (vor und nach der Thrombin-Proteolyse) ist äußerst gering.
Der Fachmann wird erkennen, dass jeder Plasmidvektor, der Replicon und Kontrollsequenzen enthält, die aus Spezies, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, abgeleitet sind, in der Ausführung der Erfindung verwendet werden können. Der Vektor weist im Allgemeinen eine Replikationsstelle, Markergene, die eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitstellen, einen oder mehrere Promotor(en), und eine Polylinker-Region auf, die mehrere Restriktionsstelle für die Einfügung der fremden DNA enthält. Zu typischen für die Transformation von E. coli verwendeten Plasmide zählen pBR322, pUC18, pUC19, pUCI18, pUCI19, und Bluescript M13, von denen alle in Abschnitt 1.12–1.20 in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Es sind jedoch auch viele andere geeignete Vektoren erhältlich. Diese Vektoren enthalten Gene, die für Ampicillin und/oder Tetracyclin-Resistenz kodieren, welche den mit diesen Vektoren transformierten Zellen ermöglicht, in der Gegenwart dieser Antibiotika zu wachsen.
Zu den häufigsten in prokaryotischen Vektoren verwendeten Promotoren zählen die β-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature 375: 615 [1978]; Itakura et al., Science, 198: 1056 [1977]; Goeddel et al., Nature, 281: 544 [1979]) und ein Tryptophan (trp) Promotor-System (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8: 4057 [1980]; EPO Appl. Publ. Nr. 36.776), und die Alkalische Phosphatase-Systeme. Obwohl diese die am Häufigsten verwendeten sind, sind andere mikrobielle Promotoren benutzt worden, und Details betreffend ihre Nukleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch einem Fachmann ermöglicht wird, diese funktionell in Plasmidvektoren zu ligieren (siehe Siebenlist et al., Cell, 20: 269 [1980]).
Viele eukaryotische Proteine, die normalerweise von der Zelle sekretiert werden, enthalten als Teil ihrer Aminosäuresequenz eine endogene Sekretionsignalsequenz. Somit können Proteine, die üblicherweise im Cytoplasma gefunden werden, durch das Binden einer Signalsequenz an das Protein auf die Sekretion gerichtet werden. Dies wird leicht durch das Ligieren einer DNA, die eine Signalsequenz kodiert, an das 5' Ende der DNA, die das Protein kodiert, gefolgt von dem Exprimieren des Fusionsproteins in einer geeigneten Wirtszelle erreicht. Die Signalsequenz kodierende DNA kann als Restriktionsfragment aus jedem Gen, welches ein Protein mit Signalsequenz kodiert, erhalten werden. Somit können prokaryotische, Hefe, und eukaryotische Signalsequenzen hierin verwendet werden, abhängig von der Art der benutzten Wirtszelle, um die Erfindung auszuführen. Die DNA und Aminosäuresequenz, die den Signalsequenzabschnitt von mehreren eukaryotischen Genen kodieren, einschließlich, z. B., humanes Wachstumshormon, Proinsulin, und Proalbumin sind bekannt (siehe Stryer, Biochemistry, W. H. Freeman and Company, New York, NY, p. 769 [1988]), und können als Signalsequenz in geeigneten eukaryotischen Wirtszellen verwendet werden. Hefesignalsequenzen, wie z. B. Saure Phosphatase (Arima et al., Nuc. Acids Res., 11: 1657 [1983]), α-Faktor, Alkalische Phosphatase und Invertase können verwendet werden, um die Sekretion aus Hefewirtszellen zu lenken. Prokaryotische Signalsequenzen aus Genen, die z. B. LamB oder OmpF (Wong et al., Gene, 68: 193 [1988]), MalE, PhoA, oder beta-Lactamase kodieren, sowie andere Gene können verwendet werden, um Proteine aus prokaryotischen Zellen in das Kulturmedium zu lenken.
Trafficking Sequenzen von Pflanzen, Tieren, und Mikroben können in der Ausführung der Erfindung verwendet werden, um die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Proteine der gegenwärtigen Erfindung zum Cytoplasma, endoplasmatischen Retikulum, zu Mitochondrien, oder andere zelluläre Komponenten zu lenken, oder um das Protein für den Export in das Medium zu zielen. Diese Betrachtungen betreffen die Überexpression von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase, und die Lenkung der Expression innerhalb von Zellen oder intakten Organismen um die Genproduktfunktion an jeder beliebig gewünschten Stelle zu ermöglichen.
Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die DNA enthalten, die Replikationssequenzen, regulatorische Sequenzen, phänotypische Selektionsgene und die interessierende 1-Deoxy-D- Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase DNA kodieren, werden unter Verwendung von rekombinanten DNA-Standardverfahren hergestellt. Isolierte Plasmid- und DNA Fragmente werden gespalten, zugeschnitten, und miteinander in einer bestimmten Reihenfolge ligiert, um die gewünschten Vektoren, wie im Fachgebiet gut bekannt ist (siehe, z. B., Sambrook et al., supra) herzustellen.
Die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Proteine der gegenwärtigen Erfindung können isoliert werden, beispielsweise durch das Einbauen eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung (wie ein cDNA Molekül) in einen Expressionsvektor, Einführen des Expressionsvektors in eine Wirtszelle und Exprimieren des Nukleinsäuremoleküls, um das Protein zu ergeben. Repräsentative Beispiele von Wirtszellen und Expressionsvektoren sind hierin dargelegt. Das Protein kann dann durch im Fachgebiet anerkannte Mittel gereinigt werden. Wenn ein Rohproteinextrakt anfänglich zubereitet wird, kann es wünschenswert sein, einen oder mehrere Proteinaseinhibitoren dem Extrakt hinzu zugeben. Zu repräsentative Beispiele von Proteinaseinhibitioren gehören: Serinproteinaseinhibitioren (wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Benzamid, Benzamidin HCl, ε-Amino-n-Capronsäure und Aprotinin (Trasylol)); Cysteinproteinaseinhibitoren, wie Natrium p-Hydroxymercuribenzoat; kompetitive Proteinaseinhibitioren, wie Antipain und Leupeptin, kovalent Proteinaseinhibitioren, wie Iodacetat und N-Ethylmaleimid; Aspartat (sauere) Proteinaseinhibitioren, wie Pepstatin und Diazoacetylnorleucinmethylester (DAN); Metalloproteinaseinhibitoren, wie EGTA [Ethylenglykol bis(β-aminoethylether) N,N,N',N'-tetraessigsäure], und der Chelatbildner 1,10-Phenanthrolin.
