DE60015356T2

DE60015356T2 - Sterilisation biologischer gewebe

Info

Publication number: DE60015356T2
Application number: DE60015356T
Authority: DE
Inventors: Jean-Marie Girardot; Marie-Nadia Girardot
Original assignee: Biomedical Design Inc
Current assignee: Biomedical Design Inc
Priority date: 1999-08-11
Filing date: 2000-08-10
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-08-11
Also published as: JP2003506380A; US6521179B1; WO2001010209A1; EP1206179A1; AU773076B2; CA2378246C; JP4619597B2; DE60015356D1; CA2378246A1; AU6535600A; ATE280495T1; EP1206179B1

Description

Diese Erfindung betrifft die Sterilisation und spezieller Sterilisationsverfahren zur Verwendung mit biologischen Materialien, wie Organersatz und Homotransplantaten, wobei das Verfahren eine Wirksamkeit gegen schwierig abzutötende Bakterien und Bakteriensporen zeigt, wobei die Wirkung auf die physikalische Eigenschaften des biologischen Materials, das sterilisiert wird, kontrollierbar ist.
Sterilisationstechniken werden weitverbreitet verwendet und sind wichtig in Industrien, wie Nahrungsmittelverarbeitung und Gesundheitspflege. Gesättigter Dampf bei Temperaturen über 110°C wurde häufig verwendet, um Mikroorganismen, wie Mikrobiensporen, zu zerstören. Bestimmte Artikel, insbesondere diejenigen, die für die Gesundheitspflege verwendet werden, die aus biologischem Gewebe bestehen oder es inkorporieren, können den Temperaturen und der Feuchtigkeit der Dampfsterilisation nicht widerstehen, und oft werden solche Artikel auch für die Sterilisation durch ionisierende Strahlung als nicht geeignet angesehen. Gasförmige Sterilisierungsmittel wurden entwickelt, die bei relativ niedrigen Temperaturen funktionieren und daher eine attraktive Alternative anbieten. Ethylenoxid ist ein häufig verwendetes gasförmiges Sterilisierungsmittel, das oft für die Sterilisation von Medizinprodukten verwendet wird; unter bestimmten Umständen wird jedoch die Gegenwart von restlichem Ethylenoxid, sogar in kleinen Mengen, als schädlich angesehen. Allotransplantate und andere Implantate, die biologisches Gewebe enthalten, wurden durch Eintauchen in antibiotische Mischungen sterilisiert, aber solche Verfahren sind sehr teuer und zerstören bestimmte Bakteriensporen und Viren nicht. Folglich wurde weiter nach verbesserten Verfahren zur Sterilisation von Medizinprodukten, die biologisches Gewebe einschließen, gesucht, die andererseits die physikalischen Eigenschaften der Medizinprodukte, insbesondere von Allotransplantaten und Xenotransplantaten, für die die physikalische Wirkung auf die Medizinprodukte sorgfältig kontrolliert werden sollte, nicht signifikant verändern.
Unser US-Patent 5,911,951 beschreibt ein ausgezeichnetes Sterilisationsverfahren für biologisches Gewebe durch Behandlung mit einem wasserlöslichen Carbodiimid, wie EDC, in Gegenwart eines niederen Alkanols, wie Isopropanol.
EP 0 897 942 A betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Bioprothesevorrichtung, umfassend vernetztes Collagen. Das Verfahren umfaßt die Schritte (i) Blockieren der Collagen-Amingruppen, (ii) Aktivieren der Collagen-Carboxylgruppen und (iii) Kontaktieren des Collagens mit einem polyfunktionellen Spacer, um das Collagen zu vernetzen. Schritt (ii) kann vor oder nach Schritt (iii) durchgeführt werden. Das Verfahren zur Vernetzung ist speziell entwickelt, um Vernetzungen mit "Null-Länge" zu vermeiden, zugunsten des Erreichens längerer Vernetzungen unter Verwendung von Spacern. Um dies zu erreichen, werden die potentiell aktiven, freien Amin-Gruppen in dem Collagen blockiert bevor die freien Carboxyl-Gruppen aktiviert werden, und eine Reaktion wird dann durchgeführt, um die polyfuktionellen Spacer zu inkorporieren, so daß im wesentlichen alle der Verbindungen dieselbe Länge haben werden.
Es wurde nun herausgefunden, daß Medizinprodukte, die biologisches Gewebe einschließen, z.B. Allotransplantate und Xenotransplantate, wie Ersatzorgane, Bänder (Ligamente), Venen, Gefäßplastiken und ähnliche, sowie azelluläres Material, einschließlich Gegenstände, hergestellt aus extrahiertem Collagen oder unter Verwendung eines Verfahrens, wie dem in US-Patent Nr. 4,776,853 gelehrten, wirksam sterilisiert werden können durch Behandlung mit einem bakteriziden Kupplungsmittel des Typs, von dem bekannt ist, daß er Amid-Bindungen zwischen Aminen und Carboxyl-Einheiten bildet, auf eine Weise, so daß es entweder keine signifikante Veränderung oder eine gut kontrollierbare Veränderung des physikalischen Charakters des sterilisierten biologischen Materials gibt. Die Sterilisationsbehandlung wird bevorzugt bei einer Temperatur über Umgebungstemperatur in einer gepufferten Lösung durchgeführt, die optional Isopropylalkohol oder einen äquivalenten Alkohol in einer Menge enthalten kann, die wirksam ist, um das Eindringen des Kupplungsmittels in die Zellen der Mikroorganismen zu fördern. Die Sterilisationsbehandlung wird in Gegenwart von Schutzmitteln durchgeführt, die entweder mit restlichen Amin-Gruppen oder restlichen Carboxyl-Gruppen auf dem eiweißartigen biologischen Material, das behandelt wird, komplexieren und diese schützen, wodurch die Menge der Vernetzung davon sorgfältig kontrolliert wird, um die physikalischen Eigenschaften des resultierenden biologischen Materials nicht unerwünscht zu verändern. Die Rückstände aus einer solchen Behandlung sind nicht-toxisch, biokompatibel und wasserlöslich, so daß sie einfach von dem Gewebe vor Verpackung und Implantation in einen menschlichen Körper abgewaschen werden können.
Es war überraschend, herauszufinden, daß biologisches Gewebe effektiv unter Verwendung von Kupplungsmitteln sterilisiert werden kann, die Amid-Bindungen bilden, während zur gleichen Zeit entweder das Auftreten jeder signifikanten Vernetzung innerhalb des biologischen Materials selbst vermieden wird oder alternativ die Menge der Vernetzung, die auftritt, sorgfältig kontrolliert wird.
Auf eine bestimmte Weise stellt die Erfindung ein Verfahren zur Sterilisation von biologischem Gewebematerial bereit, wobei das Verfahren umfaßt: Behandeln solchen Materials mit einer wäßrigen Lösung, enthaltend (a) eine Menge an wasserlöslichem Kupplungsmittel, das in der Lage ist, Amid-Bindungen zu bilden, die wirksam ist, um Sterilisation zu erreichen, und (b) eine Menge eines Schutzmittels, die wirksam ist, mit den möglicherweise reaktiven Amin- oder Carboxyl-Einheiten auf dem biologischen Gewebematerial zu komplexieren, um solche komplexierten Einheiten daran zu hindern, an einer amidbildenden Vernetzungsreaktion teilzunehmen, und dadurch das Ausmaß der Vernetzung zu begrenzen, und Beibehalten einer solchen Behandlung über einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die ausreichend sind, um das Eindringen des Kupplungsmittels in die Zellen der Mikroorganismen, die von einem solchen Material getragen werden, zu erreichen und solche Mikroorganismen wirksam abzutöten.
