DE60026152T2

DE60026152T2 - Verwendung von stearidonsäure zur herstellung eines arzneimittels für die behandlung oder vorbeugung von krebs

Info

Publication number: DE60026152T2
Application number: DE60026152T
Authority: DE
Inventors: Mark Kirkwood OBUKOWICZ; Ayman Creve Coeur KABAKIBI; Susan Hummert; M. Lisa Richmond Heights OLSEN; Julie El Ceritto LINDEMANN
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1999-09-10
Filing date: 2000-09-11
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2020-09-12
Also published as: DE60026152D1; JP2003508484A; EP1237545B1; AU7371600A; US20020010211A1; CA2384502A1; ATE318133T1; CA2384502C; US6340705B1; MXPA02002681A; WO2001017517A3; WO2001017517A2; EP1237545A2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines spezifischen Metaboliten von α-Linolensäure, nämlich Stearidonsäure, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Krebs, insbesondere Epithelzellkrebs, wie Kolonkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs und Prostatakrebs.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt zwei Typen von essentiellen Fettsäuren (EFAs), den n-3-Typ (oder ω-3-Typ), der von α-Linolensäure abgeleitet ist, und den n-6-Typ (oder ω-6-Typ), der von Linolsäure abgeleitet ist. Die mehrfach ungesättigten Ausgangsfettsäuren (PUFAs) dieser Stoffwechselwege (d.h. α-Linolensäure und Linolsäure) können im Körper nicht produziert werden und müssen daher aus der Nahrung erhalten werden. Die Entsättigungs- und Verlängerungswege für die n-3-, n-6- und n-9-PUFAs sind im Folgenden gezeigt.
Ein wichtiger Faktor, der beweist, dass Nahrungsfette eine erhebliche Wirkung auf die Entstehung von Tumoren haben können, sind Daten, die vermuten lassen, dass der Typ des Fettes in der Nahrung bei der Vermittlung der Tumorförderung vielleicht genauso wichtig ist wie die Fettmenge. In dieser Hinsicht wurde auf PUFAs große Aufmerksamkeit gerichtet. Die genauen Mechanismen, die für die Wirkungen von PUFAs verantwortlich sind, sind zwar unbekannt, doch wurde vorgeschlagen, dass PUFA-Wirkungen durch Arachidonsäure vermittelt werden, möglicherweise über Prostaglandine, HETEs und Leukotriene.
Es ist schon lange bekannt, dass n-3-PUFAs in der Nahrung sehr effektiv den Arachidonsäuregehalt im Gewebe senken und dass die langkettigen n-3-PUFAs effektiver sind als α-Linolensäure, Whelan, J., Broughton, K. S. und Kinsella, J. E., Lipids, Vol. 26, 119–126 (1991); Hwang, D. H., Boudreau, M. und Chanmugan, P., J. Nutra., Vol. 118, 427–437 (1988). Außerdem wird berichtet, dass Nahrung, die n-3-PUFAs enthält, insbesondere solche, die man in Fischölen findet (d.h. Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA)), die Tumorbildung und -förderung reduzieren und die Aufnahme von n-3-PUFA negativ mit chemisch induzierter Tumorentstehung korreliert, Braden, L. M. und Carroll, K. K., Lipids 21: 285–288, 1986; Reddy, B. und Maruyama, H., Cancer Res. 46: 3367–3370, 1986; Minoura, T., Takata, T., Sakaguchi, M., Takada, H., Yamamura, M., Hicki, K. und Yamamoto, J., Cancer Res. 48: 4790–4794, 1988; Nelson, R. L., Tanure, J. C., Andrianopoulos, G., Sourza, G. und Lands, W. E. M., Nutr. Cancer 11: 215–220, 1988; Reddy, B. und Sugie, S., Cancer Res., 48: 6642–6647, 1988.
Der Arachidonsäuregehalt im Gewebe korreliert mit der Eicosanoid-Biosynthese, Li, B. Y., Birdwell, C. und Whelan, J., J. Lipid Res., Vol. 35, 1869–1877 (1994). Die Eicosapentaensäurekonzentrationen in Phospholipiden der Kolonschleimhaut sind negativ mit Indices der Zellproliferation assoziiert, Lee, D.–Y. K., Lupton, J. R., Aukema, H. M. und Chapkin, R. S., J. Nutr., Vol. 123, 1808–1917 (1993). Umgekehrt ist der Arachidonsäuregehalt in Phospholipiden der Kolonschleimhaut mit höheren Indices der Zellproliferation assoziiert, Lee, D.–Y. K., Lupton, J. R., Aukema, H. M. und Chapkin, R. S., J. Nutr., Vol. 123, 1808–1917 (1993).
Vor kurzem zeigten Paulson et al., dass ein von Fischöl abgeleitetes Konzentrat von Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) die Bildung und das Wachstum von Darmpolypen bei Δ716-Apc-Knockout-Min/+–Mäusen senkte, Carcinogenesis, Vol. 18, 1905–1910 (1997). Ähnlich zeigten Oshima et al., dass DHA-Ethylester in der Nahrung die Entwicklung von Darmpolypen bei Δ716-Apc-Knockout-Min/+-Mäusen reduzierte, Carcinogenesis, Vol. 16, 2605–2607 (1995), Moser, A. R., Luongo, C., Gould, K A., McNeley, M. K., Shoemaker, A. R., Dove, W. F., Eur. J. Cancer, 31A(7–8), 1061–1064 (1995).
