DE60022879T2

DE60022879T2 - Reporterverbindungen und verfahren zur auffindung von hochspezifische proteaseaktivität

Info

Publication number: DE60022879T2
Application number: DE60022879T
Authority: DE
Inventors: Lodewijk Koenraad VAN ACKER; Inge Dierynck; Wilfried Rudi PAUWELS
Original assignee: Tibotec BVBA
Current assignee: Janssen Infectious Diseases Diagnostics BVBA
Priority date: 1999-05-26
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2020-05-27
Also published as: ES2249273T3; EP1185689B1; DK1185873T3; AU5217700A; WO2000073497A1; EP1185873A1; ATE305612T1; ATE361374T1; EP1055929A1; AU777118B2; DE60034672D1; EP1185689A1; EP1185873B8; CA2374038A1; DE60022879D1; US7129036B1; AU5676700A; AU778272B2; EP1185873B1; CA2374047A1

Description

Die Erfindung betrifft Polypeptid-Reportermoleküle, die mit künstlichen oder Zellmembranen assoziieren können. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptid-Reportermoleküle, welche auch von hochspezifischen Proteasen spaltbar sind. In jeder Ausführungsform sind die Polypeptid-Reportermoleküle insbesondere nützlich für die Entwicklung neuer Pharmazeutika und für Diagnosen.
Die meisten eiweißartigen Moleküle und anderen Substanzen in einer Zelle sind nicht in gleichen Mengen über die Zelle hinweg verteilt. Im Gegenteil, die meisten Substanzen, und insbesondere eiweißartige Substanzen, werden in bestimmten Teilen einer Zelle lokalisiert. Zum Beispiel werden viele Proteine in oder nahe der Plasmamembran einer Zelle lokalisiert. Für mindestens einige der lokalisierten eiweißartigen Moleküle und anderen Substanzen ist die richtige Verteilung in einer Zelle von entscheidender Wichtigkeit für die Funktion dieser Moleküle oder dieser anderen Substanzen in der Zelle.
Die richtige Verteilung eines eiweißartigen Moleküls oder einer anderen Substanz in einer Zelle kann auf vielen verschiedenen Wegen abgesichert werden. Ein Weg, ein eiweißartiges Molekül auf einen bestimmten Ort in einer Zelle zu zielen, verläuft über das Modifizieren des Moleküls während oder nach seiner Synthese. Modifizierungen wie Glykolsylierung, Phosphorylierung, proteolytische Spaltung usw. während oder nach der Proteinsynthese sind in der Vergangenheit ausführlich untersucht worden. Eine in letzterer Zeit entdeckte enzymkatalysierte Proteinmodifikation ist die kovalente Ver bindung mit Lipidmolekülen. Durch diese hydrophobe Modifikation werden überwiegend hydrophile Proteine, welchen membranbindende Strukturen fehlen, in hydrophobe Proteine umgewandelt, und es wird die Bindung der modifizierten Proteine an Membranen (z.B. Kernhülle, Plasmamembran) unterstützt, was sich auf die biologische Aktivität des Proteins auswirkt (Schmidt, 1989).
Zum Beispiel fand man heraus, dass die gesättigten Fettsäuren, Stearin-, Palmitin- und Myristinsäure, meistens mit Proteinen in eukaryotischen Zellen verbunden sind (McIlhinney, 1990). Jede dieser Fettsäuren kennzeichnet verschiedene Subpopulationen einer begrenzten Anzahl von Zellproteinen (Sepp-Lorenzino u.a., 1989, Maltese u.a., 1987, Maltese, 1990). Myristinsäure wird normalerweise über eine Amidbindung mit einem N-terminalen Glycin von Proteinen während deren Synthese verbunden (Wilcox u.a., 1987). Die verbundene Myristinsäure ist stabil und weist eine ähnliche Halbwertzeit wie das Protein auf, an welches es gebunden ist (McIlhinney, 1990). Bei der Palmitoylierung werden die Fettsäuren post-translatorisch über eine alkalilabile Esterbindung mit den Proteinen verbunden. Diese Bindung ist normalerweise biologisch labil, mit einem Turnover, der schneller ist als der des Proteins (McIlhinney, 1990).
Prenylierte Proteine werden entweder durch ein 15-Kohlenstoff(C15)-Isoprenoid, Farnesyl (F), oder ein 20-Kohlenstoff(C20)-Isoprenoid, Geranylgeranyl (GG), modifiziert. Die C-terminale Aminosäuresequenz der zu modifizierenden Proteine dient dazu, die Addition eines dieser Isoprenoide zu dirigieren (Maltese, 1990, Glomset u.a., 1990). Auf diese Weise werden Signalmoleküle, darunter Ras- und G-Proteine, durch eine Folge post-translatorischer Modifikationen des C-terminalen CAAX-Motivs (C = Cystein, A = Aliphatischer Rest (Val oder Ile), X = verschieden] auf das innere Blättchen der Plasmamembran gezielt.
Die Erkennung minimaler erkennbarer Sequenzen, wie das CAAX-Motiv, beinhaltet eine kovalente Verbindung eines Lipids mit der Sulfhydrylgruppe des Cysteins (C), welches sich vier Aminosäuren von dem C-Ende entfernt befindet (Casey u.a., 1989, Reiss u.a., 1990), gefolgt von einer Protease-Entfernung der AAX-Tripeptide und einer Methyl-Veresterung des entstehenden prenylierten Cysteincarboxyl-Endes (Hancock u.a., 1989). Proteine, die mit CAAX-Boxen enden, wobei X Leucin oder Isoleucin ist, werden durch das Enzym Geranylgeranyl-Transferase I (GGTase I) mit dem C20-Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) modifiziert (Yokoyama u.a., 1991). In Proteinen, in denen X meistens Methionin (M), Serin (S), Cystein (C), Alanin (A) oder Glutamin (E) ist, wird das C15-Isoprenoid Farnesyl durch das Enzym Farnesyl-Transferase (FTase) von Farnesylpyrophosphat (FPP) übertragen (Reiss u.a., 1990, Reiss u.a., 1991, Moores u.a., 1991). Daher werden Proteine, die C-terminales CAA (MSCAE) und CAAL enthalten, durch FTase und entsprechend GGTase prenyliert (Clarke 1992, Schafer u.a., 1992, Zhang u.a., 1996).
Obwohl FTase und GGTase I sowohl FPP als auch GGPP binden können, kann nur GGTase I beide auf Proteinsubstrate übertragen. FTase hingegen kann nur einige GGTase-I-Substrate farnesylieren (Armstrong u.a., 1995). Eine dritte verwandte Prenyltransferase, GGTase II, erkennt CARX-Boxen nicht, überträgt aber stattdes sen GG von GGPP auf Proteine, die in XXCC oder XCXC enden, welche doppelt geranylgeranyliert werden (Seabra u.a., 1992, Khosravi-Far u.a., 1992), wobei X und C die oben angegebene Bedeutung haben.
Die Rolle der lipiddirigierten Lokalisierung und des Ras bei Krebserkrankungen
Zellen reagieren auf Signale von extrazellulären Stimulantien über ein kompliziertes Netzwerk hochregulierter Vorgänge, welche zusammenfassend als Signalübertragungswege bezeichnet werden. Die Anregung dieser Wege führt zu Veränderungen der Transkriptionsaktivität (Karin u.a., 1995, Hill u.a., 1995). Während normale Zellen auf extrazelluläre Stimulantien richtig reagieren, haben viele präkanzeröse und kanzeröse Zellen diese Fähigkeit verloren und zeigen ein anomales Signalverhalten. Ras, ein Mitglied der großen Überfamilie der GTP-bindenden Proteine (G-Proteine), spielt eine zentrale Rolle als molekularer Schalter, welcher zwischen extrazellulären Rezeptoren und intrazellulären Effektorproteinen vermittelt, welche ihrerseits Wachstumsregulierungswege regulieren (Lowy u.a., 1993). Einer dieser Effektoren ist eine Serin/Threonin-Kinase, Raf (Pronk u.a., 1994), welche mitogen aktivierte Protein-Kinase (MAPK) phosphoryliert.
Ras ist aktiv, wenn es an GTP gebunden ist, und inaktiv, wenn es an GDP gebunden ist. Das Zyklieren von aktiv zu inaktiv wird durch die intrinsische GTPase-Aktivität des Proteins durchgeführt. Einige Mutationen in Ras heben die GTPase-Aktivität auf und führen zu konstitutiv aktiven Formen des Proteins. Daher senden Ras-Proteine, die im aktiven GTP-gebundenen Zustand feststecken, konstitutiv Wachstumssignale aus und zeigen ihre onkogene Aktivität (Lowy u.a., 1993, Koshravi-Far u.a., 1994). Eine onkogene Aktivität kann aber auch aus einer ÜberExpression normaler Ras-Proteine resultieren (Barbacid, 1987).
Es gibt drei Ras-Gene der Säugetiere, welche vier hochhomologe 21 kDa-Proteine codieren: H-, N-, K(i4)A- und K(i4)B-Ras. K(i4)A- und K(i4)B-Ras werden durch Spleißvarianten des Ki-Ras-Gens codiert (Barbacid, 1987, Lowy u.a., 1993). Onkogene Mutationen in Ras-Genen, insbesondere Ki4B-Ras und N-Ras, tragen zur Bildung von 30% verschiedener menschlicher Bösartigkeiten bei. Mutations-Ras-Gene wurden in 50% der kolorektalen, 90% der Bauchspeicheldrüsen- und 20 der Lungenkrebserkrankungen gefunden. Die Störung des Ras-Signalweges könnte ein bedeutendes Potenzial als chemopräventive Strategie gegen Krebserkrankungen aufweisen (Bos 1988, Bos 1989, Barbacid 1987).
Es sind viele Ansätze in Erwägung gezogen worden, um der onkogenen Funktion des Ras entgegenzuwirken, aber der größte Fortschritt für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika gegen Ras-induzierte Zellumwandlung fokussierte auf der Inhibition des Enzyms FTase. Diese Strategie basiert auf der Beobachtung, dass die vier Ras-Proteine, synthetisiert als biologisch inaktive cytosolische Proteine, für onkogene Aktivität eine post-translatorische Modifikation mit einer Farnesyl-Komponente benötigen. Es war in der Tat für einige Zeit bekannt, dass die Assoziation von Ras mit dem inneren Blättchen der Plasmamembran für dessen Umwandlungsaktivität benötigt wird (Willumsen u.a., 1984). Man begann jedoch erst damit, mögliche antineoplastische (Anti krebs-)Pharmazeutika zu entdecken, als die Biochemie der post-translatorischen Modifikationen des Ras, welche zur Membranassoziation führen (Casey u.a., 1989, Hancock u.a., 1989, Schafer u.a., 1989), entschlüsselt war.
Zusätzliche Lipidmodifikationen der stromaufwärts des CAAX befindlichen Cysteine mit einer Palmitoylgruppe stabilisieren die Assoziation der H-, N- und KiA-Ras-Proteine mit der Plasmamembran weiter (Hancock u.a., 1990). KiB-Ras andererseits wird nicht palmitoyliert, enthält aber oberhalb des farnesylierten Cysteins einen Polylysin-Strang, von welchem man annimmt, dass er die Wechselwirkung des Proteins mit der Plasmamembran weiter stabilisiert (Hancock u.a., 1990). Obwohl das Zielen des Ras auf die Plasmamembran verschiedene Schritte umfasst, scheint die Farnesylierung der einzige Schritt zu sein, der erforderlich und ausreichend für die Umwandlungsaktivität des Ras ist (Jackson u.a., 1990, Kato u.a., 1992). Deswegen ist FTase bei der Entwicklung neuer Antikrebsmittel zu einem der am meisten untersuchten Objekte geworden. Das therapeutische Ziel ist, aus dieser neuen Information Nutzen zu ziehen und sie in neue biologische und pharmakologische Agenzien umzusetzen, die eine größere Wirksamkeit und geringere Toxizität aufweisen als derzeit erhältliche cytotoxische Krebsmittel (Gibbs u.a., 1997).
Eine vernünftige Gestaltung von FTase-Inhibitoren kann in drei breite Kategorien unterteilt werden (Gibbs u.a., 1997, Keloff u.a., 1997): (i) Verbindungen, die mit dem Isoprenoid FPP konkurrieren, (ii) Verbindungen, die mit dem Tetrapeptid CAAX konkurrieren, und (iii) Bisubstrat-Analoge, welche Merkmale sowohl der FPP- als auch der CAAX-Nachahmer kombinieren. Das Problem bei (I) ist, dass Verbindungen, die mit FPP konkurrieren, die hohe Affinität der FTase für FPP überwinden müssen. FTase bindet FPP mit niedriger nanomolarer Affinität, während die Zellkonzentrationen des FPP nahezu mikromolar sind. Inhibitoren der FTase benötigen daher ein sehr festes Ki und müssten unter anderen Enzymen, die FPP verwenden (z.B. Squalen-Synthase), sehr selektiv für FTase sein. Probleme bei den CAAX-Peptidnachahmern (ii) sind eine zelluläre Protease-Labilität und eine beeinträchtigte Membrandurchlässigkeit, welche von C-terminalem Carboxylat verursacht wird. Verschiedene Peptidbindungsmodifikationen und ein Arzneimittelvorstufendesign durch temporäres Maskieren der Carboxylatladung erwiesen sich als ausreichend, um zellaktive Arzneimittel zu erzeugen. Viele dieser Verbindungen enthielten jedoch immer noch eine Thiolgruppe, welche der Oxidation unterliegt und metabolisch reaktiv ist. Bisubstrat-Inhibitoren (iii) wurden aus enzymologischen Studien der FTase hergeleitet, welche einen sequentiellen Mechanismus aufdeckten. Dies brachte die Idee hervor, dass Verbindungen, welche den Übergangszustands-FTase-FPP-CAAX-Ternärkomplex nachahmen, leistungsfähige FTase-Inhibitoren wären. Es sind leistungsfähige Bisubstrat-Inhibitoren gefunden worden, aber die große Größe dieser Moleküle kann ihre pharmakologischen Eigenschaften in vivo beseitigen.
Andere Ansätze, Inhibitoren irgendeines Enzyms zu erhalten, beziehen sich auf geplante Zufallsdurchsuchungen entweder von Naturprodukten (Mikroorganismen, Böden, Pflanzen) oder von Bibliotheken synthetischer Chemikalien. Solche Durchsuchungen liefern einen immensen Fundus an Strukturen für Zufalls-Screenings und stellen ein starkes Mittel dar, um chemische Anhaltspunkte zu erhalten, welche durch die herkömmliche medizinische Chemie für die weitere Entwicklung modifiziert werden können (Sebti u.a., 1997). Durch eine Vielfalt von Zufallsdurchsuchungen wurden eine Zahl von FTase-Inhibitoren identifiziert. Zum Beispiel wurde in einer Sammlung von Antihistaminen eine Klasse neuer nicht-peptidischer tricyclischer FTase-Inhibitoren ohne Sulfhydryl gefunden, welche mit FPP konkurrierende Inhibitoren sind (Bishop u.a., 1995). Diese Verbindungen weisen jedoch, verglichen mit CAAX-Nachahmern, eine eher niedrige Leistungsfähigkeit auf, was sie für die Auswertung in vivo ungeeignet macht (Gibbs u.a., 1994). In letzterer Zeit ist im Zuge anderer FPP-nachahmender Enzym(Squalen-Synthase)-Inhibitoren eine vielversprechende neue Klasse konkurrenzfähiger FTase-Inhibitoren entdeckt worden (Aoyama u.a., 1998). Die Aktivität chemisch optimierter Analoger ist mit CAAX-nachahmenden FTase-Inhibitoren zu vergleichen.
In Zellen blockieren FTase-Inhibitoren die zelluläre Farnesylierung. In diesen Studien wird die Farnesylierung und die Geranylgeranylierung von Proteinen durch Inkubation von Zellkulturen mit der FPP-Vorstufe [3H]Mevalonat untersucht (Hancock u.a., 1989, Kohl u.a., 1993, James u.a., 1993). Dennoch ist in Zellversuchen die Konzentration von FTase-Inhibitoren, die erforderlich ist, um deren Funktion zu herbeizuführen, häufig 1000 Mal höher als die IC50 zur Inhibition von FTase in vitro, was starke Beschränkungen für die Zellaktivität anzeigt. Die Inhibition von Ras-vermittelten Zelleffekten durch FTase-Inhibitoren wurde auf ähnliche Weise in Zellkulturversuchen demonstriert, welche die Schlüssel-Phänotypen der Zellumwandlung überwachen. Verankerungs-abhängiges (Kunststoff, Kohl u.a., 1993, James u.a., 1993) und -unabhängiges Wachstum (Weich-Agar, Kohl u.a., 1993), die Geschwindigkeit des Wachstums in Monoschicht (James u.a., 1993), morphologische Umwandlung und Veränderungen im Zytoskelett (Prendergast u.a., 1994).
Die biochemische Spezifizität von FTase-Inhibitoren steht außer Frage, da diese Agenzien die Geranylgeranylierung von Proteinen nicht blockieren (Gibbs u.a., 1993, Kohl u.a., 1993, James u.a., 1993, Bishop u.a., 1995, Cox u.a., 1994). Es ist jedoch wichtig zu erwähnen, dass berichtet wurde, dass der Ras-Mutationszustand menschlicher Tumore nicht mit deren Empfindlichkeit für FTase-Inhibitoren in Wechselbeziehung steht. Es ist darüber hinaus nicht richtig, FTase-Inhibitoren als spezifische Ras-Inhibitoren zu bezeichnen, da FTase-Inhibitoren auf mindestens 18 farnesylierte Proteine abzielen, von denen einige für die bösartige Umwandlung wichtig sind (James u.a., 1994). Ein Beispiel ist die Unterdrückung der src-Umwandlung durch FTase-Inhibitoren (James u.a., 1993). Der biochemische Mechanismus, durch welchen FTase-Inhibitoren zur Tumor-Inhibition führen, ist daher ein wichtiger Punkt. Die Fähigkeit von FTase-Inhibitoren, die Ras-abhängige konstitutive Aktivierungs-MAPK-Kaskade zu blockieren, ist heute anerkannt (Cox u.a., 1994, James u.a., 1994).
Nicht-farnesyliertes onkogenes Ha-Ras kann einen dominanten negativen Effekt aufweisen und kann die Funktion membrangebundenen Ras unter einigen Umständen hemmen (Stacey u.a., 1991). FTase-Inhibitoren können die Anhäufung cytosolischer Komplexe von GTP-gefangenem Ras mit seinen Effektoren wie z.B. Raf induzieren (Lerner u.a., 1995, Miyake u.a., 1996). Dies führt schließlich zur Absonderung der Ras-Effektor-Targets. In Tumoren, in denen Ras GTP-gefangen ist, kann cytosolisches Ras sich daher als ein dominantes negatives Protein anhäufen, welches das Tumorwachstum weiter hemmt. Da FTase-Inhibitor-vermitteltes cytosolisches Ras des wilden Typs seine Effektoren nicht absondert und daher nicht den dominanten negativen Phänotyp aufweist, ist die beobachtete Inhibition für Tumorzellen selektiv. Darüber hinaus wurde in verschiedenen Studien berichtet, dass die Konzentrationen von FTase-Inhibitoren wie BZA-5B und FTI-277, die benötigt wurden, um die Aktivitäten von Enzymen im MAP-Kinaseweg zu blockieren, niedriger waren als jene, die erforderlich waren, um die Ras-Prozessierung vollständig zu hemmen. Dies lässt ebenfalls vermuten, dass nicht-farnesyliertes aktiviertes Ras ein dominanter Inhibitor der Funktion des farnesylierten aktivierten H-Ras in den FTase-Inhibitor-behandelten Zellen ist. Daher könnte eine teilweise Inhibition der Ras-Prozessierung zu einer selektiven Inhibition des onkogenen, nicht aber des normalen Signalverhaltens führen (James u.a., 1994, Lerner u.a., 1995).
