DE60014760T2

DE60014760T2 - Verwendung von Primaquinderivaten zum Behandlung von Malaria

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Publication number: DE60014760T2
Application number: DE60014760T
Authority: DE
Inventors: Ram 226001 Lucknow Pratap; Amiya Prasad 226001 Lucknow Bhaduri; Harsh Pati 226001 Lucknow Thapliyal; Sunil Kumar 226001 Lucknow Puri; Guru Prasad 226001 Lucknow Dutta; Anil Kumar 226001 Lucknow Dwivedi; Satyawan 226001 Lucknow Singh; Pratima 226001 Lucknow Srivastava; Vikash Chandra 226001 Lucknow Pandey; Sudhir 226001 Lucknow Srivastava; Shio Kumar 226001 Lucknow Singh; Ram Chandra 226001 Lucknow Gupta; Jagdishwar Sahai 226001 Lucknow Srivastava; Omkar Prasad 226001 Lucknow Asthana
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2020-03-25
Also published as: DE60014760D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Primaquin-Derivates N¹-(3-Ethylidinotetrahydrofuran-2-on)-N⁴-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4-pentandiamin als gametozides Mittel bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Malaria. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Verwendung eines Primaquin-Derivates N¹-(3-Ethylidinotetrahydrofuran-2-on)-N⁴-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4-pentandiamin der nachstehend gezeigten Formel 1, das sich auf Grund seines hohen therapeutischen Werts als gametozides Mittel zur Bekämpfung der Verbreitung von Malaria eignet.
Das erfindungsgemäße Primaquin-Derivat schädigt weder normale noch G-6PD-defiziente Erythrozyten in dem Ausmaß, das bei der Verwendung von Primaquin beobachtet wird.
Hintergrund der Erfindung
Malaria ist eine der schwersten, durch Protozoen hervorgerufenen Infektionskrankheiten des Menschen. Nach Schätzungen in den 90er Jahren entwickeln etwa 300 bis 500 Millionen Menschen klinische Infektionen und 1 Million sterben aufgrund schwerer Infektion jedes Jahr. Indien gehört auch zu den Ländern mit endemischen Regionen der Krankheit. Es ist daher sehr wichtig und höchst erforderlich, therapeutisch verträgliche Mittel zur vielfältigen Verwendung zu haben, insbesondere solche, welche die Übertragung von Malaria durch Individuen, die endemische Regionen besuchen, unterdrücken. Ein kürzlich erschienener Bericht aus Italien über das Wiederauftreten von Malaria nach einer längeren Zeitspanne von 40 Jahren durch Übertragung, bekräftigt unser Vorhaben. [The Lancet, 350, 717 (1997)].
Malaria wird durch Infektion mit einer der vier Arten von Plasmodia verursacht. Der Lebenszyklus von Plasmodia ist komplex und umfasst eine geschlechtliche Phase (die sogenannte Sporogonie) in der Mücke (ein Überträger) und eine ungeschlechtliche Teilung (die sogenannte Schizogonie) in Menschen. Der Lebenszyklus beginnt nach dem Einspritzen von Sporozoiten durch den Stich einer infizierten weiblichen Anophelesmücke. Die Sporozoiten befallen dann rasch die Leberparenchymzellen, wo sie eine exoerythrozytäre Schizogonie unter Bildung eines exoerythrozytären Stadiums von Gewebeschizonten durchlaufen, die reifen und nach dem Zerfall der infizierten Zelle Tausende von Merozoiten in den Blutkreislauf freisetzen. Einige dieser Merozoiten befallen Erythrozyten, wo sie sich in Trophozoiten und Schizonten verwandeln. Die reifen Schizonten zerfallen und setzen Merozoiten in den Kreislauf frei, die andere Erythrozyten infizieren können. Dies wird als ungeschlechtliche Schizogonie bezeichnet (erythrozytischer Kreislauf), und diese periodische Freisetzung von Merozoiten ist für die charakteristische Periodizität des Fiebers bei Malaria verantwortlich. Nach mehreren erythrozytären Zyklen differenzieren einige erythrozytäre Formen zu geschlechtlichen Formen, die Gametozyten genannt werden. Bei Infektionen durch P. vivax und P. ovale, verbleiben einige Sporozoiten nach Befall der Leberzellen ruhend und bilden das latente Gewebestadium, das Hypnozoiten bezeichnet wird. Diese Hypnozoiten entwickeln bei Aktivierung sekundäre Gewebeschizonten, die für das Wiederauftreten der Malaria, als Malariarückfall bezeichnet, verantwortlich sind. Die 8-Aminochinolin-Antimalariamedikamente, von denen Primaquin (PQ) von herausragender Bedeutung ist, haben gezeigt, dass sie Aktivität gegen einige Lebenszyklusstadien des Parasiten besitzen. Diese Mittel sind aktiv gegen primäre Gewebeschizonten, und wirken somit als ursächlich vorbeugende Mittel gegen die sekundären exoerythrozytären Formen und heilen Rückfallformen der Malaria. Die Übertragung der Malaria erfolgt, wie vorstehend erörtert, durch Einspritzen von Sporozoiten durch den Stich von Mücken. Diese Sporozoiten entwickeln sich in einer Mücke, die an einem Individuum, das reife Gametozyten trägt, Blut gesaugt hat. Die männlichen und weiblichen Gametozyten reifen nach der Blutaufnahme durch eine weibliche Anophelesmücke und verwandeln sich zum Zygoten- und Ookinetenstadium. Die Ookineten durchstoßen das Epithelium des Mitteldarms, wo es sich zu einer Oozyste aufbauscht. Eine einzige Oozyste enthält mehr als 10000 Sporozoiten. Primaquin hat keine sporontozide Aktivität, wenn es den Insekten direkt verabreicht wird, besitzt aber stark gametozide Aktivität und stoppt sogar die Übertragung von resistenten Isolaten, wenn Mücken mit infiziertem Blut von mit Primaquin behandelten Tieren gefüttert werden. Folglich ist Primaquin auch ein starkes Übertragungsblockierungsmittel. Primaquin wird jedoch, selbst wenn es mit gründlich heilenden und gametoziden Eigenschaften verbunden ist, nicht als prophylaktisches Mittel verwendet.