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 440 307 A2 offenbart Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Brustkrebs. Die offenbarten Zusammensetzungen enthalten einen oder mehrere Metaboliten von α-Linolensäure und einen oder mehrere Metaboliten von Linolsäure.
Die Internationale Anmeldung Nr. 97/39749 beschreibt Verfahren zur Prävention und Behandlung von Kachexie und Anorexie. Es heißt, Kachexie und Anorexie seien häufige Zustände unter Krebspatienten, deren Krankheiten bis zum metastasierenden Krebs fortgeschritten sind. Die offenbarten Verfahren beinhalten die Verabreichung eines Ölgemischs, das n-6- und n-3-Fettsäuren, eine Quelle für Aminostickstoff, die verzweigte Aminosäure umfasst, und eine Antioxidanskomponente enthält, an ein Individuum.
Das US-Patent Nr. 5,886,037 offenbart Nahrungszusammensetzungen zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten, die mit dem metabolischen Syndrom (Syndrom X) assoziiert sein können; dazu gehören Hyperlipoproteinämie, Fettsucht, Hyperuricämie, Bluthochdruck, Fettleber, Diabetes Typ II, Insulinresistenz und atherosklerotische Gefäßkrankheit. Die offenbarten Zusammensetzungen enthalten mittelkettige Fettsäuren und mehrfach ungesättigte langkettige n-3-Fettsäuren.
Das US-Patent Nr. 5,158,975 beschreibt die Verwendung von Stearidonsäure für die Prävention und Behandlung von Entzündungsbedingungen einschließlich allergischer Störungen, Hautstörungen, rheumatischer Störungen und solcher, die auf Trauma, Schock und Pathologien folgen. Stearidonsäure (SDA) und ihre Metaboliten EPA und DNA sollen die Biosynthese von Leukotrienen hemmen, die an dem Entzündungsvorgang beteiligt sind.
Das US-Patent Nr. 5,562,913 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von Defiziten von essentiellen n-6- oder n-3-Fettsäuren bei Rauchern. Das Verfahren beinhaltet die Verabreichung einer Zubereitung, die eine essentielle n-6-Fettsäure, eine essentielle n-3-Fettsäure oder ein Gemisch von n-6- und n-3-Fettsäuren enthält, an den Raucher.
US 4,681,896 beschreibt die Verwendung eines Gemischs von Metaboliten von Linolsäure und Metaboliten von Linolensäure bei der Behandlung von atopischen Störungen.
EP-A-0 585 057 beschreibt ein Verfahren zur sicheren intravenösen Verabreichung von Fettsäuren in Form ihrer Lithiumsalze zur Behandlung von viralen Infektionen und Krebs.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Metaboliten von α-Linolensäure, bei dem es sich um Stearidonsäure (18:4 n-3) oder ein Lipid, Carboxylatsalz, einen Ester, ein Triglycerid, Amid oder ein anderes pharmakologisch annehmbares Carbonsäurederivat derselben handelt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Krebs bei einem Säuger, wobei der Metabolit der einzige Wirkstoff des Medikaments ist.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Rate der Aufnahme von radioaktiv markiertem ALA, SDA und EPA in HepG2-Zellen.
2 zeigt die Rate des Stoffwechsels von radioaktiv markiertem ALA zu Metaboliten von langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren in HepG2-Zellen.
3 zeigt die Rate des Stoffwechsels von radioaktiv markiertem SDA zu Metaboliten von langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren in HepG2-Zellen.
4 zeigt die Rate des Stoffwechsels von radioaktiv markiertem ALA und SDA zu EPA in HepG2-Zellen.
5 zeigt die Rate des Stoffwechsels von radioaktiv markiertem ALA, SDA und EPA zu DHA in HepG2-Zellen.
6 zeigt die Umwandlung von radioaktiv markiertem ALA, SDA und EPA in Metaboliten von langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren in der Mäuseleber.
7 zeigt die Umwandlung von radioaktiv markiertem ALA, SDA und EPA in Metaboliten von langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren in der Mäuseleber, korrigiert in Bezug auf die Rückgewinnung von radioaktiv markierter Fettsäure aus Lebergewebe.
8 zeigt die Gesamtmenge der langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren, die sich in Mäuseleber nach Fütterung mit der US17-Nahrung, die steigende Mengen an ALA, SDA, EPA oder DHA in der Ethylesterform enthält, akkumuliert haben.
9 zeigt die Gesamtmenge der langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren, die sich in Rattenleber nach Fütterung mit der US17-Nahrung, die steigende Mengen an ALA, SDA, EPA oder DHA in der Ethylesterform enthält, akkumuliert haben.
10 zeigt die Wirkungen von ALA, SDA, EPA und DHA, die als Ethylester gefüttert wurden, auf die Zahl und Größe von Darmpolypen im Min/+-Mausmodell von Darmkrebs.