Ein Nachteil der Studien, welche Zellen benutzen, die durch Ras onkogen umgewandelt sind, um den Mechanismus der Funktion der FTase-Inhibitoren zu untersuchen, ist, dass H-Ras benutzt wurde und bald entdeckt wurde, dass das am weitesten verbreitete K-Ras gegen FTase-Inhibitoren beträchtlich resistent war (James u.a., 1994, Lerner u.a., 1995). Es werden viel höhere Konzentrationen an Inhibitor benötigt, um KB-Ras zu hemmen, als H-Ras. Ein attraktiver Mechanismus für diese Resistenz ist, dass KB-Ras von GGTase-I prozessiert wird, wenn FTase blockiert ist (Lerner u.a., 1995, Whyte u.a., 1997, Rowell u.a., 1997). In vitro ist KB-Ras ein Substrat für für GGTase-I (James u.a., 1995b). GGTase-I-Inhibitoren blockieren die KB-Ras-Prozessierung in KB-Ras-umgewandelten Zellen, was einen pharmakologischen Beweis dafür liefert, dass in Zellen eine Cross-Prenylierung auftreten kann (Lerner u.a., 1995b). Diese Beobachtungen unterstreichen die Notwendigkeit, für die In-vitro- und In-vivo-Tests möglicher Inhibitoren KB-Ras-umgewandelte Zellen zu benutzen.
Sehr kürzlich wurde gezeigt, dass. das gleichzeitige Aussetzen von FTase- und GGTase-I-Inhibitoren in menschlichen Tumoren für die Inhibition der onkogenen KB-Ras-Prenylierung benötigt wird, während jeder Inhibitor allein ausreichend ist um das menschliche Tumorwachstum in xenogenen Transplantaten in der nackten Maus zu unterdrücken (Sun u.a., 1998). Die Tatsache, dass GGTase-I-Inhibitoren eine eigene Anti-Tumor-Aktivität aufweisen, lässt vermuten, dass einige Substrate für GGTase-I für die bösartige Umwandlung wichtig sind (Sun u.a., 1998). Ebenfalls sind FTase-Inhibitoren, welche die KB-Ras-Prozessierung nicht hemmen können, wirksam bei der Inhibition des Tumorwachstums, was vermuten lässt, dass andere farnesylierte Proteine als Ras existieren, welche für die bösartige Umwandlung wichtig sind (Sun u.a., 1998).
In einem zweiten In-vivo-Modell induzierte ein FTase-Inhibitor einen dramatischen Rückgang bei Mamma- und Speicheldrüsenkarzinomen in einem viralen Ha-Ras-Onkomaus-Modell (Kohl u.a., 1996). In diesen transgenen Mäusen werden die FTase-Inhibitoren auf schon existierende Tumore angewendet, im Gegensatz zu Nacktmaus-Tumormodellen. Es war eine chronische Anwendung des In hibitors erforderlich, da die Tumore nach Beendigung der Behandlung wieder auftraten (Kohl u.a., 1996). Sowohl im Nacktmaus- als auch im Onkomaus-Modell wurde eine Wirksamkeit in Abwesenheit starker mikroskopischer Toxizität erzielt, was vermuten lässt, dass solche FTase-Inhibitoren wirksame und sichere Agenzien für die Behandlung menschlicher Krebserkrankungen sein könnten (Omer u.a., 1997). Bislang wurde keine Toxizität in Mäusen beschrieben, die mit irgendeinem der getesteten FTase-Inhibitoren behandelt wurden. Diese Beobachtung steht in scharfem Kontrast zu Untersuchungsergebnissen bei kürzlich entwickelten Chemotherapeutika, welche häufig in ihrer höchsten zulässigen Dosis verwendet werden müssen, um eine Antitumoraktivität zu erzielen (Gibbs u.a., 1997).
Obwohl die biologischen Ergebnisse, die man mit FTase-Inhibitoren erhält, weitestgehend anerkannt sind, sind die genauen Gründe für die fehlende Toxizität für normale Zellen in Kultur- ebenso wie in Tierstudien nicht gesichert. Zum Beispiel ist das Wachstum Ras-umgewandelter Kulturzellen viel empfindlicher für FTase-Inhibitoren, verglichen mit deren normalen Mutterzellen. Davon ausgehend, dass eine Ras-Funktion für alle Zellen wesentlich zu sein scheint, ist es etwas unerwartet, dass normale Zellen relativ unempfindlich für FTase-Inhibitoren sein sollen. Gibbs u.a. (1997) haben eine Anzahl möglicher Erklärungen für diese Effekte vorgeschlagen: (i) Funktionell überflüssige Wachstumsfaktor-Netzwerke in normalen Zellen, welche diesen ermöglichen, das Herunterregeln der Ras-Funktion zu tolerieren. Mit anderen Worten, die Vermehrung normaler Zellen ist abhängig von mehr als einem Wachstumsfaktor, und ein Wachstumsfaktor aktiviert mehrere intrazelluläre Signalwege (Keloff u.a., 1997). (ii) Im Fall von KB-Ras könnte eher eine Geranylgeranylierung stattfinden als eine Farnesylierung, und KB-Ras des wilden Typs kann auch kritische biologische Funktionen bereitstellen. Eine Kreuzprenylierung (Geranylgeranylierung) des unmutierten Ras in Abwesenheit funktioneller FTase ist jedoch keine zufriedenstellende Erklärung, weil sich dann die Frage stellt, warum Zellen mit mutiertem N- oder Ki-Ras für FTase-Inhibitoren empfindlich sind (Omer u.a., 1997, Gibbs u.a., 1997). (iii) Nicht alle farnesylierten Proteine weisen dasselbe Maß an FTase-Inhibition in Zellen auf. Daher kann eine selektive Inhibition von H-Ras-vermitteltem gegen KB-Ras-vermitteltes Signalverhalten ein fortgesetztes Wachstum normaler Zellen ermöglichen (James u.a., 1995b). (iiii) Gemäß (iii) kann die Funktion farnesylierter Proteine, die an der Zellumwandlung beteiligt sind, empfindlicher für die Wirkung eines FTase-Inhibitors sein, als es die Funktionen derselben Proteine in normalen Zellen sind. Somit kann das quantitative Verhältnis zwischen der Funktion eines bestimmten Proteins und dessen Farnesylierungsgrad variieren, was seinerseits das Maß an Inhibition der Farnesylierung bestimmt, das erforderlich ist, um die biologische Funktion zu blockieren.
Menschliche Krebserkrankungen, die mutiertes Ras aufweisen, weisen typischerweise andere genetische Veränderungen wie den Verlust von Tumor-Suppressoren auf (Gibbs u.a., 1996). Eine kritische Frage ist es gewesen, ob die Beseitigung der Ras-Funktion in einem komplexen genetischen Hintergrund einen Antitumor-Effekt bringen wird. Die Arbeit von Shirasawa u.a. (1993) hat Beweis dafür erbracht, dass Ras eine kriti sche Funktion in Tumorzellen, die Mutationen in anderen Onkogenen oder Tumor-Suppressorgenen aufweisen, beibehält. Speziell unterbrach Shirasawa genetisch das mutierte KB-Ras-Gen in verschiedenen menschlichen Kolon-Zelllinien, von denen bekannt war, dass sie andere Mutationen aufwiesen, und beobachtete, dass die Zellen in einem Nacktmaus-Tumor-Explantationsmodell nicht länger tumorerzeugend waren (Shirasawa u.a., 1993).
Die Tatsache, dass GGTase-I-Inhibitoren auch das menschliche Tumorwachstum hemmen, wenn auch mit geringerer Wirkung als FTase-Inhibitoren, lässt vermuten, dass außer farnesylierten Proteinen auch geranylgeranylierte Proteine eine wichtige Rolle bei der bösartigen Umwandlung spielen.
Die biologischen Wirkungen von FTase-Inhibitoren lassen vermuten, dass sie nicht richtigerweise als spezifische Inhibitoren des Ras angesehen werden (Gibbs u.a., 1997). Dessen ungeachtet haben FTase-Inhibitoren einen bemerkenswerten therapeutischen Index in Zellkulturen und in Mäusen demonstriert (Gibbs u.a., 1994, Kohl u.a., 1994). Schließlich ist es ein wichtiger klinischer Aspekt, ob die Anwendung von FTase-Inhibitoren zu Arzneimittelresistenzen führen wird. Eine FTase-Inhibitor-Resistenz ist beobachtet worden, sowohl in Zellkulturen als auch in Tieren (Kohl u.a., 1995, Prendergast u.a., 1996). Daher wird die letzte Entscheidung über den Nutzen von FTase-Inhibitoren fallen, wenn Verbindungen mit geeigneten pharmakologischen Profilen in der Klinik getestet werden (Omer u.a., 1997).
Antikrebsmittel und Apoptose
Die Apoptose oder der programmierte Zelltod dient als Hauptmechanismus für die genaue Regulierung der Zellenanzahlen und als Verteidigungsmechanismus, um unerwünschte und potenziell gefährliche Zellen zu entfernen, wie z.B. virusinfizierte Zellen oder Zellen mit einem DNA-Schaden oder einer Wachstums-Deregulierung, welche Vorstufen von Tumorzellen werden könnten. Defekte in der Aktivierung oder Ausführung des apoptotischen Weges können daher zur Entwicklung einer Onkogenese führen. Ein wichtiges Ereignis beim Fortschreiten vieler Bösartigkeiten ist der Verlust der Funktion des p53-Tumorsuppressorgens. Das p53-Protein, ein Kern-DNA-bindendes Protein, ist an der Herbeiführung der Apoptose beteiligt, die durch einen DNA-Schaden und unangemessene Onkogen-Aktivierung ausgelöst wird. Es ist ein Transskriptionsaktivator einer bestimmten Gruppe von Zielgenen, darunter die Zellwachstums-Inhibitoren p21WAF1 und Gadd45, und tritt direkt in Wechselwirkung mit vielen Zellproteinen (Wang und Harris, 1997). Das p53-Gen ist bei der Mehrzahl der menschlichen Bösartigkeiten häufig mutiert, was die Wichtigkeit der p53-abhängigen Apoptose bei der Kontrolle des Krebswachstums vermuten lässt (Bellamy, 1996).
Es hat kürzlich breite Anerkennung erfahren, dass das Abtöten von Zellen, welches durch Antikrebsmittel hervorgerufen wird, das Ergebnis eines programmierten Zelltodes ist (Weinberg 1996). Insbesondere ist das p53-Tumorsuppressorprotein eng mit der Aktivierung eines apoptotischen Weges in Reaktion auf die Behandlung mit einer Bestrahlung oder einer Chemotherapie verbunden. Es scheint so zu sein, dass Arzneimittel mit verschiedenen Wirkungsarten Reaktionen auslösen, welche die Apoptose bewirken (Smets, 1994). Antimetaboliten wie Purin- und Cytidin-Analoge und Topoisomerase-Inhibitoren lösen die Herbeiführung des Zelltodes durch Störung der DNA-Replikation und durch Inhibition aus. Anders als die DNA-schädigenden Agenzien führen die taxoiden Arzneimittel, welche auf die Stabilisierung des Mikrotubulisystems abzielen, die Zellen über p53-unabhängige Wege zur Apoptose. Der Einblick in den Wirkungsmechanismus der derzeitigen Antikrebs-Chemotherapie hat zu einer Suche nach Agenzien geführt, welche die Apoptose herbeiführen, entweder über p53 oder andere Regulationsproteine.
Die Apoptose wird durch eine Folge von Ereignissen reguliert, welche zu stereotypen biochemischen und morphologischen Veränderungen führt, wie z.B. Membranverklumpung, Zellschrumpfung, Chromatinkondensation, DNA-Spaltung und Fragmentierung der Zelle in membrangebundene apoptotische Körper. Das zentrale Ereignis auf dem apoptotischen Weg ist die Aktivierung einer Hierarchie von Interleukin-1B(IL-1B)-umwandelndem-Enzym(ICE)-ähnlichen Proteasen oder Caspasen, einer Familie der Cystein-Proteasen mit einem absoluten Erfordernis für die Spaltung hinter einem Aspartinsäurerest (für einen Überblick siehe Cohen 1997, Thornberry und Lazebnek, 1998). Diese hochspezifischen Proteasen werden als inaktive Proenzyme synthetisiert und werden durch Spaltung an speziellen Asp-Resten in aktive Enzyme umgewandelt, gefolgt von der Assoziation einer großen und einer kleinen Untereinheit, um ein Heterodimer zu bilden.
Caspasen sind enge Homologe des Caenorhabditis elegans ced-3 Genproduktes, von dem gezeigt wurde, dass es essentiell für die Apoptose während der Nematodenentwicklung ist (Shaham und Horvitz, 1996). Sie vermitteln die Proteolyse einer abgeschlossenen Zahl spezifischer Proteine, was zu einer irreversiblen Leitung der Zellen führt, sich einer Apoptose zu unterziehen. Die Caspase-abhängige Spaltung inaktiviert Proteine, welche an Reparaturmechanismen des Zellzyklus beteiligt sind (darunter die Kernproteine, Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) und DNA-abhängige Kinase), führt zur Zersetzung von Strukturproteinen wie Laminen oder aktiviert Proteine, proapoptotisch zu werden (p21-aktivierte Kinase und die Caspasen selbst). Es wurde gezeigt, dass auch die Signalübertragungsproteine MEKK1, p21-aktivierte Kinase 2, die fokale Adhäsions-Kinase, Ras-GTPase-aktivierendes Protein und Raf-1 Caspasesubstrate sind (Idmann u.a., 1998). Die wesentliche Rolle der Caspaseaktivität in der Ausführungsphase des apoptotischen Prozesses wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass die Inhibition der Caspasen im Allgemeinen zur Inhibition der Apoptose führt. Es tragen jedoch verschiedene Caspasen verschieden zu dem apoptotischen Programm in verschiedenen Zelltypen bei.
Die Caspasen zielen für die Spaltung auf Proteine ab, basierend auf dem Vorliegen eines Tetrapeptid-Erkennungsmotivs, einer Minimalsequenz, die für die Proteolyse erforderlich ist. Die Sequenz dieses Motivs unterscheidet sich unter den Caspasen deutlich, und einige Proteine, welche die optimale Tetrapeptidsequenz enthalten, werden nicht wirksam gespalten, was bedeutet, dass tertiäre Strukturelemente die Substraterkennung beeinflussen können (Thornberry, 1997). Dessen ungeachtet können alle Schwierigkeiten mit der Proteolyse ei nes bestimmten Peptids überwunden werden durch das Hinzufügen einer zusätzlichen Aminosäuresequenz, welche der Zielsequenz entspricht, die das Tetrapeptid flankiert.
Die vierzehn bislang identifizierten Caspasen der Säugetiere können als Auslöser- oder Stromaufwärts-Caspasen (z.B. Caspase-2, -8 und -10) oder als Effektor- oder Stromabwärts-Caspasen (z.B. Caspase-3, -6 und -7) klassifiziert werden, wobei die letzteren die entscheidenden Vollstrecker des apoptotischen Weges sind. Spezifische Peptid-Inhibitoren von Caspase-3 und -7 wie Z-DEVD-Fluormethylketon beeinträchtigen die meisten Formen der Säugetier-Apoptose (Gurtu u.a., 1997). Tumor-Nekrosefaktor, FAS-Ligand und chemotherapeutische Arzneimittel können durch die Aktivierung von Caspase-3 (Nagata 1997), welche für die Proteolyse einer großen Zahl von Substraten, darunter PARP, entweder vollständig oder teilweise verantwortlich ist, eine Apoptose herbeiführen. Caspase-3 erkennt ein Asp-Xaa-Xaa-Asp(DXXD)-ähnliches Motiv (DEVD in PARP und DNA-abhängiger Kinase), mit dem Erfordernis eines Asp in der P1-Position und einer markierten Präferenz für ein Asp in der P4-Position. Caspase-1 dagegen spaltet an der natürlich vorkommenden Sequenz Y-V-H-D-*-A, wobei „*" die Spaltungsstelle kennzeichnet.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft zwei Haupt-Ausführungsformen neuer Polypeptid-Reportermoleküle. Die erste Ausführungsform betrifft ein Polypeptid-Reportermolekül, welches mindestens eine zur Emission eines Signals fähige Nachweisdomäne und mindestens eine Verankerungsdomäne umfasst. Die Membranverankerungsdomäne fördert direkt oder indirekt die Assoziation des Polypeptid-Reportermoleküls mit einem subzellulären Kompartiment oder vorzugsweise mit einer Membran. Der Grad und die Geschwindigkeit der Membranassoziation des Polypeptid-Reportermoleküls kann durch Analysieren des Signals, welches von der Nachweisdomäne emittiert wird, überwacht oder untersucht werden. Dieses Signal stellt eine Markierung für den Membranassoziationszustand des Membranverankerungsabschnitts oder des Polypeptid-Reportermoleküls als ganzes bereit. Somit können Behandlungen oder Agenzien auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Membranassoziation oder -lokalisierung zu verändern, indem man das von der Nachweisdomäne emittierte Signal beobachtet oder misst. Zum Beispiel sind die Polypeptid-Reportermoleküle der ersten Ausführungsform insbesondere nützlich für das Suchen nach einer Verbindung, welche die Lipidierung verändert, durch:

A) das Bereitstellen einer Membran;
B) das Bereitstellen eines Polypeptid-Reportermoleküls, welches mindestens eine Nachweisdomäne umfasst, die ein Fluoreszenz, Lumineszenz-, radioaktives oder Farbsignal emittieren kann oder eine Resonanzenergie absorbieren kann, welche dann auf ein zweites Molekül übertragen (emittiert) wird, welches ein nachweisbares Signal emittiert; und mindestens eine Membranverankerungsdomäne, welche eine zur Förderung der Farnesylierung ausreichende Aminosäuresequenz eines Ras-Gens oder einer Variante davon umfasst;
C) das Bereitstellen von Bedingungen, welche ermöglichen, dass das Polypeptid-Reportermolekül mit der Membran assoziiert;
D) das Bereitstellen von Bedingungen, welche die Emission eines Signals von der Nachweisdomäne ermögli chen;
E) das Beobachten oder Messen des von der Nachweisdomäne emittierten Signals;
F) das Wiederholen der Schritte A) bis E) in Gegenwart einer zu testenden Verbindung;
G) das Vergleichen der in Gegenwart und Abwesenheit der getesteten Verbindung emittierten Signale, um die Wirkung der Verbindung auf die Lipidierung zu ermitteln.

