DE60022549T2

DE60022549T2 - Verwendung von einem für einem anti-angiogenen faktor codierenden vektor zur behandlung von vaskularisation der hornhaut

Info

Publication number: DE60022549T2
Application number: DE60022549T
Authority: DE
Inventors: Marc Abitbol
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: DE60022549D1; WO2001049316A3; ATE303820T1; ES2245656T3; EP1246642A2; WO2001049316A2; EP1246642B1; US20080107714A1; JP2004500369A; DK1246642T3; AU2857401A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Vektors, der eine für einen anti-angiogenen Faktor codierende Nukleinsäure umfasst, zur Prävention, Verbesserung und/oder Behandlung von Neovaskularisationen der Hornhaut. Sie betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen und eine Vorrichtung, die die lokale und wirksame Verabreichung dieses Vektors erlauben.
Keratopathien sind Pathologien der Hornhaut bzw. Cornea traumatischen, chemischen, infektiösen oder genetischen Ursprungs. Die häufigsten haben infektiösen viralen Ursprung wie die herpes- oder zosterartigen Keratopathien (ophthalmischer Zoster, neuroparalytischer Hornhautentzündung). Die traumatischen Keratopathien werden durch Schleudern kleiner Gegenstände wie Scherben von Windschutzscheiben während Verkehrsunfällen hervorgerufen und die chemischen Keratopathien können durch Verspritzen chemischer Substanzen auf den Augapfel hervorgerufen werden.
Die Gesamtheit dieser Pathologien kompliziert sich oft durch Neovaskularisationen, die zum großen Teil für die Trübung der Cornea verantwortlich sind, welche zu Blindheit führt. Die einzige derzeit verfügbare Behandlung, um das Sehvermögen des Patienten, der an Erblindungskeratopathie leidet, die durch Neovaskularisation verkompliziert ist, wieder herzustellen, ist das Cornea-Transplantat. Obwohl dieser Ansatz wirksam ist, ist er durch das Fehlen von Transplantaten beträchtlich limitiert: So beobachtet man in Frankreich einen jährlichen Mangel an 3000 Transplantaten. Dieser Punkt veranschaulicht die Notwendigkeit für neue Behandlungen von Erblindungskeratopathien.
Das Auge besteht aus einem vorderen Segment, das die Cornea, die vordere Kammer, die mit Augenwasser gefüllt ist, die Iris und die Linse enthält, und einem hinteren Segment, zu dem die Retina bzw. Netzhaut, die Chorioidea und der hintere Teil der Lederhaut gehören. Die Hornhaut bzw. Cornea enthält von der Oberfläche zur Tiefe des Auges das Hornhautepithel, die Bowman-Basalmembran, das Hornhautstroma und die Descernet-Membran, auf der das Hornhautendothel ruht. Die Cornea, eine fibröse und transparente Hülle, enthält weder Blut- noch Lymphgefäße. Sie wird durch Diffusion von Metaboliten durch das Augenwasser und Blutgefäße des Limbus (Sclero-Cornea-Verbindung) ernährt und erhält einen Teil des O₂ direkt aus der äußeren Umgebung.
Das Blutgefäßnetz des Auges stammt von der Arteria ophthalmica durch zwei getrennte Systeme, die Retinagefäße und das uveale Gefäßsystem, welches die vaskulären Netze der Iris, des Ciliarkörpers und der Chorioidea umfasst. Dieser Gefäßarm kann bei pathologischen Zuständen, die durch eine Verringerung des Blutflusses oder der Sauerstoffmenge gekennzeichnet sind, modifiziert sein. Neu gebildete Gefäße entstehen aus kleinen vaskulären Schleifen, hervorgegangen aus Venolen, am Rand ischämischer Zonen. Die Basalmembran dieser Venolen teilt sich unter der Wirkung proteolytischer Enzyme auf und ermöglicht so eine Migration von Endothelzellen. Diese ändern die Morphologie, vermehren sich, werden dann hohle Vacuolen, die sich fortschreitend vereinigen werden und sich zur Bildung von richtigen Gefäßlumen organisieren. Die schlechte Dichtheit der interendothelialen Verbindungen und die Unterbrechung der Basalmembran dieser neu gebildeten Gefäße erhöht ihre Permeabilität und bringt einen Austritt von Erythrozyten mit sich.
Diese Neovaskularisation oder Angiogenese ist somit der Ursprung einer Vielzahl von Sehkrankheiten bzw. Augenkrankheiten, die eine Verringerung der Sehschärfe, sogar Blindheit, hervorrufen. Die Proliferation der limbischen Gefäße in den oberflächlichen Schichten der Cornea tritt bei zahlreichen pathologischen Zuständen wie bei bestimmten viralen Keratokonjunktiva, insbesondere bei denen, die durch das Herpesvirus verursacht werden und Ödemen auf. Eine andere Form der Neovaskularisation, die geeignet ist, Blindheit nach sich zu ziehen, tritt in Fällen von Pterygium auf, in denen die Membram mit konjuktivalem Ursprung mit Pfortader-Gefäßen von peribullären Konjunktiva zur Corneaoberfläche sogar in die Tiefe zum Corneastroma fortschreitet. Die Pterygia können auch Corneatransplantate dazu bringen, neue Cornea-Neovaskularisationen hervorzurufen, was manchmal sehr schwierig ist.
Die Erfinder haben ein neues besonders wirksames Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von Hornhaut-Neovaskularisationen entwickelt, das in der Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen Vektor umfasst, welcher für einen antiangiogenen Faktor codiert, auf dem Niveau des Auges, kombiniert mit dem Aufbringen einer weichen Kontaktlinse auf die Hornhaut besteht. Die Kontaktlinse kann vor, gleichzeitig mit oder nach Verabreichung der Zusammensetzung, die den Vektor umfasst, eingesetzt werden. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung der Zusammensetzung, die den Vektor enthält, gleichzeitig mit dem Einsetzen der Kontaktlinse und noch bevorzugter erfolgt die Verabreichung durch vorherige Imprägnierung der Kontaktlinse mit der Zusammensetzung, die den Vektor enthält, vor Aufbringen der Linse auf die Hornhaut.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, die den Vektor enthält, kann in jeder Form vorliegen, die an eine okuläre Verwendung angepasst ist, und kann insbesondere in Form von Augentropfen oder Augensalbe vorliegen. In bevorzugter Weise präsentiert sich die pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Augentropfen.