Auf eine andere bestimmte Weise stellt die Erfindung ein Verfahren zur Sterilisation von biologischem Gewebe bereit, wobei das Verfahren umfaßt: Behandeln solchen Materials mit einem Schutzmittel, das wirksam ist, mit möglicherweise reaktiven Amin- oder Carboxyl-Einheiten auf dem biologischen Gewebematerial zu komplexieren, um solche komplexierten Einheiten daran zu hindern, an einer amidbildenden Vernetzungsreaktion teilzunehmen, und dadurch die Menge der Vernetzung zu begrenzen, Behandeln solchen Materials mit einem wasserlöslichen Kupplungsmittel, das in der Lage ist, Amid-Bindungen zu bilden, das wirksam ist, Sterilisation zu erreichen, und Beibehalten einer solchen Behandlung mit dem Kupplungsmittel über einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die ausreichend sind, um das Eindringen des Kupplungsmittels in die Zellen von Mikroorganismen, die von einen solchen Material getragen werden, zu erreichen und solche Mikroorganismen wirksam abzutöten.
In einer weiteren bestimmten Weise stellt die Erfindung ein Verfahren zur Sterilisation von biologischem Gewebe bereit, das entweder vor oder nach der Vernetzung azellular gemacht wurde oder das nicht vernetzt wurde.
Medizinprodukte, die aus biologischem Gewebe bestehen oder es inkorporieren, benötigen Sterilisation vor Verpackung oder vor Implantation in einen Patienten, und bei einigen Produkten sollte das Sterilisierungsmittel eines sein, das keinen unerwünschten Rückstand zurückläßt und das die physikalischen Eigenschaften des Medizinprodukts entweder nicht oder nur auf eine sorgfältig kontrollierbare Weise verändert. Zum Beispiel werden Veränderung in der Struktur oder der Festigkeit des biologischen Gewebes bei Allotransplantaten als schädlich angesehen und sind zu vermeiden. Allotransplantate, manchmal als Homotransplantate bezeichnet, schließen Ersatzorgane und Bindegewebe ein, zum Beispiel Knorpel, Sehnen, Bänder, Knochen und Muskelgewebe, und werden im allgemeinen wünschenswert ohne Veränderung in Struktur und Eigenschaft in einen Empfängerpatienten transplantiert. Andererseits können bestimmte Medizinprodukte, die Tiergewebe einschließen, wie prothetische Gewebeventile (Klappen) als Herzklappenersatz, z.B. Schweineaortenklappen oder Gewebeklappen gebildet aus Rinderperikard, zuvor fixiert, d.h. vernetzt, worden sein, um sie sorgsam mit einem Charakter und einer Flexibilität, die für Langzeitbetrieb gewünscht sind, auszustatten. Folglich kann jede Veränderung an solchen sorgsam abgestimmten (maßgeschneiderten) physikalischen Eigenschaften, wie durch Versteifen des Gewebes, angesehen werden, als wenn sie eine unerwünschte Veränderung des Produkts darstellt. Noch andere aus Gewebe konstruierte Produkte können wünschenswert eine variable Dauer der Resorption haben in Fällen, wo es wünschenswert ist, daß der Körper das Produkt folgend auf die Implantation umbaut.
Sobald es entdeckt wurde, daß amidbildende Kupplungsmittel wirksam verwendet werden könnten, um in dem vorangehenden Kontext Artikel durch vollständige Inaktivierung von Mikroorganismen und Sporen zu sterilisieren, wurde beschlossen, zu untersuchen, ob eine solche Sterilisationsbehandlung auf das Sterilisieren von Allotransplantaten und anderen solcher konstruierter Gewebeprodukte, die biologische Gewebe von Säugern einschließen, angepaßt werden könnte. Es wurde überraschend herausgefunden, daß die potentiell begleitende unerwünschte Vernetzung des eiweißartigen biologischen Gewebes durch Durchführung der Sterilisationsbehandlung in Gegenwart von Schutzmitteln, die temporär oder permanent mit den möglicherweise reaktiven Amin- oder Carboxyl-Einheiten auf dem eiweißartigen Material komplexieren und ausgedehntes Vernetzen verhindern würden, das andernfalls die physikalischen Eigenschaften des biologischen Materials verändern würde, wie durch sein Versteifen, minimiert oder sorgfältig kontrolliert werden könnte.
Der Begriff "Kupplungsmittel" wie hierin so verwendet, daß es sich auf ein chemisches Reagens bezieht, daß die Bildung von Amid-Bindungen vereinfacht. Solche Bindungen können zwischen reaktiven Aminen und reaktiven Carboxylen an Enzymen oder Proteinen gebildet werden; sie können auch mit und zwischen den reaktiven Carboxyl- oder Amineinheiten, die auf oder innerhalb des Bioprothesegewebes lokalisiert sind, wie in US-Patent Nr. 5,733,339 gelehrt, gebildet werden. Der Fachmann in der Peptidsynthese und verwandten Gebieten wird mit solchen Reagenzien, z.B. wasserlöslichen Carbodiimiden, vertraut sein; eine Liste solcher Kupplungsmittel ist in dem Buch: "Bioconjugate Techniques" von Greg T. Hermanson veröffentlicht von Academic Press 1996 zu finden. Dieses Sterilisationsverfahren, das Bakterien und Sporen durch Behandlung mit solchen Kupplungsmitteln zerstört, wird gefördert, wenn es in Gegenwart eines C_2–4-Alkanols durchgeführt wird. Zum Zwecke dieser Anwendung wird von der Sterilisation angenommen, daß sie erreicht ist, wenn die Bedingungen der Behandlung zumindest eine log 6-Reduktion im Bakteriengehalt erreichen, oder eine Standardbakterienprobe so reduzieren würden.
Ein wasserlösliches Kupplungsmittel wird bevorzugt ausgewählt, so daß die Behandlung des biologischen Gewebematerials in wäßriger Lösung bewirkt werden kann. Das bevorzugte Kupplungsmittel ist 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC); alternative geeignete Kupplungsmittel schließen andere wasserlösliche Carbodiimide, wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid, N,N'-Carbonyldiimidazol, Woodward's Reagens K und Mischungen solcher Carbodiimide ein.
