DE60008988T2

DE60008988T2 - Synthese von Peptid-Nucleinsäuren

Info

Publication number: DE60008988T2
Application number: DE60008988T
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Dr. Batz; Henrik Frydenlund Hansen; Henrik Dr. Oerum; Troels Dr. Koch; Thomas Kofoed
Original assignee: PNA DIAGNOSTICS APS APPLIED BI; PNA Diagnostics ApS Denmark
Current assignee: PNA DIAGNOSTICS APS APPLIED BI; PNA Diagnostics ApS Denmark
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-12
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2020-09-13
Also published as: EP1085020B1; EP1085020A1; DK1085020T3; DE60008988D1; ATE261967T1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Peptid-Nukleinsäuren.
Es wurde festgestellt, dass nicht-natürliche Nukleinsäure-bindende Verbindungen wertvolle Mimikry für Nukleinsäuren sind, die insbesondere die Nukleinsäure-bindenden Merkmale von DNA und RNA nachahmen oder sogar verbessern. Es wurde gezeigt, dass Peptid-Nukleinsäuren (PNA) sehr wärmestabile Doppelhelices und Trippelhelices mit komplementären RNA- und DNA-Oligonukleotiden bilden (Egholm et al. Nature, 1993, 365, 566–568). Weiter wurde von einer Substitution des Adenin (A) durch 2,6-Diaminopurin (D) berichtet, dass sie den Schmelzpunkt (T_m) von DNA/DNA- und RNA/DNA-Hybriden erhöhen (Hoheisel et al. FEBS 1990, 274, 103; Lamm et al. Nucleic Acids Research 1991, 19, 12, 3193). Diese Wirkung des T_m hängt von der Nukleobasensequenz des DNA-Oligonukleotids ab. Daher ist die Stabilisierung im Vergleich zu Doppelhelices, die aus der DNA und einem lediglich A enthaltenden Oligonukleotid gebildet sind, bei gemischten Sequenzen am ausgeprägtesten. Bei Polyadenin-Sequenzen kann sich sogar eine destabilisierende Wirkung zeigen (Cheong et al., Nucleic Acids Research, 1988, 16, 11, 5115).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Synthese von Verbindungen der allgemeinen Formel I
worin
T NV¹V² ist
worin V¹ und V² anders miteinander verknüpft sind als über das N, wie in der Definition gezeigt, durch eine Kette von mindestens 5 Atomen, oder T NHV ist, worin V gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl und einer Schutzgruppe,
X CH oder N ist,
Y eine elektronenentziehende Schutzgruppe ist, vorzugsweise eine Gruppe, die zur Gruppe der unsubstituierten oder substituierten Acylgruppen gehört, und
Z eine Alkylgruppe ist, die mit einem Derivat einer COOH-Gruppe substituiert ist, worin das Derivat ein Ester, Thioester oder Amid mit einer ungeschützten oder geschützten Peptid-Nukleinsäure ist,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel II
worin
die Definitionen von X, Y und Z gewählt sind aus den möglichen Definitionen von X, Y und Z in Formel I, und
W eine elektronenentziehende Gruppe ist, die vorzugsweise gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NO₂, Halogen, Tos und Mes, umgesetzt wird mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III, T-H (III)worin T wie in Formel I definiert ist,
unter nicht-alkalischen Bedingungen, die die Eliminierung einer Verbindung der Formel WH begünstigen.
Jeglicher Substituent in Z kann während der Reaktion verändert werden oder auch nicht, um einen anderen Substituenten innerhalb der möglichen Definitionen der Substituenten in Z zu erhalten.
Tos steht für die Tosylgruppe und Mes steht für die Mesylgruppe. Bevorzugte Halogene sind Iod (I), Br und Cl, wobei Cl am bevorzugtesten ist.
Eine bevorzugte Definition von T, umfassend die verknüpften Substituenten V¹ und V², sind N-heterocyclische Gruppen, die von sekundären Aminen stammen, wie die Piperidylgruppe oder die Morpholinogruppe. Diese Definition beinhaltet allerdings auch Verbindungen, die aromatische Komponenten oder andere Komponenten mit Doppelbindungen umfassen, solange zumindest eine sekundäre Aminogruppe enthalten ist. Die Kette der Atome ist vorzugsweise 5 bis 8, am bevorzugtesten 6 Atome lang. Bevorzugte Atome in der Kette sind Kohlenstoffatome und Stickstoff- und Sauerstoffatome. Eine bevorzugte Definition von V ist die Benzyloxycarbonylgruppe. Bei bevorzugten Amino-Schutzgruppen V handelt es sich um Gruppen, die nach der Synthese aus der exocyclischen Aminogruppe selektiv entfernt werden können.