Zur Untersuchung der Wirkung der antiangiogenen Faktoren bei der Präventation und Behandlung der Augenpathologien, die auf Neovaskularisation basieren, hat die Anmelderin zwei Rattentiermodelle verwendet, welche Hornhaut-Neovaskularisationen aufweisen. Die Übertragung von Nukleinsäuren, die für antiangiogene Faktoren codieren, wurde mit Hilfe von defekten rekombinanten Adenoviren, die für verschiedene antiangiogene Faktoren codieren, welche durch Instillation ins Auge oder durch Aufbringen von weichen Linsen, die vorher mit einer Lösung, die Adenoviren enthält, imprägniert worden waren, durchgeführt. In unerwarteter Weise hat die Anmelderin bewiesen, dass die Übertragung eines Vektors, der eine Nukleinsäure enthält, die für einen antiangiogenen Faktor codiert, auf dem Niveau der Cornea mit Hilfe einer Kontaktlinse, die vorher mit einer Lösung, die den Vektor enthält, imprägniert worden war, es ermöglicht, Hornhaut-Neovaskularisationen mit einer bis dahin nicht erreichten Wirksamkeit zu verhindern und zu behandeln.
Unter den verschiedenen antiangiogenen Faktoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, kann man insbesondere nennen: das N-terminale Fragment des Plasminogenaktivators uPA (ATF) (Appella et al., J. Biol. Chem. 262, 4437–4440 (1987), Angiostatin (M. O'Reilly et al., Cell 79, 1157–1164 (1994) und insbesondere Angiostatin K3 (N-terminales Fragment 1–333 des humanen Plasminogens), Endostatin (M. O'Reilly et al., Cell 88, 277–285 (1997), das 16 kDa-Fragment von Prolactin (C. Clapp et al., Endocrinol. 133, 1292–1299 (1993)) oder der Plättchenfaktor 4 PF-4 (S. K. Grupta et al., P.N.A.S., USA 92, 7799–7803 (1995)).
Eine erste Aufgabe der Erfindung betrifft die Verwendung eines Vektors, der eine für einen antiangiogenen Faktor codierende Nukleinsäure umfasst, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dazu bestimmt ist, durch Imprägnierung einer weichen Linse und Aufbringen der Linse auf die Hornhaut zur Prävention, Verbesserung und/oder Behandlung von Hornhaut-Neovaskularisationen verabreicht zu werden.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die für den antiangiogenen Faktor codiert, eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid codiert, das unter dem N-terminalen Fragment des Plasminogenaktivators uPA (ATF), Angiostatin, Angiostatin K3, Endostatin, dem 16 kDA-Fragment von Prolactin und dem Plättchenfaktor 4 (PF-4) ausgewählt ist, oder eine Kombination von Nukleinsäuren, die für wenigstens zwei dieser Faktoren codiert. In noch bevorzugter Weise ist der antiangiogene Faktor aus dem N-terminalen Fragment des Plasminogenaktivators uPA (ATF) und Angiostatin K3 ausgewählt.
Nach einer besonderen Ausführungsform ist der antiangiogene Faktor eine Variante der vorstehend genannten Faktoren. Im Sinn der vorliegenden Erfindung versteht man unter einer "Variante" eines Polypeptids oder eines Proteins jedes Analogon, jedes Fragment, jedes Derivat oder jede mutierte Form, das/die von einem Polypeptid oder einem Protein abgeleitet ist und das/die die antiangiogene Funktion des Polypeptids oder des Proteins beibehält. Im natürlichen Zustand können verschiedene Varianten eines Polypeptids oder eines Proteins vorliegen. Diese Varianten können Allelvariationen sein, die durch Unterschiede in der Nukleotidsequenz der Strukturgene, die für das Protein codieren, charakterisiert sind, oder können aus einem differenziellen Splicing oder einer posttranslationalen Modifikationen resultieren. Diese Varianten können durch Substitution, Deletion, Addition und/oder Modifikation eines Aminosäurerestes oder mehrerer Aminosäurereste erhalten werden. Diese Modifikationen können durch alle dem Fachmann bekannten Techniken verwirklicht werden.
Diese Varianten sind insbesondere Moleküle, die eine größere Affinität für ihre Fixierungsstellen haben, Sequenzen, die eine verbesserte Expression in vivo ermöglichen, Moleküle, die eine größere Resistenz gegenüber Proteasen aufweisen, Moleküle, die eine größere therapeutische Wirksamkeit oder geringere Nebenwirkungen oder gegebenenfalls neue biologische Eigenschaften haben.
Andere Varianten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind insbesondere Moleküle, in denen ein Rest oder mehrere Rest ersetzt wurde(n), Derivate, die durch Deletion von Regionen, die nicht oder weniger bei der Wechselwirkung mit den betrachteten Bindungsstellen intervenieren oder eine unerwünschte Aktivität exprimieren, erhalten wurden, und Derivate, die im Vergleich zur nativen Sequenz zusätzliche Reste enthalten, wie z.B. ein Sekretionssignal und/oder ein Bindungspeptid.
Die DNA-Sequenz, die für den antiangiogenen Faktor codiert und die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann eine cDNA, eine genomische DNA (gDNA) oder ein Hybridkonstrukt sein, das z.B. aus einer cDNA besteht, in die ein Intron oder mehrere Introns insertiert sind. Es kann sich um eine Nukleinsäure tierischen oder humanen Ursprungs handeln, vorzugsweise handelt es sich um eine Nukleinsäure humanen Ursprungs. Es kann sich auch um synthetische oder halb-synthetische Sequenzen handeln. In besonders vorteilhafter Weise verwendet man eine cDNA oder eine gDNA. Die Verwendung einer gDNA kann insbesondere eine bessere Expression in den humanen Zellen zulassen.
Vorteilhafterweise wird die Sequenz, die für den antiangiogenen Faktor codiert, unter die Kontrolle von Signalen gestellt, die seine Expression in den Zellen des Corneaepithels zulassen. Vorzugsweise handelt es sich um heterologe Expressionssignale, d.h. Signale, die sich von denen unterscheiden, die natürlicherweise für die Expression des antiangiogenen Faktors verantwortlich sind. Es kann sich insbesondere um Sequenzen, die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder um synthetische Sequenzen handeln. Es handelt sich insbesondre um Promotorsequenzen von Eukaryoten-Genen oder Virus-Genen. Beispielsweise handelt es sich um Promotorsequenzen, die vom Genom der Zelle stammen, die man infizieren möchte. Es kann sich sogar um Promotorsequenzen handeln, die vom Genom eines Virus stammen, hier eingeschlossen das verwendete Adenovirus. Diesbezüglich kann man z.B. die E1A-, MLP-, CMV-, LTR-RSV-Promotoren usw. nennen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Addition von Aktivierungssequenzen, Regulationssequenzen modifiziert sein oder eine gewebespezifische Expression erlauben. Es kann in der Tat besonders interessant sein, Expressionssignale zu verwenden, die spezifisch oder hauptsächlich in den Zellen der Cornea aktiv sind, so dass die DNA-Sequenz nur exprimiert wird und ihre Wirkung nur erzeugt, wenn der Vektor diese Zellen wirksam infiziert hat.