Saxena et al. "Effect of a new 8-aminoquinoline antimalarial compound on hepatic microsomal mixed function oxidase system of mice" Indian J. Med. Res. 89 (1989) 330–333 und Paliwal et al. "Simultaneous determination of a new antimalarial agent, CDRI compound 80/53, and its metabolite primaquine in serum by high-performance liquid chromatography" Journal of Chromatography 616 (1993) 155–160 beschreiben die Verbindung Bulaquin (N'-3"[Acetyl-4',5'-dihydro-2'-furanyl]-N-[6-methoxy-8-chinolinyl]-1,4-pentandiamin), die als aktive Antirückfall- (gewebeschizontozide) Verbindung beschrieben ist.
Die praktischen Probleme, die mit der Verwendung von 8-Aminochinolinen einher gehen, betreffen hauptsächlich ihre Toxizität, weil bei gründlicher Behandlung auf Grund des schnellen Metabolismus des Arzneimittels eine anhaltende Verwendung erforderlich ist. Bekanntlich verursacht Primaquin hämolytische Schäden bei Patienten, die an einem Mangel an Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G-6PD) leiden, einem genetischen Zustand, der bei Einwohnern von Regionen, in denen Malaria endemisch ist, häufig vorkommt. Anämie ist eine übliche Komplikation der Hämolyse. Primaquin bildet Metaboliten, wie o-Chinon- und p-Chinominfunktionsgruppen, die auf Grund ihrer oxidativen Natur ungesättigte Fettsäuren von Erythrozyten oxidieren, wobei sie die Lyse roter Blutzellen (RBC) verursachen. Das reduzierte Glutathion (GSH) kontrolliert den Spiegel der oxidativen Metaboliten, und der Spiegel von GSH wird durch NADPH-kontrollierte GSSG-Reduktion aufrechterhalten. NADPH wird durch G-6PD reguliert, und folglich sind G-6PD-defiziente Patienten anfälliger für RBC-Lyse. Primaquin ist das einzige Antimalaria-Arzneimittel, das die Entwicklung des Parasiten durch Eingriff in mehrere Stadien des parasitären Lebenszyklus hemmt und ist daher ein ideales Molekül für strukturelle Modifikation, um ein Molekül mit gründlich heilender und gametozider Aktivität und niedriger Toxizität bereitzustellen. Die Untersuchung des Schicksals von Primaquin, seinen Metaboliten und der toxischen Manifestation in Bezug auf die Metaboliten bestimmt daher die Richtung der Veränderungen in dem neuen Molekül. Eine kurze Beschreibung des Primaquin-Metabolismus ist hier angegeben.
Es wurde entdeckt, dass sich nach oraler Verabreichung von markiertem Primaquin 45% der Radioaktivität im Lebergewebe und 22% in Lunge, Nebennieren, Milz, Nieren, Herz, Blut und Pankreas befanden, während 25% in das Plasma gelangten. Folglich wird Primaquin ziemlich gut absorbiert, und nur ein kleiner Anteil gelangt tatsächlich in das Plasma.
Der Primaquin-Metabolismus tritt an zwei Stellen des Moleküls auf: zum einen im aromatischen Bereich an der Position 5 und 6 und zum anderen an der 8-N-Aminoalkylseitenkette. Der erste metabolische Reaktionsweg führt zur Bildung von 5-Hydroxyprimaquin (5-HPQ, 3), 5-Hydroxydsmethylprimaquin (5-HDPQ) der Formel (4)
Der zweite Reaktionsweg, der ursprünglichen Beobachtungen zufolge in Mikroorganismen auftrat, betrifft die 8-N-Aminoalkylkette und ergibt die Bildung von N-Acetylprimaquin und Desaminocarbonsäure der Formel (12).
Das Carbonsäurederivat ist der Hauptmetabolit von Primaquin in menschlichem Plasma.