11 zeigt die Wirkungen von ALA, SDA, EPA und DHA, die als Ethylester gefüttert wurden, auf den Arachidonsäuregehalt in der Phospholipidfraktion (PL) des Mausdünndarms.
12 zeigt die Wirkung von SDA, das als Ethylester gefüttert wurde, auf das Wachstum primärer Tumoren im Nacktmaus/HT-29-Krebsmodell.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der hier verwendete Ausdruck "Behandlung" beinhaltet die partielle oder totale Hemmung des Wachstums, der Ausbreitung oder Metastasierung von gutartigen Tumoren, krebsartigen Tumoren und Polypen sowie die partielle oder totale Vernichtung von Tumor- und Polypenzellen. Der Ausdruck "Prävention" beinhaltet entweder die Verhinderung des Einsetzens klinisch evidenter Tumoren oder Polypen überhaupt oder die Verhinderung des Einsetzens eines präklinisch evidenten Stadiums der Tumor- oder Polypenentwicklung bei gefährdeten Individuen. Der Ausdruck "Prävention" beinhaltet auch die Verhinderung der Initiierung von malignen Zellen oder das Aufhalten oder Umkehren des Fortschritts von prämalignen Zellen zu malignen Zellen. Dazu gehören solche, bei denen die Gefahr besteht, Tumoren und/oder Polypen zu entwickeln.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass die Verabreichung von Stearidonsäure (SDA; 18:4 n-3) an Säuger die Gewebekonzentrationen an Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) bei den Säugern auf ein höheres Niveau anhebt als die Verabreichung einer äquivalenten Menge an α-Linolensäure (ALA; 18:3 n-3). Außerdem haben die Erfinder herausgefunden, dass SDA mit einer Geschwindigkeit und Effizienz in EP und DHA umgewandelt wird, die die Verwendung von SDA als Vorläufer von EPA und DHA für die Behandlung oder Prävention von Krebs erlaubt. Die Erfinder haben auch überraschenderweise herausgefunden, dass SDA in der Nahrung die Entstehung von Tumoren im Dickdarm noch effektiver hemmen kann als EPA und DHA in der Nahrung.
Außerdem macht man sich bei der Verabreichung von SDA anstelle von EPA und/oder DHA an einen Patienten die "physiologische Kanalisierung" zu Nutze, bei der der Stoffwechsel von SDA zu EPA und DHA letztlich durch den Fettsäuremetabolismus des Körpers gesteuert wird, was zu einer optimalen Verteilung der Lipidreservoirs führt, die die Entstehung von Tumoren beeinflussen (z.B. durch Konkurrenz mit dem Arachidonsäure-Stoffwechsel). Diese Stoffwechselsteuerung kann zu einer wirksameren Verteilung von EPA und DHA führen, als die direkte Verabreichung von EPA und/oder DHA ergibt. Da SDA außerdem eine kleinere Kettenlänge und weniger ungesättigte Bindungen hat als EPA und DHA, kann SDA wünschenswertere organoleptische Eigenschaften aufweisen als EPA oder DHA. Folglich kann SDA bei mehreren Anwendungen, zu denen zum Beispiel funktionelle Nahrungsmittel oder Nahrungsergänzungen gehören, als besonders attraktiver Ersatz für EPA und DHA dienen.
Zu den Krebserkrankungen, die mit dem Medikament dieser Erfindung behandelt oder verhindert werden können, gehört Epithelzellkrebs, wie Kolonkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs und Lungenkrebs. Weitere Krebserkrankungen, die mit dem Verfahren dieser Erfindung behandelt oder verhindert werden können, sind Hirnkrebs, Knochenkrebs, Adenokarzinom, gastrointestinale Krebserkrankungen, wie Lippenkrebs, Mundkrebs, Speiseröhrenkrebs, Dünndarmkrebs und Magenkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Eierstockkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Nierenzellkarzinom und Hautkrebs, wie Plattenepithel- und Basalzellenkarzinom.
Wenn es an einen Säuger verabreicht wird, kann SDA in jeder biologisch aktiven Form vorliegen. Zum Beispiel kann SDA in der Carbonsäureform vorliegen oder kann stattdessen in Form eines Lipids, eines Carboxylatsalzes, eines Esters, eines Amids oder eines anderen pharmakologisch annehmbaren Carbonsäurederivats vorliegen.
Das Medikament mit dem Metabolit von α-Linolensäure kann in Form eines pharmazeutischen, Nahrungs- oder Lebensmittelpräparats vorliegen. Der Fachmann auf dem Gebiet der Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen kann pharmazeutische Zusammensetzungen mit dem Metaboliten von α-Linolensäure leicht unter Verwendung bekannter Trägersubstanzen (z.B. Kochsalzlösung, Glucose, Stärke) zubereiten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können gemäß der gewünschten Verabreichungsmethode zubereitet werden. Zum Beispiel können pharmazeutische Zubereitungen, die den Metaboliten von α-Linolensäure enthalten, für die orale, enterale, parenterale oder rektale Verabreichung zubereitet werden.