Die für einen antiangiogenen Faktor oder mehrere antiangiogene Faktoren codierende Nukleinsäure wird in einen Vektor eingeführt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter "Vektor" jedes Mittel, das den Transfer einer Nukleinsäure in eine Wirtszelle, vorzugsweise auf dem Niveau der Gewebe des Auges und insbesondere auf dem Niveau der Cornea, zulässt. Der Ausdruck "Vektor" umfasst die viralen und nicht-viralen Vektoren für den Transfer einer Nukleinsäure in vivo oder ex vivo in eine Zelle. Ein Vektortyp zur Durchführung der Erfindung kann z.B. ein Plasmid, ein Cosmid oder jede nicht durch ein Virus eingekapselte DNA, ein Phage, ein künstliches Chromosom, ein rekombinantes Virus usw. sein. Es handelt sich vorzugsweise um ein Plasmid oder ein rekombinantes Virus.
Unter den Vektoren des Plasmid-Typs kann man alle Klonierungs- und/oder Expressionsplasmide nennen, die dem Fachmann bekannt sind und die im Allgemeinen einen Replikationsursprung enthalten. Man kann auch Plasmide nennen, die Replikationsursprünge und/oder Selektionsmarker enthalten, die so vervollständigt sind, wie es z.B. in den Patentanmeldungen WO 96/26270 und WO 97/10343 beschrieben ist.
Unter den Vektoren vom rekombinanten Virus-Typ kann man vorzugsweise die Adenoviren, Retroviren, Herpesviren, Lentiviren, Adeno-assoziierte Viren oder das Virus SV40 nennen. Der Aufbau von rekombinanten Viren dieses Typs, die bezüglich der Replikation defekt sind, ist in großem Umfang in der Literatur beschrieben, ebenso wie die Infektionseigenschaften dieser Viren (siehe insbesondere S. Baeck und K. L. March (1998), Circul. Research, Bd. 82, S. 295–305), T. Shenk, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley et al. (1996), Adenoviridae: the viruses and their replication (in virology), S. 211–2148, EDS – Reavenspublishers/Philadelphia, P. Yeh und M. Perricaudet (1997), FASEB, Bd. 11, S. 615–623.
Ein besonders bevorzugtes rekombinantes Virus zur Durchführung der Erfindung ist ein defektes rekombinantes Adenovires.
Die Adenoviren sind Viren mit linearer Doppelstrang-DNA mit einer Größe von etwa 36 kb (Kilobasen). Es existieren davon verschiedene Serotypen, deren Struktur und Eigenschaften etwas variieren, die aber eine vergleichbare genetische Organisation aufweisen. Die rekombinanten Adenoviren können insbesondere humanen oder tierischen Ursprungs sein. Was die Adenoviren humanen Ursprungs angeht, so kann man vorzugsweise die nennen, die in der Gruppe C klassiert sind, insbesondere die Adenoviren des Typs 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) oder 12 (Ad12). Unter den verschiedenen Adenoviren tierischem Ursprungs kann man vorzugsweise die Adenoviren vom Hund nennen und insbesondere alle Stämme der Adenoviren CAV2 [Manhattan-Stamm oder A26/61 (ATCC VR-800) zum Beispiel]. Andere Adenoviren tierischen Ursprungs sind insbesondere in der Anmeldung WO 94/26914 genannt.
Das Genom der Adenoviren enthält insbesondere an jedem Ende eine invertierte terminale Wiederholungssequenz (ITR), eine Capsidierungssequenz (Psi), frühere Gene und späte Gene. Die hauptsächlichen früheren Gene sind in den Regionen E1, E2, E3 und E4 enthalten. Unter diesen sind die Gene, die in der Region E1 enthalten sind, insbesondere zur viralen Vermehrung notwendig. Die hauptsächlichen späten Gene sind in den Regionen L1 bis L5 enthalten. Das Genom des Adenovirus Ad5 wurde vollständig sequenziert und ist in Datenbanken zugänglich (siehe insbesondere Genbank M73260). Außer Teile wurde sogar die Gesamtheit anderer adenoviraler Genome (Ad2, Ad7, Ad12 usw.) sequenziert.
Zu ihrer Verwendung als rekombinante Vektoren wurden verschiedene Konstrukte, abgeleitet von den Adenoviren, hergestellt, die verschiedene therapeutische Gene enthalten. In jedem dieser Konstrukte wurde das Adenovirus derart modifiziert, dass es zur Replikation in der infizierten Zelle unfähig gemacht wurde. So sind die im Stand der Technik beschriebenen Konstrukte Adenoviren, die bezüglich der Region E1, die für die virale Replikation essentiell ist, deletiert sind und auf deren Niveau die Sequenzen heterologer DNA insertiert sind (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Zur Verbesserung der Eigenschaften des Vektors wurde im übrigen vorgeschlagen, andere Deletionen oder Modifikationen im Genom des Adenovirus zu schaffen. So wurde in die Mutante ts125 eine wärmeempfindliche Punktmutation eingeführt, die es möglich macht, dass 72 kDA-Protein der Bindung an DNA (DBP) zu inaktivieren (Van der Vliet et al., J. Virol., 1975, 15(2) 348–354). Andere Vektoren enthalten eine Deletion einer anderen Region, die für die virale Replikation und/oder virale Vermehrung essentiell ist, die Region E4. Die Region E4 ist in die Regulation der Expression der späten Gene, in die Stabilität der späten nukleären RNA, in die Extinktion der Expression der Proteine der Wirtszelle und in die Wirksamkeit der Replikation der viralen DNA involviert. Adenovirale Vektoren, in denen die Regionen E1 und E4 deletiert sind, besitzen einen starken Transkriptionshintergrund und eine Expression der viralen Gene, die sehr reduziert sind. Solche Vektoren werden z.B. in den Anmeldungen WO 94/28152, WO 95/02697, WO 96/22378 beschrieben. Außerdem wurden auch Vektoren beschrieben, die eine Modifikation auf dem Niveau des Gens IVa2 tragen (WO 96/10088).
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das rekombinante Adenovirus ein humanes Adenovirus der Gruppe C. Noch bevorzugter handelt es sich um ein Adenovirus Ad2 oder Ad5.
Vorteilhafter Weise enthält das im Rahmen der Erfindung verwendete rekombinante Adenovirus eine Deletion in der Region E1 seines Genoms. Im Besonderen enthält es eine Deletion der Regionen E1a und E1b. Als Beispiele kann man Deletionen nennen, die die Nukleotide 454–3328; 386–3446 oder 357–4020 betreffen (bezogen auf das Genom des Ad5).
Nach einer anderen Variante enthält das rekombinante Adenovirus, das im Rahmen der Erfindung verwendet wird, außerdem eine Deletion in der Region E4 seines Genoms. Insbesondere beeinträchtigt die Deletion in der Region E4 die Gesamtheit der offenen Leseraster. Als Beispiele kann man die Deletionen 33466–35535 oder 33093–35535 nennen. Andere Deletionstypen in der Region E4 sind in den Anmeldungen WO 95/02697 und WO 96/22378 beschrieben.