Strother et al. identifizierten Metabolite aus dem Urin von mit Primaquin behandelten Hunden als 5-Hydroxy-6-methoxy-8-(4-amino-1-methylbutylamino)chinolin der Formel (3), Desmethyl-6-hydroxy-8-(4-amino-1-methylbutylamino)chinolin der Formel (9) und 5,6-Dihydroxy-6-methoxy-8-(4-amino-1-methylbutylamino)chinolin der nachstehend gezeigten Formel (4): [A. Strother, et al., "Metabolism of *-amonoquinoline antimalarial agents". Bulletin of the World Health organisation, 59, 413–425 (1981)].
Von den N-dealkylierten Primaquin-Derivaten wurden die Metabolite identifiziert als 6-Methoxy-8-aminochinolin der Formel (10) [J. D. Baty et al. "The identification of 6-Methoxy-8-aminochinolin as a metabolite of primaquine in Man". Biomedical Mass Spectrometry, 2, 304–306 (1975)] und 8-(3-Carboxy-1-methylpropylamino)-6-methoxychinolin der nachstehend gezeigten Formel (12). [J. K. Baker, et al., "HPLC analysis of the metabolism of primaquine and the identification of a New Mammalian Metabolite" Journal of Chromatography, 230, 69–77 (1982)]
Ein blaufarbiger Metabolit, der von 5-Hydroxydesmethylprimaquin stammte, wurde als tricyclisches Chinomin der nachstehend gezeigten Formel (8) identifiziert. [A Strother et al. "Metabolism of Primaquin by various Animal species" in Primaquine: Pharmacokinetics, Metabolism, Toxicity and Activity, S. 27–48 (1984), John Wiley & Sons]
Therapeutische Aktivität von Primaquin und seinen Metaboliten
Primaquin besitzt blutschizontozide Aktivitäten, wohingegen sein Desmethylderivat nur geringe besitzt. Zwei 5-OH-Derivate der vorstehend gezeigten Formel (3) und (4) sind hoch aktiv. Die Chinoline, denen die Seitenkette der Position 8 fehlt, die aber lediglich die vorstehend in Formel (10) und nachstehend in Formel (11) gezeigten Aminosubstituenten besitzen, haben keine wesentliche Aktivität.
In auffälligem Gegensatz ist die Beobachtung, dass die dealkylierten Derivate der Formeln 10 und 11 ihre gewebeschizontozide Wirkung behalten. Sie sind zwei- bis dreimal aktiver als Primaquin.
Die direkte sporontozide Aktivität von PQ und diesen vermeintlichen Metaboliten ist gegen die Entwicklung der Oozysten schwach, wenn Mücken von behandelten Tieren Blut saugen, welche Gametozyten bereitstellen. Primaquin ist als Sporontozid recht inaktiv, wenn es dem Insekt direkt verabreicht wird, ist aber ein sehr leistungsfähiges gametozides Mittel.
Das 5-Hydroxyderivat der Formel (4) des Desmethylprimaquins zeigt nur leicht gametozide Aktivität. Desmethylprimaquin der nachstehend gezeigten Formel (5) und 5-Hydroxymetaboliten der Formel (3) und Carbonsäuremetaboliten der Formel (12) von PQ sind alle inaktiv. Von besonderem Interesse ist die Beobachtung, dass zwei der Chinoline der vorstehend gezeigten Formeln (10) und (11) mit unsubstituierten -NH₂-Gruppen an der Position 8 direkt sporontozid sind. [W. Peters et al. "The activity of primaquine and its possible metabolites against rodent malaria" Primaquine: Pharmacokinetics, Metabolism, Toxicity and Activity, S. 93–101 (1984), John Wiley & Sons]
Toxizität von Primaquin und seinen Metaboliten
Primaquin der nachstehend gezeigten Formel (2) an sich scheint geringe oxidative Aktivität zu besitzen, selbst wenn es mit G-6PD-defizienten Erythrozyten inkubiert wird [I. M. Fraser et al. "Effects of Drugs and Drug Metabolites on Erythrocytes from Normal and Glucose-6-phosphate Dehydrogenase Deficient Individuals", Annals of the New York Academy of Sciences, 151, 777–94 (1968), John Wiley & Sons].
5-Hydroxyprimaquin der Formel (3) und 5,6-Dihydroxy-8-aminochinolin der Formel (11) verursachen hingegen die Oxidation von Oxyhämoglobin (HbO₂) zu Methämoglobin (Met-Hb) und von reduziertem Glutathion (GSH) [K. A. Fletcher et al., "The Pharmacokinetics and Biochemical Pharmacology of Primaquine in Rhesus Monkeys and Rats" in Primaquine: Pharmacokinetics, Metabolism, Toxicity and Activity, S. 49–63 (1984), John Wiley & Sons].