Die Konzentrationen des Kupplungsmittels können innerhalb bestimmter Grenzen variiert werden, und niedrige Konzentrationen können wirksam eingesetzt werden, wenn das Kupplungsmittel in Kombination mit einem niederen Alkanol verwendet wird. Wenn es ohne ein begleitendes niederes Alkanol verwendet wird, wird das Kupplungsmittel bevorzugt in einer Konzentration zwischen etwa 25 Millimolar (mM) und etwa 150 mM verwendet; oft werden jedoch Konzentrationen zwischen etwa 35 mM und etwa 70 mM eingesetzt, die als effektiv angesehen werden, um alle häufig angetroffenen Bakterien und Sporen bei Temperaturen zwischen etwa 35°C und 55°C zu zerstören. Die Dauer der Sterilisationsbehandlung ist gewöhnlich zumindest etwa 6 Stunden und bevorzugt zumindest etwa 12 Stunden; Behandlung für 24 Stunden ist jedoch gebräuchlich.
Die Lösung kann optional bis zu etwa 30 Vol.% eines C_2–4-Alkanols, zum Ethanol oder Isopropanol, oder eines äquivalenten Alkohols enthalten; mit Vol.% ist das Volumen des Alkohols relativ zum Volumen der Lösung gemeint. Von einem solchen niederen Alkanol wird angenommen, daß es das Kupplungsmittel beim wirksamen Eindringen in die Zellwände der Bakterien, Sporen oder anderer Mikroorganismen unterstützt. wenn ein Alkanol verwendet wird, werden zumindest etwa 10 % verwendet, und zwischen etwa 15 und etwa 25 % Isopropanol werden gebräuchlich eingesetzt, und das Kupplungsmittel kann bei einer Konzentration von nur etwa 5 mM bis 15 mM verwendet werden, obwohl 25 mM bequem verwendet werden können.
Das Schutzmittel kann eines sein, das mit den reaktiven Amineinheiten und/oder mit den reaktiven Carboxyl-Einheiten, die auf dem biologischen Gewebe vorhanden sind, komplexiert. Ein Vorteil wurde vordem aus der Gegenwart dieser potentiell reaktiven Einheiten gezogen, um Prothesen zu stabilisieren, die Tiergewebe einschließen, und dieses Stabilisationsverfahren wird üblicherweise als "Fixierung" bezeichnet.
Glutaraldehyd wurde üblicherweise als Fixierungsreagens verwendet, und andere Fixierungstechniken haben Polyepoxidvernetzung oder Photooxidation eingesetzt. Vor kürzerem hat sich erwiesen, daß die Fixierungsverfahren der in den US-Patenten Nr. 5,447,536 und 5,733,339 beschriebenen Typen, deren Offenbarungen hierin durch Bezug eingeschlossen sind, daß sie verschiedene Vorteile haben. Es wurde nun herausgefunden, daß durch Komplexierung von Schutzmitteln mit diesen potentiell reaktiven Einheiten, das Ausmaß der Vernetzung, die in dem eiweißartigen biologischen Gewebe auftritt, minimiert oder sorgfältig kontrolliert werden kann, während überraschenderweise die bakterielle Wirkung einer Sterilisationsbehandlung unter Verwendung von EDC oder einem Äquivalent nicht signifikant negativ beeinflußt wird.
So ein Schutzmittel kann in die für die Sterilisationsbehandlung verwendete Lösung eingeschlossen werden, oder das zu sterilisierende biologische Gewebematerial kann mit dem Schutzmittel vorbehandelt werden. wenn so eine Vorbehandlung verwendet wird, kann eine geringfügig niedrige Konzentration des Schutzmittels adäquat sein, alldieweil es eine größere Möglichkeit für das Auftreten der Komplexierung vor dem Aussetzen des eiweißartigen Materials zu dem Kupplungsmittel gibt. Wenn so eine Vorbehandlung eingesetzt wird, wird das Sterilisierungsmittel im allgemeinen dann später zu der Lösung zugegeben; einige Blockierungsmittel werden jedoch an das Gewebe binden, so daß Spülen vor der Sterilisation, wie nachstehend erwähnt, stattfinden kann.
Potentiell reaktive Amineinheiten, die auf dem eiweißartigen Material vorhanden sind, können wirksam vor Sterilisation mit bestimmten Schutzmitteln, wie N-Hydroxysulfosuccinimidacetat (Sulfo-NHS-acetat), Essigsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid und Citraconsäureanhydrid, blockiert werden, wonach Spülen vor der Sterilisation bewirkt werden kann. Ein alternativer Ansatz ist es, Monocarbonsäuren, wie Hydroxyprolin, Essigsäure und Propionsäure, als Schutzgruppen zu verwenden, die in Gegenwart eines Kupplungsmittels, wie eines Carbodiimids, bevorzugt Amid-Bindungen mit den aktiven Amineinheiten bilden werden, wodurch diese Einheiten daran gehindert werden, Vernetzungen mit Carboxylat-Gruppen sonstwo aus dem eiweißartigen Material während der Sterilisation zu bilden. Wenn Monocarbonsäuren als Schutzgruppen verwendet werden, kann es jedoch wünschenswert sein, etwas größere Konzentrationen des Kupplungsmittels einzusetzen, da etwas des Kupplungsmittels von seiner primären Sterilisationsfunktion zweckentfremdet werden kann.
Anstelle der Komplexierung der Amineinheiten kann ein Schutzmittel ausgewählt werden, um die Carboxyl-Einheiten zu komplexieren. Monoamine, die mit Carboxyl-Gruppen reagieren werden, können verwendet werden, und die Auswahl eines Hydroxylmonoamins, z.B. Ethanolamin oder Propanolamin, kann bevorzugt sein. Ein besonders bevorzugtes Schutzmittel ist eine Kombination von Ethanolamin und Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS); TRIS dient zwei Zwecken, da es auch ein bekannter Puffer ist, der nützlich zum Einschluß in wäßrigen Lösungen bei physiologischem pH ist, obwohl Ethanolamin oder Propanolamin allein verwendet werden könnten, da jedes in der Lage ist sowohl als Puffer als auch als Blockierungsmittel zu dienen. Zusätzlich erhöhen die von den Schutzmitteln, wie TRIS, getragenen Hydroxyl-Gruppen die Hydrophilie des biologischen Gewebes und haben die Wirkung, es weniger thromboseerzeugend zu machen.
Wenn das Schutzmittel als Teil der wäßrigen Sterilisationsbehandlungslösung eingeschlossen ist, wird es im allgemeinen einer Konzentration zwischen etwa 25 mM und etwa 200 mM, bevorzugt bei einer Konzentration zwischen etwa 50 und etwa 150 mM, und bevorzugter bei einer Konzentration zwischen etwa 80 und etwa 120 mM, eingesetzt. Wenn die Vorbehandlung des biologischen Gewebematerials mit dem Schutzmittel eingesetzt wird, kann das Schutzmittel, z.B. Essigsäureanhydrid oder Ethanolamin, im allgemeinen bei einer Konzentration zwischen etwa 5 und etwa 50 mM in wäßriger Lösung und bevorzugt bei einer Konzentration von zumindest etwa 10 mM und bevorzugter zumindest etwa 20 mM verwendet werden. wenn die Vorbehandlung verwendet wird, wird sie zumindest etwa 5 Stunden und bevorzugt zumindest etwa 12 Stunden vor der Sterilisationsbehandlung durchgeführt, da das Reagens in das Gewebe eindringen muß, damit die chemische Reaktion auftritt.