Die Expressionskassette, die die Nukleinsäure enthält, welche für einen antiangiogenen Faktor codiert, kann an verschiedenen Stellen des rekombinanten Genoms insertiert sein. Sie kann auf der Ebene der Region E1, E3 oder E4 als Ersatz deletierter Sequenzen oder zusätzlich zu diesen insertiert sein. Sie kann auch an einer ganz anderen Stelle außerhalb der Sequenzen, die zur Produktion der Viren notwendig sind (ITR-Sequenz und Capsidierungssequenz) insertiert sein.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter "Expressionskassette" einer Nukleinsäure ein DNA-Fragment, das an spezifischen Restriktionsstellen in einem Vektor insertiert werden kann; das DNA-Fragment umfasst außer der Nukleotidsequenz, die für eine RNA oder ein Polypeptid von Interesse codiert, Sequenzen, die zur Expression (Enhancer, Promotor(en), Polyadenylierungssequenz ...) der Sequenz von Interesse notwendig sind. Das DNA-Fragment und die Restriktionsstellen sind so konzipiert, dass sie eine Insertion des genannten Fragments in ein Leseraster, das für die Transkription und/oder Translation geeignet ist, sicherstellen.
Die rekombinanten Adenoviren sind Produkte einer Capsidierungslinie ("lignée d'encapsidation"), d.h. eine Linie von Zellen, die fähig sind, "en trans" eine oder mehrere defiziente Funktionen im rekombinanten adenoviralen Genom zu ergänzen. Unter den Capsidierungslinien, die dem Fachmann bekannt sind, kann man z.B. die Linie 293 nennen, in die ein Teil des Genoms des Adenovirus integriert wurde.
Genauer ausgedrückt, die Linie 293 ist eine Linie von humanen Embryonierenzellen, die das linke Ende (ungefähr 11–12%) des Genoms des Adenovirus, Serotyp 5, (Ad5) enthalten, umfassend das linke 1TTR, die Capsidierungsregion, die Region E1, einschließlich E1a und E1b, die Region, die für das Protein pIX codiert, und einen Teil der Region, die für das Protein pIVa2 codiert, umfasst. Diese Linie ist fähig, rekombinante Adenoviren, die bezüglich der Region E1 defekt sind, d.h. die Region E1 fehlt ganz oder teilweise, und die fähig sind, virale Vorräte zu produzieren, die erhöhte Titer haben. Diese Linie ist auch fähig, bei zulässiger Temperatur (32°C) Virusvorräte zu produzieren, die außerdem die wärmeempfindliche Mutation E2 enthalten. Andere Zelllinien, die fähig sind, die Region E1 zu komplementieren, wurden beschrieben; sie basieren insbesondere auf Zellen des humanen Lungenkarzinoms A549 (WO 94/28152) oder auf humanen Retinoblasten (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Im übrigen wurden Linien beschrieben, die fähig sind, mehrere Funktionen des Adenovirus zu trans-komplementieren, beschrieben. Man kann im Besonderen die Linien nennen, die die Regionen E1 und E4 komplementieren (Yeh et al., J. Virol., Bd. 70 (1996) S. 559–565; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575 und die Linien, die die Regionen E1 und E2 komplementieren (WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/27071.
Die rekombinanten Adenoviren werden üblicherweise durch Einführen von viraler DNA in die Capsidierungslinie, die eine Zelllyse überlebt hat, nach ungefähr 2 oder 3 Tagen hergestellt (die Kinetik des adenoviralen Zyklus beträgt 24 bis 36 Stunden). Zur Durchführung des Verfahrens kann die eingeführte virale DNA das vollständige rekombinante virale Genom sein, das gegebenenfalls in einem Bakterium (WO 96/25506) oder in einer Hefe (WO 95/03400) konstruiert wurde, das in die Zellen transfiziert wurde. Es kann sich auch um ein rekombinantes Virus handeln, das zum Infizieren der Capsidierungslinie ("lignée d'encapsidation) verwendet wird. Die virale DNA kann auch in Form von Fragmenten eingeführt werden, die jeweils einen Teil des rekombinanten viralen Genoms und eine Homologiezone tragen, welche nach Einführung in die Capsidierungszelle es ermöglicht, das rekombinante virale Genom durch homologe Rekombination zwischen den verschiedenen Fragmenten wieder herzustellen.
Nach der Lyse der Zellen werden die rekombinanten viralen Partikel durch Zentrifugation mit Cäsiumchloridgradienten isoliert. Ein alternatives Verfahren wurde in der Anmeldung WO 98/00528, die hier durch Referenz aufgenommen wird, beschrieben.
Als Beispiel für einen Vektor, der zur Durchführung der vorliegenden Erfindung zweckdienlich ist, kann man im Besonderen nennen: das defekte rekombinante Adenovirus, das das Gen enthält, welches für das ATF-Fragment codiert (Ad.CMV.ATF), wie es in der Anmeldung WO 98/49321 beschrieben ist, das defekte rekombinante Adenovirus, das das Gen enthält, welches für Angiostatin K3 codiert (Ad-K3), wie es in der Anmeldung WO 98/49321 beschrieben ist.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Vektor, wie er vorstehend beschrieben wurde, und ein physiologisch annehmbares Vehikel für eine Formulierung, die zur Verabreichung ins Auge, insbesondere zur Instillation, geeignet ist, umfasst. Es kann sich insbesondere um sterile isotonische Salzlösungen (Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid usw. oder Mischungen dieser Salze) oder trockene Zusammensetzungen, insbesondere lyophilisierte, die durch Zusatz gegebenenfalls von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Konstitution von gelösten Bestandteilen erlauben, die für eine Instillation ins Auge bestimmt sind, handeln.