Zu repräsentativen Beispielen von im Fachgebiet anerkannten Techniken zum Reinigen, oder teilweisen Reinigen, von Proteinen aus biologischem Material zählen Ausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, und immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie.
Die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und die Umkehrphasenchromatographie sind zwei Trennverfahren, die auf der Wechselwirkung zwischen den hydrophoben Anteilen in einer Probe und einer unlöslichen, immobilisierten hydrophoben Gruppe, die auf der Chromatographiematrix vorhanden ist, basiert. Bei der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie ist die Matrix hydrophil und ist mit kurzkettigen nicht polaren Phenyl- oder Octylgruppen substituiert. Die mobile Phase ist üblicherweise eine wässrige Salzlösung. Bei der Umkehrphasenchromatographie ist die Matrix Kieselsäure, die durch längere n-Alkyl Ketten, im Allgemeinen C₈ (Octylsilyl) oder C₁₈ (Octadecylsilyl) substituiert wurden. Die Matrix ist weniger polar als die mobile Phase. Im Allgemeinen ist die mobile Phase eine Mischung aus Wasser und einem weniger polaren organischen Modifikator.
Trennungen an hydrophoben Wechselwirkungschromatographie-Matrizen werden im Allgemeinen in wässrigen Salzlösungen, welche üblicherweise nicht-denaturierende Bedingungen darstellen, durchgeführt. Die Proben werden in einem Hoch-Salz-Puffer auf die Matrix geladen und die Elution wird durch einen abnehmenden Salzgradienten durchgeführt. Die Trennungen an Umkehrphasen-Medien werden im Allgemeinen in Mischungen aus wässrigen und organischen Lösungsmittel, welche häufig denaturierende Bedingungen darstellen, durchgeführt. Im Falle einer Protein und/oder Peptidreinigung, hängt die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie von Oberflächen hydrophoben Gruppen ab und wird unter Bedingungen, die die Integrität des Proteinmoleküls bewahren, durchgeführt. Die Umkehrchromatographie hängt von der nativen Hydrophobizität des Proteins ab und wird unter Bedingungen durchgeführt, die nahezu alle hydrophoben Gruppen der Matrix aussetzen, d. h., denaturierende Bedingungen.
Ionenaustauschchromatographie ist speziell für die Trennung von ionischen oder ionisierbaren Verbindungen entworfen. Die stationäre Phase (Säulenmatrixmaterial) trägt ionisierbare funktionelle Gruppen, die über eine chemische Bindung an die stationäre Phase gebunden sind. Diese fixen Ladungen tragen ein Gegenion mit entgegengesetztem Vorzeichen. Dieses Gegenion ist nicht fix und kann verdrängt werden. Ionenaustauschchromatographie wird auf der Basis des Vorzeichens der verdrängbaren Ladungen bezeichnet. Folglich sind die fixen Ladungen bei der Anionenaustauschchromatographie positiv und bei der Kationenaustauscherchromatographie sind die fixen Ladungen negativ.
Die Retention eines Moleküls an einer Ionenaustauscherchromatographie-Säule beinhaltet eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen den fixen Ladungen und jenen des Moleküls, die Bindung bedingt den Austausch der nicht-fixierten Ionen durch das Molekül. Die Elution, wiederum, bedingt die Verdrängung des Moleküls von den fixen Ladungen durch ein neues Gegenion mit größerer Affinität für die fixen Ladungen als das Molekül, welches dann zum Neuen, nicht-fixierten Ion wird.
Die Fähigkeit von Gegenionen (Salzen) die an die fixen Ladungen gebundenen Moleküle zu verdrängen, ist eine Funktion der Affinitätsdifferenz zwischen den fixen Ladungen und den nicht-fixen Ladungen von sowohl dem Molekül als auch dem Salz. Die Affinität wiederum wird durch mehrere Variablen beeinflusst, einschließlich der Größenordnung der Nettoladung des Moleküls und der Konzentration und Art des zur Verdrängung verwendeten Salzes.
Zu in der Ionenaustauschchromatographie verwendete Festphasenpackungen zählen Zellulose, Dextrane, Agarose und Polystyrol. Die verwendeten Austauschgruppen schließen DEAE (Diethylaminoethyl) ein, eine schwache Base, die eine positive Nettoladung aufweisen wird, wenn sie ionisiert ist und deshalb Anionen binden und austauschen wird; und CM (Carboxymethyl), eine schwache Säure, die wenn sie ionisiert ist eine negative Ladung aufweist und Kationen binden und austauschen wird. Eine andere Form von schwachem Anionenaustauscher enthält die PEI (Polyethylenimin) funktionelle Gruppe. Dieses Material, das am häufigsten auf Dünnschichtplatten gefunden wird, ist für die Bindung von Proteinen bei pH Werten über ihrem pI nützlich. Die Polystyrolmatrix kann mit quaternärem Ammonium funktionellen Gruppen für einen starken Base-Anionenaustausch oder mit Sulfonsäure funktionellen Gruppen für einen starken Säure-Kationenaustausch erhalten werden. Es sind auch dazwischenliegende und schwache Ionenaustauschmaterialen erhältlich. Ionenaustauschchromatographie muss nicht unter Verwendung einer Säule durchgeführt werden, und kann als Batch-Ionenaustauschchromatographie mit dem Schlamm der stationären Phase in einem Kessel, wie etwa einem Becherglas, ausgeführt werden.