Die Carbonsäure der Formel (12), ein Hauptmetabolit des Primaquins, das im Plasma zirkuliert, hat keine Antimalariaaktivität gezeigt. Es ist unsicher, ob sie erheblich zur Toxizität des Primaquins beiträgt, obwohl sie in vitro keine Bildung von Methämoglobin verursacht. Wir berichteten früher von der ursächlichen prophylaktischen Aktivität eines Primaquin-Derivates, nämlich N¹-(3-Acetyl-4,5-dihydro-2-furanyl)-N⁴-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4-pentandiamin, mit Dosen von 3,16 mg/kgX3 gegen eine durch Sporozoit induzierte P.cynomolgi B.-Infektion in Affen. Das Derivat übte auch Antirückfall- (gründlich heilende) -Aktivität bei 1mg/kgX7 Tagen aus (G. P. Dutta, S. K. Puri, V.C. Pandey, M. Seth, A. P. Bhaduri, S. K. Chatterjee, O. P. Asthana und K. C. Gupta, Tropical Diseases, 286 (1998), G. P. Dutta, S. K. Puri, A. P. Bhaduri und M. Seth, Am. J. Trop. Med. Hyg. 41, 635, (1989). In dem Derivat ist Primaquin an der primären Aminofunktionalität substituiert.
Es ist folglich aus den vorstehenden Untersuchungen ersichtlich, dass Primaquin Antimalaria-Aktivitäten besitzt, wie blutschizontozide, gewebeschizontozide und gametozide Aktivitäten, die auch durch seine Metaboliten gezeigt werden. Primaquin ist sogar aktiver als seine Metaboliten. Die Carbonsäure der Formel (12) ist zwar ein Hauptmetabolit, aber nicht funktionell. Die Metaboliten von Primaquin sind auch für seine Toxizität verantwortlich. Der tricyclische Metabolit der Formel (8) ist aktiv, aber weniger toxisch, was daher auf die Bedeutung einer intakten Seitenkette hinweist. Möglicherweise kann daher die Toxizität moduliert werden, wenn das Primaquinmolekül über die Seitenkette manipuliert wird. Zweitens wird Primaquin sehr schnell absorbiert und metabolisiert, und als Folge entsteht sehr schnell ein oxidativer Ausbruch. Daher kann seine kontrollierte Abgabe eine geringere Toxizität ergeben.
Dies führte uns dazu, ein Primaquin-Prodrug mit geringerem toxischem Profil herzustellen. Primaquin ist von basischer Natur und hat eine freie Aminofunktionalität, die die Stelle für den Metabolismus für inaktive Metaboliten ist. Wir derivatisierten diese Aminofunktionalität zu Enaminon und beurteilten dessen Wirksamkeit hinsichtlich gametozider Wirkung und Methämoglobin-Toxizität. Enaminone sind funktionelle Gruppen zur kontrollierten Abgabe von Aminoarzneimitteln. Ein Enaminonderivat eines physiologisch aktiven Amins kann gut verbesserten Transport durch biologische Membranen zeigen und ermöglicht, dass eine hohe Konzentration des Amins nahe am Wirkungsort freigesetzt wird. Diese funktionelle Gruppe verleiht Resistenz gegen hydrolytische Spaltung bei saurem pH-Wert, verglichen mit dem einfachen Amin. Wir stellten das in Formel (1) gezeigte Enaminon-Derivat von Primaquin unter zwei Gesichtspunkten her. Erstens sollte es aufgrund der Seitenkette langsam im Stoffwechsel abgebaut werden, und zweitens sollte die Verbindung mit stärkeren lipophilen Eigenschaften besser in das Gewebe eindringen, insbesondere in die Leber, wo sich die Hypnozoiten befinden. Wir begonnen daher mit der Herstellung des Enaminon-Derivats der Formel (1), und die Ergebnisse seiner gametoziden Wirkungen und seine Sicherheitsprofile sind hier erwähnt. Wie bereits früher am Anfang erwähnt, wird die Suche nach einem ungefährlichen gametoziden Mittel aus zwei Gründen benötigt, erstens um das Wiederauftreten von Malaria in nicht endemischen Regionen, in denen die Malaria bereits durch überträgerkontrollierte Verfahren ausgerottet worden ist, durch Individuen, die endemische Regionen besuchen, zu blockieren, und zweitens, um die Verbreitung von sogar resistenten Arten zu blockieren.
Primaquin und seine vermeintlichen Metaboliten sind nachstehend gezeigt:
Aufgaben der Erfindung
Die Hauptaufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Primaquin-Derivates mit Enaminonfunktionalität, das gametozide Aktivität und niedrige Toxizität besitzt, zur Verwendung als Ansteckungsblockierungsmittel.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines neuen Primaquin-Derivates zur Erleichterung der kontrollierten Abgabe von Aminoarzneimitteln.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Primaquin-Derivates, das aufgrund der Seitenkettenmodifikation langsam metabolisch abgebaut wird.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Primaquin-Derivates mit Enaminon als funktioneller Gruppe, die Beständigkeit gegen hydrolytische Spaltung bei saurem pH-Wert verglichen mit dem einfachen Amin liefert.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines neuen Primaquin-Derivates mit verbessertem lipophilen Charakter, so dass ein besseres Eindringen in das Gewebe erleichtert wird, insbesondere in die Leber, wo sich die Hypnozoiten befinden.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines neuen Primaquin-Derivates mit hohem therapeutischem Indexverhältnis hinsichtlich der Methämoglobinbildung.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Primaquin-Derivates, das die Oxidation des Glutathion (GSH) in geringerem Ausmaß verursacht.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines neuen Primaquin-Derivates der Formel (1).