Ähnlich kann der Fachmann auf dem Gebiet der Herstellung von Nahrungszubereitungen (z.B. Nahrungsergänzungen) leicht Nahrungszusammensetzungen mit dem Metaboliten von α-Linolensäure zubereiten. Und der Fachmann auf dem Gebiet der Herstellung von Lebensmittel- oder Lebensmittelbestandteilzubereitungen kann leicht Lebensmittelzusammensetzungen oder Lebensmittelbestandteilzusammensetzungen mit dem Metaboliten von α-Linolensäure zubereiten.
Die Dosierung hängt von dem besonderen verabreichten Metaboliten von α-Linolensäure und der gewünschten therapeutischen oder prophylaktischen Wirkung ab. Typischerweise liegt die verabreichte Menge des Metaboliten von α-Linolensäure zwischen etwa 1 mg/kg/Tag und etwa 300 mg/kg/Tag. Vorzugsweise liegt die verabreichte Menge des Metaboliten zwischen etwa 10 mg/kg/Tag und etwa 150 mg/kg/Tag. Die gewünschte Dosis kann so verabreicht werden, wie es am wirksamsten ist, im Allgemeinen in 1–5 Dosen pro Tag, wünschenswerterweise in 1–3 Dosen pro Tag.
Die folgenden Beispiele sollen bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen. Die n-3-PUFAs, die in allen folgenden Beispielen verwendet wurden, lagen in Form der freien Säure vor (100% rein), wenn sie in Zellkultur verwendet wurden, und lagen in der Ethylesterform vor (> 85% rein), wenn sie in vivo verabreicht wurden. Die Ethylester von Stearidonsäure (SDA-EE), Eicosapentaensäure (EPA-EE) und Docosahexaensäure (DHA-EE) stammten aus Fischöl und wurden von KD Pharma (Bexbach, Deutschland) erhalten. Der Ethylester von Stearidonsäure wurde von Callanish, Ltd. (Schottland, UK) weiter gereinigt, so dass der SDA-EE-Gehalt von ungefähr 60% auf 85% erhöht und auch der EPA-EE-Gehalt von ungefähr 8% auf 0,2% gesenkt wurde. Die Ethylester von α-Linolensäure (ALA-EE) und γ-Linolensäure (GLA-EE), die aus Pflanzenölen stammten, waren zu wenigstens 95% rein und wurden von Callanish, Ltd. bezogen. Die Verabreichung der Fettsäureethylester bei Nagetieren wurde durch kalorische Äquivalenz allometrisch skaliert, um die pro Tag konsumierte humanäquivalente Fettsäuremenge widerzuspiegeln (= g/Tag humanäquivalente Dosis).
Beispiel 1
Die US17-Nahrung
Um die Wirkungen von PUFAs auf die Bildung und Förderung von Kolontumoren bei Nagetieren zu untersuchen, wurde eine Nahrung (die "US17-Nahrung") entworfen, die die menschliche westliche Nahrung nachahmen sollte. Die menschliche westliche Nahrung enthält hohe Mengen an gesättigten Fettsäuren und Linolsäure, die beide mit der Krebsbildung in Zusammenhang gebracht wurden. Die Komponenten der US17-Nahrung sind in den folgenden Tabellen 1–6 dargelegt.
Tabelle 1. Bestandteile der US17-Nahrung
Tabelle 2. Salzgemisch der US17-Nahrung
Tabelle 3. Vitamingemisch der US17-Nahrung
Tabelle 4. Fettsäuregehalt der US17-Nahrung
Tabelle 5. Nährstoffgehalt der US17-Nahrung
Tabelle 6. Vergleich zwischen Nagetier-US17-Nahrung und menschlicher westlicher Nahrung
Das Fettsäure-Testmittel wurde anstelle von Oleinsäure (= Oleinsäurecassette) verwendet, und die Dosis lag bei allometrischer Skalierung in dem Bereich, den Menschen leicht konsumieren können (d.h. 0,1 bis 10 g/Tag).
Beispiel 2
Aufnahme von ¹⁴C-ALA, ¹⁴C-SDA und ¹⁴C-EPA durch HepG2-Zellen Die Aufnahme von Stearidonsäure durch HepG2-Zellen wurde mit derjenigen von α-Linolensäure und Eicosapentaensäure verglichen.
Zu einem Kulturmedium, das HepG2-Zellen enthielt, wurden 20 μM ¹⁴C-ALA, ¹⁴C-SDA oder ¹⁴C-EPA, komplexiert an fettsäurefreies BSA, gegeben. Die von den HepG2-Zellen aufgenommene Menge an ¹⁴C-ALA, ¹⁴C-SDA oder ¹⁴C-EPA wurde 6 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Zugabe der Fettsäure gemessen. Ein Szintillationszähler wurde verwendet, um die Gesamtmenge der Radioaktivität in den HepG2-Zellen und die im Medium verbleibende Menge zu messen.
Die Ergebnisse dieser Messungen sind in 1 gezeigt. Wie in 1 zu erkennen ist, wurden ¹⁴C-ALA, ¹⁴C-SDA und ¹⁴C-EPA gleichermaßen durch HepG2-Zellen aufgenommen. Ungefähr 95% jeder radioaktiv markierten Fettsäure wurde von den Zellen innerhalb der ersten sechs Stunden der Inkubation aufgenommen.