Die Polypeptid-Reportermoleküle der ersten allgemeinen Ausführungsform sind ähnlich nützlich für die Beurteilung der Empfindlichkeit einer Zelle für ein Chemotherapeutikum durch:

A) das Bereitstellen eines Polypeptid-Reportermoleküls, welches mindestens eine Nachweisdomäne umfasst, die ein Fluoreszenz, Lumineszenz-, radioaktives oder Farbsignal emittieren kann oder eine Resonanzenergie absorbieren kann, welche dann auf ein zweites Molekül übertragen (emittiert) wird, welches ein nachweisbares Signal emittiert; und mindestens eine Membranverankerungsdomäne, welche eine zur Förderung der Lipidierung ausreichende Aminosäuresequenz umfasst;
B) das Bereitstellen einer zu testenden Zelle;
C) das Bereitstellen von Bedingungen, welche ermöglichen, dass das Polypeptid-Reportermolekül mit Zellmembranen assoziiert;
D) das Bereitstellen von Bedingungen, welche die Emission eines Signals von der Nachweisdomäne ermöglichen;
E) das Beobachten oder Messen des von der Nachweisdomäne emittierten Signals;
F) das Wiederholen der Schritte A) bis E) in Gegenwart des zu testenden Agens;
G) das Vergleichen der in Gegenwart und Abwesenheit des getesteten Agens emittierten Signale, um die Empfindlichkeit einer Zelle auf das (die) getestete(n) Chemotherapeutikum(-a) zu beurteilen.

Außerdem stellt die vorliegende Erfindung dort, wo die auf Empfindlichkeit für ein Chemotherapeutikum analysierten Zellen bösartige Zellen von einem Patienten sind, ferner ein Verfahren zum Auswählen einer geeigneten antineoplastischen Therapie für die Behandlung dieses Patienten bereit.
Die zweite Haupt-Ausführungsform betrifft ein Polypeptid-Reportermolekül, welches ferner mindestens eine Erkennungsstelle für hochspezifische Protease umfasst. Die Proteolyse des Polypeptid-Reportermoleküls an einer Erkennungsstelle für hochspezifische Protease ruft ein Signal von der Nachweisdomäne hervor oder verändert dies. Insbesondere umfasst das Polypeptid-Reportermolekül:

– mindestens eine zur Emission eines Signals fähige Nachweisdomäne;
– mindestens eine Erkennungsstelle für hochspezifische Protease;
– mindestens eine Membranverankerungsdomäne, welche die Assoziation des Polypeptid-Reportermoleküls mit einer Membran oder einem subzellulären Kompartiment fördert; wobei die Proteolyse des Polypeptid-Reportermoleküls an der mindestens einen Erkennungsstelle für hochspezifische Protease ein Signal von der Nachweisdomäne hervorruft oder verändert.

Über die zweite Ausführungsform hinweg versteht es sich, dass die Membranverankerungsdomäne durch eine subzelluläre Verankerungsdomäne ersetzt werden kann, welche die Assoziation des Polypeptid-Reportermoleküls mit einem subzellulären Kompartiment fördert. Das subzelluläre Kompartiment muss nicht membranartig sein und umfasst daher den löslichen Teil von: Zellkern, Cytosol, Matrix und Membranzwischenräume von Mitochondrien, Vakuolen, Lysosomen, Golgi-Apparaten, Peroxisomen und anderen subzellularen Kompartimenten. Dessen ungeachtet verändert die Spaltung einer Erkennungsstelle für hochspezifische Protease das Signal von der Nachweisdomäne, vorzugsweise durch Freigabe dieses Abschnitts des Polypeptid-Reportermoleküls von der Verankerungsdomäne, vorzugsweise dadurch, dass der Nachweisdomäne ermöglicht wird, durch die Zelle hindurch zu diffundieren oder zu einem anderen subzellulären Kompartiment zu migrieren.
Das Polypeptid-Reportermolekül der zweiten Ausführungsform liefert ein Werkzeug für eine Anzahl hier offenbarter Verfahren. Die vorliegende Erfindung stellt daher ferner Verfahren zum Suchen nach hochspezifischen Proteasen, Verfahren zum Untersuchen der Wirkungen bioaktiver Agenzien auf die Proteolyse durch Proteasen mit hochspezifischer Aktivität und Verfahren zum Überwachen der biologischen Wirkungen einer hochspezifischen Proteolyse, wie die Neigung einer Zelle, sich einer Apoptose zu unterziehen, bereit.
Im Zusammenhang der Hauptausführungsformen ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Agens zu finden, welches eine Substanz und/oder ein eiweißartiges Molekül in einer Zelle umverteilen kann. Solch ein Agens kann dazu fähig sein, mindestens teilweise die Funktion der Substanz und/oder des eiweißartigen Moleküls in der Zelle zu verändern. Die Veränderung der Funktion der Substanz und/oder des eiweißartigen Moleküls kann zu einem zumindest teilweise veränderten Phänotyp der Zelle führen. Ein Agens, welches zumindest teilweise den Phänotyp einer Zelle verändern kann, kann für die Entwicklung von Medikamenten für die Behandlung oder Verhinderung einer Krankheit verwendet werden. Zum Beispiel werden in einem nicht beschränkenden Beispiel wie Krebs die Zellen mit einem Agens versehen, welches ein oder mehrere eiweißartige Moleküle in Krebszellen umverteilen kann, und als Ergebnis dessen wird der bösartige Phänotyp der Krebszellen zumindest teilweise vermindert. Die vorliegende Erfindung versieht den Durchschnittsfachmann mit Werkzeugen und Verfahren, um die Umverteilung eines eiweißartigen Moleküls in einer Zelle oder unter zellulären Kompartimenten zu überwachen, wodurch wirksame Agenzien für die Behandlung von Krebserkrankungen und anderen Zell-Anomalitäten ausgewählt werden.
Die Fähigkeit, die Umverteilung eines eiweißartigen Moleküls in einer Zelle zu überwachen, kann auch von Wichtigkeit für die Entwicklung von Behandlungen für andere Erkrankungen wie infektiöse Erkrankungen oder Erbkrankheiten sein. Ein nicht beschränkendes Beispiel einer solchen Erbkrankheit ist die Zystische Fibrose, bei welcher eine häufig auftretende Mutation des CFTR-Proteins einen Verteilungsdefekt aufweist. Normales CFTR wird zur Plasmamembran einer Zelle transportiert, wo es seine Funktion als Innenkanal ausüben kann. Das besagte häufig auftretende mutierte CFTR ordnet sich nicht richtig an der Plasmamembran an. Die Mittel und Verfahren der Erfindung können deshalb auch angewendet werden, um Agenzien mit der Fähigkeit auszuwählen, die Verteilung des mutierten CFTR in eine geeignete Plasmamembranverteilung zu verändern, um Medikamente für die Behandlung der Cystischen Fibrose zu entwickeln.
In einer Erscheinungsform verwendet die Erfindung ein eiweißartiges Molekül, welches eine(n) Lokalisierungsteil oder -domäne umfasst, wobei die Lokalisierungsdomäne eine bestimmte Verteilung des eiweißartigen Moleküls in einer Zelle bewirkt, für die Ermittlung, ob ein Agens, mit welchem die Zelle versehen wird, die Verteilung des eiweißartigen Moleküls in der Zelle verändern kann.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Agens zu finden, welches die Verteilung des eiweißartigen Moleküls in einer Zelle zumindest teilweise beeinträchtigen und/oder zumindest teilweise verändern kann. Vorzugsweise kann das Agens die Funktion des eiweißartigen Moleküls in der Zelle verändern.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Analysen zum Ermitteln von Agenzien zu entwickeln, welche die Verteilung des eiweißartigen Moleküls in einer Zelle zumindest teilweise beeinträchtigen oder zumindest teilweise verändern und dadurch Agenzien mit einer möglichen Wirksamkeit bei der Veränderung der Funktion des Moleküls in einer Zelle zumindest vorauswählen. Vorzugsweise sind die Analysen geeignet für das Screening einer großen Zahl verschiedener Agenzien mit einer Einstellung auf einen vorzugsweise hohen Durchsatz.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pharmazeutika zu entwickeln, welche mindestens eines oder mehrere der besagten Agenzien für die Behandlung von Erkrankungen umfassen. Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, Analysen für die phänotypische Charakterisierung einer Zelle zu entwickeln, basierend auf der Fähigkeit eines Agens, ein eiweißartiges Molekül in der Zelle zumindest teilweise umzuverteilen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. K562-LNC-EGFP-RasF-Zellen, welche auf die Membran gezieltes EGFP bei niedriger (A, 240×) und hoher (B, 480×) Vergrößerung exprimieren. Das Zielen von EGFP wird durch den Umriss der Membran offensichtlich. Einige Zellen zeigen exzentrische helle Flecken, welche sich im Golgi-Apparat befinden können.
2. Hinzufügung des wohlbekannten Farnesyl-Transferase-Inhibitors FTI-276 (5 μM) zu den K562-LNC-EGFP-RasF-Zellen bei niedriger (A, 240×) und hoher (B, 480×) Vergrößerung. Die Inhibition der Farnesylierung führt zu einer Störung der Membranlokalisierung.
3. MT4-LNC-EFGP-DEVD-RasF-Zellen (A) exprimieren auf die Membran gezieltes EGFP. DEVD ist eine Erkennungsstelle für Caspase-3 und -7, Schlüsselenzyme, welche an der Apoptose beteiligt sind, und befindet sich zwischen der Farnesylierungs-Signalsequenz und EGFP. Die Spaltung dieser Verbinder-Sequenz durch Caspasen, nachdem sie dem Apoptoseverursacher Staurosporin ausgesetzt wurde, meldet eine Apoptose. (B) Die Herbeiführung der Apoptose (10 μM Staurosporin, 4 h) in MT4-LNC-EFGP-DEVD-RasF-Zellen zeigt sich durch verringertes EGFP-Membranzielen.
4. (A) MT4-LNC-EFGP-RasF-Zellen exprimieren auch EGFP auf Membranhöhe. Das Protein enthält kein DEVD zwischen der Farnesylierungs-Signalsequenz und EGFP. (B) Die Herbeiführung der Apoptose durch Staurosporin (4 h) veränderte die Zellmorphologie, führte, verglichen mit 3B, aber nicht zu einer markierten Translokation von EGFP.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptid-Reportermoleküle, welche mindestens eine zur Emission eines Signals fähige Nachweisdomäne und mindestens eine Membranverankerungsdomäne umfassen. Die Membranverankerungsdomäne fördert direkt oder indirekt die Assoziation des Polypeptid-Reportermoleküls mit einer Membran. Der Grad und die Geschwindigkeit der Membranassoziation des Polypeptid-Reportermoleküls kann durch Analysieren des Signals, welches von der Nachweisdomäne emittiert wird, überwacht oder untersucht werden. In einigen Ausführungsformen umfasst das Polypeptid-Reportermolekül mindestens eine Erkennungsstelle für hochspezifische Protease. Die Proteolyse des Polypeptid-Reportermoleküls an einer Erkennungsstelle für hochspezifische Protease ruft ein Signal von der Nachweisdomäne hervor oder verändert dies.
In einer Erscheinungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Ermittlung der Fähigkeit eines Agens, zumindest teilweise die Verteilung einer Substanz in Beziehung zu einer oder mehreren Membran(en) oder Membrankompartimenten zu beeinträchtigen, umfassend:

A) das Bereitstellen einer Membran; B) das Bereitstellen eines Polypeptid-Reportermoleküls, welches einen Nachweisteil umfasst, welcher nachgewiesen werden kann, und mindestens einen Lokalisierungsteil, welcher direkt oder indirekt die Assoziation des Nachweisteils mit einer Membran fördern kann;
C) das Bereitstellen von Bedingungen, welche ermöglichen, dass das Polypeptid-Reportermolekül mit der Membran assoziiert;
D) das Bereitstellen von Bedingungen, welche die Emission eines Signals von dem Nachweisteil ermöglichen;
E) das Beobachten oder Messen des von dem Nachweisteil emittierten Signals;
F) das Wiederholen der Schritte A) bis E) in Gegenwart eines zu testenden Agens;
G) das Vergleichen der in Gegenwart und Abwesenheit der getesteten Verbindung emittierten Signale.