Gelfiltration wird unter Verwendung poröser Kügelchen als chromatographische Trägermittel durchgeführt. Eine aus solchen Kügelchen konstruierte Säule wird zwei messbare flüssige Volumina aufweisen, das externes Volumen, bestehend aus der Flüssigkeit zwischen den Kügelchen, und das interne Volumen, bestehend aus der Flüssigkeit innerhalb der Poren der Kügelchen. Größere Moleküle werden nur mit dem externen Volumen ins Gleichgewicht treten, während kleinere Moleküle sowohl mit dem externen als auch mit dem internen Volumen ins Gleichgewicht treten werden. Eine Mischung von Molekülen (wie Proteine) wird als ein diskretes Volumen oder Zone am oberen Teil der Gelfiltrationssäule aufgetragen und erlaubt durch die Säule hindurch zusickern. Die größeren Moleküle werden von dem internen Volumen ausgeschlossen und deshalb als erstes von der Säule auftauchen, während die kleineren Moleküle, die auf das interne Volumen zugreifen können, später auftauchen. Das Volumen einer konventionellen, für die Proteinreinigung verwendeten Matrix ist üblicherweise 30 bis 100 mal das Volumen der zu fraktionierenden Probe. Die Absorption des Säuleneffluents kann kontinuierlich unter Verwendung eines Flussmonitors bei einer gewünschten Wellenlänge überwacht werden.
Eine häufig für die Reinigung von Proteinen angewendete Technik ist die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC). HPLC ist ein Fortschritt sowohl in der betrieblichen Theorie als auch in der Herstellung von herkömmlichen chromatographischen Systemen. HPLC Systeme für die Trennung von biologischen Makromolekülen weichen von den herkömmlichen Säulenchromatographiesystemen auf drei Arten ab: (1) das Säulenpackungsmaterialen sind von viel größerer mechanischer Festigkeit, (2) die Partikelgröße des Säulenpackungsmaterials wurde 5 bis 10 fach reduziert, um die Adsorption-Desorption-Kinetiken zu erhöhen und die Bandenverbreiterung zu verkleinern, und (3) die Säulen werden bei einer 10–60 fach höheren Geschwindigkeit der mobilen Phase betrieben. Somit kann, als nicht-limitierendes Beispiel, HPLC Ausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, und immobilisierte Metallaffinitätschromatographie verwenden. Auf dem Fachgebiet anerkannte Techniken für die Reinigung von Proteinen und Peptiden sind in Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutscher, ed (1990), welche Veröffentlichung hierin durch Bezugsnahme aufgenommen ist, dargelegt.
Gemäß einem anderen Aspekt, ist die Erfindung auf Verfahren zum Reduzieren des Expressionsniveaus von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase Protein in einer Wirtszelle, wie eine Pflanzenzelle, gerichtet. Es kann eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden, um die Genexpression in Pflanzen zu inhibieren. Zum Beispiel kann Antisense RNA Technologie für gewöhnlich verwendet werden. Die erfolgreiche Implementierung von Antisense RNA in sich entwickelnde Systeme, um die Genexpression zu inhibieren, wurde vorher beschrieben (Van der Krol et al., 1990 Plant Mol. Biol. 14: 457; Visser et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225: 289; Hamilton et al., 1990, Nature 346: 284; Stockhaus et al., 1990, EMBO J. 9: 3013; Hudson et al., 1992, Plant Physiol. 98: 294; U.S. Patent Nos.: 4.801.340, 5.773.692, 5.723.761, und 5.959.180). Die Polygalacturonase, z. B. wurde mit dem Prozess des Weichwerdens von Früchten während den späteren Stadien im Reifeprozess von Tomaten in Zusammenhang gebracht (Hiatt et al., 1989, in Genetic Engineering, Setlow, ed. p. 49; Sheehy et al., 1988, Proc Natl. Acad. Sci. USA 85: 8805; Smith et al., 1988, Nature 334: 724). Die Integration von Antisense Konstrukten in das Tomatengenom, unter der Kontrolle des CaMV 35S Promotors, resultierte in einer 90% Unterdrückung der Genexpression.
Das Antisense-Gen ist eine DNA Sequenz, die relativ zu ihrer normalen Orientierung für die Transkription invertiert ist und so ein RNA Transkript exprimiert, das komplimentär zu dem Ziel mRNA Molekül ist, welches innerhalb der Wirtszelle exprimiert wird (d. h. das RNA Transkript des Antisense-Gens kann mit dem Ziel mRNA Molekül durch Watson-Crick Basenpaarung hybridisieren). Ein Antisense-Gen kann mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Arten konstruiert werden, vorausgesetzt, es ist in der Lage mit der Expression des Zielgens, wie das 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Gen zu interferieren. Das Antisense-Gen kann durch Invertieren der kodierenden Region (oder eines Teils davon) des Zielgens relativ zu seiner normalen Orientierung für Transkription konstruiert werden, um die Transkription an seinem Komplement zu ermöglichen, infolgedessen sind die RNAs, die durch das Antisense und Sense-Gen kodiert sind, komplementär.
Das Antisense-Gen wird für gewöhnlich im Wesentlichen identisch zu zumindest einem Teil des Zielgens oder Gene sein. Die Sequenz muss jedoch nicht völlig identisch sein, um die Expression zu inhibieren. Im Allgemeinen kann eine höhere Homologie verwendet werden, um für ein kürzeres Antisense-Gen zu kompensieren. Das Antisense-Gen wird für gewöhnlich im Wesentlich identisch (obwohl in Antisense-Orientierung) zu dem Zielgen sein. Die minimale Identität wird typischerweise größer als etwa 65% sein, aber eine höhere Identität könnte eine effektivere Unterdrückung der Expression der endogenen Sequenzen zeigen. Es ist eine im Wesentlichen höhere Identität von mehr als 80% bevorzugt, obwohl eine absolute Identität von etwa 95% am meisten bevorzugt wäre.
Weiters muss das Antisense-Gen nicht dasselbe Intron- oder Exon-Muster aufweisen, wie das Zielgen, und nicht-kodierende Segmente des Zielgens können gleichermaßen effektiv sein beim Erzielen der Antisense-Unterdrückung der Zielgen-Expression, wie kodierende Segmente. Normalerweise sollte eine DNA Sequenz von zumindest 30 oder 40 Nukleotide als Antisense-Gen verwendet werden, obwohl eine längere Sequenz bevorzugt wird. Das Konstrukt wird dann in eine oder mehrere Pflanzenzellen (von denen ganze Pflanzen wie hierin beschrieben regeneriert werden können) transformiert und der Antisense-Strang der RNA wird produziert.