Die Reaktionsbedingungen für das Sterilisationsverfahren können abhängig von dem eingesetzten speziellen Kupplungsmittel etwas variieren. Im allgemeinen wird die Sterilisationsbehandlung in einer wäßrigen Pufferlösung, ausgewählt unter denjenigen, die dem Fachmann gut bekannt sind, durchgeführt. Beispiele geeigneter Puffer schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (HEPES) und 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS) und ähnliche. Wie früher angegeben, ist es möglich, TRIS als Schutzmittel für die potentiell reaktiven Carboxylat-Gruppen, bevorzugt in Kombination mit Ethanolamin, zu verwenden, in welchem Fall, es dem dualen Zweck eines Puffers dienen wird. Unter diesen Umständen kann es wünschenswert sein, TRIS bei einer Konzentration zwischen etwa 50 und etwa 100 mM mit etwa derselben Konzentration an Ethanolamin zu verwenden.
Der pH und die Konzentration der gepufferten Lösung können auch wiederum abhängig von dem eingesetzten Kupplungsmittel variieren. Alle verwendeten Lösungen werden bevorzugt vor der Verwendung durch 0,45 μm oder kleinere Filter filtriert. Bevorzugt werden die Pufferkonzentration und der pH so ausgewählt, daß sie eine wirksame Sterilisationsumgebung bereitstellen, während sie am wenigsten schädlich für biologisches Gewebematerial sind; dies wird im allgemeinen ein physiologischer pH sein. Mit EDC als Kupplungsmittel ist zum Beispiel der pH der eingesetzten Lösung gewöhnlich zwischen etwa 6,0 und etwa 7,0. Die Temperatur der Sterilisationslösung wird gewöhnlich zwischen etwa 25 und 55°C gehalten, obwohl höhere Temperaturen, d.h. zumindest 35°C, oft verwendet werden, wenn ein optionales Alkanol nicht eingeschlossen ist. Bevorzugt wird die Sterilisation zwischen 35 und 45°C für eine ausreichende Zeitdauer durchgeführt; die Dauer ist abhängig von der Konzentration des Kupplungsmittels kürzer oder länger. Je höher die Konzentration des Kupplungsmittels ist, die eingesetzt wird, desto kürzer wird im allgemeinen die Dauer der Behandlung sein, die notwendig ist, um wirksame Sterilisation zu erreichen; die Sterilisationsbehandlung wird jedoch im allgemeinen für zumindest etwa 10 Stunden durchgeführt. Außerdem kann der Einschluß von etwa 20 Vol.% eines niederen Alkanols auch die benötigte Dauer der Behandlung etwas verkürzen. In der Abwesenheit eines niederen Alkanols kann zum Beispiel wirksame Sterilisation bei einer Kombination von Konzentration und Dauer gleich etwa 500 bis 600 mmol-Stunden erreicht werden. Eine Behandlung mit etwa 25 mmol Kupplungsmittel für etwa 24 Stunden oder alternativ Behandlung mit 5 mM Kupplungsmittel für etwa 12 Stunden würde daher dieses Kriterium erfüllen. Wenn zum Beispiel 20 % Isopropanol in der Sterilisationslösung eingeschlossen ist, würde jedoch von einer Behandlung mit 25 mmol EDC für eine Zeitspanne von nur 3 Stunden, d.h. 75 mmol-Stunden, angenommen werden, daß sie die Sterilisation erreicht. Von den in dem zuvor genannten '951-Patent ausgeführten Sterilisationsbedingungen wird im allgemeinen angenommen, daß sie hier genauso anwendbar sind, insbesondere vom Standpunkt der EDC-Konzentration und der Dauer der Behandlung. Andererseits ist eine Behandlung für eine Zeitdauer von etwa 24 Stunden im allgemeinen bequem zur Bearbeitung und wird oft verwendet.
Wie oben angegeben, wird von den Sterilisationsbehandlungsmethode angenommen, daß sie zur Sterilisation von Allotransplantaten wie Ersatzsehnen, Bändern, Knochen, Meniskus, Gefäßplastiken, Herzklappen oder biokonstruierten Gewebeprodukten mit kontrollierter Resorption sowie als Ersatzorgankomponenten, wie Herzklappen, die aus Tiergewebe hergestellt wurden, das geeignet fixiert wurde, um gewünschte physikalische Eigenschaften zu haben, besonders nützlich ist. Vor der Sterilisation wird ein solches Material zuerst wünschenswert mit kalter Salzlösung gespült.
Gemäß den oben erwähnten Überlegungen wird das zu sterilisierende biologische Gewebematerial gewöhnlich etwa 5 bis 72 Stunden in Kontakt mit der Sterilisationslösung gehalten; die Behandlung ist stark bakterizid, wobei sie wirksam sogar schwer abzutötende Bakterien und Sporen inaktiviert. Aufgrund des Vorhandenseins des Schutzmittels verändert diese Sterilisationsbehandlung jedoch entweder die physikalischen Eigenschaften des Bioprothesegewebes nicht oder auf eine sorgfältig kontrollierten Weise. Frisches Gewebe, das zuvor nicht fixiert, d.h. vernetzt, wurde, wird als Ergebnis der Behandlung nur minimal oder alternativ kontrollierbar vernetzt, wie durch Messung seiner Schrumpfungstemperatur oder seiner Beständigkeit gegenüber enzymatischer Verdauung gesehen werden kann, und behält daher entweder seine gewünschten physikalischen Eigenschaften oder hat sie leicht in sorgfältig kontrollierter Weise verändert. Wenn biokonstruierte Gewebeprodukte behandelt werden, könnte zum Beispiel die Beständigkeit gegenüber Vernetzung, wie besonders während Collagenaseverdauungstest gesehen, moduliert werden, um spezielle Kriterien zu erfüllen, ein Anstieg der Schrumpfungstemperatur von nicht mehr als etwa 2°C wird gewöhnlich bewirkt werden.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die Beispiele, die folgen, beschrieben. Diese Beispiele dürfen nicht als in irgendeiner Weise den Geist oder den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränkend angesehen werden.
Von Gegenständen, die in den menschlichen Körper implantiert werden sollen, wird verlangt, daß sie auf eine Weise sterilisiert werden, so daß wirksam alle Mikroorganismen zu zerstört werden. Aufgrund der einzigartigen Anwendung von flüssigen Chemikalien zur Verwendung in Sterilisationsverfahren ist es notwendig, beim Detektieren, Screenen und Testen von Mikroorganismen, die signifikante Beständigkeit gegenüber dem Sterilisationsverfahren zeigen könnten, umsichtig zu sein. Beispiele von Referenzorganismen, von denen zuvor gezeigt wurde, daß sie hohe Beständigkeit gegenüber flüssigen chemikalischen Sterilisationsmitteln haben, sind: die Sporen von Bacillus subtilis, Chlostridium sporogenes, Bacillus pumilus, Chaetonium globosom und Microascus cinereus und entsprechende vegetative Zellen, wie Mycobaceterium chelonae, Methylbactrium exotroquens und Trichosporon aquatile. Von den vorangehenden können die resistentesten die Sporen von Bacillus subtilis sein.