Alkylgruppen in den Definitionen aller Formeln, sofern nicht anderweitig erwähnt, enthalten vorzugsweise 1 bis 6, am bevorzugtesten 1 bis 3 Kohlenstoffatome. Acylgruppen enthalten vorzugsweise 2 bis 21 Kohlenstoffatome, einschließlich Acylgruppen von Alkanen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome beinhalten, die unsubstituiert oder durch ein oder mehrere aromatische Gruppen von 6 bis 14 Kohlenstoffatomen substituiert sind, und von aromatischen Komponenten wie Arenen, die 6 bis 14 Kohlenstoffatome enthalten. Bevorzugte Alkylacylgruppen sind Isobuturyl, t-Buturyl, Isopropyl und Acetyl, und ein bevorzugtes aromatisches Acyl ist Benzoyl. Eine aromatische Gruppe oder Arylgruppe ist eine Gruppe, die mindestens einen aromatischen Ring enthält, der unsubstituiert oder durch ein oder mehrere, doch gewöhnlich weniger als 3, Substituenten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl, Alkoxy, Alkyl, Nitro, Halogen oder Carboxyl, substituiert ist. Bevorzugte aromatische Gruppen sind die Phenyl- und die Naphthylgruppe.
Bei einer Schutzgruppe einer bestimmten Gruppe handelt es sich um eine solche, die der bestimmten Gruppe das Teilnehmen an jeglichen unerwünschten chemischen Reaktionen verbietet. Vorzugsweise kann die Schutzgruppe von der bestimmten Gruppe entfernt werden, wodurch die bestimmte Gruppe freigesetzt wird. Schutzgruppen, z.B. Aminogruppen, Hydroxylgruppen und Carboxylgruppen, sind einem Fachmann des Gebiets allgemein wohlbekannt, z.B. aus Lehrbüchern der Oligonukleotid- oder Peptidsynthese. Zu Schutzgruppen für Aminogruppen zählen die Acylgruppen oder Carbonyloxyalkyl, für Hydroxylgruppen die Acylgruppen und für Carboxylgruppen die Alkylgruppen. Die elektronenentziehende und elektronenspendende Fähigkeit wird verglichen mit Wasserstoff.
Eine Aralkylgruppe stellt eine durch eine Arylgruppe substituierte Alkylgruppe dar. Ein bevorzugtes Aralkyl ist die Benzylgruppe.
Bevorzugte Definitionen von T bestehen aus NH₂, NHCH₃ und Piperidyl.
Die bevorzugte Definition von X ist N.
Die bevorzugte Definition von Y ist Isobutyryl (C₃H₇CO).
Alle diese Verbindungen der allgemeinen Formel I können gemäß der vorliegenden Erfindung durch Substituieren von Gruppe W durch die Aminogruppe der Verbindung der Formel III hergestellt werden. Diese Reaktion kann als eine nukleophile Substitutionsreaktion betrachtet werden, die durch den Austritt einer Verbindung WH vorangetrieben wird. Aromatische nukleophile Substitutionen an Heterozyklen sind einem Fachmann des Gebiets prinzipiell bekannt, doch sind niemals auf Diaminopurine angewendet worden.
Nukleinsäure-bindende Verbindungen sind gemäß der vorliegenden Erfindung durch ihre Fähigkeit zum Binden an eine Nukleinsäure über Wasserstoffbrückenbindungen der Basenpaarungen zwischen komplementären Basen sowohl der Nukleinsäure als auch der Nukleinsäure-bindenden Verbindung definiert. Die Bindung kann entweder in Form einer Doppelhelix (die z.B. einen Strang einer Nukleinsäure und einen Strang der Nukleinsäure-bindenden Verbindung enthält) oder in Form einer Trippelhelix (die zum Beispiel einen Strang der Nukleinsäure und zwei Stränge der Nukleinsäure-bindenden Verbindung enthält) vorliegen. Bevorzugte Nukleinsäure-bindende Verbindungen sind die nicht-natürlich vorkommenden Verbindungen. Beispiele sind beschrieben bei: Jones, A.S., Int. J. Biol. Macromol. 1979 I, 194; De Koning, H., Pandit, U.K. Rec. Trav. Chim., 1971, 91, 1069; Takemoto, K., Inaki, Y., Polym. Mat. Sci. Eng., 1988, 58, 250; Weller, D.D., Daly, D.T., Olsen, W.K., Summerton, J.E., J. Org. Chem., 1991, 56, 6000; Garner, P., Yoo, J.U., Tett. Lett., 1993, 34, 1275; EP-A-0 672 700 ; EP 0 646 595 oder WO 86/05518.