Katalytische RNA Moleküle oder Ribozyme können ebenfalls verwendet werden um die Expression der Zielgene zu inhibieren. Es ist möglich, Ribozym Transgene zu entwickeln, die RNA Ribozyme kodieren, die spezifisch mit der Ziel RNA paaren und das Phosphodiester Rückgrat an einer spezifischen Stelle spalten, und dadurch die Ziel RNA in ihrer Funktion inaktivieren. Beim Durchführen dieser Spaltung, wird das Ribozyme selbst nicht verändert, und ist somit in der Lage zu rezyklieren und andere Moleküle zu spalten. Die Einfügung von Ribozym Sequenzen innerhalb von Antisense RNA verleiht Ihnen RNA-spaltende Aktivität, wodurch die Aktivität der Antisense-Konstrukte erhöht wird.
Eine Klasse von Ribozyme ist von einer Reihe von kleinen, zirkulären RNAs abgeleitet, welche in der Lage sind, in Pflanzen selbst zu spalten und zu replizieren. Die RNAs replizieren entweder alleine (viroide RNAs) oder mit einem Helfervirus (Satelliten RNAs). Beispiele beinhalten die RNAs vom Avocado Sunblotch Viroid und die Satelliten RNAs vom Tabakringfleckenvirus, Lucerne transient streak Virus, Velvet tobacco mottle Virus, Solanum nodiflorum mottle Virus, und Subterranean clover mottle Virus. Die Entwicklung und Verwendung von Ziel RNA-spezifischen Ribozymen ist in Haseloff et al. (1988, Nature, 334: 585–591) (siehe ebenfalls U.S. Patent Nr. 5.646.023) beschrieben, wobei beide Veröffentlichungen hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Tabler et al. (1991, Gene 108: 175) haben die Konstruktion von katalytischen RNAs, durch Kombinieren der Vorteile der Antisense RNA und der Ribozym Technologien in ein einziges Konstrukt, bedeutend vereinfacht. Es sind kleinere Regionen an Homologie für die Ribozym-Katalyse notwendig, deshalb kann diese die Unterdrückung von verschiedenen Mitgliedern einer großen Genfamilie begünstigen, wenn die Spaltungsstellen konserviert sind.
Ein anderes Verfahren, um die Zielexpression zu unterdrücken, ist Sense-Unterdrückung. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, welches in der Sense Orientierung konfiguriert ist, ein effektives Mittel ist, durch welches die Transkription von Zielgenen blockiert werden kann. Für ein Beispiel für die Verwendung dieses Verfahrens, um die Expression von endogenen Genen zu modulieren, siehe Napole et al., (1990 Plant Cell 2: 279–289), und U.S. Patent Nrn. 5.034.323, 5.231.020, 5.283.184, und 5.942.657, wobei jede von diesen Veröffentlichung durch Bezugnahe hierin aufgenommen sind. Für die Sense-Unterdrückung, muss die eingeführte Sequenz, weder die absolute Identität, noch die gesamte Länge, relativ zu entweder dem primären Transkriptionsprodukt oder zu der vollständig prozessierten mRNA aufweisen. Dies kann bevorzugt sein, um die gleichzeitige Produktion von einigen Pflanzen, die Überexprimierer sind, zu vermeiden. Eine höhere Identität in einer kürzeren als die Sequenz voller Länge, kann für eine längere, weniger identische Sequenz kompensieren. Weiters braucht die eingeführte Sequenz nicht dasselbe Intro- oder Exon-Muster aufweisen, und die Identität von nicht-kodierenden Segmenten wird gleichermaßen effektiv sein. Normalerweise, wird eine Sequenz mit einer Größe, wie oben vor die Antisense-Regulierung angegeben, verwendet.
Erst kürzlich wurde ein neues Verfahren zum Unterdrücken der Expression eines Zielgens entwickelt. Dieses Verfahren beinhaltet die Einführung eines gegenläufigen Wiederholungstransgens, das die Produktion von mRNAs leitet, die sich selbst zusammenlagern, um doppelsträngige (ds) RNA Strukturen zu bilden (Vionnet et al., 1998 Cell 95: 177–187; Waterhouse et al., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959–13964; Misquitta et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1451–1456; Baulcombe, 1999 Current Opinion Plant Biol. 2: 109–113; Sharp, 1999 Genes and Develop. 13: 139–141). Die ds RNA Moleküle interferieren, in einer nicht verstandenen Art und Weise, mit der post-transkriptionalen Expression von endogenen Genen, die zu der dsRNA homolog sind. Es ist gezeigt wurde, dass der Bereich der dsRNA Homologie einen Bereich enthalten muss, der zu einem Exonbereich des Zielgens homolog ist. Somit kann die dsRNA Sequenzen enthalten, die zu den nicht-kodierenden Abschnitten des Zielgens homolog sind. Alternativ kann Gen-unterdrückende dsRNA durch Transformieren einer Zelle mit zwei verschiedenen Transgenen hergestellt werden, wobei ein Gen eine Sense RNA und das andere Gen eine komplementäre Antisense RNA exprimiert.