In einer Ausführungsform enthält das Polypeptid-Reportermolekül oder sein Nachweisteil eine Vielzahl von Nachweisdomänen, welche dieselben oder unterschiedliche sein können und dieselben oder unterschiedliche Signale emittieren können. In einer Ausführungsform verändert sich ein von einer Nachweisdomäne emittiertes Signal in Reaktion auf eine Veränderung (wie z.B. Spaltung, Phosphorylierung oder Ligandenbindung) in irgendeinem Teil des Moleküls. Der Nachweisteil, oder die -domäne, kann derselbe Teil sein wie die Lokalisierungsdomäne oder ein anderer. Die Funktion einer Nachweisdomäne ist es, den Nachweis des Polypeptid-Reportermoleküls zu ermöglichen, insbesondere seine Verteilung sichtbar zu machen. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polypeptid-Reportermolekül das eiweißartige Molekül oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder Analogon davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid-Reportermolekül eine Lokalisierungsdomäne, welche das eiweißartige Molekül oder ein funktioneller Teil, ein Derivat und/oder Analogon davon ist, und einen Nachweisteil.
In einer weiteren Ausführungsform weist ein Polypeptid-Reportermolekül innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung eine lokalisierte Verteilung in einer Zelle auf, bevor die Zelle mit einem Agens versehen wird. Es können jedoch auch Polypeptid-Reportermoleküle mit einer im Wesentlichen gleichmäßigen Verteilung in einer Zelle, bevor die Zelle mit dem Agens versehen wird, für die Erfindung verwendet werden, zum Beispiel für die Ermittlung der Fähigkeit eines Agens, eine lokalisierte Verteilung eines Polypeptid-Reportermoleküls mit einer gleichmäßigen Verteilung in einer Zelle herbeizuführen. Vorzugsweise ist ein Polypeptid-Reportermolekül in einer Membran einer Zelle lokalisiert, insbesondere in der Plasmamembran.
Innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung kann einer Zelle ein Agens hinzugefügt werden, um die Abtrennung eines Teils, welcher zumindest teilweise die Verteilung eines eiweißartigen Moleküls in einer Zelle ermittelt, von (einem) anderen Teil(en) des eiweißartigen Moleküls zu verhindern oder herbeizuführen, wodurch zumindest teilweise die Verteilung des/der anderen Teils/Teile verändert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform verändert die Verhinderung oder Herbeiführung der Abtrennung zumindest teilweise eine Funktion der Zelle. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verhinderung oder Herbeiführung einer Abtrennung ist die Verhinderung oder Herbeiführung einer proteolytischen Spaltung, vorzugsweise einer speziellen kurzen Aminosäuresequenz in dem eiweißartigen Molekül. Vorzugsweise ist die proteolytische Spaltung eine Caspasespaltung. Am besten wird die proteolytische Spaltung durch eine hochspezifische Protease vermittelt.
In der Praxis einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polypeptid-Reportermolekül eine oder mehrere Aminosäuresequenzen, welche eine Erkennungssequenz für eine hochspezifische Protease codieren, und fungiert daher als ein Target oder Substrat für die hochspezifische Protease. Die Erkennungssequenz kann irgendwo in dem Reporter auftreten, vorzugsweise innerhalb der Nachweisdomäne oder zwischen der Nachweis- und der Membranverankerungsdomäne. Die Erkennungssequenz kann daher einen separaten Aminosäurestrang umfassen oder einen Teil der Verankerungs- oder Nachweisdomänen umfassen. Die Erkennungssequenz kann eine einzelne hochspezifische Spaltungsstelle sein oder mehrere Stellen für dieselbe oder andere hochspezifische Spaltungen. Beispielhafte Anordnungen überzähliger und verschachtelter Spaltungsstellen werden von Nicholson (1999) offenbart.
In einer Ausführungsform ist die Nachweisdomäne ein fluoreszierendes Protein, in welches eine kurze Erkennungssequenz eingefügt worden ist. In einer anderen Ausführungsform sind Aminosäuren des fluoreszierenden Proteins durch ortsspezifische Mutagenese mutiert worden, um eine Erkennungsdomäne für hochspezifische Protease zu codieren. Obwohl es unwahrscheinlich ist, dass die Nachbarstellung der Erkennungs- und der Nachweisdomäne deren Funktion nachteilig beeinflusst, wird der Durchschnittsfachmann erkennen, dass einige Polypeptid-Reportermoleküle, welche eine hochspezifische Spaltungsstelle innerhalb einer Nachweisdomäne umfassen, möglicherweise nicht aktiv sind. Dessen ungeachtet gehört das Design und die Untersuchung geeigneter Konstrukte eindeutig zu den Fähigkeiten des Routiniers, außerdem können die hierin beschriebenen Polypeptid-Reportermoleküle unter Anwendung von Routineverfahren, wie jenen bei Sambrook u.a. (1989) beschriebenen, konstruiert werden.
Wie sie hierin verwendet wird, ist eine hochspezifische Protease eine natürlich vorkommende oder genetisch veränderte Protease, welche eine Proteinstruktur höherer Ordnung (sekundär, tertiär oder quartär), oder, insbesondere, eine begrenzte Sequenz linearer Aminosäuren erkennt. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform erkennt und spaltet eine hochspezifische Protease ein Polypeptid bei einer oder wenigen einzelnen Aminosäuresequenzen. Diese Aminosäuresequenzen sind komplex genug, um nicht häufig in der Natur aufzutreten, demzufolge umfasst die Erkennungssequenz dort, wo die Protease eine Aminosäuresequenz erkennt, mindestens drei und vorzugsweise vier oder mehr Aminosäuren. Eine hochspezifische Protease spaltet daher nicht mehr als 1 von 100, vorzugsweise nicht mehr als 1 von 500, insbesondere nicht mehr als 1 von 1000, noch besser nicht mehr als 1 von 5000 willkürlich gewählten natürlich vorkommenden Proteinen in einem Organismus. Am besten spaltet eine hochspezifische Protease weniger als 2, 3, 4, 5, 10 oder 20 natürlich vorkommende Proteine in einem Organismus. In der Praxis der vorliegenden Erfindung kann jede bekannte oder vermutete Spaltungs(Erkennungs)-Stelle für hochspezifische Protease verwendet werden. Diese Stellen können natürlich vorkommende Sequenzen oder abgeleitete Consensus-Sequenzen umfassen.
Es wird ferner angemerkt, dass die genaue Spaltungsstelle für eine hochspezifische Protease für die Praxis der vorliegenden Erfindung nicht ermittelt werden muss. Solange die Aminosäuresequenz der Spaltregion ermittelt wird, kann in der Tat diese Region oder ein Abschnitt dieser Region in ein Polypeptid-Reportermolekül innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung eingebaut werden. Umgekehrt ist es auch nicht notwendig, über ihre Neigung, ein Protein zu spalten, dessen Sequenz ermittelt werden kann, hinaus die Identität einer hochspezifischen Protease zu kennen. Wenn eine Zielregion definiert werden kann, dann kann die Aktivität jeder hochspezifischen Protease gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen oder ermittelt werden. Demzufolge kann durch Vergleichen der Aktivität einer hochspezifischen Protease in Gegenwart und Abwesenheit eines Agens der Effekt des Agens auf die Protease analysiert werden.
Erkennungsstellen für Säugetier-Proteasen und menschliche Proteasen werden bevorzugt und beinhalten sowohl lösliche als auch membranassoziierte Proteasen. In einer Ausführungsform kann eine im Allgemeinen lösliche Proteaseaktivität durch Einführung einer heterologen Membranverankerungssequenz als ein rekombinantes Fusionsprotein mit einer Membran assoziiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die hochspezifische Erkennungsstelle durch eine Protease gespalten, welche an der Apoptose beteiligt ist, zum Beispiel eine Caspase (z.B. Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-10, Caspase-11, Caspase-12, Caspase-13 (ERICE), Caspase-14) oder andere Mitglieder der ICE-ced3-Genfamilie (siehe Thornberry u.a., 1997). Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird der Caspaseaktivator Granzym B hier auch als eine Caspase bezeichnet. Ebenso bevorzugt wird ein Abschnitt der cytosolischen Domäne des Beta-Amyloid-Vorstufenproteins (APP) (Cescato u.a., 2000), insbesondere die Region, welche den Caspase-ähnliche Erkennungs-Consensus (IVL)ExD enthält (Weidemann u.a., 1999), und Regionen, welche Alpha-, Beta- oder Gamma-Sekretase-Stellen enthalten; Sequenzen, welche die Spaltungsstelle von Carboxypeptidase A1 (CPA) codieren (Hamstra u.a., 1999); weitere bevorzugte Caspase-Zielproteine sind in Tabelle 1 von Stroh und Schulz-Osthoff offenbart (1998).
Natürlich vorkommende und Consensus-Spaltungsstellen für die Caspasen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, und weitere Zielsequenzen können durch Positions-Scannen kombinatorischer Bibliotheken abgeleitet werden (Thornberry u.a., 1997), oder, herkömmlicher, durch Aufreihen der Spaltungsstellen natürlich vorkommender Substrate. Beispielhafte Spaltungsstellen und Umgebungssequenzen werden bei Nicholson, 1999; Stennicke und Salvesen, 1999; Stroh und Schulz-Osthoff, 1998; und in der PCT-Veröffentlichung WO 99/18856 bereitgestellt. Beispielhafte Substrate sind WEHD (Caspase-1), DEHD (Caspase-2), W/LEGD (Caspase-4 und -5), VEHD (Caspase-6), LETD (Caspase-7), IETD (Caspase-8), LEHD (Caspase-9), (I/L/V/P)EHD (Caspase-11) und IEPD (Granzym B).
Weitere und nicht beschränkende hochspezifische Proteasen für die Praxis der vorliegenden Erfindung, für welche die Erkennungsstellen bekannt oder ausreichend definiert sind, sind im „Handbook of Proteolytic Enzymes", Hrsg. A. J. Barrett, N. D. Rawlings & J. F. Woessner (Academic Press, London 1998), definiert. Akzeptable Zielerkennungsstellen sind auch bekannt für Kathepsine wie: Kathepsin B, welche Cystein-Proteasen sind, die bei Krebserkrankungen eine Rolle spielen und eine breite Spezifizität aufweisen, gekennzeichnet durch eine große hydrophobe Aminosäure oder Arginin an P2; Kathepsin D, Aktivstellen-Aspartyl-Proteasen, die bei Brustkrebs und anderen Krebserkrankungen eine Rolle spielen, spezifisch für hydrophobe Aminosäuren an P1 und P1'; Kathepsin K, eine Cystein-Protease, welche möglicherweise an Osteoporose beteiligt ist, für deren Erkennungs-/Spaltungsstelle eine hydrophobe Aminosäure an P2 erforderlich ist. Ebenfalls akzeptabel sind alle Erkennungssequenzen für die 18 Matrix-Metallaproteasen, welche bei verschiedenen Aspekten von Krebs, Zellmigration und Entzündungen eine Rolle spielen, darunter MMP-2 (Kollagenase IV), dessen optimales Substrat durch die Formel Hyp-Xaa-Pro-Leu-Ala-*-Met-Phe-Gly-Xaa-Hyp gegeben ist. Weitere Sequenzen sind z.B. die Thrombin-Erkennungssequenz für Fibrinogen, Val-Pro-Arg-*-Ser-Phe-Arg; die hochspezifische Sequenz D-R-V-Y-I-H-P-F-H-L-*-L-V-Y-S des Renins (einer Aspartin-Protease, welche durch Spalten und Aktivieren von Angiotensinogen den Blutdruck reguliert); die Erkennungssequenz C-P-G-R-*-V-V-G-G-S der Urokinase (eine Serin-Protease und ein Plasminogen-Aktivator, welche(r) bei Krebserkrankungen eine Rolle spielt); auch Sequenzen für Tryptasen, wie die Consensuss-Erkennungssequenz Gln(Glu)-X-Arg der Tryptase Clara (Kido u.a., 1999). Tryptasen sind Serin-Proteasen, welche bei allergischen Entzündungen und Asthma eine Rolle spielen, deren Erkennungsstellen im Allgemeinen durch Lys oder Arg an P2 und Pro an P3 oder P4 gekennzeichnet sind. Ebenfalls anwendbar sind Erkennungssequenzen für Elastasen, insbesondere die Serin-Protease Leukozyt-Elastase, welche bei Lungenkrankhei ten und Asthma eine Rolle spielt, und deren Erkennungsstelle durch Leu, Val, Ala, Ser oder Cys an P1 gekennzeichnet ist. Ebenfalls anwendbar sind die Erkennungsstellen jeder der Proteasen, überwiegend des Serin-Typs, welche an der Koagulation beteiligt sind, Kinin/Kallikrein und Komplementkaskaden, ebenso wie jene verschiedener Zellhaftungsmoleküle (CAMS) (z.B. Hoffman u.a., 1998); prostataspezifisches Antigen (PSA) (Coombs u.a., 1998); und die Beta- und Gamma-Sekretasen, welche bei der Alzheimer-Krankheit eine Rolle spielen (Selkoe und Wolfe, 2000; Capell u.a., 2000; Sudoh u.a., 2000).
Erkennungsstellen für virale und bakterielle Proteasen werden für die Praxis der Erfindung ebenfalls bevorzugt. Anwendbare Spaltungsstellen sind z.B., jedoch nicht darauf beschränkt, die Consensus-Spaltungsstelle D(E)-X-X-X-X-C(T)-*-S der HCV-Serin-Protease, Spaltungsstellen für die Herpesvirus-Serin-Proteasefamilie, darunter die Consensus-Spaltungssequenz V(L,A)-N(D,Q,E)-A-*-S und Erkennungsstellen für Coronavirus- und Poliovirus-Proteasen und Rhinovirus-3C-Cystein-Proteasen, welche zwischen Gln- und Gly-Resten spalten. Ähnlich anwendbar sind die Spaltungsstellen der HIV-1-Protease, wie zum Beispiel IRKILFLDGI (Christopher u.a., Biochemistry 1989, 28(26), 9881–90), und die HSV-1-Consensus-Spaltungsstelle LVLASSSF (O'Boyle u.a., 1997).
Ebenfalls bevorzugt sind die Erkennungsstellen für Metalloproteasen von S. macescens, L. pneumophila, P. aeruginosa und anderen Bakterien, welche für opportunistische Infektionen charakteristisch sind. Die P. aeruginosa-Spaltungsstelle folgt dem Consensus X-F-*-F(L,Y,V)-A. Ebenfalls bevorzugt sind die Erkennungsse quenzen der IgA-spezifischen Proteasen von verschiedenen pathogenen Bakterien wie die N. gonorrhoeae-, N. meningitidis- und H. influenzae-Serin-Proteasen und die S. pneumoniae und S. sanguis-Metalloproteasen, welche Pro-Thr- und Pro-Ser-Bindungen in den Prolin-reichen Gelenkregionen des IgA spalten. Ebenfalls anwendbar ist die Erkennungsstelle für die D-Ala-D-Ala-Dipeptidase VanX, eine Metalloprotease grampositiver Bakterien, welche ein Vancomycinbindungs-Target zerstört.
Erkennungsstellen für Parasit-Proteasen werden ebenfalls bevorzugt, darunter die Malaria-Plasmepsine, Aspartyl-Proteasen, welche an der Hämoglobinzersetzung beteiligt sind und hydrophobe Phe- oder Leu-Reste an P1 und P1' bevorzugen, ebenso wie Stellen für die Shistosoma-Aspartyl- und Leismania-Cystein-Proteasen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Assoziation oder Disassoziation eines vollständigen Polypeptid-Reportermoleküls oder eines Abschnitts davon und einer Membran. In einer Ausführungsform umfasst die Membran ein Zell-Lysat. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Membran gereinigte oder teilweise gereinigte Zellmembranen, zum Beispiel Kern-, Plasma-, Mitochondrien-, Endosom- oder Golgi-Membranen oder Vesikel. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Membran eine künstliche Lipidmembran wie z.B. ein Vesikel, Liposom oder eine Lipid-Mono- oder Doppelschicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Membranen in einer intakten Zelle enthalten. Geeignete Zellen sind prokaryotische und eukaryotische Zellen, darunter, aber nicht beschränkt darauf, E. coli, Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen. Bei Zellen von vielzelligen Tieren umfasst eine intakte Zelle sowohl In-vivo- als auch Ex-vivo-Zellen und beinhaltet daher den gesamten Bereich von immortalisierten oder frisch isolierten Kulturzellen bis zu intakten Patienten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle von einem Patienten, hiermit definiert als irgendeine Person oder nichtmenschliches Tier. Solche nichtmenschlichen Tiere sind z.B. alle domestizierten und wild lebenden Wirbeltiere, vorzugsweise, aber nicht darauf beschränkt: Mäuse, Ratten, Hasen, Fische, Vögel, Hamster, Hunde, Katzen, Schweine, Schafe, Pferde, Rinder und nichtmenschliche Primaten. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform ist der Patient menschlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Membran von oder in einer Tumorzelle, vorzugsweise einer umgewandelten, bösartigen oder kanzerösen Zelle, vorzugsweise von einem Patienten. Die Tumorzelle kann von einem soliden oder nicht-soliden Tumor sein, welcher von irgendeinem Zelltyp oder irgendeiner Körperstelle stammt, darunter, aber nicht darauf beschränkt, Zellen, welche von Krebserkrankungen des Gehirns, der Lunge (z.B. kleinzellige oder nicht-kleinzellige), des Eierstocks, der Brust, der Prostata, der Haut und des Dickdarms abgezweigt wurden, ebenso wie von Karzinomen und Sarkomen. Ebenfalls bevorzugt werden metastatische Zellen und Zellen von der Ursprungsstelle eines Tumors. Wie der Fachmann erkennt, ist es in einigen Ausführungsformen wünschenswert, einen Klon der Zellen zu erhalten oder mehrere Tumorzellen von demselben Patienten, derselben Metastase, Zellmasse oder Zelllinie zur Verwendung in Mehrfach-, Wiederholungs- oder Vergleichsanalysen.
Bedingungen, welche die Assoziation eines Polypeptid-Reportermoleküls mit einer Membran ermöglichen, werden im Allgemeinen von einer intakten Zelle oder einem ganzen Zell-Lysat bereitgestellt. Wo die Lokalisierungsdomäne ein Signal für enzymkatalysierte Lipidierung umfasst, enthält die intakte Zelle oder das Lysat ein geeignetes Lipidierungsenzym. Wo die Membran eine hochreine subzelluläre Membrankomponente umfasst, vorzugsweise in einer wässrigen Lösung, kann es zu bevorzugen sein, die Membran mit einem Lipidierungsenzym zu ergänzen, zum Beispiel durch Hinzufügen einer löslichen zellulären Fraktion eines Zell-Lysats. Wo die Lokalisierungsdomäne eine direkte Assoziation mit einem membranassoziierten Molekül wie einem Protein, Lipoprotein oder Glycoprotein fördert, beinhalten geeignete Bedingungen eine Membran, welche das geeignete membranassoziierte Molekül enthält, vorzugsweise in einer wässrigen Lösung oder einem Puffer. Wenn natürlich die Lokalisierungsdomäne eine direkte Assoziation mit Lipidkomponenten der Membran dirigiert, dann können geeignete Bedingungen eine wässrige Lösung natürlich abgezweigter oder synthetischer Membranlipide beinhalten, welche Glycerolipide, Phospholipide, Sphingolipide, Cholesterin, Choline, Ethanolamine, myo-Inositol und Ähnliches oder Kombinationen daraus sein können.
Bedingungen, welche die Emission eines Signals von dem Nachweisteil ermöglichen, hängen von dem gewählten Nachweissystem ab, werden aber dessen ungeachtet vom Fachmann gut verstanden. Zum Beispiel werden eigenfluoreszierende Proteine am besten in einer wässrigen Umgebung nachgewiesen, während der Nachweis enzymatischer Signale (z.B. von alkalischer Phosphatase, Luci ferase oder Beta-Galactosidase) das Hinzufügen fremder Substrate erfordern kann.
Nicht beschränkende Beispiele für Polypeptid-Reportermoleküle, welche für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind K-Ras-GFP-Fusions-Chimären. K-Ras, ein kleines GTP-bindendes Protein, zielt GFP durch eine C-terminale Farnesylgruppe und eine nahe polybasische Region auf die Plasmamembran. Es wurde gezeigt, dass die K-Ras-GFP-Fusions-Chimäre in einem dynamischen Gleichgewicht vorliegt, welches schnell zwischen einer plasmamembrangebundenen Form und einer cytosolischen Form wechselt (Yokoe u.a., 1996). GFP war nicht allgemein als Cotransfektions-Markierung verwendet worden, weil es nach der Fixierung und der Permeabilisierung mit Ethanol aus den Zellen entweicht. Um dieses Problem zu vermeiden, fusionierten Jiang u.a. (1998) GFP mit der Sequenz, welche die Farnesylierungs- und Palmitoylierungssignale zum Zielen des H-Ras auf die Plasmamembran liefert.
Ein anderes nicht beschränkendes Beispiel eines Polypeptid-Reportermoleküls ist EGFP-(DEVD)-RasF, wobei DEVD eine Caspase-Spaltungserkennungs-Signalsequenz ist, welche zu einer proteolytischen Spaltung eines Nachweisteils des Polypeptid-Reportermoleküls führt, welches nachgewiesen werden kann. Natürlich kann sich in einer alternativen Ausführungsform das DEVD-Erkennungssignal innerhalb der Nachweisdomäne befinden, derart, dass der Reporter fluoreszierende Eigenschaften behält, bis er von einer Caspase gespalten wird.
So wie hier verwendet umfasst ein Lokalisierungsteil eine oder mehrere Lokalisierungsdomänen. Eine Lokali sierungsdomäne umfasst irgendeine Aminosäuresequenz, welche eine Assoziation mit einer künstlichen oder Zellmembran oder einem subzellulären Kompartiment, welches löslich sein kann, direkt oder indirekt fördert. Dessen ungeachtet wird eine Lokalisierungsdomäne, wie hier verwendet, so verstanden, dass sie eine Vielzahl trennbarer Aminosäuresequenzen umfasst, von denen jede die Assoziation mit einer Membran oder einem subzellulären Kompartiment direkt oder indirekt fördern kann. In bevorzugten Ausführungsformen stellen Lokalisierungsdomänen Mittel zum Verankern einer Nachweisdomäne in einer Membran bereit. Wenn sie in die hier beschriebenen Polypeptid-Reportermoleküle eingebaut ist, dann umfasst daher eine Lokalisierungsdomäne vorzugsweise mindestens eine Verankerungsdomäne, vorzugsweise mindestens eine Membranverankerungsdomäne. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Membranverankerungsdomäne ein oder mehrere Signale für enzymkatalysierte Lipidierung, darunter, aber nicht darauf beschränkt, Signale für die Myristoylierung, die Palmitoylierung und insbesondere die oben erörterte Geranylgeranylierung oder Farnesylierung.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Lipidierungs-Signal von einer Ras-Sequenz abgeleitet, vorzugsweise H-, N-, K(i4)A- oder K(i4)B-Ras, insbesondere Ki4B-Ras und N-Ras. In einer Ausführungsform umfasst die Lipidierungs-Signalsequenz eine Farnesylierungs-Signalsequenz eines Ras-Proteins oder eines funktionellen Teils, Derivats und/oder Analogons davon. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Ras-Sequenz die Polylysin-Region des Ki4B-Ras oder N-Ras, einschließlich Varianten davon. Wie hier verwendet, umfasst eine Variante eine ähnliche Aminosäuresequenz, welche kon servative Aminosäure-Substitutionen aufweist, welche aber im Wesentlichen dieselbe Membranassoziationsneigung aufweist. Beispiele für konservative Substitutionen sind die Substitution eines aliphatischen Restes mit einem anderen, wie Ile, Val, Leu oder Ala untereinander, oder Substitutionen eines polaren Restes mit einem anderen, wie zwischen Lys und Arg; Glu und Asp, oder Gln und Asn (siehe Zubay, 1983).
Weitere akzeptable Lipidierungssignale können von Abschnitten GTP-bindender Proteine abgeleitet werden und können Peptide beinhalten, welche das MGC-Motiv von G-Protein-Alpha-Untereinheiten (z.B. die Alpha-Untereinheiten von G_i, G₀ und G_z) codieren (Galbiati u.a., 1999; Parenti u.a., 1993; Koegl u.a., 1994); cAMP-abhängigen Protein-Kinasen und verschiedenen retroviralen Hüllproteinen. In einer intakten Zelle wird ein Myristoylierungs-, Palmitoylierungs-, Geranylgeranylierungs- und Farnesylierungssignal dazu neigen, die bevorzugte Assoziation eines Polypeptid-Reportermoleküls mit dem inneren Blättchen der Plasmamembranen zu fördern. Dagegen wird eine Membranverankerungsdomäne, welche ein Signal für die Hinzufügung von Glykosylphosphatidylinositol (GPI) umfasst, dazu neigen, das Polypeptid-Reportermolekül auf das äußere Blättchen der Plasmamembran in einer intakten Zelle zu zielen (z.B. Seaton u.a., 2000; und Marcic u.a., 2000).
Eine Membranverankerungsdomäne umfasst ferner Sequenzen, welche direkt mit einer Membran oder Membrankomponenten assoziieren. In einer Ausführungsform ist die Membranverankerungsdomäne ein Lipid, ein Steroid, ein aliphatischer oder ein auf andere Weise lipophiler Teil. In einer anderen Ausführungsform ist die Membran verankerungsdomäne eine Peptid-, Lipopeptid- oder Glykopeptidsequenz, welche spezifisch mit einer Membrankomponente in Wechselwirkung tritt. In einer Ausführungsform ist die Membranverankerungsdomäne ein Lectin, welches an einen Kohlenhydrat-Teil eines membranassoziierten Proteins bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Membranverankerungsdomäne eine Peptidsequenz, welche von einem membranassoziierten Protein spezifisch erkannt wird. Nicht beschränkende Beispiele sind das von Georget u.a. (1997) beschriebene Androgenrezeptorsystem; Protein-Kinase-Sequenzen, darunter Protein-Kinase-C(PKC)-Sequenzen wie die von Sakai u.a. beschriebenen (1997); Caveolin-bindende Sequenzen (z.B. Galbiati u.a., 1999); Plasmamembran-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren wie der Parathyroid-Rezeptor (Conway u.a., 1999); membranassoziierte virale Sequenzen wie die Nef-Verankerungsregion (Welker u.a., 1998).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Membranverankerungsdomäne eine Polypeptid-Signalsequenz für die co-translatorische oder post-translatorische Insertion eines Polypeptids direkt in eine Membran. Solche Signalsequenzen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und beinhalten das γ-Faktor-Leader-Peptid von Saccharomyces; die Signalsequenz für IL-7, beschrieben in US-Patentschrift 4,965,195; die Signalsequenz für den IL-2-Rezeptor, beschrieben bei Cosman u.a. (1984); das IL-4-Signalpeptid, beschrieben in EP-367 566; das Typ-I-IL-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in US-Patentschrift 4,968,607; und das Typ-H-IL-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in EP-460 846.
Ebenso akzeptabel sind Leader-Sequenzen für die post- translatorische Insertion in Mitochondrienmembranen und spezifische Zielsequenzen für das endoplasmatische Retikulum, den Golgi-Apparat, Peroxisomen, Kernmembranen oder jedes andere membranartige zelluläre Subkompartiment.