Das bevorzugte Kupplungsmittel, das in den folgenden Beispielen verwendet wird, ist 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC), das kommerziell erhältlich ist. Peptonwasser wird durch Lösen von 1 g Bacto Pepton in 1 l entionisiertem Wasser hergestellt, und die Lösung wird dann unter Verwenden von sterilen 0,2 μm Filtern in sterile Flaschen filtriert. Kupplungsmittel und/oder Schutzmittel werden in 10 mM HEPES-Puffer, enthaltend 0,85 % Natriumchlorid, pH 6,5 (HEPES-Puffer) oder in 10 mM TRIS-Puffer, enthaltend 0,85 % Natriumchlorid, pH 6,5 (TRIS-Puffer) solubilisiert. Die Konzentrationen werden als mM (Anzahl Millimol Chemikalien auf jeden Liter an Lösung) oder als % (Gramm pro 100 ml Lösung) ausgedrückt. Die Temperaturen sind in °C (Grad Celsius), wobei Raumtemperatur etwa 20 bis 25° ist.
Wenn Schweine-Aortenwurzeln, die fixiert sind, eingesetzt werden, sind sie gemäß dem in US-Patent Nr. 5,447,536 beschriebenen Verfahren vernetzt oder Glutaraldehyd-fixiert oder vernetzt oder mit einem anderem Verfahren, das verwendet wird, um Gewebe zu konservieren, fixiert. Nach Fixierung wird das Gewebe in 10 mM HEPES, 0,85 NaCl, 20 % Isopropylalkohol, pH 7,4 bei 4°C gelagert. Die in den folgenden Beispielen beschriebenen Sterilitätstests werden in Gegenwart von Rinderperikard oder Schweineherzklappengewebe durchgeführt.
Nachdem solches Gewebe mit Mikroorganismen für Testzwecke beimpft und dann Sterilisation unterworfen wurde, wird die Lösung durch einen 0,45 μm-Filter, verbunden mit einem Trichter (Filtertrichter) filtriert. Das Gewebe wird 20 Minuten in einem sich hin- und herbewegenden Schüttler in Gegenwart von Peptonwasser, enthaltend Tween 80 gewaschen, um alle indigenen Sporen oder Mikroorganismen aus dem Gewebe zu extrahieren. Diese Lösung wird dann durch den gleichen entsprechenden Filter filtriert. Die Filter werden dann mit Peptonwasser gespült, um restliche Chemikalien auf der Membran zu entfernen, die das Wachstum der getesteten Organismen verhindern können. Die Membranfilter werden auf festen Agar-TSA-Platten (Millipore) bei etwa 32 bis 33°C, z.B. 32,5°C, inkubiert. Alle mikrobiologischen Tests werden in einer biologischen Laminarflußhaube durchgeführt, um Kontamination zu vermeiden. Die Schrumpfungstemperaturtests und die Tests auf die Beständigkeit gegenüber Collagenaseverdau werden wie in dem '536-Patent beschrieben durchgeführt.
BEISPIEL 1
Ein Sterilisationsverfahren wird unter Verwendung von Bacillus subtilis (ATCC 9372)-Sporen (~10⁶) beimpft in sterile Becher, die vernetzte Schweineherzklappenplättchen, fixiert durch ein Verfahren gemäß US-Patent Nr. 5,447,536 enthalten, durchgeführt. Eine 10 mM HEPES, 0,85 % NaCl, pH 6,5-Lösung, enthaltend EDC und 100 mM Ethanolamin in Gegenwart von 20 % Isopropylalkohol wird zugegeben. EDC ist bei 25 mM, 50 mM und 70 mM vorhanden. Die Becher und Plättchen werden bei 40°C 1, 3 und 5 Tage der Behandlung inkubiert. Die Lösungen werden dann filtriert, und die Plättchen in einem Schüttler, wie zuvor beschrieben, gewaschen. Die Filter werden für bis zu 7 Tage (Inkubationsdauer) bei etwa 32–33°C unter Verwendung von Trypticase Soya-Agar (TSA)-Platten inkubiert. In bezug auf alle drei Konzentrationen von EDC gibt es ein vollständiges Abtöten nach einem Tag. Die Ergebnisse zeigen, daß die Sporen von Bacillus subtilis mit diesem Verfahren der Sterilisation in Gegenwart von Schweineaortenklappenplättchen inaktiviert werden. Die Plättchen bleiben flexibel und zeigen keine bemerkbare physikalische Veränderung.
Proben von vernetztem Schweineaortenwurzelgewebe, das mit entweder mit Essigsäureanhydrid oder mit einer Mischung von TRIS und Isopropylamin vorbehandelt wurde, wurden wirksam unter Verwendung von EDC in Abwesenheit eines niederen Alkanols sterilisiert. Die Wirksamkeit der EDC-Sterilisation von Rinderperikardgewebe in Gegenwart von TRIS wurde auch gezeigt.
BEISPIEL 2
Um spezifisch die Wirkung zu bestimmen, die dieses Sterilisationsverfahren auf die Schrumpfungstemperatur von biologischem Gewebe haben kann, wird frisches perikardiales Rindergewebe unter Verwendung von 25 mM in 10 mM HEPES, 0,85 % NaCl, 20 % Isopropylalkohol, pH 6,5 bei 40°C 24 Stunden sterilisiert. Das Gewebe wird präpariert, und die thermische Denaturierung oder die Schrumpfungstemperatur wird für frische Kontrollproben und für sterilisierte Proben, wie in dem '536-Patebt beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle A präsentiert und zeigen, daß diese Sterilisationsmethode eine Wirkung auf die Schrumpfungstemperatur des Gewebes hat.
Tabelle 1
Es kann aus Tabelle 1 gesehen werden, daß die Schrumpfungstemperatur von frischem Rinderperikardgewebe sich nach Sterilisation etwas verändert. Obwohl dies wesentlich weniger ist, als die Veränderung wäre, wenn frisches Rinderperikardgewebe absichtlich Fixierung gemäß den Beispielen in dem '339-Patent unterworfen wurde (wo die Schrumpfungstemperatur von frischem Perikardgewebe vernünftig auf etwa 85 % erhöht werden kann), ist es noch immer ein substantieller Anstieg von nahezu 6°C, der sehr wahrscheinlich unerwünscht für Allotransplantate sein könnte. Ein empfindlicherer Test zur Bestimmung des Grads der Vernetzung ist jedoch die Beständigkeit gegenüber Collagenaseverdauung.