Die bevorzugtesten Nukleinsäure-bindenden Verbindungen sind beschrieben in WO 92/20702. Zu dieser bevorzugtesten Gruppe von Nukleinsäure-bindenden Verbindungen sind weiterhin jegliche Derivate und spezifischen Ausführungsformen zu zählen. In WO 94/25477 sind neuartige Peptid-Nukleinsäuren beschrieben; WO 96/02558 dagegen richtet sich auf verknüpfte PNAs, und WO 96/20212 richtet sich auf PNAs, die ein chirales Rückgrat enthalten. WO 95/14708 richtet sich auf Verbindungen mit komplexbildenden Komponenten, die an die Nukleinsäure-bindenden Verbindungen gebunden sind, und WO 95/16202 richtet sich auf Nukleinsäure-bindende Verbindungen mit einem daran gebundenen Enzym-Substrat, und in WO 95/08556 sind chimäre Moleküle von Nukleinsäuren und Nukleinsäure-bindenden Verbindungen beschrieben. Die Synthese solcher Verbindungen ist darin ausführlich beschrieben. Daher wird bezüglich der chemischen Struktur, insbesondere des Rückgrats, auf diese Dokumente Bezug genommen. Diese Nukleinsäure-bindenden Verbindungen werden gewöhnlich unter Anwendung einer Strategie hergestellt, die den Schutz aller funktioneller Gruppen innerhalb der Verbindung während der Verlängerung des Rückgrats erfordert, so dass sämtliche funktionellen Gruppen, wie z.B. primäre Aminogruppen oder Hydroxygruppen, die nicht bei der Rückgrat-Verlängerung extendiert werden sollen, durch geeignete Schutzgruppen geschützt sind, wobei diese bei einem abschließenden Schritt zur Freisetzung der funktionellen Gruppen in der Nukleinsäure- bindenden Verbindung entfernt werden können. Zu diesen funktionellen Gruppen zählen vorzugsweise jegliche Aminogruppen an Nukleobasen-Komponenten, wie etwa die exocyclischen Aminogruppen von Zytosin, Adenin und Guanin. Solche Schutzgruppen sind aus WO 92/20702, WO 93/12129 und WO 95/17403 bekannt. Die bevorzugteste, bisher bekannte Schutzgruppe ist die Acylgruppe und die Z-Gruppe (Benzyloxycarbonyl). Für jegliche Aminogruppen am Rückgrat ist die Boc-Gruppe (tert-Butyloxycarbonyl) wohlbekannt.
Innerhalb der Peptid-Nukleinsäure zählen zu diesen Gruppen eine Carboxylgruppe und eine Amingruppe, vorzugsweise eine primäre Amingruppe. Wie beschrieben in WO 92/20702, ist die Amingruppe vorzugsweise durch die Boc-Gruppe geschützt, doch können andere Schutzgruppen die Mmt- oder die Fmoc-Gruppen sein. Die Carboxylgruppen können unter Verwendung der Benzylgruppe (Bn) geschützt werden, was einen Carbonsäureester bildet. Der Begriff "teilgeschützt" bedeutet, dass nicht alle funktionellen Gruppen geschützt sind, doch zumindest eine davon. Zwar können die vollständig geschützten monomeren Rückgrat-Einheiten vorzugsweise bei der Synthese dieser monomeren Rückgrat-Einheiten geschaffen werden, doch stellen teilgeschützte Rückgrat-Einheiten die bevorzugten Ausgangsverbindungen zum Knüpfen der monomeren Rückgrat-Einheit an eine Festphase, eine weitere monomere Rückgrat-Einheit oder eine zu verlängernde Nukleinsäure-bindende Verbindung dar. Vorzugsweise enthält im Falle der Peptid-Nukleinsäure solch ein teilgeschützte monomere Rückgrat-Einheit eine geschützte primäre Aminogruppe als auch eine freie Carbonsäuregruppe.