Die zur Instillation oder zur Imprägnierung der Kontaktlinsen verwendeten Dosen können als Funktion verschiedener Parameter und insbesondere als Funktion des angewendeten Verabreichungsmodus, der chemischen Natur der Kontaktlinsen, des zu exprimierenden Gens oder auch der Dauer der gewünschten Expression angepasst werden. Im Allgemeinen werden die rekombinanten Viren gemäß der Erfindung in Form von Dosen zwischen 10⁴ und 10¹⁴ pfu (bzw. kbE) und vorzugsweise von 10⁶ bis 10¹⁰ pfu (bzw. kbE) formuliert und verabreicht. Der Ausdruck pfu bzw. kbE ("plaque forming unit" bzw. "kolonienbildende Einheit") entspricht der Infektiösität einer viralen Lösung und wird durch Infektion einer geeigneten Zellkultur und Zählen der Anzahl der infizierten Zellplaques bestimmt. Die Techniken zur Bestimmung des Titers pfu bzw. kbE einer viralen Lösung sind in der Literatur gut dokumentiert.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch ein chemisches oder biochemisches Transfermittel enthalten. Unter dem Ausdruck "chemisches oder biochemisches Transfermittel" versteht man jede Verbindung (d.h. eine andere als ein rekombinantes Virus), die das Eindringen einer Nukleinsäure in eine Zelle erleichtert. Es kann sich um kationische, nicht-virale Mittel wie kationische Lipide, Peptide, Polymere (Polyethylenimin, Polylysin), Nanopartikel; oder um nicht-virale, nicht-kationische Mittel wie nicht- kationische Liposome, Polymere oder nicht-kationische Nanopartikel handeln.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung einen defekten rekombinanten Vektor, der ein Gen enthält, das für einen antiangiogenen Faktor codiert, und sie sind für eine intraokuläre Instillation formuliert. Vorteilhafter Weise enthalten die Zusammensetzungen der Erfindung 10⁴ bis 10¹⁴ pfu und vorzugsweise 10⁶ bis 10¹⁰ pfu. Der Titer der Lösungen, die zur Imprägnierung der Kontaktlinsen verwendet werden, liegt zwischen 1 × 10⁶ und 1 × 10¹² pfu/ml bzw. kbE/ml und vorzugsweise zwischen 1 × 10⁸ und 1 × 10¹⁰ pfu/ml.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, umfassend einen Behälter, der eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie sie vorher beschrieben wurde, enthält und wenigstens eine Kontaktlinse umfasst, und die Verwendung des Kits zur Herstellung eines Medikaments, das dazu bestimmt ist, um zur Imprägnierung einer Kontaktlinse zur Prävention, Verbesserung und/oder Behandlung von Hornhaut-Neovaskularisationen verabreicht zu werden.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Kontaktlinsen sind dem Fachmann gut bekannt und sind vorzugsweise weiche Kontaktlinsen, wie sie in Künzler et al. (Chemistry & Industry, 651–655 (1995); Künzler et al. (TRIP, Bd. 4(2) 52–59 (1996); J. Singh et al. (J. M. S. Rev. Macromol. Chem. Phys. C32(3 & 4), 521–534 (1992)); J. C. Wheeler et al. (Journal of Long-Term Effects of Medical Implants, 6 (3 & 4): 207–217 (1996)) beschrieben werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments, das zur Prävention, Verbesserung und/oder Behandlung von Hornhaut-Neovaskularisationen nützlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass es das Mischen eines rekombinanten Vektors, der eine für einen antiangiogenen Vektor codierende Nukleinsäure umfasst, mit einem oder mehreren Adjuvanzien, die kompatibel und pharmazeutisch annehmbar sind, umfasst.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, wobei diese als erläuternd und nicht als beschränkend anzusehen sind.
LEGENDE DER FIGUREN
1: Darstellung der Expression der β-Galactosidase durch Immunhistochemie an einem Corneaschnitt, eingeschlossen in Paraffin (5 μm), und in Kontakt mit einer Linse, die mit Ad.β-gal 2 × 10⁷ pfu) für 72 h in Kontakt war. Hämalun-Färbung. (A) Cornea, neovaskularisiert durch oberflächlichen Reiben bzw. Kratzen, Vergrößerung × 265. (B) Radioaktive Markierung von Epithelzellen, entwickelt mit einem Anti-β-gal-Antikörper, Vergrößerung × 1310. (C) Normale avaskuläre Vergleichscornea, Vergrößerung × 525. (e: Epithel; en: Endothel; neovx: neu gebildete Gefäße; s: Stroma).
2: Fotografie einer Cornea-Neovaskularisation (schwarzes Dreieck), induziert durch Nähte (schwarze Pfeile), die zwei Wochen vorher in der Cornea einer erwachsenen Ratte angebracht worden waren. Vergrößerung × 24.
3: Präventive antiangiogene Wirkung einer Linse, die mit einer adenoviralen Lösung imprägniert ist (Ad.CMV.RTF, (B) und (D); AdK3, (A) und (C)). Vergrößerung × 20. (A) und (B) entsprechen den Cornea, die während einer Woche mit der Kontaktlinse in Kontakt blieben; (C) und (D) entsprechen den Cornea, die während 2 Wochen mit der Kontaktlinse in Kontakt blieben.
MATERIAL UND VERFAHREN
Allgemeine Techniken der Molekularbiologie
Die klassischen Verfahren, die in der Molekularbiologie verwendet werden, wie z.B. präparative Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation von Plasmid-DNA mit Cäsiumchlorid-Gradient, die Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamid-Gelen, die Reinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, die Extraktion von Proteinen in Phenol oder Phenol-Chloroform, die Präzipitation von DNA in Salzmedium durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli usw., sind dem Fachmann gut bekannt und sind in der Literatur umfangreich beschrieben [T. Maniatis et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; F. M. Ausubel et al. (Herausg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987.
Für die Ligationen werden die DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe durch Elektrophorese an Agarose- oder Acrylamidgelen getrennt, mit Phenol oder einem Phenol/Chloroform-Gemisch extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, dann in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) nach den Empfehlungen des Lieferanten inkubiert.
Die Auffüllung der vorstehenden 5'-Enden kann durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) nach den Beschreibungen des Lieferanten durchgeführt werden. Die Zerstörung der vorstehenden 3'-Enden wird in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), die nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird, durchgeführt. Die Zerstörung der vorstehenden 5'-Enden wird durch eine Behandlung mit Nuklease S1 durchgeführt.
Die ortsspezifische Mutagenese in vitro durch synthetische Oligodesoxynukleotide kann nach dem Verfahren durchgeführt werden, das von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelt wurde, wobei der Kit verwendet wird, der von Amersham vertrieben wird.
Die enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die Technik, die PCR genannt wird [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, R. K. Saiki et al., Science 230 (1985) 1350–1354; K. B. Mullis und F. A. Faloona, Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] kann durchgeführt werden, indem "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) nach den Beschreibungen des Herstellers verwendet wird.
Die Bestätigung der Nukleotidsequenzen kann durch die von Sanger et al. entwickelte Methode durchgeführt werden [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467], wobei der von Amersham vertriebene Kit verwendet wird.
Modell der Hornhaut-Neovaskularisation bzw. Cornea-Neovaskularisation bei der Ratte 30 männliche erwachsene Wistar-Ratten mit 150 g werden durch eine intraperitoneale Injektion von 15 mg Ketamin und 1,5 mg Xylazin anästhesiert. Die allgemeine Anästhesie wird durch eine topische Anästhesie mit Hilfe eines Tropfens Oxybuprocain-Hydrochlorid (Novésine^®) auf Corneaniveau vervollständigt. Es werden zwei Modelle untersucht: ein Modell durch unterbrochene Nähte und ein Modell durch Kratzen.
Modell durch unterbrochene Nähte: 20 Ratten werden verwendet, um diesen Modus der Induktion zur Cornea-Neovaskularisation zu beurteilen. Drei unterbrochene Nähte (Nylon 8-0, Nadel 50 μm) werden quer durch die mittlere Cornea des rechten Auges des Tiers unter aseptischen Bedingungen angelegt, wobei ein Operationsmikroskop (Zeiss) verwendet wird. Das nicht operierte linke Auge dient als Vergleich. Die Cornea werden dann mit einem fotografischen Biomikroskop auf Entwicklung von Gefäßneubildung in der Cornea beobachtet. Um die Cornea-Vaskularisation quantitativ zu bestimmen, als Doppelblindversuch, wird ein Auge in vier identische Cornea-Quadranten aufgeteilt und in jedem wird die Neovaskularisation in Schritten mit 0,5 bis 0 bis 3 eingeteilt. Somit erstreckt sich die Skala für jedes Auge von 0 bis 12 (W. Streilen et al. 1996, Invest. Ophtamol. Vis. Sci. 37: 413–424).