Alternativ kann das Polypeptid-Reportermolekül ein Zielsignal für ein subzelluläres Kompartiment enthalten, an Stelle eines Membranankers. Das Zielsignal stellt eine Verankerungsdomäne zum Behalten des Reporters in einem löslichen subzellulären Kompartiment wie dem Zellkern bereit. Die Zieldomäne kann von einem DNA-bindenden Protein sein (z.B. einem Transskriptionsfaktor, einer Helicase, Topoisomerase oder Polymerase) oder von einem DNA-assoziierten Protein wie ein nukleosomes oder nukleoläres Protein. Zum Beispiel kann ein kleines fluoreszierendes Protein wie GFP über eine kurze Verbindersequenz, welche eine Caspase-3-Spaltungsstelle enthält, an NF_kappaB fusioniert werden. Wenn er in einer Zelle exprimiert wird, wird der Reporter durch den NF_kappaB-Anker auf den Zellkern gezielt und kann durch die Expression eines Signals von der Nachweisdomäne beobachtet werden. Nach der Spaltung an der Caspase-3-Stelle wird das GFP jedoch von seinem nuklearen Anker befreit und diffundiert durch die Zelle.
Davon ausgehend, dass Caspasen oder irgendeine Protease im Zellkern aktiv sein können, könnte man vorhersehen, dass Reportergene, welche auf den Zellkern gezielt werden, durch Entfernung eines Zielsignals durch Proteasespaltung „entzielt" werden können. Somit können Reportergenprodukte, außer dem Membran-Zielen, auch durch Einbau einer Verankerungsdomäne für einen gewünschte subzellulären Ort spezifisch an andere Orte gezielt werden (Chatterjee u.a., 1997). In der Tat tragen Polypeptide, welche für den Zellkern bestimmt sind, spezifische Zielsignale, welche als Nukleare Lokalisierungssignale (NLS) bezeichnet werden, welche die Translokation über die Kernhülle katalysieren. von Reportergenprodukten, insbesondere jenen mit weniger als etwa 70 kDa, welche durch eine Protease-Spaltungsstelle mit einem NLS verbunden sind, erwartet man, dass sie nach der Proteasespaltung vom Zellkern zum Zellplasma diffundieren. Umgekehrt erwartet man von Reportergenprodukten mit weniger als etwa 70 kDa, welche durch Protease-Spaltungsstellen miteinander verbunden sind, um ein Bindungsprotein von mehr als 70 kDa zu bilden, dass sie nach der Spaltung vom Cytosol zum Zellkern diffundieren.
Die Spaltung des nuklearen Enzyms Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP) ist ein nützlicher Indikator für einen programmierten Zelltod. Es wird von einer 116 kDa-Form zu 24 kDa- und 89 kDa-Fragmenten gespaltet. Es wird angenommen, dass hauptsächlich Caspase-3 und Caspase-7 für die PARP-Spaltung während der Apoptose verantwortlich sind (Cohen u.a., 1997). Daher kann in einer Ausführungsform eine Kernverankerungsdomäne das gesamte PARP umfassen oder einen Abschnitt des PARP, welcher ein NLS enthält. Ein Bindungsprotein, welches eine GFP-Nachweisdomäne umfasst, die durch eine Caspase-Spaltungsstelle mit einem PARP (oder einem NLS von einem PARP) verbunden ist, wird sich an dem Zellkern-Kompartiment lokalisieren. Nach Spaltung durch eine Caspase wird der GFP-Abschnitt vom Zellkern diffundieren und dadurch ein verändertes Nachweissignal emittieren.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung können auf eines oder eine Vielzahl von Agenzien angewendet werden, also auf ein oder mehrere Agenzien. Wie es hier verwendet wird, umfassen Agenzien Verbindungen, darunter: Chemikalien; kleine Moleküle wie Peptide und Nukleinsäuren; Pflanzen-, Bakterien-, Pilz- oder Tierextrakte, welche bioaktive Moleküle enthalten können; bekannte oder vermutete karzinogene Agenzien; Inhibitoren, Liganden oder Substrate von Enzymen, welche an der Proteolyse, Glykosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Proteolyse beteiligt sind; und bekannte und vermutete Chemotherapeutika und Kombinationen davon. Bekannte Chemotherapeutika sind z.B. ionisierende Strahlung, Cisplatin-Transferrin, Fluoxetin, Staurosporine, Vinblastin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Leucovorin, weitere Beispiele findet man im Physicians' Desk Reference (2000).
Wie es hier verwendet wird, können Agenzien ferner Behandlungsverläufe mit Bestrahlung und/oder Verbindungen umfassen, darunter In-vitro-Annäherungen an Behandlungsverläufe in einem Patienten. Ein Behandlungsverlauf kann solche Faktoren wie den Zeitverlauf, die Reihenfolge, die Konzentration, die Dosis und das Verfahren der Anwendung jeder Komponente einer Behandlung in Betracht ziehen.
Daher kann ein Agens der Erfindung irgendein bioaktives Agens sein, zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, eine Verbindung wie ein Molekül, ein Peptid oder ein eiweißartiges Molekül. Ein Agens kann auch ein Virus, ein Phage, ein Prion, eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle oder eine oder mehrere Wellenlängen elektromagnetischer Strahlung sein. Vorzugsweise ist das Agens eine Verbindung. Vorzugsweise wird das Agens in einer Menge verwendet, die für eine normale Zelle nicht toxisch ist. Vorzugsweise kann das Agens die Plasmamembran einer Zelle passieren.
In einer Ausführungsform ist ein Agens ein eiweißartiges Molekül. In einer anderen Ausführungsform ist ein Agens ein eiweißartiges Molekül, welches von einer Nukleinsäure codiert wird, wobei das Agens durch Versehen der Zelle mit einer Nukleinsäure, welche das eiweißartige Molekül codiert, einer Zelle bereitgestellt wird. Ein Agens kann direkt oder indirekt auf ein Polypeptid-Reportermolekül wirken. Eine mögliche indirekte Wirkung ist zum Beispiel die Aktivierung eines Signalweges durch ein Agens, wobei die Signalisierung zu einer Veränderung in der Zelle führt, was zu einer Umverteilung des Polypeptid-Reportermoleküls führt, wie durch Messung oder Nachweis von Veränderungen in einem von dem Nachweisteil emittierten Signal angezeigt wird.
Wie er hier verwendet wird, umfasst ein Nachweisteil eine oder mehrere Nachweisdomänen. Eine Nachweisdomäne ist irgendeine Aminosäuresequenz, ein Molekül oder ein Abschnitt davon, welche/-s/-r direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal erzeugen kann. Wie sie hier verwendet wird, wird eine Nachweisdomäne auch so verstanden, dass sie eine Vielzahl an trennbaren Aminosäuresequenzen, Molekülen oder Abschnitten davon umfasst, von welchen jede/-s/-r direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal erzeugen kann.
Wie er hier verwendet wird, kann ein Nachweisteil oder eine -domäne ein(e) resonante(r), farbige(r), farberzeugende(r), immunogene(r), fluoreszierende(r), lumineszierende(r) oder radioaktive(r) Sonde oder Teil sein. Ein Nachweisteil kann auch ein eiweißartiges Molekül sein, welches nachgewiesen werden kann, z.B. ein Enzym wie Beta-Galactosidase, Luciferase, alkalische Phosphatase, Beta-Lactamase usw. Ein Nachweisteil kann auch irgendein Molekül sein, welches mit herkömmlichen Techniken nachgewiesen werden kann, die verwendet werden, um eiweißartige Moleküle zu etikettieren, darunter, aber nicht darauf beschränkt, die Anwendung Epitop-spezifischer Antikörper und die Konjugation kleiner fluoreszierender Moleküle. In einer Ausführungsform umfasst ein Nachweisteil einen transkriptionellen Regulator, wie das heterologe Reportersystem, welches in US-Patentschrift 5,776,675 an Broad beschrieben ist.
Vorzugsweise ist eine Nachweisdomäne ein fluoreszierender, ein radioaktiver, ein lumineszierender und/oder ein gefärbter Teil. Vorzugsweise ist der fluoreszierende Teil ein fluoreszierendes Protein, hiermit definiert als irgendein Polypeptid, welches ein fluoreszierendes Signal emittieren kann, welches über der Hintergrundfluoreszenz einer intakten Zelle oder Membranzusammensetzung nachweisbar ist. Geeignete fluoreszierende Proteine sind z.B. Rotes Fluoreszierendes Protein (RFP) von der Spezies der Indopazifischen Seeanemone Discosoma, Grünes Fluoreszierendes Protein (GFP), abgezweigt von Aequorea victoria, und funktionelle Teile, Derivate, Analoge und/oder funktionell verbesserte Versionen davon. Ein nicht beschränkendes Beispiel einer funktionell verbesserten Version des GFP ist verbessertes Grünes Fluoreszierendes Protein (Enhanced GFP, EGFP), beschrieben bei Yang u.a., 1996. RFP, GFP und verbesserte Versionen von GFP (EYFP, EGFP, ECFP und EBFP) sind erhältlich von Clonetech. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung können diese Polypeptide austauschbar verwendet werden und können hier zusammenfassend als GFP bezeichnet sein.
RFP und GFP sind eigenfluoreszierende Proteine, welche ohne das Erfordernis irgendwelcher zellulärer Faktoren eine Fluoreszenz erzeugen, was die Proteine ideal für Studien in lebendem Gewebe macht. Die erfolgreichste Anwendung von GFP ist die Rahmenfusion mit Proteinen gewesen und die anschließende Expression in Zellen, um deren Verteilung und Schicksal zu überwachen. GFP ist erfolgreich praktisch auf jede Hauptorganelle der Zelle gezielt worden, darunter die Plasmamembran (Tsien, 1998). GFP ist durch Fusion mit K-Ras (Yokoe u.a., 1996), mit den letzten 20 Aminosäureresten von H-Ras (Jiang u.a., 1998), mit einer Pleckstrin-Homologie(PH)-Domäne (Stauffer u.a., 1998) oder mit einem Glykosylphosphatidylinotisol-Anker (De Angelis u.a., 1998) auf die Plasmamembran gezielt worden. De Angelis und seine Mitarbeiter entdeckten, dass dann, wenn zwei GFP-Moleküle in Nachbarschaft gebracht werden, Spektralveränderungen auftreten, welche ihnen ermöglichten, einen ratiometrischen Selbstassoziationsindex zu definieren (De Angelis u.a., 1998). Dieser Aspekt kann verwendet werden, um Screening-Analysen mit hohem Durchsatz zu entwickeln.
Andere mögliche Anwendungen des etikettierten GFP beim cytotoxischen Arzneimittel-Screening sind die Fusions-Chimären mit einem Kernporen-Membranprotein (Imreh u.a., 1998) oder einer Kern-RNA-Helicase (Valdez u.a., 1998). Die integrierte Fusion mit dem Kernporen-Membranprotein POM121-GFP wird in verschiedenen Zellinien korrekt auf die Kernporen gezielt und kann als Markie rung für nicht-invasive Studien der Kernporenverteilung und Kernhüllendynamik verwendet werden. Durch Überwachen der Kernhülle ist es auch möglich, zwischen apoptotischen und nekrotischen Prozessen zu unterscheiden, was beim Screening von toxischen Chemikalien nützlich sein kann. Die POM121-GFP-Fluoreszenz um die Zellkernumgebung herum ist schwächer oder fehlt in apoptotischen Zellen, im Gegensatz zu der unbeeinträchtigten Fluoreszenz in nekrotischen Zellen. Auch die durch Arzneimittel herbeigeführte Translokation der nukleolaren RNA-Helicase/des GFP-Fusionsproteins vom Nukleolus zum Nukleoplasma kann bei der Ermittlung der Wirksamkeit cytotoxischer Agenzien nützlich sein (Valdez u.a., 1998). Ein anderer auf GFP basierender Nachweis des programmierten Zelltodes (Apoptose) wurde von Xu u.a. (1998) beschrieben.
Für die Praxis der vorliegenden Erfindung sind die Absorption und Übertragung von Energie, mit der folgenden Emission eines nachweisbaren Signals, funktionell äquivalent zur direkten oder indirekten Emission oder Produktion eines Signals durch eine Nachweisdomäne. Und in einer Ausführungsform der Erfindung kann die Nachweisdomäne eine oder mehrere Komponenten eines Fluoreszenzresonanz-Energieübertragungs(FRET)-Systems umfassen. Solche Aspekte können auch genutzt werden, um Screening-Analysen mit hohem Durchsatz zu entwickeln. FRET ist ein Vorgang, bei welchem ein angeregtes Fluorophor (ein Resonanzgeber) seine Energie des angeregten Zustands auf ein lichtabsorbierendes Molekül (einen Resonanzempfänger) überträgt.
In der Praxis der vorliegenden Erfindung können sich die Resonanzgeber und die Resonanzempfänger auf demsel ben Molekül befinden. In einer Ausführungsform kann ein Polypeptid-Reportermolekül, welches eine Membranzieldomäne, mindestens eine Erkennungsstelle für hochspezifische Protease und eine Resonanzgeber-Nachweisdomäne umfasst, ein erstes Molekül umfassen, die verbleibende Komponente des FRET-Systems kann dann eine Membranzieldomäne und eine Resonanzempfängerdomäne umfassen. Dieses zweite Molekül kann, muss aber nicht notwendigerweise, eine Erkennungsstelle für hochspezifische Protease enthalten. Die Spaltung des ersten Moleküls durch die hochspezifische Protease verändert die gemeinsame Membranassoziation der beiden Moleküle, wodurch das Resonanzsignal verändert wird. Natürlich sind für den Fachmann andere Kombinationen zweiteiliger FRET-Systeme leicht ersichtlich. Resonanzübertragungssysteme, welche bei der Erzeugung und dem Nachweis eines Signals von der Nachweisdomäne nützlich sein können, sind z.B. jene in den US-Patentschriften 5,047,321; 5,340,716 und 5,709,994 an Loken, Ullman bzw. Pease beschriebenen.
Eine Resonanzübertragung kann zwischen zwei verschieden gefärbten Mutationen des GFP auftreten, wenn sie in enge Nachbarschaft gebracht werden (Mitra u.a., 1996). Die Störung der räumlichen Assoziation zwischen den Proteinen beseitigt den FRET-Effekt. Wenn zum Beispiel GFP und Blaues Fluoreszierendes Protein (BFP), ein blaues Derivat des GFP, durch ein kurzes Peptid verbunden sind, welches die Caspase-3-Erkennungssequenz DEVD enthält, dann kann die Aktivierung der intrazellulären Protease Caspase-3 während der Apoptose durch die FRET-Analyse überwacht werden. Betrachtet man die Schlüsselrolle der Caspase-3, dann basiert die Überwachung des Apoptoseprozesses in lebenden Zellen gewöhnlich auf dem Nachweis der Caspase-3-Aktivierung unter Verwendung fluorogener Proteasesubstrate, welche die DEVD-Erkennungssequenz enthalten.
Wie hier offenbart kann eine Veränderung oder das Fehlen einer Veränderung in der subzellulären Lokalisierung oder Membranassoziation eines Polypeptid-Reportermoleküls durch Nachweisen oder Ermitteln des Signals, welches von einer oder mehreren Nachweisdomänen emittiert wird, analysiert werden. Das Nachweisen bezieht sich auf die Gegenwart oder Abwesenheit eines Signals in einer bestimmten Zelle, einer Membran oder einem subzellulären Kompartiment, z.B. das Erscheinen eines Signals, wo vorher keines emittiert wurde, oder das Verschwinden eines vorher zu beobachtenden Signals. Das Ermitteln umfasst das Nachweisen, beinhaltet aber ferner eine Messung der relativen Intensität oder Geschwindigkeit der Veränderung eines Signals.
Wie sie hier verwendet wird, kann eine Lokalisierungsdomäne irgendein Molekül oder eine Substanz sein, welche(s) die Verteilung eines eiweißartigen Moleküls oder einer anderen Substanz in einer intakten Zelle, einem Zell-Lysat, welches eine Membran enthält, einer Lösung, welche eine Membran enthält, einem subzellulären Kompartiment oder einem löslichen Teil einer Organelle bekunden kann. Vorzugsweise ist die Lokalisierungsdomäne ein eiweißartiges Molekül einer Zelle oder ein funktioneller Teil, ein Derivat und/oder ein Analogon davon.
Die besagte Zelle kann eine prokaryotische Zelle oder eine eukaryotische Zelle sein. In einer Ausführungsform wird ein Polypeptid-Reportermolekül innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung in einem Lysat der Zelle, welches Zellmembranen umfasst und nach den Standardmethoden gereinigt oder angereichert sein kann, erzeugt oder damit vermischt. In einer anderen Ausführungsform wird das Polypeptid-Reportermolekül einer künstlichen Lipidmembran, wie z.B. einer Micelle, ausgesetzt. Ein nicht beschränkendes Beispiel einer intakten Zelle ist ein pathogenes Bakterium. Eine Veränderung in der Verteilung eines eiweißartigen Moleküls, welches von einem pathogenen Bakterium codiert wird, kann zumindest teilweise die Pathogenizität des pathogenen Bakteriums verändern. Wenn die besagte Zelle eine tierische oder menschliche Zelle ist, dann wird bevorzugt, dass das eiweißartige Molekül zumindest teilweise an einer Erkrankung des Tieres oder des Menschen beteiligt ist.
In einer Ausführungsform ist die besagte Zelle eine Tumorzelle, eine umgewandelte Zelle, ein Neoplasma, eine Krebszelle oder ein Derivat davon, wie z.B. eine etablierte Zelllinie einer Tumor- oder Krebszelle. Die Zelllinie kann aus Kulturzellen oder Patientenzellen von neuem erzeugt werden, oder die Zelllinie kann von einem Unternehmen erhalten werden, welches eine Gewebesammlung unterhält. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Zelle ein Pathogen, wobei das eiweißartige Molekül ein Molekül ist, welches von Nukleinsäure des Pathogens codiert wird. Ein nicht beschränkendes Beispiel eines solchen Pathogens ist ein Virus. Eine Veränderung in der Verteilung eines eiweißartigen Moleküls, welches von einem Virus codiert wird, kann zumindest teilweise die Virulenz des Virus verändern. Ein nicht beschränkendes Beispiel einer Lokalisierungsdomäne, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist die Pleckstrin-Homologie(PH)-Domäne (Stauffer u.a., 1998). PH-Domänen können in einer Vielfalt von Enzymen gefunden werden. Sie sollen an Phosphatidylinotisol-Lipide in Membranen binden. Auf diese Weise dient die PH-Domäne von Phospholipase C d1 durch Binden an Phosphatidylinotisol-4,5-biphosphat in Membranen als Lokalisierungsmodul. Es wurde gezeigt, dass eine GFP-PH-Fusion nach einer Rezeptorstimulation von der Plasmamembran dissoziiert, was zeigt, dass Phosphatidylinotisol-4,5-biphosphat eine zweite Botenfunktion haben kann (Stauffer u.a., 1998). Die letztere Studie beschrieb eine vorübergehende Dissoziierung von GFP-PH von der Plasmamembran, gefolgt von einer schnellen Rückverteilung zu der Plasmamembran (3 bis 8 Minuten), was dieses für potenzielle Inhibitoren beider Prozesse relativ unpraktisch zu erfassen macht. Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, verteilen die Lokalisierungsdomänen der Erfindung nach mehr als 10 Minuten, nachdem eine Zelle mit einem Agens der Erfindung versehen worden ist, an ihren ursprünglichen Ort zurück. Am besten verteilen die Lokalisierungsdomänen der Erfindung nicht nennenswert an ihren ursprünglichen Ort zurück, nachdem eine Zelle mit einem Agens der Erfindung versehen worden ist.
Die Verteilung kann auf eine oder mehrere bestimmte Organellen oder einen anderen unterscheidbaren Teil in einer Zelle oder einem Zell-Lysat begrenzt sein. Die Verteilung kann jedoch auch eine Verteilung über die gesamte Zelle oder eine cytoplasmische Verteilung sein.
Eine Lokalisierungs- oder Verankerungsdomäne, vorzugsweise eine Membranverankerungsdomäne, ist ein Teil, welches sich selbst und/oder ein verbundenes Molekül an einem bestimmten Ort in einer Zelle oder an einer sub zellulären Membran lokalisieren kann. Eine Membranverankerungsdomäne kann einen eiweißartigen Teil mit der ihm innewohnenden Fähigkeit umfassen, sich selbst und/oder ein verbundenes Molekül an einem bestimmten Ort in einer Zelle zu lokalisieren. Alternativ kann eine Membranverankerungsdomäne ein Teil mit der Fähigkeit sein, an ein anderes Molekül zu binden, wobei das andere Molekül an einem bestimmten Ort in einer Zelle lokalisiert ist. Des Weiteren kann eine Membranverankerungsdomäne auch eine Signalsequenz zum Modifizieren der Lokalisierungsdomäne und/oder eines verbundenen Moleküls umfassen, wobei die Modifizierung die Verteilung der Membranverankerungsdomäne und/oder des verbundenen Moleküls hinsichtlich einer Zellmembran beeinflusst und vorzugsweise verändert. Vorzugsweise ist die Signalsequenz zur Modifizierung der Membranverankerungsdomäne und/oder eines verbundenen Moleküls eine Signalsequenz, welche von einem zellulären Enzymmechanismus zur Befestigung eines oder mehrerer hydrophober Teile an der Membranverankerungsdomäne und/oder den verbundenen Molekülen erkannt werden kann.
Vorzugsweise ist ein hydrophober Teil der Erfindung eine Fettsäure, ein Isoprenoid und/oder ein Lipid. Vorzugsweise ist ein hydrophober Teil der Erfindung ein Inositol-Lipid, vorzugsweise ein Phosphatidylinositol-Lipid oder ein Glykosylphosphatidylinositol-Lipid. Ferner bevorzugt wird ein hydrophober Teil, welcher eine Fettsäure ist, vorzugsweise eine gesättigte Fettsäure wie Stearin-, Palmitin- oder Myristinsäure. Ferner bevorzugt wird ein hydrophober Teil, welcher ein Isoprenoid ist, vorzugsweise das 15-Kohlenstoff(C₁₅)-Isoprenoid Farnesyl (F) oder das 20-Kohlenstoff(C₂₀)-Isoprenoid Geranylgeranyl (GG). Allgemein bevorzugt werden hydrophobe Teile, welche Isopren(C5)-Einheiten und Derivate und/oder Analoge davon umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Membranverankerungsdomäne eine Lokalisierungsdomäne eines Ras-Proteins. Ras-Proteine umfassen eine Farnesylierungs-Signalsequenz, welche zumindest teilweise die Verteilung der Ras-Proteine auf die Plasmamembran bestimmt. Ansätze, Ras-Farnesylierungs-Inhibitoren als potenzielle Chemotherapeutika für die Behandlung von Ras-bezogenen Krebserkrankungen zu entwickeln, beinhalten In-vitro- und In-vivo-Tests. Basierend auf Unterschieden in den Affinitäten der Ras-Proteine für Farnesyl-Protein-Transferase (FPTase) ist es insbesondere wichtig, die inhibitorische Aktivität hinsichtlich K-Ras festzustellen, der Form des Ras, die bei menschlichen Krebserkrankungen am häufigsten mutiert ist (Kelloff u.a., 1997).
Die Inhibition der FPTase-Aktivität kann ermittelt werden durch Messen des Einbaus von tritiiertem Farnesylpyrophosphat in rekombinante Ras-Proteine oder Ras-bezogene Peptide. Für diese Analysen (Reiss u.a., 1990; Gibbs u.a., 1993; Kohl u.a., 1994; James u.a., 1995) wurde FPTase entweder aus gereinigten oder (halb)rohen Extrakten von E. coli oder Säugetier-Zelllinien erhalten (Prendergast u.a., 1994). Die Selektivität der Inhibitoren für FTase, relativ zu Geranylgeranyl-Transferasen (GGTasen), kann über den Einbau tritiiertem Geranylgeranylpyrophosphat in geeignete Empfängersubstrate ermittelt werden. Typischerweise wird die Selektivität der Inhibitoren für Squalen-Synthase ermittelt, welche die rückführende Dimerisierung von FPP zur Bildung von Squalen katalysiert (Cohen u.a., 1995).
Die Inhibition der Ras-Prozessierung wird herkömmlicherweise in intakten Zellen über das Exprimieren von Ras-Proteinen durchgeführt und wird metabolisch mit tritiiertem Mevalonat gekennzeichnet. In die Proteine werden Metaboliten der Mevalonsäure, wie Farnesylpyrophosphat, eingebaut (Hancock u.a., 1989). Strahlungs-gekennzeichnete Proteine wie Ras können in der Folge mit spezifischen Antikörpern immungefällt werden (Hancock u.a., 1989). Andere zelluläre Analysen, welche die biologische Aktivität der FTase-Inhibitoren demonstrieren (Gibbs u.a., 1996), beinhalten die Inhibition von Ras-vermittelten Zelleffekten wie Verankerungs-unabhängigem Wachstum (Kohl u.a., 1993; Kohl u.a., 1994), das Umstellen (James u.a., 1993) des morphologischen Phänotyps (z.B. Zusammenklumpung mehrerer Schichten, Seeburg u.a., 1984) und Veränderungen im Zytoskelett (Prendergast u.a., 1994).
Die Aktivität von FPT-Inhibitoren auf das Wachstum von Ras-abhängigen Tumoren, welche von umgewandelten menschlichen (xenografisches Transplantat) oder Nagetier(Isotransplantat)-Zellinien stammen, welche Mutations-Ras-Gene tragen, kann in Nacktmäusen ausgewertet werden (Hara u.a., 1993). Ein anderes In-vivo-Krebsmodell beinhaltet, dass transgene Mäuse unter Kontrolle des Mäusebrusttumor-Virus-Promotors ein aktiviertes Ha-Ras-Gen beherbergen. Diese Onkomäuse entwickeln regellos Mamma- und Speicheldrüsenkarzinome. In diesem Modell bewirken FTase-Inhibitoren einen Tumor-Rückgang (Kohl u.a., 1996). Die Assoziierung aktivierter Ras-Gene mit onkogener Umwandlung in Versuchstieren ist heute anerkannt (Barbacid, 1990). Die chemopräventive Aktivität von FTase-Inhibitoren kann in chemisch indu zierten Tumormodellen untersucht werden, welche sich auf mutierte Ras-Gene von Mäusen (Matzinger u.a., 1995), Ratten (Singh u.a., 1994) und Hamster (van Kranen u.a., 1991) beziehen.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid-Reportermolekül bereit, welches zwei oder mehr Membranverankerungsdomänen umfasst, wobei vorzugsweise eine eine Signalsequenz für die Lipidmodifikation der Lokalisierungsdomäne umfasst und eine zweite einen Polylysin-Strang umfasst.
Das Kultivieren einer Zelle, welche irgendein Polypeptid-Reportermolekül der Erfindung umfasst, kann durch jedes geeignete Verfahren zum Kultivieren der Zelle durchgeführt werden, vorausgesetzt, dass die Zeit zwischen dem Versehen der Zelle mit dem Agens und dem Ermitteln der Verteilung zumindest eines Teils des Polypeptid-Reportermoleküls in der Zelle lang genug ist, um den Nachweis oder die Ermittlung einer Veränderung in der Verteilung des Polypeptid-Reportermoleküls zu ermöglichen.
Eine Veränderung in der Verteilung eines Polypeptid-Reportermoleküls in einer Zelle als Ergebnis des Versehens der Zelle mit einem Agens bezieht sich im Zusammenhang der Erfindung auf ein beobachtetes Endergebnis und nicht auf ein Verfahren, mit welchem das Ergebnis erreicht wird. Zum Beispiel kann das Ergebnis durch eine tatsächliche Veränderung in der Verteilung des bestimmten Polypeptid-Reportermoleküls von einem Ort in einer Zelle zu einem anderen Ort in einer Zelle bewirkt werden. Alternativ kann eine offensichtliche Umverteilung eines Polypeptid-Reportermoleküls durch ein Umlen ken neu synthetisierter, in einigen Fällen modifizierter, Polypeptid-Reportermoleküle an einen neuen Ort in einer Zelle bewirkt werden, als Ergebnis des Versehens der Zelle mit einem Agens. In diesem nicht beschränkenden Beispiel können Polypeptid-Reportermoleküle, welche synthetisiert wurden, bevor die Zelle mit einem Agens versehen wurde, durch ein Turnover der früher synthetisierten Moleküle verschwinden. Eine Veränderung in der Verteilung der Polypeptid-Reportermoleküle kann auch durch eine Kombination dieser Prozesse oder über völlig andere Prozesse bewirkt werden.
Das Signal oder die Veränderung des Signals von einem Polypeptid-Reportermolekül kann eine Markierung für eine Zellfunktion bereitstellen. Daher stellt eine Erscheinungsform der Erfindung ein Verfahren zur Ermittlung der Fähigkeit eines Agens bereit, zumindest teilweise eine bestimmte Funktion in einer Zelle zu beeinflussen, umfassend:

– das Versehen einer Zelle oder Membran mit einem Polypeptid-Reportermolekül, welches einen Nachweisteil umfasst, welcher nachgewiesen werden kann, und eine Lokalisierungsdomäne, welche zumindest teilweise die Verteilung des Polypeptid-Reportermoleküls in der Zelle ermitteln kann,
– das Versehen einer Zelle oder Membran mit dem Agens,
– das Kultivieren der Zelle oder das Inkubieren der Membran, und
– das Ermitteln der Verteilung zumindest des Nachweisteils in der Zelle oder Membran.

Auf ähnliche Weise stellt eine andere Erscheinungsform der Erfindung ein Verfahren zur Ermittlung der Fähig keit eines oder mehrerer Agenzien, zumindest teilweise die Verteilung eines eiweißartigen Moleküls in einer Zelle zu stören, umfassend:

– das Versehen einer Zelle oder Membran mit einem Polypeptid-Reportermolekül, welches einen Nachweisteil umfasst, welcher nachgewiesen werden kann, und mindestens eine Lokalisierungsdomäne, welche zumindest teilweise die Verteilung des eiweißartigen Moleküls in der Zelle ermitteln kann;
– das Versehen einer Zelle oder Membran mit dem/den einen oder mehreren Agenzien, das Kultivieren der Zelle oder das Inkubieren der Membran, und das Ermitteln der Verteilung zumindest eines Teils des Polypeptid-Reportermoleküls in der Zelle oder Membran.