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung der Verwendung eines Primaquin-Derivates N¹-(3-Ethylidinotetrahydrofuran-2-on)-N⁴-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4-pentandiamin als ein gametozides Mittel bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Malaria.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Behandlung von Malaria unter Verwendung eines Primaquin-Derivates der nachstehend gezeigten Formel (1) mit der Enaminon-Funktionalität, das gametozide Aktivität und niedrige Toxizität als Ansteckungsblockierungsmittel besitzt. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer Verbindung der Formel (1) oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche die Verbindung der Formel (1) enthält, an Tiere, insbesondere an Menschen, die mit Malaria infiziert sind.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines neuen Primaquin-Derivates zur Erleichterung der kontrollierten Abgabe von Aminoarzneimitteln bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Malaria.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Primaquin-Derivates, das aufgrund der Seitenkettenmodifikation langsam metabolisch abgebaut wird, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Malaria.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Primaquin-Derivates mit einer funktionellen Enaminongruppe, welche die Beständigkeit gegen hydrolytische Spaltung bei saurem pH-Wert verglichen mit dem einfachen Amin bereitstellt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Malaria.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Primaquin-Derivates, das aufgrund der verbesserten lipophilen Eigenschaften besser und leichter in das Gewebe, insbesondere in die Leber, wo sich die Hypnozoiten befinden, eindringen kann, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Malaria.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Primaquin-Derivates mit hohem therapeutischem Indexverhältnis hinsichtlich der Methämoglobinbildung, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Malaria.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Primaquin-Derivates, das die Oxidation von Glutathion (GSH) in geringerem Ausmaß verursacht, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Malaria.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Primaquin-Derivates der Formel (1).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Primaquin-Derivates N¹-(3-Ethylidinotetrahydrofuran-2-on)-N⁴-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4-pentandiamin als gametozides Mittel bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Malaria.
Das erfindungsgemäß verwendete Verfahren zur Herstellung des Primaquin-Derivates umfasst die Synthese von Enaminon: N¹-(3-Ethylidinotetrahydrofuran-2-on)-N⁴-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4-pentandiamin durch Reaktion von 8-(4-Amino-1-methylbutylamino)-6-methoxychinolin (Primaquin) mit 3-Acetyl-τ-butyrolacton in Gegenwart einer Base in katalytischer Menge. Die Reaktion kann durch das nachstehende Schema dargestellt werden:
Das folgende Beispiel erläutert die Einzelheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens:
N¹-(3-Ethylidinotetrahydrofuran-2-on)-N⁴-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4-pentandiamin
Ein Gemisch von Primaquinbase (0,97 g, 3,7 mmol), frisch destilliertem 3-Acetyl-τ-butyrolacton (1,0 g, 7, 8 mmol) und einer Base, wie Piperidin (2–3 Tropfen), wurde mit einem Magnetrührer bei Raumtemperatur gerührt. Nach etwa einer Stunde erstarrte das Reaktionsgemisch. Das Produkt wurde in Ether titriert und filtriert, um das Produkt zu gewinnen. Es wurde aus alkoholischem Lösemittel, wie Propanol, kristallisiert. Ausbeute 0,89 g, Schmp.:118–120°C.
Gametozide Aktivität
Für den gametoziden Test durften Chargen von 3–4 Tage alten An. Stephensi an P.cynomolgi infizierten Rhesusaffen mit geeignetem Gametozytämie-Spiegel saugen. Eine Stunde nach dem Kontroll-Blutsaugen (vor der Behandlung) wurde die Verbindung der Formel 1 den Affen in Dosen von 0,63, 1,25, 1,87, 2,5, 3,75 und 5,0 mg/kg in einer Einzeldosis auf oralem Weg verabreicht. Das nach der Behandlung erfolgende Blutsaugen von Chargen gesunder Mücken wurde zu verschiedenen Zeiten durchgeführt (5–48 Stunden). Die Mücken wurden bei 26 ± 1°C unter optimalen Insektarium-Bedingungen gehalten. Die Infektionsrate und die Oozystenzählungen wurden am Tag 8 aufgezeichnet. Die Mücken wurden weiter im Insektarium gehalten, um die Bildung von Sporozoiten aufzuzeichnen, und das Fehlen von Sporozoiten in einigen Chargen wurde ebenso durch Impfung von heimischen Affen mit Mückenhomogenaten sichergestellt.