Beispiel 3
Stoffwechsel von Stearidonsäure zu langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren in HepG2-Zellen
Der Stoffwechsel von Stearidonsäure zu langkettigen n-3-PUFAs (Eicosatetraensäure (20:4 n-3), Eicosapentaensäure (20:5 n-3), Docosapentaensäure (22:5 n-3) und Docosahexaensäure (22:6 n-3) in HepG2-Zellen wurde mit dem von α-Linolensäure verglichen.
Man ließ HepG2-Zellen ¹⁴C-ALA oder ¹⁴C-SDA aufnehmen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die in den HepG2-Zellen vorhandene Gesamtmenge an ¹⁴C-EPA, ¹⁴C-DPA und ¹⁴C-DHA wurde 6 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Zugabe der Fettsäure durch Dünnschichtchromatographie (DC) mit Versilberung gemessen. Die Menge jeder Fettsäure, die als Bande auf der DC-Platte vorhanden war, wurde durch elektronische Autoradiographie unter Verwendung eines Instant Imager von Packard (Meriden, CT) quantifiziert.
Die Ergebnisse dieser Messungen sind in den 2 und 3 gezeigt. 2 zeigt den Stoffwechsel von ALA zu langkettigen n-3-PUFAs. 3 zeigt den Stoffwechsel von SDA zu langkettigen n-3-PUFAs. Ein Vergleich von 2 mit 3 zeigt, dass der Stoffwechsel von SDA in Hep2G-Zellen zu langkettigen n-3-PUFAs schneller erfolgt als der von ALA. Fast 95% des ¹⁴C-SDA wurden zu ¹⁴C-Fettsäure-Endprodukten (d.h. EPA oder DHA) oder ¹⁴C-Fettsäure-Zwischenstufen (d.h. 20:4 n-3, 22:5 n-3 und 24:5 n-3) metabolisiert. ¹⁴C-SDA wurde effizienter als ¹⁴C-ALA zu ¹⁴C-EPA metabolisiert (55% gegenüber 24%).
Beispiel 4
Stoffwechsel von Stearidonsäure zu EPA und DHA in HepG2-Zellen
Der Stoffwechsel von Stearidonsäure zu Eicosapentaensäure (20:5 n-3) und Docosahexaensäure (22:6 n-3) in HepG2-Zellen wurde mit dem von α-Linolensäure verglichen.
Man ließ HepG2-Zellen ¹⁴C-ALA, ¹⁴C-SDA oder ¹⁴C-EPA aufnehmen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die in den HepG2-Zellen vorhandene Menge an ¹⁴C-EPA und ¹⁴C-DHA wurde 6 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Zugabe der Fettsäuren durch Dünnschichtchromatographie (DC) mit Versilberung gemessen, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Menge an ¹⁴C-EPA und ¹⁴C-DHA, die als Banden auf der DC-Platte vorhanden waren, wurde durch elektronische Autoradiographie unter Verwendung eines Instant Imager quantifiziert, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist.
Die Ergebnisse dieser Messungen sind in den 4 und 5 gezeigt. 4 zeigt den Stoffwechsel von radioaktiv markiertem ALA und SDA zu EPA. Radioaktiv markiertes EPA wurde als Kontrolle mitverwendet, um seine Aufrechterhaltung in HepG2-Zellen im Laufe der Zeit zu bewerten. 5 zeigt den Stoffwechsel von radioaktiv markiertem ALA, SDA und EPA zu DHA. 4 zeigt, dass SDA effizienter als ALA zu EPA metabolisiert wurde (55% gegenüber 24%). Die Menge des von SDA abgeleiteten EPA war tatsächlich ganz ähnlich wie die Menge des EPA, die nach der Inkubation mit EPA selbst zurückblieb (55% gegenüber 63%). 5 zeigt, dass SDA effizienter als ALA zu DHA metabolisiert wurde (6% gegenüber 3%). Zum Vergleich wurden ungefähr 11% EPA zu DHA metabolisiert. Alles in allem zeigten die Ergebnisse, dass SDA mit einer Geschwindigkeit, die ungefähr doppelt so groß war wie bei ALA, zu EPA und weiter zu DHA metabolisiert wurde.
Beispiel 5
Stoffwechsel von Stearidonsäure bei Mäusen (Analyse des Zeitverlaufs unter Verwendung von radioaktiv markierten Fettsäuren)
Der Stoffwechsel von Stearidonsäure zu langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren (d.h. Eicosapentaensäure (EPA), Docosapentaensäure (DPA n-3) und Docosahexaensäure (DHA) in Mäuseleber wurde mit dem von α-Linolensäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure verglichen. Das verwendete Verfahren war eine Studie des Zeitverlaufs unter Verwendung von ¹⁴C-markierten Fettsäuren.