Experimente werden durchgeführt, die zeigen, daß die Zugabe von Amin- oder Carboxyl-reaktiven Vernetzungsblockern während der Sterilisation von collagenartigem Material in Gegenwart von EDC/IPA zu Gewebe mit einem kontrollierbaren Grad an Vernetzung führt, der wie gewünscht durch Variation der Konzentration der verschiedenen Blockern variiert werden kann. Diese Ergebnisse werden durch Tests demonstriert, um sowohl die Beständigkeit gegenüber Collagenaseverdauung als auch die Beständigkeit gegen thermische Denaturierung zu bestimmen. Durch Verwendung verschiedener Blockierungsmittel und/oder verschiedener Konzentrationen der Blockierungsmittel während der Sterilisation kann gezeigt werden, daß Gewebe "völlig" gegenüber Collagenaseverdauung beständig gemacht werden kann, d.h. ähnlich zu derzeitigen vernetzten Gewebe, nicht beständig, d.h. ähnlich zu frischem Gewebe, oder mit unterschiedlichen gewünschten Graden an Collagenasebeständigkeit. Von dieser biokompatiblen Sterilisationstechnik wird angenommen, daß sie besonders wertvoll bei der Gewebekonstruktion ist, wo häufig eine variable Dauer der Resorption wünschenswert ist, um den Umbau des Konstrukts durch den menschlichen Körper zu erlauben. Von dieser Methode wird daher angenommen, daß sie besonders nützlich ist, um eiweißartiges Material zu sterilisieren, wo im wesentlichen keine Zugabe von Vernetzung wünschenswert ist oder wo ein kontrollierbarer Grad an Vernetzung wünschenswert ist, um bestimmten Funktionen in dem menschlichen Körper folgend auf Implantation zu erfüllen.
BEISPIEL 3
Frisches Schweineperikard wurde in Parallelexperimenten unter Verwendung der folgenden Puffer in Gegenwart oder Abwesenheit von 25 mM EDC und 20 % Isopropylalkohol bei pH 6,5 24 Stunden bei 40°C inkubiert.

Lösung A. HEPES 10 mM, NaCl 60 mM und NH₄Cl 50 mM.
Lösung B. HEPES 10 mM, NaCl 70 mM und Hydroxyprolin 40 mM.
Lösung C. TRIS 50 mM und NaCl 70 mM.
Lösung D. HEPES 10 mM, Ethanolamin 50 mM und NaCl 60 mM.
Lösung E. TRIS 50 mM, Ethanolamin 50 mM und NaCl 20 mM.
Lösung F. Kontrolle: HEPES 10 mM, NaCl 110 mM.

Die Lösungen A, C, D und E enthalten mit Carboxyl reagierende Blockierungsmittel, während die Lösung B ein mit Amin reagierendes Blockierungsmittel enthält. Lösung F ist ein Kontrollpuffer ohne Blockierungsmittel.
Die Stabilität des sterilisierten Gewebes gegenüber thermischer Denaturierung (Schrumpfungstemperatur) wurde zuerst, wie in Beispiel 2 durchgeführt, getestet. Die Testergebnisse sind in der Tabelle, die folgt, dargelegt:
Tabelle 2A
Zum Vergleich, die thermisch Denaturierungstemperatur von Schweineperikard vernetzt entweder mit Glutaraldehyd oder mit EDC + Sulfo-NHS ist etwa 87°C.
Die Ergebnisse der thermischen Stabilität zeigen, daß NH₄Cl, Ethanolamin und TRIS + Ethanolamin die wirksamsten Vernetzungsblockierungsmittel sind, was zu einer thermischen Denaturierung ähnlich der von frischem Perikard führt. Größere Anstiege der thermischen Stabilität treten in Gegenwart von TRIS allein oder Hydroxyprolin auf, was etwas Vernetzung der Gewebecarbonyl- und -amin-Gruppen anzeigt und daß TRIS (bei 50 mM) nicht so wirksam wie andere bei der Blockierung von Vernetzung ist. Es gibt keine Veränderung der thermischen Stabilität von Perikardproben inkubiert in Abwesenheit von EDC.
Frisches Gewebe ist sehr anfällig für Collagenaseverdauung, während vernetztes Gewebe gegenüber Collagenaseabbau sehr beständig ist. Stücke von Schweineperikard (1 × 1 cm), die wie beschrieben sterilisiert wurden, wurden in Luft über Nacht getrocknet und gewogen. Sie wurden dann bei 37°C in Gegenwart von 220 Einheiten Collagenase Typ VII aus Clostridium hystolyticum (Sigma C-0773) inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Perikardproben aus der Lösung entnommen, in normaler Salzlösung gewaschen, über Nacht getrocknet und gewogen. Der Prozentsatz des verdauten Gewebes wurde dann berechnet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2B dargestellt.
Tabelle 2B
Die Ergebnisse der Collagenaseverdauung zeigen, daß Sterilisation in Gegenwart von 50 mM TRIS allein nicht so viel Schutz vor Vernetzung von proximalen Carboxyl- und Amin-Einheiten liefert wie die Sterilisation in Gegenwart von NH₄Cl, Hydroxyprolin oder Ethanolamin, die mehr Schutz als TRIS oder die HEPES-Kontrolle liefern, wogegen der stärkste Schutz mit einer Kombination von TRIS plus Ethanolamin erhalten wird. Der Grund für den eher schlechten Schutz in Gegenwart von TRIS allein kann die sterische Hinderung sein (d.h. das TRIS-Molekül könnte nicht in der Lage sein, wirksam die Carboxyl-Einheiten, die innerhalb des Collagens oder anderer Proteinmoleküle des Gewebes liegen, zu erreichen).
Die Ergebnisse zeigen auch, daß Gewebe mit einer Schrumpfungstemperatur nahe der von frischem Gewebe durch Collagenase in größerem Ausmaß abgebaut wird als Gewebe mit höherer Schrumpfungstemperatur. Es kann gesehen werden, daß ein Anstieg der Schrumpfungstemperatur von nur 4 bis 5°C zu Gewebe führt, das gegenüber Collagenase beständig ist, was ein Beweis für wesentliche Vernetzung ist.
EDC-Sterilisation in HEPES-Puffer, enthaltend 20 % Isopropylalkohol, durchgeführt entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von Gewebe führt zu vollständiger Abtötung der Sporen von Bacillus subtillis. Das folgende Experiment wurde entwickelt, um zu testen, ob die Sterilisationswirkung von EDC durch die Gegenwart von Vernetzungsmitteln im wesentlichen unbeeinflußt bleibt. Ungefähr 1,7 × 10⁵ Sporen wurden in Glasampullen, 5 Proben pro Bedingung, eingeimpft. Nach 10 Minuten wurde 10 ml der Lösungen A, B, C, D, E und F, enthaltend 25 mM EDC zugegeben, die Ampullen wurden warm verschweißt und bei 40°C plaziert. Nach 24 Stunden wurden die Lösungen aus den Ampullen filtriert, um die Sporen wiederzugewinnen, die Filter wurden mit 0,1 % Peptonwasser gewaschen, und diese wurden auf TSA-Platten für bis zu 10 Tage bei 32 bis 33°C inkubiert, wonach die Kolonien gezählt wurden. Von den positiven und den negativen Kontrollen wurde gezeigt, daß sie den Test validieren. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2C präsentiert.
Tabelle 2C
Die Ergebnisse zeigen, daß die Gegenwart von Vernetzungsblockierungsmitteln keine Wirkung auf die Stabilisationswirksamkeit von EDC hat.