Ergebnisse: Die gametozide Aktivität der Verbindung der Formel (1) wurde bei 16 Rhesusaffen abgeschätzt und die Mückeninfektiositätsergebnisse vor der Behandlung zeigte für diese Affen, dass die Oozystenzahl für verschiedene Chargen von 13,77±9,51 bis 125,77±62,89 reichte und die prozentuale Infektiosität zwischen 42,55 bis 100% (siehe Tabelle 1) variierte. Aufeinanderfolgende Blutsaugevorgänge der Mücken an einem Affen, der mit einer 0,63 mg/kg Dosis behandelt war, zeigte eine erhebliche Verminderung der Oozystenzahl und der prozentualen Infektiosität bei +5 Std. und +24 Std. nach der Behandlung, verglichen mit dem entsprechenden Kontroll-Blutsaugevorgang bei -1 Std. Speicheldrüsenpräparate der Mücken dieser Chargen am Tag 15 zeigten die Anwesenheit von Sporozoiten, die folglich anzeigten, dass die Oozysten die normale sporogene Entwicklung beendet hatten. Keine Oozysten wurden über die Mitteldärme von Mücken +48 Std. nach Blutsangen nach Arzneimittelverabreichung beobachtet, noch wurden irgendwelche Sporozoiten in ihren Speicheldrüsen entdeckt.
Identische Ergebnisse wurden bei Wirksamkeitstests mit 1,25 mg/kg bei 2/2-Affen, mit 1,87 mg/kg bei 2/2-Affen und mit 2,5 mg/kg bei 2/3-Affen erhalten. Die Mückenchargen, die 4–5 Std. nach der Behandlung Blut saugen konnten, zeigten ein erkennbares Absinken der Oozystenzahl, obwohl diese Oozysten den sporogenen Zyklus beenden konnten, wie durch die Anwesenheit von Sporozoiten in den Speicheldrüsen am Tag 15–16 gezeigt wurde. Die Mückenchargen, die von diesen Affen nach +24 Std. und +48 Std. Blut saugten, entwickelten weder Oozysten, noch waren irgendwelche Sporozoiten in ihren Speicheldrüsen nachweisbar.
Die Oozystenentwicklung wurde vollständig in den Mückenchargen gehemmt (Blutsaugen 4–5 Std. sowie +24 Std. nach Behandlung) bei einem von drei Affen, die mit 2,5 mg/kg behandelt wurden, 5/5-Affen, die mit 3,75 mg/kg und 3/3-Affen, die mit 5,0 mg/kg Dosis behandelt wurden. Außerdem zeigten Speicheldrüsenpräparate dieser Chargen, die 14 bis 20 Tage nach der Infektion eine Blutmahlzeit durchführten, keine Sporozoiten. Die ungeschlechtlichen Parasitämie- und Gametozytämie-Spiegel für verschiedene Affen sind auch in Tabelle 1 gezeigt. Obwohl die Gametozyten im Kreislauf bei +24 Std. und +48 Std. nach der Behandlung weiterbestanden, waren diese Gametozyten nicht infektiös für An. Stephensi, wie durch das Fehlen von Oozysten gezeigt wird. Mückenchargen, die von dem Überträger-Kontrollaffen bei -1 Std., +24 Std., +48 Std. und +72 Std. Blut saugten, zeigten durchgängig hohe prozentuale Infektiosität und Oozystenzahl in allen vier Ansätzen.
Infektiositätstests wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass es keine Sporozoitenentwicklung bei den Mückenchargen gab, die am Tag 8 nach ihrem Blutsaugen an mit Arzneimittel behandelten Affen als oozystennegativ befunden worden waren. Homogenate von 40–50 Mücken von je 11 Ansätzen, die von Gametozyten tragenden Affen Blut saugten, die mit Verbindung 1 mit 1,87, 2,5, 3,75 und 5,00 mg Base/kg behandelt worden waren, wurden in heimische Rhesusaffen geimpft. Keiner dieser 11 Affen zeigte Wirksamkeit bis zu 60 Tage der Beobachtung, wobei das vollständige Fehlen von jeglicher lebenden Sporozoite in diesen Chargen angezeigt wurde (Tabelle 1). Ähnliche Impfungen, die mit drei Chargen vor der Behandlung (Kontrolle) und einer Charge nach der Behandlung (von der Überträgerkontrolle) durchgeführt wurden, ergaben die Entwicklung von offensichtlicher Infektion bei drei Affen am Tag 9, 10, 10.
Ein Vergleich der Mückeninfektiosität bei Chargen, die vor der Arzneimittelverabreichung und in unterschiedlichen Intervallen nach der Verabreichung der Verbindung der Formel (1) Blut saugten, ergab die drastische Verminderung der Mückeninfektiosität und Oozystenentwicklung. Dieser Effekt wurde als dosisabhängig befunden, da eine vollständige Hemmung bei +48 Std. erhalten wurde, wobei 1,35–2,50 mg/kg bei +24 Std. und die höheren Dosen von 3,75 und 5,00 mg/kg reife Gametozyten für Mücken innerhalb von 4–5 Std. nichtinfektiös machten. Dieses rasche Absinken der Mückeninfektiosität lässt sich der gametoziden Wirkung des Arzneimittels zuordnen. Die fortbestehenden Gametozyten, die 24–48 Std. nach der Behandlung bei mit der Verbindung der Formel (1) behandelten Affen zirkulierten, waren für Mücken nicht-infektiös. Untersuchungen mit Primaquin haben gezeigt, dass eine Dosis von 3,16 mg/kg eine vollständige gametozide Wirkung bei +24 Std. herbeiführt, während mit 1,00 mg/kg nahezu 98% Verlust der Infektiosität beobachtet wurde (Tabelle II). Die Beendigung des sporogenen Zyklus bei 24–96 Std. alten Oozysten, die der Wirkung der Verbindung der Formel (1) mit einer 10–50 mg/kg Dosis ausgesetzt waren, zeigt das Fehlen von sporontozider/oozystizider Wirkung des Arzneimittels (Tabelle III).