Mäuse wurden einen Monat lang mit der US17-Nahrung gefüttert, um einen stationären Zustand des Fettsäurestoffwechsels zu erreichen. Nachdem der stationäre Zustand des Fettsäurestoffwechsels erreicht wurde, wurde den Mäusen eine intraperitoneale Injektion verabreicht, die 10 μCi ¹⁴C-ALA, ¹⁴C-SDA, ¹⁴C-EPA oder ¹⁴C-DHA enthielt. Die Mäuse wurden 3 Stunden, 8 Stunden oder 24 Stunden nach der Injektion getötet, und die Gesamtmenge an ¹⁴C-EPA, ¹⁴C-DPA n-3 und ¹⁴C-DHA wurde durch Dünnschichtchromatographie mit Versilberung und anschließende direkte elektronische Autoradiographie gemessen, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 6 gezeigt. 6 zeigt die Reihenfolge des Stoffwechsels der PUFAs nach 24 Stunden als DHA = EPA > SDA > ALA. Dieser Unterschied in den Stoffwechselgeschwindigkeiten war besonders vergrößert, wenn die Umwandlung von EPA + DPA + DHA an ¹⁴C-Zählereignisse angepasst wurde, die aus Lebergewebe zurückgewonnen wurden. Bei ALA war die Rückgewinnung merklich geringer, höchstwahrscheinlich aufgrund der Neigung von ALA zur beta-Oxidation. Diese Anpassung ist in 7 gezeigt, die weiterhin zeigt, dass SDA in vivo effizienter als ALA zu langkettigen n-3-PUFAs metabolisiert wird.
Beispiel 6
Stoffwechsel von Stearidonsäure bei Mäusen
(Endpunktanalyse unter Verwendung von kalten Fettsäureethylestern)
Der Stoffwechsel von n-6- und n-3-PUFAs bei Ratten und Mäusen ist demjenigen von Menschen ähnlich, Lands, W. E. M., Morris, A., Libelt, B., Lipids, Vol. 25(9), 5. 505–516 (1990). Daher würde man vorhersagen, dass Ergebnisse des Fettsäurestoffwechsels aus Studien mit Ratten und Mäusen bei Menschen ähnlich sind.
Der Stoffwechsel von Stearidonsäure zu langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren (d.h. Eicosapentaensäure (EPA), Docosapentaensäure (DPA n-3) und Docosahexaensäure (DNA) in Mäuseleber wurde mit dem von α-Linolensäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure verglichen. Das verwendete Verfahren war eine nichtradioaktive, metabolische Dosis-Wirkungs-Endpunktstudie.
Mäuse wurden mit einer US17-Nahrung gefüttert, die α-Linolensäureethylester (ALA-EE), Stearidonsäureethylester (SDA-EE), Eicosapentaensäureethylester (EPA-EE) oder Docosahexaensäureethylester (DHA-EE) in einer Menge enthielt, die zu einer menschlichen westlichen Nahrung äquivalent war, welche 1, 3 oder 10 g/Tag der Fettsäure enthielt (g/Tag Humanäquivalentdosis). Um einen Gehalt an Fett (37 en%) von 17% in der US17-Nahrung aufrechtzuerhalten, wurde Oleinsäure (18:1 n-9) als Oleinsäurecassette in der gleichen Menge wie der Fettsäureester, der hinzugefügt wurde, aus der US17-Nahrung entfernt. Oleinsäure wurde als zu ersetzende Fettsäure ausgewählt, weil Literaturberichte angeben, dass Oleinsäure in Bezug auf Entzündung und Krebs neutral ist.
Nach einem Monat mit der jeweiligen Nahrung auf US17-Basis wurden die Mäuse getötet, und die Fettsäurezusammensetzung ihrer Lebern wurde jeweils durch Gaschromatographie analysiert. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in 8 angegeben.
8 zeigt, dass die Summe der langkettigen n-3-PUFAs (d.h. EPA + DPA n-3 + DHA) in Lebergewebe in der folgenden Rangordnung dosisabhängig zunahm: DHA-EE > EPA-EE > SDA-EE > ALA-EE. Diese Ergebnisse zeigten, dass SDA besser als ALA zu langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren metabolisiert wurde. 8 zeigt auch, dass jede der n-3-PUFAs aus der Nahrung die Konzentration von Arachidonsäure in Lebergewebe dosisabhängig senkte. Dies ist von Bedeutung, da Arachidonsäure-Metabolite (z.B. Prostaglandine, Leukotriene und HETEs (Hydroxyeicosatetraensäure)) mit der Entstehung von Tumoren korrelieren. Die Gruppe "Basis" bezieht sich auf Mäuse, die unmittelbar vor dem Wechsel auf Nahrung, die auf US17 beruhte, mit dem Standard-Nagetier-Futter gefüttert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass das Niveau der Summe der langkettigen n-3-PUFAs oder Arachidonsäure dieselbe war, was darauf hinweist, dass die US17-Nahrung die Fettsäurezusammensetzung im Vergleich zum Standard-Nagetier-Futter nicht erheblich veränderte.
Beispiel 7
Stoffwechsel von Stearidonsäure bei Ratten
(Endpunktanalyse unter Verwendung von kalten Fettsäureethylestern)
Der Stoffwechsel von Stearidonsäure zu langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren (d.h. Eicosapentaensäure (EPA), Docosapentaensäure (DPA n-3) und Docosahexaensäure (DHA) in Rattenleber wurde mit dem von α-Linolensäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure verglichen. Das verwendete Verfahren war dasselbe, wie es in Beispiel 6 beschrieben ist, außer dass Ratten anstelle von Mäusen verwendet wurden. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in 9 angegeben.