Ebenfalls hierin beschrieben ist ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, worin Z eine monomere Rückgrat-Einheit einer Nukleinsäure-bindenden Verbindung ist, welches Verfahren das Umsetzen einer Verbindung der Formel I umfasst, worin Z R' ist, worin R' -(CR¹R²)_n-CO-OR³ ist, R¹ und R² für jedes C an unterschiedlichen n unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Allyl, oder R¹ und R² an einem C an einer definierten Position zusammengenommen Sauerstoff sind, und R³ eine Alkyl- oder Aralkylgruppe ist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 5 mit einer monomeren Rückgrat-Einheit ist, die eine nicht-geschützte Aminogruppe enthält, unter Bedingungen, die die Eliminierung eines Alkyl- oder Aralkyl-Alkohols begünstigen.
Überraschenderweise können diese Monomere in hoher Ausbeute und bei vermindertem Verlust an Schutzgruppen synthetisiert werden, indem eine Verbindung der Formel II, worin Z eine teilweise oder vollständig geschützte monomere Rückgrat-Einheit einer Nukleinsäure-bindenden Verbindung ist, mit einer Verbindung der Formel III, wie oben skizziert, umgesetzt wird. Um allerdings die Erzeugung von Guanidin-Nebenprodukten zu vermeiden, sollten alkalische Bedingungen ausgeschlossen werden. Die Synthese hat sich für Ammoniak und andere primäre Amine als nützlich erwiesen, und es wird auf der Grundlage dieser Experimente erwartet, dass sie sich auch für andere nukleophile Verbindungen als nützlich erweist.
Bei einer Gesamtbetrachtung der Monomer-Synthese weist die Synthese der Monomere über Verbindungen der Formel II den Hauptvorteil auf, dass der Syntheseweg für Diaminopurin-Derivate und Guanin-Derivate über einen großen Teil der Schritte hinweg derselbe ist. Um Guanin-Derivate anstelle von Diaminopurin-Derivaten herzustellen, kann eine Verbindung der Formel II, die für eine Diaminopurin-Synthese verwendet werden könnte, alkalischen Bedingungen unterworfen werden, wodurch der Substituent N in Formel II durch Hydroxyl ersetzt wird.
Wie oben skizziert, weisen Nukleinsäure-bindende Verbindungen, die Diaminopurin enthalten, bestimmte Eigenschaften auf, insbesondere bei PNAs. Die kontrollierte chemische Synthese von Nukleinsäure-bindenden Verbindungen umfasst gewöhnlich die Oligomerisation der monomeren Rückgrat-Einheiten, die zur Vermeidung von Nebenreaktionen sowohl des Monomers als auch des bereits hergestellten Oligomers in geeigneter Weise geschützt sind, wodurch lediglich die funktionellen Gruppen für die angestrebte Kopplungsreaktion freigelegt werden. Dieser neue Syntheseschritt kann zur Schaffung geschützter Aminopurin-Komponenten eingesetzt werden. Es sollte klar sein, dass die geschützten Nukleobasen oder ihre Analoga, als Aminopurin, vorteilhafterweise während der Synthese der Nukleinsäure-bindenden Verbindungen vorhanden sind, da die Verlängerung dieser Nukleinsäure-bindenden Verbindungen, die solche geschützten Diaminopurin-Komponenten enthalten, bei weniger Nebenreaktionen abläuft, wie sie durch die Aminogruppen, wenn diese nicht geschützt wären, erzeugt würden. Beim Stand der Technik wurde jedoch bisher keine leicht durchführbare Synthese der zweifach geschützten Diaminopurin-Komponenten vorgestellt.
Die vorliegende Erfindung umfasst, im Gegensatz zum Stand der Technik, bei einer bevorzugten Ausführungsform die chemische Synthese eines Vorläufer-Oligomers unter Verwendung mindestens einer monomeren Verbindung der Formel II, worin Z eine teilgeschützte monomere Rückgrat-Einheit ist. Diese Synthese kann analog zur Methode für die Monomere, die andere (natürlich vorkommende) Nukleobasen enthalten, unter Vermeidung alkalischer Bedingungen vorgenommen werden. Die gesamte Synthese ergibt ein Oligomer, das teilweise oder vollständig geschützt ist und mindestens einen W enthaltenden Heterozyklus umfasst. Daraufhin wird Gruppe W durch T ersetzt, wie oben skizziert, indem nukleophile Austauschbedingungen angelegt werden.