Ein Konstrukt, das eine transkribierte gegenläufige Wiederholungssequenz eines Zielgens enthält, kann zum Beispiel, durch folgende Anleitung hergestellt werden, die von Waterhouse et al. (1998), supra, bereitgestellt wurde. Der gegenläufige Wiederholungsteil des Konstrukts weist etwa 200 bis 1500 bp der transkribierten DNA, die in einer Kopf-zu-Kopf oder Schwanz-zu-Schwanz Anordung wiederholt ist, auf. Die Wiederholungen sind durch 200 bis 1500 bp nicht-wiederholender DNA getrennt, die ebenfalls Teil des transkribierten Bereichs des Zielgenes sein können, oder können von einem unterschiedlichen Gen stammen, oder enthalten vielleicht ein Intron. Ein geeignetes gegenläufiges Wiederholungs-Konstrukt kann hergestellt werden, durch Verbinden in der folgenden Reihenfolge: eine pflanzlichen Promotor; eine 3' Region der Ziel cDNA, die in der „Sense" Orientierung orientiert ist; eine 5' Region der Ziel cDNA; die selbe 3' Region der Ziel cDNA kodierenden Sequenz, jedoch in der „Antisense" Orientierung orientiert; und schließlich ein PolyA-Additionssignal. Die transkribierte RNA, die aus der Einführung des gegenläufigen Wiederholungstransgens in eine Zielpflanze resultiert, wird das Potential haben, eine interne dsRNA Region zu bilden, die Sequenzen des Zielgens enthalten, die es zu unterdrücken gilt. Die dsRNA Sequenzen sind so ausgewählt, dass sie einzelne, oder vielleicht mehrere Zielgene unterdrücken. In einigen Fällen, können die Sequenzen mit dem Potential der dsRNA Bildung, von zwei oder mehreren verwandten Zielgenen (z. B., Mitglieder einer Genfamilie) abstammen.
Eine zusätzliche Strategie, die für die Unterdrückung der Zielgenaktivität geeignet ist, verursacht die Sense-Expression einer mutierten oder teilweise deletierten Form des Proteins, welches durch das Zielgen kodiert ist, gemäß den allgemeinen Kriterien für die Herstellung von dominant negativen Mutationen (Herskowitz I, nature 329: 219–222 (1987)). Beispiele von Strategien, die dominant negative Mutationen erzeugen, werden zur Verfügung gestellt (Mizukami, 1996; Emmler, 1995; Sheen, 1998; und Paz-Ares, 1990).
Die Wildtyp Zielgenfunktion kann ebenfalls mittels DNA Regionen eliminiert oder abgeschwächt werden, die das Zielgen flankieren, um eine insertionale Unterbrechung der Zielgen kodierenden Sequenz zu vermitteln (Miao et al., 1995, Plant J. 7: 359–365; Kempin et al., 1997 Nature 389: 802–803). Der gezielte Genaustausch wird durch homologe Rekombination zwischen Sequenzen in einem Transformationsvektor, der DNA-Regionen enthält, die das Zielgen und die entsprechenden chromosomalen Sequenzen flankieren, vermittelt. Ein selektierbarer Marker, wie Kanamycin, bar oder pat, oder ein screenbarer Marker, wie beta-Glucuronidase (GUS), ist zwischen den Zielgen-flankierenden Regionen enthalten. Diese Marker fördern die Identifikation von Zellen, die einen Zielgenaustausch durchgemacht haben.
Die folgenden Beispiele illustrieren lediglich die beste Art für das Ausführen der Erfindung, wie sie derzeit beabsichtigt ist, sollten aber nicht dahin ausgelegt werden, dass sie die Erfindung limitieren.
Beispiel 1
Isolieren eines cDNA Moleküls, das eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase aus Pfefferminze (Mentha peperita) kodiert.
Eine cDNA Bibliothek wurde von mRNA, aus isolierten Pfefferminz-Öldrüsen-sekretierenden Zellen, einer für die essentielle Ölbiosysnthese hoch spezialisierte Zellart, hergestellt (Lange, B. M., and Croteau, R. (1999) Curr. Opin. Plant Biol 2: 139–144 (1999)). PCR Primer wurden basierend auf wahrscheinlich konservierten Regionen des Reduktoisomerase-Gens, entworfen (P1, 5'CGAGATTATGCCAGGAGAGC-3' (SEQ ID Nr. 3); P2, 5'-GGCTTCAGGCAAACCCTTG-3' (SEQ ID NR. 4) und dazu verwendet, um mit der Pfefferminz-Öldrüsen Bibliothek cDNA als Matrize ein, als pMPDXR1 (SEQ ID Nr. 5) bezeichnetes 223 bp Fragment, welches eine signifikante Homologie mit dem E. coli Reduktoisomerase Gen aufweist, zu amplifizieren. Es wurden fünf Klone voller Länge durch Durchsuchen der Pfefferminz-Öldrüsen-cDNA-Bibliothek (2,5 × 10⁴ Plaques) mit einer markierten Sonde, die vom pMPDXR1 (SEQ ID Nr. 5) abgeleitet ist, erhalten, einschließlich des cDNA-Moleküls mit der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz.
Beispiel 2
Isolierung eines cDNA Moleküls, welches eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase aus Arabidopsis thaliana kodiert.
2 × 10⁴ Plaques der A. thaliana Blütenknospen cDNA Bibliothek (CD4-6 von der Arabidopsis Biological Resouce Center (http://aims.cps.msu.edu/aims/)) wurden mit pMPDXR1 (SEQ ID Nr. 5) durchsucht und ergab 20 positive Klone, wie das cDNA Molekül mit der in SEQ ID Nr. 6 dargelegten Sequenz, von denen alle am 5' etwas verkürzt waren. Die Bedingungen für das Durchsuchen der A. thaliana Blütenknospen cDNA Bibliothek waren: Hybridisierung in 5 × SSC bei 65°C für 16 Stunden, gefolgt von zwei Waschungen in 2 × SSC bei Raumtemperatur für 20 Minuten pro Waschung, dann eine Waschung in 1 × SSC bei 55°C für 30 Minuten.
Beispiel 3
Funktionale Expression der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase aus Pfefferminz (Mentha piperita) und E. coli
Es wurde ein zusätzlicher Primersatz (P3, 5'-GTCTCAACTCTGGAAGCTTTATGAAGCAACTCTCAC-3' (SEQ ID Nr. 8) und P4, 5'-CTCTGTAGCCGGACCTAGGTCAGCTTGCGAGAC-3' (SEQ ID Nr. 9)) wurde verwendet um ein E. coli Reduktoisomerase-Gen voller Länge zu amplifizieren, und das resultierende Amplicon wurde in den pBluescript KS(–), als positive Kontrolle in der funktionalen Expression des Enzyms, eingefügt.