BEISPIEL 4
In Beispiel 3 wurde von der Lösung, enthaltend 50 mM TRIS plus 50 mM Ethanolamin gezeigt, daß sie größeren Schutz gegenüber der Bildung von Vernetzungen von Null Länge zeigt. Das folgende Experiment wurde entwickelt, um die Wirkung von unterschiedlichen Konzentrationen von TRIS und Ethanolamin auf den Vernetzungsschutz von Schweineperikard zu testen. Die verwendeten Konzentrationen waren TRIS 0 mM und Ethanolamin 0 mM (HEPES-Puffer Kontrolle); TRIS 25 mM und Ethanolamin 25 mM; TRIS 50 mM und Ethanolamin 50 mM; und TRIS 100 mM und Ethanolamin 100 mM; alle enthielten 20 % Isopropylalkohol. Bahnen von Schweineperikard wurden in den oben erwähnten Lösungen in Gegenwart von 25 mM EDC bei 40°C sterilisiert. Nach 24 Stunden wurden die Proben entfernt und bei Raumtemperatur plaziert. Die Stabilität von Schweineperikard gegenüber thermischer Denaturierung und seine Beständigkeit gegenüber Collagenaseverdauung wurden wie zuvor getestet. Die Ergebnisse sind in Tabellen 3A und 3B dargelegt.
Tabelle 3A
Die Ergebnisse der thermischen Denaturierung zeigen, daß Anstiege in den TRIS und Ethanolamin-Konzentrationen zu erhöhtem Schutz vor Vernetzung während der Sterilisation führen, wogegen ein Anstieg von 4°C in Abwesenheit jedes Vernetzungsblockierungsmittels beobachtet wird.
Ein Test in bezug auf die Collagenaseverdauung wurde auch wie für Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, aber die verwendete Collagenasekonzentration war ungefähr 187 Einheiten Collagenase pro Test. Die Inkubationsdauer war 72 Stunden bei 37°C, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3B präsentiert.
Tabelle 3B
Die Ergebnisse der Collagenaseverdauung zeigen, daß in Abwesenheit von Blockierungsmitteln sterilisiertes Gewebe, d.h. HEPES-Kontrolle, gegenüber Collagenaseverdau stark resistent ist, was ein Beweis dafür ist, daß es die höchste Vernetzungsdichte zeigt. Die Beständigkeit gegenüber Vernetzung steigt mit ansteigenden TRIS- + Ethanolamin-Konzentrationen an, um ein Niveau nahe dem von frischem Gewebe zu erreichen, was zeigt, daß das Ausmaß der Beständigkeit sorgfältig durch die Verwendung von variierenden Konzentrationen kontrolliert werden kann. Sterilisation in Gegenwart von Ethanolamin bei einer Konzentration höher als 50 mM in HEPES-Puffer aber ohne TRIS kann auch sehr guten Schutz gegen Vernetzung liefern.
BEISPIEL 5
Folgend auf die Beendigung von Beispiel 4 wurde beschlossen, zu bestimmen, ob es einen Unterschied in der Wirkung der Behandlung auf Schweineaortenklappenplättchen im Vergleich zu Perikard geben würde.
Mischungen von TRIS (25 mM) plus Ethanolamin (25 mM) und TRIS (100 mM) plus Ethanolamin (100 mM) wurden verwendet, um Schweineaortenklappenplättchen und Schweineperikard zu sterilisieren. Die Proben wurden 24 Stunden bei 40°C in den oben erwähnten Lösungen enthaltend 25 mM EDC und 20 % Isopropylalkohol inkubiert. Die Kontrollbedingungen waren HEPES-Puffer + 20 % Isopropylalkohol mit oder ohne 25 mM EDC und frische unbehandelte Schweineaortenklappenplättchen. Die thermische Denaturierungstemperatur und die Stabilität gegenüber Collagenaseverdau wurden für jede Gruppe von fünf Proben getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 präsentiert.
Tabelle 4
Die Ergebnisse dieses Experiments bestätigen, daß TRIS plus Ethanolamin-Puffer gegenüber Vernetzung sowohl bei Schweineaortenklappenplättchen als auch bei Schweineperikard schützen. Der Schutz steigt mit der Konzentration der Vernetzungsblockierungsmittel an, und TRIS 100 mM plus Ethanolamin 100 mM verhindert Vernetzung mit Null-Länge des Gewebes vollständig wie im Vergleich zu der HEPES + EDC-Kontrolle gesehen werden kann. Zusätzlich kann gesehen werden, daß das Niveau der Vernetzung, wie durch Collagenase bewertet, durch Modifikation der Konzentration der Blockierungsmittel, wie mit Bezug auf Beispiel 4 gezeigt, moduliert werden kann.
BEISPIEL 6
Die in Tabelle 2C von Beispiel 3 berichteten Tests wurden ferner durch Zugabe von Perikard zu den Tests weiter geführt. Fünf Schweineperikard-Coupons (5 × 5 cm) für jede Bedingung wurden in sterile Becher gegeben und mit 1,2 × 106 (6,08 Log) Sporen von Bacillus subtilis beimpft. Nach 10 Minuten wurden 50 ml der folgenden Lösungen, enthaltend 25 mM EDC auf die Coupons gegossen und bei 40°C inkubiert:

HEPES 10 mM, NaCl 60 mM und NH₄Cl 50 mM.
HEPES 10 mM, NaCl 70 mM und Hydroxyprolin 40 mM.
TRIS 50 mM und NaCl 70 mM.
HEPES 10 mM, Ethanolamin 50 mM und NaCl 60 mM.
TRIS 25 mM, Ethanolamin 25 mM und NaCl 70 mM.
TRIS 50 mM, Ethanolamin 50 mM und NaCl 20 mM.
TRIS 100 mM, Ethanolamin 100 mM.
HEPES 10 mM, NaCl 110 mM (Kontrolle).

Nach 24 Stunden wurden die Lösungen durch Millipore-Filtertrichter filtriert, mit 50 ml 0,1%igem Peptonwasser gespült und auf TSA-Platten plaziert. Die Schweineperikard-Coupons wurden 20 Minuten während Schütteln mit 150 U/Minute mit 50 ml 0,1%iger Pepton-Wasserlösung, enthaltend 1 ml pro Liter Tween 80 gewaschen. Die Lösungen wurden filtriert, und die Membranen wurden auf TSA-Platten plaziert. Die TSA-Platten wurden 15 Tage bei 32 bis 33°C inkubiert und ausgezählt. Die Anzahl von kolonienbildenden Einheiten (CFUs) für die Lösung und die Perikard-Coupons wurden zusammengezählt, und die Log-Reduktion bestimmt. Von der positiven und der negativen Kontrolle wurde gezeigt, daß sie den Test validieren, die Ergebnisse davon sind in Tabelle 5 präsentiert.
Tabelle 5
Die Ergebnisse zeigen, daß Sterilisation in Gegenwart von vernetzenden Blockierungsmitteln auftritt, und sie stützen stark das Konzept, das collagenöses Gewebe und gewebekonstruierte Gerüste in Gegenwart von vernetzenden Blockierungsmitteln sterilisiert werden können, um eine Vernetzungsdichte zu erreichen, die zur "zeitkontrollierten" Resorption und zum potentiellen Umbau nach Implantation in den menschlichen Körper geeignet ist. Dieses Verfahren ist auch zur Sterilisation von gewebeabgeleiteten Vorrichtungen geeignet, wo erhöhte Vernetzung des Gewebes für die spezielle Vorrichtung nachteilig sein kann.
Die Tests zeigen daher, daß die erhöhte Konzentration von Blockierungsmitteln zu verstärktem Schutz gegenüber Vernetzung führt.