Modell durch Reiben bzw. Kratzen: Das Corneaepithel und das Limbusepithel des rechten Auges von 10 Ratten werden durch chirurgisches Kratzen für 10 min mit Hilfe eines Skalpells 15°, dann durch Erweiterung mit Ethanol (EtOH) (100° unter einem Operationsmikroskop (Zeiss) herausgezogen (A. HUANG et al. 1988, Ophtalmology 95, 228–235). Die freigelegten Cornea vernarben in 10 Tagen und vaskularisieren. Die Cornea-Neovaskularisation wird dann so, wie es für das Modell durch unterbrochene Nähte beschrieben wurde, beurteilt, wobei das nicht-operierte linke Auge als Vergleich dient.
Herstellung und Anbringung der Linse: Die weichen Einweglinsen werden mit einer Lochzange mit einem Durchmesser unter dem der Cornea der Ratte (3 mm) zugeschnitten, dann werden sie während 1 bis 2 Stunden bei Umgebungstemperatur mit adenoviralen Lösungen (AdK3, Ad.CMV.ATF oder Ad.CMVβgal, jeweils mit 4,5 × 10⁵ pfu bzw. kbE (kolonienbildende Einheit), 10⁶ pfu und 2 × 10⁷ pfu in Kontakt gebracht. Die Vergleichslösungen werden entsprechend mit 10% Glycerin als Vehikel, in dem jedes Adenovirus verdünnt ist, hergestellt. Sobald die Linse auf die rechte Cornea der Ratte gebracht ist, wird das Auge sorgfältig wieder geschlossen, indem eine Tarsorraphie durchgeführt wird (Seide 6.0, Nadel 50 μm) angewendet wird; das nicht operierte linke Auge dient als Vergleich.
Die Expression des Transgens durch die Adenoviren wird mittels Techniken (1) der Sichtbarmachung an gefrorenen Schnitten durch Kolorimetrie zum alleinigen Nachweisen der β-Galactosidase, oder (2) Immunohistochemie an Paraffinschnitten detektiert.

(1) Neugeborene Wistarratten erhalten eine Linse mit Ad.CMVβgal auf das rechte Auge. Dazu werden die Tiere durch Eintauchen in Eis anästhesiert, dann wird das Augenlid sorgfältig parallel zu der Öffnungsnahtlinie mit Hilfe einer Dowell-Schere, die 45° gebogen ist, und einer mikrochirurgischen Pinzette geschnitten. Sobald die Linse auf der Cornea angeordnet ist, wird das Auge mit Hilfe von Seide 6.0 wieder verschlossen.
(2) 12 erwachsene Ratten ohne Cornea-Neovaskularisation (vier Tiere pro Gruppe) erhalten eine Linse mit Ad.K3 oder Ad.CMV.ATF oder Ad.CMVβgal auf das rechte Auge, und drei Ratten mit Neovaskularisation werden mit einer Linse mit Ad.CMVβgal operiert. Zum Wiederverschließen des operierten Auges wird eine Tarsorraphie durchgeführt.

Nachweistechniken: Es werden drei unterschiedliche Techniken verwendet, um β-Galactosidase zu detektieren. Die Tiere werden durch cervikale Elongation 72 h nach Einsetzen der Linse getötet, die Lider werden geöffnet und die Augen werden mit der Pinzette enukleiert. Die β-Galactosidase wird auf dem ganzen Auge und an gefrorenen Schnitten mit 14 μm oder an Paraffinschnitten mit einer Dicke von 5 μm detektiert.

(i) Am ganzen Auge: Nach Fixierung in 0,5% Glutaraldehyd während 1 h bei Umgebungstemperatur wird jedes Auge (von einer erwachsenen Ratte oder einer neugeborenen) in eine PBS 1 ×-Lösung getaucht, die 2 mM MgCl₂ enthält, dann wird es von restlichem Muskelgewebe unter einer Biokularlupe (Leica) befreit. Jedes Auge wird dann in einer Entwicklungslösung von 5 mM K3Fe(CN)₆, 5 mM K4Fe(CN)₆, 2 mM MgCl₂, 1 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactosid (X-gal) während 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach mehreren Waschgängen in PBS 1 × wird das Auge unter der binokularen Lupe fotografiert.
(ii) Gefrorene Schnitte mit 14 μm: Die Augen einer neugeborenen Ratte werden unverzüglich in 0,5% Glutaraldehyd während 1 Stunde bei Umgebungstemperatur fixiert, dann für 30 min in 15% Saccharose cryogeschützt. Die Augen werden dann in Becher aus festem Kunststoff, die ein Einschlussmedium (Tissue Tek) enthalten, gelegt, welches sobald es einmal in Isopentan bei –30°C gefroren ist, die Konservierung der Gewebe bei –80°C ermöglicht. Die Augen werden im Cryostat (Leica) auf 14 μm geschnitten. Die Entwicklungslösung wird dann direkt auf die Schnitte in einer feuchten Kammer während 2 Stunden bei 37°C aufgebracht. Nach dreimaligem Spülen für 10 Minuten in 1 × PBS werden die Schnitte mit 1% Neutralrot gegengefärbt, in Bädern mit steigendem Alkoholgehalt: 80°, 95° und 100° dehydratisiert und dann zwischen Objektträger und Deckglas in den "Eukitt" montiert.
(iii) Paraffinschnitte mit einer Dicke von 5 μm: Das Detektionsverfahren für β-Galactosidase durch Immunhistochemie ist eine Technik die viel empfindlicher ist als das klassische Nachweisverfahren durch Kolorimetrie. Nach 48 Stunden Eintauchen in Davidson-Fixierungsmittel werden die Augen einer erwachsenen Ratte sorgfältig seziert, um die Linse herauszunehmen, in eine Kunststoffkassette gelegt und in den Korb eines Geräts gelegt, das den folgenden Behandlungszyklus durchgeführt: Formalin 10%, 30 min; EtOH 70°, 1 h; EtOH 80°, 1 h; EtOH 100°, 5 × 1 h; Xylol, 2 × 1 h 30; Paraffin, 4 × 1 h. Die Augäpfel werden dann in das Paraffin gelegt und mit dem Mikrotom (Leica) in Abschnitte mit 5 μm geschnitten, und zwar sagittal parallel zum Sehnerv. Die Schnitte werden auf den vorbehandelten Objektträgern (DAKO) gesammelt.