Die Pfefferminz 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase cDNA voller Länge (als pMPDXR18 (SEQ ID Nr. 1) bezeichnet) und der E. coli Reduktoisomerase Klon (pECDXR20) wurden durch die Expression in E. coli auf die Fähigkeit, die Umordnung und Pyridin Nukleotid-abhängige Reduktion von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat zu 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-phosphat zu katalysieren, evaluiert.
2 zeigt die GC-MS Analyse von (A) das Trimethylsilylether Derivat des dephosphorylierten biosynthetischen Produktes (R _t = 7,1 ± 0,1 min), welches durch die rekombinante Pfefferminz 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase (SEQ ID Nr. 2) erzeugt wurde, und (B) das Trimethylsilylether Derivat des authentischen 2-C-Methyl-D,L-Erythritols (R _t = 7,1 ± 0,1 min), welches identisch zubereitet wurde. Die kleine Abweichung in der relativen Intensität der Ionen in dem m/z 116, 131, 147 Cluster im Spektrum A ist aufgrund der Hintergrundsubstraktion von Kontaminanten im Falle der biosynthetischen Produkte, für welche die gesamte Ionenabundanz zehnfach geringer war als für den Standard (B). Für die Enzym-Zubereitung wurden transformierte E. coli Zellen bis auf A₆₀₀ von 0,5 bei 37°C in 50 ml Luria-Bertani Medium, welches mit geeigneten Antibiotika supplementiert ist, gezüchtet. Die Pfefferminz 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase cDNA enthaltende Zellen (SEQ ID Nr. 1) wurden dann für 2 Stunden bei 20°C inkubiert, mit 0,1 mM IPTG induziert, und für 15 Stunden bei 20°C gehalten. Zellen, die die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase aus E. coli kodierende Nukleinssäuresequenz enthielten, wurden ähnlicherweise induziert, jedoch mit 1 mM IPTG, und bei 37°C für 5 Stunden gehalten. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 1 ml Untersuchungspuffer (0,1 M Tris/HCl (pH 7,5), 2 mM MnCl₂ und 0,5 mM NADPH enthaltend) gewaschen, in 1 ml Untersuchungspuffer resuspendiert, und dann durch kurze Sonication bei 0–4°C aufgebrochen. Die resultierenden Homogenate wurden zu Pellettrümmer zentrifugiert, und eine Aliquot (15 μl) jeder Zubereitung wurde mit 0,1 mmol [1-¹⁴C]Deoxyxylulosephosphat (18,5 kBq) für 10 min bei 23°C inkubiert. 50 μl 10 mM NaHCO₃ wurde zu den Reaktionsmischungen hinzugefügt, die Suspensionen durch Nanosep-Säulen (Pall Filtron; 30.000 kDa Ausschlussgrenze) filtriert, und die Filtrate wurden durch Modifikation einer etablierten Umkehrphasen-Ionenpaar-Radio-HPLC (McCaskill, D. und Croteau, R., Anal. Biochem. 215: 142–149 (1998)) unter Verwendung von 10 mM Tetrabutylammoniumacetat als Ionenpaarungsreagens analysiert. Die Enzymuntersuchungen aus beiden Quellen offenbarte das Vorhandensein eines neuen radiomarkierten Produkts bei R _t = 34,0 min, welches wie oben durch semipräparative HPLC isoliert wurde. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum, wurde das restliche Material in 50 μl 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer (pH 5,0), zu welchem 10 Einheiten saure Phosphatase aus Weizenkeim (Sigma) hinzugefügt wurden, aufgelöst, gefolgt von der Inkubation bei 23°C für 2 Stunden. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl Aceton gestoppt, gefolgt von Zentrifugation, Transfer des Überstandes und Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum. Das restliche Material wurde in 20 μl wasserfreiem Diethylether aufgelöst und wie vorher beschrieben in das Trimethylsilyl-Ether Derivat für die GC-MS Analyse umgewandelt (Lange, B. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2100–2104 (1998)). Die Massenspektra der von der rekombinanten Pfefferminz 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase (SEQ ID Nr. 2) und E. coli Reduktoisomerase stammenden Produkt waren identisch.
Die derivatisierten Produkte aus beide Quellen zeigten die gleiche Retentionszeit (7,1 ± 0,1 min). und Massenspektrum wie eine authentische Probe von 2-C-Methyl-D,L-Erythritol, welches identisch derivatisiert wurde (2B), wodurch die Identität der pflanzlichen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase (SEQ ID Nr. 2) bestätigt wurde und was darauf hindeutet, das das Pflanzenenyzm (SEQ ID Nr. 2) in der Preprotein-Form aktiv ist.
Die durch die Ketol-Säure-Reduktoisomerase katalysierte Reaktion, welche der durch die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase katalysierten Reaktion ähnelt, folgt einem geordneten Mechanismus, bei welchem NADPH und der Metallionen-Cofaktor zuerst binden, gefolgt von dem Acetohydroxysäure-Substrat (Chunduru, S. K. et al., Biochemistry 28, 486–493 (1989)). Da sowohl NADPH und Mangan (oder Magnesium) für die enzymatische Umwandlung von Deoxyxylulosephosphat zu Methylerythritolphosphat (es wurden keine zwischenprodukte, wie Methylerythrosephosphat, in der Gegenwart oder der Abwesenheit dieser Cofaktor beobachtet) erforderlich sind, kann ein ähnlicher Reaktionsmechanisums für die Deoxyxylulosephosphat-Reduktoisomerase postuliert werden.