9 zeigt, dass die Summe der langkettigen n-3-PUFAs (d.h. EPA + DPA n-3 + DHA) in Lebergewebe in der folgenden Rangordnung dosisabhängig zunahm: DHA-EE > EPA-EE > SDA-EE > ALA-EE. Diese Ergebnisse zeigten, dass SDA besser als ALA zu langkettigen mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren metabolisiert wurde. 9 zeigt auch, dass jede der n-3-PUFAs aus der Nahrung die Konzentration von Arachidonsäure in Lebergewebe dosisabhängig senkte. SDA bewirkte eine stärkere Abnahme der Konzentration von Arachidonsäure als ALA oder EPA.
Beispiel 8
Wirkung von n-3- und n-6-PUFAs auf Darmkrebs im Min/+-Mausmodell
Die Wirksamkeit von ausgewählten mehrfach ungesättigten n-3- und n-6-Fettsäuren wurde im Min/+-Mausmodell von Darmkrebs bewertet. Die folgenden Fettsäureethylester wurden auf ihre Wirkung auf die Bildung von Darmpolypen getestet: 1) ALA-EE; 2) SDA-EE; 3) EPA-EE; 4) DHA-EE; 5) GLA-EE (γ-Linolensäure, 18:3 n-6); und 6) CLA-EE (konjugierte Linolsäure; c9t11-18:2 (77%) + c9c11-18:2 (18%) + andere Isomere (5%)).
Diese Fettsäureethylester wurden so zu der US17-Nahrung gegeben, dass man eine Humanäquivalentdosis von 10 g/Tag erhielt (3 Gew.-%). Der NSAID Sulindac (320 ppm) diente als positive Kontrolle. Um einen Gehalt an Fett (37 en%) von 17% in der US17-Nahrung aufrechtzuerhalten, wurde Oleinsäure (18:1 n-9) in der gleichen Menge wie der Fettsäureethylester, der hinzugefügt wurde, aus der US17-Nahrung entfernt. Die Mäuse wurden in einem Alter von ungefähr fünf Wochen erhalten und wurden nach Erhalt mit den Testnahrungen gefüttert. Nach sieben Wochen mit der jeweiligen Testnahrung wurden die Mäuse getötet, und die Darmpolypen wurden gezählt und gemessen. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Tabelle 6 angegeben.
Die Werte sind als Mittelwert ± SEM (Fehler des Mittelwerts) angegeben. Unterschiedliche Hochzahlen geben Werte in jeder Reihe an, die signifikant verschieden mit p < 0,05 sind. Fishers multiples Least-Significant-Difference-Vergleichsverfahren wurde verwendet, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu bestimmen.
Jedem Tier wird bei der Bestimmung der mittleren Dünndarmtumorgröße und Gesamttumorgröße dasselbe Gewicht zugeordnet. Die Mittlere Kolontumorgröße wird nur bei Tieren berechnet, die Kolontumoren trugen. Tumorbelastung = Tumorzahl × Tumorgröße, ausgedrückt in mm.
Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, bewiesen die Analysen, dass SDA eine Abnahme der Polypenzahl (47%), der Polypengröße (18%) und der Polypenbelastung (Zahl × Größe) (56%) im Dickdarm und im Dünndarm bewirkte. Es sei angemerkt, dass die Ausdrücke "Polyp" und "Tumor" zwar in derselben Bedeutung verwendet werden, die Läsionen technisch gesprochen jedoch Polypen sind (d.h. Tumoren oder Neoplasmen im frühen Stadium).
Unerwarteterweise war die Wirksamkeit von SDA bei der Hemmung der Bildung und Entwicklung von Polypen im Dickdarm mit derjenigen von Sulindac, einem häufig als positive Kontrolle verwendeten NSAID, vergleichbar und war größer als diejenigen nicht nur von ALA, sondern auch von EPA und DHA. ALA und EPA waren nur am Rande wirksam, während DHA keine Wirksamkeit im Dickdarm zeigte. Genauso war die Wirksamkeit von SDA bei der Hemmung der Bildung und Entwicklung von Polypen im Dünndarm mit derjenigen von EPA vergleichbar und war größer als diejenige von ALA und DHA. Dies ist auch in 10 in Form von Balkendiagrammen gezeigt. GLA und CLA schienen im Gegensatz zu SDA, EPA und DHA die Zahl der Polypen zu erhöhen; die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant relativ zur US17-Kontrolle.
Beispiel 9
Wirkung von n-3- und n-6-PUFAs auf Gewebekonzentrationen von Arachidonsäure im Dünndarm
Die Wirksamkeit ausgewählter mehrfach ungesättigter n-3- und n-6-Fettsäuren bezüglich der Reduktion der Konzentration von Arachidonsäure in Dünndarmgewebe wurde unter Verwendung des Min/+-Mausmodells bewertet. Die folgenden Fettsäureethylester wurden auf ihre Wirkung auf die Fettsäurezusammensetzung im Darm getestet: 1) ALA-EE; 2) SDA-EE; 3) EPA-EE; 4) DHA-EE; 5) GLA-EE; und 6) CLA-EE. Die Fettsäurezusammensetzung wurde im Dünndarm bestimmt, da sich dort die große Mehrheit der Polypen bildet.