Zusätzlich liefern sowohl aminreaktive Mittel (d.h. Hydroxyprolin) als auch carboxylreaktive Mittel (d.h. Ethanolamin, Isopropylamin usw.) Schutz gegen Vernetzung des Gewebes während Sterilisation mit EDC. Andere Beispiele der aminreaktiven Mittel sind Salze von Milchsäure, Essigsäure und Salze von Monocarbonsäuren. Die Konzentration an Monocarbonsäure wird so ausgewählt, daß EDC nicht erschöpft ist, bevor die vollständige Sterilisation erreicht ist.
Obwohl die oben beschriebenen Blockierungsmittel während der Sterilisation am besten geeignet sein können, können andere carboxyl- oder aminblockierende Mittel mit Gewebe-Amin- oder -Carboxyl-Gruppen vor Sterilisation umgesetzt werden. Beispiele solcher Mittel schließen Citraconsäureanhydrid, Essigsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid und N-Hydroxysulfosuccinimidacetat ein.
Es wird auch angenommen, daß es wichtig sein kann, Blockierungsmittel auszuwählen, die in der Lage sind, schnell innerhalb des eiweißartigen Materials zu diffundieren, um die gewünschte Modifikation in einem vernünftigen Zeitrahmen durchzuführen. Zum Beispiel kann TRIS zur Verwendung bei der Behandlung von lockeren Collagenstrukturen, wie Collagenschwämmen und einigen Collagenlösungen oder -suspensionen, geeignet sein, aber kann für die Sterilisation von festeren Strukturen, wie Schweineperikard, nicht geeignet sein.
Die Ergebnisse zeigen allgemein an, daß eine wäßrige Lösung von EDC in Gegenwart eines Schutzmittels zur Komplexierung mit potentiell reaktiven Amin oder Carboxyl-Einheiten auf biologischem Gewebe mit oder ohne 10 % Isopropylalkohol (IPA) bei etwa 40°C ein kraftvolles Bakterizid gegen Sporen von Bacillus subtilis und anderen Bakterien ist, obwohl der Einschluß von IPA bevorzugt ist. Es wird folglich angenommen, daß eine solche Sterilisationsbehandlung unter Verwendung eines wasserlöslichen Kupplungsmittels in Gegenwart oder Abwesenheit von Isopropylalkohol bei einer Temperatur oberhalb Raumtemperatur ihre starke bakterizide Wirkung behält, obwohl ein Schutzmittel in einer wirksamen Menge vorhanden ist, um wesentliche Vernetzung von biologischem Gewebe zu verhindern. Folglich wird von so einer Behandlung angenommen, daß sie ausgezeichnet zur Sterilisation von Allotransplantaten, z.B. Sehnen, Bändern, Menisci, Gefäßplastiken und ähnlichen und Gewebeventilen ist, da die Gegenwart solch einer wirksamen Menge an Schutzmittel einen wesentlichen und kontrollierbaren Anstieg der Schrumpfungs- oder Denaturierungstemperatur und die Beständigkeit gegenüber Collagenase adäquat verhindert, die ein Ausmaß der Vernetzung anzeigt, wie für Allotransplantate oder bestimmte Gewebeventile ungewünscht sein kann.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen, die die beste, den Erfindern derzeit bekannte Form zur Ausführung der Erfindung darstellen, beschrieben wurde, sollte verstanden werden, daß Veränderungen und Modifikationen, die für jemanden mit gewöhnlichen Fähigkeiten in diesem Fachgebiet offensichtlich wären, durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung, der in den anhängenden Ansprüchen dargelegt ist, abzuweichen. Obwohl die Erfindung mit Bezug auf die Sterilisation von Gewebeventilmaterial und Bändern und ähnlichen beschrieben wurde, kann sie zum Beispiel auch verwendet werden, um andere Allotransplantate zur Implantation in den menschlichen Körper zu sterilisieren. Obwohl von der Verwendung eines Carbodiimid-Kupplungsmittels gezeigt wird, daß sie ohne den Einschluß eines Kupplungsverstärkers wirksam ist, kann ein Verstärker, wie N-Hydroxysuccinimid (NHS) eingeschlossen werden. Obwohl angenommen wird, daß die plausibelsten Kombinationen von Temperatur, Konzentration und Dauer der Inkubation offenbart sind, sollte verstanden werden, daß äquivalent niedrigerer Temperaturen und/oder Konzentrationen mit zunehmend längerer Dauer der Inkubation verwendet werden könnten.
Besondere Merkmale der Erfindung sind in den Ansprüchen, die folgen, dargelegt.

Claims

Verfahren zum Sterilisieren eines biologischen Gewebematerials, das umfaßt: Behandeln des biologischen Gewebematerials mit einem Schutzmittel, das die Wirkung hat, sich mit möglicherweise reaktiven Amin- oder Carboxylresten auf dem biologischen Gewebematerial zu komplexieren, um solche komplexierten Reste daran zu hindern, an einer amidbildenen Vernetzungsreaktion teilzuhaben, und dadurch das Ausmaß der Vernetzung zu begrenzen, Behandeln des biologischen Gewebematerials mit einer wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen Kupplungsmittels, das in der Lage ist, Amidbindungen herzustellen, welches wirksam ist, um eine Sterilisierung zu erreichen, und Durchführen einer solchen Behandlung mit diesem Kupplungsmittel über einen ausreichenden Zeitraum und bei einer Temperatur, um ein Eindringen dieses Kupplungsmittels in die Zellen von Mikroorganismen zu erreichen, die von einem solchen Material getragen werden, und solche Mikroorganismen abzutöten.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Kupplungsmittel und das Schutzmittel in der wäßrigen Lösung vorhanden sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das biologische Gewebematerial mit dem Schutzmittel in einer Konzentration von mindestens 10 mM vorbehandelt wird und dann vor der Behandlung mit der wäßrigen Lösung des Kupplungsmittels gespült wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei diese Sterilisierungsbehandlung bei einer Temperatur von 25 bis 55°C in Gegenwart einer wirksamen Menge eines niederen Alkanols durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Sterilisierungsbehandlung bei einer Temperatur von mindestens 35°C in Abwesenheit einer wirksamen Menge eines niederen Alkanols durchgeführt und für mindestens 24 Stunden durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Schutzmittel ein Monoamin umfaßt und in der wäßrigen Lösung in einer Konzentration von mindestens 25 mM vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Schutzmittel eine Monocarbonsäure umfaßt und in der wäßrigen Lösung in einer Konzentration von mindestens 25 mM vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die wäßrige Lösung mindestens 50 mM Ethanolamin und mindestens 50 mM TRIS umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Schutzmittel Hydroxyprolin, Milchsäure, Essigsäure, Sulfo-NHS-acetat, Essigsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid oder Citraconsäureanhydrid ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Schutzmittel in einer Konzentration zwischen 50 und 150 mM verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kupplungsmittel EDC ist, welches in einer Konzentration von mindestens 50 mM vorhanden ist, und die Sterilisierungsbehandlung für mindestens 10 Stunden bei einer Temperatur von mindestens 40°C durchgeführt wird.