Beispiel 4
Sequenzanalyse der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase aus Pfefferminz (Mentha peperita)
Die Pfefferminz 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase cDNA (SEQ ID Nr. 1) enthält einen offenen Leserahmen von 1425 bp, welcher ein Protein von 475 abgeleiteten Aminosäurenreste kodiert (SEQ ID Nr. 2). Die ersten 73 Aminosäuren zeigen typische Charakteristika von auf Ziele gerichteten plastidischen Sequenzen (von Heijne, G. et al., Eur. J. Biochem. 180, 535–545 (1989)), was mit der subzellulären Lokalisierung dieses Enzyms in Pflanzenplastiden, in welchen der Mevalonat-unabhängige Weg abläuft, übereinstimmt (Schwarz, M. K. (1994) Ph. D. Thesis, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich, Schwitzerland; Lichtenthaler, H. K., Schwender, J., Disch, A., and Rohmer, M. (1997) FEBS Lett. 400, 271–274). Wenn die Reste, die das mutmaßliche Transitpeptid definieren, ausgeschlossen werden, wird die Größe des reifen Enzyms auf etwa 43,5 kDa geschätzt. Die Ausrichtung von translatierten Sequenzen (gegebenenfalls ohne die plastidischen auf Ziele gerichteten Peptide) zeigt eine signifikante Homologie zwischen der Pfefferminz 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase (SEQ ID Nr. 2) und des mutmaßlichen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Fragments aus A. thaliana (SEQ ID Nr. 7) (88,0% Ähnlichkeit/84,2% Identität), sowie mit SLL0019 der Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 (72,3/63,7%), BG13409 aus Bacillus subtilis (56,9/45,5%), die Reduktoisomerase aus E. coli (53,4/43,0%), HI0807 aus Haemophilus influenzae (55,5/41,8%), Rv2870c aus Mycobacterium tuberculosis (52,8/43,6%), und HP0216 aus Helicobacter pylori (50,7/38,1%). Die Pfefferminz cDNA (SEQ ID Nr. 2) zeigt ebenfalls eine signifikante Homologie zu dem stark verkürzten, Arabidopsis cDNA Fragment unbekannter Funktion (SEQ ID Nr. 10), welches in der Genbank Datenbank unter der Zugangsnummer T43949 hinterlegt wurde, und zu dem Exonbereich eines Arabidopsis genomischen Klons unbekannter Funktion (SEQ ID Nr. 11), das in der Genbank Datenbank unter der Zugangsnummer AB009053 hinterlegt wurde. Es ist zu beachten, dass die SEQ ID Nr. 11 die Sequenz für den negativen (d. h. nicht-kodierenden) Strang des Arabidopsis genomischen Klon darlegt.
Obwohl der Reaktionsmechanismus der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase und der Keto-Säure Reduktoisomerase, welche die Umordnung und Reduktion von 2-Acetolacetat zu 2,3-Dihydroxyisovalerat und von 2-Aceto-2-Hydroxybutyrat zu 2,3-Dihydroxy-3-Methylvalerat in der Biosynthese von verzweigtkettigten Aminosäuren katalysiert (Mrachko, G. T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 294, 446–453 (1992)), eine gewisse Ähnlichkeit teilen, sind die abgeleiteten Aminosäuresequenzen dieser Enzyme deutlich verschieden (~35% Ähnlichkeit). Der N-Terminus der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Sequenzen enthält jedoch ein konserviertes Motiv (GSTGSIG) (SEQ ID Nr. 12), die eine gewisse Homologie zu der Signatursequenz der vorgeschlagenen NADPH Bindungsstelle der Ketol-Säure-Reduktoisomerase aufweist (GXGXXGXXXG) (SEQ ID Nr. 13) (Rane, M. J., und Calvo, K. C., Arch. Biochem. Biophys. 338, 83–89 (1997)).
Die Isolation der cDNAs, die sowohl die Deoxyxylulosephosphat Synthase (Lange, B. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2100–2104 (1998)) als auch der 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase (SEQ ID Nr. 1) aus Pfefferminz stellt einen bedeutenden Hinweis für die Funktion eines ähnlichen katalytischen Mechanismus in dem Pyruvat/Glyceraldehyd-3-phosphat Weg in Pflanzenplastiden und einigen Eubacteria bereit. Da dieser essentielle Weg in Pflanzen und Bakterien vorhanden ist, aber offensichtlich nicht in Tieren, sind sowohl die Synthase als auch die Reduktoisomerase Ziele für die Entwicklung neuer Klassen an hochspezifischen Herbiziden, Antimalaria (Jomaa, D. et al., Science, 285: 1573–1576 (1999) und Antibiotika (Kuzuyama, T. et al., Tetrahedron Lett. 39, 7913–7916 (1998)). Während Deoxyxylulosephosphat als Vorläufer für die Biosynthesis von Thiamin (Julliard, J. H., and Douce, R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2042–2045 (1991)) und wahrscheinlich Pyridoxol (Hill, R. E., et al., J. Biol. Chem. 271, 30426–30435 (1996)) in höheren Pflanzen, und auch Isopentenyldiphosphat (Mc Caskill, D., and Croteau, R., Tetrahedron Letts. 40, 653–656 (1999)) dient, katalysiert die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase die erste Schlüsselreaktion in der Umwandlung dieses häufigen Zwischenprodukts zu plastidischen Isoprenoiden, einschließlich Karotenoiden und die Prenyl-Seitenketten von Chlorophyll und Plastochinon (Bouvier, F. et al., Plant Physiol. 117, 1423–1431 (1998)). Es kann erwartet werden, dass diese spezifische Umwandlung ein regulierender (und potentiell geschwindigkeitslimitierender) Schritt in der Isoprenoid-Biosynthese in Plastiden sein wird.
Beispiel 5 Physikalische Eigenschaften der im Moment bevorzugten 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Proteine der gegenwärtigen Erfindung. Tabelle 1 legt die physikalischen Eigenschaften der im Moment bevorzugten 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-Proteine der gegenwärtigen Erfindung dar.
Beispiel 6
Hybridisierung eines Abschnitts der Pfefferminz (Mentha × piperita) 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase cDNA (SEQ ID Nr. 1) mit anderen Nukleinsäuresequenzen der gegenwärtigen Erfindung.