Fixierung der Schnitte: Um eine immunhistochemische Entwicklung mit einem Antikörper gegen β-Galactosidase (TEBU) zu nutzen, werden die Objektträger in einem Wärmeschrank mit 56°C während 48 h getrocknet, dann in 2 Xylolbädern für 15 min und 2 Bädern mit 100° EtOH 10 min lang von Paraffin befreit. Sie werden dann einige Minuten in fließendem Wasser rehydratisiert.
Blockierung und Permeabilisierung: Die Objektträger werden in einen 0,01 M Citratpuffer, pH 6, zunächst 5 Minuten lang bei Umgebungstemperatur, dann in einen Mikrowellenofen bei Stärke 8 (750 Watt) 2 × 5 min gelegt. Nach Rückkehr auf Umgebungstemperatur werden die Schnitte im Osmosewasser gespült und mit DAKO-Pen umreift. Um die Gewebeperoxidasen zu eliminieren, die mit dem Entwicklungskomplex interferieren können und somit die Reaktion nicht interpretierbar machen können, verwenden wir 3% H₂O₂ während 10 Minuten. Die Objektträger werden dann 30 Minuten lang in einem Gemisch aus 1 × PBS, 2 g/l Gelatine, 0,25% Triton und 3% Rinderserumalbumin (BSA) vorinkubiert, um die unspezifischen Stellen zu sättigen.
Markierung: Der primäre Kaninchenantikörper gegen β-Galactosidase wird in einem Gemisch aus 1 × PBS, 2 g/l Gelatine und 0,025% Triton 1:1000 verdünnt. Nach einstündiger Inkubation bei Umgebungstemperatur werden eine kurze Spülung, dann vier weitere von 5 Minuten mit dem Gemisch, das zur Verdünnung des Antikörpers dient, durchgeführt. Der sekundäre biotinylierte Antikörper gegen Kaninchen, produziert beim Esel (DAKO), wird in 1 × PBS, versetzt mit 2 g/l Gelatine, 1/200 verdünnt und dann 30 Minuten lang aufgebracht. Die Objektträger werden dann gespült, zunächst schnell, dann 4 × 5 Minuten, und zwar mit dem Verdünnungsmedium, bevor der Entwicklungskomplex Streptavidin/Peroxidase (DAKO), in dem selben Gemisch 1/400 verdünnt, während 30 Minuten zugesetzt wurde. Nach dem dritten Waschgang mit 5 Minuten wird das chromogene Substrat, Diaminobenzidin (DAB), zugesetzt. Die Entwicklungszeit variiert von 2 bis 20 Minuten. Die Reaktion wird gestoppt, indem die Objektträger in Osmosewasser eingetaucht werden. Diese werden dann während 1 Minute in Hämalon gegengefärbt, schnell mit dem Osmosewasser gespült, dann für einige Sekunden in LiCO₃ differenziert. Schließlich werden sie dehydratisiert, danach in Xylol bis zum Einbau zwischen Objektträger und Deckgläschen im Eukitt konserviert.
Beispiel 1: Konstruktion von defekten rekombinanten Adenoviren Ad.CMV.ATF, AdK3 und Ad.CMVβgal.
Die Vektoren wurden nach dem Verfahren konstruiert, das allgemein von Crouzet et al. (PNAS, Band 94, S. 1414, 1997) beschrieben ist. Details der Konstruktion der Vektoren Ad.CMV.ATF und AdK3 sind in der Anmeldung WO 98/49321 beschrieben.
Für AdK3 entspricht das Transgen mit 1 Kb dem N-terminalen Fragment des humanen Plasminogens (bis zum Rest 333) und schließt die drei ersten Kringeldomänen des Angiostatinmoleküls ein.
Für Ad.CMV.ATF ist das Transgen mit 0,5 Kb eine cDNA, die für das N-terminale Fragment von murinem uPA (Aminosäuren 1 bis 135) codiert, und das Transgen von Ad.CMVβgal enthält eine cDNA mit 3,1 Kb, die für das Reportergen von Escherichia coli, lacZ, codiert.
Die Produktion und die Sekretion von adenoviralen Molekülen, ausgehend von Konstrukten, wurde jeweils durch Northern-Blot und Western-Blot bestätigt. Tests auf die in vivo-Inhibierung des Tumorwachstums, der Angiogenese und der Tumorgenese sowie Tests auf in vitro-Inhibierung der Zellproliferation, die durch bFGF stimuliert wird, wurden für AdK3 und Ad.CMV.ATF durchgeführt. Die X-gal-Aktivität von Ad.CMVβgall wurde ebenfalls kontrolliert.
Der mittlere Titer der Stammlösungen der rekombinanten Adenoviren, die verwendet werden, ist 4,5 × 10⁸ kbE/ml für AdK3, 10⁹ kbE/ml für Ad.CMV.ATF und 6,9 × 10¹⁰ kbE/ml für Ad.CMVβgal.
Beispiel 2: Effekt eines Vektors, der für einen antiangiogenen Faktor codiert, in einem Modell für Cornea-Neovaskularisation bei der Ratte
Der Effekt der Linse auf das rechte Auge des Tiers wird als Funktion (1) der Dauer des Kontakts mit der Cornea – 1 Woche oder 2 Wochen –, (2) dem Vorliegen des Vektors, der für einen anti-angiogenen Faktor codiert oder nicht, (3) der Neovaskularisation der Cornea oder nicht untersucht.
Um einen "präventiven" therapeutischen Effekt des Adenovirus auf die Hornhaut-Neovaskularisation zu untersuchen, wird die Linse unmittelbar nach Anlegen der drei unterbrochenen Nähte auf die Cornea gebracht, während ein "heilender" Effekt untersucht wird, indem die Linse auf die Augen gelegt wird, die bereits seit 1 Woche oder 2 Wochen eine Hornhaut-Neovaskularisation bzw. Cornea-Neovaskularisation aufweisen.
Jedes Adenovirus wird an einer Gruppe von 10 Ratten getestet: 5 zur Beurteilung des präventiven Effektes und 5 zur Beurteilung des heilenden Effektes. Eine Gruppe von 10 Ratten mit einer mit Vehikel imprägnierten Linse dient als Vergleich.
Beurteilung der zwei Tiermodelle für Cornea-Neovaskularisation
Das Modell der Induktion der Cornea-Gefäßneubildung durch das Anlegen von drei unterbrochenen Nähte ist sehr wirksam; denn 100% der operierten Tiere weisen eine Cornea-Neovaskularisation auf und die Cornea der kontralateralen Kontrollaugen ist avaskulär. Die Gefäße konzentrieren sich ausgehend von den limbischen Gefäßbögen zur Mitte der Cornea und proliferieren ab der ersten Woche nach dem Eingriff in den Oberflächenschichten der Cornea.