Vorzugsweise liegt ein Polypeptid-Reportermolekül, mit welchem eine Zelle versehen wird, vor dem Kontakt mit dem/den einen oder mehreren Agenzien wirksam nur nahe der Plasmamembran vor. Vorzugsweise wird die Verteilung des Polypeptid-Reportermoleküls durch eine Modifikation der Lokalisierungsdomäne verändert.
In einer Ausführungsform umfasst die Lokalisierungsdomäne eine Lipidierungs-Signalsequenz, vorzugsweise eine Farnesylierungs-Signalsequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Lipidierungs-Signalsequenz ein Teil, Derivat oder Analogon einer Farnesylierungs-Signalsequenz eines kleinen GTP-bindenden Proteins, vorzugsweise eines Ras-Proteins, am besten eines c-Ha-Ras-Proteins.
Eine Membran kann zum Beispiel durch Versehen einer intakten Zelle mit einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid-Reportermolekül codiert, mit einem Polypeptid-Reportermolekül versehen werden, oder alternativ kann das Polypeptid-Reportermolekül ein eiweißartiges Molekül sein, welche von dem Genom der Zelle codiert ist. Das Polypeptid-Reportermolekül kann einer Zelle oder Membranlösung auch in Form eines eiweißartigen Moleküls bereitgestellt werden. Wenn ein eiweißartiges Molekül einer Zelle direkt bereitgestellt wird, dann kann es zum Beispiel einer Zelle oder Membran als Lösung, Kolloid oder Partikel vorgelegt werden, welches durch Phagocytose, Pinocytose, Elektroporation oder Fusion mit einer anderen Zelle oder einem Membranvesikel in eine Zelle eingebaut werden kann. Wo eine Membran in Abwesenheit einer intakten Zelle mit einem Polypeptid-Reportermolekül versehen wird, kann der Reporter transkribiert und/oder vor Ort translatiert werden oder in Form eines eiweißartigen Moleküls mit der Membran vermischt werden.
Daher kann ein Polypeptid-Reportermolekül einer Membran in jedem Vektor (Trägermedium) bereitgestellt werden, welcher zum Einführen des Polypeptid-Reportermoleküls in die Membran geeignet ist. Wie er hier verwendet wird, umfasst ein Vektor jede/-s/-n Medium, Virus, Lösung, Partikel, Episom, Transgen, DNA oder RNA, welche/-s/-r zum Einführen eines Polypeptid-Reportermoleküls in eine Membran geeignet ist. Zum Beispiel kann eine Membran in einer Zelle mit dem Polypeptid-Reportermolekül versehen werden durch Kontaktieren der Zelle mit dem Polypeptid-Reportermolekül, wonach das Polypeptid-Reportermolekül in die Zelle eintritt. Eine Zelle kann jedoch auch durch ein Verfahren mit einem Polypeptid-Reportermolekül versehen werden, welches das Kontaktieren der Zelle mit einem Nukleinsäure-Übermitt lungsmedium umfasst, das Nukleinsäure umfasst, welche das Polypeptid-Reportermolekül codiert. Ein Nukleinsäure-Übermittlungsmedium kann jede Art von Nukleinsäure-Übermittlungsmedium sein, darunter, aber nicht darauf beschränkt, ein Calciumphosphat-Präzipat oder Liposome. Eine geeignete wässrige Lösung für die Elektroporation von Nukleinsäure in eine Zelle wird in der vorliegenden Erfindung auch als ein geeignetes Nukleinsäure-Übermittlungsmedium angesehen. Vorzugsweise ist das Nukleinsäure-Übermittlungsmedium ein Viruspartikel oder ein funktioneller Teil, Derivat und/oder Analogon davon. Vorzugsweise ist das Nukleinsäure-Übermittlungsmedium ein Adenoviruspartikel, ein adenoassoziierter Viruspartikel oder ein Retroviruspartikel oder ein funktioneller Teil, Derivat und/oder Analogon davon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäure-Übermittlungsmedium ein Retroviruspartikel, welcher von der stabilen Verpackungs-Zelllinie PT67 LNC-EGFP-(DEVD)-RasF oder PT67 LNC-EGFP-RasF produziert wird.
Die Zelle kann jeder Zelltyp sein, von welchem man eine Funktion darin verändern oder eine Veränderung beobachten können möchte. Die Zelle kann eine prokaryotische Zelle oder eine eukaryotische Zelle sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Zelle eine Krebszelle. In einer anderen Ausführungsform wird die Zelle verdächtigt, eine geringe Empfindlichkeit für das Agens aufzuweisen, zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, eine Krebszelle, welche verdächtigt wird, eine geringe Empfindlichkeit für ein Antikrebsmittel aufzuweisen. In einer Ausführungsform weist die Zelle eine geringe Empfindlichkeit für ein erstes Agens, zum Beispiel aufgrund der Tatsache, dass die Zelle eine arzneimittelresistente oder multi-arzneimittelresistente Krebszelle ist, und ein oder mehrere andere Agenzien werden hinzugefügt, um zu ermitteln, ob die geringe Empfindlichkeit für das erste Agens durch Verändern der Verteilung eines eiweißartigen Moleküls, welches an einem Prozess beteiligt ist, der die geringe Empfindlichkeit der Zelle für das erste Agens bewirkt, verändert werden kann.
Mit der Offenbarung der vorliegenden Erfindung kann der Durchschnittsfachmann Agenzien mit der Fähigkeit auswählen, die Verteilung eines Polypeptid-Reportermoleküls in einer Zelle zu verändern. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines Mittels und/oder ein Verfahren für einen Prozess der Entwicklung neuer Arzneimittel mit hohem Durchsatz bereit, bei welchem eine große Zahl unterschiedlicher Agenzien auf ihre Wirkung auf die Verteilung eines Polypeptid-Reportermoleküls der Erfindung durchsucht werden kann. Wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „hoher Durchsatz" auf eine Einstellung, wobei ein Verfahren der Erfindung in einer kurzen Zeitspanne viele Male durchgeführt wird, zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, die Automatisierung zumindest eines signifikanten Teils des Verfahrens. In solchen Ausführungsformen kann ein Verfahren der Erfindung in einer relativ kurzen Zeit wiederholt durchgeführt werden, um die Fähigkeit einer Vielzahl von Agenzien zu analysieren, die Verteilung eines Polypeptid-Reportermoleküls in einer Zelle zu beeinflussen.
Viele Variationen des Screenings mit hohem Durchsatz sind auf dem Fachgebiet bekannt und für die Praxis der vorliegenden Verfahren anwendbar. Allgemein beinhalten anwendbare Verfahren die Anwendung der konfokalen Mikroskopie, des ArrayScan(Cellomics,Pittsburgh,PA)-Screeningsystems für großen Inhalt (siehe Conway u.a., 1999) und der Autofokus-Mikroskopietechniken von Leblans und Van Donink, beschrieben in US-Patentanmeldung 09/521,618, eingereicht am 8. März 2000.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines Agens bereit, welches zumindest teilweise die Verteilung einer Substanz oder eines eiweißartigen Moleküls in einer Zelle beeinflussen kann, zur Ermittlung, ob das Agens zumindest teilweise eine Funktion der Zelle verändern kann. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines Agens bereit, welches zumindest teilweise die Verteilung einer Substanz oder eines eiweißartigen Moleküls in einer Zelle beeinflussen kann und für die Herstellung eines Medikaments zumindest teilweise eine Funktion in der Zelle verändern kann.
In einer Erscheinungsform stellt die Erfindung Mittel und Verfahren für die phänotypische Charakterisierung einer Zelle und ein Verfahren zum Messen eines Phänotyps einer Zelle bereit. In einer Ausführungsform der Erfindung ist diese Zelle eine Tumor-, Neoplasma- oder kanzeröse Zelle. Das Verfahren kann angewendet werden, um die Fähigkeit einer Zelle zu ermitteln, auf ein bestimmtes Agens oder eine Behandlung zu reagieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle von einem Patienten abgezweigt. Vorzugsweise wird das Verfahren angewendet, um die Empfindlichkeit einer Zelle von einem Patienten für ein bestimmtes Agens oder eine Art der Behandlung zu ermitteln. Die Beobachtungen hinsichtlich der Empfindlichkeit der Patientenzellen können dann verwendet werden, um ein Behandlungsschema nach Maß auszuarbeiten, um den Patienten hinsichtlich einer Erkrankung oder eines Erkrankungsrisikos zu behandeln. In einer Ausführungsform kann der gemessene Phänotyp ein arzneimittelresistenter Phänotyp, vorzugsweise ein Farnesylierungs-Inhibitions-resistenter Phänotyp sein. In einer anderen Ausführungsform ist der gemessene Phänotyp eine Empfindlichkeit für ein Agens oder eine Behandlung. Die Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zum Messen eines Phänotyps medizinaler Empfindlichkeit bereit. Vorzugsweise beinhaltet die besagte Charakterisierung die Ermittlung der Empfindlichkeit einer Zelle für ein bestimmtes Agens.
In einer Ausführungsform der Erfindung steht die Zelle im Verdacht, eine geringe Empfindlichkeit für das Agens aufzuweisen, vorzugsweise steht eine Krebszelle unter dem Verdacht, eine geringe Empfindlichkeit für ein Antikrebsmittel aufzuweisen.
In einer Erscheinungsform stellt die Erfindung die Verwendung von Mitteln und Verfahren der Erfindung für die Entwicklung neuer Arzneimittel mit hohem Durchsatz bereit.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Zelle mit einem Polypeptid-Reportermolekül versehen, indem die Zelle mit einem Nukleinsäure-Übermittlungsmedium kontaktiert wird, welches exprimierbare Nukleinsäure umfasst, die das Polypeptid-Reportermolekül codiert, und die Zelle kultiviert wird, um eine Expression des Polypeptid-Reportermoleküls zu erhalten. Vorzugsweise ist das Nukleinsäure-Übermittlungsmedium ein Viruspartikel oder ein funktioneller Teil, Derivat und/oder Analogon davon, vorzugsweise ein Adenovirus-Partikel, ein adenoassoziierter Viruspartikel oder ein Retrovirus-Partikel. Insbesondere ist das Nukleinsäure-Übermittlungsmedium ein Retrovirus-Partikel, welcher von den stabilen Verpackungs-Zelllinien PT67 LNC-EGFP-(DEVD)-RasF oder PT67 LNC-EGFP-RasF produziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Suchen nach einer Verbindung bereit, welche die Aktivität einer hochspezifischen Protease verändert, umfassend:

– das Bereitstellen einer Membran; das Bereitstellen eines Polypeptid-Reportermoleküls, welches mindestens eine zur Emission eines Signals fähige Nachweisdomäne umfasst; mindestens eine Erkennungsstelle für hochspezifische Protease; mindestens eine Membranverankerungsdomäne, welche die Assoziation des Polypeptid-Reportermoleküls mit einer Membran oder einem subzellulären Kompartiment fördert; wobei die Proteolyse des Polypeptid-Reportermoleküls an der mindestens einen Erkennungsstelle für hochspezifische Protease ein Signal von der Nachweisdomäne hervorruft oder verändert;
– das Bereitstellen von Bedingungen, welche die Emission eines Signals von der Nachweisdomäne ermöglichen;
– das Nachweisen oder Ermitteln des von der Nachweisdomäne emittierten Signals;
– das Wiederholen der obigen Schritte in Gegenwart einer zu testenden Verbindung;
– das Vergleichen der in Gegenwart und Abwesenheit der getesteten Verbindung emittierten Signale.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Analysieren der Emp findlichkeit einer Zelle für ein Chemotherapeutikum, umfassend:

– das Bereitstellen einer zu untersuchenden Zelle;
– das Exprimieren eines Polypeptid-Reportermoleküls, welches mindestens eine zur Emission eines Signals fähige Nachweisdomäne umfasst; mindestens eine Erkennungsstelle für hochspezifische Protease; mindestens eine Membranverankerungsdomäne, welche die Assoziation des Polypeptid-Reportermoleküls mit einer Membran fördert; wobei die Proteolyse des Polypeptid-Reportermoleküls an der mindestens einen Erkennungsstelle für hochspezifische Protease in der Zelle ein Signal von der Nachweisdomäne hervorruft oder verändert;
– das Nachweisen oder Ermitteln des von der Nachweisdomäne emittierten Signals;
– das Wiederholen der obigen Schritte in Gegenwart eines zu testenden Chemotherapeutikums;
– das Vergleichen der in Gegenwart und Abwesenheit des getesteten Agens emittierten Signale.

Noch eine andere bevorzugte Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Auswählen einer chemotherapeutischen Therapie, umfassend:

– das Bereitstellen einer Vielzahl von bösartigen Zellen von einem Patienten;
– das Einführen eines Polypeptid-Reportermoleküls in die Zellen, welches mindestens eine zur Emission eines Signals fähige Nachweisdomäne umfasst; mindestens eine Erkennungsstelle für hochspezifische Protease; mindestens eine Membranverankerungsdomäne, welche die Assoziation des Polypeptid-Reportermoleküls mit einer Membran fördert; wobei die Proteolyse des Polypeptid-Reportermoleküls an der mindestens einen Erkennungsstelle für hochspezifische Protease in der Zelle ein Signal von der Nachweisdomäne hervorruft oder verändert;
– das Analysieren der Empfindlichkeit durch Nachweisen oder Ermitteln von der Nachweisdomäne emittierten Signals in Gegenwart und Abwesenheit von zumindest einem Chemotherapeutikum; und
– das Auswählen einer geeigneten chemotherapeutischen Therapie zur Behandlung des Patienten.