Methämoglobin-Toxizitätsuntersuchungen
Vergleich von Primaquin und Verbindung der Formel (1) hinsichtlich ihrer Wirkung auf Methämoglobin
Zur Gewinnung von Daten der Methämoglobinbildung nach der Behandlung mit der Verbindung der Formel (1) wurden Beaglehunde verwendet.
In Kolonie gezüchtete Beaglehunde wurden im Hundezwinger des Instituts gehalten und mit Standardnahrung gefüttert. Vierzehn Hunde wurden in fünf experimentelle Gruppen unterteilt, wie nachstehend eingehend geschildert:

Gruppe I: Drei Hunde Primaquin @ 1,0 mg/kg (Base) × 7 Tage
Gruppe II: Drei Hunde Primaquin @ 3,0 mg/kg (Base) × 7 Tage
Gruppe III: Drei Hunde Verbindung der Formel (1) @ 1,25 mg/kg (Base) × 7 Tage
Gruppe IV: Drei Hunde Verbindung der Formel (1) @ 3,75 mg/kg (Base) × 7 Tage

Primaquin oder Verbindung der Formel (1) wurde je nach Fall in 0,3% Methylcelluloselösung suspendiert und in 10 ml Volumen oral über einen Katheter verabreicht, gefolgt von 5 ml Wasser, um den Katheter zu spülen. Die Behandlung wurde einmal täglich für sieben Dosen (Tag 0–6) durchgeführt, wobei der Tag der ersten Dosis der Tag 0 ist. Die Tiere wurden 20–30 Minuten auf das Auftreten von Erbrechen beobachtet. 5 ml Blut wurde von den Beaglehunden am Tag 0, 3, 7, 13 und 25 unter Verwendung von Kaliumoxalatkristallen als Antigerinnungsmittel entnommen. Alle Schätzungen/Tests wurden am selben Tag der Blutabnahme durchgeführt. Methämoglobin wurde nach dem Verfahren von Evelyn und Malloy (1938, J. Biol. Chem., 126, 655–662) untersucht. Diese Werte sind in Tabelle V aufgeführt. Bei heilender Antirückfalldosierung von Primaquin gegen P. cynomolgi bei Affen, (Gruppe I, 1,0 mg/kg), stiegen die Met-Hb-Mittelwerte um das 3,7-fache am Tag 7 an. Anschließend sanken die Met-Hb-Werte bis zum Tag 25 allmählich ab, aber der Spiegel war immer noch zweimal höher als vor der Behandlung. Primaquin, das mit der dreifachen heilenden Dosis (Gruppe II, 3,0 mg/kg) verabreicht wurde, zeigte einen 10,5-fachen Anstieg gegenüber dem entsprechenden Wert am Tag 0, und die erhöhten Werte sanken nach der Behandlung wieder und waren 2,5-fach höher als die Vorbehandlungswerte am Tag 25. Verbindung 1 in heilender Dosis (Gruppe III: 1,25 mg/kg) erhöhte die Met-Hb-Werte nur unwesentlich um das 1,7-fache am Tag 7 und steigerte leicht (2,4-fach) am Tag 25 gegenüber den Vorbehandlungswerten. Bei der höheren Dosis (Gruppe IV: 3,75 mg/kg) stieg der Met-Hb-Spiegel am Tag 7 um das 3,2-fache, und die Werte sanken auf das 1,8-fache der Vorbehandlungswerte am Tag 25. Die Überträger-Kontrollgruppe (Gruppe V) zeigte unwesentliche Schwankungen des Met-Hb-Spiegels innerhalb der normalen Grenzen.
Folglich war die Met-Hb-Bildung am Tag 7 des heilenden Dosisspiegels mit der Testverbindung 2,7-fach niedriger als im Vergleich zu Primaquin. Entsprechend war bei dreifacher therapeutischer Dosis die Met-Hb-Bildung mit der Testverbindung 3,6-fach niedriger im Vergleich zu Primaquin.