Der mittlere Score für jedes Auge, der die Entwicklung der Cornea-Neovaskularisation angibt, ist 2 Wochen nach Anlegen der Nähte 7 ± 2. Zu diesem Zeitpunkt ist die Cornea-Neovaskularisation maximal. Im Modell der Induktion durch oberflächliches Kratzen der Cornea entwickelten nur 70% der Ratten eine Cornea-Neovaskularisation. Jedenfalls ist diese homogener als die des vorstehenden Modells, denn die Gesamtheit der vier Quadranten des Auges nehmen an der Entwicklung der Neovaskularisation teil, im Gegensatz dazu beobachtet man im Modell der Nähte, dass die Anzahl der beteiligten Quadranten variabel ist. Diese Variabilität des Ausmaßes der neovaskularisierten Corneaoberfläche steht in enger Abhängigkeit von der Position der Nähte bezüglich des Limbus, ihrer Tiefe im Stroma und ihrer Größe. Der mittlere Score für jedes Auge ist 2 Wochen nach dem Kratzen 8 ± 2.
An einem Corneaschnitt, der in Paraffin eingeschlossen ist und mit einem Gemisch aus Periodsäure/Schiff'sche Base/Hämatoxilin gefärbt ist, treten die neuen Gefäße vornehmlich in Corneaepithel, aber auch in Stroma und an der Grenze zum Corneaendothel auf.
Wirksamkeit des Transfers der adenoviralen Vektoren durch vorherige Imprägnierung einer Kontaktlinse
Makroskopische Resultate: Nach Inkubation mit der Lösung X-gal weisen die Pupillen (cupules oculaires) aller Augen, die mit einer imprägnierten Linse mit Adenovirus-β-galactosidase mit 2 × 10⁷ pfu/μl imprägniert worden war, behandelt worden waren, eine blau-gepunktete und sehr diffuse Färbung auf der gesamten Cornea bei der neugeborenen Ratte und auf einem großen Bereich der Cornea bei den erwachsenen Tieren auf. Die blaue Färbung wird auf keinem der Vergleichsaugen wiedergefunden.
Mikroskopische Resultate: die Markierung, die durch kolorimetrische Entwicklung der β-Galactosidase an gefrorenen Schnitten normaler Cornea erhalten wurde, herrscht im Kern der Cornea-Epithelzellen vor.
Auf Schnitten von neovaskularisierter Cornea, die in Paraffin eingeschlossen war, wird die durch Immunhistochemie erhaltene Markierung hauptsächlich in den Kernen der Cornea-Endothelzellen, aber auch in den Cornea-Epithelzellen und den Epithelzellen des Ciliarkörpers. Die Keratozyten des Cornea-Stroma sowie die pathologischen intrastromalen Endothelzellen sind ebenfalls markiert (1). Trotz des Signals der Kernlokalisierung, das mit dem Transgen LacZ verbunden ist, weisen einige Zellen eine Markierung im Zytoplasma auf, etwa so wie die Entwicklungstechnik.
Identische Resultate werden mit Hilfe von Adenovirus erhalten, das für murines ATF oder für humanes Angiostatin codiert. Dies konnte durch spezifische immunhistochemische Reaktionen, wie an Schnitten von Rattenaugäpfeln, welche im Paraffin eingeschlossen waren, durchgeführt wurden, bewiesen werden.
Antiangiogener Effekt der Linsen, die vorher mit Adenovirus AdCMV.ATF und AdK3 imprägniert worden waren
Linsen, die mit Vehikel imprägniert worden waren und auf eine Cornea ohne Vaskularisation gebracht wurden, haben keinen signifikanten angiogenen Effekt.
Durch Linsen, die mit Ad.CMVβgal mit 2 × 10⁷ pfu/μl getränkt waren, wurde kein inflammatorisches Phänomen und auch keine Cornea-Neovaskularisation induziert.
Ebenso induzierten Linsen mit Ad.CMV.ATF (10⁶ pfu/μl) und AdK3 (4,5 × 10⁵ pfu/μl) keine inflammatorische Reaktion an der Cornea, keine Neovaskularisation noch ein Verschwinden der Limbusvaskularisation.
Eine mit Ad.CMV.ATF imprägnierte Linse, die unmittelbar nach dem Anlegen der drei unterbrochenen Nähte auf eine Cornea gelegt wurde, verhindert die Entwicklung der Neovaskularisation, die nach Anlegen dieser drei Nähte erwartet wurde, während der ersten Woche. Dieser Effekt blieb nach zwei Wochen bestehen. Man beobachtet den selben antiangiogenen Effekt nach einer Woche Kontakt mit der Cornea bei einer mit AdK3 imprägnierten Linse (3).

Claims

Verwendung eines Vektors, der eine für einen antiangiogenen Faktor codierende Nukleinsäure umfasst, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dazu bestimmt ist, durch Imprägnierung einer weichen Linse und Aufbringen der Linse auf die Hornhaut zur Prävention, Verbesserung und/oder Behandlung von Hornhaut-Neovaskularisationen verabreicht zu werden.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die für den antiangiogenen Faktor codierende Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus dem N-terminalen Fragment des Plasminogenaktivators uPA (ATF), Angiostatin, Endostatin, dem 16 kDa-Fragment von Prolactin und dem Plättchenfaktor 4 (PF-4), oder eine Kombination von Nukleinsäuren ist, die für wenigstens zwei dieser Faktoren codiert.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der antiangiogene Faktor aus dem N-terminalen Fragment des Plasminogenaktivators uPA (ATF) und Angiostatin K3 ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Plasmid, ein Cosmid oder jede DNA, die nicht durch ein Virus eingekapselt ist, ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein rekombinantes Virus ist, das vorzugsweise von einem Adenovirus, einem Retrovirus, einem Lentivirus, einem Herpes-Virus oder einem Adeno-assoziierten Virus abgeleitet ist.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Virus ein defektes rekombinantes Adenovirus ist.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung zwischen 1·10⁶ und 1·10¹² pfu/ml und vorzugsweise zwischen 1·10⁸ und 1·10¹⁰ pfu/ml umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments, das zur Prävention, Verbesserung und/oder Behandlung von Hornhaut-Neovaskularisationen nützlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass es das Mischen eines rekombinanten Vektors, der eine für einen antiangiogenen Vektor codierende Nukleinsäure umfasst, mit einem oder mehreren Adjuvanzien, die kompatibel und pharmazeutisch annehmbar sind, und die Imprägnierung einer Kontaktlinse umfasst.
Kit, umfassend einen Behälter, der eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen defekten rekombinanten Vektor umfasst, welcher wenigstens eine für einen antiangiogenen Faktor codierende Nukleinsäure enthält, und wenigstens eine Kontaktlinse enthält.
Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung zwischen 1·10⁶ und 1·10¹² pfu/ml und vorzugsweise zwischen 1·10⁸ und 1·10¹⁰ pfu/ml umfasst.
Verwendung des Kits nach Anspruch 9 oder 10 für die Herstellung eines Medikaments, das dazu bestimmt ist, durch Imprägnierung einer Linse zur Prävention, Verbesserung und/oder Behandlung von Hornhaut-Neovaskularisationen verabreicht zu werden.