Enthält eine Nukleinsäure-bindende Verbindung mehr als eine Gruppe, in der diese Austauschreaktion stattfinden soll, so kann dies in einem Schritt erfolgen. Weiterhin können unter den Bedingungen dieser Austauschreaktion weitere Veränderungen innerhalb der Nukleinsäure-bindenden Verbindung oder der monomeren Rückgrat-Einheit vorgenommen werden, wie etwa die gleichzeitige Entfernung der Schutzgruppen. Überraschenderweise kann diese Reaktion bei hoher Ausbeute und wiederum mit einer Anzahl nukleophiler Verbindungen der Formel III vorgenommen werden. Nach der Oligomerisation und dem Austausch kann die teilweise oder vollständig geschützte Verbindung weiter behandelt werden; zum Beispiel kann jede Schutzgruppe einschließlich der bei T vorhandenen unselektiv oder selektiv entfernt werden, um Reportergruppen (wie Fluorescein), Festphasen (wie Carboxylgruppen-enthaltende Cellulose) anzuheften, oder lediglich, um die Bindungseigenschaften des Oligomers zu erhalten.
Die bevorzugtesten Nukleinsäure-bindenden Verbindungen der Formel I umfassen mindestens eine monomere Untereinheit der allgemeinen Formel IX:
worin
L ein geschütztes Diaminopurin ist, wie oben dargestellt,
k, l und m unabhängig Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 sind,
p Null oder 1 ist, und
R⁷ gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten der natürlich vorkommenden Alpha-Aminosäuren.
In 5 ist die Synthese der geschützten Diaminopurin-enthaltenden PNA-Monomere 7, 8, 9, 11 und 12 als auch des (Heterozyklus) ungeschützten Monomers 10 gezeigt.
In 6 ist die nukleophile Verdrängung in einem PNA-Oligomer unter Verwendung, als einem nukleophilen (:Nu), von entweder Ammoniak oder Methylamin gezeigt.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung ausführlicher erläutern.
Beispiele
Allgemeines
Bei allen verwendeten Reagenzien handelt es sich um analytische Qualitäten von Aldrich. HATU wurde bezogen von PerSeptive Biosystems (MA). MBHA-Harz wurde bezogen von NovaBiochem (Schweiz).
Abkürzungen
Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: Triethylamin (TEA), tert-Butyloxycarbonyl (Boc), Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan (DCM), Butyl (Bu), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Acetyl (Ac).
Beispiel 1
Benzyl-(2-amino-6-chlorpurin-9-yl)acetat (2) Synthese von Boc-6-chloro-N²-isobutyrylguanin-Monomer (5)
Eine Suspension von 2-Amino-6-chlorpurin (1) (25 g, 147 mmol) und Kaliumcarbonat (41 g, 297 mmol) in DMF (500 ml) wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt. Benzyl-2-bromacetat (37 g, 25 ml, 162 mmol) wurde in einer Portion zugegeben und das Reaktionsgemisch 3 Stunden lang gerührt. Nach Zugabe von Kieselgur (10 g) wurde der anorganische Feststoff durch Filtration durch Kieselgur entfernt und das Filtrat bis zur Trockenheit in vacuo eingedampft. Der feste Rückstand wurde in DMF (125 ml) suspendiert und bei 15°C abgekühlt, gefolgt von einer Filtrierung. Die klare braune Lösung wurde in vacuo eingedampft. Das Rohprodukt wurde in heißem Ethanol (1,5 l) gelöst und vor der Filtration über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Dies ergab 34,6 g (74 %) des reinen Produkts 2. MS (+MALDI-TOF) 318,0 [M+H]⁺ ¹H NMR (d6-DMSO) δ 8,13 (1H, s, H-8); 7,41–7,35 (5H, m, Ph); 7,00 (2H, s, NH₂); 5,21 (2H, s, CH₂Ph); 5,08 (2H, s, CH₂CO).