Reduziertes Glutathion (GSH) in menschlichen Erythrozyten
Die durch Arzneimittel induzierte Hämolyse ist eine schwere Komplikation bei Personen, die für das G-6PD-Enzym defizient sind. Die Anwesenheit von reduziertem Glutathion (GSH) in Erythrozyten kontrolliert den Spiegel von oxidativen Metaboliten. Daher sind Arzneimittel, die eine geringere Oxidation des GSH-Spiegels verursachen, sicher. Der Spiegel von reduziertem Glutathion in Erythrozyten von gesunden und G-6PD-defizienten Individuen wurde nach Inkubation mit PQ und Verbindung der Formel (1) gemessen, und die Ergebnisse sind in Tabelle V und VI aufgeführt. G-6PD-Defizienz wurde durch den Fluoreszenzspotscreeningtest festgestellt und durch das Enzymassayverfahren bestätigt. Heparinisierte Blutproben wurden von jedem Individuum entnommen und nach Zentrifugation wurden die gepackten Zellen dreimal mit kalter Salzlösung gewaschen. Ein-Milliliter-Aliquots gewaschener Zellen wurden dann in einem Wasserbad bei 37°C unter gelegentlichem Schütteln für 3 Std. mit unterschiedlichen Konzentrationen der Arzneimittel inkubiert, die von 1 bis 5 μg/ml Primaquindiphosphat-Base und entsprechenden Dosen von 1,25 bis 62,5 μg/ml Verbindung 1 reichten. Die GSH-Spiegel wurden nach dem Verfahren von Bentler et al. [Improved Method for the Determination of Blood Glutathion, J. Lab. Clin. Med., 61, 882–888 (1963)] geschätzt.
Ergebnisse
Die mittleren GSH-Spiegel der Erythrozyten bei den Kontrollen (ohne Arzneimittel) waren bei G-6PD-defizienten Individuen (29,5±1,86mg%) erheblich niedriger als bei normalen Individuen (49,91±4,49mg%).
Normale Erythrozyten, die unterschiedlichen Dosen von PQ ausgesetzt waren, zeigten einen Abfall der GSH-Spiegel, der bei einer Konzentration von 10 μg/ml statistische Bedeutsamkeit erlangte, wohingegen die gleichen, die mit Verbindung 1 inkubiert wurden, ein signifikantes Absinken der GSH-Spiegel erst bei einer Konzentration von 31,25 μg/ml zeigten. (Tabelle V).
Bei Konzentrationen von 25 μg/ml und 50 μg/ml PQ und entsprechenden Dosen von Verbindung der Formel (1) bei G-6PD defizienten Erythrozyten war das Absinken des GSH-Spiegels statistisch relevant (P<0,001) bei der Kuh, sobald GSH-Spiegel mit GSH-Spiegeln bei anderen Kontrollen verglichen wurden. Jedoch war das Absinken bei PQ-behandelten Erythrozyten verglichen mit der mit Verbindung der Formel (1) behandelten Gruppe ausgeprägt, was somit den größeren Sicherheitsbereich der neuen Verbindung verdeutlicht.
Prozentuale Abnahmen bei den GSH-Spiegeln waren bei normalen und G-6PD-defizienten Erythrozyten, die mit PQ behandelt wurden, ausgeprägter als bei der Behandlung mit der Verbindung der Formel (1). Statistisch signifikante Abnahmen wurden bei Konzentrationen von 25 μg/ml und 50 μg/ml PQ verglichen mit den äquivalenten Dosen der Testverbindungen sowohl bei normalen als auch bei G-6PD-defizienten Erythrozyten (Tabelle V und VI) beobachtet.
Tabelle I: Wirkung einer Einzeldosis von Verbindung 1 auf P. cynomolgi-B-Gametozyten, bestimmt anhand ihrer Infektiosität für An. stephensi-Mücken.
Tabelle II: Gametozide Aktivität von Primaquin
Tabelle III: Wirkung von Verbindung 1 auf die Entwicklung von Oozysten von P. cynomolgi An. stephensi-Mücken
Tabelle IV: Methämoglobinspiegel (g%) in Beagle-Hunden nach Behandlung mit Primaquin und Verbindung 1.

Tag 0 = Beginn der Arzneimittelbehandlung
Tag 3 = Nach drei Dosen
Tag 7 = 1 Tag nach letzter Arzneimitteldosis
Tag 13 = 7 Tage nach letzter Arzneimitteldosis
Tag 25 = 19 Tage nach letzter Arzneimitteldosis

Tabelle V: GSH-Spiegel in normalen Erythrozyten mit verschiedenen Dosen von Primaquin und Äquivalentdosen von Verbindung 1
Tabelle VI: GSH-Spiegel in G-6-PD-defizienten Erythrozyten mit verschiedenen Dosen von Primaquin und äquivalenten Dosen von Verbindung 1

Claims

Verwendung eines Primaquin-Derivates der Formel 1
zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Malaria.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Malaria bei Menschen.
Verwendung eines Primaquin-Derivates N¹-(3-Ethylidinotetrahydrofuran-2-on)-N⁴-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4-pentandiamin zur Herstellung eines gametoziden Mittels zur Behandlung von Malaria.
Verfahren zur Herstellung eines Primaquin-Derivates der Formel 1
das den Schritt des Umsetzens von 8-(4-Amino-1-methylbutylamino)-6-methoxychinolin (Primaquin) mit 3-Acetyl-τ-butyrolacton in Gegenwart einer Base in katalytischer Menge umfasst.