Der Abschnitt des Pfefferminz 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase cDNA Klons (SEQ ID Nr. 1), der sich vom Nukleotid 230 bis Nukleotid 1496 erstreckt, und sein komplementärer Nukleinsäurestrang wurde radiomarkiert und verwendet, um einen RNA Proben tragenden Filter zu sondieren, wobei die RNA Proben aus folgenden Pflanzen isoliert wurden: Arabidopsis thaliana Blattgewebe; Tomaten (Lycopersicon esculentum) Blattgewebe; Mais (Zea mays) Blattgewebe; und Nadeln der Riesentanne (Abies grandis). Die Hybridisierung und Waschung wurden unter Ausnutzung der Technik zum Hybridisieren radiomarkierter Nukleinsäuresonden mit auf Nitrozellulosefilter oder Neylonmembranen immobilisierten Nukleinsäuren durchgeführt, wie auf den Seiten 9.52 bis 9.55 von Molecular cloning, A Laboratory Manual (2nd Edition), J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis eds, wobei die zitierten Seiten durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind, beschrieben ist. Die Hybridisierung wurde in 3 × SSC bei 65°C für 16 Stunden, gefolgt von zwei Waschungen in 2 × SSC bei 23°C für 20 Minuten pro Waschung, gefolgt bei einer Waschung in 0,5 × SSC bei 55°C für 30 Minuten durchgeführt.
Eine einzelne mRNA Bande wurde in jeder RNA Probe in dem vorhergesagten 1,7 bis 2,0 kb Größenbereich nachgewiesen. Die vorhergesagte Größe der mRNAs entsprechend der klonierten Pfefferminz (SEQ ID Nr. 1) und Arabidopsis (SEQ ID Nr. 6) cDNA ist ungefähr 1,7 kb. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Sequenzen der mRNA Moleküle, welche die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase kodieren, in einer großen Vielfalt an phylogenetisch entfernten Pflanzenspezies hoch konserviert sind.
Während die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung illustriert und beschrieben wurde, wird es offensichtlich sein, das verschiedene Änderungen darin gemacht werden können, ohne den Geist und den Umfang der Erfindung zu verlassen.
Sequenzauflistung

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Bedingungen zu dem Nukleinsäuremolekül der SEQ ID Nr. 1 oder zu dem Komplement des Nukleinsäuremoleküls der SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, unter der Voraussetzung, dass das isolierte Nukleinsäuremolekül nicht aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 11 ausgewählt ist oder einer Nukleinsäuresequenz die komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 11 ausgewählt ist, wobei die stringenten Bedingungen 5 × SSC bei 65°C für 16 Stunden, zwei Waschungen in 2 × SSC bei 23°C für 15 Minuten pro Waschung, gefolgt von 2 Waschungen in 1 × SSC bei 60°C für 20 Minuten aufweisen, und wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül ein pflanzliches 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül ein essentielles Ölpflanzen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül ein Mentha 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül ein 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert, welches die in SEQ ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Isoliertes Ölpflanzen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein, welches durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 kodiert wird.
Isoliertes ätherisches Ölpflanzen 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein nach Anspruch 6.
Isoliertes Mentha 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein nach Anspruch 6.
Isoliertes Mentha 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein nach Anspruch 6, wobei das Protein die in SEQ ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Replizierbarer Vektor der ein erstes Nukleinsäuremolekül aufweist, dass unter stringenten Bedingungen an ein zweites Nukleinsäuremolekül, welches aus der in SEQ ID Nr. 1 dargelegeten Nukleinsäuresequenz besteht, oder an ein drittes Nukleinsäuremolekül, welches aus dem Komplement zu der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz besteht, hybridisiert, unter der Voraussetzung dass das erste Nukleinsäuremolekül nicht die Nukleinsäuresequenz die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 11 ausgewählt ist oder einer Nukleinsäuresequenz die komplementär zu der Nukleinsäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 11 ausgewählt ist, besteht, wobei die stringenten Bedingungen 5 × SSC bei 65°C für 16 Stunden, zwei Waschungen in 2 × SSC bei 23°C für 15 Minuten pro Waschung, gefolgt von zwei Waschungen in 1,0 × SSC bei 60°C für 20 Minuten aufweisen, und wobei das erste Nukleinsäuremolekül ein pflanzliches 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert.
Replizierbarer Vektor nach Anspruch 10, wobei das erste Nukleinsäuremolekül ein Mentha 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert.
Replizierbarer Vektor nach Anspruch 10, wobei das erste Nukleinsäuremolekül ein 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert, welches die in SEQ ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Replizierbarer Vektor nach Anspruch 10, wobei das erste Nukleinsäuremolekül die in SEQ ID Nr. 1 dargelegte Nukleinsäuresequenz oder das Komplement zu der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz aufweist.
Wirtszelle, welche den Vektor nach Anspruch 10 enthält.
Wirtszelle, welche den Vektor nach Anspruch 13 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 15, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren zum Erhöhen des Expressionsniveaus von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein in einer Wirtszelle welches das Einführen eines replizierbaren Expressionsvektors in die Wirtszelle aufweist, welcher das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, dass das 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert, beinhalted, unter Bedingungen welche die Expression des Proteins in der Wirtszelle ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Nukleinsäuremolekül, welches das 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert, unter stringenten Bedingungen an das Komplement zu dem Nukleinsäuremoleküls der SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen 5 × SSC bei 65°C für 16 Stunden, zwei Waschungen in 2 × SSC bei 23°C für 15 Minuten pro Waschung, gefolgt von zwei Waschungen in 1,0 × SSC bei 60°C für 20 Minuten aufweisen.
Verfahren zum Reduzieren des Expressionsniveaus von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein in einer Wirtszelle, welches das Einführen eines replizierbaren Expressionsvektors in die Wirtszelle aufweist, der ein Nukleinsäuremolekül, welches ein RNA Molekül exprimiert, enthält, welches unter stringenten Bedingungen an die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingung 5 × SSC bei 65°C für 16 Stunden, zwei Waschungen in 2 × SSC bei 23°C für 15 Minuten pro Waschung, gefolgt von zwei Waschungen in 1,0 × SSC bei 60°C für 20 Minuten aufweisen, wobei das Nukleinsäuremolekül ein pflanzliches 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reductoisomerase Protein kodiert.