Benzyl-(N²-(isobutyryl)-2-amino-6-chlorpurin-9-yl)acetat (3)
Einer Lösung von Benzyl-(2-amino-6-chlorpurin-9-yl)acetat (2) (1,0 g, 3,14 mmol) in Pyridin (10 ml) bei 0°C wurde Isobutyrylchlorid (0,4 g, 3,75 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 0°C für 30 Minuten gerührt, gefolgt von 3 Stunden bei Raumtemperatur. Das Gemisch wurde bis zur Trockenheit in vacuo eingedampft und der Rückstand in heißem Ethylacetat gelöst. Das Produkt fällte beim Stehenlassen bei 0°C langsam aus. Ausbeute = 800 mg (66 %). MS (+MALDI-TOF) 389,4 [M+H]⁺; ¹H NMR (d6-DMSO) δ 10,82 (1H, s, NH); 8,52 (1H, s, H-8); 7,37 (5H, m, Ph); 5,23/5,22 (4H, 2×s, 2×CH₂); 2,82 (1H, m, CH-iBu); 1,10 (6H, d, CH₃-iBu).
(N²-(Isobutyryl)-2-amino-6-chlopurin-9-yl)essigsäure (4)
Benzyl-(N²-(isobutyryl)-2-amino-6-chlorpurin-9-yl)acetat (600 mg, 1,5 mmol) wurde in einem Gemisch aus H₂O (4 ml) und THF (4 ml) gelöst und dem 2 M NaOH (6 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren 1 Stunde lang stehengelassen. Nach Einstellen des pH-Werts auf 2,5 mit 2 M NaHSO₄ wurde das Gemisch mit Ethylacetat (3 × 100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Filtrat in vacuo konzentriert. Das resultierende gelbe Öl wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von DCM/MeOH/Triethylamin (90:10:1) als Elutionsmittel gereinigt. Dies ergab 360 mg (78 %) der Titelverbindung 4. MS (+MALDI-TOF) 299,3 [M+H]⁺; ¹H NMR (d6-DMSO) δ 10,76 (1H, s, NH); 8,42 (1H, s, H-8); 4,62 (2H, s, CH₂CO); 2,92 (6H, q, 3 × CH₂-TEA); 2,80 (1H, m, CH-iBu); 1,10 (15H, m, 2 × CH₃-iBu und 3 × CH₃-TEA).
Methyl-N-((N²-(isobutyryl)-2-amino-6-chlorpurin-9-yl)acetat-N-(2-Boc-aminoethyl)glycinat (5)
Methyl-N-(tert-butyloxycarbonylaminoethyl)glycinat (260 mg, 1,12 mmol) wurde in DMF (5 ml) gelöst und dem (N²-(Isobutyryl)-2-amino-6-chlorpurin-9-yl)essigsäure (280 mg, 0,94 mmol), HOBt (160 mg, 1,2 mmol) und DCC (250 mg, 1,2 mmol) zugegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit DCM verdünnt und die Lösung mit 0,5 M NaHCO₃ und mit 2 M NaHSO₄ gewaschen. Nach der Konzentrierung in vacuo wurde das Rohprodukt in Ethanol/Wasser gelöst und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Das reine Produkt wurde auf die Filtration hin isoliert (320 mg, 0,62 mmol, 56 %). MS (+MALDI-TOF) 512,0 [M+H]⁺; ¹H NMR (d6-DMSO) δ 10,82 (1H, s, NH); 8,38 (1H, s, H-8); 7,07–6,74 (1H, m, NH); 5,28/5,11 (2H, 2×s, Rotamere CH₂CO); 4,48/4,10 (2H, 2×s, Rotamere CH₂CO); 3,62 (3H, s, OCH₃); 3,61–3,19 (4H, m, 2×CH₂); 2,84 (1H, m, CH-iBu); 1,32 (9H, s, 3×CH₃-tBu); 1,09 (6H, d, 2×CH₃-iBu).
N-((N²-(Isobutyryl)-2-amino-6-chlorpurin-9-yl)acetyl)-N-(2-Boc-aminoethyl)glycin (6)
sMethyl-N-((N²-(isobutyryl)-2-amino-6-chlorpurin-9-yl)acetyl)-N-(2-Boc-aminoethyl)glycinat (220 mg, 0,43 mmol) wurde in einem Gemisch aus THF (1 ml) und Wasser (1 ml) gelöst. Nach Zugabe von 1 M LiOH (1 ml, 1 mmol) wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 2 Stunden lang stehengelassen. Das THF wurde in vacuo entfernt und der pH-Wert auf 2,5 mit 2 M NaHSO₄ eingestellt. Das Produkt wurde durch Extraktion mit Ethylacetat und Konzentration der organischen Phase erhalten. Dies ergab 155 mg (72 %) der Titelverbindung. MS (+MALDI-TOF) 498,4 [M+H]⁺; ¹H NMR (d6-DMSO) δ 10,82 (1H, s, NH); 8,39 (1H, s, H-8); 7,07–6,73 (1H, m, NH); 5,27/5,11 (2H, 2xs, Rotamere CH₂CO); 4,35/4,02 (2H, 2xs, Rotamere CH₂CO); 3,54–3,03 (4H, m, 2×CH₂); 2,84 (1H, m, CH-iBu); 1,32 (9H, s, 3×CH₃-tBu); 1,08 (6H, d, 2×CH₃-iBu).