Diese Fettsäureester wurden zu der in Beispiel 8 diskutierten US17-Nahrung gegeben. Die Arachidonsäurekonzentration in der Phospholipidfraktion der Dünndärme der Mäuse wurde durch Gaschromatographie bestimmt. Die Ergebnisse dieser Analyse werden in 11 vorgestellt. In 11 haben Balken, die mit demselben Buchstaben markiert sind (z.B. Kontrolle und CLA, beides mit einem "b" markiert) Werte, die statistisch nicht verschieden sind.
11 zeigt, dass SDA bei der Senkung der Konzentration von Arachidonsäure im Dünndarm der Mäuse wirksamer war als ALA, EPA und DHA. Eine Senkung der Konzentration von Arachidonsäure in Geweben ist wünschenswert, da Arachidonsäure-Metabolite an der Entstehung von Tumoren beteiligt sein sollen (z.B. Prostaglandine, Leukotriene und HETEs).
Beispiel 10
Wirkung von Stearidonsäure auf das Wachstum primärer Tumoren im Nacktmaus/HT-29-Krebsmodell.
Die Wirksamkeit von Stearidonsäure (18:4n-3) bei der Hemmung des Wachstums von primären Tumoren wurde mit Hilfe des Nacktmaus/HT-29-Modells bewertet. Das Nacktmaus/HT-29-Modell wurde schon früher beschrieben, Hernandez-Alcoceloa, R., Fernandez, F., Lacal, J. C., Cancer Res., 59(13), 312–18 (1999); Fantini, J., Cancer J., 5(2) (1992).
Nackte (d.h. immundefiziente) Mäuse wurden drei Wochen lang mit der US17-Nahrung gefüttert. HT-29-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit fetalem Rinderserum, Penicillin und Streptomycin ergänzt war (Gibco, Grand Island, NY), und in einer CO₂-Atmosphäre bei 37°C gehalten. Nachdem die optimale Zelldichte erreicht war, wurden die HT-29-Zellen abgespült und dann in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert. Eine Zellsuspension wurde in MATRIGEL (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) hergestellt. Die Suspension bestand aus 2/3 Volumenteilen Zellen in PBS und 1/3 Volumenteilen MATRIGEL. MATRIGEL ergibt eine extrazelluläre Matrix, wie sie von Endothelzellen sezerniert wird. Die Matrix enthält angiogene und Zellproliferations-Wachstumsfaktoren, die die Anheftung und Vermehrung von HT-29-Zellen als primärer Tumor unterstützen.
Eine Million Zellen wurden in einem Volumen von 30 μl in den subplantaren Bereich des rechten hinteren Fußballens der Nackten Mäuse injiziert. Fünf Tage nach den HT-29-Zell-Injektionen wurde die Hälfte der Mäuse auf eine US17-Nahrung umgestellt, die Stearidonsäure (3 Gew.-% = 10 g/Tag Humanäquivalentdosis) anstelle von Oleinsäure enthielt. Das Ausmaß des Wachstums primärer Tumoren wurde gemessen, indem man die Änderung des Volumens der Fußballen der Mäuse mit der Zeit maß. Das Volumen der Fußballen wurde mit einem Plethysmometer (Ugo Basile, Camerio-Varese, Italien) gemessen. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in 12 dargelegt.
12 zeigt, dass die Mäuse, die mit einer Stearidonsäure enthaltenden US17-Nahrung gefüttert wurden, im Vergleich zu denjenigen, die mit der US17-Kontrollnahrung gefüttert wurden, ein reduziertes Wachstum primärer Tumoren aufwiesen. Nach 35 Tagen wiesen die Mäuse, die mit der SDA enthaltenden US17-Nahrung gefüttert wurden, 33% weniger Wachstum primärer Tumoren auf als diejenigen, die mit der US17-Nahrung gefüttert wurden.

Claims

Verwendung eines Metaboliten von α-Linolensäure, bei dem es sich um Stearidonsäure (18:4 n-3) oder ein Lipid, Carboxylatsalz, einen Ester, ein Triglycerid, Amid oder ein anderes pharmakologisch annehmbares Carbonsäurederivat derselben handelt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Krebs, wobei der Metabolit der einzige Wirkstoff des Medikaments ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Krebs um Kolonkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs oder Lungenkrebs handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Metabolit in Form eines Triglycerids vorliegt.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Metabolit in Form eines Esters vorliegt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Medikament geeignet ist, den Metaboliten in einer Dosis von 1 mg/kg/Tag bis 300 mg/kg/Tag zu verabreichen.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Medikament geeignet ist, den Metaboliten in einer Dosis von 10 mg/kg/Tag bis 150 mg/kg/Tag zu verabreichen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Medikament in Form eines pharmazeutischen Präparats, eines Nährstoffpräparats oder eines Nahrungsmittelpräparats vorliegt.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das Medikament in Form eines Nahrungsmittelpräparats vorliegt.