In einer anderen Erscheinungsform der Erfindung wird ein Polypeptid-Reportermolekül in eine Zelle eingeführt, indem die Zelle einem Vektor ausgesetzt wird, welcher eine Nukleinsäure umfasst, welche die Expression des Polypetid-Reportermoleküls dirigieren kann.
In einer anderen Erscheinungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid-Reportermolekül bereit, welches einen Nachweisteil und eine Lokalisierungsdomäne umfasst, welches ferner einen Verbindungsteil umfasst, welcher den Nachweisteil und die Lokalisierungsdomäne verbindet. Vorzugsweise umfasst der Verbindungsteil eine spezifisch spaltbare Aminosäuresequenz, vorzugsweise eine Erkennungssequenz für hochspezifische Protease. Vorzugsweise kann die Aminosäuresequenz von einer Caspase gespalten werden. Vorzugsweise umfasst die Lokalisierungsdomäne eine Lokalisierungsdomäne von RasF oder einem funktionellen Teil, Derivat und/oder Analogon davon. Vorzugsweise umfasst der Nachweisteil ein eigenfluoreszierendes Protein, wie z.B. verbessertes grünes fluoreszierendes Protein oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder Analogon davon. Insbesondere ist das Polypeptid-Reportermolekül Verbessertes Grünes Fluoreszierendes Protein-(DEVD)-RasF oder ein funktioneller Teil, Derivat und/oder Analogon davon.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verbessertes Grünes Fluoreszierendes Protein-RasF oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder Analogon davon bereit.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zelle bereit, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid-Reportermolekül umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid-Reportermolekül in der Zelle exprimiert.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Nukleinsäure bereit, welche ein Polypeptid-Reportermolekül der Erfindung oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder Analogon davon codiert.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Nuleinsäure-Übermittlungsmedium, oder einen -Vektor, bereit, welches/-r eine Nukleinsäure umfasst, die ein Polypeptid-Reportermolekül der Erfindung oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder Analogon davon codiert.
In einer Erscheinungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer Lokalisierungsdomäne eines zellulären eiweißartigen Moleküls in einem Polypeptid-Reportermolekül bereit zum Auswählen eines Agens, welches zumindest teilweise die Verteilung des eiweißartigen Moleküls in einer Zelle, welche das eiweißartige Molekül umfasst, beeinflussen kann, aus einer Gruppe von Agenzien.
Mit dem Begriff „Lipidierungs-Signalsequenz", wie er hier verwendet wird, ist eine Signalsequenz gemeint, als dessen Ergebnis ein Molekül wird einem oder mehreren Lipidteilen versehen wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche lediglich beispielhaft sind und in keiner Weise beschränkend sein sollen.
BEISPIELE
Konstrukte und Zelllinien
Die Idee war es, EGFP durch Verwendung einer Farnesylierungs-Signalsequenz auf die Plasmamembran zu zielen. Das CAAX-Motiv ist die einzige Erkennungsstelle für das Enzym Farnesyl-Transferase; somit liefert die Addition von CAAX-Sequenzen an ektopische Proteine diesen Substrate für die Farnesylierung. Die letzten 20 Aminosäuren des c-Ha-Ras sorgen für eine Farnesylierung und Palmitoylierung zum Zielen des Ras-Proteins auf die Plasmamembran. Wir fusionierten die C-terminale Membranziel-Signalsequenz des menschlichen c-Ha-ras1 (J00277, NCBI) an das C-terminale Ende des EGFP (Clontech).
Farnesylierungsanalyse
Zwanzig Aminosäuren des C-terminalen Endes des c-Ha-ras1, welche sich im Exon 4 befanden, wurden durch Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Klonierung an das C-Ende der EGFP-Codierungssequenz addiert.
Die PCR-Verstärkung des EGFP wurde mit einem 3'(antisense)-Primer (SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 2) durchgeführt, welcher die folgenden Regionen enthält, welche unten in-sense dargestellt sind: (i) die Codons der 6 C-terminalen Aminosäurereste des EGFP, (ii) stromabwärts gefolgt von den Codons, welche den 20 C-terminalen Aminosäureresten des c-Ha-ras1 entsprechen, (iii) der Reihe nach gefolgt von einer Hind-III-Schnitt(Adapter)-Stelle, (iiii) endend mit einer irrelevanten tctgtc-Sequenz, von welcher man annimmt, dass sie die Hind-III-Digerierung erleichtert. Man beachte, dass durch diese PCR die Mehrfach-Klonierungs-Stelle des pEGFP-C1 gelöscht wurde und das Stop-Codon (*) des c-Ha-ras1 enthalten ist.
Das antisense-Oligonucleotid, welches bei der PCR-Reaktion verwendet wurde, war
5'GACAGAAAGCTTTCAGGAGAGCACACACTTGCAGCTCATGCAGCCGGGG
CCACTCTCATCAGG AGGGTTCAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCAT 3'
(SEQ ID NO: 3)
Caspaseanalyse
Für das Apoptose-Konstrukt wurde derselbe Primer verwendet, außer dass eine Sequenz, welche DEVD (d.h. die Caspase-3- und Caspase-7-Spaltungsstelle) codierte, zwischen EGFP und der Ras-Plasmamembran-Zielsignalsequenz enthalten war (SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5).
Das antisense-Oligonukleotid, welches bei der PCR-Reaktion verwendet wurde, war:
5'GACAGAAAGCTTTCAGGAGAGCACACACTTGCAGCTCATGCAGCCGGGGCCACTCTCATCAGGAGGGTTCAGCTTGTCCACCTCGTCCTTGTACAGCTCGTCCAT 3' (SEQ ID NO: 6)
In der Farnesylierungsanalyse und in der Caspaseanalyse wurde derselbe 5'(sense)-Primer verwendet. In diesem Primer, unten dargestellt, ist eine Kozak-Sequenz eingebaut, weil pLNCX, der Expressionsvektor für das EGFP-(DEVD)-Farnesyl, keine Kozak-Sequenz enthält. Von dieser Sequenz nimmt man an, dass sie die Translation verbessert. Von 5' bis 3' enthält der Primer (i) eine irrelevante gacaga-Sequenz, welche die Hind-III-Stelle flankiert, von der man annimmt, dass sie die Hind-III-Digerierung erleichtert, (ii) eine Region, welche mit der Kozak-Sequenz übereinstimmt (unterstrichen), und (iii) 15 Nucleotide der EGFP-codierenden Sequenz, welche den 5 N-terminalen Aminosäureresten entsprechen und die Kozak-Sequenz überlappen. Das Sense-Oligonukleotid bei der PCR-Reaktion war identisch mit diesem unten angegebenen.
Die PCR ergab als EGFP-(DEVD)-RasF bezeichnete Fragmente, welches in der Hind-222-Region des retroviralen Vektors pLNCX kloniert wurde. Das resultierende Konstrukt pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF wurde durch Sequenzanalyse bestätigt. pLNCX, abgezweigt vom Moloney-Maus-Leukämievirus (Mo-MuLV), ist für eine retrovirale Genübermittlung und Expression vorgesehen (Miller und Rosman, 1989). Dieser Vektor enthält ein Neomycin-Resistenz(N)-Gen, gesteuert von einem 5'-viralen LTR (L), für die antibiotische Selektion in eukaryotischen Zellen und eine Klonierungsstelle X (Hind III, Hpal und Clal) stromabwärts von einem unmittelbar Cytornegalovirus(C)-benachbarten frühen Promotor. Die y-Sequenz ist ein erweitertes virales Verpackungssignal, welches dafür benötigt wird, dass das virale Vektor-Transkript in Virionen verpackt wird. pLNCX enthält nicht die viralen Strukturgene (gag-pol und env), welche für die Partikelbildung und Replikation erforderlich sind. Sie können jedoch in Verpackungs-Zelllinien in trans bereitgestellt werden, welche diese Gene stabil exprimieren. Eine solche kommerziell erhältliche Zelllinie, PT67, exprimiert die gag-pol- und env-Gene von zwei separaten Plasmiden. Das env(envelope)-Gen, welches den viralen Tropismus bestimmt, ermöglicht, dass virale Partikel, welche durch PT67-Zellen gebildet werden, eine breite Vielfalt von Ziel-Zelltypen infizieren.
Nach der Infektion tritt in der Zielzelle eine umgekehrte Transkription und eine stabile chromosomale Integration des viralen Vektors auf. Wenn die Zielzellen keine viralen Komplementärgene enthalten, dann bleibt der retrovirale Vektor, welcher das/die Gen(e) von Interesse enthält, in Form eines replikationsuntauglichen Provirus integriert.
Die amphotrope Verpackungs-Zelllinie PT67 (Clontech) wurde mit pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF transfiziert (Pfx-2, Invitrogen) und in 400 μg/ml-G418 selektiert. In den überlebenden Kolonien tritt die Transkription von (einem) stabil integrierten Plasmid(en) pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF auf. Die resultierende LNC-EGFP-(DEVD)-RasF-mRNA wird in EGFP-(DEVD)-RasF und das Neomycin-Resistenzprotein translatiert und wird ebenfalls replikationsuntaugliche Virionen verpackt. Daher produziert das PT67-pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF konstitutiv virale Partikel, welche das EGFP-(DEVD)-RasF und das Neomycin-Resistenzgen zur selben Zeit übertragen können. Diese amphotropen Virionen schaffen die Flexibilität, schnell neue Zelllinien zu entwickeln, welche EGFP-(DEVD)-RasF-Proteine stabil exprimieren. Auf diese Weise wurden die K562- und MT4(Suspensions)-Zelllinien für 96 h mit virusproduzierenden (adhäsiven) PT67-pLNC-EGFP-RasF- und entsprechend PT67-pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF-Zellen co-kultiviert. Der Gen-Transfer, welcher in den K562 und MT4-Zellen als Transduktion bezeichnet wird, ließ sich leicht durch Fluoreszenzmikroskopie beobachten.
Die K562(MT4)-Zellen wurden vom PT67-pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF getrennt, und nicht-transduzierte K562(MT4)Zellen wurden durch Selektion in 400 μg/ml-G418 entfernt. Die verbleibenden fluoreszierenden K562(MT4)-Zellen wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung unter Verwendung einer automatischen Zellablagerungseinheit direkt in 96 Well Plates kloniert. Das Gating war so eingestellt, dass nur stark fluoreszierende Zellen in den Vertiefungen abgelagert wurden, welche 50 μl eines 100%igen foetalen Kälberserums enthielten. Nach 1 h wurden 200 μl RPMI-Medium (+10% foetales Kälberserum), welches G418 enthielt, hinzugefügt, wobei eine Endkonzentration von 400 μg/ml angestrebt wurde. Zwei Wochen später wurden durch visuelle Inspektion unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops geeignete Klone selektiert und mit K562-LNC-EGFP-RasF oder MT4-LNC-EGFP-(DEVD)-RasF bezeichnet. Dasselbe Transduktionsschema kann im Prinzip auf jede Zelllinie von Interesse angewendet werden. Wenn die Ziel-Zelllinie wie der Produzent adhäsiv ist, dann kann man sich eine Co-Kultur ohne physischen Kontakt vorstellen.
Farnesyl-Transferase-Inhibitionsanalyse
Wenn EGFP-RasF ein Substrat für die Farnesyl-Transferase ist und daher farnesyliert wird, erwarten wir zu beobachten, dass die Fluoreszenz des EGFP auf Plasmamembran-Höhe zu sehen ist. Eine nahe mikroskopische Untersuchung von K562-Zellen (1, Vergrößerung 240× (A) und 480× (B)) zeigt deutlich, dass dies tatsächlich der Fall ist. Der Umriss der Plasmamembran zeigt daher an, dass die EGFP-Modifizierung mit einem Membranzielsignal bewirkte, dass EGFP sich zur Plasmamembran umlokalisierte. In Zellen, welche EGFP ohne eine Farnesylierungs-Signalsequenz exprimieren, wird die Fluoreszenz über die gesamte Zelle beobachtet. Hinsichtlich der hellen Flecken in den Zellen spekulie ren wir, dass dies EGFP repräsentiert, welches auf die Region um den Golgi-Apparat herum gezielt wurde.
Nachdem sie Farnesyl-Transferase-Inhibitoren ausgesetzt worden sind, sollte in diesen Zellen eine Störung der Farnesylierung und demzufolge der Membranverteilung beobachtet werden. Die Wirkung des wohlbekannten Farnesyl-Transferase-Inhibitors FTI-276 (Calbiochem) ist in 2 (Vergrößerung 240× (A) und 480× (B)) dargestellt. Bei ausreichend hohen Konzentrationen (> 5 μM) verschwindet die EGFP-Kompartimentierung fast vollständig nach der Zugabe des Inhibitors. Die Farnesyl-Transferase-Inhibition führt offensichtlich zur Entfernung von EGFP-(DEVD)-RasF vom inneren Blättchen der Plasmamembran und verteilt es gleichmäßig über die Zelle. Diese Translokation von EGFP ist Grund genug für uns, anzunehmen, dass die (digitale) Abbildung und eine geeignete Bildanalyse uns ermöglichen sollte, diesen Prozess zu quantifizieren. Im Hinblick auf die Tatsache, dass Ras-Proteine für eine onkogene Aktivität eine post-translatorische Modifikation mit einem Farnesyl-Teil benötigen, und dass man der Meinung ist, dass Farnesyl-Transferase-Inhibitoren ein Potenzial als Antikrebsmittel haben, ist diese Zellanalyse sehr gut geeignet für das Auffinden neuer Arzneimittel, welche spezifisch die Farnesylierung beeinträchtigen.
Caspaseanalyse
Der Einbau einer Caspaseerkennungsstelle (DEVD) zwischen dem EGFP-C-Ende und der Farnesylierungs-Signalsequenz führt auch zum Zielen auf die Plasmamembran der MT4-Zellen (3A). Die DEVD-Sequenz beeinträchtigt offensichtlich nicht die Farnesylierung. Die Spaltung des DEVD-Pentapeptids durch Caspase-3 und/oder Caspase-7 ist ein etabliertes Anzeichen der Apoptose. MT4-Zellen wurden gewählt, weil wir kürzlich in diesen Zellen eine durch Staurosporin herbeigeführte Caspase-3-Aktivität unter Verwendung des fluorogenen Ac(N-Acetyl)-DEVD-AMC-Substrats (Pharmingen, Ergebnisse nicht dargestellt) zeigen konnten. Nachdem die MT4-LNC-EGFP-DEVD-RasF-Zellen für 4 Stunden 10 μM Staurosporin ausgesetzt werden, verschwindet das Membranzielen des EGFP teilweise (3B), wie es aus der einheitlichen Fluoreszenzverteilung in den Zellen gefolgert werden kann.
Diese Beobachtung kann erklärt werden, wenn man eine Caspase-3/7-Spaltung an der DEVD-Stelle annimmt, wodurch die Verbindung zwischen EGFP und dem Membranzielsignal aufgebrochen wird. Wenn die Translokation des EGFP von dem wohlbekannten Apoptoseverursacher Staurosporin bewirkt wird, dann erwarten wir nicht, dass dieses Phänomen in MT4-LNC-EGFP-RasF-Zellen auftritt, welchen die DEVD-Spaltungsstelle fehlt. 4B zeigt, dass dies tatsächlich der Fall ist. In dieser Figur ist zu sehen, dass, obwohl Staurosporin innerhalb von Stunden die Zellmorphologie beeinflusst, wie es abzuleiten ist aus der abgerundeteren Form, verglichen mit den unregelmäßig geformten Zellen in 4A (kein Staurosporin hinzugefügt), keine auffällige Translokation des EGFP auftritt. Der einzige Unterschied zwischen MT4-LNC-EGFP-RasF und MT4-LNC-EGFP-DEVD-RasF ist das Vorliegen der DEVD-Spaltungsstelle, welche DEVD anzeigt, oder nicht, und daher ist die Caspase-3/7-Aktivität an der Entfernung von EGFP von der Plasmamembran beteiligt.
ZITIERTE LITERATUR
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SEQUENCE LISTING

Claims

Polypeptid-Reportermolekül, umfassend: A) mindestens eine zur Emission eines Signals fähige Nachweisdomäne; B) mindestens eine Proteaseerkennungsstelle; C) mindestens eine Verankerungsdomäne, die die Assoziation des Polypeptid-Reportermoleküls mit einer Membran oder einem subzellulären Kompartiment fördert; wobei es sich bei der Proteaseerkennungsstelle um eine von einer hochspezifischen Protease, die nicht mehr als 1 von 100 willkürlich gewählten natürlich vorkommenden Proteinen in einem Organismus spaltet, erkannte Stelle handelt und wobei die Proteolyse des Polypeptid-Reportermoleküls an der mindestens einen Proteaseerkennungsstelle ein Signal von der Nachweisdomäne hervorruft oder verändert.
Polypeptid-Reportermolekül nach Anspruch 1, wobei die Assoziation zwischen der Nachweisdomäne und der Membran oder dem Kompartiment durch die Proteolyse des Polypeptid-Reportermoleküls an einer Proteaseerkennungsstelle verändert wird.
Polypeptid-Reportermolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Proteaseerkennungsstelle innerhalb der Nachweisdomäne liegt.
Polypeptid-Reportermolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Proteaseerkennungsstelle die Nachweis- und die Verankerungsdomäne verbindet.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–4, wobei mindestens eine Nachweisdomäne ein Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder Farbsignal emittiert.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–5, wobei mindestens eine Nachweisdomäne ein Resonanzenergiesignal emittiert, das auf eine zweite, ein Signal emittierende Nachweisdomäne übertragen wird, die dann ein Signal emittiert.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–6, wobei mindestens eine Nachweisdomäne mindestens ein Enzym, ausgewählt aus den folgenden Enzymen, einschließlich funktionellen Teilen, Derivaten oder Varianten davon, umfaßt: Beta-Galactosidase, Luciferase, alkalische Phosphatase und Beta-Lactamase.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–7, wobei mindestens eine Nachweisdomäne ein Fluoreszenzprotein, einen funktionellen Teil, ein Derivat oder eine Variante davon umfaßt.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–8, wobei es sich bei mindestens einer Verankerungsdomäne um eine Zellkernverankerungsdomäne und bei dem subzellulären Kompartiment um einen Zellkern handelt.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–9, wobei es sich bei mindestens einer Verankerungsdomäne um eine Membranverankerungsdomäne, die die Assoziation des Polypeptid-Reportermoleküls mit einer Membran fördert, handelt.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–10, wobei mindestens eine Proteaseerkennungsstelle ein Substrat für eine membranassoziierte Protease umfaßt.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–10, wobei mindestens eine Membranverankerungsdomäne mindestens ein Signal für enzymkatalysierte Lipidierung umfaßt.
Polypeptid-Reportermolekül nach Anspruch 12, wobei mindestens ein Signal für Myristoylierung oder Pamitoylierung vorliegt.
Polypeptid-Reportermolekül nach Anspruch 12, wobei mindestens ein Signal für Geranylgeranylierung oder Farnesylierung vorliegt.
Polypeptid-Reportermolekül nach Anspruch 12, wobei das mindestens eine Signal eine zur Förderung der Prenylierung ausreichende Aminosäuresequenz eines GTP bindenden Proteins oder einer Variante davon umfaßt.
Polypeptid-Reportermolekül nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem GTP bindenden Protein um ein ras-Protein handelt.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–10, wobei mindestens eine Membranverankerungsdomäne mindestens ein Mitglied der Gruppe, gewählt aus dem Polylysin-Bereich von KiB-Ras und der c-Ha-Ras-Plasmamembran-Zielsignalsequenz oder funktionell äquivalenten Varianten davon, umfaßt.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–17, wobei mindestens eine Membranverankerungsdomäne spezifisch an ein membranassoziiertes Protein bindet.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–18, wobei mindestens eine Membranverankerungsdomäne in die Membran inseriert wird.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–19, wobei es sich bei mindestens einer Proteaseerkennungsstelle um ein Substrat für ein an Apoptose beteiligtes Enzym handelt.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–20, wobei es sich bei mindestens einer Proteaseerkennungsstelle um eine Caspase handelt.
Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–21, wobei mindestens eine Proteaseerkennungsstelle durch mindestens ein Enzym, gewählt aus Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-10, Caspase-11, Caspase-12, Caspase-13, Caspase-14 und Granzym B, gespalten wird.
Polypeptid-Reportermolekül nach Anspruch 22, wobei mindestens eine Proteaseerkennungsstelle ein Substrat für Caspase-3 und Caspase-7 umfaßt.
Polypeptid-Reportermolekül nach Anspruch 23, wobei mindestens eine Proteaseerkennungsstelle das Tetrapeptid Asp-Glu-Val-Asp enthält.
Nukleinsäure, die das Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–24 codiert.
Nukleinsäurevektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 25.
Zelle, umfassend das Polypeptid-Reportermolekül nach den Ansprüchen 1–24.
In-vitro-Verfahren zum Testen von Proteaseaktivität, umfassend: A) das Bereitstellen einer Membran; B) das Bereitstellen des Polypeptid-Reportermoleküls nach den Ansprüchen 1–24; C) das Bereitstellen von Bedingungen, die die Emission eines Signals von der Nachweisdomäne gestatten; D) das Beobachten oder Messen der zeitlichen Änderung der Signalintensität, -dauer, -frequenz oder -lokalisierung und E) das Korrelieren der Beobachtung oder Messung aus Schritt D) mit der Aktivität einer Protease, wobei es sich bei der Protease und eine hochspezifische Protease handelt, die nicht mehr als 1 von 100 willkürlich gewählten natürlich vorkommenden Proteinen in einem Organismus spaltet.
In-vitro-Verfahren zur Überwachung von Apoptose, umfassend: A) das Bereitstellen einer zu testenden Zelle, B) das Bereitstellen des Polypeptid-Reportermoleküls nach den Ansprüchen 1–24, C) das Bereitstellen von Bedingungen, die die Emission eines Signals von der Nachweisdomäne gestatten, D) das Beobachten oder Messen der zeitlichen Änderung der Signalintensität, -dauer, -frequenz oder -lokalisierung und E) das Korrelieren der Beobachtung oder Messung aus Schritt D) mit apoptotischer Aktivität.
In-vitro-Verfahren zum Testen einer Verbindung, die die Aktivität von Protease verändert, umfassend: A) das Bereitstellen einer Membran oder eines subzellulären Kompartiments, B) das Bereitstellen des Polypeptid-Reportermoleküls nach den Ansprüchen 1–24, C) das Bereitstellen von Bedingungen, die die Emission eines Signals von der Nachweisdomäne gestatten, D) das Beobachten oder Messen des von der Nachweisdomäne emittierten Signals, E) das Wiederholen der Schritte A) bis D) in Gegenwart einer zu testenden Verbindung und F) das Vergleichen der in Gegenwart und Abwesenheit der getesteten Verbindung emittierten Signale, wobei es sich bei der Protease um eine hochspezifische Protease handelt, die nicht mehr als 1 von 100 willkürlich gewählten natürlich vorkommenden Proteinen in einem Organismus spaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei es sich bei der Verbindung, die die Aktivität von Protease verändert, um einen Caspase-Inhibitor handelt.
Verfahren nach den Ansprüchen 28–31, wobei es sich um ein Verfahren mit hohem Durchsatz handelt.
Verfahren nach den Ansprüchen 28 und 30–32, wobei sich die Membran in einer Zelle befindet.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Zelle bösartig ist.
In-vitro-Verfahren zur Beurteilung der Empfindlichkeit einer Zelle gegenüber einem Chemotherapeutikum, umfassend: A) das Bereitstellen einer zu testenden Zelle, B) das Exprimieren des Polypeptid-Reportermoleküls nach den Ansprüchen 1–24 in der Zelle, C) das Beobachten oder Messen des von der Nachweisdomäne emittierten Signals, D) das Wiederholen der Schritte A) bis C) in Gegenwart des zu testenden Chemotherapeutikums und E) das Vergleichen der in Gegenwart und Abwesenheit des getesteten Agens emittierten Signale, F) das Beurteilen der Empfindlichkeit der Zelle gegenüber dem Agens.
In-vitro-Verfahren zur Auswahl einer Chemotherapie, umfassend A) das Bereitstellen mindestens einer bösartigen Zelle aus einem Patienten, B) das Zusammenbringen der mindestens einen bösartigen Zelle mit dem Nukleinsäurevektor nach Anspruch 26 oder der Nukleinsäure nach Anspruch 25 derart, daß die Zelle das Polypeptid-Reportermolekül enthält, C) das Beurteilen der Empfindlichkeit der mindestens einen bösartigen Zelle gegenüber einem Chemotherapeutikum durch Vergleichen des vom Polypeptid-Reportermolekül in Gegenwart bzw. Abwesenheit des Chemotherapeutikums emittierten Signals, D) das Auswählen eines entsprechenden Chemotherapeutikums zur Behandlung des Patienten.
Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, wobei die Zellen unterschiedlichen Chemotherapeutika ausgesetzt werden.