Beispiel 2
Nukleophiole Verdrängung im 6-Chlorpurin-Monomer
Das fertige Monomer 6 wurde in Ammoniak in Wasser (32 %), Methylamin in Wasser (40 %) bzw. Piperidin in DMF (20 %) gelöst. Der Reaktion folgte eine HPLC und die MALDI-TOF-MS. Die Substitution des 6-Chloro erfolgt innerhalb von Minuten, wie mittels HPLC und MS erkennbar. Die Entfernung der Isobutyrylgruppe erfolgt langsamer, dabei am schnellsten bei Methylamin (nach 5 Stunden bei Raumtemperatur abgeschlossen) und sehr langsam bei Piperidin (nach 72 Stunden nicht abgeschlossen). Siehe 5 für Definitionen.

7:: MS (+MALDI-TOF) 478,6 [M+H]⁺
8:: MS (+MALDI-TOF) 492,5 [M+H]⁺
9:: MS (+MALDI-TOF) 546,3 [M+H]⁺
10:: MS (+MALDI-TOF) 407,9 [M+H]⁺
11:: MS (+MALDI-TOF) 422,6 [M+H]⁺
12:: MS (+MALDI-TOF) 476,1 [M+H]⁺

Beispiel 3
Nuklephile Verdrängung von 6-Chlorpurin im PNA-Oligomer
Die PNA Ac-TGT-ACG-TCG^CI-CAA-CTA-Gly (13) wurde auf einem ABI 433A-Peptid-Synthesegerät unter Verwendung von Boc/Acyl-Monomeren und N-((N²-(Isobutyryl)-2-amino-6-chlorpurin-9-yl)acetyl)-N-(2-Boc-aminoethyl)glycin (6) synthetisiert. Der Basen-labile PAM-Linker zum MBHA-Harz wurde im ersten Ring unter Verwendung von Boc-Gly-PAM eingeführt (Doppelkopplung). Alle Ringe und Reagenzien waren standardmäßig, wie zuvor berichtet [Koch et al. J. Peptide Res. 49, 1997, 80–88]. Die fertiggestellte PNA wurde in zwei Röhrchen aufgeteilt und behandelt in (A) Ammoniak in Wasser (20 Stunden bei 60°C) und in (B) Methylamin (5 Stunden bei Raumtemperatur).

14:: MS (+MALDI-TOF) 4162,5 [M+H]⁺
15:: MS (+MALDI-TOF) 4180,0 [M+H]⁺

Claims

Verfahren zum Synthetisieren von Verbindungen der allgemeinen Formel I
worin T NV¹V² ist, worin V¹ und V² miteinander anders verknüpft sind als über das N, wie in der Definition gezeigt, durch eine Kette von mindestens 5 Atomen, oder T NHV ist, worin V gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl und einer Schutzgruppe, X CH oder N ist, Y eine Elektronen-entziehende Schutzgruppe ist, vorzugsweise eine Gruppe, die zur Gruppe der unsubstituierten oder substituierten Acylgruppen gehört, und Z eine Alkylgruppe ist, die mit einem Derivat einer COOH-Gruppe substituiert ist, wobei das Derivat ein Ester, Thioester oder Amid mit einer ungeschützten oder geschützten Peptid-Nukleinsäure ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel II
worin die Definitionen von X, Y und Z gewählt sind aus den möglichen Definitionen von X, Y und Z in Formel I, und W eine Elektronen-entziehende Gruppe ist, vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, bestehend aus NO₂, Halogen, Tos und Mes, umgesetzt wird mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III T-H (III)worin T wie in Formel I definiert ist, unter nicht-alkalischen Bedingungen, die die Eliminierung einer Verbindung der Formel WH begünstigen.